利用spoT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法 |
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| 申请号 | CN201710598641.5 | 申请日 | 2017-07-21 | 公开(公告)号 | CN107267568A | 公开(公告)日 | 2017-10-20 |
| 申请人 | 徐州工程学院; | 发明人 | 孙会刚; 李同祥; 高兆建; 刘恩岐; 崔珏; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种利用spoT基因缺失菌株通过 发酵 生产L- 氨 基酸的方法，通过在培养基中培养属于肠杆菌科，并具有L-氨基酸生产能 力 的细菌，该细菌于培养前进行修饰，使得spoT基因缺失，并从细菌的培养基或细胞收集L-氨基酸，来生产L-氨基酸。本发明通过一些列的试验验证，spoT基因的缺失，其功能或者其相关序列的缺失，对于L-氨基酸发酵有利，有助于氨基酸产量和转化率的提升。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种利用spoT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：通过在培养基中培养属于肠杆菌科，并具有L-氨基酸生产能力的细菌，该细菌于培养前进行了修饰，使得spoT基因缺失，并从细菌的培养基或细胞收集L-氨基酸，来生产L-氨基酸。 |
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| 说明书全文 | 利用spoT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法技术领域背景技术[0002] 在工业上，目前L-氨基酸的生产方法主要为生物发酵法，即通过具有L-氨基酸生产能力的各种微生物的发酵来生产L-氨基酸，因此具有L-氨基酸生产能力菌株的获得是L氨基酸生产方法的核心。目前获得L氨基酸生产菌株的方法主要有两种，一种是通过对野生型微生物(野生型菌株)进行诱变的方法，使其具有营养缺陷，并使其对某些代谢物产生拮抗作用，从而获得优良的工业生产菌株。 [0003] 近年来随着基因工程技术的发展，重组DNA技术已经开始普遍应用于微生物代谢工程改造方面，使其成为另外一种重要的获得L-氨基酸生产菌株的方法。比如，通过提高目标产品合成途径中关键酶的表达，来达到提高微生物L-氨基酸生产能力(CN1305002A)；再比如，通过提高目标产品的分泌蛋白的表达，来达到提高微生物L-氨基酸生产能力(CN1260393A)；或者，通过降低某些基因的表达，来达到提高微生物L-氨基酸生产能力(CN1607246A)；在或者，通过敲除某些基因，使其失活，来达到提高微生物L-氨基酸生产能力(CN1466630A)。 [0004] spoT的表达产物是一个双功能酶，具有水解酶和合成酶的活性,其是水解活性在ppGpp的降解过程中发挥了重要的作用。其在细胞脂肪酸合成受限，或者磷源缺失，或者离子受限的情况下，会发挥合成酶的活性。同时，SpoT对于pppGpp也具有水解酶活性和合成酶活性。目前，虽然对其的调控机制研究较多，但其对于L-氨基酸合成是否有影响还没有相关的报道。 发明内容[0005] 本发明的目的是提供一种利用spoT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，以提高L-氨基酸产量和转化率。 [0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为： [0007] 一种利用spoT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，通过在培养基中培养属于肠杆菌科，并具有L-氨基酸生产能力的细菌，该细菌于培养前进行了修饰，使得spoT基因缺失，并从细菌的培养基或细胞收集L-氨基酸，来生产L-氨基酸。 [0008] 进一步的，采用spoT基因缺失的菌株ATCC21151ΔspoT，通过发酵的方法生产得到L-苏氨酸。 [0009] 所述spoT基因缺失的菌株ATCC21151ΔspoT通过下述方法构建得到： [0010] 首先，制备菌株ATCC21151的感受态细胞；利用质粒pKD46进行转化，获得ATCC21151/pKD46菌株；然后，利用基因片段spoTknock1转化ATCC21151/pKD46菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物spoT1-F/spoT1-R进行验证，验证正确的菌株命名为ATCC21151ΔspoT::SacBCm；最后，利用基因片段spoTknock2转化ATCC21151ΔspoT::SacBCm菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物spoT2-F/spoT2-R进行验证，验证正确的菌株命名为ATCC21151ΔspoT，至此L-苏氨酸生产所用的菌株spoT基因缺失的菌株ATCC21151ΔspoT构建完毕。 [0011] 进一步的，采用spoT基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT，通过发酵的方法生产得到L-赖氨酸。 [0012] 所述spoT基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT通过下述方法构建得到： [0013] 首先，制备菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*的感受态细胞；利用质粒pKD46进行转化，获得MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株；然后，利用基因片段spoTknock2转化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物spoT2-F/spoT2-R进行验证，验证正确的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT::SacBCm；最后，利用基因片段spoTknock2转化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT::SacBCm菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物spoT2-F/spoT2-R进行验证，验证正确的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT，至此L-赖氨酸生产所用的spoT基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT构建完毕。 [0014] 所述菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*通过下述方法构建得到： [0015] 利用多片段重组的方法构建以低拷贝质粒pWSK29为出发载体，包含dapA基因表达框和lysC基因表达框的质粒pwsk-lysC-dapA； [0016] 以质粒pwsk-lysC-dapA为基础构建dapA和lysC突变体过表达质粒，得到质粒pwsk-lysC*-dapA*； [0017] 将质粒pwsk-lysC*-dapA*电转化至大肠杆菌MG1655；获得的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*。 [0018] 有益效果：本发明提供的方法，采用spoT基因缺失的大肠杆菌菌株，通过发酵的方法生产得到L-氨基酸，并通过一些列的试验验证，spoT基因的缺失，其功能或者其相关序列的缺失，对于L-氨基酸发酵有利，有助于氨基酸产量和转化率的的提升。附图说明 [0019] 图1为基因片段spoTknock1的构建过程示意图； [0020] 图2为基因片段spoTknock2的构建过程示意图； [0021] 图3为基因质粒pwsk-lysC-dapA的构建过程示意图。 具体实施方式[0022] 本发明实施例所用的L-苏氨酸生产菌株为大肠杆菌ATCC21151，来源于美国典型微生物菌株菌种保藏中心(ATCC)。 [0023] 本发明实施例所用的L-赖氨酸生产菌株为大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)，来源于美国典型微生物菌株菌种保藏中心(ATCC)。 [0024] DNA聚合酶购自北京全式金公司的Fastpfu；限制性内切酶及DNA连接酶等均购自Fermentas公司； [0026] 质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒均购自上海生工，多片段重组试剂盒( MultiS One Step Cloning Kit)购自南京诺唯赞生物科技有限公司，相关操作均严格按照说明书执行； XL-Ⅱ定点突变试剂盒购自天津博鑫生物科技有限公司，相关操作均严格按照说明书执行； [0027] 质粒构建测序验证和基因缺失测序工作由华大基因完成； [0028] DH5α感受态细胞购自北京全式金公司。 [0029] LB培养基成分：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，固体培养基中添加2％的琼脂粉。 [0030] 抗生素浓度为：氨苄青霉素100ug/mL，卡那霉素30ug/mL，氯霉素15ug/ml。 [0031] L-苏氨酸和L-赖氨酸检测方法：通过安捷伦液相仪，利用ZORBAX Eclipse AAA(氨基酸分析)色谱柱对发酵液中的L-赖氨酸和L-苏氨酸进行分析，相关操作均严格按照说明书执行。 [0032] 葡萄糖分析方法采用山东科学院生产的SBA-40D生物传感分析仪进行检测。 [0033] 实施例1 spoT敲除片段的构建 [0034] 大肠杆菌基因敲除采用经典的Red重组方法，因此需要有进行重组的基因片段。相关基因片段构建方法如下： [0035] 首先，根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物spoTup1-F/spoTup1-R和spoTdown1-F/spoTdown1-R，见表1，以大肠杆菌MG1655基因组为模板PCR扩增得到spoT基因上下游个600-700bp的同源臂基因片段，序列如序列表中SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20所示，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，67℃20s，72℃30s，循环30次，72℃延伸10min；根据质粒ploi4162基因序列，设计引物SacBCm-F/SacBCm-R，见表1，以质粒ploi4162为模板，PCR扩增氯霉素(Cm)和蔗糖致死基因(SacB)基因序列，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，55℃20s，72℃1.5min，循环30次；根据质粒pUC18基因序列，设计引物pUC1-F/pUC1-R，见表1，扩增线性pUC18基因片段，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，55℃20s，72℃ 1.5min，循环30次；72℃延伸10min。获得基因片段通过凝胶电泳回收。 [0036] 利用 MultiS One Step Cloning Kit对上述获得片段进行连接，具体方法参见试剂盒说明。构建可用于扩增敲除spoT基因的基因片段的载体，具体构建过程见图1。经华大基因公司测序正确后，质粒命名为spoT1。根据质粒spoT1基因序列，设计引物spoT1-F/spoT1-R，以质粒spoT1为模板PCR扩增第一次spoT基因敲除的基因片段spoTknock1，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，58℃20s，72℃2.5min，循环30次。获得基因片段通过凝胶电泳回收，用于进行spoT基因第一轮敲除。 [0037] 然后，根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物spoTup2-F/spoTup2-R和spoTdown2-F/spoTdown2-R，见表1，以大肠杆菌MG1655基因组为模板PCR扩增得到spoT基因上下游各600-700bp的同源臂基因片段，序列如序列表中SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20所示，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，62℃20s，72℃30s，循环30次，72℃延伸10min；根据质粒pUC18基因序列，设计引物pUC2-F/pUC2-R，见表1，扩增线性pUC18基因片段，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，57℃20s，72℃1.5min，循环30次；72℃延伸10min。获得基因片段通过凝胶电泳回收。 [0038] 利用 MultiS One Step Cloning Kit对上述获得片段进行连接，具体方法参见试剂盒说明。构建可用于扩增敲除spoT基因的基因片段的载体，具体构建过程见图2。经华大基因公司测序正确后，质粒命名为spoT2。根据质粒spoT2基因序列，设计引物spoT2-F/spoT2-R，以质粒spoT2为模板PCR扩增第二次spoT基因敲除的基因片段spoTknock2，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，55℃20s，72℃2.5min，循环30次。获得基因片段通过凝胶电泳回收，用于进行spoT基因第二轮敲除。 [0039] 表1引物 [0040]名称 序列 pUC1-F GCTGGCGAAAGTCCGGGTACCGAGCTCGAATTCG pUC1-R CAATTTTGGACGGCGGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCA spoTup1-F TCTAGAGGATCCCCCGCCGTCCAAAATTGAACTGG spoTup1-R CGATAACTCAAAAAATACGAGGCTTTCAAACAGATACAAGGGCG SacBCm-F CCCTTGTATCTGTTTGAAAGCCTCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTSacBCm-R CGGATTTTGCGCATGACAGCCTGAATCAGGCATTTGAGAAGCA spoTdown1-F CTGATTCAGGCTGTCATGCGCAAAATCCGCGTGATGC spoTdown1-R AGCTCGGTACCCGGACTTTCGCCAGCACCGGATAGCC pUC2-F GCTGGCGAAAGTCCGGGTACCGAGCTCGAATTCG pUC2-R TTTTGGACGGCGGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCA spoTup2-F TCTAGAGGATCCCCCGCCGTCCAAAATTGAACTGG spoTup2-R GCGGATTTTGCGCATGAAGGCTTTCAAACAGATACAAGGGCG spoTdown2-F TCTGTTTGAAAGCCTTCATGCGCAAAATCCGCGTGATGC spoTdown2-R AGCTCGGTACCCGGACTTTCGCCAGCACCGGATAGCC spoT1-F CGTCCAAAATTGAACTGG spoT1-R GCCAGCACCGGATAGCC spoT2-F GCAAAATCCGCGTGATGC spoT2-R CGCCAGCACCGGATAGCC [0041] 实施例2 L-赖氨酸生产菌株构建 [0042] 利用大肠埃希氏菌MG1655菌株(ATCC 47076)来构建一株可以生产L-赖氨酸的菌株。具体方法如下。 [0043] 1.过表达二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)和天冬氨酸激酶III(lysC)基因质粒构建[0044] 利用多片段重组的方法构建了以低拷贝质粒pWSK29为出发载体，包含dapA基因表达框和lysC基因表达框的质粒。具体方法如下所述： [0045] 首先，根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物lysC-F/lysC-R和dapA-F/dapA-F，见表2，以大肠杆菌MG1655基因组为模板PCR扩增得到带有自身启动子的dapA和lysC基因片段，序列如序列表中SEQ ID NO.22及SEQ ID NO.23所示，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，65℃20s，72℃2min，循环30次；72℃延伸10min。根据质粒pWSK29基因序列，设计引物pwsk-F/pwsk-R，扩增线性pWSK29基因片段，PCR扩增参数为98℃2min；98℃ 20s，60℃20s，72℃3min，循环30次；72℃延伸10min。获得基因片段通过凝胶电泳回收。 [0046] 然后，利用 MultiS One Step Cloning Kit对上述获得片段进行连接，具体方法参见试剂盒说明。构建过表达二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)和天冬氨酸激酶III(lysC)基因质粒pwsk-lysC-dapA，具体构建过程见图3。经华大基因公司测序正确后进行下一步试验。 [0047] 2.dapA和lysC突变体过表达质粒的构建 [0048] 野生型的dapA基因和lysC基因是受到L-赖氨酸的反馈抑制的，因此为了解除L-赖氨酸对其的反馈抑制，增加其在细胞内的酶活力，对其进行了点突变，以pwsk-lysC-dapA为基础构建了dapA和lysC突变体过表达质粒。具体方法如下所述。 [0049] 首先，设计利用Stratagene系列 XL-Ⅱ定点突变试剂盒，通过引物LysCT352I F/LysCT352I R(见表2)对质粒pwsk-lysC-dapA进行PCR引入突变位点，获得的质粒基因片段经过PCR产物回收，除去PCR体系中的酶及缓冲体系中的盐离子后，采用DpnI酶37摄氏度酶切1h除去甲基化的模板质粒DNA，处理后的质粒转入感受态细胞Tran10(购自北京全式金生物技术有限公司)，经测序验证，所获得的正确突变质粒命名为pwsk-lysC*-dapA，携带的lysC突变体核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.24所示。 [0050] 然后，设计利用Stratagene系列 XL-Ⅱ定点突变试剂盒，通过引物dapAE84T-F/dapAE84T-R(见表2)对质粒pwsk-lysC*-dapA进行PCR引入突变位点，获得的质粒基因片段经过PCR产物回收，除去PCR体系中的酶及缓冲体系中的盐离子后，采用DpnI酶37摄氏度酶切1h除去甲基化的模板质粒DNA，处理后的质粒转入感受态细胞Tran10，经测序验证，所获得的正确突变质粒命名为pwsk-lysC*-dapA*，携带的dapA突变体核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.25所示。 [0051] 3.L-赖氨酸生产菌株SHG01的构建及发酵验证 [0052] 将前面构建好的质粒pwsk-lysC*-dapA*电转化至大肠杆菌MG1655；获得的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*。然后，对其进行L-赖氨酸发酵能力的验证。 [0053] 发酵培养基如下：葡萄糖40g/L，硫酸铵10g/L，磷酸0.6mL/L，氯化钾0.8g/L，甜菜碱0.4g/L，硫酸镁1.2g/L，硫酸锰0.03g/L，硫酸亚铁0.03g/L，玉米浆有机氮0.4g/L，5％消泡剂0.5mL/L，苏氨酸0.2g/L，氨苄青霉素50ug/mL。 [0055] 菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*发酵32h后，L-赖氨酸产量为4.7g/L。 [0056] 表2引物 [0057]名称 序列 pwsk-F GCTGCCTGTAGTTCTGACGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCC pwsk-R GCGCTAGCGCAGGTTGCAGCACATCCCCCTTTCGC lysC-F GGATGTGCTGCAACCTGCGCTAGCGCAGGCC lysC-R GGAGAAGAGTTCACGTTTATTATATAAAGACGCTGGTTAACAGAGTACAGGCTCG dapA-F CTCTGTTAACCAGCGTCTTTATATAATAAACGTGAACTCTTCTCCCAGC dapA-R CCAGGCTTTACACTTTATGCTTCGTCAGAACTACAGGCAGCG LysCT352I-F gtggcattaatccttgataccaccggttcaacctccactg LysCT352I-R gtatcaaggattaatgccacgctcacttctgacgtggtga dapAE84T-F CGCTAACGCTACTGCGACCGCCATTAGCCTGACG dapAE84T-R CGTCAGGCTAATGGCGGTCGCAGTAGCGTTAGCG [0058] 实施例3spoT基因缺失菌株构建 [0059] 1.L-苏氨酸生产菌株ATCC21151ΔspoT基因缺失突变株构建 [0060] L-苏氨酸生产菌株ATCC21151基因敲除方法采用经典的Red重组方法，参考相关文献进行。具体操作过程如下： [0061] 首先，制备菌株ATCC21151的感受态细胞，具体感受态细胞制备和转化过程参考J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》；利用质粒pKD46进行转化，获得ATCC21151/pKD46菌株；然后，利用基因片段spoTknock1转化ATCC21151/pKD46菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物spoT1-F/spoT1-R进行验证，验证正确的菌株命名为ATCC21151ΔspoT::SacBCm。最后，利用基因片段spoTknock2转化ATCC21151ΔspoT::SacBCm菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物spoT2-F/spoT2-R进行验证，验证正确的菌株命名为ATCC21151ΔspoT，至此L-苏氨酸生产菌株ATCC21151ΔspoT基因缺失突变株构建完毕。 [0062] 2.L-赖氨酸生产菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT基因缺失突变株构建[0063] L-赖氨酸生产菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*基因敲除方法采用经典的Red重组方法，参考相关文献进行。具体操作过程如下： [0064] 首先，制备菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*的感受态细胞，具体感受态细胞制备和转化过程参考J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》；利用质粒pKD46进行转化，获得MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株；然后，利用基因片段spoTknock2转化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物spoT2-F/spoT2-R进行验证，验证正确的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT::SacBCm。最后，利用基因片段spoTknock2转化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT::SacBCm菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物spoT2-F/spoT2-R进行验证，验证正确的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT，至此L-赖氨酸生产菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT基因缺失突变株构建完毕。 [0065] 实施例4 spoT基因缺失对L-苏氨酸发酵的影响 [0066] 为了验证spoT基因缺失对于L-苏氨酸发酵的影响，利用摇瓶发酵的方法对菌株ATCC21151和菌株ATCC21151ΔspoT进行发酵验证，具体过程如下： [0067] 发酵培养基如下表3所示： [0068] 表3 [0069] [0070] [0071] 将上述L-苏氨酸生产菌株单菌落分别接种5mL LB液体培养基，37℃，220rpm培养12h。按照初始OD为0.1转接装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶，37℃，220rpm培养36h，检测L-苏氨酸的浓度。 [0072] 菌株最终产量结果如表4所示，对照菌株ATCC21151中L-苏氨酸产量为5.3g/L，spoT基因缺失的菌株ATCC21151ΔspoT中L-苏氨酸产量为6.5g/L，比出发菌株提高了22.6％，表明在大肠杆菌中部分或全部缺失ppGpp水解酶和合成酶活性能够提高L-苏氨酸的产量。 [0073] 表4 [0074]菌株 L-苏氨酸g/L ATCC21151 5.3 ATCC21151ΔspoT 6.5 [0075] 实施例5spoT基因缺失对L-赖氨酸发酵的影响 [0076] 为了验证spoT基因缺失对于L-赖氨酸发酵的影响，利用摇瓶发酵的方法对菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*和菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT进行发酵验证，具体过程如下： [0077] 发酵培养基如下表5所示： [0078] 表5 [0079] [0080] [0081] 将上述L-赖氨酸生产菌株单菌落分别接种5mL含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃，220rpm培养12h。按照10％的接种量转接装有30mL发酵培养基的500mL三角瓶，37℃，220rpm培养28h，检测L-赖氨酸的浓度。 [0082] 菌株最终产量结果如表6所示，对照菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*中L-赖氨酸产量为4.5g/L，spoT基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT中L-赖氨酸产量为5.2g/L，比出发菌株提高了19.1％，表明在大肠杆菌中部分或全部缺失ppGpp水解酶和合成酶活性能够提高L-赖氨酸的产量。 [0083] 表6 [0084]菌株 L-赖氨酸g/L MG1655/pwsk-lysC*-dapA* 4.7 MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT 5.6 [0085] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。 |
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