신규 타입 Ⅲ 폴리케타이드 합성효소 및 그 응용{NOVEL TYPE III POLYKETIDE SYNTHASE ENZYME AND USE OF THE SAME}
본 발명은 타입III 폴리케타이드의 일종인 찰콘을 생산하는 찰콘 합성효소에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항암물질 활성을 갖는 페닐프로파노이드의 생합성에 중요한 작용을 하는 찰콘 합성효소, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용한 찰콘 합성효소의 발현에 관한 것이다.
폴리케타이드는 박테리아, 곰팡이 그리고 식물로부터 천연으로 PKS 효소에 의해 생성되는 2차 대사산물로서 생물학적이고 약리학적인 활성을 가지고 있다. 또한, 일련의 축합과 후속 변형을 통해 2-탄소 유닛으로부터 합성되는 화합물 종이다. 폴리케타이드는 매우 다양한 구조를 갖는 생리적 활성 분자이고, 그 종은 여러 가지 활성을 갖는 수많은 화합물을 포함한다. 종래의 화학적 방법론에 의해 폴리케타이드 화합물을 생산하는데 어려움이 있었고, 통상적으로 야생형 세포에서 폴리케타이드의 생산율이 낮기 때문에, 이 화합물을 생산하기 위한 보다 효율적이고 향상된 선택적인 방법에 대하여 상당한 관심이 있어왔다. 이러한 관심들로 인해 PKS(POLYKETIDE SYNTHASE) 효소를 코딩하는 유전자의 재조합 DNA 기술을 이용한 클로닝, 분석 및 조작이 수행되었다. 이들 기술로 인해, 다른 방법으로 폴리케타이드를 생산하지 않는 자연 또는 숙주에서 발생하는 것보다 높은 수준으로 PKS에 의해 합성 폴리케타이드를 생산하도록 종래의 PKS 유전자 클러스터를 조작하는 것이 가능하다. 또한 이 기술은, 종래의 PKS 유전자로부터 생산된 폴리펩타이드와 구조적으로 관련되나 성질이 다른 분자를 제공할 수 있다. PKSs는 반복되는, 아실티오에스테르 빌딩 블록간의 디카르복실화 클라이젠 축합을 통해 폴리케타이드의 생합성을 촉매 작용한다. 복합체 폴리케타이드를 형성하기 위해 이용되는 빌딩 블록은 통상적으로 아세틸, 부티릴, 프로피오닐, 말로닐, 히드록시말로닐, 메틸말로닐 및 에틸말로닐 CoA와 같은 아실티오에스테르이다. 그 밖의 빌딩 블록은 아실티오에스테르와 같은 아미노산을 포함한다. 그러한 빌딩 블록에 병합 되는 PKS 효소는 아미노산 리가아제(AMP 리가아제) 또는 비-리보솜의 펩타이드 합성효소(NRPS)로서 기능하는 활성을 포함한다. 그들은 구조에 따라 타입 I, 타입II, 타입III 세 가지 종으로 나눈다. 이들은 그 조성 및 합성되는 폴리케타이드의 합성 방식이 다르다. 통상적으로 타입 I 또는 " 모듈러 (modular)", 타입 II " 반복의 (iterative)" 그리고 타입 III "호모다이머릭 (homodimeric)" PKS 효소라 불린다. 모듈러 PKS라고 불리는 타입 I PKS는 멀티기능적인 효소로서 모듈러 방식으로 폴리케타이드의 합성을 촉진시키며, 그 예로, 타입I 폴리케타이드중의 하나인 마크로라이즈는 멀티모듈라 메가신타제에 의하여 생성된다. 타입 II PKS는 방향성 분자들로서 반복되는 분리된 효소를 통하여 생성하며 멀티효소복합체로서 각 도메인이 하나의 단백질에 위치한다. 이와 반면에 타입 III PKS는 가장 간단한 분자량이 작은 방향성 분자들로 이루어진 PKS인데 하나의 활성부위에서 폴리케타이드의 합성을 반복적으로 실행한다. 타입 III PKS는 구조상으로는 아주 간단하지만 여러 가지 폴리케타이드를 생성하는데 플라보노이드, 찰콘 그리고 알파-페논 아실케타이드 등이 있다. 타입 III PKS가 다양한 폴리케타이드를 생성할 수 있는 원인은 각각 다른 스타터 유닛(지방족 혹은 방향족 아실 CoA)과 확장 유닛(말로닐 혹은 개량 말로닐 CoA)을 선택할 수 있고 신장 사이클 횟수를 통제하여 폴리케타이드의 크기를 조절하며 마지막의 선형의 폴리케타이드를 고리화 할 때에도 여러 가지 패턴(클라이젠 축합, 알돌 축합, 혹은 이종 고리식의 락토나이제이션)을 이용하기 때문이다. 종래에는 고등식물로부터 분리된 타입 III PKS는 미생물로부터의 방어시스템에서 중요한 역할을 하는 식물에만 필요한 2차 대사산물로 알려져 있었다. 그런데 최근에는 소수의 타입 III PKS가 원핵생물에서도 발견되었다. 처음으로 발견된 것은 스트렙토마이세스 그리시어스 ( Streptomyces griseus )로부터의 RppA인데 다섯 개 분자량의 말로닐 CoA를 축합하여 1,3,6,8-테트라하이드록시마프탈렌의 합성을 촉진한다. 다른 박테리아 ( Amycolatopsis orientalis )로부터 발견된 DpgA는 네 개 분자량의 말로닐 CoA를 이용하여 3,5-디하이드록시페닐아세틸 CoA를 생성한다. PKS10과 PKS18은 마이코박테리움 튜버큐로시스 ( Mycobacterium tuberculosis )에서 발견되었는데 이들은 긴 사슬의 아실 CoA들(C 12 -C 20 )로부터 알파-페논들을 생성한다. 또한, 타입 III PKS는 상대적으로 작은 호모다이머릭 단백질로서 그 크기는 40-47kDa이다. 최근들어, 미생물의 게놈 시퀀싱의 영향하에 점점 많은 타입 III PKS가 밝혀지고 있지만 대부분의 타입 III PKS의 기능은 밝혀지지 않았다. 본 본발명은 타입 III PKS 유전자를 함유하고 있는 형질전환체를 이용하여 폴리케타이드 합성효소를 대량 생산하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 첫 번째 목적은 타입 III 폴리케타이드 합성효소를 제공하는 것이다. 본 발명의 두 번째 목적은 상기 타입 III 폴리케타이드 합성효소를 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다. 본 발명의 세 번째 목적은 상기 타입 III 폴리케타이드 합성효소 유전자를 포함한 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다. 본 발명의 네 번째 목적은 형질전환된 재조합 대장균을 포함하는 모든 형질전환 균주를 제공하는 것이다. 본 발명의 다섯 번째 목적은 형질전환된 균주를 이용한 재조합 타입 III 폴리케타이드 합성효소의 발현방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 그 기능적 단편을 가지는 타입 III 폴리케타이드 합성효소를 제공한다. 본 발명의 일 구체예에 있어서 상기 타입 III 폴리케타이드 합성효소는 아스퍼질러스 플라버스에서 유래한 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다. 본 발명의 일 구체 예에 있어서, 본 발명의 상기 효소의 분자량은 44 kDa인 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명은 본 발명의 상기 효소를 코딩하는 타입 III 폴리케타이드 합성효소 유전자를 제공한다. 본 발명의 상기 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제러시 등을 고려하여 서열번호 3에 기재된 서열과 적어도 85% 이상, 바람직하게는 적어도 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 상동성을 가지는 서열이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다. 또한 본 발명은 본 발명의 상기 타입 III 폴리케타이드 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 균주를 배양하여 타입 III 폴리케타이드 합성효소를 제조하는 방법을 제공한다. 또 본 발명은 타입 III 폴리케타이드 합성효소를 생산하는 아스퍼질러스 플라버스를 제공한다. 또 본 발명은 상기 본 발명의 효소를 포함하는 찰콘 제조용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 본 발명의 효소를 4-쿠마로일 CoA, 말로닐 CoA, 카페오일 CoA, 시나오일 CoA, 및 벤조일 CoA로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 기질과 반응하여 찰콘을 생산하는 방법을 제공한다. 이하, 본 발명을 설명한다. 본 발명의 타입 III 폴리케타이드 합성효소는 서열번호 4로 표시되는 아미노산서열을 가진 것을 특징으로 한다. 또, 서열번호 4의 아미노산서열에 대해서, 이들 아미노산서열을 가진 단백질이 표시하는 타입 III 폴리케타이드 합성효소 활성이 손상되지 않는 범위 내에서, 1이상의 아미노산의 결실, 치환 및 부가의 적어도 1종의 변이가 도입된 변이 타입 III 폴리케타이드 합성효소도 본 발명에 관한 타입 III 폴리케타이드 합성효소에 포함된다. 또, 본 발명에는 서열번호 4의 아미노산서열을 가진 타입 III 폴리케타이드 합성효소를 코딩하는 타입 III 폴리케타이드 합성효소 유전자가 포함되고, 그 유전자서열로서는 서열번호 3으로 표시되는 것을 들 수 있다. 또, 이들 서열번호 3의 염기서열을 변이시켜서 얻게 되는 상기한 변이 타입 III 폴리케타이드 합성효소를 코딩하는 변이 타입 III 폴리케타이드 합성효소 유전자도 본 발명에 관한 타입 III 폴리케타이드 합성효소 유전자에 포함된다. 또, 본 발명에는, 상기 타입 III 폴리케타이드 합성효소 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터에 의해서 형질전환된 형질전환체가 포함된다. 또한, 본 발명에는, 이 형질전환체를 배양하여, 얻게되는 배양물로부터 타입 III 폴리케타이드 합성효소를 분리하는 것을 특징으로 하는 타입 III 폴리케타이드 합성효소의 제조방법이 포함된다. 이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 본 발명의 타입 III 폴리케타이드 합성효소 유전자는 아스퍼질러스 플라버스의 균체로부터 분리된 것이다. 먼저, 타입 III 폴리케타이드 합성효소 유전자를 가진 균주로부터 mRNA를 취득한다. 다음에, 설계한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하고, 아스퍼질러스 플라버스 mRNA를 주형으로 해서 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 행하여, 타입 III 폴리케타이드 합성효소 유전자를 부분적으로 증폭한다. 이와 같이 해서 얻게 된 PCR 증폭 단편은 아스퍼질러스 플라버스 균주의 타입 III 폴리케타이드 합성효소 유전자에 100% 가까운 상동성을 가진 단편으로서, 콜로니하이브리디제이션을 행할 때의 프로브로서 높은 S/N비를 기대할 수 있는 동시에, 하이브리디제이션의 스트린전시 (stringency)제어를 용이하게 한다. 상기의 PCR 증폭 단편을 적당한 시약을 사용해서 표지하고, 상기 염색체 DNA라이브러리에 대해서 콜로니 하이브리디제이션을 행하여, 타입 III 폴리케타이드 합성효소 유전자를 선발한다 (Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 603페이지, 1994년). 상기의 방법에 의해 선발된 대장균으로부터 알칼리법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 161페이지, 1994년)을 사용해서 플라스미드를 회수함으로써, 타입 III 폴리케타이드 합성효소 유전자를 함유하는 DNA단편을 얻을 수 있다. 또한, 상기 방법에 의해 염기서열을 결정한 후에는, 상기 염기서열을 가진 DNA단편의 제한효소에 의한 분해에 의해 조제한 DNA단편을 프로브로 해서 하이브리다이즈함으로써 본 발명의 전체 유전자를 얻는 것이 가능하다. 서열번호 3에는 본 발명의 타입 III 폴리케타이드 합성효소 유전자의 염기서열을 서열번호 4에는 상기 유전자가 코딩하는 아미노산서열을 표시한다. 본 발명의 형질전환된 미생물은, 본 발명의 재조합벡터를, 상기 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주 속에 도입함으로써 얻게 된다. 예를 들면 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우는, 본 발명에 관한 재조합벡터는, 그 자신이 숙주속에서 자율복제 가능한 동시에, 프로모터, 타입 III 폴리케타이드 합성효소 유전자를 함유하는 DNA 및 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 가진 것임이 바람직하다. 본 발명에 사용된 발현벡터로서는 pET28a를 사용하였으나 상기의 요건을 만족하는 발현벡터이면 어느 것이나 사용가능하다. 본 발명에 관한 타입 III 폴리케타이드 합성효소의 제조는, 이것을 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물(배양균체 또는 배양상청액)속에 유전자 산물인 타입 III 폴리케타이드 합성효소를 생성 축적시켜, 배양물로부터 효소를 취득함으로써 행하여진다. 타입 III 폴리케타이드 합성효소의 취득 및 정제는, 얻게 되는 배양물중으로부터, 균체 또는 상청액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피 등을 단독으로 또는 조합함으로써 행할 수 있다. 본 발명자는 높은 수율로 찰콘을 생산할 수 있는 효소를 개발하고자 아스퍼질러스 플라버스로 부터 타입 III 폴리케타이드 합성효소의 유전자를 클로닝하였다. 본 발명은 산업적으로 유용한 찰콘을 제조하기 위하여 아스퍼질러스 플라버스의 유전자로부터 타입 III 폴리케타이드 합성효소를 암호화하는 유전자를 클로닝하고, 전기 유전자의 염기서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 분석한다. 본 발명의 타입 III 폴리케타이드 합성효소는 4-쿠마로일 CoA와 말로닐 CoA를 기질로 하여 생합성 반응을 촉매하여 찰콘을 형성하는 효소로서, 보다 바람직하게는 생합성에 대한 특이성을 갖고 4-쿠마로일 CoA와 말로닐 CoA로부터 찰콘을 생성할 수 있는 능력을 갖는 타입 III 폴리케타이드 합성효소를 의미한다. 본 발명의 타입 III 폴리케타이드 합성효소는 다음의 특징을 갖는다:(i) 분자량이 약 44 kDa; (ii) pH6.8일 때 최대 효소활성이 나타난다. 기존에 알려진 타입I 폴리케타이드 합성효소는 대장균에서 높은 발현율을 보이고 있지만 타입 III 폴리케타이드 합성효소는 그렇지 못하다. 그러나 본 발명의 타입 III 폴리케타이드 합성효소는 높은 수율의 발현률을 가진다. 따라서 높은 발현율을 가지는 타입 III 폴리케타이드 합성효소를 생산하는 본 발명은 매우 특이하다 할 것이며, 앞으로 찰콘생산에 유용하게 적용될 것이다. 또한, 지금까지 폴리케타이드의 가치있는 약리적 특성이 주어졌을 때, 자연에서 발견되지 않는 관련 화합물의 생산에 대한 요구 뿐 아니라 대량의 폴리케타이드를 생산하기 위한 방법 및 약제에 대한 요구가 있었다. 본 발명은 아스퍼질러스 플라버스( Aspergillus flavus )로부터 발견된 찰콘 합성효소의 특성에 대하여 제공한다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 타입 III 폴리케타이드 합성효소는 높은 수율의 발현률을 가지며, 따라서 찰콘생산에 유용하게 적용될 것이다. 또한 본 발명은 대량의 폴리케타이드를 생산하기 위한 용도 및 약제에 대한 요구를 충족시킬 수 있을 것이다. 또한 찰콘 합성효소를 코딩하는 재조합 벡터 함유의 숙주 세포를 찰콘의 생산에 이용할 수 있다. 재조합 DNA 구성물을 약리적 수의적 생성물로서 응용할 수 있는 다양하게 다른 폴리케타이드와 재조합 폴리케타이드 합성효소를 생산하는데 이용할 수 있다.
도 1은 타입III 폴리케타이드 합성효소로부터 찰콘의 합성과정을 표시한 것이다.
도 2는 아스퍼질러스 플라버스 mRNA 내에서 타입III 폴리케타이드 합성효소를 지닌 단편의 서어던 하이브리다이제이션(southern hybridization) 결과를 나타낸 도면으로, lane 1, 2, 3, 4는 각각 제한효소 BamHI, EcoRI, HindIII, PstI 등을 처리한 것이다.
도 3은 벡터 pET28a-CHS의 벡터맵으로 아스퍼질러스 플라버스 mRNA내에서 타입III 폴리케타이드 합성효소 유전자를 지니고 있는 단편을 찾아 대장균에서 이용되는 발현벡터의 제조방법을 나타내는 도면이다.
도 4는 아스퍼질러스 플라버스 균주로부터 유래된 타입III 폴리케타이드 합성효소의 SDS-PAGE 젤 사진이다.
도 5는 아스퍼질러스 플라버스 균주로부터 유래된 타입III 폴리케타이드 합성효소를 이용한 반응시간에 따른 찰콘의 농도의 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 아스퍼질러스 플라버스 균주로부터 유래된 타입III 폴리케타이드 합성효소를 이용한 pH에 따른 찰콘의 농도의 변화를 나타낸 것이다.
도 7은 아스퍼질러스 플라버스 균주로부터 유래된 타입III 폴리케타이드 합성효소의 동역학적 매개변수를 나타낸 도면이다.
실시예 1: 찰콘 합성효소 생산균의 선별 박테리아와 식물성 찰콘 합성효소는 이미 많이 발견되었고 또 효소의 특성도 규명이 되었지만 곰팡이로부터 알려진 찰콘 합성효소는 많지 않다. 찰콘합성효소를 생산하는 곰팡이 균주를 분리하기 위하여 약 120여 종의 버섯 균을 100ml의 potato dextrose broth 배지에 접종한 뒤 27 ℃에서 3일간 배양하였다. 배양액을 30KDa viva-spin(sartorius,독일)을 이용하여 100배 농축하여 각각 20ug의 효소를 기질인 4-쿠마로일 CoA와 말로닐 CoA를 넣고 인산칼륨 완충용액에서 반응 시켰다. 그 다음 에틸에스테르를 이용하여 생성물을 추출하고 다시 에틸에스테르를 완전히 증발시킨 다음 생성물을 200l의 메탄올에 다시 녹여 고성능액체크로마토그래피 (HPLC)로 분석을 하였다. 그 중에서 가장 많은 찰콘을 생성한 균주를 선별하였다. 실시예 2: 균주의 동정 실시예 1에서 분리한 균주의 동정을 위하여 한국미생물 보존센터에서 ITS-5.8S rDNA 서열을 분석하였다. 분리된 균주의 ITS-5.8S rDNA 서열은 서열번호 5에 나타내었다. 상기 균주의 ITS-5.8S rDNA 서열의 유사종과의 유연관계를 분석한 결과 아스퍼질러스 플라버스( Aspergillus flavus )로 동정되었다. 상기 균주는 아스퍼질러스 플라버스( Aspergillus flavus ) KACC 93105P로 명명하였고, 대한민국 경기도 수원시 권선구 서둔동 소재 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2010년 5월 26일 기탁번호 KACC 93105P호로 부다페스트조약에 의거하여 국제 기탁하였다. 실시예 3: 아스퍼질러스 플라버스로부터 신규 타입 III 폴리케타이드 합성효소 유전자의 클로닝 타입 III 폴리케타이드인 찰콘을 합성하는 효소인 찰콘 합성효소 유전자의 염기서열을 얻기 위해 아스퍼질러스 플라버스를 사용하였다. 일반적으로 유사한 기능을 지니는 유전자의 경우에는 각 염기서열과 크기가 어느 정도 유사하다고 알려져 있다. 따라서 아스퍼질러스 플라버스의 찰콘 합성효소의 유전자도 약 1.1kb정도의 크기를 지녔을 것으로 추정하고 다른 균의 이미 알려진 찰콘 합성효소 염기서열을 바탕으로 아스퍼질러스 플라버스의 찰콘 합성효소 전체 유전자를 클로닝하였다. 클로닝에는 대장균 DH5α(NEB, 영국)와 pUC19, pET28a 벡터(NEB, 영국)를 사용하였다. 대장균의 배양 배지로는 일반적 조성의 LB 배지(Difco, 미국)를 사용하였고, 아스퍼질러스 플라버스의 배양에는 상기 감자한천배지 (Potato dextrose agar)를 사용하였다. 대장균의 평판(plate) 배지로는 각각 LB 아가(agar) (Difco, 미국)와 35% 설탕 (Difco, 미국), 0.30.5% 쇠고기 추출물 (Difco, 미국), 0.91.1% 박토 펩톤 (Difco, 미국), 1.31.7% 아가 조성의 아가 플레이트를 사용하였다. 필요에 따라 100 ㎍/ml 엠피실린(amipicillin) (Sigma, 미국)과 50 ㎍/ml 카나마이신(kanamycin)(Sigma, 미국)을 첨가하였다. 배양 방법은 아스퍼질러스 플라버스의 경우, 배지 50 ml이 들어 있는 250 ml의 삼각 플라스크에 접종하여 25℃, 150 rpm 조건에서 3일간 배양하였고, 대장균의 경우에는 37℃, 200 rpm 조건에서 16 시간 배양하였다. 대부분의 DNA는 아가로스겔(TAE buffer, 0.5%) 전기영동법으로 확인하였고, 겔 상에서 DNA 밴드의 정제는 QiaXII 겔 추출장지(QIAGEN, USA)를 이용하였으며, DNA간의 연결(ligation) 반응은 T4 DNA 연결효소(NEB)를 이용하였다. 또한 아스퍼질러스 플라버스의 mRNA 추출은 Qiagen plant mRNA extraction kit(QIAGEN)을 이용하였으며, cDNA 합성을 위한 역전사 효소는 Oligo-dT RT-mix(intron)를 이용하였다. 아스퍼질러스 플라버스의 찰콘 합성효소 유전자의 일부분을 증폭하기위해 다른 균에서 이미 알려진 찰콜 합성효소 염기서열을 바탕으로 비특이적 프라이머(degenerated primer), ReCHS F-5'-GMA GCG NHT NYY RNN YKG SVK KCN NDR NMT-3' (서열번호 1)와 ReCHS R-5'-CRD YTC YRH BGW VAD RCC SGG BCC DAR BGC-3' (서열번호 2)를 제작하였다. 이를 이용하여 연쇄중합반응에 의해 611bp 크기에 해당하는 찰콘 합성효소 유전자 일부를 아스퍼질러스 플라버스의 cDNA에서 증폭하였다. 그리고 증폭된 상기의 부분 염기서열 중 그 절단 부위가 존재하지 않는 제한 효소인 BamHI, EcoRI, HindIII, PstI을 이용하여 아스퍼질러스 플라버스의 cDNA를 완전히 절단하였다. 그리고 앞서 중합효소 연쇄반응을 통하여 얻은 DNA 단편을 이용하여 방사능 표지된 탐침자(probe)를 만들었다. 이를 이용하여 서어던 하이브리다이제이션으로 찾고자 하는 유전자를 지닌 DNA 단편을 탐색하였다(도 2). BamHI, EcoRI으로 염색체를 자른 경우에 있어서는 서어던 하이브리다이제이션의 결과 나타난 찰콘 합성효소의 유전자를 지닌 DNA의 크기가 큰 관계로 이용하지 않았고, 2.0kb 정도의 PstI으로 잘린 조각과 약 2.5 kb정도의 HindIII으로 잘린 조각을 이용하여 원하는 유전자를 탐색하였다. 라이조비움 에틀리 염색체를 PstI으로 절단한 후 분리한 2.0kb 정도 크기의 cDNA 조각과 HindIII으로 절단한 2.5kb 정도의 cDNA 단편들을 pUC19에 클로닝하고 이를 pUC19-CHS라고 명명하였다. pUC19-CHS 라이브러리에서 앞서 만든 611bp 크기의 탐침자를 이용하여 콜로니 혼성화를 수행하여 원하는 찰콘 합성효소의 유전자를 지닌 클론을 결정하였다. 그리고 결정한 클론을 이용하여 염기서열을 분석하여 찰콘 합성효소의 전체 유전자 염기서열 1,209bp를 밝혔다 (서열번호 3). 이는 앞서 예상한 바와 같이 다른 여러 균에서 밝혀진 찰콘 합성효소 유전자와 크기가 비슷하였다. 또한 아스퍼질러스 플라버스의 찰콘 합성효소는 다른 찰콘 합성효소에서 공통적으로 나타나는 염기서열을 지니고 있음을 확인하였다. 실시예 4: 재조합 발현 벡터 및 재조합 균주 제조 실시예 3에 따른 찰콘 합성효소를 암호화하는 유전자를 이용하여, 전기 찰콘 합성효소를 대장균에서 대량으로 발현시키기 위하여, 발현 벡터 pET28a (ATCC, 미국) BamHⅠ과 Hind III 부위에 상기 효소 유전자를 삽입한 후 대장균 BL21(DE3)(NEB, 영국)에 형질 전환시켰다 (도 3). 실시예 5: 재조합 찰콘 합성효소의 발현 및 순수 분리 상기 실시예 4에서 제조된 재조합 균주를 LB 배지에 접종하고 하룻밤 배양하고, 37℃에서 2시간 동안 배양한 다음 0.5mM IPTG (sigma, 미국)를 첨가하여 16시간 발현시킨 뒤 SDS-PAGE 젤에서 발현된 단백질을 확인하였다 (도 4). 상기 실시예 5의 방법으로 발현시킨 재조합 찰콘 합성효소를 정제하기 위하여, 재조합 균주 배양액을 원심분리 (8000×g, 10분)하여 균체만을 모은 후, 초음파로 처리하여 대장균의 세포벽을 파쇄하고, 20,000×g에서 20분간 원심분리 하여 침전물(균체)을 제거하고 상등액을 수득하였다. 이어, 상기 상등액을 70℃에서 15분간 열처리하고, 20,000×g에서 20분간 원심분리하여 침전물을 제거한 후, 상등액을 수득한 후, 최종적으로 Ni-NTA (QIAGEN, 네덜란드)을 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여, 재조합 찰콘 합성효소를 순수 분리하였다. 실시예 6: 재조합 찰콘 합성효소의 특성 실험 상기 실시예 5에서 분리된 찰콘 합성효소의 물리 화학적 특성을 조사하였으며, 기질로서 4-쿠마로일 CoA와 말로닐 CoA를 사용하였다. 실시예 6-1: 찰콘 합성효소반응 측정방법 상기 실시예 5의 방법으로 정제한 재조합 찰콘 합성효소의 반응을 측정하기 위하여 다음과 같은 조건에서 수행하였다. 인산칼륨 완충용액에 기질인 4-쿠마로일 CoA와 말로닐 CoA를 넣고 30℃에서 예열을 한 다음 20g의 효소를 넣고 원하는 시간만큼 반응을 시킨 다음 50l의 20% HCL을 넣어 반응을 정지시킨다. 그 다음 에틸에스테르를 이용하여 생성물을 추출하고 다시 에틸에스테르를 완전히 증발시킨 다음 생성물을 200l의 메탄올에 다시 녹여 고성능액체크로마토그래피 (HPLC)로 분석을 한다. 실시예 6-2: 찰콘 합성효소의 최적 기질농도 기질인 4-쿠마로일 CoA나 말로닐 CoA의 양이 너무 많으면 효소반응을 억제한다고 알려져 있기에 찰콘 합성효소의 최적 기질농도는 다른 논문들의 수치를 참조하여 결정하였다. 4-쿠마로일 CoA는 10M, 말로닐 CoA는 30M이상일 때 억제역할을 한다고 알려져 있기 때문에 본 발명에서는 4-쿠마로일 CoA는 10M, 말로닐 CoA는 20M을 사용하였다. 실시예 6-3: 찰콘 합성효소의 최적 반응시간 상기 실시예 4에서 제조한 찰콘 합성효소를 삽입한 대장균 BL21(DE3)를 이용하여 찰콘 합성효소의 효소반응실험을 다음과 같은 조건에서 수행하였다. 찰콘 합성효소의 반응시간을 변화시키면서 찰콘 합성효소의 최적 반응 시간을 확인하였다. 효소 정제 방법은 실시예 5에서와 같이 수행하였으며, 10uM의 4-쿠마로일 CoA 용액에서 0-20 분까지 찰콘의 생산을 확인하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 반응 시간 10분 까지는 찰콘의 생산이 증가 되지만 10분이 지난 후에는 더 이상 생산량이 증가되지 않음을 관찰할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 찰콘 생산 방법에서 효소와의 반응시간은 10분임을 알 수 있었다. 실시예 6-4: 찰콘 생산을 위한 최적 pH 상기 실시예 4에서 제조한 찰콘 합성효소를 삽입한 대장균 BL21(DE3)를 이용하여 찰콘 합성효소의 효소반응실험을 다음과 같은 조건에서 수행하였다. 본 발명에서, 효소 반응시 pH를 변화시키면서 최적 pH를 확인하였다. 효소 정제 방법은 실시예 5와 같이 수행하였으며, 10uM의 기질 용액에서 30℃의 온도 하에서 효소반응을 시키며, pH 6.0-8.0까지 변화 시키면서 찰콘의 생성을 확인하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, 초기 pH를 6.8로 유지하였을 때, 찰콘의 생성이 가장 높았다. 따라서 본 발명의 찰콘 합성효소의 최적 초기 pH는 6.8임을 알 수 있었다. 실시예 6-5: 최적 조건에서의 아스퍼질러스 플라버스 유래 신규 타입 III 폴리케타이드 찰콘 합성효소의 효소반응 신규 타입 III 폴리케타이드 찰콘 합성효소를 이용한 최대 찰콘 생산을 하기 위하여 상기의 최적 조건에서 생산 실험을 수행하였다.10uM의 기질 용액, 30℃, 초기 pH 6.8에서 찰콘의 생산실험을 수행하였으며, 그 결과는 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이, 찰콘 합성효소의 Vmax는 0.001825 umolmin -1 mg -1 이고 Km은 0.008003uM이다. 따라서 본 발명의 찰콘 합성효소의 활성은 기존의 효소에 비해 우수한 활성을 가지고 있다.
농업생명공학연구원 KACC93105 20100526
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> NOVEL TYPE III POLYKETIDE SYNTHASE ENZYME AND USE OF THE SAME <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gmagcgnhtn yyrnnykgsv kkcnndrnmt 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 crdytcyrhb gwvadrccsg gbccdarbgc 30 <210> 3 <211> 1206 <212> DNA <213> Aspergillus flavus <400> 3 atggcgccct taattcatgg tacccctccg ccggagatca gaaaccataa tgatgactct 60 ttatcaaagc gtgccatctc cgttgttgga acgggcgccc attatcctcc ccatgagctc 120 cgatctgacg aactggaaaa gctaatttca gcattccacg atccgaacga cccagttgta 180 cgaaagaccc tttacgttaa tgaaaagtca agaatacaaa ctcgtcgtac cgctgtgccg 240 ttcgacgacc ccttctggag tgaccccaag ctaccagata tcgctgaatg tgatgtcctg 300 ttcagaaaat atggtgtccc agtcgcagaa gaggcagcga ggaaagcgct tgcggactgg 360 aatggttctt tcaacgatct tactcatgtt gtcgtagtta catgtacaaa cacagccaac 420 ccaggattag actacatgat ttgtgagaga ctaggtctcc gaaaaaatgt gcaacgcact 480 ctcctccatg gagttggctg cgcagggggt gccgctgctc tacgg acggc aaatgagctt 540 cttcttgggg cggcctttca agggaagcca ggaagagcgc ttgttgttgc atgcgaaatt 600 tgtatgatct ttttccgctc aatgctcgaa gacattgtca aagcccaaga agcaaacgtt 660 gcaatgaccc ttttcggtga tggtgccggt gctatggtgc tgagcaatgg gatttgccct 720 aaaacctctg aacgagctcc tctctggaat attctgaatt gtcgcacaac cctcctcgag 780 gattctgctt ccagcatcca gttcaacatc cgcccgcacg gatacgatcc agtgattacg 840 aaggaagtcc ccgggcagac atctgcggcg ctcccttccg gctttcagga ccttatatcg 900 tctaccccct cactatattc agacaaatct aatttcgacc cctcttcata tgactgggcg 960 ttacatccgg gaggttacag tatcgctatt cttgcgcaga atgccctggg tattacggaa 1020 caccatttgc gaaagaccta tgaggtttat cggtcgaggg gaaatactag ctcgagcact 1080 gtcataagcg tcattaacga gcttgcgagg gaacaaggca cctccgaatc tggacgagat 1140 aaagtgattg ttgcggcctt tggacccggc attaccatgg aattggcggt catggctcgg 1200 ccggcc 1206 <210> 4 <211> 402 <212> PRT <213> Aspergillus flavus <400> 4 Met Ala Pro Leu Ile His Gly Thr Pro Pro Pro Glu Ile Arg Asn His 1 5 10 15 Asn Asp Asp Ser Leu Ser Lys Arg Ala Ile Ser Val Val Gly Th r Gly 20 25 30 Ala His Tyr Pro Pro His Glu Leu Arg Ser Asp Glu Leu Glu Lys Leu 35 40 45 Ile Ser Ala Phe His Asp Pro Asn Asp Pro Val Val Arg Lys Thr Leu 50 55 60 Tyr Val Asn Glu Lys Ser Arg Ile Gln Thr Arg Arg Thr Ala Val Pro 65 70 75 80 Phe Asp Asp Pro Phe Trp Ser Asp Pro Lys Leu Pro Asp Ile Ala Glu 85 90 95 Cys Asp Val Leu Phe Arg Lys Tyr Gly Val Pro Val Ala Glu Glu Ala 100 105 110 Ala Arg Lys Ala Leu Ala Asp Trp Asn Gly Ser Phe Asn Asp Leu Thr 115 120 125 His Val Val Val Val Thr Cys Thr Asn Thr Ala Asn Pro Gly Leu Asp 130 135 140 Tyr Met Ile Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Lys Asn Val Gln Arg Thr 145 150 155 160 Leu Leu His Gly Val Gly Cys Ala Gly Gly Ala Ala Ala Leu Arg Thr 165 170 175 Ala Asn Glu Leu Leu Leu Gly Ala Ala Phe Gln Gly Lys Pro Gly Arg 180 185 190 Ala Leu Val Val Ala Cys Glu Ile Cys Met Ile Phe Phe Arg Ser Met 195 200 205 Leu Glu Asp Ile Val Lys Ala Gln Glu Ala Asn Val Ala Met Thr Leu 210 215 220 Phe Gly Asp Gly Ala Gly Ala Met Val Leu Ser Asn Gly Ile Cys Pro 225 230 235 24 0 Lys Thr Ser Glu Arg Ala Pro Leu Trp Asn Ile Leu Asn Cys Arg Thr 245 250 255 Thr Leu Leu Glu Asp Ser Ala Ser Ser Ile Gln Phe Asn Ile Arg Pro 260 265 270 His Gly Tyr Asp Pro Val Ile Thr Lys Glu Val Pro Gly Gln Thr Ser 275 280 285 Ala Ala Leu Pro Ser Gly Phe Gln Asp Leu Ile Ser Ser Thr Pro Ser 290 295 300 Leu Tyr Ser Asp Lys Ser Asn Phe Asp Pro Ser Ser Tyr Asp Trp Ala 305 310 315 320 Leu His Pro Gly Gly Tyr Ser Ile Ala Ile Leu Ala Gln Asn Ala Leu 325 330 335 Gly Ile Thr Glu His His Leu Arg Lys Thr Tyr Glu Val Tyr Arg Ser 340 345 350 Arg Gly Asn Thr Ser Ser Ser Thr Val Ile Ser Val Ile Asn Glu Leu 355 360 365 Ala Arg Glu Gln Gly Thr Ser Glu Ser Gly Arg Asp Lys Val Ile Val 370 375 380 Ala Ala Phe Gly Pro Gly Ile Thr Met Glu Leu Ala Val Met Ala Arg 385 390 395 400 Pro Ala <210> 5 <211> 333 <212> DNA <213> Aspergillus flavus <400> 5 aaatgcgata actagtgtga attgcagaat tccgtgaatc atcgagtctt tgaacgcaca 60 ttgcgccccc tggtattccg gggggcatgc ctgtccgagc gtcattgctg cccatcaagc 120 acggcttgtg tgttgggtcg tcgtcccctc tccggggggg acgggcccca aaggcagcgg 180 cggcaccgcg tccgatcctc gagcgtatgg ggctttgtca cccgctctgt aggcccggcc 240 ggcgcttgcc gaacgcaaat caatcttttt ccaggttgac ctcggatcag gtagggatac 300 ccgctgaact taagcatatc aataagcgga gga 333 |
