리간드 발견 방법

리간드 발견 방법 {METHODS FOR LIGAND DISCOVERY}

약물 발견 공정은 통상적으로 후속 의약 화학 최적화를 이끌어내는 적당한 친화도를 동정하기 위한 화합물 라이브러리의 대규모 기능적 스크리닝으로 시작된다. 그러나, 모든 관심 표적이 이렇게 스크리닝될 수 있는 것은 아니다. 일부 경우에 있어서는, 고처리 스크리닝될 수 있는 분석이 이용불가능하다. 다른 경우에 있어서는, 상기 스크리닝의 결과가 불확실하고, 해석하기 어려운 다중 결합 방식을 표적이 가질 수 있다. 또한 다른 경우에 있어서는, 고처리 분석을 위한 분석 조건이 인위적이기 쉽다. 그 결과, 기능적 스크리닝에 의존할 필요가 없는 리간드 발견의 대안적 방법이 요구된다.

도면의 설명

도 1A 는 구속 (tethering) 방법의 하나의 구현예의 모식도이다. 티올-포함 단백질이 복수의 리간드 후보물과 반응된다. 표적에 대해 내재적 결합 친화도를 보유하는 리간드 후보물이 동정되고, 디술피드 부분을 포함하지 않는 동정된 결합 결정기 (원형으로 나타냄) 을 포함하는 리간드가 제조된다.

도 1B 는 구속에 대한 이론의 모식도이다. 티올-포함 단백질은 가장 바람직하게는 환원제의 존재 하에, 하나 이상의 디술피드-포함 리간드 후보물과 평형을 이루며, 개질 및 비개질 단백질 사이에 평형이 구축된다. 리간드 후보물이 표적 단백질에 대한 내재적 결합 친화도를 갖지 않는 경우, 평형은 비개질 단백질 쪽으로 이동한다. 대조적으로, 리간드 후보물이 단백질에 대해 내재적 친화도를 갖는 경우, 평형은 개질 단백질 쪽으로 이동한다.

도 2A 및 2B 는 구속 실험의 대표예이다. 도 2A 는 TS 에 대해 결합 친화도가 없거나 거의 없는 10 개의 상이한 리간드 후보물 풀 (pool) 을 이용한 티미딜레이트 신타아제 ("TS") 반응의 단순화 질량 스펙트럼이다. 도 2B 는 하나의 리간드 후보물이 효소에 대해 내재적 결합 친화도를 보유하는, 10 개의 상이한 리간드 후보물 풀을 이용한 TS 반응의 단순화 질량 스펙트럼이다.

도 3A, 3B, 및 3C 는 예시적 구속 실험에 있어서 환원제 농도의 효과를 나타낸다. 도 3A 은 반응이 2-메르캅토에탄올 없이 수행되는 경우의 단순화 질량 스펙트럼이다. 도 3B 는 동일한 반응이 0.2 mM 2-메르캅토에탄올 존재 하에서 수행되는 경우의 단순화 질량 스펙트럼이다. 도 3C 는 동일한 반응이 20 mM 2-메르캅토에탄올 존재 하에서 수행되는 경우의 단순화 질량 스펙트럼이다.

도 4A, 4B, 및 4C 는 전형적인 구속 실험에 있어서, 라이브러리 중 리간드 후보물의 수의 효과를 나타낸다. 도 4A 는 20 개 리간드 후보물을 포함하는 라이브러리 풀을 이용한 구속 실험이다. 도 4B 는 50 개 리간드 후보물을 포함하는 라이브러리 풀을 이용한 구속 실험이다. 도 4C 는 100 개 리간드 후보물을 포함하는 라이브러리 풀을 이용한 구속 실험이다.

도 5 는 본래 선택된 결합 결정기 R ^D 가 R ^D 뿐만 아니라 이들의 변이체를 포함하는 화합물 라이브러리를 제조하기 위해 사용되는 경우의 모식도이다. 상기 도는 개질 라이브러리가 제 1 결합 결정기 R ^D 의 변이체 뿐만 아니라 제 2 결합 결정기 R ^E 를 포함하는 화합물을 포함하는 구속 실험을 나타낸다. 나타낸 바와 같이, 상기의 2 개 결합 결정기는 함께 연달아 연결되어, 디술피드가 없는 콘쥬게이트 분자를 형성한다.

도 6 은 함께 연달아 연결되어 콘쥬게이트 분자를 형성하는 2 개의 결합 결정기 R ^D 및 R ^E 를 동정하기 위해 이용되는 2 개의 구속 실험의 모식도이다.

도 7 은 R ^D 결합의 존재 하에 제 2 결합 결정기 R ^E 가 동정되는 2 개의 구속 실험의 모식도이다. 일단 동정되면, 2 개 결합 결정기는 연결되어 콘쥬게이트 분자를 형성한다.

도 8 은 제 1 및 제 2 관능기를 포함하는 증량제 (extender) 가 사용되는 구속 방법의 하나의 구현예의 모식도이다. 나타낸 바와 같이, 티올을 포함하는 표적은 반응성 티올과 공유 결합을 형성할 수 있는 제 1 관능기 X 및 디술피드 결합을 형성할 수 있는 제 2 관능기-SR ^1' 을 포함하는 증량제와 접촉된다. 이어서 구속-증량제 복합체가 형성되어 복수의 리간드 후보물과 접촉된다. 증량제는 하나의 결합 결정기 (원형) 를 제공하며, 리간드 후보물은 제 2 결합 결정기 (사각형) 를 제공하고, 생성 결합 결정기는 함께 연결되어 콘쥬게이트 화합물을 형성한다.

발명의 개요

본 발명은 구속 기법을 이용한 리간드 발견 방법에 관한 것이다.

하나의 측면에 있어서, 본 발명은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적-화합물 콘쥬게이트에 관한 것이다:

(식 중,

₁ -C

₂₀ 지방족, 치환 C

₁ -C

₂₀ 지방족, 비치환 아릴, 또는 치환 아릴이고;

m 은 0, 1, 또는 2 이고;

n 은 1 또는 2 이다).

특정 구현예에 있어서, 표적은 폴리펩티드 또는 단백질이며, 이는 예를 들어, 효소, 수용체, 전사 인자, 수용체에 대한 리간드, 성장 인자, 시토카인, 면역글로불린, 핵 단백질, 신호 전달 성분, 및 알로스테릭 (allosteric) 효소 조절자로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. -SS- 결합 및 표적 화합물 사이의 공유결합은 가역적 또는 비가역적일 수 있다.

또다른 측면에 있어서, 본 발명은 각각의 멤버가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식을 갖는 화합물 라이브러리에 관한 것이다:

(식 중, R 및 R' 은 각각 독립적으로 비치환 C ₁ -C ₂₀ 지방족, 치환 C ₁ -C ₂₀ 지방족, 비치환 아릴, 또는 치환 아릴이며; m 은 0, 1, 또는 2 이고; n 은 1 또는 2 이다).

라이브러리는 바람직하게는 약 5 멤버 이상, 보다 바람직하게는 약 100 멤버 이상을 가지며, 라이브러리의 개별 멤버의 원자량은 바람직하게는 약 5 원자량 단위 이상, 보다 바람직하게는 약 10 원자량 단위 이상 상이하다.

또다른 측면에 있어서, 본 발명은 하기를 포함하는 방법에 관한 것이다:

a) 표적 단백질에 결합하는 화학식 R ^D SSR ¹ 의 제 1 화합물을 동정하고;

b) 표적 단백질에 결합하는 화학식 R ^E SSR ¹ 의 제 2 화합물을 동정하고; 및

c) R ^D 및 R ^E 를 포함하는 콘쥬게이트 화합물을 형성함 (여기서, R ^D 및 R ^E 는 각각 독립적으로 C ₁ -C ₂₀ 비치환 지방족, C ₁ -C ₂₀ 치환 지방족, 비치환 아릴, 및 치환 아릴이며; R ¹ 은 비치환 C ₁ -C ₁₀ 지방족, 치환 C ₁ -C ₁₀ 지방족, 비치환 아릴이다). 상기 방법의 특정 구현예에 있어서, 표적에 결합하는 제 2 화합물의 동정은 제 1 화합물의 존재 하에 일어난다.

또다른 구현예에 있어서, R ^D SSR ¹ 및 R ^E SSR ¹ 은 각각 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:

(식 중, R 및 R' 은 각각 독립적으로 비치환 C ₁ -C ₂₀ 지방족, 치환 C ₁ -C ₂₀ 지방족, 비치환 아릴, 또는 치환 아릴이며;

m 은 0, 1, 또는 2 이고;

n 은 1 또는 2 이다).

또다른 측면에 있어서, 본 발명은 하기를 포함하는 방법에 관한 것이다:

a) 관심 부위 또는 근처에 공유 결합을 형성하거나 금속을 배위시킬 수 있는 부착기를 갖는 표적을 제공하고;

b) 표적을 증량제와 접촉시켜 표적-증량제 복합체를 형성하고 (여기서, 증량제는 공유 결합을 형성하거나 금속을 배위시키는 제 1 관능기 및 공유 결합을 형성할 수 있는 제 2 관능기를 포함한다);

c) 표적-증량제 복합체와, 제 2 관능기과 공유 결합을 형성할 수 있는 기를 포함하는 후보물 리간드를 접촉시키고;

d) 표적-증량제 복합체 및 후보물 리간드 간에 공유 결합을 형성하고; 및

e) 표적-증량제-리간드 콘쥬게이트 중에 존재하는 후보물 리간드를 동정함.

상기 방법의 특정 구현예에 있어서, 부착기는 반응성 친전자제, 반응성 친핵제, 및 금속 배위 부위로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명은 또한 하기를 포함하는 방법에 관한 것이다:

a) 관심 부위 또는 근처에 반응성 친핵제를 갖는 표적을 제공하고;

b) 표적과 증량제를 접촉시켜 표적-증량제 복합체를 형성하고 (여기서, 증량제는 표적 내 친핵제와 반응하여 공유 결합을 형성하는 제 1 관능기 및 디술피드 결합을 형성할 수 있는 제 2 관능기를 포함한다);

c) 표적-증량제 복합체와, 디술피드 결합을 형성할 수 있는 리간드 후보물을 접촉시키고;

d) 표적-증량제 복합체 및 리간드 후보물 간에 디술피드 결합을 형성하여 표적-증량제-리간드 콘쥬게이트를 형성하고; 및,

e) 표적-증량제-리간드 콘쥬게이트에 존재하는 리간드 후보물을 동정함.

표적 상의 반응성 친핵제는, 예를 들어 티올 또는 마스킹된 티올일 수 있고, 증량제는 하기 화학식을 가질 수 있다:

(식 중, R 은 비치환 C ₁ -C ₂₀ 지방족, 치환 C ₁ -C ₂₀ 지방족, 비치환 아릴, 및 치환 아릴이며; R' 은 H, -SR ¹ 이고 (식 중, R ¹ 은 비치환 C ₁ -C ₁₀ 지방족, 치환 C ₁ -C ₁₀ 지방족, 비치환 아릴, 및 치환 아릴이다); X 는 이탈기이고, 각각의 화학식 중 네모는 결합 결정기를 나타낸다).

특정 구현예에 있어서, 증량제는 하기 화학식을 갖는다:

(식 중, R' 은 H, -SR ¹ 이고 (식 중, R ¹ 은 비치환 C ₁ -C ₁₀ 지방족, 치환 C ₁ -C ₁₀ 지방족, 비치환 아릴, 및 치환 아릴이다), 네모는 결합 결정기를 나타낸다).

다른 측면에 있어서, 본 발명은 단백질-증량제 복합체에 관한 것이며, 여기서 단백질은 공유 결합을 형성할 수 있는 제 1 관능기 및 제 2 공유 결합을 형성할 수 있는 제 2 관능기를 포함하는 증량제와 공유 결합을 형성한다.

또다른 측면에 있어서, 본 발명은 단백질-증량제 복합체에 관한 것이며, 여기서 단백질은 금속을 배위시킬 수 있는 제 1 관능기 및 공유 결합을 형성할 수 있는 제 2 관능기를 포함하는 증량제와 함께 금속을 배위시킨다.

복합체는 또한 디술피드 결합을 형성할 수 있는 화합물 및 제 2 관능기 간에 디술피드 결합을 포함할 수 있다.

바람직한 구현예의 설명

본 발명은 관심 표적 상의 선택 부위에 결합할 수 있는 리간드 동정을 위한 신속하고 효율적인 방법을 제공한다. 본원의 방법에 의해 동정되는 리간드 자체는, 예를 들어 신규 치료 약물, 효소 저해제, 표지 화합물, 진단 시약, 단백질 정제용 친화도 시약 등의 개발을 위한 선도 화합물로서 용도를 갖는다.

달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용되는 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 참고문헌, 예컨대 [Singleton 등, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2 편, J. Wiley & Sons (New York, NY 1994)], 및 [March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4 편, John Wiley & Sons (New York, NY 1992)] 은 본 출원에서 사용되는 여러 용어에 대한 일반적 지침을 당업자에게 제공한다.

본 발명의 하나의 측면에 있어서, 화합물들이 제공된다. 달리 뚜렷이 또는 내재적으로 명시되지 않는다면, 이들 화합물은 개별 거울상 이성질체, 부분 이성질체, 기하 이성질체, 또는 이들의 혼합물 형태일 수 있다. 이중 결합을 포함하는 화합물의 경우, 이들 이중 결합은 달리 명시되지 않는다면 Z 또는 E 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

정의

본원에서 사용되는 용어의 정의에는 하기가 포함된다:

용어 "지방족" 또는 "비치환 지방족" 은 직쇄, 분지쇄, 시클릭, 또는 폴리시클릭 탄화수소를 나타내며, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 및 시클로알키닐 부분이 포함된다.

용어 "알킬" 또는 "비치환 알킬" 은 포화 탄화수소를 나타낸다.

용어 "알케닐" 또는 "비치환 알케닐" 은 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 탄화수소를 나타낸다.

용어 "알키닐" 또는 "비치환 알키닐" 은 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 탄화수소를 나타낸다.

용어 "아릴" 또는 "비치환 아릴" 은 하나 이상의 방향족 고리를 갖는 모노 또는 폴리시클릭 불포화 부분을 나타낸다. 상기 용어에는 하나 이상의 방향족 고리 내에 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 헤테로아릴이 포함된다. 아릴의 예에는 하기가 포함된다: 페닐, 나프틸, 테트라히드로나프틸, 인다닐, 인데닐, 피리딜, 피라지닐, 피리미디닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아디아졸릴, 옥사디아졸릴, 티오페닐, 푸라닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐 등.

부분을 개질하기 위해 사용되는 용어 "치환" 은 하나 이상의 수소 원자가 하기를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 또다른 기로 치환된 부분의 치환 버전을나타낸다: 지방족; 아릴, 알킬아릴, F, Cl, I, Br, -OH; -NO ₂ ; -CN; -CF ₃ ; -CH ₂ CF ₃ ; -CH ₂ Cl; -CH ₂ OH; -CH ₂ CH ₂ OH; -CH ₂ NH ₂ ; -CH ₂ S0 ₂ CH ₃ ; -OR ^X ; -C(O)R ^X ; -COOR ^X ; -C(O)N(R ^X ) ₂ ; -OC(O)R ^X ; -OCOOR ^X ; -OC(O)N(R ^X ) ₂ ; -N(R ^X ) ₂ ; -S(0) ₂ R ^X ; 및 -NR ^X C(O)R ^X (식 중, 각각의 R ^x 는 독립적으로 수소, 치환 지방족, 비치환 지방족, 치환 아릴, 또는 비치환 아릴이다). 부가적으로, 부분 상의 인접기에서의 치환은 함께 시클릭기를 형성할 수 있다.

용어 "길항제" 는 가장 넓은 의미로 사용되며, 표적, 예컨대 TBM 이 나타내는 생물학적 활성을 부분적 또는 전체적으로 차단하거나, 저해하거나 또는 중화시키는 임의 리간드가 포함된다. 유사한 방식으로, 용어 "작동제" 는 가장 넓은 의미로 사용되며, 표적, 예컨대 TBM 이 나타내는 생물학적 활성, 예를 들어 상기 TBM 의 기능 또는 발현, 또는 상기 TBM 을 통한 신호전달 효율을 특이적으로 변화시켜 기존의 생물학적 활성을 변형 (증가 또는 저해) 시키거나 새로운 생물학적 활성을 유도함으로써 모방하는 임의 리간드가 포함된다.

용어 "증량제" 는 분자량 약 30 내지 약 1,500 달톤이며, 표적 상의 기와 반응할 수 있는 제 1 관능기, 및 리간드 후보물 또는 리간드 후보물 라이브러리의 멤버와 반응하여 디술피드 결합을 형성할 수 있는 제 2 관능기를 갖는 분자를 나타낸다.

용어 "리간드" 는 표적에 대해 측정가능한 결합 친화도를 보유하는 실체를나타낸다. 일반적으로, 리간드가 표적에 약 100 mM 미만, 바람직하게는 약 10 mM 미만, 보다 바람직하게는 약 1 mM 미만의 K _d 또는 K _i 로 결합하는 경우, 측정가능한 친화도를 갖는다고 말한다. 바람직한 구현예에 있어서, 리간드는 펩티드가 아니며 소분자이다. 리간드가 약 2000 달톤 미만 크기, 통상 약 1500 달톤 미만 크기인 경우, 소분자이다. 보다 바람직한 구현예에 있어서, 소분자 리간드는 약 1000 달톤 미만 크기, 통상 약 750 달톤 미만 크기, 보다 일반적으로 약 500 달톤 미만 크기이다.

증량제와 함께 참고되는 용어 "결합 결정기" 는 표적, 예컨대 표적 폴리펩티드로의 결합에 참여하는 증량제 부분에 관한 것이다.

용어 "리간드 후보물" 은 표적 상의 상보적 또는 상용성 반응기와 공유 결합을 형성할 수 있는 반응기를 보유하거나 보유하도록 개질된 화합물을 나타낸다. 리간드 후보물 또는 표적 상의 반응기는, 예를 들어 보호기로 마스킹될 수 있다.

단수 또는 복수로 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드" 는 일반적으로 비개질 RNA 또는 DNA 또는 개질 RNA 또는 DNA 일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 나타낸다. 즉, 예를 들어 본원에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에는 하기가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다: 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역을 포함하는 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역을 포함하는 RNA, 단일-가닥 또는 보다 전형적으로는 이중-가닥일 수 있거나, 단일- 및 이중-가닥 영역을 포함하는 DNA 및RNA 를 포함하는 하이브리드 분자. 또한, 본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드" 는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 둘 다를 포함하는 삼중-가닥 영역을 나타낸다. 상기 영역 중의 가닥은 동일한 분자 또는 상이한 분자에서 유래될 수 있다. 상기 영역에는 하나 이상의 분자의 전체가 포함될 수 있지만, 보다 전형적으로 일부 분자의 영역만이 관여된다. 삼중-나선 영역 분자의 하나는 종종 올리고뉴클레오티드이다. 용어 "폴리뉴클레오티드" 에는 구체적으로 하나 이상의 개질 염기를 포함하는 DNA 및 RNA 가 포함된다. 즉, 안정성 또는 다른 이유를 위해 개질된 골격을 갖는 DNA 또는 RNA 는 본원에서 의도하는 용어 "폴리뉴클레오티드" 에 포함된다. 또한, 비통상적 염기, 예컨대 이노신, 또는 개질 염기, 예컨대 3 중수소화 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA 는 본원에 정의된 용어 "폴리뉴클레오티드" 내에 포함된다. 일반적으로, 용어 "폴리뉴클레오티드" 에는 비개질 폴리뉴클레오티드의 모든 화학적, 효소적 및/또는 대사적 개질형 뿐만 아니라 단순 및 복합 세포를 포함하는 세포 및 바이러스에 특징적인 DNA 및 RNA 의 화학적 형태가 포함된다.

본원에서 사용되는 어구 "보호 티올" 은 분자 또는 기와 반응하여, 이를 덜 반응성으로 만들고, 자유 티올을 재생하도록 탈보호될 수 있는 공유 결합을 형성한 티올을 나타낸다.

본원에서 사용되는 어구 "가역적 공유 결합" 은 바람직하게는 표적을 변성시키지 않는 조건 하에서 쪼개질 수 있는 공유 결합을 나타낸다. 예에는 하기가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다: 디술피드, Schiff-염기, 티오에스테르, 배위 복합체, 보로네이트 에스테르 등.

어구 "반응기" 는 상용성 또는 상보적 반응기와 함께 제시되는 경우 공유 결합이 만들어질 수 있는 부위를 제공하는 화학기 또는 부분이다. 예로는 또다른 -SH 또는 -SS- 와 반응하여 디술피드를 형성할 수 있는 -SH; 활성화 -COOH 와 반응하여 아미드를 형성할 수 있는 -NH ₂ ; 알데히드 또는 케톤과 반응하여 Schiff 염기를 형성할 수 있는 -NH ₂ 등이 있다.

본원에서 사용되는 어구 "반응성 친핵제" 는 표적을 변성시키거나 손상시키지 않는 조건 하에서 또다른 분자 상의 상용성 관능기와 공유 결합을 형성할 수 있는 친핵제를 나타낸다. 가장 적절한 친핵제는 티올, 알콜, 및 아민이다. 유사하게, 본원에서 사용되는 어구 "반응성 친전자제" 는 바람직하게는 표적을 변성시키거나 달리 손상시키지 않는 조건 하에서 또다른 분자 상의 상용성 관능기와 공유 결합을 형성할 수 있는 친전자제를 나타낸다. 가장 적절한 친전자제는 이민, 카르보닐, 에폭시드, 아지리디, 술포네이트, 디술피드, 활성화 에스테르, 활성화 카르보닐, 및 헤미아세탈이다.

어구 "관심 부위" 는 리간드가 결합할 수 있는 표적 상의 임의 부위를 나타낸다. 예를 들어, 표적이 효소인 경우, 관심 부위에는 효소의 결합 기질, 저해제, 활성화제, 보조인자, 또는 알로스테릭 조절자와 접촉하거나 약 10 옹스트롬 이내 (보다 바람직하게는 약 5 옹스트롬 이내) 에 있는 아미노산이 포함될 수 있다. 효소가 프로테아제인 경우, 관심 부위에는 P6 부터 P6' 까지의 기질 결합 채널, 촉매 기능에 관여하는 잔기 (예컨대 촉매 3 각 부위 (triad) 및 옥시 음이온 구멍), 및 임의의 보조인자 (예컨대 Zn 과 같은 금속) 결합 부위가 포함된다. 효소가 단백질 키나아제인 경우, 관심 부위에는 기질-결합 채널에 부가하여 ATP 결합 부위가 포함된다. 효소가 탈수소효소인 경우, 관심 부위에는 기질 결합 영역 뿐만 아니라 NAD/NADH 가 점유하는 부위도 포함된다. 효소가 히드랄라아제, 예컨대 PDE4 인 경우, 관심 부위에는 cAMP 와 접촉하는 잔기 뿐만 아니라 촉매성 2 가 양이온의 결합에 관여하는 잔기도 포함된다.

용어 "표적", "표적 분자" 및 "TM" 은 상호교환되어 가장 넓은 의미로 사용되며, 리간드 결합이 표적의 기능 상에 영향을 미치는 화학적 또는 생물학적 실체를 나타낸다. 표적은 분자, 분자의 일부, 또는 분자의 응집물일 수 있다. 리간드의 결합은 가역적 또는 비가역적일 수 있다. 표적 분자의 구체예에는 폴리펩티드 또는 단백질 (예컨대 프로테아제, 예컨대 시스테인, 세린, 및 아스파르틸 프로테아제를 포함하는 효소), 수용체, 전사 인자, 수용체의 리간드, 성장 인자, 시토카인, 면역글로불린, 핵 단백질, 신호 전달 성분 (예컨대 키나아제, 포스파타아제), 알로스테릭 효소 조절자 등, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 탄수화물, 당단백질, 당지질, 및 기타 거대분자, 예컨대 핵산-단백질 복합체, 염색질 또는 리보좀, 지질 이중층-포함 구조, 예컨대 막, 또는 막 유래 구조, 예컨대 소포가 포함된다. 상기 정의에는 구체적으로 하기 정의된 바와 같은 표적 생물학적 분자 ("TBM") 가 포함된다.

본원에서 사용되는 "표적 생물학적 분자" 또는 "TBM" 은 소분자 작동제 또는길항제가 TBM 기능 상에 영향을 미치는 또다른 물질과 생물학적으로 적절한 복합체를 형성할 수 있는 단일 생물학적 분자 또는 복수의 생물학적 분자를 나타낸다. 바람직한 구현예에 있어서, TBM 은 단백질 또는 이들의 일부, 또는 2 개 이상의 아미노산을 포함하며, 상보적 반응기를 갖는 화합물과 공유 결합을 형성할 수 있는 반응기를 보유하거나 보유하도록 개질될 수 있는 것이다. TBM 의 예에는 하기가 포함된다: 효소, 수용체, 전사 인자, 수용체의 리간드, 성장 인자, 면역글로불린, 핵 단백질, 신호 전달 성분, 당단백질, 당지질, 및 기타 거대분자, 예컨대 핵산-단백질 복합체, 염색질 또는 리보좀, 지질 이중층-포함 구조, 예컨대 막, 또는 막 유래 구조, 예컨대 소포. 표적은 천연원으로부터의 단리 및 정제, 화학 합성, 재조합 생산 이들의 유사 방법 및 임의 조합을 포함하는 다양한 방식으로 수득될 수 있다.

바람직한 단백질 표적에는 하기가 포함된다: 세포 표면 및 가용성 수용체 단백질, 예컨대 임파구 세포 표면 수용체; 효소; 프로테아제 (예컨대 아스파르틸, 시스테인, 금속, 및 세린); 스테로이드 수용체; 핵 단백질; 알로스테릭 효소; 응고 인자; 키나아제 (세린/트레오닌 키나아제 및 티로신 키나아제); 포스파타아제 (세린/트레오닌, 티로신, 및 이중 특이성 포스파타아제, 특히 PTP-1B, TC-PTP 및 LAR); 티미딜레이트 신타아제; 박테리아 효소, 진균 효소 및 바이러스 효소 (특히 HIV, 인플루엔자, 리노바이러스 (rhinovirus) 및 RSV 에 연관된 것들); 신호 전달 분자; 전사 인자; DNA 및/또는 RNA 합성 또는 분해에 연관된 단백질 또는 효소; 면역글로불린; 호르몬; 및 다양한 시토카인에 대한 수용체. 수용체의 예에는, 예를 들어 에리트로포이에틴 (EPO), 과립구 집락 자극 (G-CSF) 수용체, 과립구 대식세포 집락 자극 (GM-CSF) 수용체, 트롬보포이에틴 (TPO), 인터류킨, 예컨대 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-11, IL-12, 성장 호르몬, 프로락틴, 인간 태반 락토겐 (LPL), CNTF, 온코스타틴, RANTES, MIPb, IL-8, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF-1), 표피 성장 인자 (EGF), 헤레굴린-a 및 헤레굴린-b, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 태반 성장 인자 (PLGF), 조직 성장 인자 (TGF-α및 TGF-β), 및 신경 성장 인자 (NGF) 가 포함된다. 기타 표적에는 다양한 신경영양물질 및 이들의 리간드, 기타 호르몬 및 수용체, 예컨대 골 형태형성 인자, 여포 자극 호르몬 (FSH), 및 황체형성 호르몬 (LH), CD40 리간드, 아폽토시스 인자-1 및 -2 (AP-1 및 AP-2), p53, bax/bcl2, mdm2, 카스파아제 (1, 3, 8 및 9), 카텝신, IL-1/IL-1 수용체, BACE, HIV 인테그라아제, PDE IV, C 형 간염 헬리카아제, C 형 간염 프로테아제, 리노바이러스 프로테아제, 트립타아제, cPLA (세포질 포스포리파아제 A2), CDK4, c-jun 키나아제, 어댑터, 예컨대 Grb2, GSK-3, AKT, MEKK-1, PAK-1, raf, TRAF 1-6, Tie2, ErbB 1 및 2, FGF, PDGF, PARP, CD2, C5a 수용체, CD4, CD26, CD3, TGF-알파, NF-kB, IKK 베타, STAT 6, 뉴로키닌 (Neurokinnin)-1, CD45, Cdc25A, SHIP-2, 인간 p53, bax/bcl2, IgE/IgER, ZAP-70, lck, syk, ITK/BTK, TACE, 카텝신 S, K 및 F, CD11a, LFA/ICAM, VLA-4, CD28/B7, CTLA4, TNF 알파 및 베타, (및 p55 및 p75 TNF 수용체), CD40L, p 38 map 키나아제, IL-2, IL-4, IL-13, IL-15, Rac 2, PKC 세타, IL-8, TAK-1, jnk, IKK2 및 IL-18 이 포함된다.

구속 방법

본 발명은 "구속" 으로 불리는 공정에 근거하는 리간드 발견을 위한 신규 방법을 제공한다. 잠재적 리간드는 표적에 공유 결합되거나 "구속되고", 이어서 동정된다. 전술된 바와 같이, 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 상기 방법에는 하기가 포함된다:

a) 관심 부위 또는 근처에 화학적 반응기를 포함하는 표적과, 화학적 반응기와 공유 결합을 형성할 수 있는 화합물을 접촉시키고;

b) 표적 및 화합물 간에 공유 결합을 형성하여 표적-화합물 콘쥬게이트를 형성하고; 및,

c) 표적-화합물 콘쥬게이트를 동정함.

하나의 구현예에 있어서, 상기 방법에 하기가 포함되도록 복수의 화합물이 사용된다:

a) 관심 부위 또는 근처에 화학적 반응기를 포함하는 표적을 수득하고;

b) 화학적 반응기에 공유 결합할 수 있고, 하나 이상의 화합물이 표적과 공유 결합을 형성하는 복수의 화합물과 표적을 조합하고; 및,

c) 표적-화합물 콘쥬게이트에서 공유 결합을 형성한 화합물을 동정함.

바람직한 구현예에 있어서, 표적은 단백질이며, 화학적 반응기는 내부 시스테인 잔기 상의 티올이다. 관심 부위가 천연 생성 시스테인 잔기를 포함하지 않는다면, 표적은 관심 부위 또는 근처에 시스테인 잔기를 포함하도록 개질될 수 있다. 시스테인이 관심 부위로부터 10 옹스트롬 이내, 바람직하게는 5 옹스트롬 이내에 위치하는 경우 관심 부위 근처라고 말한다. 개질을 위해 바람직한잔기는 용매가 접근가능한 것들이다. 용매 접근가능성은 표준 수학법 (Lee, B. & Richards, FMJ Mol. Biol 55: 379-400 (1971); Shrake, A. & Rupley, JAJ Mol. Biol. 79: 351-371 (1973)) 또는 분석법 (Connolly, ML Science 221: 709-713 (1983); Richmond, TJJ Mol. Biol. 178: 63-89 (1984)) 을 이용하는 구조적 모델로부터 계산될 수 있다. 예를 들어, 잠재적 시스테인 변이체는 탄소-베타 (CB), 또는 황-감마 (SG) 의 조합 표면적이 Lee 및 Richards 의 방법 (Lee, B. & Richards, FMJ Mol. Biol 55: 379-400 (1971)) 에 의해 계산되는 경우 21Å ² 초과이면 용매-접근가능성인 것으로 간주된다. 상기 값은 Creamer 등이 설명한 바와 같이 시스테인 측쇄에 접근가능한 대략 33% 의 이론적 표면적을 나타낸다 (Creamer, TP 등, Biochemistry 34: 16245-16250 (1995)).

또한, 잔기가 골격 원자와의 수소 결합에 참여하지 않는 시스테인 또는 또다른 티올-포함 아미노산 잔기로 돌연변이되거나, 많아도 단 하나의 수소 결합을 통해 골격과 상호작용하는 것이 바람직하다. 측쇄가 다른 측쇄와 함께 다중 (> 1) 수소 결합에 참여하는 야생형 잔기도 또한 덜 바람직하다. 모든 표준 회전체 (chi1 각 -60°, 60°또는 180°) 가 임의의 다른 잔기의 N, CA, C, O, 또는 CB 원자와 바람직하지 않은 입체 접촉을 도입할 수 있는 변이체도 또한 덜 바람직하다. 바람직하지 않은 접촉은 참여 원자의 반 데르 발스 반경 합의 80% 미만인 원자간 거리로 정의된다. 관심 부위가 오목한 영역인 특정 구현예에 있어서, 상기 부위의 가장자리 (예컨대 볼록한 영역의 근방 또는 융기) 에서 발견되는 잔기가 시스테인 잔기로 돌연변이시키기 위해 보다 바람직하다. 볼록성 및 오목성은 표면 벡터에 근거하여 (Duncan, BS & Olson, AJ Biopolymers 33: 219-229 (1993)), 또는 분자 표면을 따라 배치된 물 탐침의 접근가능성을 결정하여 (Nicholls, A. 등 Proteins 11: 281-296 (1991); Brady, GP, Jr. & Stouten, PFJ Comput. Aided Mol. Des. 14: 383-401 (2000)) 계산될 수 있다. 보통 L-아미노산에 대해 금지된 골격 배좌를 보유하는 잔기 (Ramachandran, GN 등, J. Mol. Biol. 7: 95-99 (1963); Ramachandran, GN & Sasisekharahn, V. Adv. Prot. Chem. 23: 283-437 (1968)) 는 시스테인으로의 개질에 덜 바람직한 표적이다. 금지된 배좌는 통상 양의 값의 phi 각을 특징으로 한다.

기타 바람직한 변이체는 시스테인으로 돌연변이되고 -Cys-SSR ¹ 을 포함하도록 구속되는 경우, R ¹ 원자를 관심 부위로 향하게 하는 배좌를 보유하는 것들이다. 2 가지 일반 절차가 상기 바람직한 변이체를 동정하는데 이용될 수 있다. 제 1 절차에 있어서, 절편의 잔기 j-1, j, 및 j+1 의 골격 원자가 0.75 제곱 옹스트롬 미만의 RMSD 를 가지며 표적 분자의 잔기 i-1, i, 및 i+1 의 골격 원자 상에 포개질 수 있는, 위치 j 에 디술피드-결합된 시스테인을 포함하는 구조적 절편을 동정하기 위해, 단백질 데이타뱅크 (Berman, HM 등, Nucleic Acids Research 28: 235-242 (2000)) 에서 독특한 구조를 탐색한다 (Hobohm, U. 등, Protein Science 1: 409-417 (1992)). 잔기 i (시스테인으로 돌연변이되는 경우) 의 Cβ원자 이외에 관심 부위의 임의 원자에 더 가까운 위치 j 에 시스테인에 디술피드 결합된잔기의 Cβ원자를 배치하는 절편이 동정되는 경우, 위치 i 는 바람직한 것으로 간주된다. 대안적 절차에 있어서, 위치 i 에서의 잔기는 컴퓨터적으로 시스테인으로 "돌연변이화" 되고, 디술피드 결합을 통해 S-메틸기로 캡핑된다.

하나 이상의 시스테인을 관심 부위에 부가하는 것 이외에, 관심 부위 밖에 위치한 하나 이상의 천연 생성 시스테인을 결실시키는 것이 (그리고 이들을 예를 들어 알라닌으로 치환하는 것이) 바람직할 수 있다. 하나 이상의 천연 생성 시스테인이 결실되거나 "제거된 (scrubbed)" 된 상기 돌연변이가 본 발명의 또다른 측면에 포함된다. 다양한 재조합, 화학, 합성 및/또는 기타 기법이, 구속에 이용가능한 목적하는 수의 자유 티올기를 보유하도록 표적을 개질시키는데 이용될 수 있다. 상기 기법에는, 예를 들어 표적 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 상이한 수의 시스테인 잔기를 갖는 폴리펩티드를 코딩하도록 하는 부위-지정 돌연변이화가 포함된다. 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 증폭을 이용하는 부위-지정 돌연변이화 (예를 들어, 1987. 7. 28. 허여된 미국 특허 4,683,195; 및 [Current Protocols In Molecular Biology, 15 장, Ausubel 등 편저, 1991] 참조) 가 특히 바람직하다. 기타 부위-지정 돌연변이화 기법도 또한 당분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 하기 공개문헌에 기재되어 있다: [Ausubel 등, supra, 8 장]; [Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2 편, Sambrook 등, 1989]; [Zoller 등, Methods Enzymol. 100: 468-500 (1983)]; [Zoller & Smith, DNA 3: 479-488 (1984)]; [Zoller 등, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)]; [Brake 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4642-4646 (1984)]; [Botstein 등, Science 229: 1193(1985)]; [Kunkel 등, Methods Enzymol. 154: 367-82 (1987)], [Adelman 등, DNA 2: 183 (1983)]; 및 [Carter 등, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986)]. 카세트 돌연변이화 (Wells 등, Gene, 34: 315 [1985]), 및 제한 선택 (restriction selection) 돌연변이화 (Wells 등, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 [1986]) 도 이용될 수 있다.

하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 변이체는 여러 방식 중 하나로 생성될 수 있다. 아미노산들이 폴리펩티드 사슬 중에서 함께 가까이 위치한 경우, 이들은 모든 목적 아미노산 치환을 코딩하는 하나의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 동시에 돌연변이될 수 있다. 그러나 아미노산들이 서로 일정 거리 떨어져 위치하는 경우 (예컨대 10 개 초과 아미노산으로 구분된 경우), 모든 목적 변화를 코딩하는 단일 올리고뉴클레오티드를 생성하는 것이 더 어렵다. 대신에, 2 가지 대안적 방법 중 하나가 이용될 수 있다. 제 1 방법에 있어서, 개별 올리고뉴클레오티드가 치환될 각각의 아미노산에 대해 생성된다. 이어서, 올리고뉴클레오티드는 동시에 단일-가닥 주형 DNA 에 어닐링되고, 주형으로부터 합성되는 제 2 DNA 가닥이 모든 목적 아미노산 치환을 코딩할 것이다. 대안적 방법에는 목적 돌연변이를 제조하기 위한 2 회 이상의 돌연변이화가 관여된다.

일단 표적-화합물 콘쥬게이트가 형성되면, 이는 여러 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, 질량 분광측정이 이용된다. 표적-화합물 콘쥬게이트는 질량 분광측정에서 직접 검출되거나, 검출 전에 표적 화합물 콘쥬게이트가 절편화될 수 있다. 이와는 달리, 화합물이 질량 분광측정기 내에서유리된 후 동정될 수 있다. 하기에서 더욱 상세히 기재되는 바와 같이, 상기의 손쉽고 거친 방식으로 표적-화합물 콘쥬게이트 중 화합물을 동정하기 위한 질량 분광측정의 이용은 본 발명의 놀랍고도 예상치 못한 발견 중 하나이다. 표적-화합물 콘쥬게이트 및 표적-화합물 콘쥬게이트를 포함하는 질량 분광측정기 (MS) 가 본 발명의 측면에 포함된다.

MS 는 질량 대 전하비 (m/z) 에 근거하여 분자를 검출하므로, 이들의 크기에 따라 분자를 분해할 수 있다 (Yates, Trends Genet. 16: 5-8 [2000] 에서 개론됨). 질량 분광측정기는 일차적으로 분자를 기상 이온으로 전환시킨 후, 개별 이온이 m/z 비에 근거하여 분리되어 최종적으로 검출된다. 질량 분광측정기의 필수구성 부분인 질량 분석기는 특정 m/z 값의 이온을 분리하기 위해 물리적 성질 (예컨대, 전기장 또는 자기장, 또는 비행시간 (time-of-flight, [TOF])) 을 이용한 후, 이온 검출기에 타격된다. 질량 분광측정기는 데이타를 신속히 생성할 수 있어서, 고처리 분석에 대해 우수한 잠재력을 갖는다. 질량 분광측정은 표적에 공유 결합된 화합물을 검출 또는 동정하기 위한 다른 수단과 조합되어 또는 단독으로 이용될 수 있다. 질량 분광측정 기법에 대한 추가 설명에는 하기가 포함된다 [Fitzgerald 및 Siuzdak, Chemistry & Biology 3: 707-715 [1996]; Chu 등, J. Am. Chem. Soc. 118: 7827-7835 [1996]; Siudzak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11290-11297 [1994]; Burlingame 등, Anal. Chem. 68: 599R-651R [1996]; Wu 등, Chemistry & Biology 4: 653-657 [1997]; 및 Loo 등, Am. Reports Med. Chem. 31: 319-325 [1996]].

표적-화합물 콘쥬게이트는 다른 수단을 이용하여 동정될 수 있다. 예를 들어, 반응 혼합물의 성분을 분리하여 공유 결합된 분자의 동정 능력을 증강시키기 위해, 다양한 크로마토그래피 기법, 예컨대 액체 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피 등이 이용될 수 있다. 상기 크로마토그래피 기법은 질량 분광측정과 조합되거나 질량 분광측정과 구분되어 이용될 수 있다. 또한 유리된 화합물에 표지 탐침을 (형광적으로, 방사성으로 또는 다르게) 커플링하여 임의의 상기 기법을 이용한 그 동정을 촉진시킬 수 있다. 또다른 측면에 있어서, 신규 결합의 형성은 표지 탐침을 유리시키며, 이는 모니터링될 수 있다. 단순한 기능적 분석, 예컨대 ELISA 또는 효소 분석이 또한, 결합이 분석 측정이 수행되는 것이 필수적인 부분에서 일어나는 경우 결합을 검출하기 위해 이용될 수 있다. 표적 분자에 결합한 유기 화합물을 동정하기 위한 용도를 가질 수 있는 기타 기법에는, 예를 들어 핵 자기 공명 (NMR), 표면 플라스몬 공명 (예컨대 BIACORE), 모세관 전기영동, X-선 결정측정 등이 포함되며, 이 모두는 당업자에게 널리 공지된 것이다.

본 발명의 또다른 측면에 있어서, 표적은 단백질이며, 공유 결합 또는 구속은 디술피드 결합이다. 상기 방법에는 하기가 포함된다:

a) 디술피드 결합을 형성할 수 있는 표적 단백질과, 디술피드 결합을 또한 형성할 수 있는 리간드 후보물을 접촉시키고;

b) 표적 단백질 및 리간드 후보물 사이에 디술피드 결합을 형성하여 표적 단백질-리간드 콘쥬게이트를 형성하고; 및

c) 표적 단백질-리간드 콘쥬게이트 중에 존재하는 리간드를 동정함.

임의로, 표적 단백질은 환원제의 존재 하에 후보물 리간드와 접촉된다. 적합한 환원제의 예에는 하기가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다: 시스테인, 시스테아민, 디티오트레이톨, 디티오에리트리톨, 글루타티온, 2-메르캅토에탄올, 3-메르캅토프로프리온산, 포스핀, 예컨대 트리스-(2-카르복시에틸포스핀) ("TCEP"), 또는 나트륨 보로히드리드. 하나의 구현예에 있어서, 환원제는 2-메르캅토에탄올이다. 또다른 구현예에 있어서, 환원제는 시스테아민이다. 또다른 구현예에 있어서, 환원제는 글루타티온이다. 또다른 구현예에 있어서, 환원제는 시스테인이다.

하나의 구현예에 있어서, 표적 단백질은 천연 생성 단백질 서열의 일부인 시스테인으로부터의 천연 생성-SH 기를 보유한다. 또다른 구현예에 있어서, 표적 단백질은 천연 생성 아미노산을 시스테인으로 돌연변이시키는데 돌연변이화가 이용된, 가공된 -SH 기를 보유한다. 비천연 시스테인을 갖는 상기 표적 단백질은 본 발명의 또다른 측면에 포함된다.

또다른 구현예에 있어서, 표적 단백질은 디술피드 형태의 마스킹된 -SH 를 보유한다. 또다른 구현예에 있어서, 표적 단백질은 티올이 디술피드로 마스킹된 시스테인을 보유한다. 또다른 구현예에 있어서, 표적 단백질은 티올이 또다른 시스테인과 디술피드 결합을 형성하는 시스테인을 보유한다. 또다른 구현예에 있어서, 표적 단백질은 티올이 글루타티온과 디술피드 결합을 형성하는 시스테인을 보유한다. 또다른 구현예에 있어서, 표적 단백질은 티올이 화학식 -SSR ¹ 의 디술피드를 형성하는 시스테인을 보유한다 (식 중, R ¹ 은 비치환 C ₁ -C ₁₀ 지방족, 치환 C ₁ -C ₁₀ 지방족 비치환 아릴 또는 치환 아릴이다). 또다른 구현예에 있어서, 표적 단백질은 티올이 화학식 -SSR ² R ³ 의 디술피드로 마스킹된 시스테인을 보유한다 (식 중, R ² 는 C ₁ -C ₅ 알킬이며 R ³ 은 NH ₂ , OH, 또는 COOH 이다). 또다른 구현예에 있어서, 표적 단백질은 티올이 화학식 -SSCH ₂ CH ₂ OH 의 디술피드로 마스킹된 시스테인을 보유한다. 또다른 구현예에 있어서, 표적 단백질은 티올이 화학식 -SSCH ₂ CH ₂ NH ₂ 의 디술피드로 마스킹된 시스테인을 보유한다.

또다른 구현예에 있어서, 리간드 후보물은 -SH 기를 보유한다. 또다른 구현예에 있어서, 리간드 후보물은 마스킹된 티올을 보유한다. 마스킹된 티올기를 갖는 리간드 후보물은 본 발명의 또다른 측면에 포함된다. 또다른 구현예에 있어서, 리간드 후보물은 화학식 -SSR ¹ 의 디술피드 형태의 마스킹된 티올을 보유한다 (식 중, R ¹ 은 비치환 C ₁ -C ₁₀ 지방족, 치환 C ₁ -C ₁₀ 지방족 비치환 아릴 또는 치환 아릴이다). 또다른 구현예에 있어서, 리간드 후보물은 화학식 -SSR ² R ³ 의 디술피드로 마스킹된 티올을 보유한다 (식 중, R ² 는 C ₁ -C ₅ 알킬 (바람직하게는 -CH ₂ -, -CH ₂ CH ₂ -, 또는 -CH ₂ CH ₂ CH ₂ - 이며, R ³ 은 NH ₂ , OH, 또는 COOH 이다). 또다른 구현예에 있어서, 리간드 후보물은 화학식 -SSCH ₂ CH ₂ OH 의 디술피드로 마스킹된 티올을 보유한다. 또다른 구현예에 있어서, 리간드 후보물은 화학식 -SSCH ₂ CH ₂ NH ₂ 의 디술피드로 마스킹된 티올을 보유한다. 리간드 후보물의 예에는 하기가 포함된다:

(식 중, R 및 R' 은 각각 독립적으로 비치환 C ₁ -C ₂₀ 지방족, 치환 C ₁ -C ₂₀ 지방족, 비치환 아릴, 또는 치환 아릴이며; m 은 0, 1, 또는 2 이고; n 은 1 또는 2 이다).

복수의 리간드 후보물은 리간드 후보물의 라이브러리를 구성한다. 하나의 구현예에 있어서, 라이브러리에는 5 개 이상의 리간드 후보물이 포함된다. 또다른 구현예에 있어서, 라이브러리에는 20 개 이상의 리간드 후보물이 포함된다.또다른 구현예에 있어서, 라이브러리에는 100 개 이상의 리간드 후보물이 포함된다. 또다른 구현예에 있어서, 라이브러리에는 500 개 이상의 리간드 후보물이 포함된다. 또다른 구현예에 있어서, 라이브러리에는 1000 개 이상의 리간드 후보물이 포함된다. 또다른 구현예에 있어서, 라이브러리의 각 멤버는 상이한 분자량을 갖는다. 또다른 구현예에 있어서, 라이브러리의 각 멤버는 라이브러리의 다른 멤버로부터 5 원자량 단위 이상 상이한 질량을 갖는다. 또다른 구현예에 있어서, 라이브러리의 각 멤버는 라이브러리의 다른 멤버로부터 10 원자량 단위 이상 상이한 질량을 갖는다.

표적이 단백질이고, 공유 결합이 디술피드인 구속 방법을 도 1 에 도식적으로 나타낸다. 도 1A 는 티올 포함 단백질이 복수의 리간드 후보물 (예컨대 >5, >20, >100, >500, >1000 등) 과 반응하는 구속 방법의 하나의 구현예를 나타낸다. 상기 구현예에 있어서, 리간드 후보물은 화학식 -SSR ¹ 의 디술피드 형태인 마스킹된 티올을 보유한다 (식 중, R ¹ 은 상기 정의된 바와 같다). 특정 구현예에 있어서, R ¹ 은 잠재적 리간드 후보물의 용해도를 증강시키기 위해 선택된다. 나타낸 바와 같이, 표적에 대해 내재적 결합 친화도를 보유하는 리간드 후보물이 동정되며, 디술피드 부분을 포함하지 않는 대응 리간드가 동정된 결합 결정기 (원형으로 나타냄) 를 포함하여 제조된다.

도 1B 는 구속에 대한 이론을 도식적으로 나타낸다. 티올-포함 단백질은 하나 이상의 디술피드-포함 리간드 후보물과 평형을 이루며, 평형은 개질 및 비개질 단백질 사이에 성립된다. 하나의 구현예에 있어서, 티올-포함 단백질 및 리간드 후보물은 환원제의 존재 하에 접촉된다. 또다른 구현예에 있어서, 티올-포함 단백질 및 리간드 후보물은 화학양론 미만량의 환원제의 존재 하에 접촉된다. 리간드 후보물이 표적 단백질에 대해 내재적 결합 친화도를 갖지 않는 경우, 평형은 비개질 단백질 쪽으로 이동한다. 대조적으로, 리간드 후보물이 단백질에 대해 내재적 친화도를 갖는 경우, 평형은 개질 단백질 쪽으로 이동한다. 두 상황 모두가 도 1B 에 예시된다. 일차적으로, 리간드 후보물의 R ^A 부분은 단백질에 대해 결합 친화도를 보유하지 않거나 거의 보유하지 않는다. 따라서, 단백질-리간드 콘쥬게이트의 형성은 주어진 단백질, 리간드 후보물, 및 환원제 농도의 디술피드 결합 가능성의 함수이다. 이차적으로, 리간드 후보물의 R ^B 부분은 단백질에 대해 내재적 결합 친화도를 보유한다. 결과적으로, 일단 디술피드 결합이 단백질 및 리간드 후보물 사이에 형성되면, 단백질-리간드 콘쥬게이트는 안정화된다. 즉, 평형은 단백질-리간드 콘쥬게이트의 형성 쪽으로 이동한다.

구속을 더욱 예시하기 위해, 실제로 모든 생명체에 있어 필수적 효소인 티미딜레이트 신타아제 ("TS") 에 상기 방법을 적용하였다. TS 는 디히드로폴레이트 리덕타아제 ("DHFR") 및 세린 히드록시메틸라아제와 함께, RNA 염기 dUMP 로부터 DNA 염기 티미딘 5'-모노포스페이트 ("dTMP") 합성을 위한 유일한 신생 (de novo) 기전을 제공하는 생화학적 기능 단위인 티미딜레이트 신타아제 사이클을 형성한다. TS 및 DHRF 는 둘 다 항암제 약물 개발을 위한 표적이다. TS 유전자가 또한 여러 바이러스에서 발견되므로, 이는 또한 항기생충제, 항진균제 및 항바이러스제 개발을 위한 표적이다.

TS 는 여러 이유로 이상적인 검증 표적이다. 일차적으로, 다양한 TS 효소의 여러 고해상도 결정 구조가 결정되어 있으므로, 구조적 정보가 화합물 고안에 도입될 수 있다. 이차적으로, 잠재적 리간드가 TS 에 결합하는지 여부를 결정하기 위한 간단한 열량측정 분석이 존재한다. 상기 분석은 dUMP 의 존재 하에 5,10-CH ₂ -H ₄ 폴레이트의 H ₂ 폴레이트로의 전환율에 근거한다. 결합에 대한 제 2 분석도 또한 분광측정이며, 독특한 분광 기호를 가지며 TS 와 복합체를 형성하는 피리독살-5'-포스페이트 ("PLP") 와의 경합에 의존한다.

예시 목적으로 선택된 TS 는 대장균 TS 이다. 모든 TS 효소와 마찬가지로, 상기물도 구속에 사용될 수 있는 활성 부위에 천연 생성 시스테인 잔기 (Cys146) 를 포함한다. 대장균 TS 에는 4 개의 다른 시스테인이 포함되지만, 이들은 다른 TS 효소에서는 보존되지 않으며, 묻혀 있어서 접근불가능하다. 그러나, 하나 이상의 상기 시스테인이 디술피드에 대해 반응성이라면, 상기 시스테인이 또다른 아미노산, 예컨대 알라닌으로 돌연변이된 상기 효소의 돌연변이 버전이 사용될 수 있다.

첫번째 실험에서, 야생형 TS 및 C146S 돌연변이 (여기서 위치 146 의 시스테인은 세린으로 돌연변이되었다) 는 시스타민, H ₂ NCH ₂ CH ₂ SSCH ₂ CH ₂ NH ₂ 과 접촉되었다. 야생형 TS 효소는 뚜렷이 1 당량의 시스타민과 반응한 반면, 돌연변이 TS 는 반응하지 않아서, 시스타민이 Cys-146 과 반응하였고, 이에 대해 선택적임을 나타내었다.

야생형 TS 로 상이한 리간드 후보물 풀과 함께 여러 구속 실험을 수행하였다. 도 2 는 2 개의 대표적 구속 실험을 나타내며, 여기서 리간드 후보물은 하기 화학식을 가졌다:

이는 화학식 RSSR ¹ 의 리간드 후보물류의 특정 구현예이다 (식 중, R 은 R ^c C(=O)NHCH ₂ CH ₂ - 에 해당하며, R ¹ 은 -CH ₂ CH ₂ NH ₂ 에 해당한다). 이는 또한 화학식 RSSR ² R ³ 의 리간드 후보물류의 특정 구현예이다 (식 중, R 은 R ^c C(=O)NHCH ₂ CH ₂ - 에 해당하며, R ² R ³ 은 함께 -CH ₂ CH ₂ NH ₂ 에 해당한다). R ^c 는 비치환 C ₁ -C ₁₀ 알킬, 치환 C ₁ -C ₁₀ 알킬, 비치환 아릴, 또는 치환 아릴이며, 상기 라이브러리 멤버 풀 가운데 가변 부분이다.

도 2A 는 TS 에 대해 결합 친화도를 갖지 않거나 거의 갖지 않는 10 개의 상이한 리간드 후보물 풀과 TS 반응의 단순화 질량 스펙트럼이다. 임의의 결합 상호작용의 부재 하에서, TS 및 개별 리간드 후보물 사이의 디술피드 교환 반응에있어서의 평형은 비개질 효소 쪽이다. 이를 하기 식으로 도식적으로 나타낸다.

예상되는 바와 같이, 비개질 효소에 해당하는 피크는 스펙트럼에 있어서 2 개의 가장 현저한 피크 중 하나이다. 다른 현저한 피크는 Cys146 의 티올이 시스테아민으로 개질된 TS 이다. 임의의 개별 라이브러리 멤버에 대해 상기 종이 상당한 정도로 형성되지는 않으나, 상기 피크는 라이브러리 풀의 각 멤버에 대한 평형 반응의 축적 효과에 기인한다. 반응이 티올-포함 환원제, 예컨대 2-메르캅토에탄올의 존재 하에 수행되는 경우, 활성 부위 시스테인도 또한 환원제로 개질될 수 있다. 시스테아민 및 2-메르캅토에탄올은 유사 분자량을 가지므로, 이들 각각의 디술피드 결합된 TS 효소는 상기 실험에서 이용된 조건 하에서는 구별될 수 없다. 우측의 작은 피크는 분별되는 라이브러리 멤버에 해당된다. 명백하게, 이들 피크 중 어느 것도 매우 현저하지는 않다. 도 2A 는 리간드 후보물이 표적에 대한 내재적 결합 친화도를 보유하지 않는 스펙트럼의 특징이다.

도 2B 는 리간드 후보물 중 하나가 효소에 대한 내재적 결합 친화도를 보유하는, 10 개의 상이한 리간드 후보물 풀과 TS 반응의 단순화 질량 스펙트럼이다. 알 수 있듯이, 가장 현저한 피크는 Cys146 의 티올이 N -토실- D -프롤린 화합물로 개질된 TS 에 대응하는 것이다. 상기 피크는 비개질 효소 및 Cys146 의 티올이 시스테아민으로 개질된 TS 에 대응하는 것을 포함하는 모든 다른 피크를 작아 보이게 만든다. 도 2B 는 구속으로 목적 부위에 대해 강력한 내재적 결합 친화도를보유하는 부분이 포획된 질량 스펙트럼의 예이다.

구속이 환원제의 존재 하에 일어나는 경우, 공정은 열역학적으로 보다 잘 유도되며 평형-조절된다. 도 3 은 상기 현상의 예시이며, TS 가 증가하는 농도의 환원제 2-메르캅토에탄올의 존재 하에 선택된 N -토실- D -프롤린 화합물을 포함하는 동일한 라이브러리 풀과 반응하는 3 개 실험을 나타낸다.

도 3A 는 반응이 2-메르캅토에탄올 없이 수행되는 경우의 단순화 질량 스펙트럼이다. 가장 현저한 피크는 시스테아민으로 개질된 TS 에 대응한다. 그러나, N -토실- D -프롤린에 대응하는 피크가 역시 다른 리간드 후보물에 비해 적절히 선택된다. 도 3B 는 반응이 0.2 mM 2-메르캅토에탄올의 존재 하에 수행되는 경우의 단순화 질량 스펙트럼이다. 대조적으로, 도 3A 의 스펙트럼에 비해, N -토실- D -프롤린에 대응하는 피크가 가장 현저한 피크이며, 따라서 다른 리간드 후보물에 비해 강력히 선택된다. 마지막으로, 도 3C 는 반응이 20 mM 2-메르캅토에탄올의 존재 하에 수행되는 경우의 단순화 질량 스펙트럼이다. 놀랍지 않게, 상기 강력한 환원 조건 하에서의 가장 현저한 피크는 비개질 효소이다. 그럼에도 불구하고, N -토실- D -프롤린에 대응하는 피크는 라이브러리 풀 중에서 다른 리간드 후보물의 피크에 비해 여전히 선택된다.

도 3 은 표적에 대한 내재적 친화도를 보유하는 특정 리간드 후보물에 의한 표적 단백질의 시스테인 개질 정도가 부분적으로는 환원제 농도의 함수라는 사실을 강조한다. 일반적으로, 표적 단백질에 대한 리간드 후보물의 결합 친화도가 높을수록, 사용되어 여전히 강력한 선택을 얻을 수 있는 환원제 농도가 더 높아진다.결과적으로, 구속 스크리닝에 사용되는 환원제의 농도는 결합 친화도에 대한 대리물로서 뿐만 아니라, 강력히 선택되어야 하는 리간드 후보물의 결합 친화도 한계를 더 낮게 설정하는데 이용될 수 있다.

하나의 측면에 있어서, 상기 방법에는 하기가 포함된다:

a) 디술피드 결합을 형성할 수 있는 표적 단백질과, 또한 디술피드 결합을 형성할 수 있는 리간드 후보물을 접촉시키고;

b) 표적 단백질 및 리간드 후보물 간에 디술피드 결합을 형성하여 표적 단백질-리간드 콘쥬게이트를 형성하고;

c) 표적 단백질-리간드 콘쥬게이트와 환원제를 접촉시키고; 및,

d) 표적 단백질-리간드 콘쥬게이트의 양을 목적량으로 감소시키기 위한 환원제의 농도를 결정함.

이어서, 표적 단백질-리간드 콘쥬게이트의 양을 더 저하시키는데 필요한 환원제의 농도를 표적 단백질의 리간드 후보물의 결합 친화도에 대한 대리물로 이용한다.

이와는 달리, 상기 방법을 이용하여, 구속 실험을 조정할 수 있다. 상기 조정의 예는 하기와 같다. 제 1 구속 실험은 강력히 선택된 리간드 후보물이 동정된 복수의 리간드 후보물에 대해 수행된다. 이와는 달리, 특정 친화도를 갖는 공지의 기질이, 예를 들어 디술피드의 첨가에 의해 개질된다. 이어서 동정된 리간드 후보물 (또는 조정 화합물) 이 사용되어, 특정한 최소 결합 친화도를 갖는 리간드 후보물만이 선택되는데 필요한 실험 조건이 조정된다. 하나의 구현예에 있어서, 조정은 환원제의 농도이며, 조정 화합물은 일정 범위의 환원제 농도가 사용되는 일련의 구속 실험에서 사용된다. 그 예는 하기를 포함하는 상법이다:

a) 디술피드 결합을 형성할 수 있는 표적 단백질과, 또한 디술피드 결합을 형성할 수 있는 조정 화합물을 접촉시키고;

b) 표적 단백질 및 조정 화합물 간에 디술피드 결합을 형성하여 표적 단백질-조정 화합물 콘쥬게이트를 형성하고;

c) 표적 단백질-조정 화합물 콘쥬게이트와 환원제를 접촉시키고; 및,

d) 표적 단백질-조정 화합물 콘쥬게이트의 양을 목적량으로 감소시키는데 필요한 환원제의 농도를 결정함.

일반적으로, 환원제의 농도가 낮을수록 조정 화합물로 개질된 표적의 백분율이 더 높아질 것이며, 반대도 마찬가지이다. 하나의 구현예에 있어서, 목적량은 50% 이다. 다시 말하면, 약 50% 의 표적 단백질이 비개질형이며, 나머지 약 50% 는 표적 단백질-조정 화합물 콘쥬게이트로서 존재한다. 즉, 목적량 (상기 경우는 약 50%) 과 연관된 환원제의 농도가 리간드 후보물이 선택되기 위해 일부 더 낮은 수준의 결합 친화도를 가질 것이 요구되는 후속 구속 실험에서 이용된다. 목적하는 결합 친화도의 더 낮은 수준에 따라 사용될 수 있는 기타 목적량의 예에는 약 20%, 25%, 30%, 40%, 60%, 75% 등이 포함된다.

전술된 바와 같이, 구속 방법은 단일 리간드 후보물 또는 복수의 리간드 후보물과 이용될 수 있다. 바람직한 구현예에 있어서, 구속 방법은 처리 및 효율을 최대화시키기 위해, 복수의 리간드 후보물 (예컨대, 5 개, 20 개, 100 개, 500 개, 1000 개, 및 나아가 >1000 개) 을 스크리닝하는데 이용된다. 도 4 는 라이브러리 풀 중 리간드 후보물의 수가 변하는 실험 결과를 나타낸다. 상기 실험은 풀이 100 개의 리간드 후보물을 포함하는 경우에도 N -토실- D -프롤린이 강력히 선택됨을 나타내었으나, 이제는 더 큰 수의 리간드 후보물 (예컨대 >500 개, >750 개, >1000 개) 을 포함하는 라이브러리가 일반적으로 사용된다.

구조-활성 상관관계 ("SAR") 는 SAR 이 전통 분석을 이용하여 개발된 방식과 매우 유사한 구속 실험으로부터의 정보를 이용하여 개발될 수 있다. 예를 들어, 하기 모식도의 좌측에서 R ^c 를 갖는 리간드 후보물이 대장균 TS 에 대해 강력히 선택되었지만, 우측에서 R ^c 를 갖는 리간드 후보물은 그렇지 못했다.

대략 1200 개 화합물의 스크리닝 데이타에 기초하여, 페닐-술폰아미드 코어 및 프롤린 고리가 필수적임이 결정되었다. 예를 들어, TS 는 페닐 고리 주위에서 상당한 정도의 유연성에 적응되는 것으로 나타나며, 여기서 페닐 고리는 메틸, t-부틸, 및 할로겐을 포함하는 일정 범위의 기로 치환되거나 비치환될 수 있지만, 그 존재는 선택을 위해 필요하다. 유사하게, 프롤린 고리는 이것이 페닐알라닌, 페닐글리신 또는 피롤로 대체된 화합물이 선택되지 않았으므로 필수적인 것으로 나타난다.

상기에 부가하여, 구속으로부터 선택된 화합물이 표적에 대해 결합 친화도를 갖는 것에 해당하는지를 검증하기 위해 추가 실험이 수행되었다. 하나의 예에 있어서, 구속 실험은 공지된 기질의 존재 하에 수행된다. 선택된 리간드 후보물이 표적에 대한 내재적 결합 친화도를 보유하는 경우, 기질에 의한 이동에 저항성일 것이다. 대조적으로, 내재적 결합 친화도 또는 시스테아민이 없는 리간드 후보물은 기질에 의해 쉽게 이동할 것이다. 또다른 예는 구속되지 않은 유사체 상에서의 전통적 효소 분석이다. 예를 들어, 하기 화합물의 리간드 절편의 R ^c 부분 친화도는 Michaelis-Mention 역학을 이용하여 결정되었다:

자유산 1 의 K _i 는 1.1 ±0.25 mM 이었다. 명백하게, 자유산은 천연 기질 dUMP 와 경합하였다. 즉, N -토실- D -프롤린 1 은 TS 의 약하지만 경합적인 저해제이다.

또다른 구현예에 있어서, 활성 부위 내의 천연 생성 시스테인 잔기가 세린으로 돌연변이되고 (C146S) 또다른 시스테인이 도입되었다 (L143C 또는 H147C). C146S/L143C 돌연변이를 사용한 구속에서는 야생형 효소에서와 유사한 결과가 얻어진다. 명백하게, N -토실- D -프롤린 유사체가 강력히 선택되었다. 대조적으로, C146S/H147C 은 N -토실- D -프롤린 유사체를 선택하지 않았으나 여러 다른 분자가 선택되었다. 상기 결과는 반응성 시스테인을 둘러싼 국소적 결합 환경 및 디술피드 링커의 기하학적 속박의 차이를 반영하는 것으로 여겨진다.

구속에서 수득된 정보가 표적으로의 생산적 결합과 연관될 수 있음을 확인하기 위해, X-선 결정학을 이용하여 천연 효소 및 여러 복합체의 3 차원 구조를 해석하였다. 표 1 은 결정학 데이타 및 정련 파라미터를 상세히 나타낸다. 하나의 복합체는 TS 에 결합된 N -토실- D -프롤린의 자유산의 것이었다 (표 1 중 4 번째 물질). 또다른 복합체는 활성 부위 시스테인 (Cys-146) 에 구속된 N -토실- D -프롤린 유도체의 것이었다 (표 1 중 2 번째 물질). 또다른 복합체는 C146S/L143C 돌연변이에 구속된 N -토실- D -프롤린 유도체의 것이었다 (표 1 중 3 번째 물질).

유의미하게, N -토실- D -프롤린 부분의 위치는 3 경우 모두에서 매우 유사하다 (단백질 중 모든 Cα탄소에 대한 0.11-0.56Å 과 비교하여, RMSD 0.55-1.88Å). N -토실- D -프롤린 치환기가 근접하게 겹치지만 알킬디술피드가 상이한 시스테인 잔기로부터의 상기 부분 상에 커버를 구속한다는 사실은, 구속이 아닌 N -토실- D -프롤린 부분이 결합 결정기라는 개념을 지지한다.

알 수 있듯이, 구속은 표적 내 관심 부위에 결합하는 리간드를 동정할 수 있는 강력한 방법이다. 구속은 단독으로, 또는 약물 후보물을 동정하고 최적화하기 위한 다른 의약 화학 방법과 조합되어 이용될 수 있다.

본 발명의 하나의 측면에 있어서, 결합 결정기 (예컨대 R ^c ) 를 동정하기 위해 구속이 이용된 후, 동정된 결합 결정기 또는 이들의 변이체를 포함하는 화합물의 친화도를 더 높게 만들기 위해 전통적 의약 화학이 이용된다. 하나의 구현예에 있어서, 결합 결정기를 동정하고, 또한 화합물이 더 높은 친화도로 표적에 결합하는지 여부에 접근하는데도 모두 구속이 이용된다. 예를 들어, 구속은 기능적 분석이 이용불가능하거나 인위적이기 쉬운 전통적 결합 실험에 대한 대안이다. 상기 접근법을 도 5 에 도식적으로 나타낸다. 알 수 있듯이, 결합 결정기 R ^D 를 동정하기 위해 구속이 이용된다. 일단 상기 결합 결정기가 동정되면, 개질 라이브러리 중 R ^D 의 변이체를 합성하기 위해 전통적 의약 화학 접근법이 이용된다. 리간드 후보물의 개질 라이브러리에는 R ^D 의 변이체, 예컨대 이들의 등량흡착제 및 상동체가 포함될 것이다. 개질 라이브러리에는 또한 R ^D 또는 이들의 변이체 뿐만 아니라 주변 결합 영역을 이용할 수 있는 다른 결합 결정기를 포함하는 "확장된" 화합물이 포함될 수 있다. 도 5 에는 본래 결합 결정기 R ^D 가 R ^D' 으로 개질되고 선택된 화합물에 제 2 결합 결정기 R ^E 가 포함된, 개질 라이브러리로부터 선택된 화합물이 예시된다. 실시예 6 은 추가로 낮은 밀리몰 화합물인 화합물 1 의 최적화에서 동정된, TS 에 대해 낮은 마이크로몰 친화도 화합물 (2 및 3) 의 최적화 시도에 대한 상기 방법을 나타낸다.

본 발명의 또다른 측면에 있어서, 이후에 함께 연결되는 2 개의 결합 결정기를 동정하는 방법이 제공된다. 일반적으로, 상기 방법에는 하기가 포함된다:

a) 표적 단백질에 결합하는 제 1 화합물을 동정하고;

b) 표적 단백질에 결합하는 제 2 화합물을 동정하고; 및

c) 제 1 화합물 및 제 2 화합물을 링커 요소를 통해 연결하여 표적 단백질에 결합하는 콘쥬게이트 분자를 형성함. 바람직한 구현예에 있어서, 콘쥬게이트 분자는 제 1 화합물 또는 제 2 화합물 단독에서보다 더 높은 결합 친화도로 표적 단백질에 결합한다.

하나의 구현예에 있어서, 제 1 화합물은 화학식 R ^D SSR ¹ 을 가지며, 제 2 화합물은 화학식 R ^E SSR ¹ 을 가지고 (식 중, R 및 R ¹ 은 전술한 바와 같으며, R ^D 및 R ^E 는 각각 독립적으로 C ₁ -C ₂₀ 비치환 지방족, C ₁ -C ₂₀ 치환 지방족, 비치환 아릴, 또는 치환 아릴이다) 제 1 및 제 2 화합물은 디술피드 결합을 통해 표적 단백질에 결합한다. 도 6 은 뒤에 함께 연결되어 표적 단백질에 결합하는 콘쥬게이트 분자를 형성하는 결합 결정기 R ^D 및 R ^E 를 동정하기 위해 2 개의 개별 구속 실험이 이용되는 상기 방법의 모식도이다.

또다른 구현예에 있어서, 결합 결정기 R ^D 및 R ^E 를 동정하기 위한 구속 실험은 동시에 수행된다. 상기 방식으로, 2 개의 동정된 결합 결정기가 겹치지 않는 부위에서 표적 단백질에 결합함이 확인된다. 즉, 상기 방법에는 하기가 포함된다:

a) 표적 단백질에 결합하는 제 1 화합물을 동정하고;

b) 표적 단백질에 결합하는 제 1 화합물의 존재 하에 표적 단백질에 결합하는 제 2 화합물을 동정하고; 및,

c) 제 1 화합물 및 제 2 화합물을 링커 요소를 통해 연결하여 표적 단백질에 결합하는 콘쥬게이트 분자를 형성함. 도 7 은 상기 방법의 모식도이다. 제 1 구속 실험에서, 결합 결정기 R ^D 가 동정된다. 일단 R ^D 가 동정되면, 제 2 반응성 시스테인이 도입되거나 탈마스킹되며, 결합 결정기 R ^E 를 동정하기 위한 구속 실험이 결합 결정기 R ^D 의 존재 하에 수행된다. 이어서 2 개의 결합 결정기 R ^D 및 R ^E 가 연결되어, 표적 단백질에 결합하는 콘쥬게이트 분자를 형성한다.

또다른 구현예에 있어서, 제 1 화합물은 구속을 이용하여 동정되며, 제 2 화합물은 비구속 방법을 통해 동정된다. 하나의 구현예에 있어서, 비구속 방법에는 합리적 약물 고안 및 전통적 의약 화학이 포함된다. TS 에 결합한 N -토실- D -프롤린의 결정 구조는, 토실기가 TS 효소에 대한 천연 보조인자인 메틸렌테트라히드로폴레이트의 벤즈아미드 부분과 대략 동일한 위치 및 배향임을 나타내었다. 결과적으로, 메틸렌테트라히드로폴레이트의 글루타메이트 부분이 화합물 1 상에 이식되었다. 표 2 는 선택된 번호의 상기 화합물을 나타낸다.

프롤린의 L-거울상 이성질체 (화합물 4) 에 비해 D-거울상 이성질체 (화합물 5) 에 대해 뚜렷한 선호가 존재하며, 글루타메이트 잔기의 α-카르복실레이트는 이것을 제거하거나 (화합물 12) 일차 아미드로 변화시키는 (화합물 10) 경우 상당한 결합 친화도 손실과 연관되므로 중요하다.

본 발명의 또다른 측면에 있어서, 화합물의 제조 및 최적화에 이용하기 위한 구속 방법의 변법이 제공된다. 일반적으로, 상기 방법에는 하기가 포함된다:

a) 관심 부위 또는 근처에 금속을 배위시키거나 공유 결합을 형성할 수 있는부착기를 갖는 표적을 제공하고;

b) 표적과 증량제를 접촉시켜, 표적-증량제 복합체를 형성하고 (여기서, 증량제는 공유 결합을 형성하거나 금속을 배위시키는 제 1 관능기 및 공유 결합을 형성할 수 있는 제 2 관능기를 포함한다);

c) 표적-증량제 복합체와, 제 2 관능기와 공유 결합을 형성할 수 있는 기를 포함하는 후보물 리간드를 접촉시키고;

d) 표적-증량제 복합체 및 후보물 리간드 간에 공유 결합을 형성하고; 및

e) 표적-증량제-리간드 콘쥬게이트 중에 존재하는 후보물 리간드를 동정함.

하나의 구현예에 있어서, 표적 내 부착기는 반응성 친핵제 또는 친전자제이며, 증량제의 제 1 관능기와 비가역적 공유 결합을 형성한다. 또다른 구현예에 있어서, 표적 내 부착기는 반응성 친핵제 또는 친전자제이며, 증량제의 제 1 관능기와 가역적 공유 결합을 형성한다. 또다른 구현예에 있어서, 표적 내 부착기는 금속 배위 부위이며, 부착기는 제 1 관능기가 함께 금속 배위 부위를 형성한다. 상기 부위에 결합할 수 있는 적합한 금속의 예에는 Cd, Hg, As, Zn, Fe, Cu, Ni, Co 및 Ca 가 포함된다. 또다른 구현예에 있어서, 제 2 관능기는 반응성 친핵제 또는 반응성 친전자제이다.

바람직한 구현예에 있어서, 증량제에는 상기 기재된 바와 같은 제 1 및 제 2 관능기가 포함되며, 표적에 대한 내재적 결합 친화도를 보유하는 결합 결정기가 포함된다. 결합 결정기가 이미 제 1 및 제 2 관능기를 포함하지 않는다면, 이들을 포함하도록 개질될 수 있다. 하나의 방법에 있어서, 결합 결정기 R ^c 를 동정한 후 제 1 및 제 2 관능기를 포함하도록 개질하기 위해 구속이 이용된다. 또다른 방법에 있어서, 결합 결정기는 표적의 공지된 기질 또는 이들의 절편으로부터 수득된다.

또다른 구현예에 있어서, 표적 내 부착기는 반응성 친핵제이며, 증량제에는 친핵제와 공유 결합을 형성할 수 있는 제 1 관능기 및 디술피드 결합을 형성할 수 있는 제 2 관능기가 포함된다. 상기 방법에는 하기가 포함된다:

a) 관심 부위 또는 근처에 반응성 친핵제를 갖는 표적을 제공하고;

b) 표적과 증량제를 접촉시켜, 표적-증량제 복합체를 형성하고 (여기서, 증량제는 표적 내 친핵제와 반응하여 공유 결합을 형성하는 제 1 관능기 및 디술피드 결합을 형성할 수 있는 제 2 관능기를 포함한다);

c) 표적-증량제 복합체와, 디술피드 결합을 형성할 수 있는 리간드 후보물을 접촉시키고;

d) 표적-증량제 복합체 및 리간드 후보물 간에 디술피드 결합을 형성하여 표적-증량제-리간드 콘쥬게이트를 형성하고; 및

e) 표적-증량제-리간드 콘쥬게이트 중에 존재하는 리간드 후보물을 동정함. 임의로, 표적은 환원제의 존재 하에 리간드 후보물과 접촉된다.

적합한 환원제의 예에는 하기가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다: 시스테인, 시스테아민, 디티오트레이톨, 디티오에리트리톨, 글루타티온, 2-메르캅토에탄올, 3-메르캅토프로프리온산, 포스핀, 예컨대 트리스-(2-카르복시에틸-포스핀) ("TCEP"), 또는 나트륨 보로히드리드. 하나의 구현예에 있어서, 환원제는 2-메르캅토에탄올이다. 또다른 구현예에 있어서, 환원제는 시스테아민이다. 또다른 구현예에 있어서, 환원제는 글루타티온이다. 또다른 구현예에 있어서, 환원제는 시스테인이다.

하나의 구현예에 있어서, 표적에는 반응성 친핵제로서 -OH 가 포함되며, 증량제에는 표적 상의 반응성 친핵제와 공유 결합을 형성할 수 있는 제 1 관능기 및 디술피드 결합을 형성할 수 있는 제 2 관능기가 포함된다. 또다른 구현예에 있어서, 표적 상의 반응성 친핵제는 천연 생성 단백질 서열의 일부인 세린, 트레오닌, 또는 티로신 유래의 -OH 이다. 또다른 구현예에 있어서, 표적 상의 반응성 친핵제는 돌연변이화가 이용되어 천연 생성 아미노산이 세린, 트레오닌, 또는 티로신으로 돌연변이된 가공된 -OH 기이다. 또다른 구현예에 있어서, 증량제의 제 1 관능기는 보론산이며, 제 2 관능기는 -SH 또는 마스킹된 -SH 이다. 마스킹된 -SH 의 예는 화학식 -SSR ¹ 의 디술피드이다 (식 중, R ¹ 은 상기 기재된 바와 같다).

또다른 구현예에 있어서, 표적에는 반응성 친핵제로서 -SH 가 포함되며, 증량제에는 표적 상의 반응성 친핵제와 공유 결합을 형성할 수 있는 제 1 관능기 및 디술피드 결합을 형성할 수 있는 제 2 관능기가 포함된다. 하나의 구현예에 있어서, 표적 상의 반응성 친핵제는 천연 생성 단백질 서열의 일부인 시스테인 유래의 -SH 이다. 또다른 구현예에 있어서, 표적 상의 반응성 친핵제는 돌연변이화가 이용되어 천연 생성 아미노산이 시스테인으로 돌연변이된 가공된 -SH 기이다.

또다른 구현예에 있어서, 표적 단백질은 반응성 친핵제로서 디술피드 형태의 마스킹된 -SH 를 보유한다. 또다른 구현예에 있어서, 표적 단백질은 티올이 디술피드로서 마스킹된 시스테인을 보유한다. 또다른 구현예에 있어서, 표적 단백질은 티올이 또다른 시스테인과 디술피드 결합으로 마스킹된 시스테인을 보유한다. 또다른 구현예에 있어서, 표적 단백질은 티올이 글루타티온과의 디술피드 결합으로 마스킹된 시스테인을 보유한다. 또다른 구현예에 있어서, 표적 단백질은 티올이 화학식 -SSR ¹ 의 디술피드로서 마스킹된 시스테인을 보유한다 (식 중, R ¹ 은 상기 기재된 바와 같다).

하나의 구현예에 있어서, 증량제의 제 1 및 제 2 관능기는 각각 독립적으로 -SH 또는 마스킹된 -SH 이다. 마스킹된 티올의 예는 화학식 -SSR ¹ 의 디술피드이다 (식 중, R ¹ 은 상기 기재된 바와 같다). 상기 구현예에 있어서, 표적 및 증량제 간에 형성된 공유 결합은 디술피드 결합이며, 따라서 가역적 공유 결합이다. 하나의 변법에 있어서, 표적-증량제 복합체와 하나 이상의 리간드 후보물을 접촉시키기 전에 표적이 증량제와 접촉된다. 또다른 변법에 있어서, 표적은 증량제 및 하나 이상의 리간드 후보물을 포함하는 풀과 접촉된다.

또다른 구현예에 있어서, 제 1 관능기는 표적을 변성시키지 않는 조건 하에 표적의 반응성 친핵제와 비가역적 공유 결합을 형성할 수 있는 기이며, 제 2 관능기는 -SH 또는 마스킹된 -SH 이다. 하나의 구현예에 있어서, 제 1 관능기는 SN2-유사 부가를 겪을 수 있는 기이다. 상기 증량제의 예에는 하기가 포함된다: (i) α-할로산, 예컨대

(ii) 플루오로포스포네이트, 예컨대

(iii) 에폭시드, 예컨대

(iv) 아지리딘, 예컨대

(v) 티란, 예컨대

(vi) 할로메틸 케톤/아미드, 예컨대

(식 중, R 은 비치환 C ₁ -C ₂₀ 지방족, 치환 C ₁ -C ₂₀ 지방족, 비치환 아릴, 및 치환 아릴이며; R' 은 H, -SR ¹ 이고 (식 중, R ¹ 은 상기에서 정의되었다); X 는 이탈기이다. 예에는 할로겐, N ₂ , OR, -P(=O)Ar ₂ , -NO(C=O)R, -(C=O)R, -SR 및 비닐 술폰이 포함된다). 하기 예시되는 상기 및 기타 구조에 있어서, 네모는 소분자 증량제 (SME) 내의 결합 결정기를 나타낸다, 즉 표적에 대해 결합 친화도를 갖는 SME 의 일부를 나타낸다.

또다른 구현예에 있어서, 제 1 관능기는 SN 아릴 유사 부가를 겪을 수 있는 기이다. 적합한 기의 예에는, 하기와 같은 7-할로-2,1,3-벤족사디아졸, 및 오르토/파라 니트로 치환 할로벤젠이 포함된다:

(식 중, R' 및 X 는 상기 정의된 바와 같다).

또다른 구현예에 있어서, 제 1 관능기는 Michael-유형 부가를 겪을 수 있는 기이다. 적합한 기의 예에는 전자 당김 시스템에 인접한 이중 또는 삼중 결합을 포함하는 임의 부분, 예컨대 카르보닐, 이민, 퀴닌, CN, NO ₂ , 및 -S(=O)- 이 포함된다. 상기 증량제의 예에는 하기가 포함된다:

(식 중, R' 은 상기 정의된 바와 같다).

증량제는 종종 특정 표적 또는 표적 패밀리에 대해 맞춤화된다. 키나아제 특이적 증량제의 예에는 하기가 포함된다:

(식 중, R ^a , R ^b , R ^c , R ^d , R ^e , 및 R ^f 는 각각 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 수소, C ₁ -C ₅ 알킬, C ₁ -C ₅ 알킬아민, 및 아릴 (단, 증량제 상의 하나 이상의 R 기는 Michael 수용자이며, 또다른 R 기는 -(CH ₂ ) _n -SR'; -C(=O)-(CH ₂ ) _n -SR'; -O-(CH ₂ ) _n -SR'; -(CH ₂ ) _n -SR'; 및 티올 보호기 (식 중, R' 은 상기 기재된 바와 같다) 로부터 선택된다)). 적합한 Michael 수용자의 예에는 하기가 포함된다:

세린 프로테아제 특이적 증량제의 예에는 하기가 포함된다:

상기 증량제 중 제 1 관능기는 금속 배위 부위이며 제 2 관능기는 -SSCH ₂ CH ₂ NH ₂ 형태의 마스킹된 티올이지만, -SSR ¹ 형태일 수도 있다 (식 중, R ¹ 은 상기 기재된 바와 같다). 상기 증량제는 아연의 존재 하에서만 세린 프로테아제에 결합한다 (Katz 등, Nature 391: 608-12 (1998); Katz 및 Luong, J. Mol. Biol. 292: 669-84 (1999); Janc 등, Biochemistry 39: 4792-800 (2000) 참조). 제 2 관능기가 없는 상기 화합물 버전은 하기에 나타낸 바와 같이 활성 부위 히스티딘및 세린을 통해 세린 프로테아제의 활성 부위에 결합한다:

도 8 은 증량제를 이용한 구속 방법의 하나의 구현예를 나타낸다. 나타낸 바와 같이, 반응성 친핵제 -SH 를 포함하는 표적과, 반응성 친핵제와 공유 결합을 형성할 수 있는 제 1 관능기 X 및 디술피드 결합을 형성할 수 있는 제 2 관능기 -SR ^1' (식 중, R ^1' 은 상기 정의된 R ¹ 과 동일하다) 을 포함하는 증량제가 접촉된다. 구속-증량제 복합체가 형성된 후 복수의 리간드 후보물과 접촉된다. 증량제는 제 1 결합 결정기 (원형) 를 제공하며, 리간드 후보물은 제 2 결합 결정기 (사각형) 를 제공하고, 생성 결합 결정기들이 함께 연결되어 콘쥬게이트 화합물을 형성한다.

표적 및 리간드, 표적 및 증량제, 표적-증량제 복합체 및 리간드 상의 반응기 사이에, 또는 2 개의 리간드 사이에 가역적 또는 비가역적 공유 결합을 형성하기 위한 합성 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 기본 참고서, 예컨대 [March, Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, New York, 4 편, 1992] 에 기재되어 있다. 알데히드 및 케톤 및 아민 간의 환원성 아민화는, 예를 들어 [March 등, supra, 898-900 페이지] 에; 대안적 아민 제조 방법은 1276 페이지에; 히드라존 및 히드라존 유도체, 예컨대 세미카르바존을 얻기 위한 알데히드 및케톤 및 히드라지드 유도체 간의 반응은 904-906 페이지에; 아미드 결합 형성은 1275 페이지에; 요소 형성은 1299 페이지에; 티오카르바메이트 형성은 892 페이지에; 카르바메이트 형성은 1280 페이지에; 술폰아미드 형성은 1296 페이지에; 티오에테르 형성은 1297 페이지에; 디술피드 형성은 1284 페이지에; 에테르 형성은 1285 페이지에; 에스테르 형성은 1281 페이지에; 에폭시드로의 부가는 368 페이지에; 아지리딘으로의 부가는 368 페이지에; 아세탈 및 케탈의 형성은 1269 페이지에; 카르보네이트의 형성은 392 페이지에; 데나민의 형성은 1264 페이지에; 알켄의 복분해는 1146-1148 페이지에 (또한 [Grubbs 등, Acc. Chem. Res. 28: 446-453 [1995]] 참조); 아릴 할라이드 및 술포네이트와 알칸 및 아세틸렌의 전이 금속-촉매 커플링, 예컨대 Heck 반응은 717-178 페이지에; 아릴 할라이드 및 술포네이트와 유기금속 시약, 예컨대 유기붕소 시약의 반응은 662 페이지에 (또한 [Miyaura 등, Chem. Rev. 95: 2457 [1995]] 참조); 유기주석, 및 유기아연 시약, 옥사졸리딘의 형성 (Ede 등, Tetrahedron Letts. 28: 7119-7122 [1997]); 티아졸리딘의 형성 (Patek 등, Tetrahedron Letts. 36: 2227-2230 [1995]); 이미도에스테르를 통한 아민 커플링에 의한 아미딘기를 통해 연결된 아민 (Davies 등, Canadian J. Biochem. c50: 416-422 [1972]) 등이 기재되어 있다.

증량제를 이용하는 구속 방법을 추가로 예시하기 위해, 상기 방법이 시스테인 아스파르틸 프로테아제 ( c ysteine as partyl prote ase ) 패밀리 멤버인 항아폽토시스 표적 카스파아제 (caspase)-3 에 적용되었다. 현재 약 12 개의 공지된 카스파아제 패밀리 멤버가 존재하며, 그 다수가 아폽토시스 케스케이드의 개시 또는진행에 관여된다. 카스파아제는 과다하거나 비정상적인 수준의 프로그램화 세포 사멸이 관여되는 여러 치료 적응증, 예컨대 뇌졸중, 외상성 뇌 손상, 척추 손상, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 파킨슨 질환, 심혈관계 질환, 간 부전 및 패혈증에 대해 잠재적인 약물 표적이다. 또한, 카스파아제-3 에는 활성 부위에 천연 생성 시스테인 잔기가 포함되며, 기능적으로 및 결정학적으로 모두 잘 특징분석되어 있다.

카스파아제-3 활성 부위에 사용하기 적합한 증량제는 작은 아스파르틸-기재 아릴아실옥시메틸 케톤이 활성 부위 시스테인과 비가역적으로 반응한다는 것이 공지된 사실을 이용하여 고안되었다. 실시예 7-10 및 14 에는 5 개의 예시적 증량제의 합성이 기재되어 있다. 상기 증량제는 또한 다른 카스파아제 표적, 예컨대 카스파아제-1 및 카스파아제-7 을 이용한 구속 실험에 이용될 수 있다. 더욱 자세히 기재될 2 개의 증량제는 화합물 13 및 14 이다:

알 수 있듯이, 화합물 13 및 14 에는 결합 결정기로서 아스파르트산 부분이 포함된다. 명백히, 아스파르트산 부분의 카르보닐은 또한 활성 부위 시스테인의 티올과 공유 결합을 형성하는 제 1 관능기의 일부 (아릴아실옥시메틸 케톤 부분) 이다. 증량제 13 및 14 에는 또한 적절한 시점에 탈마스킹될 수 있는 티오에스테르 형태의 제 2 관능기인 마스킹된 -SH 가 포함된다. 예를 들어, 티오에스테르는 표적-증량제 복합체를 히드록실아민으로 처리하여 자유 티올로 전환될 수 있다.

두 증량제 모두 활성 부위 시스테인에서 카스파아제-3 을 선택적으로 개질시키는 것으로 나타났으며, 하기 표적-증량제 복합체를 생성하기 위해 히드록실아민으로 처리되었다:

실시예 11 에는 증량제 13 으로 카스파아제-3 을 개질하여 표적-증량제 복합체 13' 을 형성하는 것에 관한 절차가 보다 상세히 기재되어 있다.

표적-증량제 복합체 13' 및 14' 는 각각 약 10,000 개 리간드 후보물 라이브러리에 대한 구속 방법에서 사용되었다. 표적-증량제 복합체 13' 을 이용하여 선택된 리간드-후보물의 예는 하기와 같다:

표적-증량제 복합체 14' 을 이용하여 선택된 리간드-후보물의 예는 하기와 같다:

명백하게, 리간드 후보물 15 는 표적-증량제 복합체 14' 에 의해 선택되지 않았으며, 리간드 후보물 16 은 표적-증량제 복합체 13' 에 의해 선택되지 않았다. 선택된 화합물 중의 구조-활성 상관관계도 또한 뚜렷하였다. 예를 들어, 히드록실기가 없는 것을 제외하고는 리간드 후보물 15 와 동일한 하기 리간드 후보물 17 은 표적-증량제 복합체 13' 또는 14' 에 의해 선택되지 않았다:

증량제 및 선택된 리간드 후보물이 어떻게 표적에 결합하는지를 알아보기 위해, 표적-증량제 리간드 콘쥬게이트의 2 개 구조를 결정하였다. 일반적 결정학적 절차가 실시예 12 에 추가 설명되어 있다. 제 1 구조는 표적-증량제 복합체 13' 이 리간드 후보물 15 와 접촉하는 경우 형성되는 콘쥬게이트의 것이다. 제 2 구조는 표적-증량제 복합체 14' 이 리간드 후보물 16 과 접촉하는 경우 형성되는 콘쥬게이트의 것이다. 표 3 에 상기 구조에 대해 선택된 결정학적 데이타가 요약된다.

명백하게, 두 증량제의 아스파르트산 부분은 공지된 테트라펩티드 기질 내의아스파르틸 잔기와 포개질 수 있었다. 리간드 후보물 15 의 결합 결정기에 있어서, 살리실레이트 술폰아미드는 4 개의 수소 결합을 포함하여, 단백질과 수회 접촉된다. 살리실레이트 부분은 카스파아제-3 에서 아스파르트산을 우선적으로 인지하는 효소의 P4 포켓을 점유한다. 리간드 후보물 16 의 결합 결정기에 있어서, 술폰은 살리실레이트에서와 일부 유사한 접촉을 만든다.

증량제 및 리간드 후보물로부터의 결합 결정기가 카스파아제-3 의 활성 부위와 생산적으로 접촉하였으므로, 디술피드가 보다 안정한 연결로 대체된 화합물이 고안되었다. 또한, 결합 결정기의 SAR 를 조사하기 위해 유도체를 제조하였다. 증량제 13 및 리간드 후보물 15 를 포함하는 콘쥬게이트에 있어서, 표적-증량제 리간드 콘쥬게이트에는 하기가 포함된다:

상기 콘쥬게이트로부터, 하기 부분을 포함하는 일군의 강력한 카스파아제-3 저해제가 제조되었다:

최적화 및 SAR 모두를 위해 콘쥬게이트에 근거하여 제조된 화합물의 4 개 예가 표 4 에 개시된다.

알 수 있듯이, 2 개의 황 원자가 2 개의 메틸렌 단위로 대체되고, 아릴아실옥시메틸케톤 (제 1 관능기) 이 단순 알데히드로 대체되어 K _i 2.8 μM 을 갖는 카스파아제-3 의 강력한 저해제인 화합물 18 이 얻어지는 보존적 접근법을 취했다. 화합물 19 를 얻기 위해 히드록실기를 제거함으로써 친화도가 계수 5 만큼 감소되어, 구속 스크리닝에서 관찰된 SAR 가 확인되었다. 화합물 20 을 얻기 위해 히드록실기 및 산 부분 모두를 제거함으로써, 결합 친화도가 완전히 제거되었다.모델링 연구에서, 메틸렌 링커를 강직한 아미노벤질 부분으로 대체함으로써 아스파르틸기 및 살리실레이트 간의 거리가 효과적으로 가교되는 반면 링커의 엔트로피 손실이 감소되는 것으로 제시되었다. 실제로 알 수 있듯이, 화합물 21 은 화합물 18 보다 10 배 초과로 더 나은 K _i 를 갖는다.

유사하게, 증량제 14 및 리간드 후보물 16 을 포함하는 표적-증량제 리간드 콘쥬게이트로부터 신규군의 카스파아제-3 저해제가 생성되었다:

하나의 구현예에 있어서, 상기 화합물에는 하기 부분이 포함된다:

또다른 구현예에 있어서, 상기 화합물은 하기 구조를 갖는다:

(식 중, X 는 CH ₂ , S, SO, SO ₂ 이며 R ⁵ 는 비치환 아릴 또는 치환 아릴이다). 또다른 구현예에 있어서, R ⁴ 는 비치환 헤테로아릴 또는 치환 헤테로아릴이다. 상기군의 화합물의 예는 K _i 0.33 μM 을 갖는 화합물 22 이다.

실시예 13 및 15-21 에는 증량제 13 및 14 를 사용한 구속의 이용에 근거하여 합성된 선택된 번호의 카스파아제-3 저해제가 보다 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 살리실레이트 술폰아미드-포함 화합물이 부가적으로 주목할만 하다. 적합한 P4-결합 절편으로서의 살리실레이트 술폰아미드의 동정은 전통적 의약 화학을 이용해서는 얻어지지 않았을 것이다. 예로서 화합물 21 을 사용하면, 화합물 21 의 살리실레이트 술폰아미드가 없는 버전은 대략 28 μM 의 K _i 로 카스파아제-3 을 저해한다. 상기 절편으로의 살리실레이트 술폰아미드의 부가는 결합을 약 200 배 개선시키고, 대략 0.16 μM 의 K _i 를 갖는 화합물 21 이 얻어진다. 대조적으로, 카스파아제-3 의 P1-P3 부위에 결합하는 공지된 트리펩티드, 예컨대 화합물 I 을 출발점으로서 이용하는 경우 결합 친화도는 감소한다.

알 수 있듯이, 화합물 I 은 K _i 0.051 μM 을 가지며, 상기 화합물로의 살리실레이트 술폰아미드 부분의 부가는 결합 친화도에 있어서 약 300 배 감소를 나타내는 화합물 II 를 만든다. 이러한 극적인 감소로 인해, 트리펩티드로 P4 결합을 조사하는 것은 적합한 P4-결합 절편으로서 살리실레이트 술폰이미드의 동정을 이끌어내지 않을 것이다. 그러나, P4 로의 결합에 이용가능한 상기 절편을 갖는 화합물은 강력한 저해제이다. 결과적으로, 상기 예는 전통적 방법을 이용하여 발견되지 않을 수 있는 중요한 절편을 동정하기 위한 구속의 능력을 강조한다. 카스파아제-3 의 경우에서 나타낸 바와 같이, 상기 절편은 함께 연결되어 관심 표적의 강력한 길항제 또는 작동제를 형성할 수 있다.

본 발명을 추가로 하기 비제한적 실시예로 예시한다.

실시예 1

비개질 또는 "야생형" 대장균 TS 효소의 여러 돌연변이를 제조하고, 대장균 균주 χ2913 (여기에는 TS 유전자가 제거되어 있다) 중에서 과발현시켜 정제하였다. χ2913 균주는 (결실된) TS 유전자가 생명에 필수적이기 때문에 티미딘 보충을 필요로 한다. 제 1 돌연변이는 활성 부위 시스테인이 세린으로 대체된 것이다 (C146S 로 약칭함). 제 2 및 제 3 돌연변이에는 C146S 돌연변이에 부가하여 활성 부위 내로 도입된 비천연 시스테인이 포함되었다. 제 2 돌연변이에는 류신 대신 잔기 143 에 시스테인이 포함되며, C146S/L143C 로 표시되었다. 제 3 돌연변이에는 히스티딘 대신 잔기 147 에 시스테인이 포함되며, C146S/H147C 로 표시되었다. 다른 돌연변이에는 활성 부위 시스테인 (C146) 이 유지된 D169C, W83C, 및 I79C 가 포함되었다.

실시예 2

디술피드-포함 라이브러리 멤버를 Parlow 및 공동연구자들의 방법 (Mol. Diversity 1: 266-269 (1995)) 을 채용하여 시판 카르복실산 및 모노-N-(tert-부톡시카르보닐)-보호 시스타민 (모노-BOC-시스타민) 으로부터 제조하였다. 간략하게, 260 μmol 의 각 카르복실산을 N,N-디메틸포름아미드 ("DMF") 중의 1,3-디이소프로필카르보디이미드 ("DIC") 를 사용하여 폴리스티렌 수지 상의 130 μmol 동등량의 4-히드록시-3-니트로벤조페논 상에 고정화하였다. 실온에서 4 시간 후에, 수지를 DMF (2×), 디클로로메탄 (DCM, 3×), 및 테트라히드로푸란 ("THF", 1×) 으로 헹궈서 커플링하지 않은 산과 DIC 를 제거하였다. THF 중 66 μmol 의 모노-BOC 보호 시스타민으로의 아미드 형성을 통해 산을 수지로부터 절단하였다. 상온에서 12 시간 동안 반응 후, 용매를 증발시키고, BOC 기를 DCM 중의 80% 트리플루오로아세트산 ("TFA") 을 사용하여 각 디술피드의 커플링되지 않은 절반으로부터 제거하였다. 생성물을 HPLC-MS 로 특징분석하고, 실질적으로 순수한 상기 생성물을 추가 정제 없이 사용하였다. 상기 방법으로 총 530 개 화합물을 제조하였다.

또한 모노-BOC-보호 시스타민 및 다양한 술포닐 클로라이드, 이소시아네이트, 및 이소티오시아네이트로부터 라이브러리를 구축하였다. 술포닐 클로라이드의 경우, 10 μgmol 의 각 술포닐 클로라이드를 15 mg 의 폴리(4-비닐피리딘) 의 존재 하에 THF 중 10.5 μmol 의 모노-BOC 보호 시스타민 (2% 디이소프로필 에틸 아민을 가짐) 과 커플링하였다. 48 시간 후, 여과를 통해 폴리(4-비닐피리딘) 을 제거하고, 용매를 증발시켰다. BOC 기를 DCM 중 50% TFA 를 사용하여 제거하였다. 이소(티오)시아네이트의 경우, 10 μmol 의 각 이소시아네이트 또는 이소티오시아네이트를 THF 중 10.5 μmol 의 모노-BOC 보호 시스타민과 커플링하였다. 상온에서 12 시간 동안 반응 후, 용매를 증발시키고, BOC 기를 DCM 중 50% TFA 를 사용하여 제거하였다. 상기 방법을 이용하여 총 212 개 화합물을 제조하였다.

마지막으로, 10 μmol 의 특정 알데히드 또는 케톤과, 1:1 메탄올:클로로포름 (2% 아세트산이 첨가됨) 중의 10.5 μmol 의 HO(CH ₂ ) ₂ SS(CH ₂ ) ₂ 0NH ₂ 를 12 시간 동안 상온에서 반응시켜 옥심 생성물을 생성함으로써, 옥심-기재 라이브러리를 구축하였다. 상기 방법을 이용하여 총 448 개 화합물을 제조하였다.

개별 라이브러리 멤버를 최종 농도 50 또는 100 mM 로 아세토니트릴 또는 디메틸술폭시드 중에 재용해시켰다. 이어서 상기 각각의 분취물을 8-15 개 분별 화합물군으로 풀링하였다 (풀의 각 멤버는 독특한 분자량을 갖는다).

실시예 3

-토실-프롤린 유도체를 하기와 같이 합성하였다. 프롤린 메틸 에스테르 히드로클로라이드를 수중에서 4-(클로로술포닐)벤조산 및 탄산나트륨과 반응시켰다. 생성물을 N,N-디메틸포름아미드 중 피리딘 및 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트와 반응시키고 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하여 펜타플루오로페닐 에스테르로 전환시켰다. 이어서 상기 활성화 에스테르를 트리에틸아민 및 디클로로메탄의 존재 하에 글루타메이트 (또는 시험된 임의의 기타 아미노산) 의 메틸-에스테르와 반응시키고, 생성물을 플래시 크로마토그래피로 정제하고, 메틸 에스테르를 수중에서 수산화리튬으로 가수분해하였다. 최종 생성물을 역상HPLC 를 통해 정제하고 동결건조하였다.

이와는 달리, 상기 순서를 프롤린 t-부틸 에스테르로 출발하여 따랐다. 아미노 에스테르를 벤조산으로 커플링한 후, t-부틸 에스테르를 포획제로서 트리에틸실란과 함께 DCM 중 50% TFA 로 제거하였다. 이어서 자유산을 상기에서와 같이 펜타플루오로페닐 에스테르로 전환시키고 적절한 아민과 반응시켰다. 메틸 에스테르를 수중에서 수산화리튬으로 가수분해하고, 최종 생성물을 역상 HPLC 를 통해 정제하고 동결건조하였다.

실시예 4

디술피드 라이브러리를 하기와 같이 스크리닝하였다. 전형적 실험에 있어서, 8-15 개 디술피드-포함 화합물 라이브러리를 포함하는 1 ㎕ 의 DMSO 용액을 49 ㎕ 의 단백질-포함 완충액에 첨가하였다. 상기 화합물은 각각이 독특한 분자량을 갖도록 선택되었다. 이상적으로, 상기 분자량은 단순화가 모호하지 않도록 10 원자량 단위 (amu) 이상 다르다. 8-15 개 디술피드-포함 화합물 풀이 전형적으로 단순화의 용이성을 위해 사용되었지만, 더 큰 풀이 사용될 수도 있다. 단백질은 ~15 μM 농도로 존재하며, 각각의 디술피드 라이브러리 멤버는 ~0.2 mM 로 존재하여, 모든 디술피드 라이브러리 멤버의 총 농도는 ~2 mM 이었다. 스크리닝은 25 mM 인산칼륨 (pH 7.5) 및 1 mM 2-메르캅토에탄올을 포함하는 완충액 중에서 수행하였지만, 기타 완충액 및 환원제가 사용될 수 있다. 반응은 30 분 이상 동안 상온에서 평형에 도달하도록 방치되었다. 상기 조건은 질량-분광측정기 (하기를 참고) 에서 단백질이 이온화되는 용이성, 특정 시스테인(들) 의 반응성 등에 따라 상당히 변할 수 있다. TS 의 경우에 있어서, 상기 기재된 조건이 만족스러운 것으로 나타났다. 산소 또는 외래 금속 이온을 배제하기 위한 특별한 노력은 취하지 않았으며; 상기 반응의 시간 척도 상에서, 디술피드 교환을 촉진하기 위해 충분한 자유 티올이 존재하였다.

평형 후에, 반응물을 HP1100 HPLC 상에 주입하고, 질량-분광측정기 (Finnigan MAT LCQ) 에 부착된 C18 칼럼 상에서 크로마토그래피하였다. 단백질에서 얻어지는 다중 하전된 이온을 이용가능한 소프트웨어 (Xcalibur) 로 단순화하여 단백질 질량에 도달하였다. 이어서 단백질에 디술피드 결합을 통해 결합된 임의 라이브러리 멤버의 정체를 관찰 질량으로부터 비개질 단백질의 공지된 질량을 빼서 쉽게 결정하였다. 상기 공정은 라이브러리 멤버의 부착이 단백질 자체의 이온화 특성을 극적으로 변화시키지 않는다는 것을 가정하며, 대부분의 경우 단백질이 임의의 주어진 라이브러리 멤버에 비해 20 배 이상 더 클 것이라는 사실에 기인한 보존적 가정이다. 상기 가정은 하나의 단백질에 의해 선택된 소분자가 다른 단백질에 의해 선택되지 않음을 나타냄으로써 확인되었다.

실시예 5

비공유 복합체에 있어서, 1 mM 화합물이 결정화 완충액 중에 포함되는 것을 제외하고, 예전에 [Perry 등, Proteins 8: 315-333 (1990)] 에 기재된 바와 같이 결정을 성장시켰다. 데이타 수집 전에, 결정을 70% 포화 (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 20% 글리세롤, 50 mM K ₂ HP0 ₄ , pH 7.0 을 포함하는 용액으로 옮겼다. 비공유 N -토실- D -프롤린 복합체에 있어서, 10 mM 화합물을 소우킹 (soaking) 용액에 첨가하였고; 다른 복합체에 있어서, 1 mM 화합물이 포함되었다. 회절 데이타는 -170℃ 에서 Rigaku RU-3R 제네레이터 및 R-축-IV 검출기를 이용하여 수집하였고, d*TREK 을 이용하여 가공하였다. 상기 결정이 예전에 기재된 구조 (I2 I3 형태에 대한 PDB 코드는 1TJS, 및 P6 3 형태에 대해서는 2TSC) 를 갖는 동형이었으므로, REFMAC (CCP4) 를 이용한 강직체 정련에 의해 정련을 시작하였다. 단백질 모델은 MAKEDIC (CCP4) 을 이용하여 생성된 PROTIN (CCP4) 사전 및 INSIGHT-II (MSI, San Diego) 에 구축된 화합물 모델을 이용하여 조절하였다. 나타낸 해상도 범위 내에서 모든 반사를 이용하여, REFMAC (CCP4) 으로 위치 및 개별 등방성 온도 인자 정련을 수행하였다. 용매 분자를 ARPP (CCP4) 를 이용하여 자동으로 위치시키고, Fo-Fc 차이 맵에서 해석가능한 특징이 남지 않을 때까지 정련을 계속하였다. PDB 접근 번호는 천연, C146-구속 N -토실- D -프롤린, L143C-구속 N -토실- D -프롤린, N -토실- D -프롤린 자유산 소오크 (soak), 글루타메이트- N -토실- D -프롤린 소오크, 및 글루타메이트- N -토실- D -프롤린-β-알라닌 결정 각각에 대해 1F4B, 1F4C, 1F4D, 1F4E, 1F4F 이다.

실시예 6

선택된 N -토실- D -프롤린 화합물을 최적화하고, 구속을 이용하여 일련의 리간드 후보물로서 시험하였다. TS 에 결합된 N -토실- D -프롤린의 결정 구조에 근거하면, 페닐 고리를 벗어난 메틸기가 유도체화 위치로서 이용하기에 전망있는 위치였다. 반응식 1 에는 88 개의 상이한 알데히드 (여기서, R ⁵ 는 비치환 아릴 또는 치환 아릴로부터 선택된다) 및 6 개의 상이한 링커를 사용하여 유도체를 합성하는데 사용된 일반적 방법이 예시되었다.

반응식 1

선택된 리간드 후보물의 비구속 버전의 저해 상수를 결정하였다. 2 개의 최적 화합물은 하기였다:

화합물 2 의 K _i 는 약 55 μM 로 결정되었고, 화합물 3 의 K _i 는 약 40 μM 로 결정되었다.

실시예 7

이 실시예에는 화합물 13 의 합성의 하나의 구현예가 기재된다. 일반적 반응 반응식을 반응식 2 에 나타내었다.

반응식 2

2-(2-아세틸술파닐-아세틸아미노)-숙신산 4-tert-부틸 에스테르 24

아세틸술파닐-아세트산 펜타플루오로페닐 에스테르 (1.6 g, 5.3 mmol) 및 H-Asp(OtBu)-OH (1 g, 5.3 mmol) 를 20 mL 의 건조 디클로로메탄 (DCM) 중에 혼합하였다. 이어서, 1.6 mL 의 트리에틸아민 (11.5 mmol) 을 첨가하고, 반응이 상온에서 3.5 시간 동안 진행하도록 방치하였다. 이어서, 유기층을 3 ×15 mL 의 1M 탄산나트륨으로 추출하고, 합한 수성 분획을 100 mL 의 1M 황산수소나트륨으로 산성화시켜 3 ×30 mL 의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 이어서 합한 유기 분획을 30 mL 의 1M 황산수소나트륨, 30 mL 의 5 M NaCl 로 행구고, 황산나트륨 상에서 건조하고 여과하고 감압 하에 증발시켜, 거의 무색인 시럽으로 1.97 g 의 24 를 얻고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다. MW = 305 (실측치 306, M+1).

3-(2-아세틸술파닐-아세틸아미노)-5-클로로-4-옥소-펜탄산 tert-부틸 에스테르 25

자유산 24 를 10 mL 의 건조 테트라히드로푸란 (THF) 중에 용해시켜 0℃ 로 냉각하고, 0.58 mL 의 N-메틸-모르폴린 (5.3 mmol) 및 0.69 mL 의 이소부틸클로로포르메이트로 처리하였다. 진백색 침전물이 즉시 형성되었고, 30 분 후에 반응물을 글래스 프릿을 통해 여과하고, 부가적인 10 mL 의 THF 와 함께 새 플라스크로 옮겼다. 한편, 1-메틸-3-니트로-1-니트로소구아니딘 (2.3 g, 15.6 mmol) 과 7.4 mL 의 40% 수성 KOH 및 25 mL 의 디에틸 에테르를 45 분 동안 0℃ 에서 반응시켜 디아조메탄을 제조하였다. 이어서 황색 에테르층을 혼합 무수물을 포함하는 반응물 내로 경사분리하고, 165 분의 기간에 걸쳐 상온으로 천천히 가온하면서 반응이 진행하도록 방치하였다. 반응물을 8℃ 로 냉각하고, 디옥산 중 1.5 mL 의 4 N HCl (총 6 mmol) 을 적가하였다. 이로 인해 많은 거품이 생겼고, 황색 용액이 무색화되었다. 점차적으로 상온으로 가온하면서 반응이 진행되도록 2 시간 동안 방치한 후, 1 mL 의 빙초산으로 켄칭하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 75 mL 의 에틸 아세테이트 중에 재용해시켜, 2 ×50 mL 의 포화 중탄산나트륨, 50 mL 의 5 M NaCl 로 헹구고, 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고 증발시켜 건조하여, 90:10 클로로포름:에틸 아세테이트를 사용한 플래시 크로마토그래피로 정제하고, 0.747 g 의 25 를 담황색 오일로 얻었다 (2.2 mmol, 23 으로부터 42%). 예상 MW = 337.7, 실측치 338 (M+1).

2,6-디클로로-벤조산 3-(2-아세틸술파닐-아세틸아미노)-4-tert-부톡시카르보닐-2-옥소-부틸 에스테르 26

클로로메틸케톤 25 (0.25 g, 0.74 mmol) 를 5 mL 의 건조 N,N-디메틸포름아미드 (DMF) 중에 용해시키고, 여기에 0.17 g 의 2,6-디클로로벤조산 (0.89 mmol) 및 0.107 g 의 KF (1.84 mmol) 를 첨가하였다. 반응을 19 시간 동안 상온에서 진행하도록 방치하고, 이 시점에서 75 mL 의 에틸 아세테이트로 희석하고, 2 ×50 mL 의 포화 중탄산나트륨, 50 mL 의 1M 황산수소나트륨, 50 mL 의 5 M NaCl 으로 헹구고, 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고 감압 하에 건조하여, HPLC-MS 에서 약 75% 의 생성물 26 및 25% 의 미반응 25 가 나타나는 황색 시럽을 얻었다. 이를 추가 정제 없이 사용하였다. 예상 MW = 492.37, 실측치 493 (M+1).

2,6-디클로로-벤조산 3-(2-아세틸술파닐-아세틸아미노)-4-카르복시-2-옥소-부틸 에스테르 13

생성물 26 을 10 mL 의 건조 DCM 중에 용해시키고, 0℃ 로 냉각하고, 9 mL 의 트리플루오로아세트산 (TFA) 으로 처리하였다. 이어서, 반응물을 빙조로부터 제거하고, 1 시간 기간에 걸쳐 상온으로 가온되도록 방치하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 DCM 중에 2 회 재용해시키고 증발시켜, 잔여 TFA 를 제거하였다. 조정제 생성물 13 을 역상 고압 액체 크로마토그래피로 정제하여, 백색 흡습성 분말 101.9 mg (0.234 mmol, 25 로부터 32%) 을 얻었다. 예상 MW = 436.37, 실측치 437 (M+1). 이를 디메틸술폭시드 (DMSO) 중에 용해시켜, 50 mM 스톡 용액을 얻었다.

실시예 8

a. 이 실시예에는 카스파아제-3 에 대한 구속 실험에서 사용된 증량제 화합물 32 에 대한 하나의 구현예가 기재된다. 일반적 반응식이 반응식 3 에 기재되었다.

반응식 3

a) 3-메르캅토프로피온산 (4 g, 37.69 mmol) 을 질소 하에 125 mL 의 탈이온화 ("DI") 수중 K ₂ C0 ₃ 의 탈기 용액 (15.63 g, 113 mmol) 에 첨가하였다. 이어서, 상기 용액을 0℃ 로 냉각하고, 무수 아세트산 (3.56 mL, 37.69 mmol) 을 적가하였다. 반응물을 15 분 동안 교반하고, 2 ×50 mL Et ₂ O 로 세척하고, 1M HCl 로 pH 2 로 산성화시켰다. 이어서, 수성층을 3 ×25 mL 에틸 아세테이트 ("EtOAc") 로 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세척하고, 무수 Na ₂ S0 ₄ 상에서건조하고, 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하여 화합물 27 (5.19 g, 35 mmol), 93%, ES (+) MS m/e = 148 (M+H) 을 얻고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.

b) 화합물 27 (2.36 g, 15.94 mmol) 을 50 mL 의 건조 테트라히드로푸란 ("THF") 중에 용해시키고, 피리딘 (1.35 mL, 16.74 mmol), 이어서 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트 (2.71 mL, 15.78 mmol) 를 첨가하였다. 용액을 상온에서 2 시간 동안 교반하였다. THF 를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 75 mL 의 EtOAc 중에 재용해시키고, 2 ×25 mL 1M HCl, 25 mL 포화 NaHCO ₃ , 25 mL 염수로 세척하고, 무수 Na ₂ S0 ₄ 상에서 건조하고, 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하여, 화합물 28 (3.77 g, 12 mmol, 75%), ES (+) MS m/e = 314 (M+H) 를 얻고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.

c) 화합물 28 (3.77 g, 11.99 mmol) 을 H ₂ N-Asp(OtBu)-CO ₂ H (2.27 g, 11.99 mmol) 과 혼합하고 40 mL 의 건조 DCM 중에 현탁하였다. 이어서, 트리에틸아민 (2.9 mL, 20.8 mmol) 을 첨가하고, 용액을 16 시간 동안 교반한 시점에서, 100 mL 의 EtOAc 를 채우고, 2 ×50 mL 1M NaHS0 ₄ 및 50 mL 염수로 헹구고, 무수 Na ₂ S0 ₄ 상에서 건조하고, 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하여 생성물을 얻고, 94:5:1 CHCl ₃ :메탄올:아세트산을 이용한 플래시 크로마토그래피로 정제하여 화합물 29 를 얻었다 (2.62 g, 8.2 mmol, 68% 수율, ES (+) MS m/e = 264 ((M-tBu)+H)).

d) 화합물 29 (2.62 g, 8.2 mmol) 를 25 mL 의 건조 THF 중에 용해시키고, 0℃ 로 냉각하였다. 상기 용액에 N-메틸모르폴린 (1.88 mL, 17.06 mmol), 이어서 이소부틸 클로로포르메이트 (2.15 mL, 16.56 mmol) 를 첨가하였다. 생성 현탁액을 추가 2 시간 동안 교반하며 방치하고 혼합물을 여과하였다. 상기 용액을 에테르성 디아조메탄 용액 내로 0℃ 에서 부었다. 진황색 용액을 하룻밤 동안 실온으로 가온되도록 방치하였다. 질소를 진오렌지색 용액을 통해 30 분 동안 버블링하였다. 용액의 절반을 0℃ 로 냉각하고 4M HCl (3.8 mL, 15 mmol) 을 적가하고, 용액을 0℃ 에서 1 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 50 mL 의 EtOAc 중에 재용해시켰다. 유기층을 2 ×25 mL 포화 NaHCO ₃ , 25 mL 염수로 세척하고, 무수 Na ₂ S0 ₄ 상에서 건조하고 농축하여, 95:5 CHCl ₃ :EtOAc 를 사용한 플래시 크로마토그래피로 정제하고 화합물 30 을 얻었다 (0.198 g, 0.562 mmol, 14%), ES (+) MS m/e = 296 ((M-tBu)+H)).

e) 화합물 30 (50 mg, 0.143 mmol) 을 1 mL 의 건조 디메틸포름아미드 ("DMF") 중에 용해시키고, 2,6-디클로로벤조산 (33 mg, 0.172 mmol) 및 KF (21 mg, 0.358 mmol) 의 혼합물에 첨가하였다. 상기 용액을 상온에서 16 시간 동안 교반한 후, 20 mL EtOAc 로 채우고, 2 ×10 mL 포화 NaHCO ₃ , 10 mL 염수로 헹구고, 무수 Na ₂ S0 ₄ 상에서 건조하고, 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하여, 화합물 31 을 얻었다 (48 mg, 0.0948 mmol, 67%), ES (+) MS m/e = 451 ((M-tBu)+H)).

f) 화합물 31 을 5 mL 디클로로메탄 ("DCM") 중에 용해시키고 0℃ 로 냉각하여, 5 mL 트리플루오로아세트산 ("TFA") 을 첨가하고 용액을 30 분 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 조정제 잔류물을 역상 분취용 HPLC 로 정제하여 화합물 32 를 얻었다 (0.006 g, 0.013 mmol, 14%) ES (+) MS: m/e = 450.29 (M+1).

실시예 9

이 실시예에는 화합물 14 합성의 하나의 구현예가 기재된다. 일반적 반응 반응식을 반응식 4 에 나타내었다.

반응식 4

a) Z-ASP(OtBu)-OH 를 사용하여, 실시예 8 의 화합물 30 과 유사한 화합물 33 을 얻었다. ES (+) MS m/e = 344 ((M-tBu)+H)).

b) 화합물 30 대신 화합물 33 으로 출발한 것을 제외하고는 실시예 8e 의 절차에 따라 화합물 34 를 제조하였다 (88%). ES (+) MS m/e = 454 ((M-tBu)+H)).

c) 화합물 34 (0.5 g, 0.9 mmol) 를 10 mL MeOH 중에 용해시키고 0℃ 로 냉각하였다. 이어서, NaBH ₄ (0.074 g, 1.96 mmol) 를 일부씩 첨가하고, 반응물을 1.5 시간 동안 교반하였다. 반응물에 25 mL 1M HCl 을 채우고, 3 ×10 mL DCM 으로 추출하고, 무수 Na ₂ S0 ₄ 상에서 건조하고, 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하여 화합물 35 를 얻었다 (0.297 g, 0.058 mmol, 60%), ES (+) MS m/e = 456 ((M-tBu)+H)).

d) 화합물 35 (0.297 g, 0.579 mmol) 을 5 mL MeOH 중에 용해시킨 후, 용액에 질소를 살포하고, 습식 Pd/C (10 중량/중량%, Aldrich, 0.123 g) 를 첨가하고, 용액을 수소로 충전한 풍선 하에서 30 분 동안 교반하였다. 이어서 반응물을 셀라이트를 통해 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하여 화합물 36 을 얻었다 (0.188 g, 0.497 mmol, 86%), ES (+) MS m/e = 292 ((M-tBu)+H)).

e) 40 mL CCl ₄ 중 메타-톨루엔술포닐 클로라이드 (6.8 g, 35.67 mmol), N- 브로모숙신이미드 (6.35 g, 35.67 mmol), 및 벤조일 페록시드 (0.670 g, 3.07 mmol) 용액을 2 시간 동안 환류시켰다. 실온으로 냉각한 후, 혼합물을 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하여, 9.5:0.5 헥산:EtOAc 를 사용한 플래시 크로마토그래피로 생성물을 정제하여 화합물 37 을 얻었다 (3.43 g, 12.7 mmol, 36%), ES (+) MS m/e = 213 ((M-)+H)).

f) 화합물 36 (0.188 g, 0.497 mmol) 을 2 mL DCM 중에 용해시키고 디이소프로필에틸아민 (0.173 mL, 0.994 mmol) 을 첨가한 후, 상기 용액을 20 mL DCM 중에 용해된 화합물 37 (0.670 g, 2.49 mmol) 에 첨가하였다. 실온에서 20 분 동안 교반한 후, DCM 을 감압 하에 제거하고 잔류물을 20 mL EtOAc 중에 재용해시키고, 2 ×10 mL 1M NaHS0 ₄ , 10 mL 포화 NaHCO ₃ , 10 mL 염수로 헹구고, 무수 Na ₂ S0 ₄ 상에서 건조하고, 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하여 생성물을 얻고, 4:1 헥산:EtOAc 을 사용하여 플래시 크로마토그래피로 정제하여 화합물 38 을 얻었다 (0.068 g, 0.111 mmol, 22%), ES (+) MS m/e = 555 ((M-tBu)+H)).

g) 화합물 38 (0.068 g, 0.111 g) 을 1 mL DMF 중에 용해시키고, 칼륨 티오아세테이트 (0.013 g, 0.111 mmol) 를 첨가하였다. 반응물을 상온에서 1 시간 동안 교반한 후, 10 mL DCM 으로 채우고, 2 ×5 mL 1M NaHS0 ₄ , 5 mL 포화 NaHCO ₃ , 및 5 mL 염수로 세척하고, 무수 Na ₂ S0 ₄ 상에서 건조하고, 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하여 화합물 39 를 얻었다 (0.044 g, 0.073 mmol, 66%), ES (+) MS m/e = 550 ((M-tBu)+H)).

h) 화합물 39 (0.044 g, 0.073 mmol) 를 2 mL DCM 중에 용해시키고, Dess-Martin 퍼요오디난 (0.046 g, 0.108 mmol) 을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 30 분 동안 교반하고, 반응물을 여과하였다. 5 mL 의 DCM 을 첨가하고, 용액을 0℃ 로 냉각한 후 7 mL TFA 를 첨가하였다. 반응물을 30 분 동안 교반하고 용매를 감압 하에 제거하였다. 조정제 잔류물을 역상 분취용 HPLC 로 정제하여화합물 14 를 산출하였다 (0.005 g, 0.008 mmol, 11%) ES (+) MS: m/e = 548.41 (M+1).

실시예 10

이 실시예에는 카스파아제-3 의 구속에 사용하기 위한 증량제 40 합성의 하나의 구현예가 기재되며, 여기서 티올은 효소의 프라임측 (prime side) 을 향한다. 일반적 반응 반응식을 반응식 5 에 나타내었다.

반응식 5

Cbz-Asp(OtBu)-OH (7.778 g, 24.1 mmol) 를 65 mL THF 중에 용해시키고, 빙수조 내에서 냉각하여, N-메틸-모르폴린 (2.6 mL, 23.6 mmol) 및 이소부틸클로로포르메이트 (3.1 mL, 23.9 mmol) 를 첨가하였다. 반응물을 20 분 동안 얼음 상에서 교반하며 방치하였다. 한편, N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (3.51 g, 36 mmol) 및 탄산칼륨 (7 g, 51 mmol) 을 24 mL THF 및 1 mL 물 중에 현탁하여 상온에서 20 분 동안 강력히 교반한 후, 상기 카르보네이트 용액, 이어서 20 mL THF 내로 직접 여과지를 통해 여과하였다. 40 분 후, 반응물에 200 mL EtOAc 를 채우고, 3 ×75 mL 1 N HCl, 75 mL 포화 탄산수소나트륨, 및 75 mL 염수로 헹구고, 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고 무색 시럽으로 증발시켜, 이를 추가 정제 없이 사용하였다 (9 g, 24.1 mmol, 100%, ES (+) MS m/z = 389 (M+Na)).

아미드 (8.8 g, 24 mmol) 를 건조 THF (100 mL) 중에 용해시키고, -5℃ 로 질소 하 빙염수조 내에서 냉각하고, THF 중 1M 리튬 알루미늄 히드리드 (12 mL, 12 mmol) 를 10 분에 걸쳐 첨가하였다. 반응물을 40 분 동안 얼음 상에서 교반하며 방치한 후, 75 mL 포화 황산수소나트륨 및 250 mL 디에틸 에테르를 첨가하고, 15 분 동안 얼음 상에서 교반하였다. 에테르층을 제거하여 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고 증발시켜 알데히드를 얻고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다 (8.3 g, 24 mmol, 100%, ES (+) MS m/z = 348 (M+Na+H ₂ O)).

알데히드 (8.3 g, 24 mmol) 를 건조 THF (100 mL) 중에 용해시키고, 드라이아이스/아세톤 조 내에서 냉각하고, THF 중 1M 비닐마그네슘 브로마이드 (30 mL, 30 mmol) 를 첨가하였다. 1 시간 후, 또다른 20 mL 의 그리냐드 (Grignard) 를 첨가한 후, 또다른 20 mL 을 2 시간 후에 첨가하였다. 4 시간 후, 반응을 상온으로 가온되도록 방치하고 90 분 동안 진행되도록 놔두어, 그 시점에서 빙수조 내에서 냉각하고, 100 mL 의 포화 황산수소나트륨을 첨가하고, 수성층을 따르고, 유기층을 75 mL 1 N HCl, 75 mL 포화 중탄산나트륨, 및 75 mL 염수로 헹구고, 황산나트륨 상에서 건조하고, 건조하도록 증발시켜, 먼저 80:20 헥산:EtOAc, 이어서 70:30 헥산:EtOAc 로의 플래시 크로마토그래피를 이용한 실리카 겔 상에서 정제하여 생성물 알콜을 얻었다 (2.5 g, 7.45 mmol, 31%, ES (+) MS m/z =358 (M+Na)).

알콜 (2.5 g, 7.45 mmol) 을 건조 DCM (40 mL) 중에 용해시키고, 빙수조 내에서 냉각하고 메타-클로로페록시벤조산 (mCPBA, 10 g, 44.6 mmol) 및 또다른 40 mL 건조 DCM 으로 처리하였다. 반응이 19 시간 동안 진행되도록 방치하고, 이 시점에서 75 mL 포화 중탄산나트륨을 또다른 100 mL DCM 과 함께 첨가하였다. 수성층을 따르고, 유기층을 75 mL 포화 중탄산나트륨, 2 ×100 mL 20% 포화 중탄산나트륨, 75 mL 염수로 헹구고, 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고 건조하도록 증발시켜, 먼저 70:30 헥산:EtOAc, 이어서 50:50 헥산:EtOAc 로의 플래시 크로마토그래피를 이용하여 정제하고 생성물 에폭시드를 얻었다 (0.828 g, 2.36 mmol, 32%, ES (+) MS m/z = 352 (M+H)).

에폭시드 (0.132 g, 0.376 mmol) 를 건조 메탄올 (2 mL) 중에 용해시키고, 여기에 티오요소 (52.3 mg, 0.687 mmol) 및 3 mL 추가 메탄올을 첨가하였다. 이어서, 반응물을 살포하고, 질소 하에서 2 일 동안 유지하였다. 이어서 반응물에 50 mL EtOAc 를 채우고, 2 ×25 mL 1M 황산수소나트륨, 2 ×25 mL 중탄산나트륨, 25 mL 염수로 헹구고, 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고 건조하도록 증발시켜, 먼저 80:20 헥산:EtOAc, 이어서 70:30 헥산:EtOAc 를 이용한 플래시 크로마토그래피로 정제하여 생성물 티란을 얻었다 (35 mg, 0.095 mmol, 25%, ES (+) MS m/z = 390 (M+Na)).

티란 (35 mg, 0.095 mmol) 을 건조 DCM (0.5 mL) 중에 용해시키고 Dess-Martin 퍼요오디난 (43.3 mg, 0.102 mmol), 이어서 또다른 0.5 mL 건조 DCM 을 첨가하였다. 30 분 후, 반응물을 7 mL DCM 으로 희석하고, 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과하고, 80:20 헥산:EtOAc 으로 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물을 얻었다 (17 mg, 0.047 mmol, 49%, ES (+) MS m/z = 388 (M+Na)).

티란 (17 mg, 0.047 mmol) 을 건조 DCM (5 mL) 중에 용해시키고, 빙수조 중에서 냉각하고, 5 mL 트리플루오로아세트산으로 처리하였다. 반응을 40 분 동안 얼음 상에서 진행되도록 방치하고, 이 시점에서 건조하도록 증발시키고 역상 HPLC 를 이용하여 정제하여, 백색 고체로서 화합물 40 을 얻었다 (1.8 mg, 0.0058 mmol, 13%, ES (+) MS m/z = 332 (M+Na)). 상기 물질은 DMSO 중에서는 불안정하지만, -20℃ 에서 유지되는 메탄올 중 용액으로서 여러달 동안 안정하였다. 카스파아제의 활성 부위 티올로의 상기 증량제의 콘쥬게이션 반응이 효소에 대해 낮은 화학양론 (1-3 동등량) 으로 pH 6 에서 2-5 분 동안만 수행되는 것이 일반적으로 바람직하였다.

실시예 11

이 실시예에는 증량제 13 으로의 카스파아제-3 의 개질이 기재된다. 카스파아제-3 을 클로닝하고 과발현시켜, 표준 기법을 이용하여 정제하였다. 2 mL 의 0.2 mg/ mL 용액에 10 ㎕ 의 50 mM 화합물 13 을 첨가하고, 반응이 상온에서 3.5 시간 동안 진행되도록 방치하여, 이 시점에서 질량-분광측정으로 카스파아제 3 의 큰 서브유닛이 완전 개질되었음을 확인하였다 (MW 16861, 계산치 16860).PBS 완충액 중에 완충된 0.2 mL 의 0.5 M 히드록실아민을 첨가하여 티오에스테르를 탈보호하고 반응이 18 시간 동안 진행되도록 방치하여, 이 시점에서 큰 서브유닛의 질량은 16819 였다 (16818 으로 계산됨). 단백질을 Ultrafree 5 MWCO 단위 중에서 농축하고, Nap-5 칼럼을 이용하여 완충액을 0.1M TES pH 7.5 로 교환하였다.

실시예 12

행잉 드롭 (hanging drop) 증기 확산 방법을 이용하여, 카스파아제-3 의 결정을 20℃ 에서 성장시켰다. 동일 부피의 단백질 용액 (10 mM 트리스 pH 8.5 중 5-10 mg/ mL 의 사전 개질 단백질) 을 100 mM 시트르산나트륨, pH 5.9, 4% 글리세롤, 10-20% PEG6000 및 10 mM DTT 를 포함하는 저장기 용액과 혼합하였다. 작은 사방정계 (rhombic) 플레이트는 보통 1 내지 2 주 후에 나타났다. 이들은 2 달 후에 대략 200 ×200 ×20 ㎛ 인 이들의 최대 크기에 도달하였다. 데이타 수집 전에, 결정을 잠시 25% 글리세롤을 포함하는 저장기 용액 중에 침지시킨 후 액체 질소 중에 급속 냉동하였다.

2 개의 구속 화합물에 대한 회절 데이타는 Rigaku (Tokyo) RU-3R 제네레이터, R-축-IV 검출기를 이용하여 100K 에서 수집되어 D*Trek 을 이용하여 가공되었다. 구조는 단백질 데이타 뱅크 (Protein Data Bank) 엔트리 1CP3 의 배위를 이용하여 프로그램 AmoRe (Navaza, J., Acta Crystallogr. Sect. A, A50: 157-163 (1994)) 에서 실시된 바와 같은 분자 교환으로 해석하였다. 화합물 모델은 Pymol (DeLano, WL, World Wide Web URL: http://www.pymol.org) 에서 구축되었고, 모델은 프로그램 O (Jones, TA, 등, Acta Cryst., A47: 110-119 (1991)) 를이용하여 조정되고 프로그램 Refmac (CCP4) 을 이용하여 정련되었다.

실시예 13

이 실시예에는 화합물 50 의 합성의 하나의 구현예가 기재된다. 일반적 반응 반응식을 반응식 6 에 나타내었다.

반응식 6

a) 3-(클로로술포닐) 벤조산 (10.38 g, 47.04 mmol) 을 500 mL DI 수중의 탄산나트륨 (14.05 g, 133 mmol) 및 H-ASP(OtBu)-OMe (10.25 g, 42.76 mmol) 와 혼합하고, 반응물을 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 용액을 여과한 후, 1M NaHS0 ₄ 로 pH 2 로 산성화시켰다. 수용액을 3 ×300 mL EtOAc 로 추출하였다. 이어서, 합한 유기층을 250 mL 염수로 세척하고, 무수 Na ₂ S0 ₄ 상에서 건조하고, 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하여 화합물 41 을 얻고 (7.07 g, 18.25 mmol,39%), ES (+) MS m/e = 331 ((M-tBu)+H)), 이를 추가 정제 없이 사용하였다.

b) 화합물 41 (7.07 g, 18.25 mmol) 을 질소 대기 하에 90 mL 건조 THF 중에서 현탁하고 0℃ 로 냉각하였다. 이소부틸 클로로포르메이트 (2.49 mL, 19.16 mmol), 이어서 N-메틸모르폴린 (2.21 mL, 20 mmol) 을 주사기를 통해 첨가하였다. 반응물을 0℃ 에서 30 분 동안 교반한 후, 182 mL THF 및 63 mL MeOH 중 나트륨 보로히드리드 (2.4 g, 63.88 mmol) 의 -78℃ 용액 내로 부었다. 반응물을 2 시간 동안 -78℃ 에서 교반한 후, 대부분의 THF 를 감압 하에 제거하였다. 잔류물에 200 mL EtOAc 를 채우고, 2 ×75 mL 1M NaHS0 ₄ , 75 mL 포화 NaHC0 ₃ , 및 75 mL 염수로 헹구고, 무수 Na ₂ SO ₄ 상에서 건조하고 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하여 화합물 42 (6.80 g, 18.21 mmol, 100%), ES (+) MS m/e = 317 ((M-tBu)+H)) 를 백색 고체로 얻고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.

c) 화합물 42 (6.80 g, 18.21 mmol) 를 질소 대기 하에 100 mL 건조 DCM 중에 용해시키고 0℃ 로 냉각하였다. 트리에틸아민 (5.34 mL, 38.33 mmol) 을 첨가한 후, 메탄술포닐 클로라이드 (1.55 mL, 20.08 mmol) 를 적가하였다. 반응물을 0℃ 에서 1 시간 동안 교반한 후, 2 ×35 mL 1M NaHS0 ₄ , 40 mL 염수로 헹구고, 무수 Na ₂ S0 ₄ 상에서 건조하고, 여과하여, 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔류물을 3:2 헥산:EtOAc 를 이용한 플래시 크로마토그래피로 정제하여 화합물 43 을 얻었다 (6.69 g, 14.82 mmol, 83%), ES (+) MS m/e = 395 ((M-tBu)+H)).

d) 하기에 나타낸 바와 같이, 화합물 42 대신 Fmoc-β-알라니놀 (5.14 g,17.29 mmol) 로부터 출발하는 것을 제외하고 실시예 13c 의 방법에 따라 화합물 A 를 제조하였다 (93%).

ES (+) MS m/e = 375 (M+1). 이를 추가 정제 없이 사용하였다.

e) 하기에 나타낸 바와 같이, 화합물 38 대신 화합물 A 로부터 출발하는 것을 제외하고 실시예 9g 의 방법에 따라 화합물 B 를 제조하였다 (91%).

ES (+) MS m/e = 355 (M+1). 이를 추가 정제 없이 사용하였다.

f) 화합물 B (5.12 g, 14.4 mmol) 를 10 mL DCM 중에 용해시키고 50 mL MeOH 를 첨가하였다. 15 분 동안 용액을 통해 질소를 버블링한 후, 히드록실아민 (수중 50%, 4.42 mL, 72 mmol), 이어서 TCEP (4.13 g, 14.4 mmol) 를 첨가하고, 반응물을 질소 대기 하에 4 시간 동안 교반하였다. 이어서, 용매를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 100 mL EtOAc 중에 재용해시키고, 50 mL 포화 NaHCO ₃ , 및 50 mL 염수로 세척하고, 무수 Na ₂ S0 ₄ 상에서 건조하고, 여과하였다. 용매를 감압 하에 제거하고 잔류물을 4:1 헥산:EtOAc 를 이용한 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 44 를 얻었다 (3.32 g, 10.6 mmol, 74%), ES (+) MS m/e = 313 (M+1).

g) 화합물 43 (2.29 g, 5.07 mmol) 을 25 mL DMF 중에 용해시키고, 요오드화칼륨 (1.68 g, 10.15 mmol) 을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15 분 동안 교반하였다. 화합물 44 (1.59 g, 5.07 mmol), 이어서 중탄산나트륨 (0.426 g, 5.07 mmol) 을 첨가하였다. 반응물을 질소로 퍼징하고, 상온에서 20 시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물에 100 mL EtOAc 를 채우고, 2 ×50 mL 1M NaHS0 ₄ , 50 mL 포화 NaHCO ₃ , 및 50 mL 염수로 헹구고, 무수 Na ₂ S0 ₄ 상에서 건조하고, 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하여 생성물을 얻고, 이를 MeOH 중 CHCl ₃ :2M NH ₃ 95:5 를 이용한 플래시 크로마토그래피로 정제하여 화합물 45 를 얻었다 (1.38 g, 2.06 mmol, 41% 수율), ES (+) MS m/e = 612 ((M-tBu)+H)).

h) 화합물 45 (1.38 g, 2.06 mmol) 를 10 mL DCM 중에 용해시켰다. 이어서, 10 mL 디에틸아민을 첨가하였다. 반응물을 상온에서 16 시간 동안 교반하고, 용매를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 MeOH 중 CHCl ₃ :2M NH ₃ 95:5 를 이용한 플래시 크로마토그래피로 정제하여 화합물 46 을 얻었다 (0.723 g, 1.62 mmol, 79% 수율), ES (+) MS m/e = 390 ((M-tBu)+H)).

i) 화합물 27 대신 5-(메탄술포닐)티오펜-2-카르복실산으로부터 출발하는 것을 제외하고 실시예 8b 의 방법에 따라 화합물 47 를 제조하였다 (97%). ES (+) MS m/e = 372 (M+H).

j) 화합물 46 (0.320 g, 0.717 mmol) 을 5 mL DCM 중에 용해시키고, 화합물47 (0.401 g, 1.08 mmol), 이어서 DIEA (0.249 mL, 1.43 mmol) 를 첨가하였다. 반응물을 16 시간 동안 상온에서 교반하고, 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔류물을 20 mL EtOAc 중에 재용해시키고, 2 ×5 mL 1M NaHS0 ₄ , 5 mL 염수로 세척하고, 무수 Na ₂ S0 ₄ 상에서 건조하고, 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하여 생성물을 얻고, 이를 DCM:EtOAc 4:1 을 이용한 플래시 크로마토그래피로 정제하여 화합물 48 을 얻었다 (0.126 g, 0.198 mmol, 28% 수율), ES (+) MS m/e = 578 ((M-tBu)+H)).

k) 화합물 48 (0.062 g, 0.098 mmol) 을 0.5 mL 건조 THF 중에 용해시켰다. 상기 용액에 1 mL 에틸 에테르 중 리튬 보로히드리드 (0.003 g, 0.121 mmol) 를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 45 분 동안 교반한 후 10 mL EtOAc 를 채우고, 5 mL 포화 NaHCO ₃ , 및 5 mL 염수로 헹구고, 무수 Na ₂ S0 ₄ 상에서 건조하고, 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하여 화합물 49 를 얻었다 (0.058 g, 0.096 mmol, 98%), ES (+) MS m/e = 550 ((M-tBu)+H)).

l) 화합물 49 (0.058 g, 0.098 mmol) 를 1 mL DMSO 중에 용해시키고 IBX 를 첨가하였다 (0.082 g, 0.294 mmol). 반응물을 상온에서 5 시간 동안 교반한 후 10 mL EtOAc 를 채우고, 5 mL 포화 NaHCO ₃ , 및 5 mL 염수로 헹구고, 무수 Na ₂ S0 ₄ 상에서 건조하고, 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하여 황색 고체를 얻은 후, 이를 5 mL DCM 중에 용해시키고 0℃ 로 냉각하였다. 5 mL 의 TFA 를 첨가하고, 반응물을 30 분 동안 교반하였다. 감압 하에 용매를 제거한 후, 조정제 잔류물을 역상 분취용 HPLC 로 정제하여 화합물 50 을 산출하였다 (0.009 g, 0.016 mmol,17%) ES (+) MS: m/e = 548.68 (M+1).

실시예 14

이 실시예에는 하기 나타내는 화합물 51 의 합성의 하나의 구현예가 기재된다.

파라-톨루엔술포닐 클로라이드를 메타-톨루엔술포닐 클로라이드 대신에 치환한 것을 제외하고는 실시예 9a-h 의 절차에 따라 화합물 51 을 제조하였다. ES (+) MS: m/e = 548.41 (M+1).

실시예 15

이 실시예에는 화합물 54 의 합성의 하나의 구현예가 기재된다. 일반적 반응 반응식을 반응식 7 에 나타내었다.

반응식 7

a) 화합물 48 (0.063 g, 0.099 mmol) 을 5 mL MeOH 중에 용해시키고, 과산화수소 (0.026 mL, 0.297 mmol, 수중 30%) 를 첨가하였다. 반응물을 16 시간 동안 50℃ 로 가열하고, 용매를 감압 하에 제거하여 화합물 52 를 얻었다 (0.063 g, 0.097 mmol, 98%), ES (+) MS m/e = 594 ((M-tBu)+H)).

b) 화합물 52 를 화합물 48 대신에 치환한 것을 제외하고는 실시예 13k 의 절차에 따라 화합물 53 을 제조하였다, ES (+) MS m/e = 566 ((M-tBu)+H)).

c) 화합물 53 을 화합물 39 대신에 치환한 것을 제외하고는 실시예 9h 의 절차에 따라 화합물 54 를 제조하였다 (0.005 g, 0.009 mmol, 11%), ES (+) MS m/e = 564.68 (M+1).

실시예 16

이 실시예에는 화합물 56 의 합성의 하나의 구현예가 기재된다. 일반적반응 반응식을 반응식 8 에 나타내었다.

반응식 8

a) 화합물 48 (0.150 g, 0.236 mmol) 을 5 mL MeOH 중에 용해시키고, 아세트산 (5 mL), 이어서 과산화수소 (0.77 mL, 10 mmol, 수중 35%) 를 첨가하였다. 반응물을 16 시간 동안 80℃ 로 가열하고, 용매를 감압 하에 제거하여 화합물 55 를 얻었다 (0.157 g, 0.236 mmol, 100%), ES (+) MS m/e = 610 ((M-tBu)+H)).

b) 화합물 55 로 출발한 것을 제외하고는 실시예 13k, 이어서 실시예 9h 의 절차에 따라 화합물 56 을 제조하였다 (0.005 g, 0.0086 mmol, 36%), ES (+) MS m/e = 580 (M+1).

실시예 17

이 실시예에는 하기 나타내는 화합물 57 의 합성의 하나의 구현예가 기재된다.

4-(메틸술포닐)벤조산을 5-(메탄술포닐)티오펜-2-카르복실산 대신에 치환한 것을 제외하고는 실시예 13a-l 의 절차에 따라 화합물 57 을 제조하였다. ES (+) MS: m/e = 543 (M+1).

실시예 18

이 실시예에는 하기 나타내는 화합물 58 의 합성의 하나의 구현예가 기재된다.

4-(메틸술포닐)벤조산을 5-(메탄술포닐)티오펜-2-카르복실산 대신에 치환한 후 실시예 15a-c 의 절차를 따른 것을 제외하고는 실시예 13a-j 의 절차에 따라 화합물 58 을 제조하였다. ES (+) MS: m/e = 559 (M+1).

실시예 19

이 실시예에는 하기 나타내는 화합물 59 의 합성의 하나의 구현예가 기재된다.

45-클로로-6-히드록시니코틴산을 5-(메탄술포닐)티오펜-2-카르복실산 대신에치환한 후 실시예 16a-b 의 절차를 따른 것을 제외하고는 실시예 13a-j 의 절차에 따라 화합물 59 를 제조하였다. ES (+) MS: m/e = 548 (M+1).

실시예 20

이 실시예에는 하기 나타내는 화합물 60 의 합성의 하나의 구현예가 기재된다.

벤조티아졸-6-카르복실산을 5-(메탄술포닐)티오펜-2-카르복실산 대신에 치환한 것을 제외하고는 실시예 13a-l 의 절차에 따라 화합물 60 을 제조하였다. ES (+) MS: m/e = 522 (M+1).

실시예 21

이 실시예에는 하기 나타내는 화합물 61 의 합성의 하나의 구현예가 기재된다.

벤조티아졸-6-카르복실산을 5-(메탄술포닐)티오펜-2-카르복실산 대신에 치환하고 실시예 15a-c 의 절차를 따른 것을 제외하고는 실시예 13a-j 의 절차에 따라화합물 61 을 제조하였다. ES (+) MS: m/e = 538 (M+1).

명세서를 통해 언급된 모든 참고문헌은 본원에 명백히 참고문헌으로 도입된다. 본 발명은 이들의 특정 구현예를 참고하여 기재되었지만, 당업자는 본 발명의 실제 요지 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변화가 얻어질 수 있고 동등물로 대체될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 특정한 상황, 물질, 해당 조성물, 공정 등에 적응되어 여러 변형이 얻어질 수 있다. 모든 상기 변형은 본원에 첨부된 청구범위의 범위 내에 속한다.