蛋白质和生物活性肽的表面环常常参与蛋白质结合配偶体的识 别。因此，将这些环作为药物开发的潜在线索来研究是有意义的。尤 其有意义的是β发夹：β发夹基序在自然界中十分丰富，存在于许多 蛋白质配体的表面和抗体的高变区中。β发夹基序由两个通过短环或 转角连接的反平行β链组成，并已经根据H键成键网络进行分类 [Sibanda，B.L.；Blundell，T.L.；Th或nton，J.M.J.Mol.Biol. 1989，206，759-777]。
目前已经确立了通过使用组合和平行合成方法制备β发夹肽模拟 物(peptidomimetics)的能力(L.Jiang，K.Moehle，B.Dhanapal，D. Obrecht，J.A.Robinson，Helv.Chim.Acta.2000，83，3097-3112)。 然而，这些分子不可能在大到1010或1012的文库中合成。
对于基于肽的引导开发，一种补充策略是在允许制备大到1010至 1012的文库的丝状噬菌体上展示文库，这比合成方式可以制备的文库 大许多数量级。
此外，已有快速价廉的选择方案可以用于鉴定与目的靶结合的文 库成员。如熟知的，噬菌体展示技术允许构建环状的、受约束的肽， 例如二硫键约束的β发夹环(H.B.Lowman，Annu.Rev.Biophys. Biomol.Struct.1997，26，401-24)。
这些环表现出有限数量的构象，这可能导致受体靶的亲和配体的 分离。然而，通过仅一个二硫键稳定的环肽仍然在构象上具有相当的 柔性。而且，熟知，二硫键的形成和断裂可以是可逆的，柔性随着肽 限制物(constraints)与基因III蛋白质氨基端的融合而增加。因此， 重要的是，通过邻近二硫键并利于β折叠构象的其它残基稳定该环结 构(R.H.Hoess，Current Opinion in Structural Biology，1993，3， 572-579)。这可能不会产生受体靶的高亲和配体。可以将相同的肽环 固定在天然蛋白质支架中，其中蛋白质支架接在环的N和C端上；此 外，使所述肽环受到天然蛋白质支架所诱导的反平行β折叠的氢键的 约束。再者，也已经提出了其它方法，例如用于轮流展示(turn display) 的肽支架(A.G.Cochran，R.T.Tong，M.A.Starvasnik，E.J.Park， R.S.McDowell，J.E.Theaker，N.J.Skeleton，J.Am.Chem.Soc. 2001，123，625-632)。该问题的另一可能解决方案是使用折叠蛋白质 的结构约束性来呈现小的可变肽段(P.-A.Nygren，M.Uhlen，Curr. Opin.Struc.Biol.1997，7，463-469；G.P.Smith，S.U.Patel， J.D.Windass，J.M.Thornton，G.Winter，A.D.Griffiths，J.Mol. Biol.1998，277，317-332；A.Christmann，K.Walter，A.Wenzel， R.Krazner，R.Kolmar，Protein Eng.1999，12，797-806)。
事实上，表位从蛋白质转移至小肽中仍是一个问题(A.G.Cochran Chem.Biol.2000，7，R85-R94)。

以下描述的本发明提供由天然存在的L-α-氨基酸的残基组成的 肽模板，其功能在于将肽环主链限制成具有稳定的β发夹构象的发夹 几何形状(hairpin geometry)。这些模板可以用于构建来自噬菌体 展示的模板固定的β发夹环模拟物，从而产生对靶标具有非常高结合 常数的噬菌体展示文库。
本发明提供的此方法可以有利地用于筛选大的来自噬菌体展示的 模板固定的β发夹环模拟物文库，这反过来又可以相当大地促进结合- 活性研究，由此促进具有强大活性和对不同类型的靶具有新选择性的 新分子的开发。
由于以下定义的通式I的β发夹环模拟物具有结构和构象已经充 分明确的构造，所以可以按构象锁定的排布(arrangements)在链Z ——在噬菌体展示文库中以核酸序列形式编码——中整合关键氨基酸 残基或基序。通过沿着β发夹结构移动这些关键氨基酸残基或基序， 可以扫描重要氨基酸的新排布(关键序列的位置扫描)。或者，可以对 蛋白质序列进行作图，以检测β发夹环基序。总之，该技术允许快速 确定对于大表面的平蛋白质界面中的结合而言重要的关键氨基酸和基 序(热点)的序列和空间排布。此信息最终可以用于设计小的肽模拟物 药物候选物(Cunningham，B.C.；Wells，J.A.Curr.Opin.Struct. Biol.1997，7，457；Obrecht，D.；Altorfer，M.；Robinson，J.A. Adv.Med.Chem.Vol.4，1-68，JAI Press Inc.，1999)。
本发明的模板固定的β发夹环模拟物是具有如下通式的化合物
R1-Cys-Z-Cys-R2        I
其中
两个Cys残基通过二硫键桥接(bridged)，由此形成环肽；
R1和R2是
A-B和B-C；或B-A和C-B；或C-B和B-A；或B-C和A-B；或C-A 和C-A；或A-C和A-C；或C-A和C-B；或B-B和C-B；或B-B和B-C； 或A-B和C-C；或B-A和C-C；或C-B和B-B；或B-C和B-B；或C-C 和B-A；或C-C和A-B；或B-B和C-C；或C-C和B-B；或A-C和B-C； 或C-B和C-A；或B-C和A-C；或A-C和A-B；或B-A和C-A；A-A和 C-C；或C-C和A-A；
或A-B-C和A-B-C；或B-A-B和B-C-B；或B-C-B和B-A-B； 或A-B-B和B-B-C；或C-B-B和B-B-A；或A-C-B和B-A-C；或 C-A-B和B-C-A；或B-A-B和B-C-C；或B-C-B和B-A-C；或 C-C-B和B-B-A；或C-C-B和B-A-B，或C-B-B和C-C-A；或 A-C-C和B-B-C；或B-C-C和B-A-B；或B-C-C和B-A-C；或 A-B-B和B-C-C；或B-A-B和C-C-B；或C-A-B和C-C-B；或 B-B-B和B-C-C；或C-B-B和B-B-B；或B-B-B和C-C-B；或 B-C-C和B-B-B；或A-B-C和B-B-C；或C-B-B和C-B-A；或 A-B-C和A-C-C；或C-C-A和C-B-A；或B-A-C和A-C-B；或 B-C-A和C-A-B；或C-B-A和C-B-A；或A-A-B和B-C-C；或 C-C-B和B-A-A；或B-B-C和A-C-C；或B-B-C和A-B-C；或 B-B-C和B-B-C；或B-B-C和B-B-B；或B-A-C和B-C-C；或 C-C-B和C-A-B；或C-C-B和C-B-A；或A-B-C和B-C-C；或 C-A-B和B-C-B；或B-C-B和B-B-C；或C-B-B和B-C-B；或 B-C-B和B-B-B；或B-B-B和B-C-B；或C-B-B和B-C-A；或 A-C-B和B-B-C；或C-B-B和C-B-B；或B-B-B和B-B-B；或 B-B-B和B-B-C；或A-A-C和A-C-C；或C-C-A和C-A-A；或 A-A-C和A-C-B；或B-C-A和C-A-A；或A-A-C和B-C-C；或 C-C-B和C-A-A；或A-A-B和C-C-B；或B-C-C和B-A-A；或 A-B-A和C-B-C；或C-B-C和A-B-A；或A-B-B和C-B-C；或 C-B-C和B-B-A；或B-A-A和C-C-B；或B-C-C和A-A-B；或 B-B-A和C-B-B；或B-B-C和A-B-B；或B-B-A和C-C-B；或 B-C-C和A-B-B；或B-B-C和A-C-B；或B-C-A和C-B-B；或 B-C-B和C-B-B；或B-B-C和B-C-B；或B-C-B和C-A-B；或B-A-C 和B-C-B；或B-C-B和C-B-B；或B-A-C和A-C-B；或B-A-C和 A-C-C；或C-C-A和C-A-B；或B-A-C和B-C-C；B-C-C和A-A-C； 或C-A-A和C-C-B；或C-A-A和C-C-A；或A-C-C和A-A-C；或 C-B-A和C-C-A；或A-C-C和A-B-C；或C-B-A和C-B-B；或C-B-A 和C-C-B；或B-C-C和A-B-C；或C-B-B和C-C-A；或C-B-B和 C-B-B；或C-B-B和C-C-B；或B-CC和B-B-C；或C-C-A和C-A-B； 或C-C-A和C-B-B；或C-C-B和B-B-B；或C-C-B和C-A-A；或 C-C-B和C-B-A；或C-C-B和C-B-B；或B-B-C和B-C-C；或 A-C-B和B-B-C；或A-C-C和B-B-C；
A是Asn，Gln，Asp，Glu，Thr，Ser和Gly中之任一；
B是Val，Ile，Ser，Thr，Phe，Tyr，Trp和Gly中之任一；
C是Arg，Lys和Gly之任一；且
Z是n个氨基酸残基的链，其中n是4至20的整数，这n个氨基 酸残基中的每一个独立地来源于任何天然存在的L-α-氨基酸。
例如，Z含有关键序列-Arg-Gly-Asp-、-Glu-Leu-Arg-、-Arg- Lys-Lys-和-Lys-Gly-Phe-之一，或者由如下关键序列之一组成或含有 如下关键序列之一：-Val-Arg-Lys-Lys-[SEQ ID NO：1]、 -Lys-Lys-Tyr-Leu-[SEQ ID NO：2]、-Trp-Leu-Asp-Val-[SEQ ID NO：3]、-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-[SEQ ID NO：4]、 -Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-[SEQ ID NO：5]、-Ile-Lys-Val-Ala-Val- [SEQ ID NO：6]、-Pro-Pro-Xaa-Xaa-Trp-[sEQ ID NO：7](其中 Xaa可以是任何天然存在的L-α-氨基酸的残基)、 -Leu-Trp-Tyr-Ser-Asn-His-Trp-Val-[SEQ ID NO：22]、 -Lys-Trp-Phe-Ser-Asn-His-Tyr-Gln-[SEQ ID NO：23]、 -Phe-Leu-Ala-His-Tyr-Ala-[SEQ ID NO：24]和-Leu-Trp-Tyr -Ser-Asn-His-Trp-Val-Lys-Trp-[SEQ ID NO：25]；这些关键序列 将在下文中作更详细的讨论。
本发明的模板固定的β发夹模拟物文库包含多个以上通式I的化 合物。此模板固定的β发夹模拟物的该文库可以与噬菌体外壳蛋白质 的至少一部分融合，将此模板固定的β发夹模拟物展示在噬菌体或噬 菌粒颗粒的表面上。
本发明还提供筛选模板固定的发夹β模拟物的方法，以寻找具有 可以在构象上稳定β发夹构象的模板并能够与特定结合配偶体结合的 模板固定的发夹β模拟物，所述方法包括步骤：
a)提供通式I的模板固定的β发夹模拟物的文库，该模拟物可以 与噬菌体外壳蛋白的至少一部分融合，从而将模板固定的β发夹模拟 物展示在噬菌体或噬菌粒颗粒的表面上；
b)使步骤a)的文库与结合配偶体接触；
c)从文库中选择能够与结合配偶体形成非共价复合体的噬菌体 肽；和
d)任选地，分离步骤c)的肽或通过DNA分析确定其序列。
在此方法中，结合配偶体通常是抗体、酶、受体或配体或者其片 段或部分。
通过以上方法确定并任选地分离的噬菌体肽以及与由此确定和任 选地分离的这些肽具有相同结构的合成肽，也形成本发明的部分。
形成模板的结构元件由两个二硫键桥接的Cys残基和残基R1和R2 一起组成，残基R1和R2包含两个或三个氨基酸残基，这些氨基酸残基 能够稳定β折叠构象(见下述)并位于反平行β链的相对位置上邻近二 硫键的位置；此外，这些模板具有被定向以与链Z连接的N端和C端。 肽链Z与模板的C端和N端分别通过相应的N端和C端连接，使得模 板和链组合成环状结构。
对于氨基酸残基，可以考虑来源于天然存在的L-α-氨基酸的那 些。下文中，给出了一系列其本身或其残基适用于本发明目的的氨基 酸，缩写相应于一般所采用的惯例。
  Ala   A   L-丙氨酸   Arg   R   L-精氨酸   Asn   N   L-天冬酰胺   Asp   D   L-天冬氨酸   Cys   C   L-半胱氨酸   Glu   E   L-谷氨酸   Gln   Q   L-谷氨酰胺   Gly   G   甘氨酸
  His   H   L-组氨酸   Ile   I   L-异亮氨酸   Leu   L   L-亮氨酸   Lys   K   L-赖氨酸   Met   M   L-甲硫氨酸   Phe   F   L-苯丙氨酸   Pro   P   L-脯氨酸   Ser   S   L-丝氨酸   Thr   T   L-苏氨酸   Trp   W   L-色氨酸   Tyr   Y   L-酪氨酸   Val   V   L-缬氨酸
R1和R2各包含两个或三个氨基酸残基，这些残基在上文中以符号 A、B和C表示，其中A、B、C各代表下组之一：
-A组：能够形成离子键或氢键相互作用的氨基酸残基；
-B组：能够形成疏水性相互作用的氨基酸残基；和
-C组：能够形成阳离子-π相互作用或者离子键或者氢键的氨基 酸残基。
A组包括含有具有极性不带电荷的或酸性的残基的侧链的氨基 酸。极性不带电荷残基指在生理pH下不带电荷的亲水性侧链。这些侧 链典型地含有氢键供体基团，例如伯和仲酰胺或醇。酸性残基指含有 羧基基团的亲水性侧链。天然存在的极性不带电荷的或酸性的L-α- 氨基酸是天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸和丝氨酸。 甘氨酸作为中性的β折叠形成者被包括在A组中。这些氨基酸侧链可 以与位于反平行β折叠相对位置上的C组氨基酸残基形成链间离子键 (盐桥)或者氢键相互作用，此外，可以与模板中三肽部分(Ciani B等， J.Am.Chem.Soc.2003，125，9038-9047；Searle，M.S.等，J.Am. Chem.Soc.1999，121，11615-11620)的C组氨基酸残基形成链内氢 键或离子键相互作用。
B组包括含有小至中等大小的疏水性、或芳香族的或杂芳族的、 或极性不带电荷的侧链残基的氨基酸残基。小至中等大小的疏水性残 基指在生理pH下不带电荷的氨基酸侧链。芳族氨基酸残基指具有如下 侧链的疏水性氨基酸，所述侧链含有至少一个具有共轭π电子系统的 环(芳族基团)。此外，它们可以含有氢键供体基团，例如伯和仲胺和 醇。极性不带电荷残基指在生理pH下不带电荷的亲水性侧链。该类侧 链典型地含有氢键供体基团，例如醇。天然存在的小至中等大小的L- α-氨基酸、芳族和杂芳族L-α-氨基酸和极性不带电荷L-α-氨基酸 是缬氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 甘氨酸作为中性β折叠形成者被包括在B组中。这些氨基酸测量可以 与位于反平行β折叠的相对位置上的B组氨基酸残基形成链间疏水- 疏水相互作用或者与C组氨基酸残基形成疏水(π)-阳离子相互作用， 此外，还可以与模板中的三肽部分的B组或C组氨基酸残基形成链内 疏水或疏水-阳离子相互作用。
C组包括含有具有极性-阳离子残基的侧链的氨基酸。极性阳离子 指在生理pH下质子化的碱性侧链。天然存在的极性-阳离子L-α-氨 基酸是精氨酸和赖氨酸(Ciani B.等，J.Am.Chem.Soc.2003，125， 9038-9047；Searle，M.S.等，J.Am.Chem.Soc.1999，121， 11615-11620)。甘氨酸作为中性β折叠形成者被包括在C组中。精氨 酸和赖氨酸的氨基酸侧链可以与位于反平行β折叠的相对位置上的B 型氨基酸残基形成链间阳离子-疏水(π)相互作用(J.P.Gallivan， D.A.Dougherty，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96，9459-9464) 或者与A组氨基酸残基形成离子键相互作用(盐桥)或氢键相互作用， 此外，还可以与模板中的三肽部分的B组氨基酸残基形成链内阳离子- 疏水(π)相互作用。
R1和R2优选是
Glu-Thr和Thr-Lys；或者Lys-Thr和Thr-Glu；或者
Thr-Glu和Lys-Thr；或者Thr-Lys和Glu-Thr；或者
Leu-Glu和Lys-Val；或者Val-Lys和Glu-Leu；或者
Glu-Leu和Val-Lys；或者Lys-Leu和Val-Glu；或者
Asn-Gly和Lys-Val；或者Val-Gly和Lys-Asn；或者
Gly-Asn和Val-Lys；或者Gly-Val和Asn-Lys；或者
Gly-Gly和Gly-Gly；或者
Glu-Leu-Lys和Glu-Val-Lys；或者Lys-Val-Glu和Lys-Leu-Glu； 或者
Leu-Glu-Lys和Glu-Lys-Val；或者Val-Lys-Glu和Lys-Glu-Leu； 或者
Glu-Lys-Leu和Val-Glu-Lys；或者Lys-Glu-Val和Leu-Lys-Glu； 或者
Lys-Glu-Leu和Val-Lys-Glu；或者Glu-Lys-Val和Leu-Glu-Lys； 或者
Lys-Val-Gly和Gly-Leu-Glu；或者Glu-Leu-Gly和Gly-Val-Lys； 或者
Val-Lys-Gly和Gly-Glu-Leu；或者Leu-Glu-Gly和Gly-Lys-Val； 或者
Val-Gly-Lys和Glu-Gly-Leu；或者Leu-Gly-Glu和Lys-Gly-Val； 或者
Gly-Gly-Gly和Gly-Gly-Gly。
链Z中各氨基酸残基的位置P1至Pn清楚地定义如下：P1表示链Z 中第一个氨基酸，其通过其N端与模板的C端偶联；Pn表示链Z中最 后一个氨基酸，其通过其C端与模板的N端偶联。
有利地，链Z包含或者其组成是：两个、三个、四个、五个、六 个或偶尔地多达10个氨基酸残基的关键序列，这些氨基酸残基的两个 末端成员是“恒定的”(“k”)，而其它任何成员或者也是“恒定的” 或者是“可变的”(“x”)，包括所有可能的组合或者排列方式。两个 末端“恒定”成员可以相同或者不同，这同样适用于剩余的任何“恒 定的”和/或任何“可变的”成员。
可以将关键序列翻译成寡聚核酸序列并植入本发明噬菌体展示肽 中。
尤其适宜的“恒定”成员(“k”)是Trp，Arg，Tyr，Ile，Asp，His， Lys，Glu和Thr，其它适宜的“恒定”成员(“k”)是Gln，Phe，Met 和Ser，且适宜的“可变”成员(“x”)是Ala，Leu和Val。
具有二个、三个、四个、五个和六个氨基酸残基的关键序列可以 示意性描述如下：
二肽
-k1-k2-
三肽
-k1-k2-k3-
-k1-x1-k2-
四肽
-k1-k2-k3-k4-
-k1-x1-k2-k3-
-k1-k2-x1-k3-
-k1-x1-x2-k2-
五肽
-k1-k2-k3-k4-k5-
-k1-x1-k2-k3-k4-
-k1-k2-x1-k3-k4-
-k1-k2-k3-x1-k4-
-k1-x1-x2-k2-k3-
-k1-k2-x1-x2-k3-
-k1-x1-k2-x2-k3-
-k1-x1-x2-x3-k2-
六肽
-k1-k2-k3-k4-k5-k6-
-k1-x1-k2-k3-k4-k5-
-k1-k2-x1-k3-k4-k5-
-k1-k2-k3-x1-k4-k5-
-k1-k2-k3-k4-x1-k5-
-k1-x1-x2-k2-k3-k4-
-k1-k2-x1-x2-k3-k4-
-k1-k2-k3-x1-x2-k4-
-k1-x1-k2-x2-k3-k4-
-k1-k2-x1-k3-x2-k4-
-k1-x1-k2-k3-x2-k4-
-k1-x1-x2-x3-k2-k3-
-k1-k2-x1-x2-x3-k3-
-k1-x1-k2-x2-x3-k3-
-k1-x1-x2-k2-x3-k3-
-k1-x1-x2-x3-x4-k2-
已知某些关键序列存在于重要的生理活性肽中，例如
RGD     在纤连蛋白(FN)、玻连蛋白(VN)、骨桥蛋白、
        胶原蛋白、血小板反应蛋白、纤维蛋白原(Fg)、
        冯.维勒布兰德因子(vWF)中，见Obrecht，D.；
        Altorfer，M.；Robinson，J.A.Adv.Med.
        Chem.Vol.4，1-68，JAI Press Inc.，1999
ELR     在CXC趋化因子中，见Saunders，J.；Tarby，
        C.M.Drug Discovery Today，1999，4，80-92
RKK     见J.Biol.Chem.1999，274，3513
KGF     见Prot.Sci.1998，7，1681-1690
VRKK[SEQ ID NO：1]   在血小板衍生生长因子(PDGF)中，见Ross，
                     R.；Raines，E.W.；Bowden-Pope，D.F.
                     Cell，1986，46，155-159
KKYL[SEQ ID NO：2]   在显示出对抗β-淀粉样神经毒性的神经保
                     护性质的VIP(血管肠肽，vasointestinal
                     peptide)中，见Proc.Natl.Am.Soc.
                     USA 1999，96，4143-4148
WLDV[SEQ ID NO：3]   在整联蛋白α4β1中，见Europ.J.Biol.1996，
                     242，352-362和Int.J.Pept.Prot.Res.
                     1996，47，427-436
YIRLP[SEQ ID NO：4]  在因子Xa抑制剂中，见Al Obeidis，F.；
                     Ostrem，J.A.Drug Discovery Today 1998，
                     3，223-231
YIGSR[SEQ ID NO：5]  在层粘连蛋白(laminine)中，见EMBO.J.
                     1984，3，1463
IKVAV[SEQ ID NO：6]  见Cell 1987，88，989
PPRXXW[SEQ ID NO：7] 见J.Biol.Chem.1998，273，
                     11001-11006&11007-11011
噬菌体展示是一项将变体多肽作为与外壳蛋白的融合蛋白展示在 噬菌体，丝状噬菌体颗粒，表面上的技术，见“肽和蛋白质的噬菌体 展示”(Phage Display of Peptides and Proteins)，B.K.Kay，J. Winter，J.Mc Cafferty 1996，Academic Press。
如本说明书中所述，术语“外壳蛋白”指至少一部分存在于病毒 颗粒表面上的蛋白质。外壳蛋白可以是主要的外壳蛋白或者可以是次 要外壳蛋白。
术语“电穿孔”指通过在足以允许细胞摄取外源物质的条件下向 细胞施加电压以将外源物质(蛋白质、核酸等)引入细胞中的方法。外 源物质典型地是DNA。
“融合蛋白”是具有共价连接在一起的两个部分的多肽，其中各 部分是具有不同性质的多肽。
“噬菌粒”是具有细菌复制起点ColE1和噬菌体的基因间隔区拷 贝的质粒载体。噬菌粒可以基于任何已知的噬菌体，包括丝状噬菌体。 可以以质粒形式扩增克隆在这些载体中的DNA区段。当给包含这些载 体的细胞提供产生噬菌体颗粒所必需的所有基因时，质粒复制模式转 变为滚环复制，以产生质粒DNA的一条链的拷贝并包装噬菌体颗粒。 噬菌粒可以形成感染性或非感染性噬菌体颗粒。
术语“噬菌体载体”指含有异源基因并能够复制的双链复制形式 的噬菌体。噬菌体载体具有噬菌体复制起点，从而允许噬菌体复制和 噬菌体颗粒形成。噬菌体优选是丝状噬菌体，例如M13噬菌体或其衍 生物，λ类噬菌体例如但不限于phi80、噬菌体21、82、424、432、 lambda.imm343、lambda.imm21、lambda.EMBL或lamdab.gt，或其所 有衍生物、遗传工程衍生物和杂种。
“连接”是在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程。为了连 接两个片段，两个DNA片段的末端必需彼此相容。大多数情况下，在 内切核酸酶消化后末端直接是相容的。然而，也可能必需首先将内切 核酸酶消化后通常产生的粘性末端转化成平末端以便其适用于连接。 为了产生平末端，在供应商描述的条件下，使用DNA修饰酶，例如T4 聚合酶或Klenow。
DNA纯化可以利用酚-氯仿、凝胶纯化或市场上出售的试剂盒完 成。
内切核酸酶消化后，可以使用聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳凝胶 纯化DNA，之后再进行连接。可以利用标准分子生物学技术(Sambrook 等，M：A Laboratory Manual，Sambrook等，分子克隆，实验室手册， Cold Spring Harbor，Laboratory Press，1989)或者应用商业试剂 盒例如但不限于QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Inc.， Chatsworth，Calif.)，纯化DNA。
在连接反应之前，可以用细菌碱性磷酸酶或小牛小肠碱性磷酸酶 处理线性化的载体片段以防止连接步骤过程中发生自连接。连接反应 优选使用T4DNA连接酶催化。如本领域普通技术人员所知，连接条件 可以在时间、温度、缓冲液浓度、待连接的DNA分子的量和连接酶及 ATP的量方面改变。
“寡核苷酸”是短长度的、单或双链多脱氧核苷酸，其可以利用 已知方法化学合成。或者，如果靶氨基酸序列是已知的，可以使用每 个氨基酸残基的已知优选编码残基，推导出潜在的核酸序列。
“结合配偶体复合体”是指彼此以一种特异的可检测方式结合在 一起的两个或多个分子的缔合，由此指配体和受体、抗体和抗原的缔 合。
可以有利地以平行阵列合成方式作为获得本发明化合物的合成方 法，以产生以上通式I的模板固定的β发夹模拟物的文库。此平行合 成允许以高产率和确定的纯度得到具有大量(通常地24至192个，典 型地96个)通式I化合物的阵列，使得二聚体和多聚体副产物的形成 最小化。官能化固相载体(即，固相载体加上接头分子)、模板和环化 位点的正确选择由此起到关键作用。
官能化固相载体可以方便地衍生自用(优选地1-5％的)二乙烯基 苯交联的聚苯乙烯；接枝了聚乙二醇间隔基的聚苯乙烯 和聚丙烯酰胺树脂(也参见Obrecht，D.；Villalgordo，J.-M，“小 分子量化合物文库的固相支持的组合和平行合成(Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries)”，四面体有机化学系列(Tetrahedron Organic Chemistry Series)，17卷，Pergamon，Elsevier Science，1998)。
固相载体通过接头，即双官能间隔分子官能化，该分子在一端包 含用于连接到固相载体上的固着基团并在另一端包含用于随后化学转 化和断裂程序的可选择性地断裂的官能团。就本发明而言，接头必需 设计成最终在不影响存在于各种氨基酸侧链中的任何官能团上的保护 基团的温和酸性条件下释放羧基。适用于本发明的接头与氨基酸的羧 基形成酸不稳定的酯，通常是酸不稳定的苄基、二苯甲基和三苯甲基 酯；这种接头结构的例子包括2-甲氧基-4-羟基甲基苯氧基(SasrinR 接头)、4-(2，4-二甲氧基苯基-羟基甲基)-苯氧基(Rink接头)、4-(4- 羟基甲基-3-甲氧基苯氧基)丁酸(HMPB接头)、三苯甲基和2-氯三苯甲 基。
优选载体得自用(最优选地1-5％的)二乙烯基苯交联并通过2- 氯三苯甲基接头官能化的聚苯乙烯。
当以平行阵列合成形式来进行时，本发明方法可有利地按下文所 述来进行，但是如果需要合成一种具有上式I的单个化合物，本领域 熟练技术人员显然立即可看出该工艺步骤必需如何进行修改。
在等于待由平行法合成的化合物的总数的许多反应容器(一般 24-192，典型96个)中装载25-1000mg，优选100mg的合适官能化 固相载体，优选1-3％交联的聚苯乙烯或tentagel树脂。
所用溶剂必需能够溶胀树脂，且包括，但不限于，二氯甲烷(DCM)、 二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二噁烷、甲苯、四氢呋 喃(THF)、乙醇(EtOH)、三氟乙醇(TFE)、异丙醇等。包含至少一种极 性溶剂组分的溶剂混合物(例如，20％TFE/DCM、35％THF/NMP)对保证 树脂结合的肽链的高反应性和溶剂化是有益的(Fields，G.B.， Fields，C.G.，J.Am.Chem.Soc.1991，113，4202-4207)。
随着开发出各种能够在不影响保护侧链中的官能团的酸不稳定基 团的温和酸性条件下释放C-末端羧酸基团的接头，受保护的肽链片段 的合成已取得显著进步。2-甲氧基-4-羟基苄醇-衍生的接头(SasrinR 接头，Mergler等，Tetrahedron Lett.1988，29 4005-4008)可用稀 三氟乙酸(在DCM中的0.5-1％TFA)断裂且在肽合成过程中在Fmoc去 保护条件下是稳定的，基于Boc/tBu的其它保护基团适合该保护方案。 适用于本发明方法的其它接头包括超酸不稳定的4-(2，4-二甲氧基苯 基-羟基甲基)-苯氧基接头(Rink接头，Rink，H.Tetrahedron Lett. 1987，28，3787-3790)，其中肽的去除需要10％于DCM中的乙酸或0.2％ 于DCM中的三氟乙酸；4-(4-羟基甲基-3-甲氧基苯氧基)丁酸-衍生的 接头(HMPB-接头，&Riniker，Peptides 1991，1990 131)，其也用1％TFA/DCM断裂以得到包含所有酸不稳定侧链保护基团 的肽链片段；以及，2-氯三苯甲基氯化物接头(Barlos等，Tetrahedron Lett.1989，30，3943-3946)，它能够通过使用冰醋酸/三氟乙醇/DCM (1∶2∶7)的混合物处理30分钟以实现肽的脱离。
适用于氨基酸，以及相应地适用于其残基，的保护基团是，例如
-对于氨基(也存在于赖氨酸的侧链中)
Cbz    苄氧基羰基
Boc    叔丁基氧基羰基
Fmoc   9-芴基甲氧基羰基
Alloc  烯丙基氧基羰基
Teoc   三甲基甲硅烷基乙氧基羰基
Tcc    三氯乙氧基羰基
Nps    邻硝基苯基磺酰基；
Trt    三苯基甲基或三苯甲基
-对于羧基(也存在于天冬氨酸和谷氨酸的侧链中)，用醇组分转 化成酯
tBu    叔丁基
Bn     苄基
Me     甲基
Ph     苯基
Pac    苯甲酰基甲基
       烯丙基
Tse    三甲基甲硅烷基乙基
Tce    三氯乙基；
-对于胍基(存在于精氨酸的侧链中)
Boc    叔丁氧羰基
Pmc    2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基
Ts     对甲苯磺酰基(即，对甲苯磺酰基)
Cbz    苄氧基羰基
Pbf    甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
-对于羟基(存在于例如苏氨酸和丝氨酸的侧链中)
tBu    叔丁基
Bn     苄基
Trt    三苯甲基
-以及对于巯基(存在于半胱氨酸的侧链中)
Acm    乙酰氨基甲基
tBu    叔丁基
Bn     苄基
Trt    三苯甲基
Mtr    4-甲氧基三苯甲基.
9-芴基甲氧基羰基-(Fmoc)-保护的氨基酸衍生物优选用作结构单 元以构建具有式I的模板固定的β-发夹环模拟物。对于去保护，即， Fmoc基团的断裂除去，可以使用在DCM中的20％哌啶或在DMF中的2％ DBU/2％哌啶。
基于每克原始称重到反应管中的官能化固相载体的荷载量的毫摩 尔数/克(meq/g)(对于聚苯乙烯树脂，通常为0.1-2.85mmol/g)，反 应物，即氨基酸衍生物，的量通常是1-20当量。如果驱动反应在合理 时间内完成需要的话，可以使用外加当量的反应物。将反应管以及夹 具部件和歧管重新插入储集部件中并将该装置固定在一起。启动通过 歧管的气流以提供受控环境，例如氮气、氩气、空气和类似物。气流 也可在流过歧管之前加热或冷却。反应孔的加热或冷却通过加热反应 部件或外部用异丙醇/干冰和类似物进行冷却而实现，由此获得所需的 合成反应。搅拌通过振荡或磁力搅拌(在反应管内)而实现。优选的工 作台(但不限于此)是ACT90，Symphoni abi 433A肽合成仪和MultiSyn Tech′s-Syro合成仪。
酰胺键形成需要活化α-羧基以用于酰化步骤。当这种活化通过常 用的碳二亚胺如二环己基碳二亚胺(DCC，Sheehan&Hess，J.Am. Chem.Soc.1955，77，1067-1068)或二异丙基碳二亚胺(DIC， Sarantakis等Biochem.Biophys.Res.Commun.1976，73，336-342) 来进行时，所得二环己基脲和二异丙基脲分别是不溶性的和可溶于一 般使用的溶剂。在该碳二亚胺方法的一个变型中，1-羟基苯并三唑 (HOBt，&Geiger，Chem.Ber 1970，103，788-798)作为偶联 混合物的添加剂而包括在内。HOBt防止脱水、抑制活化氨基酸的外消 旋化并用作催化剂以改善缓慢的偶联反应。已经使用某些磷鎓试剂作 为直接偶联试剂，如苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲基氨基)-磷鎓六氟 磷酸盐(BOP)(Castro等，Tetrahedron Lett.1975，14，1219-1222； Synthesis，1976，751-752)、或苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷基- 磷鎓六氟磷酸盐(Py-BOP，Coste等，Tetrahedron Lett.1990，31， 205-208)、或2-(1H-苯并三唑-1-基-)1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸 盐(TBTU)、或六氟磷酸盐(HBTU，Knorr等，Tetrahedron Lett.1989， 30，1927-1930)；这些磷鎓试剂也适合与受保护的氨基酸衍生物原位 形成HOBt酯。更新近的是，还使用二苯氧基磷酰基叠氮化物(DPPA) 或O-(7-氮杂-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐 (TATU)或O-(7-氮杂-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟 磷酸盐(HATU)/7-氮杂-1-羟基苯并三唑(HOAt，Carpino等， Tetrahedron Lett.1994，35，2279-2281)作为偶联试剂。
由于接近定量的偶联反应是必需的，因此期望有反应完成的实验 证据。可在每个偶联步骤之后容易并迅速地进行茚三酮试验(Kaiser 等，Anal.Biochemistry 1970，34，595)，其中对树脂结合肽的等 分试样的阳性比色反应定性地表示伯胺的存在。当用碱释放Fmoc生色 团时，Fmoc化学允许分光光度检测Fmoc生色团(Meienhofer等，Int. J.Peptide Protein Res.1979，13，35-42)。
每个反应管内的树脂结合的中间体利用以下两种方法之一，通过 重复暴露于纯溶剂而洗净过量的保留试剂、溶剂、和副产物：
1)用溶剂(优选5ml)加入反应孔，浸泡反应管以及夹具部件和 歧管并搅拌5-300分钟，优选15分钟，并利用重力，随后利用通过歧 管入口(在关闭出口的同时)施加的气压进行排液以排出溶剂；
2)将歧管从夹具部件上移开，分配溶剂的等分试样(优选5ml) 使之通过反应管的顶部并利用重力通过过滤器排放到接收容器如试管 或小瓶中。
以上两种洗涤方法都重复最高约50次(优选约10次)，利用TLC、 GC、或洗涤液的视觉检测之类的方法监控试剂、溶剂、和副产物去除 的效率。
每一相继转化都重复上述将树脂结合的化合物与试剂在反应孔内 反应并随后去除过量试剂、副产物和溶剂的程序，直到获得最终的、 树脂结合的、完全被保护的线性肽。
通过将反应管以及夹具部件和歧管浸在包含断裂试剂溶液(优选 3-5ml)的反应孔中，使完全被保护的线性肽脱离固相载体。气流、温 度控制、搅拌、和反应监测如上所述并根据需要进行，以实现此脱附 反应。反应管以及夹具部件和歧管从储集部件上拆开并升高到溶液液 位之上但低于反应孔的上唇，然后通过歧管入口(同时关闭出口)施加 气压以有效地将最终产物溶液排出到储集井中。留在反应管中的树脂 随后如上所述用3-5ml的合适溶剂洗涤2-5次以提取(洗出)尽可能多 的脱离产物。合并如此得到的产物溶液，小心以避免交叉混合。各溶 液/提取物随后根据需要进行处理以分离最终化合物。典型的处理包 括，但不限于，蒸发、浓缩、液/液萃取、酸化、碱化、中和或其它溶 液中的反应。
将包含已从固相载体上断裂下来并用碱中和的完全被保护的线性 肽衍生物的溶液蒸发。在使该完全被保护的线性肽脱离固相载体前， 如果期望，可以选择性地将N端氨基酸残基的被保护的α-氨基去保 护，并使用对应于待引入的酰基取代基的酰化剂，酰化由此释放的该 氨基基团。或者，可以首先选择性地除去半胱氨酸的保护基，并可以 按如下所述进行环化。自树脂上的断裂和环肽的去保护可以按如下所 述实施。
该完全被保护的肽衍生物用82.5％TFA、5％H2O、5％苯酚、5％苯 硫基甲烷(thioanisol)、2.5％乙硫醇(ethanthiol)或其它用于断 裂保护基的清除剂的组合进行处理。断裂反应时间通常为30分钟至 12小时，优选大约5小时。然后蒸发掉大多数TFA并用醚或其它适用 于此的溶剂沉淀该产物。在小心去除溶剂之后，可以纯化由此获得的 肽衍生物。
然后在溶液中使用溶剂，例如水、DMF等实现环化(二硫键形成)。 可以将各种氧化试剂，例如H2O2、空气或者碘用于环化。环化持续时 间大约15分钟至24小时，优选地大约40分钟。通过例如RP-HPLC(反 相高效液相色谱)和质谱跟踪反应进程。然后通过蒸发除去溶剂，并经 RP-HPLC纯化环肽衍生物。
本发明噬菌体展示方法可以按如下进行：
将本发明的模板固定的β发夹环模拟物与噬菌体外壳蛋白的至少 一部分融合，形成含有所述模板固定的β发夹环模拟物的融合蛋白质。 该融合蛋白可以通过使用已知的噬菌体展示技术，例如如下所述的技 术，表达编码此融合蛋白的基因融合物而制备。
噬菌体展示是一种将变体多肽以和外壳蛋白质融合的融合蛋白质 形式展示在噬菌体颗粒表面上的已知技术(Scott，J.K.和Smith， G.P.，Science，1990，249；386)。此应用的基础在于如下事实：可 以快速有效地分拣由选择性随机化的蛋白质变体(或者随机克隆的 cDNA)组成的大型文库以找到与靶分子以高亲和力结合的那些序列。
典型地，将变体多肽，例如本发明的模板固定的β发夹模拟物， 与展示在病毒体一端的基因III蛋白质融合。
单价噬菌体展示是将蛋白质或肽序列与基因III蛋白质的一部分 融合并在野生型基因III蛋白质存在下以低水平表达该融合蛋白的一 种方法，由此病毒颗粒将展示大部分为野生型的基因III蛋白质和一 个或零个拷贝的融合蛋白质，该技术也可以用于本发明中。
适用于展示本发明模板固定的β发夹模拟物的基因III载体包括 fUSE5，MKE 13(New England Biolabs，Inc)，fAFF1(Cwirla等，Proc. Natl.Acad.Sci USA，1990，87，6378-6382)，fd-CAT1，fdtetDOG， 33，88，pComb3，pComb8，m663，pHEN1，pCANTAB5E genentech载体 CB等。
用于蛋白质、肽和其突变变体的噬菌体展示方法是已知的并可以 用于本发明，该方法包括构建一系列含有可操作地与编码融合多肽的 基因融合物连接的转录调节元件的变体可复制载体，转化适宜的宿主 细胞，培养转化的细胞以形成在其表面上展示该融合多肽的噬菌体颗 粒，使该重组噬菌体颗粒与靶分子接触以使该颗粒的至少一个部分与 靶结合，和将结合的和未结合的颗粒分开(O`Neil K.and Hoess R.， Curr.Opin Struct.Biol.19955，443-449)。
编码噬菌体外壳蛋白的基因和编码融合蛋白中的目的模板固定的 β发夹模拟物部分的基因可以通过本领域已知方法(Sambrook等，分 子克隆，实验室手册，Cold Spring Harbor，Laboratory Press，pp. A1-A4 1989)获得。编码所述基因的DNA可以化学合成(Letzinger和 Khorona.J.Am.Chem.Soc.1965，87，3526，ibd.1966，88，3181； L.J.McBride，M.H.Caruthers，Tetrahedron Lett.1983，24， 245-248)，然后按如下述方式突变以制备变体文库。
为了将DNA片段连接在一起以形成含有融合基因的功能载体，DNA 片段的末端必需彼此相容。可能必需首先将内切核酸酶消化后通常产 生的粘性末端转化成平端，以便它们适于连接。为了使末端平端化， 在适宜的缓冲液中15℃用DNA聚合酶I的Klenow片段(Klenow)在四 种脱氧核苷三磷酸存在下处理DNA至少15分钟。然后利用酚-氯仿提 取和乙醇沉淀或者其它DNA纯化技术，纯化DNA。
切割的DNA片段可以使用凝胶电泳按大小分离和选择。DNA可以 通过琼脂糖或聚丙烯酰胺基质进行电泳。电泳后，利用电洗脱或者用 于纯化和连接的方法，从基质中提取DNA。
将待连接在一起的DNA片段以大约等摩尔量置于溶液中。溶液还 含有ATP、连接酶缓冲液和连接酶例如T4 DNA连接酶。
连接后，通过标准分子生物学方法(Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，Laboratory Press，1989)，纯化目前插入了外源基因的载体，并转化适宜的宿主 细胞。优选的转化方法是电穿孔，这可以使用本领域已知技术进行。 对于文库构建，优选地DNA以每100微升感受态细胞悬浮液0.05-0.2 微克的终浓度存在。
优选纯化DNA以除去杂质。可以通过任何已知方法纯化DNA；然 而，优选的纯化方法是使用DNA亲和纯化。使用DNA结合树脂和亲和 试剂纯化DNA是熟知的，并且在本发明中可以使用本领域熟知的任何 此类方法。
可以通过电穿孔转化的任何适宜细胞均可以作为宿主细胞用于本 发明方法中。可以被转化的适宜宿主细胞包括革兰氏阴性细胞例如大 肠杆菌(E.coli)。适宜的大肠杆菌菌株包括但不限于XL1 Blue (Stratagene)，ElectroTen-Blue(Stratagene，)，ER2738(New England Biolabs)，DH5α(Gibco)，MC1061(美国典型培养物保 藏中心(ATTC)，ATTC号53338)。
电穿孔过程中优选使用的细胞浓度为每ml有生活力的活细胞悬 液大约1010或更高菌落形成单位。电穿孔后，优选在SOC培养基(对于 SOC培养基的制备，见例如Sambrook等，分子克隆，实验室手册， Cold Spring Harbor Laboratory Press，pp.A1-A4，1989)中培养 细胞。
如果氨基酸在多肽链中紧靠在一起，则可以使用编码所有期望的 氨基酸替代的一个寡核苷酸同时突变这些氨基酸。可以合成在预定位 置含有多义的或非多义的核苷酸(例如编码本发明模板)的寡核苷酸。 在多义位置，在合成过程中包括所有核苷酸的混合物或者选定的一个 核苷酸子集的混合物。编码完整集合氨基酸的密码子可以通过例如 NNK或NNS密码子体现，其中N是A、C、G或T，且K是G或T且S 是G或C。
选择转化细胞后，培养细胞，然后可以分离载体DNA。可以使用 本领域已知方法，分离、纯化和采用DNA测序方法分析噬菌体或噬菌 粒载体DNA。
本发明证明了新系统在合理设计和分析具有充分确定的结构特征 的肽方面的优点。包含此类模板固定的β发夹模拟物的组合文库及其 使用方法为探索蛋白质-蛋白质相互作用提供了有用信息和工具。本文 中公开的或者根据本发明公开制备的模板固定的β发夹模拟物，可以 是各种生物剂或治疗剂的候选物，包括但不限于，酶抑制剂、配体拮 抗剂或配体激动剂。
以下实施例更详细地举例说明本发明，但无意于以任何方式限定 其范围。将以下缩写用于这些实施例：
HBTU：1-苯并三唑-1-基-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
(Knorr等Tetrahedron Lett.1989，30，1927-1930)
HOBt：1-羟基苯并三唑
DIEA：二异丙基乙胺
实施例
1.模板限制的β发夹模拟物的肽合成
a)合成
第一个被保护的氨基酸残基的偶联
将0.5g 2-氯三苯甲基氯化物(2-chlorotritylchoride)树脂 (Barlos等Tetrahedron Lett.1989，30，3943-3946)(0.83mmol/g， 0.415mmol)装到一干燥烧瓶中。该树脂悬浮于CH2Cl2(2.5ml)中并 在室温下在恒定搅拌下溶胀30分钟。树脂用在CH2Cl2(2.5ml)中的 0.415mMol(1当量)第一个适宜地被保护的氨基酸残基(参见下文) 和284μl(4当量)二异丙基乙胺(DIEA)处理，将该混合物在25℃下 振荡4小时。树脂颜色变成紫色且溶液保持微黄色。振荡(30ml的 CH2Cl2/MeOH/DIEA：17/2/1)树脂30分钟，然后用CH2Cl2(1x)，DMF (1x)，CH2Cl2(1x)，MeOH(1x)，CH2Cl2(1x)，MeOH(1x)，CH2Cl2(2x)， Et2O(2x)按此顺序洗涤并真空干燥6小时。
载荷典型地是0.45-0.5mMol/g。
制备以下预载荷的树脂：Fmoc-Cys(Trt)-氯三苯甲基树脂； Fmoc-Glu(OtBu)-氯三苯甲基树脂；Fmoc-Lys(Boc)-氯三苯甲基树脂； Fmoc-Val-氯三苯甲基树脂；和Fmoc-Gly-氯三苯甲基树脂。
程序1
使用Syro-肽合成器(Multisyntech)用24-96个反应容器进行合 成。在每一容器中放置60mg(加载之前树脂的重量)上面的树脂。编 程和实施以下反应循环：
步骤     试剂                          时间
1        CH2Cl2，洗涤和溶胀(手工)      3x1分钟
2        DMF，洗涤和溶胀               1x5分钟
3        40％哌啶/DMF                  1x5分钟
4        DMF，洗涤                     5x2分钟
5        5当量Fmoc氨基酸/DMF+5当量     1x120分钟
         HBTU+5当量HOBt+5当量DIEA
6        DMF，洗涤                     4x2分钟
7        CH2Cl2，洗涤(在合成结束时)    3x2分钟
重复步骤3-6以便添加每个氨基酸。
氨基端氨基酸的乙酰化
实施程序1的步骤1-4以从合成的序列的N端除去Fmoc保护基。
然后，将加载了肽的树脂转移至15ml配备有釉料(frit)和活塞 的注射器中。用5ml CH2Cl2溶涨树脂30分钟。向每一个反应器中加入 DIEA(0.4ml)和乙酸酐(0.1ml)。振荡树脂6小时至1夜。过滤树脂并 相继用CH2Cl2/MeOH/CH2Cl2/MeOH/CH2Cl2/二乙基醚洗涤。真空干燥 树脂。
完全被保护的肽片段的断裂和去保护
在完成合成之后，树脂悬浮在1ml于CH2Cl2中的1％TFA(v/v) 和1ml于CH2Cl2中的20％DIEA中3分钟。该过程重复3次以保证断裂 完成。滤液蒸发至干，并且产物用包含82.5％三氟乙酸(TFA)、5％水、 5％苯酚、5％苯硫基甲烷和2.5％乙二硫醇(ethanedithiol)的断裂混 合物室温处理5小时以完全地去保护，然后真空浓缩。通过添加10ml 二乙基醚沉淀肽、然后离心、除去醚相。用5ml二乙基醚重复该操作 两次。
粗肽溶解在1ml 10％CH3CN水溶液和0.5至1mlDMF中，硅藻土过 滤，并通过制备性反相-HPLC纯化。
线性去保护肽的环化
将所获得的线性肽以10-4M浓度溶解在1.5ml水中，加入15μl H2O2(0.01M，1当量)。环化时间不超过700分钟。所获环肽利用分析 性HPLC和ESI-MS分析。包含HPC保持时间和ESI-MS的分析数据显示 在实施例中。
使用VYDAC 218MS5215柱(尺寸0.21cm×15cm，5μm填充侧 (packing side)(二氧化硅))用如下溶剂A(H2O+0.02％TFA)和B(CH3CN) 及如下梯度：0min：92％A，8％B；8min：62％A 38％B；9-12min：0％ A，100％B，流速：0.4ml/min，确定分析性HPLC保持时间(RT，单位： 分钟)。
实施例1(n＝8)显示在表1中。以氨基酸Cys起始，合成肽，将 Cys嫁接至树脂上。起始树脂是Fmoc-Cys(Trt)-氯三苯甲基树脂(按 以上所述制备)。根据程序1以如下顺序在固相载体上合成线性肽： 树脂-Cys-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys，然后按所指明的进行酰 化、断裂、去保护、纯化和环化。使用上述梯度确定HPLC保持时间(分 钟)和质量：RT＝7.26min，[M+H]+＝1281.3。
实施例2(n＝8)显示在表1中。以氨基酸Lys起始，合成肽，将 Lys嫁接至树脂上。起始树脂是Fmoc-Lys(Boc)-氯三苯甲基树脂(按 以上制备)。根据程序1以如下顺序在固相载体上合成线性肽：树脂 -R2-Cys-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys-R1，然后按所指明的对肽进 行酰化、断裂、去保护、纯化和环化。使用上述梯度确定HPLC保持时 间(分钟)和质量：RT＝6.41min，[M+H]+＝871.4。
实施例3(n＝10)显示在表2中。以氨基酸Cys起始，合成肽，将 Cys嫁接至树脂上。起始树脂是Fmoc-Cys(Trt)-氯三苯甲基树脂(按 以上制备)。根据程序1以如下顺序在固相载体上合成线性肽：树脂- Cys-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys，然后按所指明的对肽进 行酰化、断裂、去保护、纯化和环化。使用上述梯度确定HPLC保持时 间(分钟)和质量：RT＝5.74min，[M+H]+＝779.2。
实施例4(n＝10)显示在表2中。以氨基酸Lys起始，合成肽，将 Lys嫁接至树脂上。起始树脂是Fmoc-Lys(Boc)-氯三苯甲基树脂(按 以上制备)。根据程序1以如下顺序在固相载体上合成线性肽：树脂 -R2-Cys-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys-R1，然后按所指明的 对肽进行酰化、断裂、去保护、纯化和环化。使用上述梯度确定HPLC 保持时间(分钟)和质量：RT＝5.13min，[M+H]+＝1009.2。
实施例5(n＝10)显示在表2中。以氨基酸Cys起始，合成肽，将 cys嫁接至树脂上。起始树脂是Fmoc-Cys(Trt)-氯三苯甲基树脂(按 以上制备)。根据程序1以如下顺序在固相载体上合成线性肽：树脂- Cys-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys，然后按所指明的对肽进 行酰化、断裂、去保护、纯化和环化。使用上述梯度确定HPLC保持时 间(分钟)和质量：RT＝6.81min，[M+H]+＝1482.6。
实施例6和7(n＝10)显示在表2中。以嫁接至树脂上的氨基酸Val 起始，合成肽。起始树脂是Fmoc-Val-氯三苯甲基树脂(按以上制备)。 根据程序1以如下顺序在固相载体上合成线性肽：树脂 -R2-Cys-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys-R1，然后按所指明的 对肽进行酰化、断裂、去保护、纯化和环化。使用上述梯度确定HPLC 保持时间(分钟)和质量：实施例6：RT＝7.24min，[M+H]+＝977.0；实 施例7：RT＝6.24min，[M+H]+＝941.2。
实施例8(n＝10)显示在表2中。以嫁接至树脂上的氨基酸Gly起 始，合成肽。起始树脂是Fmoc-Gly-氯三苯甲基树脂(按以上制备)。 根据程序1以如下顺序在固相载体上合成线性肽：树脂 -R2-Cys-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys-R1，然后按所指明的 对肽进行酰化、断裂、去保护、纯化和环化。使用上述梯度确定HPLC 保持时间(分钟)和质量：RT＝6.39min，[M+H]+＝856.0。
实施例9(n＝10)显示在表2中。以嫁接至树脂上的氨基酸Lys起 始，合成肽。起始树脂是Fmoc-Lys(Boc)-氯三苯甲基树脂(按以上制 备)。根据程序1以如下顺序在固相载体上合成线性肽：树脂 -R2-Cys-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys-R1，然后按所指明的 对肽进行酰化、断裂、去保护、纯化和环化。使用上述梯度确定HPLC 保持时间(分钟)和质量：RT＝6.18min，M+H]+＝972.3。
实施例10(n＝10)显示在表3中。以嫁接至树脂上的氨基酸Lys 起始，合成肽。起始树脂是Fmoc-Lys(Boc)-氯三苯甲基树脂(按以上 制备)。根据程序1以如下顺序在固相载体上合成线性肽：树脂 -R2-Cys-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys-R1，然后按所指明的 对肽进行酰化、断裂、去保护、纯化和环化。使用上述梯度确定HPLC 保持时间(分钟)和质量：RT＝5.49min，[M+H]+＝1142.0。
实施例11(n＝10)显示在表3中。以嫁接至树脂上的氨基酸Glu 起始，合成肽。起始树脂是Fmoc-Glu(Boc)-氯三苯甲基树脂(按以上 制备)。根据程序1以如下顺序在固相载体上合成线性肽：树脂 -R2-Cys-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys-R1，然后按所指明的 对肽进行酰化、断裂、去保护、纯化和环化。使用上述梯度确定HPLC 保持时间(分钟)和质量：RT＝6.85min，[M+H]+＝1033.8。
实施例12(n＝10)显示在表3中。以嫁接至树脂上的氨基酸Gly 起始，合成肽。起始树脂是Fmoc-Gly-氯三苯甲基树脂(按以上制备)。 根据程序1以如下顺序在固相载体上合成线性肽：树脂 -R2-Cys-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys-R1，然后按所指明的 对肽进行酰化、断裂、去保护、纯化和环化。使用上述梯度确定HPLC 保持时间(分钟)和质量：RT＝6.41min，[M+H]+＝913.0。
实施例13(n＝12)显示在表4中。以嫁接至树脂上的氨基酸Cys 起始，合成肽。起始树脂是Fmoc-Cys(Trt)-氯三苯甲基树脂(按以上 制备)。根据程序1以如下顺序在固相载体上合成线性肽：树脂- Cys-P12-P11-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys，然后按所指明 的对肽进行酰化、断裂、去保护、纯化和环化。使用上述梯度确定HPLC 保持时间(分钟)和质量：RT＝5.74min，[M+H]+＝836.5。
实施例14(n＝12)显示在表4中。以嫁接至树脂上的氨基酸Lys 起始，合成肽。起始树脂是Fmoc-Lys(Boc)-氯三苯甲基树脂(按以上 制备)。根据程序1以如下顺序在固相载体上合成线性肽：树脂 -R2-Cys-P12-P11-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys-R1，然后按 所指明的对肽进行酰化、断裂、去保护、纯化和环化。使用上述梯度 确定HPLC保持时间(分钟)和质量：RT＝5.01min，[M+H]+＝1065.1。
2a.模板固定的β发夹模拟物的二硫键形成动力学的测量方法
制备每个线性去保护的纯化肽的储备溶液，含有1.5ml浓度为 10-4M的肽在水中的溶液。按上述，在分析性LC-MS上监测二硫键形成。 在时间t0，无氧化试剂H2O2存在时得到第一个数据点。加入氧化剂 H2O2(15μl，0.01M，1当量)后15分钟，获取第二个数据点。每隔33 分钟记录数据点，直到检测到无转化进展之后。
通过波长220nm下时间t时环肽的峰面积百分数(手工积分)减去 时间t0时环肽的峰面积百分数(手工积分)，计算二硫键桥接的环肽 的量。
2b.测量圆二色性的方法
园二色性测量对于肽和蛋白质的二级结构敏感，并且已经广泛地 用于检查两者的构象(M.Jourdan，S.R.Griffiths-Jones，M.S. Searle，Eur.J.Biochem.2000，267，3539-3548；J.T.Pelto，L.R. Mc.Lean，Analytical Biochemistry，2000，277，167-176)。
在配备有Windows 95/NT的光谱管理程序(1.52.01版本[Build2]) 的Jasco J-715旋光分光计上，获得园二色性光谱。所有测量均在室 温下在具有0.1cm光程的石英室中在水中进行。以1nm带宽(Band width)记录光谱，收集5个扫描以提高信噪比，记录溶剂基线并从样 品光谱中扣除。将所有CD谱进行平滑化(以相同值)，并以肽残基的分 子椭圆度单位(Mol.Ellip.)形式报告。
测量参数：带宽：1.0nm，反应：1s，灵敏度：标准，测量范围： 240-190nm，数据倾斜度(pitch)：0.5nm，扫描速度：50nm/min。 线性、去保护的纯化的肽溶液的浓度：TFA盐形式在水中10-4M。作为 以下实施例的前体的线性脱保护的纯化肽的pH和纯度是：实施例3： pH 6.38，纯度91％；实施例4：pH 6.77，纯度89％；实施例5：pH 6.01，纯度98％；实施例9：pH 6.00，纯度94％。
2c.结果：
图1-6比较了直到检测不到转化进程之前的时间，二硫键桥接的 β发夹模拟物的形成百分数。
图1：实施例1和2(n＝8)；具有模板的实施例2的化合物的二硫 键形成速度与不具有模板的实施例1参照物的比较。
图2：实施例3和4(n＝10)；具有模板的实施例4的化合物的二 硫键形成速度与不具有模板的实施例3参照物的比较。
图3：实施例5-9(n＝10)；具有模板的实施例6-9的化合物的二 硫键形成速度与不具有模板的实施例5参照物的比较。
图4：实施例3和10(n＝10)；具有模板的实施例10的化合物的 二硫键形成速度与不具有模板的实施例3参照物的比较。
图5：实施例5、11和12(n＝10)；具有模板的实施例11和12的 化合物的二硫键形成速度与不具有模板的实施例5参照物的比较。
图6：实施例13和14(n＝12)；具有模板的实施例14的化合物的 二硫键形成速度与不具有模板的实施例13参照物的比较。
图7：实施例3、4、5和9的化合物的线性肽前体(即，在二硫 键形成之前)的CD谱(ε，degxcm2/mol)。
2d.讨论
设计实施例序列Z
选择了两种不同类型的核心肽序列Z，以研究模板是否将利于模 板固定的β发夹模拟物的形成和稳定：序列-Leu-Trp-Tyr-Ser -Asn-His-Trp-Val-[SEQ ID NO：22]取自抗体的CDR L3环(L.Jiang， K.Moehle，J.Robinson，Chimia(2000)54，558-563)，并修饰成 序列-Lys-Trp-Phe-Ser-Asn-His-Tyr-Gln-[SEQ ID NO：23]，后一序 列含有根据P.Y.Chou G.D Fasman，J.Mol.Biol.(1977)115， 135-175的稳定性β转角和β折叠序列，作为参照β-发夹。第二序列 Z-Phe-Leu-Ala-His-Tyr-Ala-[SEQ ID NO：24]构建自序列 -Leu-Trp-Tyr-Ser-Asn-His-Trp-Val-Lys-Trp-[SEQ ID NO：25]，其 不含有根据P.Y.Chou G.D Fasman，J.Mol.Biol.(1977)115， 135-175的专门的稳定性β-转角序列或β折叠序列。
图1-6所示的结果说明，具有模板和核心序列 -Phe-Leu-Ala-His-Tyr-Ala-[SEQ ID NO：24]的化合物的二硫键形 成速度比含有相同核心序列但不含有模板的化合物的二硫键形成速度 快。这些结果清楚地说明，本发明模板有效地促进了β发夹模拟物的 形成。甚至在核心序列Z-Lys-Trp-Phe-Ser-Asn-His-Tyr-Gln-[SEQ ID NO：23](它自身已经含有稳定性β转角和β折叠序列)的情况下， 也可以证明(见图2和4)模板促进了β发夹模拟物的形成。
此外，含有核心序列-Phe-Leu-Ala-His-Tyr-Ala-[SEQ ID NO：24] 但不含有模板的实施例5化合物的线性前体的CD谱(见图7)显示出高 含量的卷曲-和α-螺旋结构以及痕量的β折叠结构，而实施例9化合 物的线性前体(含有模板和相同核心序列)显示出高含量的β折叠结构 和β转角结构。含有核心序列Lys-Trp-Phe-Ser-Asn-His-Tyr-Gln- [SEQ ID NO：23]但不含有模板的实施例3化合物的线性前体的CD谱显 示出卷曲结构和β折叠结构的混和，而实施例4化合物的线性前体(含 有模板和相同核心结构)的CD谱显示出高含量的β折叠结构。这些发 现说明，本发明模板诱导了β发夹模拟物形成。
3.构建噬菌体展示的、并入了模板的、模板固定的β发夹模拟物 序列
程序1：
本发明寡核苷酸文库可以根据Ph.D.肽展示克隆系统，技术公 报#E801(8/21/02，New England Biolabs，Inc)和K.Noren，C.Noren， Methods，2001，23，169-178的方法和丝状噬菌体M13KE的基因III 融合。
按如下部分所述完成实施例3模板固定的发夹模拟物[SEQ ID NO： 10]的噬菌体展示。对于表5-9中列出的所有其它序列，除了用于产生 插入DNA的寡核苷酸不同外，使用相应的程序。
使用寡核苷酸1和2(见下述)构建插入DNA。下划线表示用于向 载体DNA中进行克隆的单一AccI和EagI限制性位点的位置。
对于退火，将2μg(大约170pmol)寡核苷酸1和4.5μg寡核苷酸 2(大约170pmol)在含有100mM NaCl的50μl TE(10mM Tris-HCl， pH 8.0，1mM EDTA)中加热至大约95℃。经15至30分钟缓慢地冷却 后，用DNA聚合酶I的Klenow片段在200μl总体积中延伸退火的双 螺旋。反应条件概述于Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，Laboratory Press中。 所得插入DNA用EagI和Acc65I按照供应商(New England Biolabs) 推荐的条件消化。用酚/氯仿和氯仿抽提混合物，之后用乙醇沉淀水相。 沉淀物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上利用标准分子生物学程序 (Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，Laboratory Press)纯化。
用EagI和Acc65I根据New England Biolabs推荐的条件消化15 μg M13KE载体(New England Biolabs)。混合物在琼脂糖上纯化，并 用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)回收线性化的载体DNA。
1号寡核苷酸
Acc65I
5′CATGCCCGGGTACCTTTCTATTCTCACTCTGAAACCTGC 3′[SEQ ID NO：26]
2号寡核苷酸
EagI
5’
CATGTTTCGGCCGAGCCACCACCTTTGGTGCAGGTCTGATAATGGTTGCT
GAACCATTTGGTGCAGGTTTCAGAGTGAGAATAG’3′[SEQ ID NO：27]
对于插入DNA的克隆，未优化连接条件。
简言之，在总体积20μl的T4DNA连接酶缓冲液中16℃过夜连 接，所述缓冲液含有大约40ng线性化的载体、大约3∶1摩尔过量的双 链和200单位T4连接酶。对照反应仅含有载体并加上和减去连接酶， 实施此对照反应以确定连接效率和由于载体重新连接导致的背景。连 接混合物65℃加热灭活15分钟，用1μl等分试样对100μl Electro Ten-blue电穿孔感受态细胞(Stratagene)按照New England Biolabs 所述进行随后的电穿孔。电穿孔后立即向每个小杯中加入1ml SOC培 养基(2％细菌用胰蛋白胨、0.5％细菌用酵母提取物、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mM葡萄糖)，37℃孵育30分钟。使 用其等分试样，利用含有X-gal和IPTG的培养基，通过兰/白筛选滴 定每一培养物。选择用于序列验证的各个克隆，37℃孵育4-4.5小时 后在1ml 1∶100稀释的XL1-Blue过夜培养物中温育。从这些液体培养 物，应用本领域熟知的方案，获得用于长期储存和测序目的的噬菌体。
程序2：(随机化的模板固定的β发夹模拟物文库)
实施例15序列[SEQ ID NO：42](见表9)的噬菌体展示代表随机 化的模板固定的β发夹模拟物文库的制备，并描述在以下部分。
使用寡核苷酸1和3(分别见上文和下文)构建插入DNA。下划线 表示用于向载体DNA中进行克隆的单一AccI和EagI限制性位点的位 置。
对于退火，将2μg(大约170pmol)寡核苷酸1和4.5μg寡核苷酸 2(大约170pmol)在含有100mM NaCl的50μl TE(10mM Tris-HCl， pH 8.0，1mM EDTA)中加热至大约95℃。经15至30分钟缓慢地冷却 后，用DNA聚合酶I的Klenow片段在200μl总体积中延伸退火的双 螺旋，反应条件是本领域熟知的(Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，Laboratory Press)。所 得插入DNA用EagI和Acc65I按照New England Biolabs推荐的条件 消化。用酚/氯仿和氯仿抽提混合物，之后用乙醇沉淀水相。沉淀物在 8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上利用标准分子生物学程序(Sambrook等， Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor， Laboratory Press)纯化。
用EagI和Acc65I根据New England Biolabs推荐的条件消化15 μg M13KE载体。混合物在琼脂糖上纯化，并用QIAquick凝胶提取试 剂盒(Qiagen)回收线性化的载体DNA。
1号寡核苷酸
Acc65I
5′CATGCCCGGGTACCTTTCTATTCTCACTCTGAAACCTGC 3′[SEQ ID NO：26]
3号寡核苷酸
EagI
5’
CATGTTTCGGCCGAGCCACCACCTTTGGTGCAMNNMNNMNNMNNGTCA
CCACGMNNMNNMNNGCAGGTTTCAGAGTGAGAATAG 3’[SEQ ID NO：43]
在20μl总体积中通过变化插入物：载体的摩尔比(从3∶1，5∶1至 10∶1)以及分别使用40和100ng消化的载体，确定最佳连接条件。此 外，实施仅含有载体以及有和无连接酶存在的对照反应，以确定连接 效率和由于载体重新连接导致的背景。在1×连接缓冲液和200NEB 单位(＝3Weiss单位)T4DNA连接酶中16℃过夜反应。试验连接物在 65℃热灭活15分钟。随后根据厂商描述的推荐条件，用1μl等分试 样电穿孔100μl Eelctro Ten-blue电穿孔感受态细胞(Stratagene)。 电穿孔后立即向每个小杯中加入1ml SOC培养基(2％细菌用胰蛋白胨、 0.5％细菌用酵母提取物、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mM葡萄糖)，37℃孵育30分钟。根据标准分子生物学方法 (Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，Laboratory Press)，通过X-gal的兰/白筛选，确 定每个长出的培养物的噬斑形成单位滴度。
将展示最高噬斑/微克投入载体比率的连接按比例放大以获得期 望的文库复杂度。对于文库的构建，DNA以每100μl感受态细胞悬浮 液大约0.1μg的终浓度存在。电穿孔后立即向每个小杯中加入1ml SOC培养基，将SOC生长物(outgrowths)分成5个库，37℃温育30 分钟。通过滴定几个生长物确定文库复杂度，剩余的生长物用于噬菌 体扩增。对于扩增，将每个SOC生长物库加入1升1∶100稀释的 XL1-Blue过夜培养物中。37℃温育4.5至5小时并伴随有力通气。从 这些液体培养物，通过离心澄清上清液两次、并用聚乙二醇(终浓度 3.3％聚乙二醇-8000，0.4M NaCl)4℃过夜沉淀噬菌体颗粒，获得噬菌 体。离心后，所获沉淀重新溶解在TBS中，离心澄清悬浮液，通过用 聚乙二醇(如上述)4℃沉淀1小时，从上清液获得噬菌体颗粒。离心后， 噬菌体沉淀重新悬浮在TBS(50mM Tris-HCl，pH 7.5，100mM NaCl) 中，并存储在4℃。