可编程的阵列 |
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| 申请号 | CN201280052452.3 | 申请日 | 2012-10-24 | 公开(公告)号 | CN103945930B | 公开(公告)日 | 2016-10-05 |
| 申请人 | 亚利桑那董事会; 代表亚利桑那州立大学行事的亚利桑那州法人团体; 工程艺术有限责任公司; | 发明人 | P·维克托; J·拉拜尔; P·卡恩; B·塔库拉帕立; J·丘; A·波恩内尔; M·马吉; | ||||
| 摘要 | 描述了 基板 上的 生物 分子阵列，所述阵列在多个离散的、分离的 位置 上包含多个生物分子例如编码核酸和/或分离的多肽。阵列可在例如高通量基因组学和蛋白组学中用于特殊用途，包括但不限于用于早期检测的 分子诊断 剂、诊断、 治疗 、 预后 、监控临床反应和 蛋白质 晶体学。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种生物分子阵列，其包含 |
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| 说明书全文 | 可编程的阵列[0001] 交叉参考 [0004] 本发明是在由国立卫生研究院授予的基金号R42RR031446下由政府资助进行的。政府具有本发明的某些权利。 [0005] 背景 [0006] 微阵列已通过使得能够在单个显微镜载玻片的尺寸内同时进行数以千计的实验而使分子生物学发生了变革。最初微阵列由数千个短的核苷酸聚合物(直接合成在微阵列表面上的或预先合成，随后点在表面上)的点组成。这些“寡核苷酸”微阵列通常用于检测对应于基因表达的mRNA。微阵列领域现已扩展至包括各种不同类型的生物学分子(生物分子)例如肽、siRNA、microRNA、抗体或蛋白质的阵列。然而，许多这些新出现的微阵列作为研究或临床诊断工具仍未达到它们的完全潜能，因为它们比寡核苷酸微阵列更难以制造。例如，目前蛋白质微阵列通常通过表达和纯化数千种蛋白质，随后将其贮存直至使用针式点样仪(pin-spotter)(一种具有许多固有逻辑问题的工艺流程)打印它们来制造。此外，许多蛋白质是不稳定的，因此必须将所有这些步骤维持在低温下。核酸可编程性蛋白阵列(NAPPA)是避开这些问题的良好建立的方法。其包括首先打印DNA微阵列，随后转录DNA并且将其直接翻译为微阵列表面上的蛋白质。这具有许多有利方面，因为DNA阵列即使在常温下亦相对稳定，并且通常在临进行实验之前表达蛋白质，这样它们保持功能性。目前NAPPA阵列密度限定于每个阵列数千种蛋白质。存在许多对经济地制造更高密度的蛋白质微阵列和其它类型的微阵列的迫切需要。 [0007] 发明概述 [0008] 在第一方面，本发明提供了生物分子阵列，包括：(a)第一基板；和(b)包括至少10种分离的编码核酸和/或至少10种分离的多肽的生物分子，其中每一种核酸和/或多肽被物理地限制在第一基板上的离散位置上，并且其中每一种核酸能够在基板上的其离散位置上表达其编码的产物，和/或其中每一种多肽能够在基板上的其离散位置上原位具有特征活性；其中离散位置在第一基板上彼此间隔约20nm至约1mm的中心间距。 [0009] 在第二方面，本发明提供了阵列，所述阵列包含(a)含硅基板，其具有在离散位置处包含多个纳米孔的表面，其中离散位置在含硅基板上彼此间隔约20nm至约1mm的中心间距；和(b)位于每一个离散位置上的能够捕获另一种分子的生物分子。在一个实施方案中，含硅基板是二氧化硅或硅基板，例如玻璃或硅晶片。 [0010] 在这些方面的任一方面的一个实施方案中，离散位置在第一基板上彼此间隔约20nm至约100μm的中心间距。在另一个实施方案中，每一个物理地限定的离散位置包含孔。 在其它实施方案中，每一个孔具有约14nm至约0.75mm的直径。在另一个实施方案中，孔以每平方厘米约2500亿个孔至每平方厘米约100个孔的密度存在于第一基板上。在其它实施方案中，功能化离散位置。在另一个实施方案中，每一个离散位置还包含用于表达编码的核酸产物和/或用于测试多肽活性的试剂。在其它实施方案中，每一个离散位置还包含用于表达编码的核酸产物和/或用于测试多肽活性的试剂的试剂，其中这些试剂与核酸或多肽分开地添加至阵列。在一个实施方案中，试剂包括网织红细胞裂解物。在其它实施方案中，生物分子包括至少10种分离的编码核酸。在另一个实施方案中，生物分子包括至少10种分离的多肽。在其它实施方案中，核酸和/或多肽结合至基板。 [0011] 在这些方面的任一方面的另一个实施方案中，(i)阵列还包含适合于与第一基板匹配的捕获基板，其中将捕获基板功能化以捕获和分离表达产物；或(ii)进一步功能化离散位置以捕获和分离表达产物。 [0012] 在这些方面的任一方面的另一个实施方案中，生物分子包括抗原或抗体等。在其它实施方案中，生物分子通过针对能够与基板表面结合或缔合的官能团的二价连接基团连接于第一基板的表面。 [0013] 在第三方面，本发明提供了用于原位核酸表达的方法，包括(a)将本发明的任何实施方案或实施方案的组合的阵列的每一个离散位置与用于核酸表达的试剂接触，以形成混合物；和(b)在适合于核酸表达的条件下温育混合物。 [0014] 在第四方面，本发明提供了用于表达和捕获产物的方法，包括(a)将核酸阵列与用于核酸表达的试剂接触以形成混合物，其中核酸阵列包含第一基板和至少10种物理地限定在第一基板上的离散位置上的分离的编码核酸，并且其中每一种核酸能够在第一基板上的其离散位置上原位表达其编码的产物；(b)任选地，使第一基板与捕获基板靠近；(c)在适合于产生核酸表达产物的条件下温育混合物；和(d)捕获和分离第一基板上的表达产物或，当存在捕获基板时，捕获和分离捕获基板上的表达产物。在一个实施方案中，捕获基板包括第二基板，所述第二基板包含多个匹配第一基板上的物理地限定的离散位置的物理地限定的离散位置。在另一个实施方案中，方法包括用结合对的第一成员预涂覆第一基板或捕获基板(当存在时)，其中表达产物包括结合对的第二成员，并且其中在适合于结合对的第一成员与第二成员的结合的条件下进行温育，从而导致表达产物在预涂覆的基板上的捕获。在其它实施方案中，方法包括用结合对的第一成员预涂覆第一基板或捕获基板。在其它实施方案中，将捕获基板与第一基板接触以形成密封。在另一个实施方案中，每一个离散位置包含孔。在其它实施方案中，核酸表达包括RNA表达和/或蛋白质表达。在另一个实施方案中，试剂包含体外表达系统。在其它实施方案中，方法包括修饰捕获基板上的多肽捕获物。在其它实施方案中，方法还包括稳定化捕获基板上的捕获的多肽以保持蛋白质功能性，例如通过冷冻捕获基板上的捕获的多肽。附图说明 [0015] 图1显示示例性阵列基板的侧切面图和用于制备和使用所述阵列基板的示例性流程。 [0016] 图2示例了用于充注和密封基板上的纳米孔以进行产物表达的方法。 [0017] 图3显示图2的具有密封罩的基板。 [0018] 图4示例了用于充注本文中描述的基板上的纳米孔的示例性方法。 [0019] 图5显示了玻璃上的对照实验的两个单独的结果，将4滴DNA和试剂分配在中央点中，使用网织红细胞裂解物从DNA产生蛋白质，并且利用荧光标记的抗体标记蛋白质。 [0020] 图6显示了与图5相同的实验，其使用硅纳米孔而非玻璃，将4滴DNA和试剂分配在中央孔中，以及将网织红细胞裂解物密封在每一个纳米孔中。 [0021] 图7显示了与图6相同的实验，将8滴DNA和试剂分配在中央孔中。 [0022] 图8显示了与图6相同的实验，将16滴DNA和试剂分配在中央孔中。 [0023] 图9显示了与图6相同的实验，将32滴DNA和试剂分配在中央孔中。 [0024] 图10显示了与图9相同的实验，网织红细胞裂解物不密封在每一个孔中。 [0025] 图11示例了用于在微毛细管阵列中表达产物的示例性流程。 [0026] 图12示例了用于检测微毛细管内和表面上的荧光分子的存在的示例性方案。 [0027] 图13是按照图12中示例的方法产生的图像。 [0028] 图14是按照图12中示例的方法产生的图像。 [0029] 图15示例了用于通过如下步骤从DNA阵列产生蛋白质的方法：首先将DNA阵列打印在表面上，用网织红细胞裂解物充注微毛细管阵列，将微毛细管的阵列与DNA阵列对齐，将微毛细管的阵列与DNA阵列接触，密封微毛细管的阵列，随后温育组装体以从DNA产生蛋白质。 [0030] 图16示例了使用包含纳米孔的基板将表达产物捕获在第二(捕获)表面的示例性方法。 [0031] 图17示例了使用包含微毛细管的基板将表达产物捕获在第二(捕获)表面上的示例性方法。 [0032] 图18示例了用于从包含微毛细管的基板释放捕获的表达产物的示例性方法。 [0033] 图19是图18的继续，显示了用于制备释放的表达产物的阵列或捕获溶液的方法。 [0034] 图20是图18的继续，显示了使用释放的表达产物的示例性诊断方法。 [0035] 图21是图18的继续，显示了使用释放的表达产物的其它示例性诊断方法。 [0036] 图22图21的继续，显示了使用释放的表达产物的示例性诊断方法。 [0037] 图23示例了用于在与产物表达相同的纳米微孔内捕获表达产物的示例性方法。 [0038] 图24示例了用于高阵列密度的NAPPA的载玻片上的扩散。(a)在玻璃上进行的NAPPA的方案，阵列间距小于400微米。原位表达的蛋白质在裂解物混合物中扩散并且在相邻位置交叉结合。如左边打印布局方案中显示的，对于(b)和(c)，仅中央点用DNA+打印混合物打印，而周围的点仅用由抗-GST捕获抗体(无DNA)组成的打印混合物打印。(b)具有750微米的部件周期的载玻片上的NAPPA，未显示可观察的扩散。(c)具有375微米的部件周期的载玻片上的NAPPA，显示可见的扩散。 [0039] 图25(a)硅纳米孔中的NAPPA的方案；将NAPPA样品压电分配在孔中，随后用裂解物充注所述小孔，用支撑在玻璃调合板上的柔性垫膜压封。蛋白质表达和随后通过基板结合的抗体进行的捕获在限制于纳升的体积中进行，从而导致无扩散高密度蛋白质阵列；(b)硅纳米孔的制造方法；表面功能化，打印和NAPPA表达；(c)具有375微米间距的纳米孔的横断面SEM图像；(d)Engineering Arts au3028-head压电打印机，即时分配入硅纳米孔；(e)内部开发来用IVTT裂解物有效地充注硅纳米孔的真空辅助充注器的方案。将硅纳米孔载玻片置于垫剪切块中并夹在两个框架之间。当夹紧装配体时，在载玻片上方形成薄的微流室，从而使得能够流注和密封蛋白质；(f)显示密封的充注有裂解物的纳米孔的图。 [0040] 图26示例了密封的纳米孔中的受限的蛋白质表达。(a)将16个不同的基因打印至7x7纳米孔阵列(375μm的周期)中的间隔的孔中的方案；(b)打印的DNA的Pico-绿染色；右边-显示针对x和y坐标作图的强度的信号的3D轮廓；(c)使用抗GST抗体检测的未密封的纳米孔中的表达。表达的蛋白质局部扩散至相邻孔中并且被物理吸附，从而在所有孔中显示强信号；(d)使用抗GST抗体检测的密封的纳米孔中的表达。之间的空孔未显示任何信号，表明蛋白质未从密封的孔扩散。显示于右边的蛋白质的3D轮廓明确地显示密封纳米孔中无扩散信号。(关于cDNA打印细节，参考支持信息)。 [0041] 图27单一载玻片上接近24,000种蛋白质的极高密度蛋白质阵列的示范。通过使用不同的硅湿蚀刻化学以圆孔和方孔几何形状产生225微米周期的纳米孔阵列。在两种情况下，将对照打印混合物点(无cDNA)以+模式打印在围绕中央表达点的周围。包含抗体的对照打印混合物点和周围的空点都未显示显著的蛋白质扩散信号。(a)225微米的周期的圆硅孔的顶视和横断面的扫描电子显微镜(SEM)图像；插图显示光学显微镜图像；(b)225微米的周期的圆纳米孔阵列中打印布局的方案；(c)显示无显著扩散本底的来自中央cDNA点的高密度的对应蛋白质阵列展示；(d)方形纳米孔阵列的顶视和横断面的SEM和光学显微镜的图像；(e)225微米的周期的方形纳米孔阵列中的打印布局的方案；(f)来自cDNA打印的纳米孔的表达的蛋白质经显示具有强信号(方形)，而打印混合物打印的孔在孔的锐边上显示信号(并且空孔未显示可辨别的信号)。来自方形边缘的信号被认为是因蛋白质和染料在方孔锐边优先聚集而产生的。 [0042] 发明详述 [0043] 将所有引用的参考资料通过引用整体并入本文。在本申请中，除非另有所指，否则使用的技术可见于若干公知的参考资料例如：Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook,等人,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press),Gene Expression Technology(Methods in Enzymology,第185卷,由D.Goeddel编辑,1991.Academic Press,San Diego,CA),“Guide to Protein Purification”in Methods in Enzymology (M.P.Deutshcer,ed.,(1990)Academic Press,Inc.)；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Innis,等人1990.Academic Press,San Diego,CA),Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,第2版.(R.I.Freshney.1987.Liss, Inc.New York,NY),Gene Transfer and Expression Protocols,pp.109-128, ed.E.J.Murray,The Humana Press Inc.,Clifton,N.J.),和Ambion1998Catalog(Ambion,Austin,TX)的任一参考资料中。 [0044] 除非上下文明确地另有所指，否则可将本文中公开的实施方案与其它实施方案组合。 [0045] 除非上下文明确地另有所指，否则在整个说明书和权利要求中，单词”包括"、"包含"等应以包含在内的意义(与排除在外的意义或穷尽的意义相反)来进行解释；也就是说，以“包括，但不限于”的意义。使用单数或复数的单词分别包括复数或单数。此外，单词"在本文中"、"在上文中"和"在下文中"及相似意义的单词，当在本申请中使用时，应指作为整体的本申请而不是指本申请的任何特定部分。如本文中所用，除非上下文另有所指，否则单数形式"一个/一种(a)"、"一个/一种(an)"和"所指物(the)"包括复数所指物。如本文中所用，除非明确地另有所指，否则“和”可与“或”互换使用。 [0046] 如本文中所用，术语“约”意指在引述极限的5％内。 [0047] 本公开内容的实施方案的描述无意是穷尽的或将本公开内容限定于公开的精确形式。虽然本公开内容的特定实施方案和实施例是为了举例说明的目的而在本文中进行描述的，但各种等同的变动在本公开内容的范围内是可能的，如本领域技术人员将认识到的。例如，虽然方法步骤或功能以给定的序列给出，但替代实施方案可以不同的顺序进行功能，或可大体上同时进行功能。本文中提供的本公开内容的教导适当时可用于其它过程或方法。可组合本文中描述的各种实施方案来提供其它实施方案。 [0048] 在一个方面，本公开内容提供了生物分子阵列，其包含(a)第一基板；和(b)包括至少10种分离的编码核酸和/或至少10种分离的多肽的生物分子，其中每一种核酸和/或多肽物理地限定在第一基板上的离散位置，并且其中每一种核酸能够在基板上的其离散位置上原位表达其编码的产物，和/或其中每一种多肽能够在基板上的其离散位置上原位具有特征活性；其中离散位置在第一基板上彼此间隔约20nm至约1mm的中心间距。 [0050] 本阵列的生物分子可以是核酸或多肽，当与适当的试剂(酶、缓冲剂、盐、核苷酸、氨基酸、核糖体等)温育时其能够产生表达产物，或能够在基板上测试比活性。 [0051] 当生物分子是多肽时，这样的多肽可包括全长蛋白质、蛋白质片段以及天然存在的肽和合成肽或由上述物质组成。为了给定的目的，多肽可根据需要包含非天然存在的氨基酸和其它修饰。 [0052] 当生物分子是核酸时，核酸可以是RNA或DNA。(例如，单链DNA，或双链DNA)。在优选实施方案中，核酸包括质粒或病毒DNA或其片段；扩增产物(例如通过RCA、PCR、NASBA产生的产物)；或合成DNA。核酸还可包含下列的一种或多种：转录启动子、转录调控序列、非翻译前导序列、编码切割位点的序列、重组位点、3’非翻译序列、转录终止子、编码表位标签的序列和内部核糖体进入位点。在另一个实施方案中，核酸还包含编码报道蛋白(例如丰度可被定量并可提供表达产物的量的指示的蛋白质)的序列。可将报道蛋白连接(例如共价连接，例如作为翻译融合物连接)至核酸表达产物。报道蛋白可以是酶，例如，β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、β-葡糖醛酸糖苷酶等。报道蛋白可产生或调节光，例如，荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白、其变体、红色荧光蛋白、其变体等)和萤光素酶。转录启动子可以是原核生物启动子、真核生物启动子或病毒启动子。调控元件例如转录启动子可在核酸间在多个不同位置上变化。例如，不同的启动子可用于改变在不同的位置产生的多肽的量。 [0053] 生物分子可结合至基板，或可不结合。用于将生物分子结合至基板的方法在本领域是公知的，如下文中描述的。根据任意给定的目的所需，每一个离散位置上的生物分子可以全部相同，或可在每一个位置上不同。根据给定的目的所需，表达产物可在每一个位置上相同，可在每一个位置上不同，或以任何其它排列存在。 [0054] 如本文中所用，术语“基板”是指任何类型的固体支持物，例如下文中描述的含硅基板或可在其上排列生物分子的下列基板的任一种。这样的基板的实例包括但不限于微阵列、珠粒、柱子、光纤维、巾(wipe)、硝酸纤维素、尼龙、玻璃、石英、重氮化膜(纸或尼龙)、硅酮、多聚甲醛、纤维素、醋酸纤维素、纸、陶瓷、金属、类金属、半导体材料、涂覆的珠粒、磁性颗粒；塑料例如聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯；以及凝胶形成材料例如蛋白质(例如，明胶)、脂多糖、硅酸盐、琼脂糖、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯聚合物；溶胶凝胶；多孔聚合物水凝胶；纳米结构表面；纳米管(例如碳纳米管、功能化分子的自组装单层和纳米颗粒(例如金纳米颗粒或量子点)。 [0056] 在一个示例性实施方案中，基板包括适合用于“试纸(dipstick)”装置的基板，例如上文中公开的基板的一种或多种。当结合至基板时，生物分子可直接连接至支持物或通过接头连接至表面。因此，可使用本领域已知的方法对基板和/或生物分子进行衍生化以促进生物分子至支持物的结合。同样地可任选地将其它分子例如参照或对照分子固定在表面上。用于将不同类型的分子固定在各种表面上的方法对于本领域技术人员来说是公知的。许多种材料可用于功能化固体支持表面，包括但不限于例如玻璃、金或硅。 [0057] 生物分子物理地限定于离散位置，以便生物分子通过任何适当类型的屏障与其它离散位置上的生物分子间隔。在各种非限定性实施方案中，离散位置可以是基板的孔、管、图案化的(化学或机械的)区域、柱子(浮雕)或抑制相邻位置之间的侧向扩散的任何三维部件。 [0058] 在一个实施方案中，本文中公开的阵列和方法提供了蛋白质微阵列的显著改善；特别是降低了核酸可编程性阵列(NAPPA)的制造成本，改善了其质量和增加了其密度。 NAPPA是以微阵列版式原位表达和捕获数千种不同蛋白质的方法。在该方法中，将对应于目标蛋白质的DNA分子打印在微阵列基板上，随后在测试时进行原位转录/翻译。DNA分子被构造来将共同的表位标签在N或C末端上添加至所有蛋白质，以便它们可被与DNA以及牛血清白蛋白(BSA)和BS3交联剂一起被固定的高亲和力捕获试剂捕获。将体外转录和翻译(IVTT)偶联剂例如兔网织红细胞裂解物用于产生蛋白质。将表达的蛋白质通过识别表位标签的高亲和力试剂捕获在阵列上。NAPPA微阵列被研究者用于在微阵列表面上同时研究数千种不同的蛋白质与另一种生物分子、药物候选者或血清样品的相互作用。 [0059] 离散位置的物理限制在例如NAPPA的体外蛋白质表达过程中阻止了扩散。在某些实施方案中，每一个物理地限定的离散位置可包含孔。如本文中所用，孔是在一端开放并且在另一端封闭的液体容器。孔可具有任何期望的形状，包括但不限于圆形、矩形、正方形、多边形或任意形状。孔可通过任何适当的技术来制造，包括但不限于：照相平版印刷术和/或硅晶片上的各向同性或各向异性蚀刻；在硅晶片的顶部形成二氧化硅层以与已被开发用于玻璃(二氧化硅)表面的NAPPA化学试剂相容；通过PDMS的微米/纳米印迹或通过SU8的照相平板印刷术形成纳米孔；玻璃的蚀刻或将穿孔的膜键合至固体表面。在一个实施方案中，当贮存或使用时，基板包括一个或多个其它部件以在生物化学过程中改善孔的密封。密封在生物化学过程中阻止分子从一个孔扩散至相邻孔，对于具有小的孔间间距的高密度阵列是特别有用的。这样的部件包括但不限于，用于密封每一个孔的匹配基板；每一个孔周围的边(lip)(其中所述边包含与制造基板的材料相同或不同的材料)，每一孔周围的聚硅酮橡胶垫，和在基板的每一个孔周围形成密封的匹配基板。例如，匹配基板可具有柔性材料来当其与基板匹配时在离散位置之间形成紧密密封。 [0060] 在某些实施方案中，每一个孔具有约14nm至约0.75mm的直径。在不同的实施方案中，孔直径为20nm至500μm；50nm至500μm；100nm至500μm；250nm至500μm；500nm至500μm；1μm至500μm；10μm至500μm；100μm至500μm；150μm至500μm；20nm至300μm；50nm至300μm；100nm至300μm；250nm至300μm；500nm至300μm；1μm至300μm；10μm至300μm；100μm至300μm；150μm至 300μm；20nm至250μm；50nm至250μm；100nm至250μm；250nm至250μm；500nm至250μm；1μm至250μm；10μm至250μm；100μm至250μm以及150μm至250μm。 [0061] 孔可以以约2500亿个孔/平方厘米至约100个孔/平方厘米的密度存在于第一基板上。在不同的实施方案中，孔以如下密度存在于第一基板上：约2500亿个孔/平方厘米至约500个孔/平方厘米；约2500亿个孔/平方厘米至约1000个孔/平方厘米；约2500亿个孔/平方厘米至约10,000个孔/平方厘米；约1000亿个孔/平方厘米至约100个孔/平方厘米；约1000亿个孔/平方厘米至约500个孔/平方厘米；约1000亿个孔/平方厘米至约1000个孔/平方厘米；约1000亿个孔/平方厘米至约10,000个孔/平方厘米；约100亿个孔/平方厘米至约100个孔/平方厘米；约100亿个孔/平方厘米至约500个孔/平方厘米；约100亿个孔/平方厘米至约 1000个孔/平方厘米；约100亿个孔/平方厘米至约10,000个孔/平方厘米；10亿个孔/平方厘米至约100个孔/平方厘米；约10亿个孔/平方厘米至约500个孔/平方厘米；约10亿个孔/平方厘米至约1000个孔/平方厘米；约10亿个孔/平方厘米至约10,000个孔/平方厘米；约1亿个孔/平方厘米至约100个孔/平方厘米；约1亿个孔/平方厘米至约500个孔/平方厘米；约1亿个孔/平方厘米至约1000个孔/平方厘米；约1亿个孔/平方厘米至约10,000个孔/平方厘米；约1000万个孔/平方厘米至约100个孔/平方厘米；约1000万个孔/平方厘米至约500个孔/平方厘米；约1000万个孔/平方厘米至约1000个孔/平方厘米；约1000万个孔/平方厘米至约10,000个孔/平方厘米；约100万个孔/平方厘米至约100个孔/平方厘米；约100万个孔/平方厘米至约500个孔/平方厘米；约100万个孔/平方厘米至约1000个孔/平方厘米；约100万个孔/平方厘米至约10,000个孔/平方厘米；约100,000个孔/平方厘米至约100个孔/平方厘米；约100,000个孔/平方厘米至约500个孔/平方厘米；约100,000个孔/平方厘米至约 1000个孔/平方厘米；约100,000个孔/平方厘米至约10,000个孔/平方厘米；约75,000个孔/平方厘米至约100个孔/平方厘米；约75,000个孔/平方厘米至约500个孔/平方厘米；约75, 000个孔/平方厘米至约1000个孔/平方厘米；约75,000个孔/平方厘米至约10,000个孔/平方厘米；约50,000个孔/平方厘米至约100个孔/平方厘米；约50,000个孔/平方厘米至约500个孔/平方厘米；约50,000个孔/平方厘米至约1000个孔/平方厘米；以及约50,000个孔/平方厘米至约10,000个孔/平方厘米。 [0062] 在不同的实施方案中，孔具有约10μm至约150μm；约10μm至约125μm；约10μm至约100μm；约10μm至约90μm；约10μm至约80μm；约10μm至约75μm；约10μm至约70μm；约10μm至约 60μm；约10μm至约50μm；25μm至约100μm；约25μm至约150μm；约25μm至约125μm；约25μm至约 100μm；约25μm至约90μm；约25μm至约80μm；约25μm至约75μm；约25μm至约70μm；约25μm至约 60μm；约25μm至约50μm；约50μm至约150μm；约50μm至约125μm；约50μm至约100um；约50μm至约90μm；以及约50μm至约75μm的深度。 [0063] 在不同的实施方案中，孔在阵列上具有约100μm至约400μm；约100μm至约375μm；约100μm至约350μm；约100μm至约325μm；约100μm至约300μm；约100μm至约275μm；约100μm至约 250μm；约100μm至约225μm；约100μm至约200μm；约100μm至约185μm；约100μm至约175μm；约 100μm至约150μm；125μm至约400μm；约125μm至约375μm；约125μm至约350μm；约125μm至约 325μm；约125μm至约300μm；约125μm至约275μm；约125μm至约250μm；约125μm至约225μm；约 125μm至约200μm；约125μm至约185μm；约125μm至约175μm；约125μm至约150μm；150μm至约 400μm；约150μm至约375μm；约150μm至约350μm；约150μm至约325μm；约150μm至约300μm；约 150μm至约275μm；约150μm至约250μm；约150μm至约225μm；约150μm至约200μm；约150μm至约 185μm；约150μm至约175μm；175μm至约400μm；约175μm至约375μm；约175μm至约350μm；约175μm至约325μm；约175μm至约300μm；约175μm至约275μm；约175μm至约250μm；约175μm至约225μm；约175μm至约200μm；约175μm至约185μm；约185μm至约400μm；约185μm至约375μm；约185μm至约350μm；约185μm至约325μm；约185μm至约300μm；约185μm至约275μm；约185μm至约250μm；约185μm至约225μm；以及约185μm至约200μm的周期(即，间距)。 [0064] 在另一个实施方案中，其中孔间距(以mm表示)为“Sp”，密度为“Dn”，直径为“Dm”，深度为“Dp”。 [0065] (a)孔密度(以点/mm2表示)为1/Sp2<＝Dn<＝1/(Sp*(0.75)0.5)2； [0066] (b)孔直径(以mm表示)为0.1*Sp<＝Dm<＝0.95*Sp；和/或 [0067] (c)孔深度为(以mm表示)为0.1*Dm<＝Dp<＝3*Dm；和 [0068] 在其它实施方案中，每一个物理地限定的离散位置包含管(图11)。如本文中所用，管是两端开口的流体容器。“管”可以是单个位置中1或多个(即：2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多个)相邻的管。在一个优选实施方案中，将离散位置中的多个管集束在一起。在另一个实施方案中，将多个管在一端融合，另一端保持分离。因此，每一个管在使用中将接受相同液体样品。管可具有任何期望的形状，包括但不限于圆形、矩形、正方形、多角形或任意形状。 [0069] 管可利用任何适当的技术制造，包括但不限于：将玻璃行管集束在一起，融合它们并将它们拉长，随后将所得物切成融合纳米管薄片，将其抛光；照相平版印刷术和/或硅晶片中的各向同性或各向异性蚀刻；在纳米管的表面上形成二氧化硅层以与已被开发用于玻璃(二氧化硅)表面的NAPPA化学试剂相容；通过PDMS的微米/纳米压印光刻或通过SU8的照相平板印刷术或玻璃的蚀刻形成纳米孔。 [0070] 在某些实施方案中，每一个管可具有约14nm至约0.75mm的内径。管以约2500亿个管/平方厘米至约1个管/平方厘米的密度存在于第一基板上。在另一个实施方案中，管以约2500亿个管/平方厘米至约10个管/平方厘米的密度存在于第一基板上。在另一个实施方案中，也以约2500亿个管/平方厘米至约100个管/平方厘米的密度存在于第一基板上。阵列上孔直径、周期和间距的所有实施方案同样地适用于管内径、周期和间距。管深度可以是基于使用的毛细管的长度的任意适当深度。在一个实施方案中，管长度为10nm至10mm。在各种其它实施方案中，管长度为10nm至5mm；10nm至1mm；10nm至100μm；10nm至50μm；10nm至10μm； 10nm至1μm；10nm至100nm；25nm至10mm；25nm至5mm；25nm至1mm；25nm至100μm；25nm至50μm； 25nm至10μm；25nm至1μm；25nm至100nm；50nm至10mm；50nm至5mm；50nm至1mm；50nm至100μm； 50nm至50μm；50nm至10μm；50nm至1μm；25nm至100nm；100nm至10mm；100nm至5mm；100nm至 1mm；100nm至100μm；100nm至50μm；100nm至10μm；100nm至1μm；500nm至10mm；500nm至5mm； 500nm至1mm；500nm至100μm；500nm至50μm；500nm至10μm；500nm至1μm；1μm至10mm；1μm至 5mm；1μm至1mm；1μm至100μm；1μm至50μm；1μm至10μm；10μm至10mm；10μm至5mm；10μm至1mm；10μm至100μm；10μm至50μm；100μm至10mm；100μm至5mm以及100μm至1mm。 [0071] 可额外地对每一个离散位置进行功能化。在某些实施方案中，如下文中所述，将表面功能化成亲水性的。这样的亲水表面可促进试剂的润湿和扩散。在某些实施方案中，如下文中所述，将表面功能化成疏水性的。这样的表面功能化可在每一个离散位置内或离散位置之间；在后一种情况下，表面功能化可用于确定离散位置。在基板包含硅的一个实施方案中，可通过用氧化物涂覆来功能化硅基板(例如其中每一个物理地限定的离散位置包含孔的基板)，以减少硅对荧光的淬灭。在该实施方案中，可将任意适当厚度(例如厚度为约10nm至500nm，优选厚度为约50nm至250nm或厚度为约100nm)的氧化物涂覆在基板上。 [0072] 每一个离散位置还可包含用于表达编码的核酸产物和/或用于测试多肽活性的试剂。可使用为了给定目的的任何适当试剂。基于与本领域技术人员的水平组合的本文中的教导，本领域技术人员可确定用于给定用途的适当试剂。在一个非限定性实例中，当生物分子包含DNA分子并且期望的表达产物是多肽时，试剂可包括网织红细胞裂解物。 [0073] 例如，试剂可包括用于表达编码的核酸产物和/或用于测试多肽活性的试剂，并且其中将这些试剂与核酸或多肽分开地添加至阵列。可在添加核酸或多肽之前添加试剂，或可在核酸或多肽之后添加它们。对于例如NAPPA，试剂由捕获抗体、BSA和BS3的混合物组成。可将该混合物在将它们打印至阵列表面上之前与核酸组合或可分开地打印它们。此外，可将核酸与适当的化学品一起打印至阵列表面上以将它们结合至阵列表面，随后可使混合物溢满整个阵列表面。在具体实施方案中，试剂可包括网织红细胞裂解物。网织红细胞裂解物可以是溶液(例如，由终用户添加)，或可被置于离散位置和冷冻(例如，由制造商)，以便其可被贮存、运输等。在表达后，终产物可以是在每一个物理地限定的离散位置内结晶的蛋白质。 [0074] 在某些实施方案中，生物分子包括至少10种分离的编码核酸。如对于本领域技术人员将是很明了的，可将超过10种分离的编码核酸和/或分离的多肽排列在基板上；在不同的实施方案中，可将50、100、500、1000、2500、5000、10,000、25,000、50,000、100,000或更多种分离的编码核酸和/或分离的多肽排列在基板上。在其它实施方案中，生物分子包含至少100种分离的编码核酸；或至少1000种分离的编码核酸；或至少10种分离的多肽；或至少100种分离的多肽；或至少1000种分离的多肽。在前述实施方案的任何实施方案中，核酸和/或多肽可被结合至基板。 [0075] 阵列还可包含(i)适合于与第一基板匹配的捕获基板，其中对捕获基板进行功能化以捕获和分离表达产物；或(ii)对离散位置进一步功能化以捕获和分离表达产物。如本文中所用，“匹配”意指形成密封，以便每一个离散位置彼此完全分隔。然而，完全密封不是必需的，微米数量级的距离在一些情况下是足够好的。捕获基板可以是平面的或其可具有与第一基板上的物理部件匹配的物理部件。在某些实施方案中，捕获基板与第一基板形成完全密封。捕获基板和/或第一基板可具有柔性材料，以便当两者匹配在一起时在离散位置之间形成紧密密封。 [0076] 在另一个方面，本公开内容提供了阵列，其包含含硅基板，具有多个在离散位置上于基板表面中形成的纳米孔，其中离散位置在含硅基板上彼此间隔约20nm至约1mm的中心间距；和位于每一个离散位置上的能够捕获另一种分子的生物分子。在某些实施方案中，离散位置在第一基板上彼此间隔约20nm至约100μm的中心间距。上文中提供的阵列的孔直径、周期、深度和间距的所有实施方案同等地适用于本发明的该方面。 [0077] 在一个实施方案中，阵列包含一个或多个其它部件来改善当贮存或使用时孔的密封。这样的部件包括但不限于边(其中所述边包含与制造基板的材料相同或不同的材料)，每一孔周围的聚硅酮橡胶垫，和在基板的每一个孔周围形成密封的匹配基板。例如，匹配基板可具有柔性材料以便当其与基板匹配时在离散位置之间形成紧密密封。 [0078] 可位于每一个离散位置上的纳米孔中的生物分子的实例包括但不限于核酸、抗原、抗体等，如上文中论述的。当生物分子是多肽时，这样的多肽可包含全长蛋白质、蛋白质片段以及天然存在的和合成的肽，或由上述项组成。根据给定的目的所需，多肽可包含非天然存在的氨基酸和其它修饰。 [0079] 当生物分子是核酸时，核酸可以是RNA或DNA(例如，单链DNA或双链DNA)。在优选实施方案中，核酸包括质粒或病毒DNA或其片段；扩增产物(例如，通过RCA、PCR、NASBA产生的产物)；或合成的DNA。核酸还可包括如下的一种或多种：转录启动子；转录调控序列；非翻译前导序列；编码切割位点的序列；重组位点；3’非翻译序列；转录终止子；编码表位标签的序列和内部核糖体进入位点。在另一个实施方案中，核酸还包括编码报道蛋白(例如其丰度可被定量并且可提供表达产物的量的指示的蛋白质)的序列。可将报道蛋白连接(例如共价连接，例如作为翻译融合物连接)至核酸表达产物。报道蛋白可以是酶，例如，β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、β-葡糖醛酸糖苷酶等。报道蛋白可产生或调节光，例如荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白、其变体、红色荧光蛋白、其变体等)和萤光素酶。转录启动子可以是原核生物启动子、真核生物启动子或病毒启动子。调控元件例如转录启动子可在核酸间在多个不同位置上变化。例如，不同的启动子可用于改变在不同的位置产生的多肽的量。 [0080] 可按照本领域技术人员熟知的方法将生物分子限制在纳米孔中；例如，前述的任何生物分子可通过针对能够与基板的表面结合或缔合的官能团的二价连接基团连接于含硅基板上的纳米孔的表面，如下文中论述的。 [0081] 生物分子可捕获的分子的实例包括但不限于，当用适当的试剂(酶、缓冲剂、盐、核苷酸、氨基酸、核糖体等)温育时，核酸表达产物。在其它实施方案中，可捕获和分离表达产物的生物分子包括但不限于抗原、抑制剂(例如，不可逆抑制剂)或表达产物的抗体。这样的表面功能化可通过本领域技术人员熟知的方法引入。 [0082] 在某些实施方案中，含硅(Si)基板是二氧化硅或硅基板。例如，基板可包含玻璃或硅晶片(每一个硅晶片具有适合用于期望目的的形状)。可按照本领域技术人员已知的方法化学地使这样的基板图案化(例如，微接触打印)或蚀刻(例如，用于硅的标准掩模和刻蚀法)以在其表面上提供多个离散位置。例如，参见例如，Xia和Whitesides,Ann.Rev.Mater.Sci.1998,28,153，将其通过引用整体并入本文。 [0083] 在一个实施方案中，用氧化物涂覆硅纳米孔，以减少硅对荧光的淬灭。在本实施方案中，可以在基板上涂覆任意适当厚度(例如厚度为约10nm至500nm，优选厚度为约50nm至250nm，或厚度为约100nm)的氧化物。 [0084] 适当的连接基团包括但不限于式-(C0-C10烷基-Q)0-1-C0-C10烷基-的基团，其中Q为键、芳基、杂芳基、C3-C8环烷基或杂烷基；并且每一个烷基中不超过一个亚甲基任选地且独立地被–O-、-S-、-N(R00)-、-C(H)＝C(H)-、-C≡C-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)(OH)-、-OP(O)(OH)-、-P(O)(OH)O-、-N(R00)P(O)(OH)-、-P(O)(OH)N(R00)-、-OP(O)(OH)O-、-OP(O)00 00 00 00 00 (OH)N(R )-、-N(R )P(O)(OH)O-、-N(R )P(O)(OH)N(R )-、-C(O)O-、-C(O)N(R )-、-OC(O)-、-N(R00)C(O)-、-S(O)O-、-OS(O)-、-S(O)N(R00)-、-N(R00)S(O)-、-S(O)2O-、-OS(O)2-、-S(O)2N(R00)-、-N(R00)S(O)2-、OC(O)O-、-OC(O)N(R00)-、-N(R00)C(O)O-、-N(R00)C(O)N(R00)-、-OS(O)O-、-OS(O)N(R00)-、-N(R00)S(O)O-、-N(R00)S(O)N(R00)-、-OS(O)2O-、-OS(O)2N(R00)-、-N(R00)S(O)2O-,或-N(R00)S(O)2N(R00)-替代，萁中每一个R00独立地是氢或C1-C6烷基。 [0085] 适当的官能团包括但不限于-NH2(胺基),-COOH(羧基),硅氧烷(-Si(OR)3，其中每一个R为C1-C4烷基)、-OH(羟基)、-SH(巯基)、-CONH2(氨基)、-P(O)(OH)2(磷酸)、-S(O)2OH(磺酸)、-S(O)OH(亚磺酸)、-OS(O)2OH(硫酸)和包含所述官能团的化学基团。 [0086] 二价接头还可在二价基团内包含光致断裂基团。这样的表面功能化可允许通过与能够捕获表达产物的生物分子结合来在表面上分离表达产物。表达后，利用本领域内技术人员熟知的方法洗涤基板，以除去残余起始材料、反应物和/或污染物。随后，可将洗涤的基板暴露于适当波长的光进行适合于切割光致断裂接头的一段时间(图18)，从而释放表达产物以允许进一步操作表达产物(例如，如下所述在第二基板上进行的分离)。 [0087] 二价接头还可在二价基团内包含化学上可切割的基团。这样的表面功能化可允许通过与能够捕获表达产物的生物分子结合来在表面上分离表达产物。表达后，利用本领域内技术人员熟知的方法洗涤基板，以除去残余起始材料、反应物和/或污染物。随后，可将洗涤的基板暴露于适当的试剂进行适合于切割化学上可切割的接头的一段时间，从而释放表达产物以允许进一步操作表达产物(例如，如下所述在第二基板上进行的分离)。 [0088] 在某些实施方案中，将表面功能化成亲水性的。亲水性功能化的实例包括但不限于羟基烷基、氨基烷基或羧基烷基功能化的硅氧烷(对于二氧化硅表面；例如，3-氨基丙基三甲氧基硅烷、(N,N-二甲基氨基丙基)三甲氧基硅烷或[3-(2-氨基乙基氨基)丙基]三甲氧基硅烷)和羟基烷基-、氨基-烷基-或羧基烷基-官能化硫醇(对于金属表面，例如Au、Ag、Cu、Ni、Zn,或Pt等；(例如11-巯基十一基)四(乙二醇)；溴化11-巯基十一基)-N,N,N-三甲铵；11-巯基-1-十一烷醇；11-巯基十一烷酸；11-巯基十一基磷酸)。如本文中所用，“亲水性”意指位置具有小于40度的水接触角，如通过本领域技术人员已知的卧滴法测量的。这样的亲水性表面可促进试剂的润湿和扩散。 [0089] 这样的功能化可包括光保护羟烷基、氨基烷基和/或羧基烷基功能化硅氧烷的使用，可按照本领域技术人员已知的方法将所述硅氧烷进行光刻蚀(photopatterned)以在基板表面上于离散位置局部产生亲水性表面。这样的功能化还可包括反应性表面功能化的使用，例如可与第二分子(例如，1,2-二氨基乙烷)反应以产生局部亲水性表面的环氧基或异氰酰基(例如，(三乙氧基甲硅烷)丙基异氰酸酯或3-缩水甘油醚氧基丙基二甲基乙氧基硅烷)。 [0090] 在某些实施方案中，将含硅基板的表面功能化成疏水性的。疏水性功能化的实例包括但不限于烷基功能化和氟烷基功能化硅氧烷(对于二氧化硅表面；例如，1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷和十二烷基三乙氧基硅烷)和烷基功能化硫醇(对于金属表面，例如Au、Ag、Pt等(例如，1-十二烷基硫醇)。如本文中所用，“疏水的”意指位置具有大于90度的水接触角，如通过本领域技术人员已知的卧滴法测量的。 [0091] 这样的捕获和分离表达产物的功能化可位于第二基板上，或可位于第一基板的相同离散位置内。例如，可处理单个孔(例如，具有矩形大小的或大椭圆形的/圆形的)以便孔的一部分具有打印的核酸(例如，DNA)，另一部分具有针对表达产物的抗体的涂层。表达的蛋白质可结合该抗体来分离纯蛋白。即，“捕获基板”可以是与含硅基板分开的基板，或可以是包含可获得的用于捕获表达产物的含硅基板的一部分。在一个非限定性实施方案中，“捕获基板”在基板上包含一个或多个与在其上发生表达的离散位置相邻的离散位置，所述位置在物理上受到孔或管(底部捕获、管壁捕获或侧面捕获等)的限制。 [0092] 在另一个方面，本公开内容提供了用于原位核酸表达的方法，包括： [0093] (a)将如前述方法的任何方面中及其实施方案所述的阵列的每一个离散位置与用于核酸表达的试剂接触以形成混合物；和 [0094] (b)在适合用于核酸表达的条件下温育混合物。 [0095] 在另一个方面，本公开内容提供了用于表达和捕获表达产物的方法，包括 [0096] (a)将核酸阵列与用于核酸表达的试剂接触以形成混合物，其中核酸阵列包含第一基板和物理地限定于第一基板上的离散位置的至少10种分离的编码核酸，并且其中每一种核酸能够在第一基板上于其离散位置上原位表达其编码的产物； [0097] (b)任选地，可使第一基板与捕获基板靠近； [0098] (c)在适合于产生核酸表达产物的条件下温育混合物；和 [0099] (d)在第一基板或捕获基板(当存在时)上捕获和分离表达产物。 [0100] 基于本文中的教导确定用于接触、温育和捕获步骤的最适当条件完全在本领域技术人员的水平内。在一个非限定性实例中，用于NAPPA的条件通常包括在30℃温育DNA1-2小时以表达蛋白质。 [0101] 表达产物可被捕获在相同的第一基板或捕获基板上。例如，每一个离散位置还可包含能够与表达的产物结合或缔合的生物分子，如本文中所描述的，以便在离散位置产生和捕获表达产物。在另一个实例中，可将第一基板与捕获基板接触，其中用能够结合表达产物或与其缔合的生物分子涂覆捕获基板；表达后，产物可被捕获在捕获基板上。示例性的捕获基板及其用途提供于图16-17中。图16(孔)和图17(毛细管)显示了其中将捕获抗体涂覆在用作捕获基板的载玻片上(而不是在孔中的DNA/试剂混合物中)的实施方案；将该捕获基板与阵列接触并且进行蛋白质表达导致产生为纯蛋白质阵列并且不包含起始DNA或试剂的捕获基板。捕获基板可由任何材料制造或包含适合于给定的用途的任何其它组分，包括但不限于金和/或银涂覆的捕获基板(例如，用于表面等离子体共振(SPR)研究)、包含场效应纳米线(例如，以产生具有涂覆有表达的蛋白质的纳米线的基板)的捕获基板和包含涂覆有第二抗体或化学接头的旋转涂覆的探针分子磁性微颗粒/纳米颗粒的捕获基板。 [0102] 通过使用本发明的方法，可从相同阵列多次表达表达产物，从而便得每个阵列能够进行超过一次分离的-表达产物捕获。在本文中，“分离的”意指DNA打印位置与表达产物的捕获位置分离并且不被其它生物材料污染。(例如，在常规NAPPA中，这两种位置都相同)。 [0103] 可在适合于给定目的任何条件下进行接触。在一个实施方案中，可将试剂注满漫过所有离散位置。在另一个实施方案中，可以例如使用已知的微流体技术将试剂分开地递送至一些或所有离散位置。如本领域技术人员将理解的，可产生并立即使用阵列，或可产生阵列并贮存以待以后使用。当产生阵列并将其贮存以待以后使用时，可在使用时添加试剂(例如网织红细胞裂解物)，或可产生阵列/试剂并冷冻贮存，以便使用时将裂解物解冻，和适当时进行温育。在其它实施方案中，可在温育/蛋白质表达和任何期望的随后步骤后冷冻阵列，以待以后使用表达的蛋白质。 [0104] 在前述方面的任何方面及其实施方案的各种非限定性实施方案中，方法可包括下列步骤的一个或多个： [0105] ■(a)在多肽表达过程中充注和密封离散位置(例如纳米孔)以防止相邻孔之间交叉污染。例如，将纳米孔中的质粒DNA暴露于试剂，例如网织红细胞裂解物，以从DNA表达蛋白质(例如，使用预抽真空的PDMS孔(或另一种泡沫基板如聚硅酮橡胶泡沫)，其中残留真空吸入裂解物；或例如，首先用水充注孔，除去孔的内侧以外的水，随后注射裂解物以用裂解物替代/混合水)。 [0106] o(b)使用在盖子(如本文中所用，包括但不限于捕获基板)与基板阵列表面之前有间隔的坚硬盖子，随后除去间隔以按下盖板，密封离散位置； [0107] o(c)使用在盖子与离散位置之间具有弹性间隔的坚硬盖板，随后按下盖板以挤压弹性间隔来密封离散位置； [0108] o(d)使用柔性盖子并下按盖子来使其变形并密封离散位置； [0109] o(e)迫使试剂例如网织红细胞裂解物流体通过基板与盖子之间的狭窄空隙以使液体均匀地在阵列表面上方扩散； [0110] o(f)使用真空、注射器和电磁阀用试剂例如网织红细胞裂解物充注离散位置(例如纳米孔或管)。参见，例如，图4。在基板上方装配具有两个洞的盖板。将盖板环绕边缘密封基板。在盖板与基板之间留下空隙。将注射器连接至电磁阀，以正好足够的网织红细胞裂解物充满离散位置、基板和组合阀、配件和管件上方的空隙。将电磁阀的另一端连接至盖板中的一个洞。将真空施用于盖板中的另一个洞。打开电磁阀。释放真空。本实施方案可通过下方面的一个或多个方面来进行改变： [0111] ■(1)用隔膜替代电磁阀，用连接至注射器的注射器针头刺穿隔膜以起始试剂至装置的流入； [0112] ■(2)除去电磁阀，使用注射器柱塞上的机械式塞棒阻止试剂流动，随后释放机械式塞棒以起始试剂至装置的流入； [0114] ■(4)必要时将限流器与电磁阀置于一条直线以减慢流速； [0115] ■(5)必要时添加机械阻尼以减慢注射器柱塞的运行； [0116] ■(6)调整基板与盖板之间的空隙以获得所有离散位置的均匀充注；和 [0117] ■(7)将单个注射器的网织红细胞裂解物连接至多个阵列以一次同时充注超过一个阵列。 [0118] o(g)将基板垂直取向并以受控的速度将其浸入试剂，从而纳米孔中的空气被试剂置换； [0119] o(h)将基板垂直取向并以受控的速度将其浸入试剂，同时振动试剂以进一步帮助试剂置换纳米孔中的空气； [0120] o(i)将基板垂直置于容器中，以受控的速度用试剂从底部充注容器，从而纳米孔中的空气被试剂置换； [0121] o(j)将基板垂直置于容器中，以受控的速度用试剂从底部充注容器，同时振动试剂，从而纳米孔中的空气被试剂进一步置换； [0122] o(k)用真空室内的试剂例如网织红细胞裂解物充注离散位置。在纳米孔阵列表面上方装配具有一个孔的盖板。将盖板环绕边缘密封纳米孔阵列表面。在盖板与纳米孔阵列表面之间留下空隙。将一滴网织红细胞裂解物置于所述洞的上方，将装配体置于真空室内。将真空施用于真空室，并等待直至来自空隙的全部空气通过盖板中的小孔逸出。除去真空，然后迫使网织红细胞裂解物进入小孔并到达纳米孔阵列表面上。 [0123] o(l)用试剂充注基板的离散位置，同时振动基板以释放捕获在离散位置内的任何气泡。 [0124] o(m)围绕每一个离散位置(例如纳米孔)添加边，所述边用于改善的密封。 [0125] o(n)在聚硅酮橡胶与孔之间添加薄膜(其可任选地是透明的) [0126] o(o)使用薄膜和气压来密封孔而非聚硅酮橡胶。 [0127] o调节液体的温度以进行反应过程的热循环。 [0128] 在另一个实施方案中，可将微筛膜用于覆盖阵列。例如(与改善的NAPPA相关)，将NAPPA混合物打印在基板上。通过使用精密工具，将膜的孔与NAPPA点对齐。将NAPPA点通过膜上的孔暴露于网织红细胞裂解物来分离单个点内的蛋白质表达。维持微筛膜底部与平面微阵列表面顶部之间的空气隙。然而，允许网织红细胞桥接空隙。使微筛膜的底部与微阵列表面的顶部之间产生物理接触。使用具有极小的紧密堆积的孔的高度穿孔的微筛膜，以便多个孔覆盖一个NAPPA点。这减少了对微筛膜与微阵列表面的精确对准的需要。基于本文中的教导，确定用于期望的用途的适当的试剂和温育条件在本领域技术人员的水平内。 [0129] 如本文中所用，“捕获基板”可以是与第一基板分开的基板，或可以是可获得的用于捕获表达产物的第一基板的一部分。在一个非限定性实施方案中，“捕获基板”在基板上包含与在其上发生表达的离散位置并置的一个或多个离散位置，所述位置在物理上通过孔或管限制(底部捕获、管壁捕获或侧面捕获等)。 [0130] 在一个实施方案中，捕获基板包括包含多个物理地限定的离散位置的第二基板，所述位置与第一基板上的物理地限定的离散位置匹配。视任何期望的用途而定，捕获基板可以是一个或多个其它基板。可使用适合用于给定的表达产物捕获法在第二基板上的离散位置的任何排列。在一个非限定性实施方案中，第二基板上的每一个离散位置包括装置的图案化的位置/阵列或化学图案或材料薄膜图案。在不同的非限定性实施方案中，金纳米点可用于产生等离子体传感器，纳米线阵列可用于产生场效应传感器，中孔氧化铝/金垫可用于产生电化学传感器。 [0131] 在另一个非限定性实施方案中，第二基板上的每一个离散位置包含具有脂双层的纳米孔洞的阵列，其中脂双层捕获表达的多肽以产生膜多肽。 [0132] 在其它非限定性实施方案中，在不同的捕获基板上提供了多个第二离散位置。在本实施方案的非限定性实例中，多个捕获基板可用于每一个核酸阵列(例如，可重复使用的)。 [0133] 在另一个非限定性实施方案中，离散位置包括被引入捕获基板上的受限空间的微米或纳米颗粒的表面。在本实施方案的一个实例中，可将金或磁性微颗粒/纳米颗粒引入离散位置以产生其中在捕获后用单种多肽涂覆表面的颗粒。 [0134] 在各种其它实施方案中，视期望的用途而定，将捕获基板用于/经历变化的电势/电压/电流或磁场的应用或温度或机械力的应用的任一种或上述之组合。在一个实施方案中，可将电化学氧化/还原用于在金属或介电基板上诱导覆盖捕获。 [0135] 在另一个实施方案中，覆盖-捕获表面可被纳米构造来增加表面捕获面积和/或表面粗糙度，从而结合更多表达产物，以产生增加的信号。在另一个实施方案中，可将刻蚀的/霜化玻璃(化学或物理刻蚀)可用于提供粗糙表面以用捕获试剂涂覆。 [0136] 在前述方法的任何方案的某些实施方案中，可用结合对的第一成员预涂覆第一基板或捕获基板，其中表达产物包含结合对的第二成员，并且其中在适合于结合对的第一成员和第二成员的结合的条件下进行温育，从而导致表达产物在预涂覆的基板上的捕获。 [0137] 任何适当的结合对可用于给定的目的。在一个实例中，用生物素预涂覆基板，并且生物分子表达产物包含链霉抗生物素蛋白标签。在链霉抗生物素蛋白标签的序列表达后，其将表达的蛋白质结合至生物素涂覆的基板。如对于本领域技术人员来说是很明显的，许多这样的排列是可能的，其全部包括在本文中。例如另一个适当的结合对包括halotag蛋白和halotag配体。在另一个实施方案中，表达产物上的大肠杆菌标签结合固定在基板上的K-螺旋肽。 [0138] 在有述方法的任何方法的其它实施方案中，用结合对的第一成员预涂覆第一基板。在前述方法的任何方法的其它实施方案中，用结合对的第一成员预涂覆捕获基板。 [0139] 可将捕获基板与第一基板接触以形成密封。在本实施方案中，进行密封以便每一个离散位置彼此完全分开。在某些实施方案中，每一个离散位置包含孔。在某些其它实施方案中，每一个离散位置包含管。管可具有用于给定目的的任何适当的类型。在一个实施方案中，管可从例如Incom或其它提供商(如上文中提到的)商购获得。 [0140] 在一个实施方案中，将NAPPA混合物按阵列版式分配至管中。例如，管的内部可充满网织红细胞裂解物来表达多肽并将它们捕获在管的内壁。任选地，可在多肽表达和捕获过程中封闭管的两个末端。为了进行检测，可通过任何适当的技术对阵列进行成像，所述技术包括但不限于从一端照射阵列并在另一端检测荧光信号，这利用了排列的光导性质。在另一个实施方案中，用户可任选地以一定的角度保持光源以增加信号强度(图12)。提供了用于在管阵列内表达产物(图13)和用于检测荧光分子在管内和管的表面上存在(图14)的示例性方法。用试剂混合物稀释cDNA，将其置于管内。随后用网织红细胞裂解物充满管，如通常在NAPPA中一样进行表达。当NAPPA打印混合物被充分稀释时，将具有cDNA的打印混合物沉积于管的侧面上。如果打印混合物太浓，则其可能阻塞管，使得其更难以引入裂解物。管侧面上的cDNA涂层有利于充注裂解物和表达。在该情况下，最终的图像显示在管的内部对应于打印的位置存在清楚的内部荧光信号环。 [0141] 在某些实施方案中，核酸表达包括RNA表达。在其它实施方案中，核酸表达包括多肽表达。因此，试剂可包括体外表达系统。可使用任何适当的体外表达系统，包括但不限于网织红细胞裂解物、昆虫细胞裂解物和人细胞裂解物。 [0142] 方法还可包括修饰基板上的多肽捕获物。可视期望的用途而定，对多肽进行任何适当的修饰。在一个非限定性实施方案中，使用相同的试剂或可存在于表达混合物中或在表达-捕获后添加的第二试剂对结合的/捕获的多肽进行翻译后修饰。本实施方案可仅在捕获基板上进行，或可包括第三基板。方法还可包括稳定化捕获基板上的捕获的多肽以限制蛋白质扩散。稳定化可以是例如但不限于冷冻捕获基板上的捕获的多肽。 [0143] 捕获试剂涂覆的表面上的捕获的蛋白质可用于进行一个或多个选自下列的过程：表面等离子体共振(SPR)检测、MALDI质谱法和翻译后修饰。 [0144] 在另一个方面，本发明提供了用于检测前述方面及其实施方案中描述的任何阵列上的生物分子的方法，包括以不同的深度扫描阵列和组合所得扫描图像的每一个像素上的强度读数。如本文中所用，“组合”意指为了一致地增加离散位置的检测信号，计算像素强度的任何适当的算术矩阵，包括但不限于平均值或峰值。用于生物分子的荧光检测的典型微阵列扫描仪被设计来扫描平面，因而具有有限的景深。然而，本文公开的离散位置可以是三维的。在不同的焦深上扫描这些位置，随后组合所得的图像克服了因用于本申请的微阵列扫描仪的有限景深而导致的限制。 [0145] 本发明的阵列的一个非限定实施方案以及它们的制备和用途提供于图1中，具有50μm深的孔，所述孔具有35°的壁和145μm的直径)，其中孔具有225μm的周期。包含这样的阵列的基板可以例如获自刻蚀的硅或刻蚀的玻璃。可在将cDNA打印在孔(或可选择地盖子)的底部上之前用氨基甲硅烷对孔进行功能化，并充满网织红细胞裂解物，随后使用盖子挤出过量网织红细胞裂解物并密封微孔(图2-3)。随后可将阵列温育0.5至2小时以转录和翻译由cDNA编码的蛋白质。 [0146] 图5-10显示其中将受控量的DNA和试剂分配在玻璃上或孔中的实验的结果，显示了使用本发明的阵列和方法在扩散减少上的显著改善。图5显示在玻璃上进行的对照实验，将4滴DNA和试剂分配在中央点中，使用网织红细胞裂解物从DNA产生蛋白质，用荧光标记的抗体标记所述蛋白质；在检测的荧光模式中，点之间的显著扩散是很明显的。图6显示与图5相同的实验，该实验使用具有200-225μm的周期的密封的硅纳米孔而非玻璃，荧光在孔间的扩散显著减少。图7-9显示使用递增量的每孔DNA和试剂产生的相似结果，而图10显示盖子密封帮助限制孔间的扩散。 [0147] 在一个应用微毛细管的实施方案中，图18显示用于通过可切割接头(化学品或光诱导的)的切割或通过与过量抗体或抗原竞争，从包含微毛细管的基板释放捕获的表达产物的方法。由此将表达产物悬浮于溶液中，在溶液相中产生蛋白质的阵列，可以以任何适当的方式贮存该阵列。例如，可用密封/捕获基板在阵列的任一侧或两侧密封阵列，将其冷冻以用于贮存或运输(图19)。当准备好了可使用时，用户可在即将使用时将蛋白质转移至基板上，或可以以任何其它适当的方式使用阵列。在其它实施方案中，可用适合用于表面等离子体共振(SPR)的捕获基板(包括但不限于金和/或银涂覆的基板)密封阵列，从而允许捕获基板上所得的阵列用于基于SPR的检测/诊断或其它适当的研究。或者，可用包含场效应纳米线的捕获基板密封阵列以用于诊断或其它适当的传感方法(图20)，其中所得的捕获基板具有涂覆有表达蛋白的纳米线。其它示例性捕获基板包括具有旋转涂覆的探针分子的捕获基板，或具有涂覆有第二抗体或化学接头(并使用旋转涂覆或微流体涂布于捕获基板)的磁性微粒/纳米颗粒的捕获基板。(图21-22) [0148] 本领域技术人员将理解，还可将所有这些示例性实施方案与阵列的基于孔的实施方案或用于物理限制的方法的任何其它实施方案一起使用。 [0149] 图23显示用于在相同纳米孔内(其中发生表达)捕获表达产物的实施方案。在本实施方案中，用作为待表达的蛋白质产物的一部分表达的标签的配体涂覆硅纳米孔。通过任何适当的技术例如通过压电点样仪将编码标记的目标表达产物的质粒DNA打印在微孔中。随后通过任何适当的技术，例如通过充满所有孔或使用压电点样仪分配至各个孔中来将网织红细胞裂解物置于孔中，封闭孔。将阵列在用于蛋白质表达的适当条件下进行温育，表达的标记的蛋白质将被孔中的配体捕获。除去密封装置，在适合于除去未结合的材料的条件下洗涤孔。将结合的蛋白质与任何适当的试剂、例如适合用于结合的蛋白的瓜氨酸化的试剂/条件接触，随后可通过在适合结合抗瓜氨酸抗体/荧光标记的第二抗体条件下进行温育来检测所述蛋白。 实施例 [0150] 在本研究中，我们寻求确定NAPPA反应的原位合成在更高的阵列密度上是否遭受扩散相关干扰。我们随后寻求利用使用NAPPA蛋白阵列系统作为测试案例的新型硅纳米孔平台寻求解决扩散的问题。该平台使得能够在物理上分开的纳米孔中进行受限的生物化学反应。NAPPA法经改造适合使用芯片微制造技术产生的纳米孔阵列基板，所述芯片微制造技术使得能够进行纳米孔基板的高通量、高保真制造。我们还同时开发了精确和精密的高通量液体分配系统来将基因和试剂与单个孔对齐并将所述基因和试剂分配至所述孔中。在利用密封的盖子于纳米孔中体外表达蛋白质后，我们显示了孔中的成功蛋白质展示，扩散可忽略不计。初步结果还表明了允许检测已知的蛋白质间相互作用的功能性蛋白质。我们的开发代表了无可溶性物质在部件间扩散的功能性人类蛋白质组蛋白质阵列的产生中的一大进步。 [0151] 结果 [0152] 载玻片上的NAPPA [0153] 我们使用NAPPA测试了部件的减少的间距的效应。随着NAPPA上间距(中心之间)下降至低于400微米，相邻位置上捕获的表达的蛋白质的扩散变得明显。这显示于图24中，其中将基因以两个不同的阵列密度：具有750微米的周期的低密度阵列(图24b)和具有375微米的周期的高密度阵列(图24c)打印在平面玻璃上。以这样的模式打印部件，以便含有cDNA+打印混合物的中央部件被对照部件环绕，其中对照部件仅包含捕获抗体(无基因)。该构型对于交叉污染的检测高度灵敏，因为对照部件不产生可与扩散蛋白竞争的蛋白质。如3-D绘制图(图24)中所示，相较于750微米的周期的阵列的最小扩散，在间距为375微米的阵列中存在显著的至相邻部件的扩散。在两个图像中看到的围绕中央点的信号的光环可能是因蛋白质扩散，随后物理吸附至胺涂覆的玻璃表面而造成的，并且偏离中心的光环的偏移可因液体漂移而引起。 [0154] 硅纳米孔中的NAPPA [0155] 为了使得能够进行高密度打印而无扩散，我们用在硅基板上包含纳米孔的阵列的载玻片替代平面载玻片，并且在蛋白质表达过程中密封孔(图25)。改造NAPPA法以适应纳米孔平台使得能够在物理上限制蛋白质表达和确保在纳升体积(纳米孔的体积≤5纳升)中进行抗体捕获。表达的蛋白质在单个密封的孔中自由扩散直至它们被孔中的抗GST抗体捕获。在切成载玻片的形状(1英寸x3英寸)的硅晶片上制造具有375微米的周期的直径约250微米、深度75微米的半球形纳米孔的阵列，并用作用于蛋白质展示的基板。因允许良好地控制和廉价地制造纳米孔阵列载玻片的已建立的硅加工技术而选择单块晶体硅晶片。使用HNA各向同性蚀刻化学(也参见材料和方法)，通过置于硅上的光刻蚀硅-氰化物掩模层刻蚀孔。 用在氧化炉中于1,000C生长的100nm的干氧化物涂覆在硅中刻蚀的纳米孔。半导体硅因其半金属性质而用于淬灭表面荧光，从而需要100nm的氧化物介电层的薄层。此外，热生长的二氧化硅用作高质量玻璃表面，用于随后氨基丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)涂覆和适当的NAPPA化学。 [0156] 非接触式压电分配 [0157] 标准固体针式打印不能满足在将表达混合物打印至纳米孔中所需的精确度。因此，我们开发了使用压电打印的新方法。使用EngineeringArts’8-tip au302压电打印机(能够以极高的速度对齐纳米孔的中心并在该中心打印)(图25c)将NAPPA表达混合物压电喷射分配至APTES涂覆的硅纳米孔(SiNW)中。纳米孔技术的关键挑战之一是精确的对齐和在适当的时帧内将许多“独特的”打印溶液分配至一批纳米孔载玻片上。开发了专用分配硬件和软件，其使用8头非接触式“动态”分配技术，从而导致数小时的批处理时间以在一批达到8个纳米孔载玻片(细节在方法部分中)上充注每一张载玻片～7,000个孔。 [0158] 纳米孔的真空辅助SiNW充注 [0159] 打印后，首先使NAPPA SiNW载玻片经历利用去离子水的真空渗透5至10分钟，随后经历利用SuperBlock TBS(Thermo Scientific)溶液的真空渗透5至10分钟，随后在摇摆摇床上于室温和大气压下温育30-60分钟。随后用去离子水充分漂洗载玻片，在缓缓的过滤压缩空气流下进行干燥。任何未结合的或松散结合的材料(DNA、抗GST、BSA、BS3交联剂或痕量DMSO)应当在这些预杂交封闭和洗涤步骤中被洗去；从而使材料在随后步骤中逃脱的概率减小至最小。封闭后，用基于兔网织红细胞裂解物(RRL)的体外转录和翻译(IVTT)系统温育SiNW载玻片以进行原位蛋白质表达和捕获。当将该粘稠的裂解物直接引入具有纳米孔的阵列的载玻片时，其显示在纳米孔上方流动的倾向，从而捕获空气而不充满孔(数据未显示)。由于液体表面张力(其中内聚力倾向于使液体表面积最小的)的原因，这是预期的行为。为了解决该问题，我们开发了真空辅助充注法(图25d,e)，其不依赖于纳米孔的尺寸和形状； 充注液体的流体性质；或纳米孔基板的性质而进行工作。 [0160] 在该方法中，通过将SiNW载玻片夹在垫剪切块与两个平面之间而在纳米孔载玻片上方产生密封的不透气微室，如图25d中显示的。不可弯曲的金属板形成底平面，而顶平面通过在保持在金属框架上的厚的不可弯曲的玻璃调板上粘贴柔性透明硅酮的薄膜来制造。将2个1.5mm宽100微米厚的涂满胶粘剂的塑料条(示意图中未显示)手动沿着SiNW载玻片的长边施用。夹住装配体的所有侧面，将其压在一起以将不透气微室的高度(厚度)减少约100微米，顶平面压紧周围的垫剪切块并压在SiNW载玻片上的侧带上。 [0161] 将裂解物引入连接至所显示的端口(顶板上1mm直径的孔)的注射器，所述裂解物因不透气微室的缘故而原位保持在注射器内部(图25d)。通过施加渐增的真空(达到28英寸Hg)持续2分钟来除去微室中的空气和溶解在裂解物溶液中的空气。通过使用三通电磁阀(适配器和螺线管未显示)，将注射器从真空瞬时转换成大气压。转换后，压力差，即作用于裂解物溶液的大气压对孔中的真空，有效地在2秒内驱动液体进入充满所有纳米孔。该内部开发的真空辅助充注系统确保通过玻璃调板上支持的透明柔性硅酮薄膜产生的良好压力密封(密封硅纳米孔的插图图像,图25e)。在施用的压力下，硅酮薄膜密接孔的狭窄顶边周围，以密封纳米孔。随后温育密封的装配体以进行蛋白质表达和结合。 [0162] 使用SiNW的纳米孔之间的最小蛋白质扩散 [0163] 为了测试硅纳米孔中的蛋白质表达和捕获以及为了评估纳米孔之间的干扰水平，将16个不同的基因间隔1个纳米孔打印。(图26a中的打印模式的方案)。使间插孔保持为空，这些间插孔中观察到的信号将表明因扩散引起的交叉污染的水平。打印的DNA的Pico-绿染色显示预期的交替荧光信号(图26b)，确认了通过压电打印机至孔中的精确“动态”分配。当在蛋白质表达过程中不密封纳米孔(不夹紧)时，在间插孔中观察到溢出信号(图26c)。然而，密封的纳米孔中表达和捕获的蛋白质的展示示于图26d中。如从图及其3D信号轮廓看到的，在表达孔与相邻的空孔之间不存在可辨别的蛋白质的扩散。 [0164] 高密度NAPPA蛋白质阵列 [0165] 在成功地显示精确分配和对少数基因的限制表达后，我们利用8,000个纳米孔(SiNW-8K芯片,375um的部件距离)的阵列产生了SiNW载玻片。这些载玻片用于确认横跨全尺寸显微镜载玻片的占据空间的密封的纳米孔中大量基因的无扩散表达(未显示)。将二百八十七(287)个随机选择的基因(192个来自霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，96个来自人)打印在6行x48列的块上，将其重复打印24次。TP53、FOS和JUN蛋白在块图案中散开，p53蛋白在每一个块中重复打印2次。通过将8个不同的基因混合成单一组合物(无p53)来打印DNASU图形。打印图案也包括围绕上述阵列的空纳米孔，在底部围绕图形，作为阴性对照。整个阵列上的一致且精确的分配通过打印的DNA的pico绿染色来显示(未显示)。总体上，阵列显示一致地高蛋白质表达，如通过抗GST染色检测的。 [0166] 无扩散高密度蛋白质阵列 [0167] 本工作的主要目的-解决极高密度阵列中的扩散的问题-已被成功地解决。几乎所有围绕打印块的空点和围绕DNASU图形的空点未显示高于本底的显著信号。 [0168] 为了进一步确认无扩散蛋白质展示，我们使用更灵敏的测试，通过利用抗TP53蛋白的抗原特异性抗体探测SiNW中的高密度NAPPA以确定在相邻孔中是否观察到其信号(未显示)来评价扩散。来自相邻点的平均信号与来自相关p53点的平均信号的比率被计算为仅仅1.34％。这确认了极高密度原位蛋白质阵列可使用阻止蛋白质扩散和交叉结合的纳米孔来成功地产生。通过分析p53信号，48个重复点之间的变异系数(CV)被计算为12.84％。 [0169] 扣除右下侧的一个离群值低信号p53点，CV被计算为8.5％。 [0170] 关于纳米孔蛋白质阵列的功能研究 [0171] 为了研究纳米孔中产生的蛋白质的功能性，我们使用良好地建立的FOS-JUN相互作用(16)作为在具有与上述打印图案(未显示)相同的打印图案的SiNW载玻片上表达的蛋白质的正确折叠和功能性的替代性测定，来检查蛋白质间相互作用。将编码HA标记的FOS的查询DNA混合在IVTT裂解物混合物中，与阵列蛋白质共表达。随后将针对FOS或HA-标签的抗体用于显示FOS与阵列上展示的JUN的特异性相互作用。查询蛋白HA-FOS不具有GST标签，从而不能被共点在每一个孔中的抗GST抗体捕获。只有当它们可结合系于孔的捕获的阵列靶蛋白时，HA-FOS才可被检测到。 [0172] 高度特异性的抗体被选择用于相互作用研究。如果不将查询DNA添加至表达系统中，则抗HA不能检测到任何反应性并且抗Fos仅在表达的阵列上检测到FOS点(未显示)。研究还使用上述真空辅助充注和密封法进一步确认FOS在硅纳米阵列上单个孔中的受限表达，并且显示特异性Fos-Jun相互作用(以HA-FOS蛋白作为查询蛋白并且利用抗Fos抗体检测)。由于抗目标蛋白质的抗体并非总是可获得的，因此我们还通过使用抗查询蛋白上的HA标签的抗体来显示蛋白质相互作用的检测(未显示)。 [0173] 超高密度蛋白质阵列 [0174] 为了确定硅纳米孔平台是否也与人芯片上蛋白质组规模相容，我们产生了两种形式的具有24,000个部件的超高密度阵列。在单个阵列上展示24,000种蛋白质需要具有225微米或更小的阵列间距的纳米孔。以圆孔和方孔几何形状产生了225微米的周期的硅纳米孔(图27)。使用HNA刻蚀化学产生了圆形纳米孔，使用KOH各向异性刻蚀化学以约100微米的孔深度在Si(100)晶片上产生了方形纳米孔。产生不具有明显的侧面刻蚀的深孔的方孔的刻蚀各向异性对于进一步的更高密度蛋白质阵列是有益处的。使用标准方案在这些芯片中测试了蛋白质表达和捕获。在这些24,000个部件的阵列上获得了可与在8,000个部件的阵列上获得的信号相比较的信号，这表明这些超高密度阵列上的强劲蛋白质表达并且解除了对更小体积的孔中潜在的表达裂解物耗尽的担心。图27f中沿着方形纳米孔的边缘的明亮信号据推测是因蛋白质和染料在锐边上优先聚集而引起的。连续的KOH各向异性刻蚀，随后短持续时间的HNA各向同性刻蚀(以将所有锐边修圆磨光)预期会解决该问题。值得注意地，甚至在该密度上，在圆纳米孔和方纳米孔几何形状中在相邻孔中都不存在显著的干扰信号，这确认了可与芯片上蛋白质组技术相比较的密封硅纳米孔中的扩散的有效限制。 [0175] 讨论 [0176] 建立以多重和高通量方式研究蛋白质生物化学性质的平台对于许多不同的生物医学研究领域是重要的。蛋白质微阵列代表一个这样的平台。NAPPA是对常规蛋白质测定的创新型替代并且避开了与蛋白质表达、纯化和贮存在相关的挑战。NAPPA是特别灵活的蛋白质微阵列版式，因为可简单地通过重新排列一系列的编码目标蛋白质的质粒来产生订制的阵列。然而，平面上的转录和翻译使得可在被共点的捕获试剂捕获之前扩散的中间体出现。此外，平面被限定于不具有需要保持在局部的可扩散产物或反应物的测定。 [0177] 在本研究中，我们开发了基于硅纳米孔的蛋白质微阵列平台，其不仅解决了高密度NAPPA中的干扰问题而且还具有在这些纳米反应容器中进行其它生物化学反应的潜能，所述反应在传统平面蛋白质阵列版式上是不可能的。例如，可在每一个孔中直接监控释放荧光产物的酶促测定的动力学或可对展示的蛋白质进行各种翻译后修饰。我们的NAPPA SiNW平台建立在用于基板微制造的成熟半导体工业上。虽然我们的大多数实验使用每标准载玻片8,000个部件的密度(中心间距为375um)，但我们不能预见使密度增加许多倍的任何障碍，并且我们已在具有24,000个部件的阵列上进行了概念验证表达。 [0178] 我们已观察到弯曲的纳米孔内信号强度的少量区域变化。这些变化也在平面上观察到，可能代表在微阵列点的干燥过程中沉淀物的非均匀沉降。其它贡献者可包括在打印过程中纳米孔的不完全充满(这引起一些朝向边缘的信号减弱)和/或因纳米孔的湿刻蚀引起的不均匀表面不规则。 [0179] 材料和方法 [0180] 硅纳米孔的微制造 [0181] 将6英寸直径的硅<100>晶片用作用于产生硅纳米(SiNW)载玻片的起始材料。每一个6英寸晶片在切割后产生每晶片6个载玻片。在将来，更大直径的晶片预期产生每晶片更多数目的载玻片，从而使SiNW载玻片非常便宜。如图25中的示意图所述，将标准半导体加工技术用于制造SiNW载玻片。在Arizona State University Center for Solid State Electronics Research制造硅纳米载玻片。首先在835C利用300nm的LPCVD低应力氮化物涂覆晶片，所述LPCVD低应力氮化物用作用于纳米孔的湿刻蚀的掩模层。随后用1微米厚的AZ3312正性光致抗蚀剂(AZ Electronic Materials Inc)旋转涂覆晶片，随后将其在100C于平底锅上软烘焙2分钟。将具有圆形部件的光刻掩膜用于在OAI光刻掩模对准器上暴露抗蚀剂，以产生具有期望的直径和间距的圆形纳米孔。随后将光致抗蚀剂在AZ300MIF显影剂中显影45秒，在100℃于平底锅上硬烘焙2分钟。使用CHF3-O2等离子体的反应离子刻蚀用于将氮化物膜腐蚀掉，在氮化物层上打开圆形阵列图案。使用丙酮洗掉光致抗蚀剂层。 [0182] 纳米孔的各向同性和各向异性刻蚀 [0183] 相较于各向异性刻蚀，将孔的各向同性刻蚀选择作为优选方法。虽然各向异性刻蚀具有产生高长宽比的孔的有利方面，但其在纳米孔内导致尖锐的刻面和边缘。已观察到压电分配的DNA/质粒混合物和表达的蛋白质都倾向于聚集在这些锐边并且优先结合这些锐边。为了获得孔内相对均匀的蛋白质结合，使用各向同性刻蚀产生半球形弯曲表面。此外，设计刻蚀掩模和刻蚀时间使得在半球的底部产生圆形平底，所述圆底用作分配的DNA/质粒混合物的基板。半球孔的底部的圆形平面相较于倾向于将这些分配的DNA和所得的蛋白质结合聚集在点中央的完全球状变曲底部，具有在平面上将分配的DNA和所得的蛋白质结合均匀分配的有利方面。 [0184] 通过将氢氟酸(49％)、硝酸(70％)和冰醋酸(98％)以2.75:1.75:1的比例混合来制备HNA硅蚀刻剂。所有化学药品获自SigmaAldrich。HNA蚀刻剂是极具侵袭性和腐蚀性的混合物。必需在专门的酸浴中制备，其需要由受过良好培训的人员利用专门的处理法来非常小心地操作。HNA混合物以大约3微米/分钟的速度刻蚀硅。取决于氮化物掩模中的圆形开口的直径，30分钟的硅刻蚀产生深度从60微米变化至80微米的孔。通过在Si(1000)晶片上的氮化物掩模层上形成方形开口图案来产生各向异性锥体状孔(图27f,概念验证的225微米的周期的阵列)，在80℃于30％KOH溶液中进行刻蚀。热KOH是侵袭性化学药品，具有强腐蚀性，需要由受过良好训练的用户来操作。通过各向异性刻蚀产生的锐边可使用两步骤过程，利用HNA各向同性刻蚀步骤、随后利用各向异性刻蚀来变光滑。 [0185] 刻蚀的孔的底部的硅表面在测定过程中、随后步骤的查询检测中淬灭荧光信号。因此热生长用作适当的介电体以及还模拟常规NAPPA阵列的玻璃表面的二氧化硅薄膜。为了该目的，在Piranha混合物(1:1的硫酸与过氧化氢的混合物)中清洗具有刻蚀孔的晶片，随后在缓冲的氧化物腐蚀剂(1:6的HF与NH4F的混合物)中清洗10秒。Piranha混合物和缓冲的氧化物腐蚀剂都是极具侵袭性的化学药品，需要在专门的容器中制备，并且需要由受过良好训练的用户来操作。在Tystar4600氧气炉中在1,000℃热生长厚度为100nm的干氧化物。在氧化物生长后，在热磷酸(185℃)中腐蚀掉掩模氮化物膜。所得的晶片具有涂覆有均匀的100nm的氧化物薄膜的圆形孔，中间间隔半金属硅表面组成的孔。该结构具有从玻璃样氧化物涂覆的孔发射荧光信号的额外优点，然而在孔之间未刻蚀区域中的金属样硅表面淬灭任何荧光发身(图26d中显示的–无密封情况)，从而在荧光成像中提供了良好对比。最后，将晶片切成显微镜载玻片大小，产生用于高密度NAPPA蛋白质阵列的硅纳米孔(SiNW)基板。 [0186] 二氧化硅表面的胺功能化 [0187] 在将DNA/质粒混合物压电分配入纳米孔之前，用氨基-丙基-三乙氧基-甲硅烷(APTES)单层涂覆孔的表面。已显示为了产生NAPPA蛋白质阵列，需要以胺基结束的表面，其用作粘附至分配的DNA/质粒混合物的适当基板。为此目的，首先在Piranha混合物(1:1的H2SO4与H2O2)中清洗SiNW基板进行15分钟。Piranha混合物是强氧化剂，其清除SiNW基板上的任何残留有机材料并且氧化二氧化硅表面以产生硅烷醇(-SiOH)表面终止。随后将SiNW载玻片浸没在2％的丙酮中的APTES的溶液中，进行15分钟，随后在丙酮和DI水中充分漂洗，以产生均匀的单层APTES分子。 [0188] 纳米孔中的高速压电打印 [0189] 使用au302压电分配系统(参见网站engineeringarts.com)，对纳米孔载玻片利用新开发的整合的对准系统来实现压电打印。对准系统由微米角度对准固定装置、下视照相机、机械手和真空盘组成。使用下视照相机在对准固定装置上一次一个地对准纳米孔载玻片，随后利用转移臂将其转移至真空盘。随后可以175mm/秒的头移动“动态”分配置于真空盘中的一排对准的纳米孔载玻片，从而产生使用8个分配头的每秒50个孔的峰速度。每一个纳米孔充满800皮升的打印溶液(cDNA+打印混合物)。在于纳米孔阵列中压电打印cDNA后，将NAPPA SiNW载玻片贮存在干燥密封容器中直至使用的时间。 [0190] DNA制备 [0191] 从Arizona State University,Biodesign Institute,Center Personal Diagnostics,DNASU获得基于T7的哺乳动物表达载体pANT7_cGST或pANT7-nHA中的序列经验证的全长cDNA表达质粒，所述质粒可公共地获得(参见网站dnasu.asu.edu/DNASU/)。如所描述的(30)，进行用于无细胞蛋白质表达的高质量超螺旋DNA的高通量制备。对于蛋白质相互作用测定，使用标准Nucleobond制备法(Macherey-Nagel Inc.,Bethlehem,PA)制备更大量的查询DNA。 [0192] 蛋白质表达 [0193] 如所描述的(9)，进行蛋白质展示。使用Tyramide信号扩增(TSA,Life technologies,Carlsbad,CA)，利用单克隆抗GST抗体(Cell signaling Inc.,Danvers,MA)和HRP-标记的抗小鼠抗体(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)检测展示的蛋白质。 将抗p53单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz,CA)用于p53特异性信号检测来评价扩散。 [0194] 蛋白质相互作用 [0195] 如所描述的(9)，进行蛋白质相互作用。将pANT7-nHA中的FOS基因以1ng/ml的浓度添加至RRL表达混合物。利用基因特异性抗FOS(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)抗体或标签特异性抗体(抗-HA,Convance)，随后利用Alexa fluor标记的第二抗体(Life technologies,Carlsbad,CA)检测结合至阵列上的相互作用伴侣的HA标记的FOS。 [0196] 参考文献 [0197] 1.Gibson,D.S.；Qiu,J.；Mendoza,E.A.；Barker,K.；Rooney,M.E.；Labaer,J.,Circulating and synovial antibody profiling of juvenile arthritis patients by nucleic acid programmable protein arrays.Arthritis Res Ther14,(2),R77. 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[0227] 本发明通过上述说明和实施例来示例。上述说明意欲用作非限定性说明，因为根据这些描述许多变化对于本领域技术人员将变得显然。由此期望包括在所述权利要求的范围和精神内的所有这样的变化。为了所有目的将本文中的每一篇提及的文献通过引用整体并入本文。可在本文中公开的本发明的组合物、方法的操作和安排方面进行改变而不背离本文中定义的本发明的概念和范围。 |
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