表面锚定的轻链诱饵抗体展示系统 |
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| 申请号 | CN201380024633.X | 申请日 | 2013-05-06 | 公开(公告)号 | CN104271816A | 公开(公告)日 | 2015-01-07 |
| 申请人 | 默沙东公司; | 发明人 | H.H.沙希恩; D.查; | ||||
| 摘要 | 本 发明 部分提供了同时使用分泌和展示模式的 抗体 展示系统。本发明的实施方案提供了一种系统，其中借助于表面展示抗体轻链并利用此轻链与在相同宿主中共表达的抗体分子的重链的共价相互作用，与单价抗体 片段 复合的诱饵在宿主细胞中分泌之前可以被捕获。还提供了可用于制造该抗体展示系统的多肽、多核苷酸和宿主细胞，以及使用该系统用于鉴定特异性结合目的 抗原 的抗体的方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.抗体展示系统，其包含： |
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| 说明书全文 | 表面锚定的轻链诱饵抗体展示系统技术领域[0004] 然而，传统噬菌体展示具有几个缺点。例如，一些真核分泌的蛋白和细胞表面蛋白需要翻译后修饰，例如糖基化或广泛二硫键异构化，其在细菌细胞中是无法获得的。 [0005] 目前的酵母表面抗体展示系统例如冷捕获也具有多个缺点。在冷捕获抗体展示系统中，在低温下，来自宿主细胞转运囊泡的抗体释放过程延迟，从而使得分泌的抗体可以在细胞表面上就抗原结合进行测定。冷捕获方法具有低信噪比的缺点，并且对于靶抗原具有特异性的抗体的鉴定很大程度上依赖于抗体的细胞表达水平。 [0006] 亲和基质系统例如通过生物素将抗体与宿主细胞表面偶联，由此它们可以就抗原结合进行测定。亲和基质系统显示出在抗体克隆之间的交叉污染的高发生率。抗体可以变得从宿主细胞解偶联，并从而丧失它们与编码其免疫球蛋白链的多核苷酸的连接。 [0007] 全长抗体展示系统通过结合免疫球蛋白结合蛋白例如蛋白A将全长抗体栓系在宿主细胞表面上，所述免疫球蛋白结合蛋白融合至细胞表面锚蛋白。宿主细胞含有编码抗体免疫球蛋白链的多核苷酸。典型地，抗体的结合在免疫球蛋白结合蛋白在细胞表面上表达后发生。因此这个系统导致抗体与不表达该抗体的宿主细胞的一些错误结合。本系统和方法相对这些较早的方法提供了很多优势。 [0008] 发明概述本发明部分地提供了不具有目前可用系统的缺点的抗体展示系统。此展示系统允许发现具有特定的、所希望的生物学性质，例如Fc受体结合亲和力的新的Fc变体。其还允许对Fab区进行工程改造。先前的方法依赖于分泌到培养基中后在细胞表面上捕获抗体。本发明的方法和捕获系统通过在分泌前捕获抗体来避免相同培养物内克隆之间的交叉污染。有利地，本发明的实施方案允许共分泌展示的分子允许进一步的体外分析。 [0009] 本发明提供了抗体展示系统，其包括：（a）分离的宿主细胞； （b）诱饵，其包含融合到表面锚多肽或其功能片段上的免疫球蛋白轻链或其功能片段； （c）编码免疫球蛋白轻链可变区的一种或多种多核苷酸；和 （d）编码免疫球蛋白重链可变区的一种或多种多核苷酸。 [0010] 任选地，所述抗体展示系统进一步包含：（i）非栓系的全抗体或其抗原结合片段，其包含由所述多核苷酸编码的所述免疫球蛋白轻和重链；和/或 （ii）与免疫球蛋白重链复合的单价抗体片段，所述免疫球蛋白重链与诱饵的免疫球蛋白轻链复合。 [0011] 在本发明的实施方案中，编码免疫球蛋白轻链的所述一种或多种多核苷酸来自免疫球蛋白轻链的遗传上不同的群体；和/或，编码免疫球蛋白重链的所述一种或多种多核苷酸来自免疫球蛋白重链的遗传上不同的群体。 [0012] 在本发明的另一个附加实施方案中，所述宿主细胞包含编码诱饵的多核苷酸，其与可调节的启动子可操作地结合。 [0013] 在某些实施方案中，所述宿主细胞是毕赤酵母（Pichia）细胞或酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞。 [0014] 本发明还提供了分离的诱饵多肽，其包含轻免疫球蛋白链或其功能片段，任选地通过肽接头，融合到表面锚多肽或其功能片段，其中诱饵多肽任选地氨基末端融合信号肽。所述诱饵多肽包括表面锚多肽是SED-1或其功能片段。在某些实施方案中，所述轻免疫球蛋白链或其功能片段包含κ或λ免疫球蛋白恒定结构域。 [0015] 本发明涵盖任何编码任何多肽的任何分离的多核苷酸；包括所述多核苷酸的载体和包含所述多核苷酸和载体的宿主细胞。此外，本发明包括分离的宿主细胞（例如真核宿主细胞（包括中国仓鼠卵巢细胞，即CHO细胞），还包括低等真核酵母或丝状真菌宿主细胞，诸如毕赤酵母，例如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）细胞），其进一步包含一种或多种编码免疫球蛋白轻链的多核苷酸；和/或一种或多种编码免疫球蛋白重链的多核苷酸。在某些实施方案中，所述诱饵多肽位于细胞膜的表面上。 [0016] 本发明还提供了包含本发明的任一宿主细胞（参见，例如上文）的组合物，进一步包含含有所述免疫球蛋白轻和重链的非栓系的全抗体或其抗原结合片段；和/或诱饵/抗原结合片段或诱饵/抗体；任选地与抗原复合。 [0017] 本发明还提供了用于确定从宿主细胞分泌的抗体或其抗原结合片段是否特异性结合抗原的方法，包括将所述抗体展示系统与所述抗原接触，其中所述抗体展示系统包括：（a）分离的真核宿主细胞（例如毕赤酵母，例如巴斯德毕赤酵母），其包含编码免疫球蛋白轻链的一种或多种多核苷酸；和编码免疫球蛋白重链的一种或多种多核苷酸，所述免疫球蛋白重链与诱饵的免疫球蛋白轻链或其功能片段复合；和 （b）诱饵，其包含融合到表面锚多肽或其功能片段（例如，SED1）上的免疫球蛋白轻链或其功能片段； 并且确定包含所述诱饵与重和轻链免疫球蛋白的诱饵/抗原结合片段或诱饵/抗体是 否与所述抗原在细胞表面上特异性结合； 其中如果所述诱饵/抗原结合片段或诱饵/抗体特异性地在细胞表面结合所述抗原， 则确定所述分泌的抗体或其抗原结合片段特异性结合所述抗原。 [0018] 在本发明的实施方案中，所述方法进一步包括分离所鉴定的多核苷酸。在本发明的实施方案中，所述方法进一步包括抑制所述诱饵的表达，并确定所述分泌的抗体或其抗原结合片段对于所述抗原的亲和力。 [0019] 在本发明的又一个附加实施方案中，所述方法进一步包括重组表达由多核苷酸编码的免疫球蛋白链，并且任选地，分离包含所述免疫球蛋白的抗体或其抗原结合片段，并任选地产生药物制剂，包括组合所述抗体或其抗原结合片段和药学可接受的载体。 [0020] 本发明还提供用于制造抗体展示系统的方法，其包括：（a）提供分离的真核宿主细胞（例如，毕赤酵母诸如巴斯德毕赤酵母）， （b）向所述宿主细胞导入包含融合到表面锚多肽的轻链免疫球蛋白结构域的诱饵；和（i）编码免疫球蛋白轻链的一种或多种多核苷酸；和 （ii）编码免疫球蛋白重链的一种或多种多核苷酸。 [0021] 本发明还提供了抗体展示系统，其是本文所述方法的产物。 [0022] 本发明还提供了抗体展示系统，所述抗体展示系统利用能够产生与人样N-聚糖异源蛋白的任何糖基化改造的毕赤酵母作为宿主。 [0023] 本发明还提供了用于制造抗体或其抗原结合片段的方法，包括向包含诱饵的分离的真核宿主细胞（例如，毕赤酵母，诸如巴斯德毕赤酵母）导入一种或多种编码免疫球蛋白轻链的多核苷酸，和/或一种或多种编码免疫球蛋白重链的多核苷酸，所述诱饵包含融合到表面锚多肽或其功能片段的免疫球蛋白轻链或其功能片段；并在由此表达编码免疫球蛋白链的多核苷酸并从所述链形成抗体或其抗原结合片段的条件下培养宿主细胞；其中所述诱饵可操作地连接可调节的启动子并且当表达所述免疫球蛋白链时诱饵表达被抑制。 [0024] 本发明还提供了用于确定特异性结合抗原的抗体或其抗原结合片段上的糖的效果的方法，包括将所述抗体展示系统与所述抗原接触，其中所述抗体展示系统包括：（a）分离的受控制的糖基化真核宿主细胞（例如毕赤酵母诸如巴斯德毕赤酵母），其包含编码免疫球蛋白轻链的多核苷酸和编码免疫球蛋白重链的多核苷酸；和 （b）诱饵，其包含在所述宿主细胞的表面上融合到表面锚多肽或其功能片段（例如，SED1）的轻链免疫球蛋白或其功能片段； 其中所述诱饵的轻链免疫球蛋白在宿主细胞表面上与所述免疫球蛋白重链和免疫球 蛋白轻链复合，其中所述重或轻链包含所述糖； 确定是否所述诱饵/抗原结合片段特异性结合所述抗原； 确定包含所述糖的针对抗原的抗体或其抗原结合片段的结合亲和力；和 比较所述抗体或其抗原结合片段的亲和力与缺少所述糖的另外相同的抗体或其抗原 结合片段的亲和力； 其中如果包含所述糖的抗体或其抗原结合片段的亲和力高于缺少该糖的抗体或其抗 原结合片段的亲和力，则确定所述糖增加针对抗原的亲和力，和/或如果包含所述糖的抗体或其抗原结合片段的亲和力低于缺少该糖的抗体或其抗原结合片段的亲和力，则确定所述糖减少针对抗原的亲和力。 [0025] 本发明还提供了确定免疫球蛋白重链Fc区中的突变是否增加或降低所述链对Fc受体（例如FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32), FcγRIIB (CD32), FcγRIIIA (CD16a), FcγRIIIB (CD16b)）或对凝集素（例如，DC-SIGN (CD209)和小鼠直系同源SIGN-R，DCIR（树突状细胞抑制性受体））的结合的方法，包括使抗体展示系统与所述Fc受体或凝集素接触，其中所述抗体展示系统包括：（a）分离的真核宿主细胞（例如毕赤酵母诸如巴斯德毕赤酵母），其包含编码免疫球蛋白轻链的多核苷酸和编码包含一种或多种突变的免疫球蛋白重链的多核苷酸；和（b）诱饵，其包含在所述真核宿主细胞的表面上融合到表面锚多肽（例如，SED1）或其功能片段的轻链免疫球蛋白或其功能片段；其中所述诱饵的轻链免疫球蛋白在宿主细胞的表面上与重链免疫球蛋白复合形成诱饵/抗原结合片段或诱饵/抗体复合物；并确定所述诱饵/抗原结合片段或诱饵/抗体是否特异性结合所述Fc受体或凝集素；并确定针对Fc受体或凝集素的抗体或其抗原结合片段的结合亲和力；并比较所述抗体或其抗原结合片段的亲和力与缺少所述突变的另外相同的抗体或其抗原结合片段的亲和力； 其中如果包含所述突变的抗体或其抗原结合片段的亲和力高于缺少该突变的抗体或其抗原结合片段的亲和力，则确定所述突变增加重链针对Fc受体或凝集素的亲和力，和/或如果包含所述突变的抗体或其抗原结合片段的亲和力低于缺少该突变的抗体或其抗原结合片段的亲和力，则确定所述突变减少针对Fc受体或凝集素的亲和力。 [0027] 图2：Lc-Sed1p抗体展示系统的示意图。包含IgG轻链（Lc）的DNA序列通过柔性接头融合到细胞壁锚定配偶体，在此情况下使用酿酒酵母GPI锚Sed1p。当与可分泌的全长IgG分子在相同宿主中共表达时，锚定融合物（诱饵）的Lc部分在ER中与IgG分子的重链（Hc）区异源二聚体化形成二硫键桥。由于表面展示的半个IgG分子仍然可以与分泌的重和轻链（H+L）配对，此复合物导致全长IgG分子（两条重链与两条轻链配对，即H2+L2）的表面展示。同时，可溶性全长IgG的组装以等概率发生，导致二价体（H2+L2）分泌到培养基中。 [0028] 图3A-D：表达人IgG和Lc-SED1诱饵表达盒的糖基化改造的酵母的FACS分析。改造的细胞培养物通过孵育BMMY与PMTi抑制剂诱导。用APC635标记的小鼠抗人Fc标记细胞以及用带His标签的Hs FcγRI.、Hs FcγRIIB或Mm FcγRIIB，随后是DyeLight488标记的抗His抗体标记细胞并通过流式细胞术测定以检测展示的IgG的Fc结合。图3A显示无Lc-Sed1p诱饵的亲本抗Her2链。图3B显示包含Lc-Sed1p诱饵的抗Her2 IgG1链。图3C显示与在Fc区含有突变（F243A/V264A）的抗PCSK9 IgG2共表达的Lc-Sed1p。图3D显示与在Fc区含有突变F243A/V264A/S267E/L328F的抗PCSK9 IgG2共表达的Lc-Sed1p。 [0029] 发明详述本发明提供了用于抗体表面展示的方法和系统，其同时特征在于展示模式和全抗体分泌模式。宿主细胞分泌全抗体或其抗原结合片段（例如，Fab、Fab'、F(ab')2或单链抗体）且在细胞表面上展示诱饵/抗原结合片段或诱饵/抗体。这种方法利用轻免疫球蛋白链（例如，VL-CL，例如人）与细胞表面蛋白例如SED-1的融合物（例如在N或C末端融合）作为“诱饵”，所述诱饵共价偶联至细胞表面（例如细胞壁）或嵌入（部分或全部）细胞膜中（例如作为跨膜蛋白质），且与抗体或其抗原结合片段（例如来自克隆来源的或来自文库的单特异性抗体或片段）共表达。在本发明的实施方案中，在其中抗体分子通常二聚化以形成全抗体分子的内质网中，诱饵的轻链免疫球蛋白与所述抗体或其抗原结合片段的重链异二聚体化（例如形成单价抗体片段），其复合物展示在细胞表面上。细胞表面上的轻/重链复合物，例如单价抗体片段，可以结合抗原。 [0030] 尽管不希望被理论约束，本发明的实施方案通过表面展示抗体轻链并利用此轻链与在相同宿主中共表达的抗体分子的重链共价相互作用来实施。此相互作用将IgG分子栓系在细胞表面（参见图2）。此展示允许发现具有特定的、所希望的生物学性质，例如Fc受体结合亲和力的新的Fc变体。其还允许对Fab区进行工程改造。先前的方法依赖于分泌到培养基中后在细胞表面上捕获抗体。本发明的方法和捕获系统通过在分泌前捕获抗体来避免相同培养物内克隆之间的交叉污染。有利地，本发明的实施方案允许共分泌展示的分子允许进一步的体外分析。 [0031] 诱饵（例如，诱饵的轻链免疫球蛋白）和重链免疫球蛋白之间的复合物可以称为“诱饵/抗原结合片段”。 [0032] 在本发明的实施方案中，本发明的抗体展示系统和制造或使用该系统的方法具体排除其中诱饵包含任何融合到细胞表面蛋白例如Hc-Sed1p的重免疫球蛋白链或其片段的实施方案。 [0034] 在本发明的实施方案中，仍然发生不含诱饵的抗体或其抗原结合片段的形成，允许抗体或片段分泌到培养上清液中。可以使用分泌的抗体或片段，例如用于临床前研究，例如在分离后。 [0035] 如果需要，可以敲除或突变诱饵或可以关闭其表达以造成仅产生抗体或片段（不含诱饵）的株。 [0036] 分子生物学依照本发明，在本领域技术内可存在采用的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。此类技术在文献中充分说明。参见例如，Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Second Edition（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York（在本文中"Sambrook，等，1989"）；DNA Cloning: A Practical Approach，第I和II卷（D.N. Glover编辑1985）；Oligonucleotide Synthesis（M.J. Gait编辑1984）；Nucleic Acid Hybridization（B.D. Hames & S.J. Higgins编辑（1985））；Transcription And Translation（B.D. Hames & S.J. Higgins，编辑（1984））； Animal Cell Culture（R.I. Freshney，编辑（1986））；Immobilized Cells And Enzymes（IRL Press,（1986））；B. Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning（1984）； F.M. Ausubel，等（编辑），Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.（1994）。 [0037] 文库一般是相关但不同的多核苷酸的集合，所述多核苷酸一般在共同载体主链中。例如，轻链或重链免疫球蛋白文库可以含有在共同载体主链中的多核苷酸，其编码在其核苷酸序列中不同但相关的轻和/或重链免疫球蛋白；例如，所述免疫球蛋白例如在本发明的抗体展示系统中在其与其它免疫球蛋白形成复合物的能力中是功能上不同的，且结合特定抗原。例如，插入共同载体主链的所述多核苷酸可以通过仅一个或两个或几个核苷酸而不同，展示例如90%或更多的序列同一性（例如95或99%）。所述文库可以编码形成全抗体或其抗原结合片段（例如，Fab、Fab'、F(ab')2或单链抗体）的免疫球蛋白。 [0038] 当序列指导RNA聚合酶介导的编码序列转录成RNA、优选mRNA时，所述RNA随后可以剪接（如果它含有内含子）且翻译成由编码序列编码的蛋白，编码序列是“在细胞中的转录和/或翻译控制序列控制下”、“与细胞中的转录和/或翻译控制序列功能上结合”或“与细胞中的转录和/或翻译控制序列可操作地结合”。因此，编码诱饵的多核苷酸可以与启动子例如可调节的启动子或组成型启动子可操作地结合。 [0039] 本文讨论的多核苷酸构成本发明的部分。“多核苷酸”、“核酸”或“核酸分子”包括单链或双链的DNA和RNA。 [0040] 在本发明的实施方案中，例如编码本发明的抗体展示系统的免疫球蛋白链或组分（例如诱饵）的多核苷酸可以由天然调节（表达控制）序列侧接，或可以与异源序列结合，所述异源序列包括例如启动子、内部核糖体进入位点（IRES）和其它核糖体结合位点序列、增强子、应答元件、抑制基因、信号序列、多腺苷酸化序列、内含子、5'-和3'-非编码区等。 [0041] 例如编码本发明的抗体展示系统的免疫球蛋白链或组分的多核苷酸可以与启动子可操作地结合。在本发明的实施方案中，“启动子”或“启动子序列”是能够结合细胞中的RNA聚合酶（例如直接地或通过其它启动子结合蛋白或物质）且起始编码序列的转录的DNA调节区。启动子序列一般在其3'末端以转录起始位点为界，且向上游（5'方向）延伸，以包括在任何水平起始转录所必需的最小数目的碱基或元件。在启动子序列内可以发现转录起始位点（例如通过用核酸酶S1作图方便地定义的），以及负责RNA聚合酶结合的蛋白结合结构域（共有序列）。启动子可以与其它表达控制序列包括增强子和阻遏序列或与本发明的核酸结合。可以用于控制基因表达的启动子包括但不限于巨细胞病毒（CMV）启动子（美国专利号5,385,839和5,168,062）、SV40早期启动子区（Benoist，等，（1981）Nature290:304-310）、在劳斯肉瘤病毒的3'长末端重复序列中含有的启动子（Yamamoto，等，（1980）Cell 22:787-797）、疱疹胸苷激酶启动子（Wagner，等，（1981）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445）、金属硫蛋白基因的调节序列（Brinster，等，（1982）Nature 296:39-42）；原核表达载体例如β-内酰胺酶启动子（Villa-Komaroff，等，（1978）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731）、或tac启动子（DeBoer，等，（1983）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25）；还参见"Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American（1980）242:74-94；和来自酵母或其它真菌的启动子元件，例如Gal 4启动子、ADC（醇脱氢酶）启动子、PGK（磷酸甘油激酶）启动子或碱性磷酸酶启动子。 [0042] 术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”包括媒介物（例如质粒），通过其可以将DNA或RNA序列引入宿主细胞内，以便转化宿主并且任选促进所引入序列的表达和/或复制。在本发明的实施方案中，编码本发明的抗体展示系统的免疫球蛋白链或组分（例如诱饵）的多核苷酸可以在载体中。 [0043] 如本文讨论的，可以在本发明的组合物或方法中使用的宿主细胞包括真核生物例如低等和高等真核细胞以及原核生物。高等真核细胞包括哺乳动物、昆虫（例如草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）细胞）、和植物细胞（例如Protalix 细胞）。在本发明的实施方案中，宿主细胞是低等真核生物例如酵母或丝状真菌细胞，其例如选自任何毕赤酵母属细胞、巴斯德毕赤酵母、芬兰毕赤酵母（Pichia flnlandica）、喜海藻糖毕赤酵母（Pichia trehalophila）、Pichia koclamae、膜醭毕赤氏酵母（Pichia membranaefaciens）、微小毕赤酵母（Pichia minuta）（Ogataea minuta、Pichia lindneri）、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、柳 毕 赤 酵 母（Pichia salictaria）、Pichia guercuum、杰普毕赤酵母（Pichia pijperi）、树干毕赤酵母（Pichia stiptis）、甲醇毕赤酵母（Pichia methanolica）、毕赤酵母属、酿酒酵母、酵母菌属（Saccharomyces）、多形汉逊酵母（Hansβnula polymorpha）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、白色假丝酵母（Candida albicans）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、里氏木霉（Trichoderma reesei）、Chrysosporium lucknowense、镰刀菌属（Fusariυm）、禾谷镰刀菌（Fusa�um gramineum）、Fusarium venenatum、和粗糙链孢霉（Neuraspora crassa）。高等真核宿主细胞包括哺乳动物宿主细胞例如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、BHK细胞或NSO细胞。原核宿主细胞可以是例如细菌细胞，例如埃希氏杆菌属（Escherichia）（例如，大肠杆菌）、肠杆菌属（Enterobacter）、固氮菌属（Azotobacter）、欧文氏菌属（Erwinia）、芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、变形杆菌属（Proteus）、沙门氏菌属（Salmonella）、沙雷氏菌属（Serratia）、志贺氏菌属（Shigella）、根瘤菌属（Rhizobia）、透明颤菌属（Vitreoscilla）和副球菌属（Paracoccus）。大肠杆菌（E. coli）宿主细胞包括DHB4、BL21（其在Lon（Phillips等（1984）J. Bacteriol. 159:283）和OmpT蛋白酶中缺陷）、HB101、BL21 DE3、大肠杆菌AD494、大肠杆菌W3110（ATCC 27,325）、大肠杆菌294（ATCC 31,446）、大肠杆菌B和大肠杆菌X1776（ATCC 31,537）。其它菌株包括其为甲硫氨酸缺陷的大肠杆菌B834（Leahy 等（1992）Science 258，987）；其它菌株包括BLR菌株，以及K-12菌株HMS174和NovaBlue，其为改善质粒单体得率且可以帮助稳定含有重复序列的靶质粒的recA衍生物（这些菌株可以得自Novagen）。还参见美国专利号4,952,496、5,693,489和5,869,320，以及Davanloo，P.，等，（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81，2035-2039；Studier，F. W.，等，（1986）J. Mol. Biol. 189: 113-130； Rosenberg，A. H.，等，（1987）Gene 56: 125-135；和Dunn，J. J.，等，（1988）Gene 68: 259。 原核细胞也可以例如在培养基中在允许多肽例如免疫球蛋白多肽和/或诱饵的重组表达的条件下进行培养。包含此类基因和蛋白的此类方法和宿主细胞是本发明的部分。原核宿主细胞也可以用作本发明的抗体展示系统中的宿主细胞，如本文讨论的。 [0044] 如本文使用的，术语“N-聚糖”和“糖型”可互换使用且指N连接的寡糖，例如通过天冬酰胺-N-乙酰葡糖胺连接附着至多肽的天冬酰胺残基的那种。N连接的糖蛋白含有与蛋白中的天冬酰胺残基的酰胺氮连接的N-乙酰葡糖胺残基。在糖蛋白上发现的占优势糖是葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）、N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和唾液酸（例如N-乙酰神经氨酸（NANA））。 [0045] N-聚糖具有Man3GlcNAc2（"Man"指甘露糖；"Glc"指葡萄糖；并且"NAc"指N-乙酰基；GIcNAc指N-乙酰葡糖胺）的共同戊糖核心。N-聚糖在构成周围糖（例如，GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾液酸）的支链（天线）的数目方面存在差异，所述支链添加在Man3GlcNAc2（“Man3”）核心结构上，所述核心结构也称作“三甘露糖核心”、“戊糖核心”或“少甘露糖核心”。根据它们的支链组成对N-聚糖进行分类（例如，高甘露糖型、复杂型或杂合型）。“高甘露糖”型N-聚糖具有5个或更多个甘露糖残基。“复杂”型N-聚糖通常具有至少一个与1,3甘露糖臂相连的GlcNAc和至少一个与“三甘露糖”核心的1,6甘露糖臂相连的GlcNAc。复杂型N-聚糖还可具有半乳糖（“Gal”）或N-乙酰基半乳糖胺（“GalNAc”）残基，所述残基任选地被唾液酸或衍生物（例如，“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”是指神经氨酸，且“Ac”是指乙酰基）修饰。复杂型N-聚糖还可具有构成“二天线的”GlcNAc和核心岩藻糖（“Fuc”）的链内取代。复杂型N-聚糖还可具有在“三甘露糖核心”上的多个天线，经常称作“多天线的聚糖”。“杂合型”N-聚糖具有至少一个在三甘露糖核心的1,3甘露糖臂的末端上的GlcNAc和零个或更多个在三甘露糖核心的1,6甘露糖臂上的甘露糖。不同的N-聚糖也称作“糖型”。“PNG酶”或“聚糖酶”或“葡糖苷酶”指肽N-糖苷酶F（EC 3.2.2.18）。 [0046] 在本发明的实施方案中，在“真核宿主细胞”中的糖蛋白的O-糖基化是受控制的。本发明的范围包括其中O-糖基化是受控制的如本文讨论的分离的真核宿主细胞（例如巴斯德毕赤酵母），以及包含此类真核宿主细胞的抗体展示系统及其使用方法（如本文讨论的）。例如，其中O-聚糖占据和甘露糖链长是减少的。在低等真核宿主细胞例如酵母中，可以通过缺失编码一种或多种蛋白质O-甘露糖基转移酶的基因（Dol-PMan: 蛋白（Ser/Thr）甘露糖基转移酶基因）（PMTs）或通过在含有一种或多种Pmtp抑制剂的培养基中生长宿主来控制O-糖基化。因此，本发明包括例如包含编码PMTs的一种或多种基因的缺失的分离的真核宿主细胞、抗体展示系统及其使用方法（如本文讨论的），和/或例如，其中宿主细胞可以在包括一种或多种Pmtp抑制剂的培养基中培养。Pmtp抑制剂包括、但不限于：亚苄基噻唑烷二酮。可以使用的亚苄基噻唑烷二酮的实例是：5-[[3,4-双(苯基甲氧基)苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷醋酸; 5-[[3-(1-25苯基乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷醋酸；和5-[[3-(1-苯基-2-羟基)乙 氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷醋酸。 [0047] 在本发明的实施方案中，“真核宿主细胞”包括编码α-1,2甘露糖苷酶的核酸，其具有指导其用于分泌的信号肽。例如，在本发明的实施方案中，将宿主细胞改造为表达具有5.1-8.0、优选5.9-7.5的最佳pH的外源α-1,2甘露糖苷酶。在本发明的实施方案中，将外源酶靶向宿主细胞的内质网或高尔基体，在其中它修改N-聚糖例如Man8GlcNAc2，以获得MansGlcNAc2。参见美国专利号7,029,872。 [0048] 在本发明的实施方案中，“真核宿主细胞”是低等真核细胞（例如酵母，例如巴斯德毕赤酵母），通过缺失或破坏一个或多个β-甘露糖基转移酶基因（例如BMTl、BMT2、BMT3和BMT4）（参见，美国公开专利申请号2006/0211085），或使用干扰RNA、反义RNA等取消编码一个或多个β-甘露糖基转移酶的RNAs的翻译，所述低等真核细胞经遗传改造以消除具有α-甘露糖苷酶抗性N-聚糖的糖蛋白。本发明的范围包括此类分离的真核宿主细胞（例如巴斯德毕赤酵母），以及包含此类真核宿主细胞的抗体展示系统及其使用方法（如本文讨论的）。 [0049] “真核宿主细胞”还包括低等真核细胞（例如酵母和丝状真菌，例如巴斯德毕赤酵母），例如通过缺失或破坏磷酸甘露糖基转移酶基因PNO1和MNN4B之一或两者（参见例如美国专利号7,198,921和7,259,007），其可以包括缺失或破坏MNN4A基因或使用干扰RNA、反义RNA等取消编码一个或多个磷酸甘露糖基转移酶的RNA的翻译，所述低等真核细胞经遗传改造以消除具有磷酸甘露糖残基的糖蛋白。在本发明的实施方案中，“真核宿主细胞”已经遗传修饰为产生具有占优势地选自下述的N-聚糖的糖蛋白：复杂N-聚糖（唾液酸化的α2,3或α2,6连接；或去唾液酸化的（asialylated））、杂合型N-聚糖和高甘露糖N-聚糖，其中在本发明的实施方案中，复杂N-聚糖选自Man3GlcNAc2、GlcNAc(l-4)Man3GlcNAc2、Gal(1-4)GlcNAc(l-4)Man3GlcNAc2和NANA(l-4)Gal(1-4)Man3GlcNAc2、NAGNA(l-4)Gal(1-4)Man3GlcNAc2；在本发明的实施方案中，杂合型N-聚糖选自Man5GlcNAc2、GlcNAcMan5GlcNAc2、 GalGlcNAcMan5GlcNAc2和NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2、NAGNAGalGlcNAcMan5GlcNAc2；并且在本发明的实施方案中，高甘露糖N-聚糖选自Man6GlcNAc2、Man7GlcNAc2、Mang81cNAc2和Man9GlcNAc2。本发明的范围包括此类分离的真核宿主细胞（例如巴斯德毕赤酵母），以及包含此类真核宿主细胞的抗体展示系统及其使用方法（如本文讨论的）。 [0050] 如本文使用的，当它涉及在糖蛋白上的特定糖残基例如岩藻糖或半乳糖等的缺乏时，术语“基本上不含”用于指示糖蛋白组合物基本上缺乏含有此类残基的N-聚糖。就纯度而言表达的，基本上不含意指含有此类糖残基的N-聚糖结构的量不超过10%，且优选低于5%、更优选低于1%、最优选低于0.5%，其中百分比是按重量计或按摩尔百分比计。 [0051] 如本文使用的，当在N-聚糖结构上不存在可检测量的此类糖残基时，糖蛋白组合物“缺乏”特定糖残基例如岩藻糖或半乳糖。例如，在本发明的优选实施方案中，如本文讨论的，糖蛋白组合物通过低等真核生物产生，并且将“缺乏岩藻糖”，因为这些生物的细胞不具有产生岩藻糖化的N-聚糖结构所需的酶。因而，术语“基本上不含有岩藻糖”涵盖术语“缺少岩藻糖”。然而，即使如上所述组合物曾经含有岩藻糖化的N-聚糖结构，或含有有限但可检测量的岩藻糖化的N-聚糖结构，组合物也可以“基本上不含岩藻糖”。 [0052] 例如，在某些情况下，引入、消除或修饰在宿主细胞中表达的免疫球蛋白上的糖残基的宿主细胞例如如本文讨论的在本文中可以被称为“控制糖基化的宿主细胞”。 [0053] 本发明的范围包括分离的真核宿主细胞（例如，巴斯德毕赤酵母），例如，任何那些本文中所讨论的，包含本发明的抗体展示系统或其任何组分（例如，诱饵和/或编码诱饵的一种或多种多核苷酸；和/或免疫球蛋白链和/或编码免疫球蛋白链的一种或多种多核苷酸）；以及包括这样的真核宿主细胞的抗体展示系统，以及使用它们的方法（如本文中所讨论的）。 [0054] 荧光激活细胞分选（FACS）是专门类型的流式细胞术。它提供了基于每个细胞的特定光散射和荧光特征，用于将生物细胞的异质混合物分选到两个或更多容器内的方法，一次一个细胞。本发明涵盖使用例如如本文讨论的本发明的抗体展示系统的方法，其中通过FACS分选，从未结合的细胞或无足够结合水平的细胞中分选出与目的抗原结合（通过诱饵/抗原结合片段或诱饵/抗体）的真核宿主细胞。在本发明的实施方案中，FACS分选可以基于细胞是否由可检测的荧光标记进行标记（例如其中抗原自身或二级抗体是标记的）。例如，展示结合目的抗原的诱饵/抗体或诱饵/抗原结合片段的细胞可以基于荧光标记的抗原对诱饵/抗体或诱饵/抗原结合片段的结合；或基于荧光标记的二级抗体对结合诱饵/抗体或诱饵/抗原结合片段的抗原的结合进行鉴定。这些分选的标记的宿主细胞和包含这些分选的标记的宿主细胞的组合物也是本发明的部分。 [0055] 可调节的启动子是其表达可以被诱导或抑制的启动子。本发明的实施方案包括其中诱饵的表达通过可调节的启动子进行控制的抗体展示系统，以及如本文讨论的其使用方法。与可调节的启动子可操作地结合的编码诱饵的多核苷酸连同包括该多核苷酸的分离的真核宿主细胞一起也构成本发明的部分。在酵母中存在的可调节的启动子的例子包括GUT1启动子、GADPH启动子和PCK1启动子。 [0056] 在本发明的实施方案中，通过使细胞暴露于反义RNA或通过RNA干扰（例如微小RNA（miRNA）或小干扰RNA（siRNA））抑制多核苷酸（例如诱饵）在真核宿主细胞（例如诱饵）中的表达。本发明的实施方案包括使用抗体展示系统（例如如本文讨论的）的方法，其中诱饵的表达通过RNA干扰或反义RNA得到抑制。包含诱饵且还包含抑制诱饵表达的反义或RNA干扰分子的本发明分离的真核宿主细胞（例如如本文讨论的）也是本发明的部分。 [0057] Fc受 体 包 括，例 如 FcγRI (CD64)、FcγRIIA (CD32)、FcγRIIB (CD32)、FcγRIIIA (CD16a)和FcγRIIIB (CD16b)；并且凝集素包括例如DC-SIGN (CD209)和小鼠直系同源SIGN-R和DCIR（树突状细胞抑制性受体）。 [0058] 抗体本发明的宿主细胞（除了诱饵之外）还包括编码重和轻免疫球蛋白的多核苷酸，所述重和轻免疫球蛋白复合形成可以从宿主细胞分泌的抗体或其抗原结合片段。多核苷酸编码的重链可以与轻链免疫球蛋白复合形成包括一个或多个抗原结合位点的诱饵/抗原结合片段或诱饵/抗体。当在细胞表面上时，所述诱饵/抗原结合片段或诱饵/抗体可以结合抗原并且此结合可以被检测，例如通过FACS，从而表明所述重和轻链包含对于抗原具有特异性的结合位点。 [0059] 与本发明的用途（例如本发明的抗体展示系统的用途）结合鉴定的抗体或其抗原结合片段可以重新格式化成任何合适的形式。例如，来自使用抗体展示系统分离的全抗体的CDRs可以掺入不同构架（例如人构架）内，以生成包含从本发明的抗体展示系统中分离的CDRs的抗体或其抗原结合片段。用于产生嵌合、人源化和人抗体的方法是本领域众所周知的。参见例如，颁给Queen 等的美国专利号5,530,101，颁给Winter 等的美国专利号5,225,539，颁给Boss 等的美国专利号4,816,397。用于重新格式化抗体或其抗原结合片段或用于将CDRs从一个构架重新定位到另一个的此类方法是本领域常规和众所周知的。例如，抗体或抗原结合片段的CDRs可以用于生成单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、重组抗体、抗独特型抗体、人源化抗体和双特异性抗体；或其抗原结合片段例如纳米抗体（nanobodies）、Fab、Fab'、F（ab'）2、Fv片段；dsFv；（dsFv）2、ds双抗体；dsFv-dsFv’；单链抗体分子例如sc-Fv、sc-Fv二聚体（二价双抗体）；和双特异性双抗体。 [0060] 全抗体包含亚单位的四聚体。每个四聚体具有两对等同的多肽链，每对具有一条“轻”链（LC）和一条“重”链（HC）。基于轻链中的恒定结构域类型，将轻链（LCs）分类为κ或λ。基于重链中的恒定结构域类型，将重链（HCs）分类为γ、μ、α、δ或ε，并且将抗体的同种型分别限定为IgG（例如IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4）、IgM、IgA（例如IgA1或IgA2）、IgD或IgE。 [0061] 本发明包含用于制备抗体或其抗原结合片段的方法，其包括将编码免疫球蛋白轻链的一种或多种多核苷酸；和/或编码免疫球蛋白重链的一种或多种多核苷酸引入包含诱饵的分离的宿主细胞（例如真核宿主细胞，例如毕赤酵母，例如巴斯德毕赤酵母）内，所述诱饵包括融合至表面锚（例如SED-1）的免疫球蛋白轻链（例如VL-CL，例如人）或其功能片段；和在由此表达编码免疫球蛋白轻和重链的多核苷酸且由所述链形成抗体或其抗原结合片段的条件下培养宿主细胞。 [0062] 在本发明的实施方案中，所述诱饵与可调节的启动子可操作地结合，并且当所述免疫球蛋白链表达时，诱饵表达被抑制。在本发明的实施方案中，用反义RNA或通过RNA干扰抑制诱饵表达。 [0063] 本发明还提供了例如通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）用于确定抗体或其抗原结合片段的数量的方法。例如，在本发明的实施方案中，该方法包括培养包含分离的多肽的真核宿主细胞，所述分离的多肽包含诱饵多肽（所述诱饵多肽包含融合至表面锚多肽或其功能片段的免疫球蛋白轻链（例如VL-CL，例如人））；其中宿主细胞分泌全抗体或其抗原结合片段（任选地，抗体或片段从宿主细胞和/或培养基中分离）；且通过ELISA确定抗体或其抗原结合片段的数量。在本发明的实施方案中，诱饵的表达在定量前被抑制，从而使得宿主细胞仅表达且分泌全抗体。诱饵多核苷酸可以与被抑制的可调节的启动子可操作地结合，以便抑制诱饵表达。例如，在本发明的实施方案中，ELISA包含将抗原包被在固体基质上；使抗体或其抗原结合片段与抗原结合；使可检测标记的二级抗体与抗体或片段结合；且检测二级抗体。在本发明的实施方案中，二级抗体用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶进行标记。在本发明的实施方案中，通过使碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）与底物结合且测量板的吸光度（例如HRP底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）；HRP底物3,3'-二氨基联苯胺（DAB）；或HRP底物2,2'-连氮基-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）；或AP底物对硝基苯基磷酸酯）来检测标记。 [0064] 本发明还提供了用于确定抗体或其抗原结合片段（在本发明的抗体展示系统中其由真核宿主细胞分泌）对于抗原的亲和力的方法。例如，亲和力可以通过标准亲和ELISA、Biacore分析或竞争测定进行测定。 [0065] 抗体展示系统本发明提供了包含下述的抗体展示系统、组合物或试剂盒：（1）真核宿主细胞和（2）包含在N或C末端（任选通过肽接头例如 GGGS (x3)）融合至表面锚的免疫球蛋白轻链（例如VL-CL，例如人）的诱饵，所述诱饵任选与信号序列（例如α交配因子信号序列，例如来自酿酒酵母）连接；所述系统可以例如用于结合目的抗原的抗体和其抗原结合片段的鉴定中。因此，在本发明的实施方案中，该系统中的宿主细胞表达抗体或其抗原结合片段和/或诱饵/抗原结合片段或诱饵/抗体的一条或多条免疫球蛋白链（例如轻和重链，例如其中一条或多条链来自文库来源）。 [0066] 诱饵的轻链免疫球蛋白可以与非诱饵部分的轻链免疫球蛋白相同或不同。宿主细胞可以包含超过一种重链免疫球蛋白序列。 [0067] 抗体的诱饵/抗原结合片段（1）是诱饵的免疫球蛋白轻链（例如VL-CL，例如人）和免疫球蛋白重链之间的复合物；和（2）在宿主细胞的表面上时结合抗原。诱饵/抗原结合片段的实例是结合诱饵的细胞表面锚的全抗体的单价片段（即，单价抗体片段）。诱饵/抗体是诱饵的免疫球蛋白轻链（例如VL-CL，例如人）和免疫球蛋白轻和重链之间的复合物，其形成具有两条重和两条轻链的全抗体四聚体复合物，其在宿主细胞的表面上时结合抗原。 [0068] “单价抗体片段”包含抗体的一半，即包含三个配对的CDRs的与抗体轻链（VL-CL）结合的抗体重链（VH-CH1-CH2-CH3），例如其中CH1和CL由二硫桥结合，所述单价抗体片段能够可检测地结合抗原。 [0069] “诱饵”包含轻链免疫球蛋白，诸如，例如CL多肽或VL-CL多肽，例如在氨基末端或羧基末端融合到细胞表面锚，该诱饵具有本文所述的功能性质（例如，如下文阐述），其使诱饵能够在本发明的抗体展示系统中发挥作用。在本发明的实施方案中，诱饵的轻链免疫球蛋白被突变以便改善其在本发明的抗体展示系统中起作用的能力，例如可以加入或移除半胱氨酸或其它残基，以当与免疫球蛋白重链复合时，允许更广泛的二硫键桥形成。适合用在诱饵中的轻链免疫球蛋白当融合到表面锚蛋白时，能够与例如重链免疫球蛋白在真核宿主细胞的表面二聚化。在本发明的实施方案中，诱饵和免疫球蛋白重链之间的二聚化在按路线运送（routing）至细胞表面之前在细胞内发生，其中重链免疫球蛋白和诱饵一旦在细胞表面上就保持结合。在本发明的实施方案中，与诱饵共表达的全抗体或其抗原结合片段包含能够彼此二聚化形成单价抗体片段的轻和重链，该单价抗体片段还能够与诱饵的轻链和重链免疫球蛋白之间的复合物二聚化。（参见图2）。 [0070] 抗原可以是任何免疫原性分子或物质，例如多肽（例如寡肽）、细胞膜、细胞提取物或全细胞。多肽抗原包括例如下述多肽：趋化因子、细胞因子（例如炎性细胞因子或趋化因子）、受体、PCSK9、粒细胞-CSF；凝固因子例如因子VIII、因子IX和人蛋白C；可溶性IgE受体α链；尿激酶；胰凝乳蛋白酶和尿素胰蛋白酶抑制剂；IGF结合蛋白；胰岛素样生长因子1受体、血管表皮生长因子、表皮生长因子；生长激素释放因子；GITR（糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白质）、膜联蛋白V融合蛋白；IL-23p19、IL-23p40、IL-23R、IL12R-β1、TNFα（肿瘤坏死因子α）、TGFβ（转化生长因子β）、IL-10、IL-17、TSLP（胸腺基质淋巴细胞生成素）、血管抑素；血管内皮生长因子-2；髓样前体细胞抑制因子-1；骨保护素（OPG）、RANK（核因子κB受体活化因子）或RANKL（核因子κB受体活化因子配体）；在本发明的实施方案中，其中任何可以是人的。 [0071] “表面锚”是当与轻链免疫球蛋白或其功能片段（例如，VL-CL或CL或VL）融合时，被表达且定位至细胞表面的任何多肽，并且重链免疫球蛋白可以通过结合诱饵的轻链免疫球蛋白与表面锚复合。合适的细胞表面锚的实例是蛋白，例如但不限于任何下列蛋白：SED-1P、α-凝集素、Cwpl、Cwp2、GasI、Yap3、FIoIp1 Crh2、Pirl、Pir4、Tipl、Wpi、Hpwpl、Als3和Rbt5；例如，酿酒酵母CWP1、CWP2、SED1或GAS1；巴斯德毕赤酵母SP1或GAS1；或多形汉逊酵母（H. polymorpha）TIP1；或这些蛋白的其任何功能片段或变体，其描述于国际公开号WO09/111183。在本发明的实施方案中，表面锚是任何糖基磷脂酰肌醇锚定（GPI）蛋白。表面锚的功能片段包含全表面锚多肽的片段，其可以在一定程度上如全表面锚多肽所做的在本发明的抗体展示系统中发挥作用。 [0072] 如本文所讨论的，用于本发明的抗体展示系统的合适的真核宿主细胞是毕赤酵母细胞，例如巴斯德毕赤酵母。 [0073] 本发明的范围涵盖例如在细胞表面上包含诱饵的分离的真核宿主细胞（例如，巴斯德毕赤酵母），任选地其中诱饵与一条或多条免疫球蛋白链二聚化以形成诱饵/抗原结合片段或诱饵/抗体。本发明还包括这样的组合物，其包括进一步包含例如在液体培养基中分泌的抗体或其抗原结合片段的这种真核宿主细胞。 [0074] 本发明提供了例如使用本发明的抗体展示系统的方法。例如本发明包括用于鉴定下述的方法：（i）特异性结合目的抗原的抗体或其抗原结合片段，或诱饵/抗原结合片段或诱饵/抗体；和/或（ii）编码任意上述的免疫球蛋白重或轻多肽链的多核苷酸，或任意所述免疫球蛋白多肽链本身。在本发明的实施方案中，该方法包括：（a）在分离的真核宿主细胞（例如巴斯德毕赤酵母）中共表达诱饵（例如包括包含与细胞表面锚例如Sed1p连接的轻链免疫球蛋白的多肽）和一条或多条重和轻免疫球蛋白链（例如其中此类链中的一条或多条由来自文库来源的多核苷酸编码），从而使得在诱饵的轻链免疫球蛋白和一条或多条所述重链免疫球蛋白之间的复合物形成（例如诱饵/抗体或诱饵-抗原结合片段），并且位于细胞表面上；例如，其中宿主细胞用编码诱饵和/或免疫球蛋白链的一种或多种多核苷酸转化； （b）鉴定表达诱饵的真核宿主细胞，所述诱饵与重链免疫球蛋白二聚化，其对于抗原具有可检测的亲和力（例如可接受的亲和力）（例如，其可检测地结合抗原）。 [0075] 在本发明的实施方案中，形成包含导入宿主细胞的轻和重链免疫球蛋白的非栓系的、分泌的全抗体或其抗原结合片段。可以分析这些以确定它们是否具有可检测的亲和力。 [0076] 在本发明的实施方案中，所述全抗体或其抗原结合片段从宿主细胞分泌到培养基中。在本发明的实施方案中，所述分泌的全抗体或其抗原结合片段从宿主细胞和/或培养基分离。 [0077] 在本发明的实施方案中，在步骤（b）后，抑制宿主细胞中诱饵的表达，但不抑制全抗体或其抗原结合片段的表达。在本发明的这个实施方案中，宿主细胞仅表达全抗体但不表达以任何显著数量的多肽。在本发明的实施方案中，一旦诱饵的表达被抑制，就分析由宿主细胞产生的全抗体，以测定它是否具有可检测的亲和力（例如可接受的亲和力）；和，（c）如果观察到针对抗原的诱饵/抗原结合片段或诱饵/抗体的可检测结合，则鉴定所述抗体或抗原结合片段或多核苷酸，例如其中编码轻和/或重链免疫球蛋白的一种或多种多核苷酸任选从宿主细胞中分离。在本发明的实施方案中，确定多核苷酸的核苷酸序列。 [0078] 在本发明的实施方案中，宿主细胞群体表达共同诱饵和共同免疫球蛋白重链以及例如来自文库来源的多种不同轻链免疫球蛋白（非诱饵链），其中可以鉴定形成诱饵/抗原结合片段的个别轻链免疫球蛋白和与诱饵栓系且显示出抗原结合的全抗体。类似地，在本发明的实施方案中，宿主细胞群体表达共同诱饵和共同免疫球蛋白轻链以及例如来自文库来源的多种不同重链免疫球蛋白（非诱饵），其中可以鉴定形成诱饵/抗原结合片段的个别重链免疫球蛋白和与诱饵栓系且显示出抗原结合的全抗体。 [0079] 在本发明的实施方案中，具有编码重和轻链免疫球蛋白的多核苷酸的宿主细胞还可以用于在培养中表达分泌的非栓系的抗体（例如全抗体）或其抗原结合片段。例如，在本发明的这个实施方案中，诱饵的表达是任选被抑制的，从而使得不发生以显著数量的诱饵表达。宿主细胞随后在培养基中在由此分泌的、非栓系的抗体（例如全抗体）或其抗原结合片段由宿主细胞表达且分泌的条件下进行培养。非栓系的抗体或其抗原结合片段可以任选从宿主细胞和培养基中分离。在本发明的实施方案中，将免疫球蛋白链转移至分开的宿主细胞（例如缺乏抗体展示系统组分）用于重组表达。 [0080] 本发明的抗体展示系统可以用于评估给定糖基化模式对抗体或其抗原结合片段对于抗原的亲和力的作用。一般而言，可以评价包含改变的糖基化模式的诱饵/抗原结合片段或诱饵/抗体结合抗原的能力，这之后可以评价游离全抗体或其抗原结合片段的亲和力。例如通过使用当链表达时修饰糖基化模式的例如如本文讨论的宿主细胞和/或通过例如如本文讨论的在由此修饰糖基化模式的条件下培养宿主，可以修饰在抗体展示系统中表达的免疫球蛋白链上的糖基化模式。例如，在本发明的实施方案中，该方法包括使抗体展示系统与所述抗原接触；其中所述抗体展示系统包含：（a）分离的受控制的糖基化真核宿主细胞，其包含编码免疫球蛋白轻链的多核苷酸和编码免疫球蛋白重链的多核苷酸；和（b）诱饵，其包含在所述真核宿主细胞的表面上融合到表面锚多肽或其功能片段的轻链免疫球蛋白或其功能片段；其中所述诱饵的轻链免疫球蛋白在宿主细胞表面上与所述重链免疫球蛋白复合形成诱饵/抗原结合片段或诱饵/抗体，其中所述重或轻链包含所述糖；确定是否所述诱饵/抗原结合片段或诱饵/抗体特异性结合所述抗原；确定包含所述糖的针对抗原的抗体或其抗原结合片段的结合亲和力；和比较所述抗体或其抗原结合片段的亲和力与缺少所述糖的另外相同的抗体或其抗原结合片段的亲和力；其中如果包含所述糖的抗体或其抗原结合片段的亲和力高于缺少该糖的抗体或其抗原结合片段的亲和力，则确定所述糖增加针对抗原的亲和力，和/或如果包含所述糖的抗体或其抗原结合片段的亲和力低于缺少该糖的抗体或其抗原结合片段的亲和力，则确定所述糖减少针对抗原的亲和力。例如，缺少糖的抗体或抗原结合片段的亲和力可以在本发明的抗体展示系统中以类似的方式确定，或者其亲和力可以通过由已知的方法例如ELISA、Biacore™测定或竞争性测定测量亲和力来直接确定。 [0081] 诱饵表达可以通过几个可接受的方法中的任何得到抑制。例如，编码诱饵的多核苷酸可以通过可调节的启动子进行表达，其表达可以在宿主细胞中得到抑制。在本发明的实施方案中，诱饵表达通过RNA干扰、反义RNA、来自宿主细胞的编码诱饵的多核苷酸的突变或去除或多核苷酸的遗传突变得到抑制，从而使得宿主细胞不表达功能诱饵。 [0082] “可接受的亲和力”指抗体或抗原结合片段对于抗原的亲和力，其为至少约10-3 M-3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10或更大亲和力（更低数目），例如约10 M、10 M、10 M、10 M、10 M、10 M、10 M、10 -11 -12 M、10 M或10 M。 [0083] 在本发明的实施方案中，编码游离抗体或其抗原结合片段或诱饵/抗原结合片段或诱饵/抗体重和轻免疫球蛋白链的多核苷酸在一个或多个多核苷酸文库中，所述多核苷酸编码轻和/或重链免疫球蛋白（例如编码轻链的一个文库和编码重链的一个文库）。在这个实施方案中，当观察到宿主细胞表面上的表面锚定的诱饵/抗原结合片段或诱饵/抗体与目的抗原结合时，特定目的免疫球蛋白链区别于文库中的其它链。 [0084] 在本发明的实施方案中，在抗体展示系统中表达的重或轻链免疫球蛋白来自文库来源，并且其它免疫球蛋白链是已知的（即来自克隆来源的单链）。在本发明的这个实施方案中，如本文讨论的，抗体展示系统可以用于鉴定新文库链，当与已知链偶联时，所述新文库链形成期望抗体或其抗原结合片段。可替代地，抗体展示系统可以用于分析包含两条已知免疫球蛋白链的抗体或其抗原结合片段的表达和结合特征。 [0085] 本发明的抗体展示系统可用于评价免疫球蛋白重链中（例如，免疫球蛋白重链的Fc区，例如在重链的CH2和/或CH3结构域中）的一个或多个突变是否激动或拮抗重链对Fc受体（例如FcγRI (CD64)、FcγRIIA (CD32)、FcγRIIB (CD32)、FcγRIIIA (CD16a)、FcγRIIIB (CD16b)）或对凝集素（例如，DC-SIGN (CD209)）和小鼠直系同源SIGN-R，DCIR（树突状细胞抑制性受体）的结合。例如，在本发明的实施方案中，该方法包括使抗体展示系统与所述Fc受体或凝集素接触；其中所述抗体展示系统包含：（a）分离的真核宿主细胞，其包含编码免疫球蛋白轻链的多核苷酸和编码包含待评价的一种或多种突变的免疫球蛋白重链的多核苷酸，和（b）诱饵，其包含在所述真核宿主细胞的表面上融合到表面锚多肽或其功能片段的轻链免疫球蛋白或其功能片段；其中所述诱饵的轻链免疫球蛋白在宿主细胞的表面上与重链免疫球蛋白复合形成诱饵/抗原结合片段或诱饵/抗体；确定所述诱饵/抗原结合片段或诱饵/抗体是否特异性结合所述Fc受体或凝集素；确定针对Fc受体或凝集素的抗体或其抗原结合片段的结合亲和力；并比较所述抗体或其抗原结合片段的亲和力与缺少所述突变的另外相同的抗体或其抗原结合片段的亲和力；其中如果包含所述突变的抗体或其抗原结合片段的亲和力高于缺少该突变的抗体或其抗原结合片段的亲和力，则确定所述突变增加针对Fc受体或凝集素的亲和力（激动结合），和/或如果包含所述突变的抗体或其抗原结合片段的亲和力低于缺少该突变的抗体或其抗原结合片段的亲和力，则确定所述突变减少针对Fc受体或凝集素的亲和力（拮抗结合）。例如，缺少突变的抗体或抗原结合片段的亲和力可以在本发明的抗体展示系统中以类似的方式确定，或者其亲和力可以通过由已知的方法例如ELISA、Biacore™测定或竞争性测定测量亲和力来直接确定。在本发明的实施方案中，包含突变的重链免疫球蛋白（例如，免疫球蛋白重链的Fc区，例如，在重链的CH2和/或CH3结构域中）来自于文库来源，其中文库中的克隆在重链中（例如，免疫球蛋白重链的Fc区，例如，在重链的CH2和/或CH3结构域中）包含一个或多个突变。 [0086] 在本发明的实施方案中，通过使细胞与荧光标记的抗原（例如生物素标记）一起孵育，且通过荧光激活的细胞分选（FACS）分选/选择特异性结合抗原的细胞，可以检测表达与抗原结合的通过锚例如SED1与细胞栓系的诱饵/抗原结合片段或诱饵/抗体的细胞。从而在本发明的实施方案中，使用荧光激活细胞分选（FACS）鉴定且分选表达与抗原结合的诱饵/抗原结合片段或诱饵/抗体的真核宿主细胞。例如，在本发明的实施方案中，用荧光抗原或同样与抗原结合的荧光二级抗体标记表达在细胞表面上与抗原结合的诱饵/抗原结合片段或诱饵/抗体的细胞。荧光标记在FACS分选过程中被检测且用作用于分选的信号。标记的细胞指示结合抗原的细胞表面表达的诱饵/抗原结合片段或诱饵/抗体的存在，且收集在一个器皿中，而不表达信号的细胞收集在分开器皿中。相应地，本发明包括包含下述步骤的方法用于确定来自文库的抗体或其抗原结合片段是否与抗原特异性结合： （1）将下列转化到包含编码诱饵的多核苷酸的真核宿主细胞（例如巴斯德毕赤酵母）内： （i）一个或多个免疫球蛋白文库，含有编码轻和重链免疫球蛋白的多核苷酸； （ii）一个或多个免疫球蛋白文库，含有编码轻链免疫球蛋白和单一克隆重链免疫球蛋白的多核苷酸；或 （iii）一个或多个免疫球蛋白文库，含有编码重链免疫球蛋白和单一克隆轻链免疫球蛋白的多核苷酸； 其中所述链能够形成抗体或其抗原结合片段； （2）在液体培养基中培养转化的细胞； （3）允许诱饵在细胞表面上表达； （4）用荧光标记的抗原或与荧光标记的二级抗体结合的抗原标记细胞； （5）使用FACS分选且分离荧光标记的细胞进行一轮； （6）再培养标记的、分选的细胞； （7）允许诱饵在细胞中表达； （8）用荧光标记的抗原或与荧光标记的二级抗体结合的抗原标记细胞； （9）使用FACS分选且分离荧光标记的细胞第二轮； （10）在固体培养基上再培养标记的、分选的细胞，从而使得个别细胞克隆生长成离散的细胞菌落； （11）鉴定对于抗原具有亲和力的菌落； （12）在液体培养基中培养来自鉴定菌落的细胞，且分离含有包含免疫球蛋白轻和重链的非栓系全抗体或其抗原结合片段的上清液；其中，诱饵的表达任选被抑制； （13）确定来自上清液的非栓系的抗体或其抗原结合片段对于抗原的亲和力，且鉴定具有可接受的亲和力（例如通过Biacore分析）的克隆； （14）确定编码重和轻链免疫球蛋白的鉴定克隆中的多核苷酸的核苷酸序列。 [0087] 本发明的范围还包括用于鉴定编码抗体或其抗原结合片段的重链和轻链免疫球蛋白的多核苷酸或用于鉴定显示出高稳定性的抗体或其抗原结合片段的方法。此类方法包括下述步骤：（a）在真核宿主细胞（例如巴斯德毕赤酵母）中共表达诱饵和编码重和轻链的多核苷酸，同时对包含所述链的抗体实施变性剂； 在本发明的实施方案中，变性剂以本领域普通技术人员从业者将预期至少部分变性抗体且因此抑制其与抗原结合的能力的浓度或量或量级（例如在足够高的温度）存在。例如，可能的变性剂包括尿素（例如2、3、4、5或6 M或更多）、去污剂例如triton X-100（例如1%或更多）、二硫苏糖醇（DTT）（例如250 mM或500 mM或更多）、盐酸胍、光（例如紫外线或可见光）、极端pH（例如1、2、3、14、13或12）或高于约4℃的温度例如37℃（例如42℃、48℃或50℃）或其任何组合（例如500 mM DTT/6 M尿素）。 [0088] （b）鉴定表达诱饵/抗原结合片段或诱饵/抗体的真核宿主细胞，所述片段对于抗原具有可检测的亲和力（例如可接受的亲和力）；在本发明的实施方案中，还分析包含等同于与诱饵复合的那些的轻和重链可变区的全抗体，以确定它们是否具有可检测的亲和力。 [0089] 在本发明的实施方案中，全抗体从宿主细胞中分泌。在本发明的实施方案中，全抗体从宿主细胞中分离。 [0090] 在本发明的实施方案中，抑制宿主细胞中诱饵的表达，但不抑制全抗体的表达。在本发明的这个实施方案中，宿主细胞仅表达全抗体但不表达以任何显著数量的多肽。在本发明的实施方案中，一旦诱饵的表达被抑制，就分析由宿主细胞产生的全抗体，以测定它是否具有可检测的亲和力（例如可接受的亲和力）；和，（c）从细胞中鉴定所述抗体或编码重和轻链的多核苷酸，其中一种或多种多核苷酸任选从宿主细胞中分离；其中在变性剂的存在下显示出对于抗原的亲和力的抗体确定为显示出高稳定性。在本发明的实施方案中，确定多核苷酸的核苷酸序列。 [0091] 在本发明的实施方案中，sed1p是酿酒酵母sed1p，其在本发明的实施方案中包含下列氨基酸序列：(SEQ ID NO:1) 编码sed1p的相应核苷酸序列（SED-1）是（SEQ ID NO:2）： [0092] 在本发明的实施方案中，诱饵连接到信号序列，诸如酿酒酵母的α交配因子信号序列（例如MRFPSIFTAVLFAASSALA (SEQ ID NO: 3)），其由核苷酸序列SEQ ID NO:4编码：。 [0093] 在本发明的实施方案中，诱饵包含融合到Sed1p多肽的人轻链免疫球蛋白结构域，所述Sed1p多肽包含氨基酸序列(SEQ ID NO: 5)，其中轻链免疫球蛋白结构域加下划线并且接头用黑体，随后是Sed1p序列： [0094] 编码SEQ ID NO: 5的相应的核苷酸序列是SEQ ID NO:6（其中轻链序列加下划线，接头序列用黑体，随后是纯文本的SED-1 序列）：实施例 [0095] 本发明意在举例说明本发明并且不在于限制其。下文公开的方法和组合物（例如，多肽、多核苷酸、质粒、酵母细胞）落入本发明的范围。 [0096] 实施例1. 表达盒的构建将编码细胞表面锚定蛋白酿酒酵母Sed1p的多核苷酸连接到编码人IgG2抗PCSK9 （1F11）轻链（Lc）的核酸序列，其中所述锚定蛋白酿酒酵母Sed1p固有地包含附着的糖基磷脂酰肌醇锚定（GPI）翻译后修饰，将蛋白锚定在酵母细胞壁上。 [0097] 使用密码子优化的人IgG2 Lc（VL+CL）片段的序列构建包含抗PCSK9 Lc诱饵盒的质粒pGLY11714，其合成并融合到框架中酿酒酵母α交配因子信号序列的核酸序列的3'末端。接头(GGGS, SEQ ID NO:10)的三个的核酸序列用于连接Lc的核酸序列3'末端到酿酒酵母Sed1p的5'末端。由合同研究组织（contracting research organization，CRO）Genewiz将构建体在EcoRI –SalI处亚克隆入pGLY9008（替换Fc）。如上述实施例中，所获得的质粒使得能够将Lc-SED1盒递送在巴斯德毕赤酵母AOX1启动子的控制下，所述AOX1启动子在巴斯德毕赤酵母中的URA6 基因座。 [0098] pGLY11714的核酸序列(SEQ ID NO: 7) [0099] 抗PCSK9轻链的氨基酸序列（SEQ ID NO:8） [0100] α交配因子-抗PCSK9 Lc（GGGS，SEQ ID NO:10）接头-酿酒酵母Sed1p（SEQ ID NO:9）的氨基酸序列 [0101] 实施例2. 糖基化改造的单克隆抗体生产菌株为了测试此系统用于在酵母细胞壁上展示全长抗体（包含人IgG），将pGLY11714引入巴斯德毕赤酵母菌株，所述菌株先前被选择并创造作为人抗Her2或抗PCSK9 IgG的表达宿主（如PCT/US2011/62286中所述）。包括空的巴斯德毕赤酵母菌株作为对照。在此研究中包括不同的IgG形式（IgG1、IgG2和IgG4）以建立捕获不同抗体形式的能力。 [0102] 表1：所使用的菌株菌株 抗体 IgG形式 YGLY8316 空 空 YGLY13979 抗Her2 人IgG1 YGLY21352 抗PCSK9人IgG2 YGLY23236 抗PCSK9人IgG4 YGLY22982 抗PCSK9唾液酸化的人IgG2(F243A/V264A) YGLY25266 抗PCSK9唾液酸化的人IgG2(F243A/V264A/S267E/L328F) [0103] 表1中糖基化改造的巴斯德毕赤酵母单克隆抗体生产菌株在50 mL BMGY培养基中生长，直至在600 nm处的培养物光密度是2时。将细胞用1 M山梨糖醇洗涤三次，并且重悬浮于1 mL 1 M山梨糖醇中。将约1-2微克SpeI线性化的pGLY11714 与这些感受态细胞混合。使用对于核酸电穿孔到巴斯德毕赤酵母内特异性的制造商程序，用BioRad电穿孔仪执行转化。将1毫升回收培养基加入细胞中，所述细胞随后在具有50 μg/mL亚砷酸盐的酵母-大豆胨-右旋糖（YSD）培养基上铺平板。 [0104] 实施例3. Lc-Sed1p展示酵母的生长和诱导通过检测细胞表面上的Fc片段，将可以确立可以使用Lc-Sed1p系统展示抗体，因为对于Fc在细胞表面上展示的唯一途径是通过轻链和重链的异源二聚化。为此，使用在96深孔板中的600 μL BMGY或在250 mL摇瓶中的50 mL BMGY接种表达人IgG和Lc-SED1诱 饵表达盒的糖基化改造的酵母两天。通过离心收集细胞且弃去上清液。根据国际专利申请公开号WO2007/061631中所述的方法，通过在具有PMTi抑制剂的300 μL或25 mL BMMY中孵育过夜诱导细胞。 [0105] 实施例4表面展示抗体的流式细胞术检测为了确定使用这种方法的表面展示抗体的效率，将细胞用检测人抗体分子的Fc片段 的APC 635标记的小鼠抗人Fc进行标记，并且通过流式细胞术进行处理。简言之，在生长至在600 nm处的光密度2后，将每种培养物通过离心形成团块且在100 μL PBS中洗涤。 细胞在室温（RT）在含有荧光标记（APC635）的小鼠抗人Fc轻链的100 μL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中孵育30分钟，并且在100 μL PBS中洗涤。在流式细胞仪中分析前，一百微升PBS用于重悬浮团块。(参见图3A-D)。 [0106] 使用共表达Fc-Sed1p诱饵和抗Her2（图3B）、或Lc-Sed1p诱饵和抗PCSK9变体（图3C和D）的细胞进行流式细胞术分析。制备其中仅表达全长抗Her2抗体（H2+L2）的空菌株（图3A）或表达Lc-Sed1p的菌株的对照。发现共表达抗Her2和Lc-Sed1p诱饵（图3B）或抗PCSK9与Lc-Sed1p诱饵（图3C）的菌株展示显著水平的抗Fc结合，而缺少Lc-Sed1p诱饵的菌株显示背景信号水平（图3A），因此表明Lc-Sed1p诱饵捕获包含Fc的重链片段。在图3A-D中，比较了来自这些实验的荧光强度。图3B显示抗Her2展示细胞的不同荧光强度，而图3C显示抗PCSK9展示细胞的强度，以及不包含Lc-Sed1p诱饵的亲本菌株（图3A）。 [0107] 实施例5用于调节对Fc受体的结合的展示形式的阐释本发明的展示形式促进Fc的工程改造以能够调节对Fc受体的结合。测试Fc受体对 不同的展示的IgG的结合以阐释此理论。使用人Fcγ受体I和人Fcγ受体IIb，因为它们对不同Fc形式具有不同亲和力。使用小鼠Fcγ受体IIb作为对照。100nM的每种受体（His标签的R和D系统）与如早先所述600nm光密度2的每种培养物在100μL磷酸缓冲盐水中在RT孵育30分钟，然后在100μL相同缓冲液中清洗。将1微升FITC缀合的抗His片段加入到在100微升PBS中的细胞，并在RT孵育15分钟。沉淀的细胞在100微升PBS 中清洗并重悬在100微升PBS中，然后在流式细胞系统中分析。 [0108] 如图3A所示，来自表达全长抗体而无Lc-Sed1系统的菌株的细胞用抗His FITC不染色，而表达IgG连同Lc-Sed1p的菌株与抗His FITC反应，与抗体、IgG类型或糖型无关，表明所有Fc形式都能够结合Fcγ受体I。这些结果表明轻和重链在细胞表面充分组装。 [0109] 相反，仅在Fc中包含4个突变（F243A/V264A/S267E/L328F）的菌株与抗His FITC反应，表明Fc形式能够结合Fcγ受体IIb（图3D）。这与从可溶性IgG获得的Biacore数据一致。这表明此方法可以用于工程改造Fc片段具有所需的Fcγ受体结合用于增强生物学和药代动力学性质。 [0110] 本发明不限于本文所述具体实施方案的范围内。事实上，本发明的范围包括本文具体阐述的实施方案和本文未具体阐述的其它实施方案；本文具体阐述的实施方案不一定预期是穷尽的。除了本文描述那些外的本发明的多个修饰根据前述说明书对于本领域技术人员将是显而易见的。此类修饰预期落于权利要求的范围。 [0111] 本申请通篇引用专利、专利申请、出版物、产品说明书和方案，其公开内容为了所有目的以其整体引入本文作为参考。 |
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