[0001] 本发明涉及表达2-羟基异丁酰-辅酶A变位酶的氢氧细菌(knallgasbacterium)或产乙酸细菌，用于生产2-羟基异丁酸的方法，包括在水性介质中使氢氧细菌或产乙酸细菌与包含氢气和二氧化碳的混合气体混合物接触，以及氢氧细菌或产乙酸细菌在2-羟基异丁酸生产中的用途。

[0002] 日渐增长的全球人口和全世界提高的生活标准不可避免地加强了人们一方面对于商品和服务的需求和另一方面对可持续发展以及对自然和地球资源的慎重处置的需要之间的冲突。未来不仅仅是化石碳源会变得有限，而且目前被处置和勘探的地点的可及性也会越来越受到阻碍。已知的事故极大地证明了这种危险，例如最近在墨西哥湾的石油灾难。白色生物科技提供了一种优雅的方式来提供替代物，这不仅仅是因为微生物或细胞组分的应用，还因为广谱的新一代可再生基质的应用。

[0003] 很久以来，化学工业已在生物技术工艺中批量规模生产，例如醇类和有机酸，主要是用作化学品，尤其是作为能源载体。其中生物乙醇是构成现代机动车辆燃料的近期要素，并且生物丁醇也在考虑范围内。基于批量规模能源载体生产的知识，最近意图设想将平台化学品延伸至更广泛的应用。特别尝试合成化学品如1,3-丙二醇，琥珀酸盐，葡萄糖酸或柠檬酸。同样地，2-羟基异丁酸(2-HIB)也很适合该方案，因为它正发展成为平台化学品。®
特别是，由于2-HIB可被用作甲基丙烯酸（一种重要产品如Plexiglas 的合成所需要的单体化合物）的前体，并且可被用作涂层材料，涂料和粘合剂的重要组分。

[0004] 通常，传统的生物技术工艺，例如用于生物乙醇生产的工艺，是基于所谓的第一代的碳源，即直接来源于植物的碳水化合物如糖或淀粉。但事实证明，这种资源是有限的，它们似乎更适合于生产食品而不是化工产品。

[0005] 现有技术教导了2-HIB生产的生物技术路线。例如，PCT/EP2009/055089教导了已被基因修饰，以致于与其野生型相比能够生产更多2-羟基异丁酸或更多含有2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基脂肪酸酯的细胞，其特征在于2-羟基异丁酸或含有2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基脂肪酸酯的生产以乙酰乙酰基-辅酶A作为中间产物并以3-羟基丁酰-辅酶A作为前体。但是， 2-HIB的生产工艺考虑使用含碳水化合物的碳水化合物(carbohydrate-containing carbohydrates)或其衍生物，例如葡萄糖酸钠，从环境的角度来说这应当被避免。而且，在所述碳水化合物的生产中所消耗的二氧化碳的很大比例并不被转化为所需的产物2-HIB，而是在通向2-HIB的过程中的各种代谢途径中丧失了。

[0006] 因此，本发明所基于的问题是发明一种生产2-HIB的工艺，其能在缺少高能有机化合物的条件下进行。而且，本发明所基于的问题是发明一种2-HIB生产的生物技术路线。而且，本发明所基于的问题是发明一种用于2-HIB生产的生物技术方法，其与现有技术工艺相比的优越之处在于所获得的2-HIB中有更多的碳原子来源于二氧化碳分子，即，来自于二氧化碳，而不是来自于其它任何有机分子（例如醇类或碳水化合物）的碳原子的比例更高。

[0007] 本发明所基于的问题由所附权利要求的主题解决。

[0008] 在第一方面，本发明所基于的问题由表达2-羟基异丁酰-辅酶A变位酶的氢氧细菌或产乙酸细菌解决。

[0009] 在第一方面的第一实施方案中，细菌被基因修饰以使得它与各自的野生型菌株相比，具有降低的合成聚羟基丁酸酯的能力。

[0010] 在第一方面的第二实施方案中，其也是第一实施方案的一个实施方案，细菌具有聚羟基丁酸酯合成酶基因敲除。

[0011] 在第一方面的第三实施方案中，其也是第一至第二实施方案的一个实施方案，细菌不能合成聚羟基丁酸酯。

[0012] 在第一方面的第四实施方案中，其也是第一至第三实施方案的一个实施方案，细菌是选自包含甲烷细菌(Methanobacterium)、醋酸杆菌(Acetobacterium)、脱硫弧菌(Desulfovibrio)、脱硫单胞菌(Desulfomonas)、副球 菌(Paracoccus)、无色杆菌(Achromobacter)、产碱杆菌(Alcaligenes)、假单胞 菌(Pseudomonas)、诺卡氏菌(Nocardia)和贪铜菌(Cupriavidus)的组的氢氧细菌，且优选是贪铜菌(Cupriavidus)菌株，最优选是钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator) H16，或者是选自包含梭菌(Clostridium)、穆尔氏菌(Moorella) 和厌氧醋菌 (Acetoanaerobium)、醋酸杆菌(Acetobacterium)、古球菌(Archaeoglobus)、丁酸杆菌(Butyribacterium)、Carboxydibrachium、Carboxydocella、一氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus)、柠檬酸杆菌(Citrobacter)、脱硫肠状菌(Desulfotomaculum)、真细菌(Eubacterium)、甲烷八叠球菌(Methanosarcina)、甲烷嗜热杆菌(Methanothermobacter)、产醋杆菌(Oxobacter)、消 化 链 球 菌(Peptostreptococcus)、红 假 单 胞 菌(Rhodopseudomonas)、红 螺 菌(Rhodospirillum)、红长命菌(Rubrivivax)、Thermincola、热球菌(Thermococcus)、热石杆菌(Thermolithobacter)、嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter)和Thermosyntrophicum的组的产乙酸细菌。

[0013] 在第一方面的第5实施方案中，其也是第一至第四实施方案的一个实施方案，细菌表达包含SEQ ID NO 1的核酸或其变体或由所述核酸编码的多肽或所述多肽的变体，并且表达包含SEQ ID NO 2的核酸或其变体或由后一种核酸编码的多肽或后一种多肽的变体。

[0014] 在第一方面的第6实施方案中，其也是第一至第5实施方案的一个实施方案，细菌除了表达2-羟基异丁酰-辅酶A变位酶外，还表达MeaB蛋白，由SEQ ID NO 3编码的多肽或其变体。

[0015] 在第一方面的第7实施方案中，其也是第一至第6实施方案的一个实施方案，细菌表达，细菌能够合成3-羟基丁酰-辅酶A。

[0016] 在第一方面的第8实施方案中，其也是第一至第7实施方案的一个实施方案，细菌表达，细菌表达β-酮硫酶和乙酰乙酰基-CoA还原酶。

[0017] 在第二方面，本发明所基于的问题由2-羟基异丁酸的生产方法解决，该方法包括a) 在水性介质中使根据权利要求1-9任一项的氢氧细菌或产乙酸细菌与包含氢气和二氧化碳的气体混合物接触。

[0018] 在第二方面的第一实施方案中，气体混合物中氢气的分压为0.1-100巴，更优选0.2-10巴，最优选0.5-4巴，而二氧化碳分压为0.03-100巴，更优选0,05-1巴，最优选
0.05-0.3巴。

[0019] 在第二方面的第二实施方案中，其也是第一实施方案的一个实施方案，细菌耐受氧的存在，且水溶液是有氧的。

[0020] 在第二方面的第三实施方案中，其也是第一至第二实施方案的一个实施方案，细菌耐受氧的存在，且气体混合物除了氢气和二氧化碳之外，还包含氧气，并且气体混合物中氧气的分压优选是0.03-10巴，更优选0.04-1巴，最优选0.04-0.5巴。

[0021] 在第二方面的第四实施方案中，其也是第一至第三实施方案的一个实施方案，水性介质不包含碳水化合物，或优选不包含除二氧化碳之外的任何碳源。

[0022] 在第二方面的第5实施方案中，其也是第一至第四实施方案的一个实施方案，步骤a)在缺乏除碳以外的其它生长限制营养素的条件下进行。

[0023] 在第二方面的第6实施方案中，其也是第一至第5实施方案的一个实施方案，步骤a)在20-37℃，更优选25-35℃，最优选在28-32℃进行。

[0024] 在第三方面，本发明所基于的问题由根据本发明的任意方面或实施方案的氢氧细菌或产乙酸细菌在生产2-羟基异丁酸中的用途解决。

[0025] 本发明是基于这样的令人惊讶的发现：表达2-羟基异丁酰-辅酶A变位酶的氢氧细菌或产乙酸细菌可被用于生产2-HIB。

[0026] 而且，本发明是基于这样的令人惊讶的发现：可以通过这种方式增加这种工艺的产量：对于2-HIB的生产，使用表达2-羟基异丁酰-辅酶A变位酶的氢氧细菌或产乙酸细菌，其与各自的野生型菌株相比，具有降低的合成聚羟基丁酸酯的能力。

[0027] 而且，本发明基于这样的令人惊讶的发现：可以通过这种方式增加这种工艺的产量：对于2-HIB的生产，使用表达2-羟基异丁酰-辅酶A变位酶的氢氧细菌或产乙酸细菌，并经受除了缺乏碳源之外的生长限制条件。

[0028] 本发明集中于表达2-羟基异丁酰-辅酶A变位酶的氢氧细菌或产乙酸细菌的用途。这些细菌通常具有代谢包含氢气和二氧化碳的混合物以生成有机化合物的能力。

[0029] 本发明考虑野生型和基因修饰的产乙酸细菌或氢氧细菌的用途。在优选的实施方案中，本文使用的术语“产乙酸细菌”指能够利用Wood-Ljungdahl途径，即将一氧化碳，二氧化碳和氢气转化为乙酸盐的途径的细菌。在优选的实施方案中，Wood-Ljungdahl途径中涉及的至少一种酶的活性相对于野生型细胞来说被增强。在优选的实施方案中，如本文使用的，术语“Wood-Ljungdahl途径中涉及的酶”包含与所述途径的一种底物，优选一氧化碳，二氧化碳或氢气结合，或与随着底物被转化为乙酸盐或其衍生物的过程，在由这些底物中的任一种开始的途径中形成的任何中间产物结合的，或者接受其为底物的任何酶。在另一个优选的实施方案中，如本文所使用的，术语“Wood-Ljungdahl途径中涉及的酶”指来自包含CO脱氢酶和乙酰-CoA合成酶的组的酶。在优选的实施方案中，产乙酸细菌选自包含梭菌(Clostridium)、穆尔氏菌(Moorella) 和厌氧醋菌 (Acetoanaerobium)、醋酸杆菌(Acetobacterium)、古球菌(Archaeoglobus)、丁酸杆菌(Butyribacterium)、Carboxydibrachium、Carboxydocella、一氧化碳 嗜热菌(Carboxydothermus)、柠 檬酸杆菌(Citrobacter)、脱硫肠状菌(Desulfotomaculum)、真细菌(Eubacterium)、甲烷八叠球菌(Methanosarcina)、甲烷嗜热杆菌(Methanothermobacter)、产醋杆菌(Oxobacter)、消化链球菌(Peptostreptococcus)、红假单胞菌(Rhodopseudomonas)、红 螺 菌 (Rhodospirillum)、红 长 命 菌 (Rubrivivax)、Thermincola、热 球 菌(Thermococcus)、热石杆菌(Thermolithobacter)、嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter)和Thermosyntrophicum 的组。示例性的产乙酸细菌包括，但不限于潮湿厌氧醋菌(Acetoanaerobium notera)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、闪烁古球菌(Archaeoglobus fulgidus)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methyltrophicum), Carboxydibrachium pacificus、Carboxydocella sporoproducens、Carboxydocella thermoautotrophica、生氢一氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)、柠檬酸杆菌Y19 (Citrobacter sp. Y19)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、自产乙醇梭菌, (Clostridium autoethanogenum)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、食一氧化碳脱硫肠状菌(Desulfotomaculum carboxydivorans)、库 氏 脱 硫 肠 状 菌 (Desulfotomaculum kuznetsovii)、热苯脱硫肠状菌亚种(Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp. )、Thermosyntrophicum、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、食乙酸甲烷八叠球菌C2A (Methanosarcina acetivorans C2A)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、热自养甲烷嗜热杆菌(Methanothermobacter thermoautotrophicus)、穆尔氏菌AMP (Moorella AMP)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermoautotrophica)、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)、产生消化链球菌(Peptostreptococcus productus) 、产生消化链球菌(Peptostreptococcus productus)、沼泽红假单胞菌P4 (Rhodopseudomonas palustris P4)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)、Thermincola carboxydiphila、Thermincola ferriacetica、热球菌AM4 (Thermococcus AM4)、食一氧化碳热石杆菌(Thermolithobacter carboxydivorans)和凯伍嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter kivui).
在另一个优选的实施方案中，产乙酸细菌是通常被基因修饰以产乙酸的细菌，而相应的野生型菌株不产乙酸。在这种情况下，细菌可以是任何可进行这种修饰的生物体，例如大肠杆菌。

[0030] 在优选的实施方案中，如本文使用的，术语“氢氧细菌”指任何能够使用氧作为最终电子受体来氧化氢，并能够在好氧条件下固定二氧化碳的细菌。在优选的实施方案中，氢氧细菌选自包含甲烷细菌(Methanobacterium)、醋酸杆菌(Acetobacterium)、脱硫弧菌(Desulfovibrio)、脱硫单胞菌(Desulfomonas)、副球菌(Paracoccus)、无色杆菌(Achromobacter)、产碱杆菌(Alcaligenes)、假单胞菌(Pseudomonas)、诺卡氏菌(Nocardia)和贪铜菌(Cupriavidus)的组，并且优选是贪铜菌(Cupriavidus)菌株，更优选是钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator) H16。示例性的氢氧细菌包括，但不限于敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)、食酸菌(Acidovorax sp. )、真养产碱杆菌(Alcaligenes eutropha)、产碱杆菌(Alcaligenes sp. )、慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp. )、钩虫贪铜菌DSM 531 (Cupriavidus necator DSM 531)、螺杆菌(Heliobacter sp. )、产氢杆菌(Hydrogenobacter sp. )、嗜热产氢杆菌(Hydrogenobacter thermophilus)、真氧氢单胞菌(Hydrogenomonas eutropha)、泛氧氢单胞菌(Hydrogenomonas pantotropha)、氢单胞菌(Hydrogenomonas sp. )、敏捷氢单胞菌(Hydrogenomonas facilis)、氢噬胞菌(Hydrogenophaga sp. )、海洋氢弧菌(Hydrogenovibrio marinus) (MH-110株)、氢弧菌(Hydrogenovibrio sp)、氢氧微生物(Oxyhydrogen microorganism)、氢嗜热假单胞菌(Pseudomonas hydrogenothermophila)、食氢假单胞菌(Pseudomonas hydrogenovora)、假单胞菌(Pseudomonas sp. )、真养青枯菌(Ralstonia eutropha)、青枯菌(Ralstonia sp. )、大豆根瘤菌(Rhizobium japonicum)、根瘤菌(Rhizobium sp. )、混浊红球菌(Rhodococcus opacus)、红球菌(Rhodococcus sp. )、噬酸红假单胞菌(Rhodopseudomonas acidophila)、生芽红假单胞菌(Rhodopseudomonas blastica)、荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonas capsulata)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、Rhodopseudomonas sheroides、绿硫红假单胞菌(Rhodopseudomonas sulfoviridis)、绿色红假单胞菌(Rhodopseudomonas viridis)、红假单胞菌(Rhodoseudomonas sp. )、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、红螺菌(Rhodospirillum sp. )、桃红荚硫菌(Thiocapsa roseopersicina)、荚硫菌(Thiocapsus sp. )、争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)、贪噬菌(Variovorax sp. )、黄色杆菌(Xanthobacter sp. )、海洋嗜热解氢杆菌(Hydrogenothermus marinus)、真养青枯菌(Ralstonia eutropha)、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)、争论产 碱杆菌(Alcaligenes paradoxus)、脱氮副球菌 (Paracoccus denitrificans)、敏捷假单胞菌(Pseudomonas facilis)、黄假单胞菌(Pseudomonas flava)、帕氏假单胞菌(Pseudomonas palleronii)、噬糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)，和红球菌(Rhodococcus sp. ) (不透明诺卡氏菌(Nocardia opaca))、类黄假单胞菌(Pseudomonas pseudoflava)。在另一个优选的实施方案中，氢氧细菌被基因修饰成为氢氧细菌，而相应的野生型菌株不是氢氧细菌。在这种情况下，细菌可以是任何可进行这种修饰的生物体，例如大肠杆菌。

[0031] 可用于解决本发明所基于问题的许多细菌能够合成聚羟基丁酸酯，一种被用于储存细胞摄取的碳的化合物。这种细菌利用一种或多种聚羟基丁酸酯合成酶。在优选的实施方案中，如本文使用的，术语“聚羟基丁酸酯合成酶”指能够通过催化链长度为3-14个碳原子的中链酰基-CoA，优选羟基丁酸CoA的聚合来合成聚羟基脂肪酸酯的酶。

[0032] 在优选的实施方案中，所发明的细菌被基因修饰以使得它与各自的野生型菌株相比，具有降低的合成聚羟基丁酸酯的能力，或者合成聚羟基丁酸酯的能力降低以使得细胞不再能够合成可检测量的聚羟基丁酸酯。在优选的实施方案中，编码聚羟基丁酸酯合成酶的至少一个基因，优选所有基因被敲除，例如通过向阅读框中引入终止子以达到表达不完整的无活性的蛋白的效果。

[0033] 在优选的实施方案中，如本文使用的，术语“2-羟基异丁酰-辅酶A变位酶”指能够催化形成2-羟基异丁酰-辅酶A 的酶，优选通过将3-羟基丁酸辅酶A转化为2-羟基异丁酰-辅酶A来实现：这些酶和表达它们的生物体在国际专利申请PCT/EP2007/052830, PCT/
EP2009/055089 和 PCT/EP2010/065151中公开。变位酶是包含大的底物结合亚基和小的辅酶B12-结合亚基的异二聚酶。在优选的实施方案中，变位酶通过SEQ ID NO 1或其变体以及多肽SEQ ID NO 2或其变体的表达被表达。

[0034] 在优选的实施方案中，“2-羟基异丁酰-辅酶A变位酶”是异源的和/或在细菌中过表达，即它的表达使得它在细胞中的浓度比在各自野生型细胞中高。在优选的实施方案中，2-羟基异丁酰-辅酶A变位酶在细菌内部表达或者其表达使得它的活性中心暴露于细菌内部。

[0035] 术语“2-羟基异丁酸”，与本申请通篇提及的任何化合物一样，如本文所使用的，不仅包括质子化形式，还包括该化合物的任何游离状态或任何盐，例如钠盐或钾盐。

[0036] 可以通过共表达有助于保持变位酶处于活性构象的分子伴侣来增加2-羟基异丁酰-辅酶A变位酶的活性。在优选的实施方案中，氢氧细菌或产乙酸细菌除了表达2-羟基异丁酰-辅酶A变位酶之外，还表达MeaB蛋白，优选SEQ ID NO 3，或其变体，特别是包含MeaB蛋白或其变体和2-羟基异丁酰-辅酶A变位酶或其变体的融合蛋白。合适的MeaB蛋白和包含MeaB的融合蛋白以及其变体在PCT/EP2010/065151中公开。示例性的MeaB蛋白包括SEQ ID NO 3 (Aquincola tertiaricarbonis DSM 18512)、YP_001023545 (Methylibium petroleiphilum PM1)、YP_001409454 (自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus) Py2), YP_001045518 (球 形 红 细 菌 (Rhodobacter sphaeroides) ATCC 17029)、YP_002520048 (球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides))、AAL86727 (扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens) AMI)、CAX21841 (扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens) DM4)、YP_001637793 (扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens) PA1)、AAT28130 (红霉素气微菌(Aeromicrobium erythreum)), CAJ91091 (纤维多囊菌(Polyangium cellulosum))、 AAM77046 (红 色糖 多孢菌 (Saccharopolyspora erythraea))、NP_417393 (大肠杆菌(Escherichia coli ) K-12菌株 MG1655亚株)和其变体。本申请通篇使用的任何收录号(access code)指来自NCBI管理的Genbank数据库的各个序列，其中其版本是2012年5月15日的在线版本。

[0037] 本发明的主张可以不仅仅是通过具有本发明明确提及的，例如通过名称或收录号提及的，或暗示的确切氨基酸或核酸序列的生物大分子来实现，而且还可以使用这些序列的变体。在优选的实施方案中，如本文使用的，术语“变体”分别包含氨基酸或核酸序列，其与参考氨基酸或核酸序列具有70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98或99 %的同一性，其中优选对于功能，例如蛋白的催化活性，或分子的折叠或结构来说非必需的氨基酸被缺失，或通过插入被取代或替换，或者必需氨基酸以保守的方式被替换。现有技术包括可被用于比对两个给定核酸或氨基酸序列并计算同一性程度的算法，参见Arthur Lesk rd(2008), Introduction to bioinformatics, 3 edition, Thompson 等, Nucleic Acids Research 22, 4637-4680, 1994，和Katoh 等, Genome Information, 16(1), 22-33,
2005。术语“变体”与术语“同源物”含义相同并可互换使用。可以通过在氨基酸或核酸序列中引入缺失，插入或取代来制备这些变体以及包含这种大分子或其变体的融合蛋白。在优选的实施方案中，术语“变体”，对于氨基酸序列来说，包含，优选地，除了上述序列同一性之外，还有相对于各自的参考或野生型序列而言包含一个或多个保守氨基酸变化的氨基酸序列，或者包含编码具有一个或多个保守氨基酸变化的氨基酸序列的核酸序列。在优选的实施方案中，术语氨基酸序列或核酸序列的“变体”分别包含，优选地，除了上述的序列同一性程度之外，还有氨基酸序列或核酸序列的任何活性部分和/或片段，或任何编码氨基酸序列的活性部分和/或片段的核酸序列。在优选的实施方案中，如本文所使用的，术语“活性部分”指氨基酸序列或核酸序列，其分别小于全长的氨基酸序列或编码小于全长的氨基酸序列，其中氨基酸序列或被编码的氨基酸序列，分别保留至少一部分基本生物学活性。例如，蛋白酶的活性部分和/或片段能够水解多肽中的肽键。在优选的实施方案中，如本文使用的，术语“保留至少一部分基本生物学活性”指所涉及的氨基酸序列具有超过背景活性并与其区分开的生物学活性以及表征该活性的动力学参数，更特别是kcat和KM，对于特定的底物来说优选在参考分子显示的数值的3个，更优选2个，最优选1个数量级以内。在优选的实施方案中，术语核酸的“变体”包含核酸，其互补链，优选在严谨条件下，与参考或野生型核酸杂交。杂交反应的严谨性是本领域普通技术人员易于确定的，通常根据探针长度，洗涤温度和盐浓度通过经验计算而得。通常较长的探针需要较高的温度以恰当退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常取决于变性DNA再退火至在低于其熔解温度的环境下存在的互补链的能力，探针和可杂交序列之间所期望同源性的程度越高，可以使用的相对温度越高。因此，由此断定较高的相对温度倾向于使反应条件更严谨，而较低的温度较不严谨。更多的细节以及杂交反应严谨性的说明，参见F. M. Ausubel (1995), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc.,。而且，对于如何通过杂交鉴别DNA序列，本领域技术人员可以按照手册“The DIG System Users Guide for Filter Hybridization”, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany, 1993 中和Liebl 等 (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)中给出的指导来进行。在优选的实施方案中，严谨条件被应用于任何杂交，即只有当探针与靶序列有
70%或更高的同一性时才发生杂交。与靶序列具有较低程度同一性的探针可以杂交，但是这种杂交是不稳定的，将会在严谨条件下的洗涤步骤中被除去，严谨条件下的洗涤步骤是例如盐浓度降低至2 x SSC或者，任选地并在随后，降低至0,5 x SSC，而温度为，按优先级增加的顺序，大约50℃–68℃，大约52℃–68℃，大约54℃–68℃，大约56℃–68℃，大约58℃–68℃，大约60℃–68℃，大约62℃–68℃，大约64℃–68℃，大约66℃–68℃。
在特别优选的实施方案中，温度为大约64℃–68℃或大约66℃–68℃。可以将盐浓度调节至0.2 x SSC或甚至0.1 x SSC。与参考或野生型序列具有至少70, 80, 90, 91, 92,
93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 %的同一性程度的多核苷酸片段可以被分离。在优选的实施方案中，如本文使用的，术语核酸序列的“同源物”指根据基因编码的简并性，与参考核酸序列编码相同氨基酸序列的任何核酸序列。

[0038] 在优选的实施方案中，2-羟基异丁酰-辅酶A变位酶，MeaB蛋白，包含MeaB或其变体的融合蛋白的活性可以相对于它们所源于的野生型细胞被增加。可用于基因修饰细菌细胞的技术在现有技术中被描述，例如在Sambrook 等 (Molecular cloning - A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press)中，如在细菌细胞中增加酶活性的方法，例如通过染色体基因扩增来增加编码具有目的活性的酶的基因的表达(WO 03/014330和WO 03/040373)。其它可用于在微生物体中缺失编码酶的基因或降低这种酶的活性的技术包括使细胞暴露于放射性，随后积聚或筛选获得的突变体，定点引入点突变或者敲除编码活性酶的染色体整合基因(chromosomally integrated gene)。

[0039] 在优选的实施方案中，产乙酸细菌或氢氧细菌能够合成3-羟基丁酰-辅酶A。后者的化合物可以在从乙酰-CoA开始的由β-酮硫酶和乙酰乙酰基-CoA还原酶的组合催化的反应中形成。在优选的实施方案中，如本文使用的，术语“β-酮硫酶”指能够催化两分子乙酰-CoA转化为乙酰乙酰基-CoA和HS-CoA的酶。示例性的酶是来自真养青枯菌(Ralstonia eutropha) H16 (收录号 NC_008313.1)的β-酮硫酶。在优选的实施方案中，如本文使+用的，术语“乙酰乙酰基-CoA还原酶”指能够催化乙酰乙酰基-CoA和NADPH以及H 转化+
为3-羟基丁酰-CoA和NADP 的酶。示例性的酶是来自真养青枯菌(Ralstonia eutropha) H16 (收录号 NC_008313.1)的乙酰乙酰基-CoA还原酶。一些氢氧细菌和产乙酸细菌，例如青枯菌能够使用内源酶利用这种途径。可以在其它菌株如大肠杆菌中表达重组酶以使得它们能够生产3-羟基丁酰-辅酶A。

[0040] 用于合成复杂聚合物的广受欢迎的生物技术产品不仅仅包括2-羟基异丁酸，还包括其衍生物，特别是烷基酯如甲酯。在优选的实施方案中，所发明的细菌不仅仅表达2-羟基异丁酰-辅酶A变位酶，还表达能催化2-羟基异丁酰-辅酶A和/或2-羟基异丁酸酯化的酶。在优选的实施方案中，能催化2-羟基异丁酰-辅酶A和/或2-羟基异丁酸酯化的酶选自包含脂肪酸O-甲基转移酶 (EC 2.1.1.15)、茉莉酸O-甲基转移酶 (EC 2.1.1.141)、保幼激素O-甲基转移酶 (EC 2.1.1.-)、马钱酸O-甲基转移酶 (EC
2.1.1.50)、乙醇O-酰基转移酶 (EC 2.3.1.75, EC 2.3.1.84)、酰基-CoA (辅酶 A) 硫酯酶 (EC 3.1.2.2, EC 3.1.2.18, EC 3.1.2.19, EC 3.1.2.20, EC 3.1.2.22) 和酰基-ACP (酰基载体蛋白) 硫酯酶 (EC 3.1.2.14, EC 3.1.2.22)的组。在优选的实施方案中，如本文使用的，术语“脂肪酸O-甲基转移酶 (EC 2.1.1.15)”指能催化下列反应的酶： S-腺苷-L-甲硫氨酸 + 脂肪酸 = S-腺苷-L-同型半胱氨酸 + 脂肪酸甲酯。在另一个优选的实施方案中，如本文使用的，术语“茉莉酸O-甲基转移酶 (EC 2.1.1.141)”指能催化下列主反应的酶： S-腺苷-L-甲硫氨酸 + 茉莉酸 = S-腺苷-L-同型半胱氨酸 + 茉莉酸甲酯。
在另一个优选的实施方案中，如本文使用的，术语“保幼激素O-甲基转移酶 (EC 2.1.1.-)”指能催化下列反应的酶： S-腺苷-L-甲硫氨酸 +保幼激素II酸= S-腺苷-L-同型半胱氨酸 +保幼激素II酸甲酯。在优选的实施方案中，如本文使用的，术语“马钱酸O-甲基转移酶 (EC 2.1.1.50)”指能催化下列反应的酶： S-腺苷-L-甲硫氨酸 + 马钱酸 = S-腺苷-L-同型半胱氨酸 + 马钱酸甲酯。在优选的实施方案中，如本文使用的，术语“乙醇O-酰基转移酶 (EC 2.3.1.75, EC 2.3.1.84)”催化酰基-CoA 硫酯 + 乙醇 = 脂肪酸烷基酯 + CoA的反应。在优选的实施方案中，如本文使用的，术语“酰基-CoA (辅酶 A) 硫酯酶 (EC
3.1.2.2, EC 3.1.2.18, EC 3.1.2.19, EC 3.1.2.20, EC 3.1.2.22)”指能催化下列反应的酶： 酰基-CoA 硫酯 + 乙醇 = 脂肪酸烷基酯 + CoA。在优选的实施方案中，如本文使用的，术语“酰基-ACP (酰基载体蛋白) 硫酯酶 (EC 3.1.2.14, EC 3.1.2.22)”指能催化下列反应的酶： 酰基-ACP 硫酯 + 乙醇 = 脂肪酸烷基酯 + ACP。

[0041] 这样的细菌可被用于实施本发明的方法。相应地，本发明的方法可以包括额外的步骤b) 使步骤a)中产生的任何2-羟基异丁酸或2-羟基异丁酰-辅酶A烷基化，优选使
其甲基化。

[0042] 不是使用共表达能催化2-羟基异丁酰-辅酶A和/或2-羟基异丁酸酯化的酶的细胞，有利的是富集或分离步骤a)中产生的任何2-羟基异丁酸或2-羟基异丁酰-辅酶并使其烷基化，优选使其甲基化，例如通过使用合成方法如在存在甲醇的条件下进行酸催化的酯化或者使化合物与具有甲基化活性的酶接触。

[0043] 所发明的方法考虑使氢氧细菌或产乙酸细菌与包含氢气和二氧化碳的气体混合物接触，其中气体混合物包含，按优先级增加的顺序，10-80，15-70，20-60和25-50 %的氢气和，按优先级增加的顺序，5-60，10-45和15-30 %的二氧化碳，条件是其体积总和不超过100 %，优选在大气压下。

[0044] 如果用于实施的细菌是耐氧细菌，气体混合物除了包含氢气和二氧化碳之外，还可以包含氧气。在优选的实施方案中，气体混合物包含，按优先级增加的顺序，最多20, 15,10, 5或1 %的氧气。在优选的实施方案中，如本文使用的，术语“耐氧”指目的细菌能在存在，按优先级增加的顺序，最多1, 5, 10, 15或20 %氧气，优选在大气压的条件下生长。
本领域技术人员能够容易地确定细菌是否是耐氧的，例如通过使该细菌在包含限定量氧气的气氛下生长，并如所示地，例如，通过所使用的培养基的光密度或光散射的变化来监控是否发生任何生长。

[0045] 所应用的气体混合物的压力是，在优选的实施方案中0.5-10巴，更优选0.8-8，更优选1.5-6巴。在另一个优选的实施方案中，压力是大于1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10巴。在优选的实施方案中，所应用的压力超过大气压。在优选的实施方案中，氢气分压是0.1-100巴，更优选0.2-10巴，最优选0.5-4巴。在优选的实施方案中，二氧化碳分压是0.03-100巴，更优选0,05-1巴，最优选0.05-0.3巴。在优选的实施方案中，氧气分压是0.03-10巴，更优选0.04-1巴，最优选0.04-0.5巴。在优选的实施方案中，总的合并压力是1-200巴，优选1-10巴，最优选1-5巴。

[0046] 在优选的实施方案中，氢氧细菌或产乙酸细菌具有降低的脂肪酸降解能力。在优选的实施方案中，如本文使用的，术语“具有降低的脂肪酸降解能力”指各个微生物降解脂肪酸优选那些从环境中摄取的脂肪酸的速度比具有正常脂肪酸降解能力的可比微生物低。在优选的实施方案中，这种微生物的脂肪酸降解由于编码β-氧化途径中涉及的酶的至少一个基因的缺失，抑制或失活而被降低。在本发明的优选实施方案中，β-氧化途径中涉及的至少一种酶相对于同一个酶在各自野生型微生物中的相当条件下的活性而言，丧失，按优先级增加的顺序，5、10、20、40、50、75、90或99 %的活性。本领域技术人员熟悉可用于缺失编码酶的基因或者减少这种酶在微生物中的活性的各种技术，例如使细胞暴露于放射性，随后积聚或筛选获得的突变体，定点引入点突变或者敲除编码活性酶的染色体整合基因(chromosomally integrated gene)，如Sambrook/Fritsch/Maniatis (1989)中所述。此外，转录抑制因子FadR可以被过表达以获得β-氧化途径中涉及的酶的表达被抑制的效果 (Y Fujita, H Matsuoka, and K Hirooka (2007) Mol. Microbiology 66(4), 829-839)。
在优选的实施方案中，如本文使用的，术语“基因的缺失”指编码所述基因的核酸序列被修饰，以使得所述基因编码的活性多肽的表达减少。例如，基因可以通过框内去除包含编码多肽催化活性中心的序列的序列的一部分而被缺失。或者，核糖体结合位点可以被改变，以使得核糖体不再翻译相应的RNA。而且，本领域技术人员能够使用酶学教科书，例如A Cornish-Bowden (1995), Fundamentals of Enzym Kinetics, Portland Press Limited,
1995中所述的标准检测方法常规地测定活细胞表达的酶的活性。现有技术公开了特别设计用于确定β-氧化途径中涉及的酶的活性的各种试验，例如K Kameda & W D Nunn (1981) J. Biol. Chem. 256, 5702-5707, H Marrakchi, W E DeWolf, C Quinn, J West, B J Polizzi, C Y So 等. (2003) Biochem. J. 370, 1055-1062, S Lobo, G Florova, and K A Reynolds (2001) Biochemistry 40 (39), 11955-64, X Yu, T Liu, F Zhu, and C Khosla (2011) PNAS，在线公开)。

[0047] 根据所本发明的方法，产乙酸细菌或氢氧细菌与气体混合物在水性介质中接触。在优选的实施方案中，术语“水性介质”包括任何包含生长或维持产乙酸细菌或维持产乙酸作用必需量的盐和缓冲剂的水溶液。例如，根据Hurst, K. M., and Lewis, R. (2010), Biochemical Engineering Journal 2010, 48, 159-165的水性介质可以被用于实施本发明的教导。

[0048] 一方面考虑到产乙酸细菌和氢氧细菌的需要，另一方面考虑到热力学参数的需要，步骤a)和b)中的温度需要被选择。现有技术教导了大量产乙酸细菌的温度范围以及最适温度。例如，耐热醋酸梭菌(Clostridium thermoaceticum) 可以在最高60℃的温度被孵育。关于可被用于生长产乙酸细菌和古细菌细胞的温度，另参见微生物学标准教科书，例如Dworkin 等 (2006) The Prokaryotes – A Handbook on the Biology of Bacteria, Volume 2。在优选的实施方案中，步骤a)中应用的温度是，按优先级增加的顺序，0-100℃，10-80℃，20-60℃，30-45℃或35-42℃。在另一个优选的实施方案中，步骤a)中应用的温度是37℃或更高。

[0049] 本发明进一步通过下述附图和非限制性实施例来说明，从中可以获得本发明的进一步的特征，实施方案，方面和优点。

[0050] 图1显示了0-60 g/L的生物量浓度和0-100 g/L 的2-HIB产物浓度的氢转化效率的计算数据。

[0051] 图2显示了实施实施例1时获得的实验数据，更特别是生长期 (0-60 h)和产物合成期 (60 h-160 h)，其中 • 生物量，单位g/L 2-HIB，单位g/L，以及 pH。

[0052] 实施例 1：通过钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)H16 PHB-4 [47] DSM 541的基因修饰菌株进行2-羟基异丁酸的生物技术生产方法
细菌菌株和质粒
钩 虫 贪铜 菌H16 PHB-4 [47] DSM 541 得自 DSMZ (Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany)，并通过引入质粒pBBR1MCS-2::HCM (Reinecke L, Schaffer S, Marx A, Pötter M, Haas T (2009) Recombinant cell producing 2-hydroxyisobutyric acid. WO/2009/156214)而被修饰，该质粒来源于广宿主范围的克隆载体pBBR1MCS (Kovach ME, Elzer PH, Hill DS, Robertson GT, Farris MA, Roop RM, Peterson KM (1995) Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene 166(1):175-6)。该质粒包含编码来自Aquincola tertiaricarbonis的2-羟基-异丁酰-辅酶A变位酶的两个亚基的基因hcmA 和 hcmB (Yaneva N, Schuster J, Schäfer F, Lede V, Przybylski D, Paproth T, Harms H, Müller RH, Rohwerder T (2012) A bacterial acyl-CoA mutase specifically catalyzes coenzyme B12-dependent isomerization of 2-hydroxyisobutyryl-CoA and (S)-3-hydroxybutyryl-CoA. J Biol Chem. doi:10.1074/jbc.M111.314690)。

[0053] 培养条件一般培养在LB培养基(Luria Bertani broth) (Miller)中在30℃进行，菌株于4℃保存于LB-琼脂平板上。对于分批培养和连续培养，使用无机盐培养基，如Schlegel和共同作者 (Schlegel HG, Kaltwasser H, Gottschalk G (1961) Ein Submersverfahren zur Kultur wasserstoffoxydierender Bakterien: Wachstumsphysiologische
Untersuchungen. Arch Microbiol 38(3):209-222)所述，其中加入卡那霉素。培养以实验室规模进行，使用含0.6 L工作容积的摇瓶在22℃进行。摇动被设定为200 rpm，通气保持恒定不变，为5 L/h。

[0054] 从单菌落制备预培养物，在200 mL 相同培养基中在30℃和150 rpm的条件下进行，但使用果糖作为唯一碳源底物并在好氧条件下进行。果糖耗尽之后培养物被转移至氢和二氧化碳，继续在分批条件下进行培养。除了氧气之外，这两种气体由根据气量计原理处理过的18 L的储罐供应。初始的气体浓度是大约25-50 % H2, 15-30% CO2和10-20 % O2。气体通过中空纤维组件(Fresenius, St. Wendel, Germany) 通过膜泵以750 L/h的2
速度被提供给培养物。中空纤维具有0.2 µm 的空隙宽度和0.7 m 的特定交换区域。由齿轮泵提供的细菌悬液以750 L/h的速度流过中空纤维组件的外部体积(external volume)。
通过该组件之后，气体和悬液被输入配备有搅拌器的烧瓶中。气体再次循环至储气罐中并借助安装在储气罐外部的磁力耦合电动机通过推进器与其中的气体混合。根据记录储气罐水平移动的总体积并根据三个特定传感器的浓度来监测气体的消耗。而且，根据总气体和单个气体浓度的变化差异计算气体消耗。如果需要的话，特定的气体被再充满到储气罐中。
由于在这种简化的培养系统中没有自动的pH控制，离线监测pH并根据生长培养基的滴定曲线通过加入所需体积的10 % NaOH 调节为pH 7.5。

[0055] 在线分析气体浓度通过特定的氢气传感器(0-100 %)，氧气传感器(0-50 %)和二氧化碳传感器(0-50 %) (BlueSens, Herten, Germany) 被测量，并且它们的浓度被连续监测。培养系统的管道以允许测量流入气体以及流出气体的方式排布。

[0056] 离线分析生物量浓度通过在700 nm的光密度被确定，并在105℃烘干之后进行一式四份的重量分析。通过在Nucleogel Ion 300OA柱(300mm×7.8mm, Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Düren, Germany) 上在70℃ 进行等度HPLC(Shimadzu)来分析底物消耗和2-HIB合成，洗脱液为0.6 mL/min 0.01 N H2SO4。

[0057] 计算：3-磷酸甘油酸盐 (PGA)被定义为主要的碳前体[51, 52]，完整的生物量合成来自
于它。模型中生物量的摩尔组分被认为是C4H8O2N。它是由作为一般能量载体的ATP合成的，并且以每摩尔(pro mol)ATP 10.5 g干质量的效率进行。(Stouthamer AH (1973) A theoretical study on the amount of ATP required for synthesis of microbial cell material. Antonie Van Leeuwenhoek 39(3):545-65)。从PGA开始的生物量总平衡方程相应地是：
+
[2H]代表通常相应于NAD(P)H + H 的还原当量。

[0058] 结果和讨论为了定义在生长相关过程中可能的产物产率，我们默认一种化学计量模型。氢氧细菌+
如钩虫贪铜菌利用卡尔文循环来吸收碳，并利用酶氢化酶获取NAD(P)H 和来自于氢气的H作为通过呼吸链进行的氧化磷酸化的底物和二氧化碳还原的来源。因此，包括在P/O = 2的条件下由H2氧化产生的能量在内的通过PGA的生物量合成的总平衡方程的结果是
(方程2)。

[0059] 对于生长来说，这相应于供应的每Cmol有1 Cmol被吸收的CCE的碳转化效率和消耗的每Hmol有0.214 Hmol被吸收的HCE(氢转化效率)。通过卡尔文循环以PGA和丙酮酸盐作为中间产物合成2-HIB (C4H8O3)作为所期望的产物根据下式获得乙酰-CoA (AcCoA)(方程3a)。

[0060] CO2 固定所需要的ATP得自通过呼吸链进行的氢的氧化；相应地，方程3a被扩展为(方程3b)。

[0061] CCE仍然是1 Cmol/Cmol，而理论HCE是0.25 Hmol/Hmol (方程3b)。生物量合成和产物形成组成完整过程，关于产物决定最终HCE的两个过程之间的相关性显示于图1中。我们考虑0 -10 g/L以及10-60 g/L的两个范围的生物量浓度以考虑一系列的变量。很明显，生物量合成是代价非常高的 (方程2)。显然，当生物量浓度低于10 g/L而产物浓度接近100 g/L 时总过程接近0.2-0.25 Hmol/Hmol的值 (图1)。生物量的增加和产物浓度的减少二者极大地降低HCE。

[0062] 我们使用菌株钩虫贪铜菌H16 PHB-4 (Schlegel HG, Lafferty R, Krauss I (1970) The isolation of mutants not accumulating poly-β-hydroxybutyric acid. Arch Microbiol 71(3):283-294)，其由于敲除了PHB聚合酶基因，因而在PHB合成上有缺陷。这使得该菌株在过量代谢的条件下合成代谢物3-HB-CoA。克隆并表达来自A. tertiaricarbonis 的2-HIB-CoA变位酶建立了我们所期望的终产物2-HIB的替代/另一种路线。为了检验所选系统对于2-HIB合成的能力，在果糖上预生长的菌株被用于接种培养器。含有25-50 % H2, 15-30 % CO2和10-20 % O2的气流被供应作为生长底物，由此导致诱导化学无机自养生长所需的酶，特别是氢化酶 (Lenz O, Schwartz E, Dernedde J, Eitinger M, Friedrich B (1994) The Alcaligenes eutrophus H16 hoxX gene participates in hydrogenase regulation. J Bacteriol 176(14):4385-93; Burgdorf T, Lenz O, Buhrke T, van der Linden E, Jones AK, Albracht SP, Friedrich B (2005) [NiFe]-hydrogenases of Ralstonia eutropha H16: modular enzymes for oxygen-tolerant biological hydrogen oxidation. J Mol Microbiol Biotechnol10(2-4):181-96)和用于二氧化碳固定的酶 (Husemann M, Klintworth R, Büttcher V, Salnikow J, Weissenborn C, Bowien B (1988) Chromosomally and plasmid-encoded gene clusters for CO2 fixation (cfx genes) in Alcaligenes eutrophus. Mol Gen Genet MGG 214(1):112-120))。在这些条件下，生长以大约0.058/h的速度进行，直至氮源耗尽，获得的最终生物量浓度为大约2.0 g/L (图2)。在指数生长期间，二氧化碳被吸收到生物量中，CCE = 0.58 Cmol/Cmol。氢转化产生0.0715 Hmol/Hmol 的HCE。应当注意，无法获得0.214 Hmol/Hmol的理论最大可能HCE值，这是因为为了维持的目的必然需要能量(H2)。与理论值之间的较大的偏差可能是因为除生物量以外的其它产物，如丙酮酸盐的合成所导致的。但是，更详细的分析不在研究的这个阶段进行。

[0063] 在生物量生长期间，发现2-HIB仅处于低浓度。但是，在氮源耗尽后，外部2-HIB浓度急剧地增加(图2)。合成速度相应于8.35 mg 2-HIB/(g干质量 h)。这个速度保持稳定直至浓度为大约410 mg/L。随后产物合成速度突然停止，这种现象在重复试验中同样也被观察到。这种突然变化表明有明显的限制/干扰，这对于试验设置来说不明显，但需要进一步优化。2-HIB的每增长消耗的气体的量被用于计算收率系数。在缺乏生物量的条件下通过进行试验确定的非特异性气体损失对数据进行校正。其余的被吸收到2-HIB中，CCE为0.178 Cmol/Cmol。氢气作为第二底物被转化为这种产物， HCE为0.032 Hmol/Hmol。很明显，这远远未达到上述的极限值。

[0064] 底物平衡中的缺口可能可以用推定的除2-HIB以外的其它产物的合成来解释。考虑到CO2被氢气还原产生卡尔文循环中碳固定的第一个中间产物，甘油醛-3-磷酸(GAP, C3H6O3, 总分子式不含磷酸盐)，由于当前的消耗特性，可利用的CO2允许在2-HIB形成的线性阶段每小时合成0.57 mmol GAP。这接下来需要5.16 mmol H2/h，根据是(方程4)。

[0065] 由于氢平衡，在2-HIB合成之后还有5.71 mmol H2可利用，这可以满足推定的产物合成。而且，一些氢进一步保持可利用状态，以达到活细胞中必然需要的维持的目的。考虑到先前在果糖上所确定的真养青枯菌(钩虫贪铜菌) JMP 134的ms = 0.09 mmol/(g干质量h)比维持系数[57]并将这种基于底物的系数转换为基于能量(ATP)的值(P/O=2)，其等同于me = 2.34 mmol ATP/(g干质量h)，2-HIB合成之后剩余的氢和推定的其它还原产物将足以产生2.8 mmol ATP/(g干质量h)。这与该物种之前的结果相当吻合。