脂肪酶是羧酸酯水解酶并且广泛用于食品和表面活性剂工业以及各种 手性化合物的合成。在许多来源于微生物的脂肪酶中，来自南极洲假丝酵 母(Candida antarctica)的脂肪酶B(此后称为“CALB”)由317个氨基 酸组成并且形成α/β水解酶的形式。
CALB由于能够特异地光学转化仲醇和仲胺(Rotticci等，Chembiochem.， 2001，2，766)而在光学异构体的选择中和聚酯的合成中非常重要(Anderson 等，Biocatal.Biotransform.，1998，16，181)，并且可以用于医学供应品和农业 化学品的各种生产中。
最近，关于在单细胞生物如酵母、细菌(包括噬菌体)等的细胞表面 表达外源蛋白的研究已经在活跃地进行并且用于产生新疫苗、筛选抗原和 抗体、将有用的酶固定到细胞表面上，等等。例如，已经使用一种酵母(酿 酒酵母，Saccharomyces cerevisiae)进行了细胞表面上蛋白质表达的研究。 通过利用高等真核细胞的胞内分泌系统，该酵母诱导了在培养基中分泌有 用的外源蛋白而不损失其活性，这使得该酵母是作为通过遗传重组技术生 产重要外源蛋白的宿主细胞的有用候选者。一种众所周知的细胞壁蛋白- -α-凝集素已经成为酵母的表面表达的主要靶标(Schreuder等，Yeast.， 1993，9，399)。由于α-凝集素或其他细胞壁蛋白，各种酶如α-半乳糖苷 酶、葡糖淀粉酶、脂肪酶、角质酶等可以在细胞表面上稳定地表达。
此外，根据最近报导，通过在细胞中同时表达各种酶使得工业有效的 生物催化剂的开发得以实现(Murai等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，1999，51， 65)。到今天为止，通过破碎细胞、分离所表达的酶，并将酶固定在载体上 或者用渗透溶剂如甲苯处理，已经制备了用于生产食品或医学供给品的用 于生物转化的微生物来源的生物催化剂。但是这些方法因为高成本和酶的 失活而具有低生产率的问题。
最近，已经进行了使用酿酒酵母的筛选方法的研究，该酿酒酵母适于 在细胞表面表达靶蛋白。作为一种真核细胞，酵母具有类似于高等动物的 蛋白质合成过程，并且具有通过FACS(荧光激活细胞分选仪)的细胞选 择的足够大小，FACS可以辨别具有微小差异的细胞(VanAntwerp和 Wittrup.，Biotechnol.Prog.，2000，16，31)。使用酵母表达系统，可以简化基 因和文库构建的操作。而且，可以克服表达水平的差异。还可能通过用表 面展示系统筛选，选择最适合表面表达的酶。用该方法选择的酶可以极大 地增加表面表达的酶的用途。已经多次报导用FACS筛选展示具有增强的 亲和力的抗体、抗原或T-细胞受体的酵母菌株(Schreuder等，Vaccine.，1996， 14，383，Kieke等，Protein.Eng.，1997，10，1303，Kieke等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA.，1999，96，5651)，然而还没有报导展示具有提高活性的酶的株系 的筛选。到目前为止只报导了使用来自假单胞菌变种(Pseudomonas sp) 的冰晶核蛋白通过表面展示系统筛选具有提高的活性的羧甲基纤维素酶 的情况(Kim等，Appl.Environ.Microbiol.，2000，66，788)。
本发明人从工业酵母多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)分离了新 的细胞壁粘附-介导蛋白并使用其开发了在细胞表面表达靶蛋白的新的表 面展示系统(PCT/KR00/00819)。多形汉逊酵母是具有强诱导型启动子的工 业有效菌株，其在高温和有机溶剂中都具有稳定性，生长快并且可以极好 地产生外源重组蛋白。因此，该菌株非常适于生物反应系统和诸如脂肪酶 的酶的生产。
为了大量产生脂肪酶——一种有用的生物催化剂，本发明人已经使用 在细胞表面表达靶蛋白的表面表达系统(PCT/KR00/00819)构建了南极洲 假丝酵母脂肪酶B突变文库，并且已经从该文库选择了具有极好脂肪酶活 性的突变菌株，并通过开发从该酵母菌株大量生产突变脂肪酶蛋白的新方 法，最终完成了该发明。
优选实施方案详述
本发明提供了筛选具有改良的酶活性的突变脂肪酶的方法，该方法包 含以下步骤：1)将脂肪酶基因克隆到表面展示载体中，2)通过诱变PCR， 使用步骤1的表达载体中的脂肪酶基因作为模板，制备突变脂肪酶基因文 库，3)将步骤2的突变脂肪酶基因文库和表面展示载体转化到宿主细胞 中，和4)测量所转化的宿主细胞的表面中展示的突变脂肪酶的活性并从 突变库(pool)中选择具有改良的活性的脂肪酶。
本发明还提供了通过本发明的筛选方法制备的突变脂肪酶蛋白，其中， SEQ.ID.No 14表示的南极洲假丝酵母脂肪酶B的#219亮氨酸和/或# 278亮氨酸被其他氨基酸代替。
本发明还提供了编码突变的脂肪酶蛋白的基因。
本发明还提供了含有以上基因的表达载体。
本发明还提供了其中导入了上述表达载体的转化体。
本发明还提供了通过培养上述转化体生产突变脂肪酶蛋白的方法。
本发明的其他特征将在下文出现。
本发明涉及筛选具有改良的酶活性的突变脂肪酶的方法，该方法包括 下列步骤：
1)将脂肪酶基因克隆到表面展示载体中；
2)通过诱变PCR，使用步骤1的表面展示载体中的脂肪酶基因作为 模板，制备突变脂肪酶基因文库；
3)将步骤2的突变脂肪酶基因文库和表面展示载体转化到宿主细胞 中；和
4)测量所转化的宿主细胞的表面中展示的突变脂肪酶的活性并从突变 库中选择具有改良的活性的脂肪酶。
本发明中“表面展示载体”指在细胞表面上稳定表达外源蛋白的载体。
在本发明中，SEQ.ID.No 14所表示的并且来自南极洲假丝酵母的南 极洲假丝酵母脂肪酶B优选被用于克隆到表面展示载体中。
用于本发明筛选的表面展示载体是在转化体的表面表达外源蛋白质的 载体并且其特征在于包括启动子基因、编码分泌信号序列的基因、脂肪酶 基因或突变的脂肪酶基因、表面展示介导基因和终止子基因。
优选从GAPDH、PGK、ADH、PHO5、GAL1、GAL10、SED1、MOX、 TEF和TPI中选择启动子基因，从Mfα、PHO6、SUC2、AMY、SED和 杀伤毒素(killer toxin)中选择编码分泌信号序列的基因，从SED1、PIR2、 TIP1、CWP1、GAS1和WSC1中选择表面展示介导基因——可以在细胞 表面表达脂肪酶的一种因子，但是并不总是限于此。
作为用于本发明中筛选方法的步骤3中的转染的宿主细胞，可以选择 酵母如假丝酵母属(candida)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、汉逊酵母 属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、 裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、Yarrowia和酵母(Saccharomyces)属、 丝状真菌如曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)和根霉属(Rhizopus) 或者细菌如埃希氏菌属(Escherichia)和芽孢杆菌属(Bacillus)，但是其 不仅仅限于这些。
在本发明的优选实施方案中，本发明人使用了导入转化体(保藏号： KCTC 0824BP、KCTC 0825BP、KCTC 0826BP、KCTC 0827BP和KCTC 0828BP)的表面展示载体，这些转化体保藏在Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology的基因储藏库中(韩国专利公开号 2002-0010428)。
根据本发明的筛选方法，实施PCR以在脂肪酶基因被克隆到表面展示 载体中后诱导该基因的突变。用突变基因转染宿主细胞。然后，该突变基 因在宿主细胞中表达。结果，突变脂肪酶位于转化体的表面。从而，通过 测量在转化体表面表达的突变脂肪酶的活性，可以容易并快速筛选具有高 活性的突变脂肪酶。
本发明还提供了通过本发明的筛选方法制备的突变脂肪酶蛋白，其中， SEQ.ID.No 14表示的南极洲假丝酵母脂肪酶B的#219亮氨酸和/或# 278亮氨酸被其他氨基酸代替。
本发明提供了突变蛋白，其中，SEQ.ID.No 14表示的南极洲假丝酵 母脂肪酶B(此后称为“CALB”)的#219亮氨酸和/或#278亮氨酸被其 他氨基酸代替。
本发明的突变蛋白的疏水氨基酸是SEQ.ID.No 14所表示的CALB的 #219氨基酸，该氨基酸优选被选自谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、 丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的亲水氨基酸代替，并且更优选被谷 氨酰胺置换，导致该突变蛋白由SEQ.ID.No 11表示。
此外，SEQ.ID.No 14表示的CALB的#278氨基酸亮氨酸优选被选 自脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的氨基酸代替，更优选被 脯氨酸置换，使得其由SEQ.ID.No 9表示。
此外，SEQ.ID.No 14表示的CALB的#219氨基酸亮氨酸优选被选 自谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸和谷 氨酸的亲水氨基酸代替，并且同时，#278氨基酸赖氨酸优选被选自脯氨 酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的氨基酸代替。#219氨基酸和 #278氨基酸更优选分别被谷氨酰胺或脯氨酸代替，在同一蛋白中，使得 其由SEQ.ID.No 10表示。
CALB的#219氨基酸是暴露在表面上的疏水氨基酸。当上面的亮氨 酸被亲水氨基酸代替时，在水中的稳定性增加了，导致突变蛋白的酶活性 增加。CALB的#278氨基酸位于CALB的第10个α-螺旋，已经报导该 螺旋作为脂肪酶活性位点的盖子(Uppenberg等，Structure.，1994，2，293)。 许多疏水氨基酸被包括在第10个α-螺旋区内。用脯氨酸置换其中的亮 氨酸导致螺旋结构的稳定性增加，产生弯曲结构(改变方向)并通过改变 活性位点的暴露水平增加活性。#278氨基酸亮氨酸位于#223氨基酸天冬 氨酸和#188氨基酸谷氨酸附近，赋予活性位点的表面上的电荷。如果#278 氨基酸被脯氨酸代替，那么结构改变，其中被疏水性赖氨酸占据的空间变 窄并且活性位点延长，使得#223和#188带电氨基酸的更稳定的空间并 且为水分子得到更大空间。水分子稳定了活性位点上的底物并导致活性增 加。
使用产生突变脂肪酶蛋白的分泌形式的转化体的细胞培养上清液测量 酶活性。结果，对具有SEQ.ID.No 9，No 10和No 11所表示的氨基酸序列 的突变蛋白的底物的亲和力彼此类似，但是分别比野生型CALB高5倍、 10倍和3倍的酶活性(见表3)。
还用在表面表达本发明的突变脂肪酶蛋白的转化体的全细胞级分测量 了酶活性。结果，具有SEQ.ID.No 9和No 10所表示的氨基酸序列的突 变蛋白显示出比野生型CALB高5倍的活性(见表1)。
从而，证实本发明的突变脂肪酶蛋白具有比野生型脂肪酶蛋白更高的 酶活性。
本发明还提供了编码突变脂肪酶蛋白的基因。
本发明的基因优选编码其中选自谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、 丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的亲水氨基酸代替CALB的#219氨 基酸的突变蛋白，该基因更优选由SEQ.ID.No 8表示。
还优选本发明的基因编码突变蛋白，其中CALB的#278氨基酸被选 自脯氨酸。酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的氨基酸代替，更优选该 基因被SEQ.ID.No 6表示。
还优选本发明的基因编码突变蛋白，其中CALB的#219氨基酸被选 自谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸和谷 氨酸的亲水氨基酸代替，并且#278氨基酸被选自脯氨酸、酪氨酸、苯丙 氨酸、色氨酸和缬氨酸的氨基酸代替。更优选该基因由SEQ.ID.No 7表 示。
本发明还提供了包括所述基因的表达载体。
本发明的表达载体包括编码本发明的突变脂肪酶蛋白的基因，并且其 被制备用以在细胞表面上表达突变脂肪酶蛋白。
表达本发明的突变脂肪酶蛋白的载体的特征是具有启动子基因、编码 分泌信号序列的基因、突变脂肪酶基因、表面展示介导基因和终止子基因。
表面展示载体的启动子基因优选选自GAPDH、PGK、ADH、PHO5、 GAL1、GAL10、SED1、MOX、TEF和TPI，并且编码分泌信号序列的基 因优选选自MF-α、PHO5、SUC2、AMY、SED和杀伤毒素。表面展示 -介导基因是在细胞表面表达脂肪酶的因子，并且优选选自由SED1、 PIR2、TIP1、CWP1、GAS1、和WSC1组成的细胞壁构成基因组成的组。 然而，该选择并不总是限于此。
在本发明的优选实施方案中，本发明人构建了含有SEQ.ID.No 6、No 7或No 8表示的碱基序列的表达载体，这些碱基序列是编码本发明的突变 蛋白的基因。
本发明还提供了通过将所述表面展示载体导入宿主细胞制备的转化 体。
尤其，通过将包括突变脂肪酶基因的所述表达载体导入宿主细胞制备 本发明的转化体。本发明的宿主细胞可选自酵母如假丝酵母属(candida)、 德巴利酵母属(Debaryomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属 (Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖酵母属 (Schizosaccharomyces)、Yarrowia和酵母(Saccharomyces)属、丝状真菌 如曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)和根霉属(Rhizopus)或者 细菌如埃希氏菌属(Escherichia)和芽孢杆菌属(Bacillus)，但是该选择 不仅仅限于这些。
在本发明的优选实施方案中，酵母被用作宿主细胞。具体地，多形汉 逊酵母DL1-L、多形汉逊酵母A16或酿酒酵母Y2805被用作宿主细胞以 制备转化体。在本发明中，通过用含有各自由SEQ.ID.No 6和No 7表示 的脂肪酶基因的表达载体转化多形汉逊酵母DL-1制备转化体，并且转化 体被命名为“多形汉逊酵母/pLGK Lip10”和多形汉逊酵母/pLGK Lip14”， 它们于2002年7月31日被保藏在Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology的基因储藏库中(保藏号：KCTC 10320BP和KCTC 10321BP)。
本发明还提供了通过培养所述转化体产生突变脂肪酶蛋白的方法。
本发明的转化体优选在比通常宿主细胞培养温度低2℃-20℃的温度 下培养来生产蛋白质。
具体地，汉逊酵母优选在25℃-35℃培养，酵母菌优选在20℃-28 ℃培养。在本发明的优选实施方案中，据证实多形汉逊酵母DL1-L当培养 在25℃时可以产生最大量的脂肪酶。多形汉逊酵母A16当培养在25℃时 可以产生最大量的脂肪酶，酿酒酵母Y2805当培养在20℃时也是如此(见 图6)。
此外，通过补料分批培养大量培养本发明的转化体后，据证实细胞生 长和细胞培养液中的脂肪酶活性极佳(见图7a)并且还产生800mg/l的 CALB蛋白(见图7b)。
附图简述
参考附图可以最好地理解本发明的优选实施方案的应用，其中：
图1是显示CALB分泌型载体(pGK-Lip*)和CALB表面展示载体 (pGK-Lip-CwpF)的示意图。
pGPD：GAPDH启动子，
KT：杀伤毒素分泌信号序列，
tUK：未知的终止子，
c：HARS36的末端区，
BD：HARS36的弯曲DNA结构域，
ARS：HARS36的自复制序列，
Rep：HARS36的端粒重复序列。
图2是显示CALB突变体Lip10和Lip14的氨基酸序列与野生型(Lip wt) 序列的比较的序列图。
图3是显示CALB突变体的活性位点结构与野生型的比较的一组示意 图。
A：野生型脂肪酶的活性位点结构，
B：突变型脂肪酶的活性位点结构。
图4是显示突变CALB活性的照片，其在平板培养基上证实。
泳道1：Wt；野生型多形汉逊酵母DL1株系，
泳道2：Lip-CwpF；含有在表面上展示脂肪酶的载体的株系 (pLGK-Lip-CwpF)，
泳道3和泳道4：Lip10-CwpF和Lip14-CwpF；含有Lip10和Lip14的 表面展示载体的株系，
泳道5：Lip*；含有脂肪酶的分泌型载体的一种株系(pLGK-Lip*)，
泳道6和泳道7：Lip10和Lip14；含有突变脂肪酶Lip10和Lip14的 分泌型载体的株系(pLGK-Lip*)。
图5是显示CALB-展示突变株系的培养上清液的SDS-PAGE结果。
泳道1：Lipwt*株系，
泳道2：Lip10*株系，
泳道3：Lip14*株系，
泳道4和泳道5：LP突变株系，
泳道6和泳道7：LQ突变株系，
泳道8和泳道9：LPQ突变株系。
图6a是显示CALB的脂肪酶活性的图，该活性根据多形汉逊酵母DL1 株系的培养温度而变。
图6b是显示CALB的脂肪酶活性的图，该活性根据多形汉逊酵母A16 株系的培养温度而变。
图7a是显示培养酿酒酵母转化体后，用细胞培养液在OD600测量的显 示细胞生长(◇)，和通过测量培养液中脂肪酶活性计算的CALB(□)生产 率的一组图。
图7b是显示酿酒酵母转化体培养液中产生的CALB蛋白质的量的照 片，该CALB蛋白质的量通过SDS-PAGE分析。
实施例
下面的实施例中展示的本发明的实际的和当前优选的实施方案是举例 说明的。
然而，本领域技术人员将理解，考虑到本公开内容，可以在本发明的 精神和范围内作出修改和改进。
实施例1：CALB表达载体和转化体的制备
本发明人构建了在多形汉逊酵母的表面表达CALB或者将该蛋白分泌 到细胞外面的载体。
具体地，为了构架将CALB分泌到培养基的载体，首先通过聚合酶链 式反应(PCR)使用SEQ.ID.No 1和No 2表示的引物从南极洲假丝酵母 基因组得到CALB基因。使用pfu聚合酶(Stratagene，USA)在94℃3分钟 和15轮94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，并在72℃延伸1分钟，然后 是72℃最后延伸10分钟，实施CALB的PCR合成。此后，通过序列分析 鉴定基因。将CALB基因用SapI消化使其平端化并再次用BamHI消化。 将该基因插入载体的KpnI和BamHI区，该载体是一种多形汉逊酵母表达 载体AMIpL1(Agaphonov等.，Yeast，1999，15，541)，其中插入GAPDH启 动子(Sohn等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，1999，51，800)和杀伤毒素信号序 列(Sor和Fukuhara.，Curr.Genet.，1985，9，147)，通过该载体制备了本发明 的载体，如图1中所见，并将其命名为“pGK-Lip*”(图1)。
为了制备在细胞表面表达CALB的载体，通过PCR使用SEQ.ID.No 1 和No 3表示的引物从南极洲假丝酵母基因组得到CALB基因，所得基因 用和上面相同的方法消化，然后将其插入AMIpL1载体，导致pGK LipF 载体的构建。通过将CwpF(PCT/KR00/00819)-来自CWP1基因的表面展 示介体插入pGK LipF的BamHI和Hind III区构建本发明的表面展示载 体，并将其命名为“pGK-Lip-CwpF”(图2)。
按照Li/TE方法(Hill等，Nucl.Acids.Res.，1991，19，5971)，用将CALB 分泌到细胞外面的载体(pGK-Lip*)和在细胞表面表达CALB的另一载体 (pGK-Lip-CwpF)转染多形汉逊酵母DL 1-L株系，然后从基本培养基 (0.67％氨基酸缺陷的酵母培养基和2％葡萄糖)选择转化体。将所得转化 体转移到含有1％tributyline的YPD平板培养基(1％酵母提取物，2％蛋 白胨和2％葡萄糖)上并通过测量菌株周围环的大小检测转化体的活性。
结果，通过转化体周围活性环的存在证实CALB的表达。
实施例2：通过体内重组构建文库
为了建立CALB突变文库，本发明人使用了体内重组，其曾经在酿酒 酵母中报导(Abecassis等，Nucleic.Acids.Res.，2000，28，E88)。为了建立 CALB文库，将该方法针对多形汉逊酵母进行了修改。
体内重组方法中，将细胞用载体片段和在DNA片段的两端具有与该 载体同源性的合成的插入片段一起转染，从而通过其中的重组产生真正的 环状载体。体内重组是简单而有效的方法，不必提前在大肠杆菌中建立文 库，所以该方面可有效使用特别用于由大肠杆菌致死基因组成的文库的建 立。
将pGK-Lip-CwpF——在细胞表面上表达CALB的一种载体——用 EcoRI/PstI消化，导致得到5kb片段。该片段通过凝胶回收并用作转化的 载体片段。使用PCR预混合试剂盒(Bioneer，韩国)用SEQ.ID.No 4和No 5表示的引物(该引物通过将载体片段和HARS 36区的的100bp杂交制 备)在94℃3分钟和25轮94℃变性30秒，55℃退火30秒，和72℃延 伸1分钟，然后是72℃最后延伸7分钟，实施PCR。此时，pGK-Lip-CwpF 被用作底物。最后，通过使用Li/TE方法，将100ng所得片段与100ng载 体片段一起用于多形汉逊酵母菌株的转化。
随机选择转化的菌株以测量含有1％tributyline的YPD平板培养基上 脂肪酶的活性，导致证实所构建的文库具有一致的活性。
实施例3：CALB突变文库的构建
为了构建CALB突变文库，本发明人使用易错PCR和体内重组。
具体地，用SEQ.ID.No 4和No 5表示的引物，使用在细胞表面上表 达CALB的载体pGK-Lip-CwpF作为模板，实施易错PCR。用PCR随机 易错试剂盒(Clontec，USA)诱导每1kb 2-5个错误。DNA片段在凝胶上以 所需要的大小切割后被回收。使用PCR预混合试剂盒(Bioneer，韩国)用 SEQ.ID.No 4和No 5表示的引物，在94℃3分钟和25轮94℃变性30 秒，55℃退火30秒，和72℃延伸1分钟，然后是72℃最后延伸7分钟， 使用那些片段实施扩增PCR。
使用Li/TE方法，将通过上面的方法所得100ng片段和通过用 EcoRI/PstI消化pGK-Lip-CwpF所得5kb载体片段混合并转染到多形汉逊 酵母菌株中。
结果，得到约1×104个转化株。
实施例4：CALB突变选择
本发明人从上面的实施例3中构建的CALB突变文库中选择具有高脂 肪酶活性的CALB突变株。
将突变文库的约7,000个菌株接种在含有1％tributylin的YPD平板培 养基上并培养24小时。然后，初步筛选具有大活性圈的23个菌株。将初 步筛选的菌株接种于YPD液体培养基中并在37℃培养16小时，然后以 5,000rpm离心5分钟以分离细胞级分和培养上清液。将细胞级分悬浮在 50mM tris缓冲液(pH 7.5)中，将其洗涤并再次用相同量的相同缓冲液 悬浮。
为了测量脂肪酶活性，将棕榈酸对硝基苯酯(此后称为“pNPP”)用 作底物。通过将10μl 10mM pNPP、40μl乙醇和950μl 50mM tris缓冲 液(pH 7.5)混合制备反应溶液，向其中加入100μl细胞悬浮液。在25 ℃反应2小时后，测量OD450。使用pNPP测量脂肪酶活性的该方法用于 测量405nm下pNP基团的消光水平。通过脂肪酶，pNP基团从pNPP分 离(pNP基团和棕榈酸在其中结合)。在本发明中，1单位脂肪酶活性被定 义为每1分钟分离1μM pNP基团的酶活性。
结果，最终选择菌株Lip14、Lip10和Lip23，它们都在全细胞级分中 表现出极佳的活性。
实施例5：CALB突变体的分析
本发明分析了上面实施例4中所得三种突变株系的突变基因。
为了回收CALB突变基因，首先纯化该突变菌株的基因组，将其用作 模板。使用PCR预混合试剂盒(Bioneer，韩国)用SEQ.ID.No 4和No 5表 示的引物在94℃3分钟和25轮94℃变性30秒，55℃退火30秒，和72 ℃延伸1分钟，然后是72℃最后延伸7分钟，实施PCR。从凝胶回收DNA 片段并分析DNA序列。
结果，Lip10和Lip14的DNA序列各自由SEQ.ID.No 6和No 7表示， 并且它们的相应氨基酸序列分别由SEQ.ID.No 9和No 10表示。已证实 Lip10和Lip14的第278位亮氨酸被脯氨酸代替，并且另外Lip14的第219 位亮氨酸被谷氨酰胺置换(图2)。
278位亮氨酸位于CALB的第10个α-螺旋并且已经报导该区域为脂 肪酶活性位点的盖结构(Uppenberg等，Structure.，1994，2，293)。许多疏水氨 基酸出现在该第10个α-螺旋并且亮氨酸是其中之一。由于该氨基酸被脯 氨酸置换，螺旋结构变得更稳定并且甚至可形成弯曲结构(方向的改变)， 导致通过改变活性位点的暴露水平而增加活性。278位亮氨酸位于活性位 点表面上带电的188位谷氨酸和223位天冬氨酸附近。当该氨基酸被脯氨 酸置换时，278位亮氨酸的疏水末端的空间变窄但是223位天冬氨酸和188 位谷氨酸的空间变大，导致活性位点的改变。此外，扩大的空间可以有水 分子，水分子可通过使底物稳定停留在活性位点而促进活性的增加(图3)。 219位亮氨酸是暴露在表面的疏水氨基酸并且被亲水氨基酸谷氨酰胺代 替。CALB是在其表面具有多数为疏水氨基酸的酶。蛋白质表面上亲水氨 基酸的暴露导致形状的改变和增加水中的稳定性。对于Lip23，CALB基 因的末端持有中止密码子，通过其产生分泌性脂肪酶，表明脂肪酶活性的 增加。
实施例6：CALB突变株系活性的测量
本发明人使用在上面实施例4中选择的CALB突变株系测量脂肪酶的 酶活性。
为了构建载体以在细胞表面表达基因，分离了突变株和野生型CALB- 表达株的基因组，其用作PCR的模板。使用PCR预混合试剂盒(Bioneer，韩 国)用SEQ.ID.No 4和No 5表示的引物在94℃3分钟和25轮94℃变性 30秒，55℃退火30秒，和72℃延伸1分钟，然后72℃最后延伸7分钟， 实施PCR。所得DNA片段用EcoRI/ClaI消化并与GAPDH启动子一起插 入单拷贝整合载体‘AMIpLD1’(Agaphonov等，Yeast.，1999，15，541)中以制 备在细胞表面表达基因的载体。所产生的载体被命名为 ‘pLGK-Lip 10-CwpF’和‘pLGK-Lip 14-CwpF’。
为了构建将基因产物分泌到培养基的载体，分离了突变株和野生型株 系的基因组，它们用作PCR的模板。使用PCR预混合试剂盒(Bioneer，韩 国)用SEQ.ID.No1和No 2表示的引物在94℃3分钟和25轮94℃变性 30秒，55℃退火30秒，和72℃延伸1分钟，然后72℃最后延伸7分钟， 实施PCR。将所得DNA片段与GAPDH启动子一起插入AMIpLD1的 EcoRI/BamHI位点以构建载体pLGK-Lip10*和pLGK-Lip14*。
通过DNA测序证实载体中导入野生型和突变的CABL后，通过Li/TE 方法转化多形汉逊酵母DL1-L株系，并通过DNA印迹分析证实向基因组 LEU2位点的单拷贝整合。所得转化体接种在含有1％tributyline的平板培 养基上，并在37℃温育24小时。通过观察所产生的活性环研究活性的改 变(图4)。转化体再次在YPD液体培养基中培养16小时，然后通过离心 分离全细胞级分和培养上清液。使用pNPP作为底物测量酶活性。
结果，当脂肪酶展示在细胞表面上时，在2种突变株中观察到增加5 倍的脂肪酶活性。当脂肪酶被分泌到细胞外面时，证实培养上清液中的活 性与野生型相比分别增加5倍(Lip10)和10倍(Lip14)(表1)。
表1
多形汉逊酵母的野生型和突变CALB脂肪酶活性的比较

而且，通过12％SDS-PAGE研究了分泌CALB的株系的培养上清液并 通过银染证实了结果(图5)。尽管表达Lip10的株系显示出与表达野生型 CALB等量的CALB带，但是表达Lip14的株系显示出比其他株系多得多 的量的CALB。含有Lip14的分泌形式的株系比含有Lip10的株系显示出 高2倍的脂肪酶活性，并且这主要是因为Lip14被更有效地分泌到培养基 中。对于表面展示的脂肪酶，来自全细胞级分的活性在菌株之间不变，表 明当外源蛋白在细胞表面上表达时，仅仅有限量的蛋白质被转移到表面 上，使得分泌水平平均。
实施例7：从突变株纯化CALB和对其特征的分析
本发明人分离并纯化了野生型CALB和突变的CALB以准确分析突变 CALB的特征。
将分泌CALB的每种菌株培养于YPD培养基中18小时，然后在5,000 rpm离心5分钟以得到培养上清液。通过超离心将培养上清液浓缩10倍。 然后，向蛋白质溶液中加入硫酸铵直到硫酸铵的浓度被调节到1M。让回 收的溶液通过用含有1M硫酸铵的50mM，pH 6.5的磷酸盐缓冲液饱和的 丁基琼脂糖CL-4B柱(Pharmacia，USA)。通过100％水降低浓度以洗脱蛋 白质。在洗脱的蛋白质级分中，仅仅回收显示出脂肪酶活性的级分，通过 超离心将其再次浓缩，然后，使用superdex-G200凝胶过滤柱层析 (Pharmacia，USA)纯化。得到纯化的Lip10、Lip14和野生型脂肪酶(Lip wt)。
通过用纯化蛋白，使用pNPP作为底物测量Km和Kcat来比较突变蛋 白和野生型蛋白。将10μl蛋白质溶液加入通过补加连续不同浓度的pNPP 制备的脂肪酶反应溶液。在405nm测量分离的pNP基团的光密度以确定 Vi。
应用Michales-Menten方程使用Vi计算每种蛋白质的Km值。结果， Lip10和Lip14的Km值都没有增加。另一方面，每种蛋白的Kcat值增加 了6.5倍以上，表明Lip10和Lip14的活性增加了而不改变底物亲和力(表 2)。还让蛋白质在50℃保温10分钟后测量蛋白质的剩余活性以检验热稳 定性。结果，突变蛋白和野生型蛋白在热稳定性中没有大的差异。使用 (R，S)-乙酰基酯作为底物还测量了立体选择性。结果，突变蛋白和野生型 蛋白在立体选择性中没有大的差异。
因此，证实每种突变蛋白的酶活性增加6倍而不破坏该蛋白的稳定性 和特异性。
<表2>
每种突变株的CALB稳定性
 Km(μmol)   Vmax   Kcat(S-1p mol-1)   Lip wt   20.4   1.99   130.9   Lip10   21.4   12.9   850.9   Lip14   23.8   13.7   898.0
实施例8：使用定点诱变分析突变特性
本发明人通过使用定点诱变研究了突变特性以证实突变蛋白的特征性 变化是否由氨基酸的改变导致。
通过PCR诱导L278P突变(278位亮氨酸被脯氨酸代替，其存在于 Lip10和Lip14中)和L219Q突变(219位亮氨酸被谷氨酰胺代替，其仅存 在于Lip14中)以在野生型基因中进行定点诱变，并分析这些突变的效果。 对于定点诱变，使用pfu聚合酶和野生型CALB基因作为底物，用SEQ.ID. No 15、No 16、No 17和No 18表示的引物作为底物，在94℃3分钟和 15轮94℃变性1分钟，55℃退火1分钟和72℃延伸1分钟，然后是72℃ 10分钟的最后延伸，实施PCR。
为了合成L278P突变基因，通过PCR，使用SEQ.ID.No 2和No 17 表示的引物，用野生型基因作为底物，制备一种基因。还通过PCR，使用 SEQ.ID.No 4和No 18表示的引物合成另一种基因。将两种合成的DNA 片段混合，并将混合物用作PCR底物，并使用SEQ.ID.No 2和No 4表 示的引物，导致两种基因片段的连接。那时，将5μl每种基因片段和3μ l每种引物加入PCR反应混合物中，然后使用ExTaq聚合酶(Dakara，日 本)，94℃3分钟和20轮94℃变性30秒，55℃退火30秒，和72℃延伸 90秒，然后是72℃最后延伸7分钟，实施PCR。通过上面方法合成的基 因用EcoRI/ClaI消化，将该基因插入载体‘pLGK-Lip-CwpF’的相应区域并 命名为‘pLGK-LP’。
为了合成SEQ.ID.No 8所表示的L219Q突变基因，通过PCR，用SEQ. ID.No 2和No 15表示的引物，使用野生型基因作为底物，制备一种基因。 通过PCR，使用SEQ.ID.No 4和No 16表示的引物，还合成了另一种基 因。将两种合成的DNA片段混合，并将混合物用作PCR的底物，使用 SEQ.ID.No 2和No 4表示的引物，导致两种基因片段的连接。那时，将 5μl每种基因片段和3μl每种引物加入PCR反应混合物中，然后使用 ExTaq聚合酶(Dakara，日本)，94℃3分钟和20轮94℃变性30秒，55℃ 退火30秒，和72℃延伸90秒，然后是72℃最后延伸7分钟，实施PCR。 通过上面方法合成的基因用EcoRI/ClaI消化，将该基因插入载体 ‘pLGK-Lip-CwpF’的相应区域并命名为‘pLGK-LQ’。
为了得到包括L278P突变和L219Q突变的基因，用SEQ.ID.No 2、 No 15、No 4和No 16表示的引物，使用pLGK-LP基因作为底物实施PCR， 按照和上面相同的方法，构建‘pLGK-LPQ’。通过Li/TE方法用每种载体转 化多形汉逊酵母。将转化体培养在YPD培养基中18小时。之后，通过和 上面所用的相同的方法回收培养上清液以测量脂肪酶活性。
结果，LP和LPQ显示出和Lip10和Lip14类似的增加的活性(表3)。 由SEQ.ID.No 11表示的氨基酸组成的LQ显示出比野生型基因高3倍的 脂肪酶活性。通过SDS-PAGE比较每种菌株的培养上清液以研究增加的 LQ活性的原因。结果，LQ产生和LPQ一样多的蛋白质(图5)。
表3定点诱变的CALB的活性的比较
  脂肪酶   培养上清液中的活性(U/l)   Lip wt   17,458   Lip10   118,401   Lip14   190,854   LP   98,890   LQ   48,850   LPQ   200,300
这样，已证实L219Q突变增加了蛋白质生产率，而L278P突变降低了 蛋白质活性。考虑Kcat值，认为Lip14而不是Lip10，具有增加蛋白质生 产率以及其活性的作用，表明L219Q突变参与多个方面。
实施例9：CALB表达根据培养温度改变
本发明人测量了各种培养温度下CALB活性以便确定CALB的最适培 养条件。
在不同培养温度测量包括pLGK-Lip14*的多形汉逊酵母DL1-L株的活 性。将该菌株接种在YPD培养基中，使得最初OD600为1并在20℃、25 ℃、30℃或37℃培养，培养期间，回收培养上清液以测量活性。为了测量 活性，将pNPP用作底物并将10μl适当稀释的细胞培养上清液加入200 μl反应混合物中，该反应混合物通过混合25μl 50mM pNPP、450μl乙 醇和9500μl 50mM tris缓冲液(pH 7.5)制备，反应混合物在25℃反应。 最后在405nm测量Vi。1AU(任意单位)脂肪酶活性被定义为在上面的 条件下得到的Vi值。
结果，来自25℃下生长的细胞的培养上清液显示出脂肪酶的最高活性 和生长。同时，在37℃培养导致随着时间的流逝活性的快速降低(图6a)。
那似乎是凋亡期间细胞分泌的蛋白酶的作用。用已知较少受蛋白酶影 响的多形汉逊酵母A16株系(CBS4732衍生株系)重复实验。通过和上 面的相同的方法用pLGK-Lip14*转化多形汉逊酵母A16株。所得转化体在 YPD培养基中温育，使得最初OD600为1，然后在25℃、30℃和37℃培养。 回收培养上清液以测量活性。
结果，证实多形汉逊酵母A16株的脂肪酶活性与多形汉逊酵母DL-1 株的相比几乎没有改变但是在低温培养时表达多得多的脂肪酶(图6b)。 25℃培养30小时导致脂肪酶的最高活性，产生480AU酶。
实施例10：酿酒酵母中CALB表达
为了优化酶的生产，在酿酒酵母中表达突变CALB。
通过PCR使用SEQ.ID.No 2和No 12表示的引物合成Lip14基因， 然后将其通过与NdeI和SEQ.ID.No 13表示的α-淀粉酶分泌信号序列融 合连接到载体“YEGαHIR525”的EcoRI/BamHI位点(Choi等，Appl. Microbial.biotechnol.，1994，42，587)。使用Li/TE方法用所得载体转化酿酒 酵母Y2805(MATα pep4::HIS3 prb-1.6R can1 his3-20 ura3-52)株。使用 SC-URA(0.67％缺少氨基酸的酵母培养基，2％葡萄糖和除了尿嘧啶的各种 其他氨基酸)培养基选择转化体。所选的转化体培养于含有1％tributyline 的YPDG(1％酵母提取物、2％蛋白胨、0.5％葡萄糖和1.5％半乳糖)上以 测量脂肪酶活性。
结果，在平板上观察到活性圈。所证实的菌株接种于YPDG液体培养 基中并被诱导在30℃表达24小时，并测量酶活性。
为了研究酿酒酵母在培养过程中是否同等地受到温度的影响，将酿酒 酵母分别培养于20℃和30℃并回收培养上清液以测量活性。
结果，当其在20℃表达(720AU)时，该活性为在30℃表达的活性的10 倍。
实施例11：使用发酵罐大量产生改良的CALB的优化
为了使用酿酒酵母大量产生改良的CALB，51发酵罐被用于补料分批 培养以优化CALB的产生。YPD培养基(1％酵母提取物、4％蛋白胨和2 ％葡萄糖)被用作初级原代培养基。还额外以6-18ml/小时的间隔提供 YG培养基(20％酵母提取物和40％半乳糖)以诱导CALB蛋白的表达。 如上所述，重组CALB生产株(KCTC 10321BP)在比最优培养温度低的多 的温度下表现出最佳生产率。这样，在培养的早期将培养温度设为30℃以 容许细胞进入对数期。此后，将培养温度降低到20-23℃以使蛋白质生产 率最佳。那时，向培养基中加入诱导剂半乳糖。培养后，通过用细胞培养 基测量OD600以研究细胞生长，之后测量脂肪酶活性。通过使用培养基进 行SDS-PAGE定量补料-分批培养产生的CALB蛋白。
结果，如在图7a中所示，观察细胞生长直到OD600达到300，并且改 进的CALB的最大产量为18,000AU。每小时回收并通过SDS-PAGE分析 培养上清液。结果在图7b中显示。改进的CALB的产量为800mg/l。
工业适用性
如此前所解释的，本发明的突变脂肪酶的筛选方法促进了产生具有改 良的酶活性的突变脂肪酶的转化株的制备。从所述转化株制备的突变脂肪 酶可被固定在细胞表面上并且是可再现的，因此大量生产是可能的。从而， 可以筛选具有改良的酶活性的酶的本发明方法可以有效用于各种领域，如 食品和洗涤剂工业。
本领域技术人员应当理解前面的描述中公开的概念和具体实施方案可 以容易地用作改进和设计其他实施方案的基础以实施本发明的相同目的。 本领域技术人员还应当理解这些等价实施方案不背离在后附权利要求中 阐明的本发明的精神和范围。
生物材料国际保藏和存活证明(译文)
  保藏人   崔毅星   地址   韩国大田   保藏日   2002年7月31日   保藏号   KCTC 10320BP   生物材料分类命名   多形汉逊酵母DL1/pLGK Lip10   国际保藏单位名称   韩国典型培养物保藏中心   存活状态   □存活  □不存活   代理机构盖章
生物材料国际保藏和存活证明(译文)
  保藏人   崔毅星   地址   韩国大田   保藏日   2002年7月31日   保藏号   KCTC 10321BP   生物材料分类命名   多形汉逊酵母DL1/pLGK Lip14   国际保藏单位名称   韩国典型培养物保藏中心   存活状态   □存活  □不存活   代理机构盖章
序列表
<110>韩国生命工学研究院
<120>使用酵母表面展示载体筛选具有改良的酶
活性的脂肪酶的方法和该脂肪酶
<130>3fpo-07-05
<150>KR 2002-55575
<151>2002 09 13
<160>18
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CALB引物1
<400>1
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<212>DNA
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<220>
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<400>2
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<212>DNA
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<220>
<223>CALB引物3
<400>3
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>GPD-易错引物
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<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>T-0引物
<400>5
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<210>6
<211>1023
<212>DNA
<213>南极洲假丝酵母
<220>
<221>信号肽
<222>(-51)..(-1)
<223>分泌信号
<400>6
atgaatatat tttacatatt tttgtttttg ctgtcattcg ttcaaggtac cgccactccc   9
ttggtgaagc gtctgccttc cggttcggac cctgcctttt cgcagcccaa gtcggtgctc  69
gatgcgggtc tgacctgcca gggtgcttcg ccatcctcgg tctccaaacc catccttctc 129
gtccccggaa ccggcaccac aggtccacag tcgttcgact cgaactggat ccccctctct 189
gcgcagctgg gttacacacc ctgctggatc tcacccccgc cgttcatgct caacgacacc 249
caggtcaaca cggagtacat ggtcaacgcc atcaccacgc tctacgctgg ttcgggcaac 309
aacaagcttc ccgtgctcac ctggtcccag ggtggtctgg ttgcacagtg gggtctgacc 369
ttcttcccca gtatcaggtc caaggtcgat cgacttatgg cctttgcgcc cgactacaag 429
ggcaccgtcc tcgccggccc tctcgatgca ctcgcggtta gtgcaccctc cgtatggcag 489
caaaccaccg gttcggcact cactaccgca ctccgaaacg caggtggtct gacccagatc  549
gtgcccacca ccaacctcta ctcggcgacc gacgagatcg ttcagcctca ggtgtccaac  609
tcgccactcg actcatccta cctcttcaac gggaagaacg tccaggcaca ggctgtgtgt  669
gggccgctgt tcgtcatcga ccatgcaggc tcgctcacct cgcagttctc ctacgtcgtc  729
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ctcatgccct acgcccgccc ctttgcagta ggcaaaagga cctgctccgg catcgtcacc  969
ccc                                                                972
<210>7
<211>1023
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<213>南极洲假丝酵母
<220>
<221>信号肽
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<210>8
<211>1023
<212>DNA
<213>南极洲假丝酵母
<220>
<221>信号肽
<222>(-51)..(-1)
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<210>9
<211>341
<212>PRT
<213>南极洲假丝酵母
<220>
<221>信号
<222>(-24)..(-8)
<223>分泌信号
<400>9
Met Asn Ile Phe Tyr Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Val Gln Gly
-24             -20                 -15                 -10
Thr Ala Thr Pro Leu Val Lys Arg Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala
            -5                   1                   6
Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly
        11                   16                 21
Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr
    26                  31                   36
Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser
 41                 46                   51                 56
Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met
                 61                 66                  71
Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr
            76                   81                  86
Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp
        91                   96                 101
Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser
    106                 111                 116
Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys
121                 126                 131                 136
Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro
                141                 146                 151
Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg
            156                 161                 166
Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser
         171                 176                 181
Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp
    186                 191                 196
Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys
201                 206                 211                 216
Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe
                221                 226                 231
Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala
            236                 241                 246
Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn
        251                 256                 261
Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Pro Ala Pro
    266                 271                 276
Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp
281                 286                 291                 296
Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser
                301                 306                 311
Gly Ile Val Thr Pro
            316
<210>10
<211>341
<212>PRT
<213>南极洲假丝酵母
<220>
<221>信号
<222>(-24)..(-8)
<223>分泌信号
<400>10
Met Asn Ile Phe Tyr Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Val Gln Gly
-24             -20                 -15                 -10
Thr Ala Thr Pro Leu Val Lys Arg Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala
            -5                   1                   6
Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly
        11                  16                  21
Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr
    26                  31                  36
Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser
 41                 46                  51                  56
Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met
                61                  66                  71
Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr
            76                  81                  86
Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp
         91                 96                  101
Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser
    106                 111                 116
Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys
121                 126                 131                 136
Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro
                141                 146                 151
Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg
            156                 161                 166
Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser
        171                 176                 181
Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp
    186                 191                 196
Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys
201                 206                 211                 216
Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe
                221                 226                 231
Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala
            236                 241                 246
Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn
        251                 256                 261
Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Pro Ala Pro
    266                 271                 276
Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp
281                 286                 291                 296
Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser
                301                 306                 311
Gly Ile Val Thr Pro
            316
<210>11
<211>341.
<212>PRT
<213>南极洲假丝酵母
<220>
<221>信号
<222>(-24)..(-1)
<223>分泌信号
<400>11
Met Asn Ile Phe Tyr Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Val Gln Gly
-24             -20                 -15                 -10
Thr Ala Thr Pro Leu Val Lys Arg Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala
            -5                  1                    6
Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly
        11                  16                  21
Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr
    26                  31                  36
Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser
41                  46                  51                  56
Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met
                61                  66                  71
Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr
            76                  81                  86
Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp
        91                  96                  101
Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser
    106                 111                 116
Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys
121                 126                 131                 136
Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro
                141                 146                 151
Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg
            156                 161                 166
Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser
        171                 176                 181
Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp
    186                 191                 196
Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys
201                 206                 211                 216
Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe
                221                 226                 231
Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala
            236                 241                 246
Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn
        251                 256                 261
Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro
    266                 271                 276
Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp
281                 286                 291                 296
Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser
                301                 306                 311
Gly Ile Val Thr Pro
            316
<210>12
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CALB引物4
<400>12
ctcatatgct accttccggt tcggac                                26
<210>13
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>a-淀粉酶分泌信号
<400>13
Met Met Val Ala Trp Trp Ser Leu Phe Leu Tyr Gly Leu Gln Val Ala
  1              5                  10                  15
Ala Pro Ala Leu Ala
            20
<210>14
<211>317
<212>PRT
<213>南极洲假丝酵母
<400>14
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys  Ser Val Leu
  1              5                  10                   15
Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys
            20                   25                 30
Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe
        35                  40                  45
Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys
    50                  55                  60
Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr
 65                 70                   75                 80
Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn
                 85                 90                  95
Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln
            100                 105                 110
Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu
        115                 120                 125
Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu
    130                 135                 140
Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly
145                 150                 155                 160
Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile
                165                 170                 175
Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro
            180                 185                 190
Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys
        195                 200                 205
Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His
    210                 215                 220
Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala
225                 230                 235                 240
Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr
                245                 250                 255
Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val
            260                 265                 270
Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly
        275                 280                 285
Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe
    290                 295                 300
Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro
305                 310                 315
<210>15
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>LQ53引物
<400>15
gctgtgtgtg ggccgcagtt cgtcatcg                            28
<210>16
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>LQ35引物
<400>16
gcatggtcga tgacgaactg cggcccacac                         30
<210>17
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>LP53引物
<400>17
gtcgccgcgg ctgcgctccc ggcgccggcg                            30
<210>18
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>LP35引物
<400>18
ctgcagccgc cggcgccggg agcgcagcc                             29