用于生物合成异戊二烯的方法 |
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| 申请号 | CN201480053745.2 | 申请日 | 2014-08-05 | 公开(公告)号 | CN105683385A | 公开(公告)日 | 2016-06-15 |
| 申请人 | 英威达技术有限责任公司; | 发明人 | A.L.博特斯; A.V.E.康拉迪; | ||||
| 摘要 | 本文件描述了通过在从异丁酰-CoA，3-甲基-2- 氧 代戊酸，或4-甲基-2-氧代戊酸产生的中心前体中形成两个乙烯基基团产生异戊二烯的 生物 化学途径以及用于产生异戊二烯的重组宿主。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种用于酶促合成异戊二烯的方法，所述方法包括向3-甲基-戊-2-烯酰-[acp]，4-甲基-戊-2-烯酰-[acp]，3-甲基-3-羟基-戊酸，4-甲基-3-羟基戊酸，或甲羟戊酸以酶促引入末端乙烯基基团，并将所得的产物在一个或多个步骤中转化为异戊二烯。 |
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| 说明书全文 | 用于生物合成异戊二烯的方法[0001] 对相关申请的交叉引用 [0002] 本申请要求2013年8月5日提交的美国申请系列号61/862,401的优先权，其公开通过提述以其整体并入。 技术领域[0003] 本发明涉及使用一种或多种分离的酶例如脱水酶，单加氧酶，细胞色素P450，酰基-[acp]脱氢酶，甲羟戊酸二磷酸脱羧酶，酰基-[acp]脱羧硫酯酶，和甲羟戊酸-3-激酶中的一种或多种；或使用表达一种或多种这些酶的重组宿主细胞生物合成异戊二烯的方法。 [0004] 发明背景 [0005] 对于生产特殊弹性体，包括电机安装/配件，手术手套，橡皮筋，高尔夫球和鞋子，异戊二烯是一种重要的单体。苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物形成热熔压敏粘合剂配制剂的关键组分，而反式-聚-异戊二烯用于轮胎的制造(Whited等，Industrial Biotechnology,2010,6(3),152-163)。 [0007] 考虑到对石油化工原料和树木采伐的依赖，生物技术提供了通过生物催化的替代方法。生物催化是使用生物催化剂，例如酶，来进行有机化合物的生物化学转化。 [0008] 因而，针对此背景，很明显对于生产中间物，特别是异戊二烯的可持续方法有需要，其中所述方法是基于生物催化的。 [0009] 生物衍生原料和石油化工原料两者都是生物催化工艺的可行起始材料。 [0011] 在原核生物例如枯草芽孢杆菌和真核生物例如银白杨(Populus alba)中，存在引起异戊二烯合成的已知代谢途径(Whited等，2010,见上文)。 [0012] 可以通过通向前体二甲基乙烯基-PP的两种途径合成异戊二烯，例如甲羟戊酸和非甲羟戊酸途径(Kuzuyama,Biosci.Biotechnol.Biochem.,2002,66(8),1619-1627)。所述甲羟戊酸途径包含一种脱羧酶，甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(在下文中为MDD)，其将第一个乙烯基基团引入通向异戊二烯的前体中。第二个乙烯基基团由异戊二烯合酶(在下文中为ISPS)在异戊二烯合成的最终步骤中引入。 [0013] 所述甲羟戊酸途径(图1)已经在使用大肠杆菌作为宿主的异戊二烯生物催化生产中采用。工程化为具有甲羟戊酸途径的大肠杆菌需要三摩尔乙酰-CoA，三摩尔ATP和两摩尔NAD(P)H来生产一摩尔异戊二烯。考虑到甲羟戊酸途径的22.5％(w/w)的理论最大产出，已经以2g/(L·h)的体积计生产率从葡萄糖以和11％(w/w)的产率以生物催化生产异戊二烯(Whited等，2010,见上文)。特别地，甲羟戊酸到5-二磷酸甲羟戊酸的磷酸活化在代谢上是能量密集的，每摩尔异戊二烯合成需要两摩尔ATP(图1)。因此，减少ATP消耗可以改进该途径的效率。 [0014] 发明概述 [0015] 本发明人已经确定可构建生物化学途径来从(R)-甲羟戊酸，3-甲基-2-氧代戊酸，4-甲基-2-氧代戊酸或异丁酰-CoA，通过引入两个乙烯基基团而不需要末端醇磷酸化来合成异戊二烯。这些途径依赖于脱水酶，单加氧酶，细胞色素P450，或脱氢酶来引入第一个乙烯基基团；和MDD，甲羟戊酸-3-激酶，酰基-[acp]脱羧硫酯酶(例如，CurM TE)或芳樟醇脱水酶来将第二个乙烯基基团引入导致异戊二烯合成的前体。本文所述的方法可以包括引入第一个乙烯基基团，引入第二个乙烯基基团，或引入第一和第二乙烯基基团两者。 [0016] 在本发明之前，不知道能够引入两个乙烯基基团，而不需要末端醇磷酸化的酶可以用于生成非磷酸化的中间物用于异戊二烯合成。因此，本发明提供能够将中心前体甲羟戊酸，3-甲基-2-氧代戊酸，4-甲基-2-氧代戊酸或异丁酰-CoA转化为异戊二烯的酶。 [0017] 在一些实施方案中，由归类于，例如EC 4.2.1.-下的2-羟基酰基-CoA脱水酶，例如HadBC的基因产物(SEQ ID NOs:3和4)及其引发剂HadI(SEQ ID NO:2)，或HgdAB的基因产物(SEQ ID NOs:6和7)及其引发剂HdgC(SEQ ID NO:5)形成3-甲基-戊-2-烯酰-CoA或4-甲基-戊-2-烯酰-CoA。在一些实施方案中，所述2-羟基酰基-CoA脱水酶是酶工程的产物。从厌氧细菌分离的2-羟基酰基-CoA脱水酶拥有氨基酸降解途径中采用的常见催化机制。例如，来自艰难梭菌(Clostridium difficile)的HadBC/HadI的基因产物催化(R)-2-羟基异己酰-CoA转化为异己酰-CoA(isocaprenoyl-CoA)。类似的，HgdAB/HdgC的基因产物催化2-羟基-戊二酰-CoA(2-hydroxyglutaryl-CoA)转化为戊烯二酰-CoA(glutaconyl-CoA)(Kim等，FEMS Microbiol.Reviews,2004,28,455–468)。见图2-5。 [0018] 在一些实施方案中，将第一个乙烯基基团引入3-甲基-戊-2-烯酰-CoA中，衍生于中心代谢物3-甲基-2-氧代戊酸，其可以在一个或多个步骤中酶促转化为3-甲基-3-羟基戊-4-烯酸或3-甲基-3-磺酰-戊-4-烯酰-ACP(例如，如图2中所示)。已证明来自卡那链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)的tcsD的基因产物(SEQ ID NO:14)对于直链和支链C5酰基-ACP底物具有脱氢酶活性(Mo等，JACS,2011,133,976-985)。 [0019] 在一些实施方案中，引入第一个乙烯基基团，形成4-甲基-戊-2-烯酰-ACP，衍生于中心代谢物4-甲基-2-氧代戊酸或异丁烯-CoA，其可以在一个或多个步骤中酶促转化为4-甲基-3-羟基戊-4-烯酸，4-甲基-3-磺酰-戊-4-烯酰-ACP，或3-甲基-3-丁烯-2-醇(例如，见图3，图6和图7)。已经证明来自卡那链霉菌的tcsD的基因产物(SEQ ID NO:14)对于4-甲基-戊-2-烯酰-ACP具有脱氢酶活性(Mo等，2011,见上文)。 [0020] 在一些实施方案中，将第一个乙烯基基团引入3-甲基-3-羟基-戊酸，其可以在一个或多个步骤中酶促转化为酶促转化为3-甲基-3-羟基戊-4-烯酸(例如，见图4)。已经证明由mdpJ编码的单加氧酶(SEQ ID NO:15)将末端双键引入结合到仲醇(secondary alcohol)的烯丙基基团( 等，Appl.Environ.Microbiol.,2012,78(17),6280-6284)。 [0021] 在一些实施方案中，将第一个乙烯基基团引入4-甲基-3-羟基戊酸，其可以在一个或多个步骤中酶促转为4-甲基-3-羟基戊-4-烯酸(见，例如，图5)。 [0022] 在一些实施方案中，将第一个乙烯基基团引入甲羟戊酸，其可以在一个或多个步骤中酶促转为3-羟基-3-甲基-戊-4-烯酸(见，例如，图8)。 [0023] 在一些实施方案中，由归类于，例如EC 4.2.1.119下的(R)-特异性烯酰-CoA水合酶例如phaJ(SEQ ID NO:16,Fukui等，J.Bacteriol.,1998,180(3),667-673)或MaoC(SEQ ID NO:17；Park and Lee,J.Bacteriol.,2003,185(18),5291–5397)的基因产物，或归类于，例如EC 4.2.1.7下的细菌(S)-特异性烯酰-CoA水合酶，例如YsiB的基因产物(SEQ ID NO:1)将3-羟基官能团引入3-甲基-戊-2-烯酰-CoA或4-甲基-戊-2-烯酰-CoA。在一些实施方案中，所述烯酰-CoA水合酶是酶工程的产物。用于将3-羟基官能团引入3-甲基丁烷-2-烯酰-CoA(3-methylbuten-2-enoyl-CoA)的单个酶候选物先前已经在Galactomyces reessii的无细胞提取物中鉴定，含有归类于EC 4.2.1.17下的烯酰-CoA水合酶，其将3-甲基丁烷-2-烯酰-CoA(3-methylbuten-2-enoyl-CoA)转化为3-羟基-3-甲基丁酰-CoA(Lee等，Appl.Environ.Microbiol.,1997,63(11),4191–4195)。细菌来源的同等烯酰-CoA水合酶活性还未鉴定。见图4和图5。 [0024] 在一些实施方案中，通过使用归类于，例如EC 2.3.1.-(EC 2.3.1.41，EC 2.3.1.79，或EC 2.3.1.80)下的β-酮脂酰-ACP-合酶，例如AnlF的基因产物(SEQ ID NO:18)缩合异丁酰-CoA和丙二酰-ACP形成4-甲基-3-氧代戊酰-ACP。已经证明anlF的基因产物缩合异丁酰-CoA和丙二酰-ACP(Lechner等，ACS Synth.Biol.,2013,2(7),379-83)。 [0025] 在一些实施方案中，由甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(Lefurgy等，J.Biol.Chem.,2010,285(27),20654–20663)或甲羟戊酸3-激酶(Vinokur等，Biochemistry,2014,53(25),4161- 4168)将第二个乙烯基基团引入中等链碳链烯酸(alkenoate)，将3-甲基-3-羟基戊-4-烯酸或4-甲基-3-羟基戊-4-烯酸转化为异戊二烯(图2-5)。 [0026] 在一些实施方案中，由脱羧硫酯酶(CurM TE)将第二个乙烯基基团引入中等链碳链烯酸，将3-甲基-3-磺酰-戊-4-烯酰-ACP或4-甲基-3-磺酰-戊-4-烯酰-ACP转化为异戊二烯(见图2，图3和图6；Gehret等，J.Biol.Chem.,2011,286(16),14445–14454) [0027] 在一些实施方案中，由归类于，例如EC 4.2.1.127下的芳樟醇脱水酶(Brodkorb等，J.Biol.Chem.,2010,285(40),30436–30442)或归类于EC 4.2.1.-下的脱水酶(例如从物种例如Aquincola tertiaricarbonis或Methylibium petroleiphilum分离的脱水酶；等，2011,见上文)引入第二个乙烯基基团(见图3和图7)。 [0028] 在一个方面，本文件的特征在于用于酶促合成异戊二烯的方法。所述方法包括向3-甲基-戊-2-烯酰-[acp]，4-甲基-戊-2-烯酰-[acp]，3-甲基-3-羟基-戊酸，4-甲基-3-羟基戊酸，或甲羟戊酸酶促引入末端乙烯基基团，并在一个或多个步骤中将所得的产物转化为异戊二烯。可以使用归类于EC 4.2.1.-下的脱水酶(例如，与SEQ ID NO:22中的氨基酸序列具有至少70％同源性的脱水酶)，单加氧酶(例如，与SEQ ID NO:15中的氨基酸序列具有至少70％同源性的单加氧酶)，细胞色素P450还原酶，或酰基-[acp]脱氢酶(例如，与SEQ ID NO:14中的氨基酸序列具有至少70％同源性的酰基-[acp]脱氢酶)引入第一个乙烯基基团。 例如，可以使用酰基-[acp]脱氢酶将末端乙烯基基团引入3-甲基-戊-2-烯酰-[acp]或4-甲基-戊-2-烯酰-[acp]。例如，可以使用归类于EC 4.2.1.-下的脱水酶将末端乙烯基基团引入甲羟戊酸。例如，可以使用单加氧酶或细胞色素P450还原酶将末端乙烯基基团引入3-甲基-3-羟基-戊酸或4-甲基-3-羟基戊酸。可以从3-甲基-2-氧代戊酸，4-甲基-2-氧代戊酸，或异丁酰-CoA酶促形成3-甲基-戊-2-烯酰-[acp]，4-甲基-戊-2-烯酰-[acp]，3-甲基-3-羟基-戊酸，4-甲基-3-羟基戊酸或甲羟戊酸。 [0029] 本文件的特征还在于用于酶促合成异戊二烯的方法，包括向3-甲基-3-羟基-戊-4-烯酸，4-甲基-3-羟基戊-4-烯酸，4-甲基-3-磺酰戊-4-烯酰-[acp]，或3-甲基-3-丁烯-2-醇引入第二个末端乙烯基基团以生产异戊二烯。可以使用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶，甲羟戊酸3-激酶，酰基-[acp]脱羧硫酯酶，或芳樟醇脱水酶引入所述第二个乙烯基基团。所述甲羟戊酸二磷酸脱羧酶可以与SEQ ID NOs：8-11中列出的任一氨基酸序列的甲羟戊酸二磷酸脱羧酶具有至少70％的同源性。所述甲羟戊酸3-激酶可以与SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有至少70％的同源性。所述酰基-[acp]脱羧硫酯酶可以与SEQ ID NO：21的氨基酸序列具有至少70％的同源性。芳樟醇脱氢酶可以与与SEQ ID NO：13的氨基酸序列具有至少70％的同源性。所述甲羟戊酸二磷酸脱羧酶在比对SEQ ID NO:11的残基74的位置可以具有组氨酸和/或在比对SEQ ID NO:11的残基145的位置具有苯丙氨酸。所述甲羟戊酸二磷酸脱羧酶可以具有SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列，只是在位置74处用组氨酸取代精氨酸和/或在位置145处用苯丙氨酸取代异亮氨酸。例如，所述甲羟戊酸二磷酸脱羧酶可以将3-甲基-3-羟基戊-4-烯酸或4-甲基-3-羟基戊-4-烯酸转化为异戊二烯。例如，甲羟戊酸3-激酶可以将3-甲基-3-羟基戊-4-烯酸或4-甲基-3-羟基戊-4-烯酸转化为异戊二烯。例如，酰基-[acp]脱羧硫酯酶可以将3-甲基-3-磺酰戊-4-烯酰-[acp]或4-甲基-3-磺酰戊-4-烯酰-[acp]转化为异戊二烯。例如，芳樟醇脱水酶可以将3-甲基-3-丁烯-2-醇转化为异戊二烯。 [0030] 可以使用分离的酶进行本文所述的任意方法。 [0031] 可以使用包含所述酶的细胞裂解物进行本文所述的任意方法。 [0032] 可以在重组宿主中进行本文所述的任意方法。例如，宿主可以是选自下组的原核生物：埃希氏菌属(Escherichia)如大肠杆菌(Escherichia coli)；来自梭菌属(Clostridia)如杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)或克氏梭菌(Clostridium kluyveri)；来自棒状杆菌属 (Corynebacteria)如谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)；来自贪铜菌属(Cupriavidus)如钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)或耐金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans)；来自假单胞菌属(Pseudomonas)如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)或恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；来自芽孢杆菌属(Bacillus)如枯草芽胞杆菌(Bacillus subtillis)；或来自红球菌属(Rhodococcus)如马红球菌 (Rhodococcus equi)。所述宿主可以是选自下组的真核生物：曲霉菌属(Aspergillus)如黑曲霉菌(Aspergillus niger)；来自酵母菌(Saccharomyces)属如酿酒酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae)；来自毕赤氏酵母属(Pichia)如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；来自耶氏酵母属(Yarrowia)如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；来自伊萨酵母属(Issatchenkia)如东方伊萨酵母(Issathenkia orientalis)；来自德巴利氏酵母属(Debaryomyces)如汉逊德巴利氏酵母(Debaryomyces hansenii)；来自Arxula属如Arxula adenoinivorans；或者来自克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。 [0034] 进料至发酵的主要碳源可以衍生于生物或非生物原料。所述生物原料可以是以下物质，或衍生于以下物质：单糖，二糖，半纤维素例如乙酰丙酸和糠醛，纤维素，木质纤维素，木质素，甘油三酯例如甘油和脂肪酸，农业废物或城市废物。所述非生物原料可以是以下物质，或衍生于以下物质：天然气、合成气、CO2/H2，甲醇，乙醇，非挥发性残留物(NVR)，来自环己烷氧化过程的碱洗液，或来自化学或石油化学工业的其它废物流。 [0035] 本文件的特征还在于生产异戊二烯的重组宿主。所述宿主包括至少一种编码以下酶的外源性核酸：(i)2-羟基酰基-CoA脱水酶或β-酮酰-ACP-合酶；(ii)酰基-ACP脱氢酶，单加氧酶，细胞色素P450，或归类于EC 4.2.1.-下的脱水酶和(iii)甲羟戊酸二磷酸脱羧酶，甲羟戊酸3-激酶，酰基-[acp]脱羧硫酯酶，或芳樟醇脱水酶，所述宿主生产异戊二烯。所述宿主可以包括至少一种编码以下酶的外源性核酸：(i)2-羟基酰基-CoA脱水酶，(ii)酰基-ACP脱氢酶，和(iii)甲羟戊酸二磷酸脱羧酶，甲羟戊酸3-激酶，酰基-[acp]脱羧硫酯酶，或芳樟醇脱水酶。所述宿主可以包括至少一种编码以下酶的外源性核酸：(i)2-羟基酰基-CoA脱水酶，(ii)单加氧酶或细胞色素P450，和(iii)甲羟戊酸二磷酸脱羧酶，甲羟戊酸3-激酶，酰基-[acp]脱羧硫酯酶，或芳樟醇脱水酶。所述宿主可以包括至少一种编码以下酶的外源性核酸：(i)β-酮酰-ACP-合酶，(ii)酰基-ACP脱氢酶，和(iii)甲羟戊酸二磷酸脱羧酶，甲羟戊酸3-激酶，酰基-[acp]脱羧硫酯酶，或芳樟醇脱水酶。 [0036] 本文件的特征还在于重组宿主，其包括至少一种编码以下酶的外源性核酸(i)归类于EC 4.2.1.-下的脱水酶和(ii)甲羟戊酸二磷酸脱羧酶或甲羟戊酸3-激酶，所述宿主生产异戊二烯。 [0037] 在任意所述重组宿主中，可以对宿主引入或基因投入导致类异戊二烯合成的来自甲羟戊酸途径的酶，例如归类于EC 2.3.1.9，EC 2.3.3.10，EC 1.1.1.34或EC 1.1.1.88下的酶，所述宿主利用非甲羟戊酸或2-C-甲基-D-赤藓糖醇4磷酸途径用于类异戊二烯合成。 [0038] 在所述重组宿主中，可以将来自非甲羟戊酸或2-C-甲基-D-赤藓糖醇4磷酸途径的酶引入宿主微生物中，其利用甲羟戊酸途径用于类异戊二烯合成。 [0039] 在本文所述的任意重组宿主中，所述宿主可以包括一种或多种以下减弱的酶：接受甲羟戊酸作为底物的归类于EC 2.7.1.36下的酶，聚合物合酶，乙酸激酶，乳酸脱氢酶，将磷酸烯醇式丙酮酸降解为琥珀酸的酶，以及将乙酰-CoA降解为乙醇的酶。 [0040] 在本文所述的任意重组宿主中，所述宿主可以过表达一种或多种编码以下酶的基因：用于3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸合成的酶，吡啶核苷酸转氢酶，甘油醛-3-磷酸-脱氢酶，苹果酸酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，和果糖1,6-二磷酸酶。 [0041] 在本文所述的任意重组宿主中，所述宿主可以包括乙酰乳酸合酶的反馈抑制抗性突变体。 [0042] 在本文所述的任意重组宿主中，所述宿主可以包括在启动子控制下的乙酰乳酸合酶，所述启动子不受制于通过支链氨基酸的基因抑制。 [0043] 本文所述途径的反应可以在一种或多种细胞(例如宿主细胞)株中进行，所述细胞株(a)天然表达一种或多种相关酶，(b)经遗传工程化而表达一种或多种相关酶，或(c)天然表达一种或多种相关酶并经遗传工程化而表达一种或多种相关酶。或者，可以从以上任意种类的宿主细胞中提取相关酶，并以纯化或半纯化形式使用。提取的酶可选地固定在固体基质上，例如适合的反应容器的底和/或壁。此外，这些提取物包括可以作为相关酶来源使用的裂解物(如细胞裂解物)。在本申请提供的方法中，所有步骤可以在细胞(例如宿主细胞)中进行，所有步骤可以使用提取的酶进行，或一些步骤可以在细胞中进行，而其它步骤可以使用提取的酶进行。 [0044] 除非另外定义，本申请使用的所有技术和科学术语的定义与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的含义相同。虽然与本申请所述的方法和材料相似或者等同的方法和材料也可用于实践本发明，下文描述适合的方法和材料。本文提及的所有公开、专利申请、专利和其它参考文献通过提述完整并入本文。在冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。另外，材料、方法和实施例仅为说明性的而不意图限制。 [0045] 本发明的一个或多个实施方案的细节列于下面的附图和描述中。根据说明书和附图，并根据权利要求，本发明的其它特征、目的和优点将显而易见。根据专利法的标准实践，词语“包含”在权利要求中可被“基本上由…组成”或者“由…组成”替代。 [0046] 附图简述 [0047] 图1是通过异戊烯二磷酸和二甲基烯丙基二磷酸，使用(R)-甲羟戊酸作为中心前体通向异戊二烯的示例性生物化学途径的示意图。 [0048] 图2是使用3-甲基-2-氧代戊酸作为中心前体和酰基-ACP脱氢酶通向异戊二烯的示例性生物化学途径的示意图。 [0049] 图3是使用4-甲基-2-氧代戊酸作为中心前体和酰基-ACP脱氢酶通向异戊二烯的示例性生物化学途径的示意图。 [0050] 图4是使用3-甲基-2-氧代戊酸作为中心前体和单加氧酶通向异戊二烯的示例性生物化学途径的示意图。 [0051] 图5是使用4-甲基-2-氧代戊酸作为中心前体和单加氧酶通向异戊二烯的示例性生物化学途径的示意图。 [0052] 图6是使用异丁酰-CoA作为中心前体和酰基-ACP脱氢酶以引入第一个乙烯基基团和GHMP超家族酶以引入第二个乙烯基基团，通向异戊二烯的示例性生物化学途径的示意图。 [0053] 图7是使用异丁酰-CoA作为中心前体和酰基-ACP脱氢酶以引入第一个乙烯基基团和脱水酶，例如芳樟醇脱水酶以引入第二个乙烯基基团，通向异戊二烯的示例性生物化学途径的示意图。 [0054] 图8是使用(R)-甲羟戊酸作为中心前体通过3-羟基-3-甲基-戊-4-烯酸通向异戊二烯的示例性生物化学途径的示意图。 [0055] 图9含有由YsiB编码的枯草芽孢杆菌烯酰-CoA脱水酶(见，Genbank登录号CAA99573.1,SEQ ID NO:1)，由HadIb编码的艰难梭菌2-羟基酰基-CoA脱水酶活化剂(见，Genbank登录号AAV40818.1,SEQ ID NO:2)，由HadBC编码的艰难梭菌2-羟基酰基-CoA脱水酶(见Genbank登录号AAV40819.1和AAV40820.1，分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)，由HgdC编码的发酵氨基酸球菌2-羟基酰-CoA脱水酶活化剂(见Genbank登录号CAA42196.1,SEQ ID NO:5)，由HdgAB编码的发酵氨基酸球菌2-羟基酰-CoA脱水酶(见Genbank登录号CAA32465.1和CAA32466.1,分别为SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7)，酿脓链球菌甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(见Genbank登录号AAK33797.1,SEQ ID NO:8)，Thioalkalimicrobium aerophilum甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(见Genbank登录号AHF01884.1,SEQ ID NO:9)，肺炎链球菌甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(见Genbank登录号CAR68209.1,SEQ ID NO:10)，酿酒酵母甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(见Genbank登录号CAA66158.1,SEQ ID NO:11)，嗜酸热原体甲羟戊酸3-激酶(见Genbank登录号CAC12426.1,SEQ ID NO:12)，Castellaniella defragrans芳樟醇脱水酶(见Genbank登录号CBW30776.1,SEQ ID NO:13)，由tesD编码的卡那链霉菌酰基-ACP脱氢酶(见Genbank登录号ADU56239.1,SEQ ID NO:14)，由mdpJ编码的Aquincola tertiaricarbonis单加氧酶(见Genbank登录号AER12131.1,SEQ ID NO:15)，由phaJ编码的斑点气单胞菌烯酰-CoA脱水酶(见Genbank登录号BAA21816.1,SEQ ID NO:16)，由MaoC编码的大肠杆菌烯酰-CoA脱水酶(见Genbank登录号AFY98994.1,SEQ ID NO:17)，由AnlF编码的链霉菌属sp.CNH189的β-酮脂酰-ACP-合酶(见Genbank登录号AFY98994.1,SEQ ID NO:18)，由OLS ST编码的聚球藻属PCC 7002磺基转移酶结构域(见Genbank登录号ACA99172.1,SEQ ID NO:19)，由CurM ST编码的Moorea producens 19L磺基转移酶结构域(见Genbank登录号ACV42478.1,SEQ ID NO:20)，由CurM TE编码的Moorea producens 19L硫酯酶结构域(见Genbank登录号ACV42478.1,SEQ ID NO:21)和由ohyA编码的Elizabethkingia meningoseptica油酸合酶(见Genbank登录号ACT54545.1,SEQ ID NO:22)。 [0056] 图10是烯酰-CoA水合酶(由phaJ编码)的正向活性，接受巴豆酰-CoA作为底物的分光光度酶测定的结果图。 [0057] 图11表格提供了对烯酰-CoA水合酶(由phaJ编码)的反向活性，接受外消旋3-羟基丁酰-CoA作为底物的酶测定的LC-MS分析的详情。 [0058] 图12表格提供了对烯酰-CoA水合酶(由phaJ编码)的反向活性，接受3-甲基-3-羟基戊酰-CoA作为底物的酶测定的LC-MS分析的详情。 [0059] 图13表格提供了对烯酰-CoA水合酶(由phaJ编码)的反向活性，接受4-甲基-3-羟基戊酰-CoA作为底物的酶测定的LC-MS分析的详情。 [0060] 图14是相对于空载体对照将3-甲基-3羟基戊-4-烯酸转化为异戊二烯的GHMP超家族酶(AAK33797.1,SEQ ID NO:8；AHF01884.1,SEQ ID NO:9；CAR68209.1,SEQ ID NO:10；CAA66158.1,SEQ ID NO:11；CAA66158.1在位置74具有组氨酸代替精氨酸；CAA66158.1在位置74具有组氨酸代替精氨酸和位置145苯丙氨酸代替异亮氨酸；CAC12426.1,SEQ ID NO: 12)的对数GC-MS种类丰度的柱状图。 [0061] 图15是相对于空载体对照将3-甲基-3-丁烯-2-醇转化为异戊二烯的芳樟醇脱水酶(CBW30776.1,SEQ ID NO:13)的GC-MS峰值面积的柱状图。 [0062] 发明详述 [0063] 具体的，本发明提供用于异戊二烯合成的酶和重组宿主微生物，其中在一个或多个酶促步骤中将两个乙烯基基团引入中心前体，例如3-甲基-戊-2-烯酰-[acp]，4-甲基-戊-2-烯酰-[acp]，3-甲基-3-羟基-戊酸，4-甲基-3-羟基戊酸，或甲羟戊酸以产生异戊二烯。可以在一个或多个酶促步骤中，从3-甲基-2-氧代戊酸，4-甲基-2-氧代戊酸，或异丁烯-CoA酶促产生3-甲基-戊-2-烯酰-[acp]，4-甲基-戊-2-烯酰-[acp]，3-甲基-3-羟基-戊酸，4-甲基-3-羟基戊酸。如本文所述使用的，术语“中心前体”用于表示本文所示的任意代谢途径中的任意代谢物，其通向异戊二烯的合成。术语“中心代谢产物”用于本文表示在所有微生物中生产以支持生长的代谢产物。 [0064] 因此，本文所述的宿主微生物可以包括能够操作而使得可以生成异戊二烯的途径。在内源性途径中，所述宿主微生物天然表达催化所述途径中反应的所有酶。含有工程化途径的宿主微生物不天然表达催化所述途径中反应的所有酶，但已经过工程化使得所述途径中的所有的酶在所述宿主中表达。 [0065] 术语“外源性”用于本文关于核酸(或蛋白)和宿主，指代不在特定种类的细胞中以其在自然界中存在的形式发生(也不能从其获得)的核酸，或由此类核酸编码的蛋白。因此，非天然发生的核酸一旦在宿主中时，认为对于该宿主是外源性的。重要的是要注意非天然发生的核酸可以含有在自然界存在的核酸亚序列或核酸序列片段，只要所述核酸作为整体在自然界中不存在。例如，表达载体中含有基因组DNA序列的核酸分子是非天然发生的核酸，因此一旦引入到宿主中其对于宿主是外源性的，因为该核酸分子作为整体(基因组DNA加上载体DNA)在自然界不存在。因此，任意载体，自主复制质粒，或病毒(例如逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)，其作为整体在自然界中不存在，认为是非天然发生的核酸。由此得出结论通过PCR或限制性内切酶处理产生的基因组DNA片段和cDNA认为是非天然发生的核酸，因为其作为单独的分子在自然界中不存在。还由此得出结论含有以自然界中不存在的排列的启动子序列和多肽编码序列(例如cDNA或基因组DNA)的任意核酸是非天然发生核酸。天然发生的核酸对于具体的宿主微生物可以是外源性的。例如，从酵母x的细胞分离的整个染色体一旦该染色体引入到酵母y的细胞中，其对于酵母y的细胞是外源性核酸。 [0066] 与此相反，术语“内源性”用于本文关于核酸(例如基因)(或蛋白)和宿主，指代核酸(或蛋白)确实以其在自然界中存在的形式在特定的宿主中发生(并能够从其获得)。此外，“内源性表达”核酸(或蛋白)的细胞如相同特定种类的宿主一样以其在自然界中存在的形式表达该核酸(或蛋白)。此外，“内源性生产”核酸、蛋白或其它化合物产物的宿主如相同特定种类的宿主一样以其在自然界中存在的形式生产该核酸、蛋白或化合物。 [0067] 例如，取决于宿主和由所述宿主生产的化合物，可以在所述宿主中表达一种或多种以下酶：2-羟基酰基-CoA脱水酶，3-羟基酰基-[acp]脱水酶，(R)-2-羟基酰基脱氢酶，酰基-ACP脱氢酶例如tcsD的基因产物，单加氧酶例如mdpJ的基因产物，(R)-特异性烯酰-CoA脱水酶例如pha或MaoC的基因产物，(S)-特异性烯酰-CoA脱水酶例如YsiB的基因产物，β-酮脂酰-ACP合酶例如AnlF的基因产物，甲羟戊酸二磷酸脱羧酶，甲羟戊酸3-激酶，脱羧硫酯酶，脱水酶，芳樟醇脱水酶，油酸水合酶例如ohyA的基因产物，a kevitone加水酶(hydrase)、类胡萝卜素1,2-水合酶、CoA转移酶、CoA连接酶，酰基转移酶，硫酯酶，酰基[acp]硫酯酶，3-羟基酰基-[acp]:CoA转酰酶，磺基转移酶，乙酰乙酸脱羧酶，仲醇脱氢酶，羟甲基戊二酰-CoA还原酶，羟甲基戊二酰-CoA合酶，或3-氧酰-[acp]还原酶。 [0068] 在一些实施方案中，重组宿主包括至少一种编码以下项的外源性核酸：(i)2-羟基酰基-CoA脱水酶或β-酮脂酰-ACP合酶；(ii)酰基-ACP脱氢酶，单加氧酶，细胞色素P450或归类于EC 4.2.1.-下的脱水酶和(iii)甲羟戊酸二磷酸脱羧酶，甲羟戊酸3-激酶，酰基-ACP脱羧硫酯酶，或芳樟醇脱水酶，并产生异戊二烯。例如，宿主可以包括至少一种编码以下项的外源性核酸：2-羟基酰基-CoA脱水酶，酰基-ACP脱氢酶和甲羟戊酸二磷酸脱羧酶，甲羟戊酸3-激酶，酰基-ACP脱羧硫酯酶，或芳樟醇脱水酶。例如，宿主可以包括至少一种编码以下项的外源性核酸：(i)2-羟基酰基-CoA脱水酶,(ii)单加氧酶或细胞色素P450，和(iii)甲羟戊酸二磷酸脱羧酶，甲羟戊酸3-激酶，酰基-ACP脱羧硫酯酶，或芳樟醇脱水酶。例如，宿主可以包括至少一种编码以下项的外源性核酸：(i)β-酮脂酰-ACP合酶，(ii)酰基-ACP脱氢酶，和(iii)甲羟戊酸二磷酸脱羧酶，甲羟戊酸3-激酶，酰基-ACP脱羧硫酯酶，或芳樟醇脱水酶。 [0069] 在一些实施方案中，重组宿主包括至少一种编码以下项的外源性核酸：(R)-2-羟基酰基脱氢酶，2-羟基酰基-CoA脱水酶，2-羟基酰基-CoA脱水酶引发剂，和酰基-[acp]脱氢酶并产生3-甲基-戊-2,4-二烯酰-[acp]或4-甲基-戊-2,4-二烯酰-[acp]。这种宿主也可以包括一种或多种以下外源性酶：CoA转移酶或CoA连接酶，和/或酰基转移酶和4’磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，并产生3-甲基-戊-2,4-二烯酰-[acp]或4-甲基-戊-2,4-二烯酰-[acp]。这些宿主的任一种可以进一步包括外源性3-羟基酰基-[acp]脱水酶并产生3-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]或4-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]。见图2和3。 [0070] 在一些实施方案中，重组宿主可以包括编码一种或多种β-酮脂酰-ACP合酶的外源性核酸，并产生4-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]。这宿主也可以包括一种或多种以下酶：3-氧酰-[acp]还原酶，3-羟基酰基-[acp]脱水酶和酰基-CoA脱氢酶并产生4-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]。见图6和图7。 [0071] 在一些实施方案中，产生3-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]或4-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]的重组宿主可以进一步包括外源性磺基转移酶和外源性脱羧硫酯酶并产生异戊二烯。见图2，图3和图6。 [0072] 在一些实施方案中，产生3-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]或4-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]的重组宿主可以包括下列一种或多种：外源性(R)-3-羟基酰基-[acp]:CoA转酰酶，和甲羟戊酸二磷酸脱羧酶或甲羟戊酸3-激酶并产生异戊二烯。这种宿主可以包括硫酯酶或CoA转移酶，并产生异戊二烯。见图2，图3和图6。 [0073] 在一些实施方案中，产生3-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]或4-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]的重组宿主进一步可以包括下列一种或多种：外源性硫酯酶(例如，酰基[acp]硫酯酶)和甲羟戊酸二磷酸脱羧酶或甲羟戊酸3-激酶并产生异戊二烯。见图2，图3和图6。 [0074] 在一些实施方案中，产生4-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]的重组宿主可以包括下列一种或多种：外源性(R)-3-羟基酰基-[acp]:CoA转酰酶，乙酰乙酸脱羧酶，仲醇脱氢酶，芳樟醇脱水酶并产生异戊二烯。这种宿主也可以包括下列一种或多种外源性酶：脱氢酶，CoA-转移酶，和/或硫酯酶并产生异戊二烯。见图3和图7。 [0075] 在一些实施方案中，产生4-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]的重组宿主可以包括下列一种或多种：外源性硫酯酶(例如，酰基[acp]硫酯酶)，乙酰乙酸脱羧酶，仲醇脱氢酶，和芳樟醇脱水酶并产生异戊二烯。这种宿主也可以包括外源性3-氧酰-[acp]还原酶并产生异戊二烯。见图7。 [0076] 在一些实施方案中，重组宿主可以包括至少一种编码以下酶的外源性核酸：(R)-2-羟基酰基脱氢酶，2-羟基酰基-CoA脱水酶和2-羟基酰基-CoA脱水酶引发剂，和(R)-特异性或(S)特异性烯酰-CoA水合酶并产生3-甲基-3-羟基-戊酰-CoA或4-甲基-3-羟基-戊酰-CoA。这种宿主也可以包括一种或多种以下外源性酶：CoA转移酶或CoA连接酶，和/或酰基转移酶和4’磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，并产生3-甲基-3-羟基-戊酰-CoA或4-甲基-3-羟基-戊酰-CoA。这些宿主可以进一步包括外源性硫酯酶或CoA转移酶并进一步产生3-甲基-3-羟基戊酸或4-甲基-3-羟基戊酸。任意这些宿主可以进一步包括单加氧酶并产生3-甲基-3-羟基-戊-4-烯酸或4-甲基-3-羟基-戊-4-烯酸。见图4和图5。 [0077] 产生3-甲基-3-羟基戊-4-烯酸或4-甲基-3-羟基戊-4-烯酸的重组宿主可以包括甲羟戊酸二磷酸脱羧酶或甲羟戊酸3-激酶并产生异戊二烯。见图4和图5。 [0078] 在一些实施方案中，重组宿主可以包括外源性脱水酶，甲羟戊酸二磷酸脱羧酶或甲羟戊酸3-激酶并产生异戊二烯。这种宿主可以进一步包括一种或多种以下外源性酶：乙酰-CoA C-乙酰转移酶，羟甲基戊二酰-CoA合酶，和/或羟甲基戊二酰-CoA还原酶，见图8。 [0079] 在工程化途径中，所述酶可以来自单个来源，例如来自于一个物种，或可以来自于多个来源，例如不同的物种。编码本文所述的酶的核酸已经从多种生物鉴定，并在公共数据库例如GenBank或EMBL中容易获得。 [0080] 本文所述的可用于生产异戊二烯的任意酶可以与对应野生型酶的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。 [0081] 例如，本文所述的烯酰-CoA水合酶可以与枯草芽孢杆菌(GenBank Accession No.CAA99573.1,SEQ ID NO:1)，斑点气单胞菌(Genbank Accession No.BAA21816.1,SEQ ID NO:16)，或大肠杆菌(Genbank Accession No.AFY98994.1,SEQ ID NO:1)烯酰-CoA水合酶的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。参见图9。 [0082] 例如，本文所述的2-羟基酰基-CoA脱水酶可以与由HadBC编码的艰难梭菌2-羟基酰基-CoA脱水酶(Genbank Accession Nos.AAV40819.1和AAV40820.1,分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)或由HdgAB编码的发酵氨基酸球菌2-羟基酰基-CoA脱水酶(Genbank Accession Nos.CAA32465.1和CAA32466.1,分别为SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7)的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。见图9。 [0083] 本文所述的的2-羟基酰基-CoA脱水酶活化剂可以与艰难梭菌(Genbank Accession No.AAV40818.1,SEQ ID NO:2)或发酵氨基酸球菌(Genbank Accession No.CAA42196.1,SEQ ID NO:5)2-羟基酰基-CoA脱水酶活化剂的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。 见图9。 [0084] 例如，本文所述的甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(MDD)可以与酿脓链球菌(Genbank Accession No.AAK33797.1,SEQ ID NO:8)，Thioalkalimicrobium aerophilum(Genbank Accession No.AHF01884.1,SEQ ID NO:9)，酿酒酵母(GenBank Accession No.CAA66158.1,SEQ ID NO:11)或肺炎链球菌(GenBank Accession No.CAR68209.1,SEQ ID NO:10)的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、 90％、95％、97％、98％、99％或100％)。见图9。 [0085] 例如，本文所述的甲羟戊酸3-激酶可以与嗜酸热原体(Genbank Accession No.CAC12426.1,SEQ ID NO:12)甲羟戊酸3-激酶的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。见图9。 [0086] 例如，本文所述的脱水酶可以与来自Castellaniella defragrans的芳樟醇脱水酶的氨基酸序列(GenBank Accession No.CBW30776.1,SEQ ID NO:13)具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。见图9。 [0087] 例如，本文所述的酰基-ACP脱氢酶可以与来自卡那霉素链霉菌(由tcsD基因编码)酰基-CoA脱氢酶的氨基酸序列(GenBank Accession No.ADU56239.1,SEQ ID NO:14)具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。见图9。 [0088] 例如，本文所述的单加氧酶可以与由mdpJ编码的Aquincola tertiaricarbonis单加氧酶的氨基酸序列(Genbank Accession No.AER12131.1,SEQ ID NO:15)具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。见图9。 [0089] 例如，本文所述的β-酮脂酰-ACP合酶可以与链霉菌CNH189(Genbank Accession No.AFY98994.1,SEQ ID NO:18)β-酮脂酰-ACP合酶的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。见图9。 [0090] 例如，本文所述的磺基转移酶可以与聚球藻属PCC 7002(Genbank Accession No.ACA99172.1,SEQ ID NO:19)或Moorea producens 19L(Genbank Accession No.ACV42478.1,SEQ ID NO:20)磺基转移酶的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。见图9。 [0091] 例如，本文所述的脱羧硫酯酶可以与Moorea producens 19L(Genbank Accession No.ACV42478.1,SEQ ID NO:21)脱羧硫酯酶的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。见图9。 [0092] 两个氨基酸序列之间的同一性(同源性)百分比可以如下确定。首先，使用来自含有BLASTP 2.0.14版本的单机版BLASTZ的BLAST 2 Sequence(Bl2seq)程序比对所述氨基酸序列。BLASTZ的这一单机版可以从Fish&Richardson的网站(例如www.fr.com/blast/)或者美国政府的National Center for Biotechnology Information网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)上获得。解释如何使用Bl2seq程序的说明可以在BLASTZ随附的自述文件中找到。Bl2seq使用BLASTP算法进行两个氨基酸序列之间的比较。为了比较两个氨基酸序列，Bl2seq的选项如下设定：-i设置为含有待比较的第一个氨基酸序列的文件(例如C:\seq1.txt)；-j设置为含有待比较的第二个氨基酸序列的文件(例如C:\seq2.txt)；-p设置为blastp；-o设置为任意所需的文件名(例如C:\output.txt)；所有其它选项保留其默认设置。例如，以下命令可以用于生成含有两个氨基酸序列之间比较的输出文件：C:\Bl2seq–i c:\seq1.txt–j c:\seq2.txt–p blastp–o c:\output.txt。如果两个比较的序列共有同源性(同一性)，则指定的输出文件将呈现那些同源区域作为比对序列。如果两个比较序列不具有同源性(同一性)，则指定的输出文件将不呈现比对序列。除了使用blastn外，可以遵循类似的步骤用于核酸序列。 [0093] 一旦比对后，匹配的数量通过数两个序列中都出现的相同氨基酸残基位置的数量来确定。百分比同一性(同源性)通过将匹配的数量除以多肽氨基酸序列全长的长度，接着将所得值乘以一百来确定。应当注意百分比同一性(同源性)值四舍五入到最近的十分位。例如，78.11、78.12、78.13和78.14舍到78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18和78.19入到 78.2。还应当注意所述长度值总是整数。 [0094] 应当理解若干核酸可以编码一种具有特定氨基酸序列的多肽。遗传密码子的简并是本领域公知的，例如，对于许多氨基酸，存在多于一种核苷酸三联体，其作为该氨基酸的密码子。例如，可以使用对于该物种适合的密码子偏好表修饰所给酶的编码序列中的密码子，来得到在特定物种(例如细菌或真菌)中的最优表达。 [0095] 本文所述的任意酶的功能片段也可以用于本申请的方法。术语“功能片段”用于本文指代蛋白的肽片段，其具有相应成熟、全长、野生型蛋白的至少25％(例如至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、95％、98％、99％、100％；或甚至超过100％)的活性。所述功能片段通常可以是，但不总是由蛋白的连续区域组成，其中所述区域具有功能活性。 [0096] 本申请还提供(i)用于本申请方法的酶的功能变体和(ii)上述功能片段的功能变体。酶和功能片段的功能变体可以含有相对于对应野生型序列的增加、缺失或取代。带有取代的酶通常具有不多于50个(例如不多于一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、12、15、20、25、30、35、40或50)氨基酸取代(例如保守取代)。这适用于本文所述的任意酶和功能片段。保守取代是一个氨基酸对具有相似特性的另一个氨基酸的取代。保守取代包括下组中的取代：缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸、半胱氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。非极性疏水氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。上述极性、碱性或酸性组中一个成员被同组另一个成员的任意取代可以认为是保守取代。相比之下，非保守取代是一个氨基酸对具有不相似特性的另一个氨基酸的取代。 [0097] 缺失变体可以缺少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸片段(由两个或更多氨基酸组成)或非连续的单个氨基酸。增加(增加变体)包括含有下述项的融合蛋白：(a)本文所述的任意酶或其片段；和(b)内部或末端(C或N)不相关或异源的氨基酸序列。在此类融合蛋白的语境中，术语“异源氨基酸序列”指代除了(a)的氨基酸序列。异源性序列可以是，例如，用于重组蛋白纯化的序列(例如FLAG、多聚组氨酸(例如六聚组氨酸)、血细胞凝集素(HA)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、或麦芽糖结合蛋白(MBP))。异源性序列也可以是作为可检测标记物有用的蛋白，例如萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。在一些实施方案中，所述融合蛋白含有来自于另一个蛋白的信号序列。在某些宿主细胞中(例如酵母宿主细胞)目标蛋白的表达和/或分泌可以通过使用异源性信号序列增加。在一些实施方案中，所述融合蛋白可以含有载体(例如KLH)(例如在引起免疫应答以产生抗体中有用)或ER或高尔基体驻留信号。异源性序列可以是不同的长度，并在一些情况下可以是比该异源性序列所附着的全长目标蛋白更长的序列。 [0098] 重组宿主可以天然表达无一或一些(例如一种或更多、两种或更多、三种或更多、四种或更多、五种或更多、或六种或更多)本文所述途径的酶。也可以扰乱重组宿主的内源性基因来阻止不需要的代谢产物的形成，或阻止所述途径中间代谢物通过其它作用于该中间产物的酶而流失。重组的宿主可称为重组宿主细胞，工程化细胞，或工程化宿主。因此，如本文所述，重组宿主可以包括编码以下一种或多种的核酸：脱羧酶，激酶，脱氢酶，单加氧酶，酰基[酰基载体蛋白(acp)]脱氢酶，脱水酶，硫酯酶，或脱羧硫酯酶，如在下文中更详细描述的。 [0099] 另外，可以使用本文所述的分离的酶，使用来自于作为所述酶的来源的宿主微生物的裂解物(例如细胞裂解物)，或使用来自于作为所述酶的来源的不同宿主微生物的多个裂解物，在体外进行进行异戊二烯的生产。 [0100] 支链C5中心代谢物骨架的产生 [0101] 在一些实施方案中，由归类于，例如EC 4.2.1.-下的2-羟基酰基-CoA脱水酶，例如HadBC的基因产物(SEQ ID NOs:3和4)及其引发剂HadI(SEQ ID NO:2)，或HgdAB的基因产物(SEQ ID NOs:6和7)及其引发剂HdgC(SEQ ID NO:5)形成3-甲基-戊-2-烯酰-CoA或4-甲基-戊-2-烯酰-CoA。见图2-5。 [0102] 在一些实施方案中，所述2-羟基酰基-CoA脱水酶是酶工程的产物。从厌氧细菌分离的2-羟基酰基-CoA脱水酶拥有氨基酸降解途径中采用的常见催化机制。例如，来自艰难梭菌(Clostridium difficile)的HadBC/HadI的基因产物催化(R)-2-羟基异己酰-CoA转化为异己酰-CoA。类似的，HgdAB/HdgC的基因产物催化2-羟基-戊二酰-CoA转化为戊烯二酰-CoA(Kim等，FEMS Microbiol.Reviews,2004,28,455–468)。见图2-5。 [0103] 在一些实施方案中，由归类于，例如EC 4.2.1.119下的(R)-特异性烯酰-CoA水合酶例如phaJ(SEQ ID NO:16,Fukui等，J.Bacteriol.,1998,180(3),667-673)或MaoC(SEQ ID NO:17；Park and Lee,J.Bacteriol.,2003,185(18),5291–5397)的基因产物，或归类于，例如EC 4.2.1.7下的细菌(S)-特异性烯酰-CoA水合酶，例如YsiB的基因产物(SEQ ID NO:1)将3-羟基官能团引入3-甲基-戊-2-烯酰-CoA或4-甲基-戊-2-烯酰-CoA。见图4和图5。 [0104] 在一些实施方案中，所述烯酰-CoA水合酶是酶工程的产物。用于将3-羟基官能团引入3-甲基丁烷-2-烯酰-CoA的单个酶候选物先前已经在Galactomyces reessii的无细胞提取物中鉴定，含有归类于EC 4.2.1.17下的烯酰-CoA水合酶，其将3-甲基丁烷-2-烯酰-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酰-CoA(Lee等，Appl.Environ.Microbiol.,1997,63(11),4191–4195)。细菌来源的同等烯酰-CoA水合酶活性还未鉴定。见图4和图5。 [0105] 在一些实施方案中，通过使用归类于，例如EC 2.3.1.-(EC 2.3.1.41，EC 2.3.1.79，或EC 2.3.1.80)下的β-酮脂酰-ACP-合酶，例如AnlF的基因产物(SEQ ID NO:18)缩合异丁酰-CoA和丙二酰-ACP形成4-甲基-3-氧代戊酰-ACP。已经证明anlF的基因产物缩合异丁酰-CoA和丙二酰-ACP(Lechner等，ACS Synth.Biol.,2013,2(7),379-83)。见图6。 [0106] 在一些实施方案中(图8)，由归类于，例如EC 2.3.1.9下的乙酰-CoA C-乙酰转移酶将3-甲基-3-羟基戊-4-烯酸的中心前体，乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA，接着由归类于，例如EC 2.3.3.10下的羟甲基戊二酰-CoA合酶转化为3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA；接着由归类于，例如EC 1.1.1.88或EC 1.1.1.34下的羟甲基戊二酰-CoA还原酶转化为(R)-甲羟戊酸；接着由归类于，例如EC 4.2.1.-下的酶，例如油酸水合酶(例如，ohyA的基因产物(SEQ ID NO:22))或归类于EC 4.2.1.-下的脱水酶(例如从物种Aquincola tertiaricarbonis或Methylibium petroleiphilum分离的脱水酶)转化为3-甲基-3-羟基戊-4-烯酸。 [0107] 在一些实施方案中，将甲羟戊酸转化为3-甲基-3-羟基戊-4-烯酸的脱水酶是酶工程的产物，以使用例如油酸脱水酶(SEQ ID NO:22)的结构和野生型残基多样性来改进活性或特异性。 [0108] 生成第一个末端乙烯基基团的酶 [0109] 在一些实施方案中，将第一个末端乙烯基基团引入3-甲基-戊-2-烯酰-ACP，形成3-甲基-戊-2,4-二烯酰-[acp]，然后在一个或多个步骤中酶促地转化为3-甲基-3-羟基戊- 4-烯酸或3-甲基-3-磺酰-戊-4-烯酰-ACP(例如，如图2中所示)。已证明来自卡那链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)的tcsD的基因产物(SEQ ID NO:14)对于直链和支链C5酰基-ACP底物具有脱氢酶活性(Mo等，JACS,2011,133,976-985)。3-甲基-戊-2-烯酰-ACP可以衍生于中心代谢物3-甲基-2-氧代戊酸。 [0110] 在一些实施方案中，将第一个末端乙烯基基团引入4-甲基-戊-2-烯酰-[acp]，形成4-甲基-戊-2,4-二烯酰-[acp]，其可以在一个或多个步骤中酶促地转化为4-甲基-3-羟基戊-4-烯酸(见，例如图3和图6)，4-甲基-3-磺酰-戊-4-烯酰-ACP(见，例如图3和图6)，或3-甲基-3-丁烯-2-醇(见，例如图3和图7)。已经证明来自卡那链霉菌的tcsD的基因产物(SEQ ID NO:14)对于4-甲基-戊-2-烯酰-ACP具有脱氢酶活性(Mo等，2011,见上文)。4-甲基-戊-2-烯酰-[acp]可以衍生于中心代谢物4-甲基-2-氧代戊酸或异丁酰-CoA。 [0111] 在一些实施方案中，由单加氧酶将第一个乙烯基基团引入3-甲基-3-羟基-戊酸，形成3-甲基-3-羟基-戊-4-烯酸(见，例如图4)。已经证明由mdpJ编码的单加氧酶(SEQ ID NO:15)将末端双键引入结合到仲醇的烯丙基( 等，Appl.Environ.Microbiol.,2012,78(17),6280-6284)。 [0112] 在一些实施方案中，将第一个乙烯基基团引入4-甲基-3-羟基戊酸，形成4-甲基-3-羟基戊-4-烯酸(见，例如图5)。 [0113] 在一些实施方案中，将第一个乙烯基基团引入甲羟戊酸，形成3-羟基-3-甲基-戊-4-烯酸(例如，如图8所示)。 [0114] 生成第二个末端乙烯基基团并产生异戊二烯的酶 [0115] 在一些实施方案中，由GHMP超家族酶，例如归类于，例如EC 4.1.1.33下的甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(例如，SEQ ID NOs:8-11)(Lefurgy等，J.Biol.Chem.,2010,285(27),20654–20663)或归类于，例如EC 2.7.1.-下的甲羟戊酸3-激酶(例如，SEQ ID NO:12)(Vinokur等，Biochemistry,2014,53(25),4161-4168)将第二个乙烯基基团引入中等链碳链烯酸例如3-甲基-3-羟基戊-4-烯酸或4-甲基-3-羟基戊-4-烯酸，产生异戊二烯(图2-6和 8)。在一些实施方案中，MDD具有对应SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列的氨基酸74和/或 145的一个或两个位置处的氨基酸取代。例如，在比对SEQ ID NO:11的残基74的位置，可以用组氨酸残基取代精氨酸和/或在比对SEQ ID NO:11的残基145的位置，可以用苯丙氨酸残基取代异亮氨酸。在一些实施方案中，MDD可以具有SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列，除了位置74处用组氨酸取代精氨酸和/或位置145处用苯丙氨酸取代异亮氨酸。 [0116] 在一些实施方案中，由脱羧硫酯酶(例如，来自巨大鞘丝藻(CurM TE)，Moorea producens(SEQ ID NO:21)，虫媒假单胞菌，H.ochraceum，聚球藻属PCC 7002，蓝丝藻属PCC 7424或蓝丝藻属PCC 7822)(见Gehret等，J.Biol.Chem.,2011,286(16),14445–14454)将第二个乙酰基团引入中等链碳链烯酸例如3-甲基-3-磺酰-戊-4-烯酰-ACP或4-甲基-3-磺酰-戊-4-烯酰-ACP，将3-甲基-3-磺酰-戊-4-烯酰-ACP或4-甲基-3-磺酰-戊-4-烯酰-ACP转化为异戊二烯(见图2，图3和图6)。 [0117] 在一些实施方案中，由归类于，例如EC 4.2.1.-例如EC 4.2.1.127下的芳樟醇脱水酶(SEQ ID NO:13,GenBank Accession No.CBW30776.1,Brodkorb等，J.Biol.Chem.,2010,285(40),30436–30442)或归类于EC 4.2.1.-下的脱水酶例如从物种例如Aquincola tertiaricarbonis或Methylibium petroleiphilum分离的脱水酶( 等， Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(17),5981-5987)将第二个乙酰基团引入中等链碳链烯酸例如3-甲基-3-丁烯-2-醇。见图3和图7。 [0118] 通向3-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]的途径 [0119] 在一些实施方案中(图2)，通向3-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]的中心前体，3-甲基-2-氧-戊酸由归类于，例如EC 1.1.1.272下的(R)-2-羟基酰基脱氢酶，例如ldhA的基因产物转化为3-甲基-2-羟基戊酸，接着由CoA-转移酶例如HadA或GctAB的基因产物(例如，归类于例如EC 2.8.3.12下的戊烯二酸CoA转移酶)或归类于，例如EC 6.2.1.-(例如，EC 6.2.1.2)下的CoA-连接酶转化为3-甲基-2-羟基-戊酰-CoA；接着由(R)-2-羟基酰基-CoA脱水酶例如HadBC的基因产物(SEQ ID NOs:3和4)和引发剂HadI(SEQ ID NO:2)或HgdAB的基因产物(SEQ ID NOs:6和7)和引发剂HgdC(SEQ ID NO:5)转化为3-甲基-戊-2-烯酰-CoA；接着由酰基转移酶例如由tcsA编码(见Genbank Accession No.ADU56236.1)或4’磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyl transferase)例如由sfp(见Genbank Accession No.CAA44858.1)或svp(见Genbank Accession No.AAG43513.1)编码的4′磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶转化为3’-甲基-戊-2-烯酰-[acp]；接着由酰基-[acp]脱氢酶例如TscD的基因产物(SEQ ID NO:14)转化为3-甲基-戊-2,4-二烯酰-ACP；接着由归类于，例如EC 4.2.1.59下的3-羟基酰基-[acp]脱水酶转化为3-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-ACP。 [0120] 在一些实施方案中(图2)，3-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]，即通向3-甲基-3-羟基戊-4-烯酸的中心前体，由(R)-3-羟基酰基-ACP:CoA转移酶例如PhaG的基因产物转化为3-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-CoA；接着由CoA转移酶例如HadA或GctAB的基因产物或由归类于例如，EC 3.1.2.-下的硫酯酶例如tesB(例如，GenBank Accession No.AAA24665.1)或YciA(见Genbank Accession No.BAA14785.1)的基因产物转化为3-甲基-3-羟基戊-4-烯酸。 [0121] 在一些实施方案中(图2)，3-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-ACP，通向3-甲基-3-羟基戊-4-烯酸的中心前体，由硫酯酶例如酰基[acp]硫酯酶(例如由GenBank Accession No.AAO77182或CCC78182.1编码的基因产物)转化为3-甲基-3-羟基戊-4-烯酸。 [0122] 在一些实施方案中(图2)，3-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]，通向3-甲基-3-磺酰-戊-4-烯酰-[acp]的中心前体，由归类于，例如EC 2.8.2.-下的磺基转移酶，例如CurM ST或OLS ST的基因产物转化为3-甲基-3-磺酰-戊-4-烯酰-[acp]。 [0123] 通向4-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]的途径 [0124] 在一些实施方案中(图3)，通向4-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]的中心前体，4-甲基-2-氧-戊酸由归类于，例如EC 1.1.1.272下的(R)-2-羟基酰基脱氢酶，例如ldhA的基因产物转化为4-甲基-2-羟基戊酸，接着由CoA-转移酶，例如HadA或GctAB的基因产物或CoA-连接酶例如归类于EC 6.2.1.-(2)下的CoA-连接酶转化为4-甲基-2-羟基-戊酰-CoA；接着由(R)-2-羟基酰基-CoA脱水酶例如HadBC的基因产物和引发剂HadI转化为4-甲基-戊-2-烯酰-CoA；接着由酰基转移酶例如与TcsA&sfp/svp的基因产物反应转化为4-甲基-戊-2-烯酰-[acp]；接着由酰基-ACP脱氢酶例如TcsD的基因产物转化为4-甲基-戊-2,4-二烯酰-[acp]；接着由归类于，例如EC 4.2.1.59下的3-羟基酰基-[acp]脱水酶例如fabZ的基因产物转化为4-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]。 [0125] 在一些实施方案中(图6)，通向4-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]的中心前体，异丁烯-CoA，由β-酮脂酰-[acp]-合酶例如AnIF的基因产物转化为4-甲基-3-氧-戊酰-[acp]；接着由3-氧酰-[acp]还原酶(EC 1.1.1.100)例如fabG或AnlG的基因产物转化为4-甲基-3-羟基-戊酰-[acp]；接着由3-羟基酰基-[acp]脱氢酶(EC 4.2.1.59)例如fabZ的基因产物转化为4-甲基-戊-2-烯酰-[acp]；接着由酰基-[acp]脱氢酶例如tcsD的基因产物转化为4-甲基-戊-2,4-二烯酰-[acp]；接着由3-羟基酰基-[acp]水合酶例如EC 4.2.1.59例如fabZ的基因产物转化为4-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]。 [0126] 在一些实施方案中(图7)，通向4-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]的中心前体，异丁烯-CoA，由β-酮脂酰-[acp]-合酶例如AnIF的基因产物转化为4-甲基-3-氧-戊酰-[acp]；接着由3-氧酰-[acp]还原酶(EC 1.1.1.100)例如fabG或AnlG的基因产物转化为4-甲基-3-羟基-戊酰-[acp]；接着由3-羟基酰基-[acp]脱氢酶(EC 4.2.1.59)例如fabZ的基因产物转化为4-甲基-戊-2-烯酰-[acp]；接着由酰基-[acp]脱氢酶例如tcsD的基因产物转化为4-甲基-戊-2,4-二烯酰-[acp]；接着由3-羟基酰基-[acp]水合酶例如EC 4.2.1.59例如fabZ的基因产物转化为4-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]。 [0127] 通向3-甲基-3-羟基戊-4-烯酸的途径 [0128] 在一些实施方案中(图2)，通向3-甲基-3-羟基戊-4-烯酸的中心前体，3-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]，由(R)-3-羟基酰基-ACP:CoA转移酶例如PhaG的基因产物转化为3-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-CoA；接着由CoA转移酶例如HadA或GctAB的基因产物或由硫酯酶例如tesB(例如，GenBank Accession No.AAA24665.1)或YciA(见Genbank Accession No.BAA14785.1)的基因产物转化为3-甲基-3-羟基戊-4-烯酸。 [0129] 在一些实施方案中(图2)，通向3-甲基-3-羟基戊-4-烯酸的中心前体，3-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]，由归类于，例如EC 3.2.1.-下的硫酯酶例如多形拟杆菌酰基-[acp]硫酯酶(GenBank Accession No.AAO77182)或植物乳杆菌硫酯酶(GenBank Accession No.CCC78182.1)转化为3-甲基-3-羟基戊-4-烯酸。 [0130] 在一些实施方案中(图4)，通向3-甲基-3-羟基戊-4-烯酸的中心前体，3-甲基-2-氧-戊酸，由归类于，例如EC 1.1.1.272下的(R)-2-羟基酰基脱氢酶，例如ldhA的基因产物转化为3-甲基-2-羟基戊酸，接着由CoA-转移酶例如HadA或GctAB的基因产物或归类于，例如EC 6.2.1.-(例如，EC 6.2.1.2)下的CoA-连接酶转化为3-甲基-2-羟基-戊酰-CoA；接着由(R)-2-羟基酰基-CoA脱水酶例如HadBC的基因产物(SEQ ID NOs:3和4)和引发剂HadI(SEQ ID NO:2)或HgdAB的基因产物(SEQ ID NOs:6和7)和引发剂HgdC(SEQ ID NO:5)转化为3-甲基-戊-2-烯酰-CoA；接着由烯酰-CoA水合酶例如phaJ(SEQ ID NO:16)，MaoC(SEQ ID NO:17)或YsiB(SEQ ID NO:1)的基因产物转化为3-甲基-3-羟基戊酰-CoA；接着由CoA-转移酶例如HadA或GctAB的基因产物或硫酯酶例如tesB(例如，GenBank Accession No.AAA24665.1)或YciA(见，Genbank Accession No.BAA14785.1)的基因产物转化为3-甲基-3-羟基戊酸；接着由单加氧酶例如MdpJ(SEQ ID NO:15)的基因产物或细胞色素P450例如CYP4家族的基因产物转化为3-甲基-3-羟基戊-4-烯酸。 [0131] 在一些实施方案中，图4中示出的酶是酶工程的产物，其使用酶结构和野生型残基多样性来告知合理的酶设计以改进活性或特异性。 [0132] 通向4-甲基-3-羟基戊-4-烯酸的途径 [0133] 在一些实施方案中(图3和图6)，通向4-甲基-3-羟基戊-4-烯酸的中心前体，4-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]，由(R)-3-羟基酰基-ACP:CoA转移酶例如PhaG的基因产物转化为4-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-CoA；接着由CoA转移酶例如HadA或GctAB的基因产物或由硫酯酶例如tesB(例如，GenBank Accession No.AAA24665.1)或YciA(见Genbank Accession No.BAA14785.1)的基因产物转化为4-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-CoA。 [0134] 在一些实施方案中(图3和图6)，通向4-甲基-3-羟基戊-4-烯酸的中心前体，4-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]，由归类于，例如EC 3.2.1.-下的硫酯酶例如多形拟杆菌酰基-[acp]硫酯酶(GenBank Accession No.AAO77182)或植物乳杆菌硫酯酶(GenBank Accession No.CCC78182.1)转化为4-甲基-3-羟基戊-4-烯酸。 [0135] 在一些实施方案中(图5)，通向4-甲基-3-羟基戊-4-烯酸的中心前体，4-甲基-2-氧-戊酸，由归类于，例如EC 1.1.1.272下的(R)-2-羟基酰基脱氢酶，例如ldhA的基因产物转化为4-甲基-2-羟基戊酸，接着由CoA-转移酶例如HadA或GctAB的基因产物或归类于，例如EC 6.2.1.-(例如，EC 6.2.1.2)下的CoA-连接酶转化为4-甲基-2-羟基-戊酰-CoA；接着由(R)-2-羟基酰基-CoA脱水酶例如HadBC的基因产物(SEQ ID NOs:3和4)和引发剂HadI(SEQ ID NO:2)或HgdAB的基因产物(SEQ ID NOs:6和7)和引发剂HgdC(SEQ ID NO:5)转化为4-甲基-戊-2-烯酰-CoA；接着由烯酰-CoA水合酶例如phaJ(SEQ ID NO:16)，MaoC(SEQ ID NO:17)或YsiB(SEQ ID NO:1)的基因产物转化为4-甲基-3-羟基戊酰-CoA；接着由CoA-转移酶例如HadA或GctAB的基因产物或硫酯酶例如tesB(例如，GenBank Accession No.AAA24665.1)或YciA(见，Genbank Accession No.BAA14785.1)的基因产物转化为4-甲基-3-羟基戊酸；接着由单加氧酶例如MdpJ(SEQ ID NO:15)的基因产物或细胞色素P450例如CYP4家族的基因产物转化为4-甲基-3-羟基戊-4-烯酸。 [0136] 在一些实施方案中，图5中示出的酶是酶工程的产物，其使用酶结构和野生型残基多样性来告知合理的酶设计以改进活性或特异性。 [0137] 通向4-甲基-3-磺酰-戊-4-烯酰-[acp]的途径 [0138] 在一些实施方案中，通向4-甲基-3-磺酰-戊-4-烯酰-[acp]的中心前体，4-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]由磺基转移酶例如CurM ST或OLS ST的基因产物转化为4-甲基-3-磺酰-戊-4-烯酰-[acp]。见图3和图6。 [0139] 通向3-甲基-3-丁烯-2-醇的途径 [0140] 在一些实施方案中(例如，图3和图7)，通向3-甲基-3-丁烯-2-醇的中心前体，4-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]，可以由(R)-3-羟基酰基-[acp]:CoA转酰酶例如PhaG的基因产物转化为4-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]；接着归类于，例如EC 1.1.1.-例如EC 1.1.1.36或EC 1.1.1.157下的脱氢酶转化为4-甲基-3-氧代戊-4-烯酰-CoA；接着由归类于，例如EC 3.2.1.11下的硫酯酶或归类于EC 2.8.3.-下的由AtoAD或pcaIJ编码的CoA-转移酶转化为 4-甲基-3-氧代戊-4-烯酸；接着由归类于，例如EC 4.1.1.4下的乙酰乙酸脱羧酶转化为3-甲基-3-丁烯-2-酮；接着归类于，例如EC 1.1.1.B3，EC 1.1.1.B4或EC 1.1.1.80下的仲醇脱氢酶转化为3-甲基-3-丁烯-2-醇。 [0141] 在一些实施方案中(例如，见图3和图7)，通向3-甲基-3-丁烯-2-醇的中心前体，4-甲基-3-羟基戊-4-烯酰-[acp]可以由3-氧酰-[acp]还原酶例如归类于EC 1.1.1.100下的酶(例如，fabG或AnlG的基因产物)转化为4-甲基-3-氧代戊-4-烯酰-[acp]；接着由归类于，例如EC 3.2.1.-下的硫酯酶例如多形拟杆菌酰基-[acp]硫酯酶(GenBank Accession No.AAO77182)或植物乳杆菌硫酯酶(GenBank Accession No.CCC78182.1)转化为4-甲基-3-氧代戊-4-烯酸；接着由归类于，例如EC 4.1.1.4下的乙酰乙酸脱羧酶转化为3-甲基-3-丁烯-酮；接着由归类于，例如EC 1.1.1.B3，EC 1.1.1.B4或EC 1.1.1.80下的仲醇脱氢酶转化为3-甲基-3-丁烯-2-醇。 [0142] 在一些实施方案中，图3和图7中示出的酶是酶工程的产物，其使用酶结构和野生型残基多样性来告知合理的酶设计以改进活性或特异性。 [0143] 在一些实施方案中，图3和图7中示出的酶是酶工程的产物，其使用酶结构和野生型残基多样性来告知合理的酶设计以改进活性或特异性。 [0144] 培养策略 [0145] 在一些实施方案中，将编码图2-8中所述的途径的酶的核酸引入宿主微生物中，其为原核生物或真核生物。 [0146] 1.例如，所述原核生物可以是例如来自于埃希氏菌属的细菌如大肠杆菌；来自梭状芽胞杆菌属如杨氏梭菌、自产乙醇梭菌或克氏梭菌；来自棒状杆菌属如谷氨酸棒状杆菌；来自贪铜菌属如钩虫贪铜菌或耐金属贪铜菌；来自假单胞菌属如荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌或者食油假单胞菌；来自代尔夫特菌属(Delftia)例如代尔夫特食酸(Delftia acidovorans)；来自芽孢杆菌属如枯草芽胞杆菌；来自乳杆菌属如德氏乳杆菌；或来自乳球菌属如乳酸乳球菌。这些原核生物还可以是构建本文所述的能够产生异戊二烯或其前体的重组宿主细胞的基因来源。 [0147] 在一些实施方案中，所述宿主微生物是真核生物，例如，所述真核生物可以是丝状真菌，例如来自曲霉属如黑曲霉菌。或者，所述真核生物可以是酵母，来自酵母菌属如酿酒酵母菌；来自毕赤氏酵母属如巴斯德毕赤酵母；或来自耶氏酵母属如解脂耶氏酵母；来自伊萨酵母属如东方伊萨酵母；来自德巴利氏酵母属如汉逊德巴利氏酵母；来自Arxula酵母属如Arxula adenoinivorans；或者来自克鲁维酵母菌属如乳酸克鲁维酵母菌。这些真核生物还可以是构建本文所述的能够产生异戊二烯或其前体的重组宿主细胞的基因来源。 [0148] 在一些实施方案中，使用发酵策略在重组宿主中生物合成异戊二烯，所述发酵策略可以包括所述重组宿主的厌氧，微氧或需氧培养。 [0150] 在一些实施方案中，可以采用使用例如陶瓷中空纤维膜的细胞保留策略，来达到并维持异戊二烯合成中分批补料或持续发酵期间的高细胞密度。在一些实施方案中，所述生物原料可以是以下物质，包括以下物质，或来自以下物质：单糖、二糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸和甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农业废物、浓缩的酒糟可溶物或城市废物。 [0151] 对来自生物柴油生产的粗制甘油的高效分解代谢已经在几种微生物中揭示，例如大肠杆菌、钩虫贪铜菌、食油假单胞菌、恶臭假单胞菌和解脂耶氏酵母(Lee等，Appl.Biochem.Biotechnol.,2012,166,1801–1813；Yang等，Biotechnology for Biofuels,2012,5:13；Meijnen等，Appl.Microbiol.Biotechnol.,2011,90,885-893)。 [0152] 对木质纤维素衍生的乙酰丙酸的高效分解代谢已经在几种生物中揭示，例如钩虫贪铜菌和恶臭假单胞菌通过前体丙酰-CoA合成3-羟基戊酸酯(Jaremko和Yu,2011,见上文；Martin和Prather,Journal of Biotechnology,2009,139,61–67)。 [0153] 对木质素衍生的芳香族化合物例如苯甲酸类似物的高效分解代谢已经在几种微生物中揭示，例如恶臭假单胞菌和钩虫贪铜菌(Bugg等，Current Opinion in Biotechnology,2011,22,394–400；Pérez-Pantoja等，FEMS Microbiol.Rev.,2008,32, 736–794)。 [0154] 对农业废弃物例如橄榄油工厂废水的高效利用已经在几种微生物中揭示，包括解脂耶氏酵母(Papanikolaou等，Bioresour.Technol.,2008,99(7),2419-2428)。 [0155] 对可发酵糖例如衍生于纤维素、半纤维素、甘蔗和甜菜糖蜜、木薯、玉米和其它农业来源的单糖和二糖的高效利用已经在几种微生物中揭示，例如大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌和德氏乳酸杆菌和乳酸乳球菌(见，例如Hermann等，Journal of Biotechnology,2003,104,155–172；Wee等，Food Technol.Biotechnol.,2006,44(2),163–172；Ohashi等，Journal of Bioscience and Bioengineering,1999,87(5),647-654)。 [0156] 对来自于各种农业木质纤维素来源的糠醛的高效利用已经在钩虫贪铜菌中揭示(Li等，Biodegradation,2011,22,1215–1225)。 [0157] 在一些实施方案中，所述非生物原料可以是或来自于天然气、合成气、CO2/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸盐、非挥发性残留物(NVR)、来自环己烷氧化过程的碱洗废物流，或对苯二甲酸/间苯二甲酸混合物(terephthalic acid/isophthalic acid mixture)废物流。 [0158] 对甲醇的高效分解代谢已经在甲醇营养型酵母毕赤酵母中揭示。 [0159] 对乙醇的高效分解代谢已经在克氏梭菌中揭示( 见Seedorf等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2008,105(6)2128-2133)。 [0160] 对CO2和H2的高效分解代谢，其可能来自天然气或其它化学和石油化学来源，已经在钩虫贪铜菌中揭示(Prybylski等，Energy,Sustainability and Society,2012,2:11)。 [0161] 对合成气的高效分解代谢已经在许多微生物中揭示，例如杨氏梭菌和自产乙醇梭菌( 等，Applied and Environmental Microbiology,2011,77(15),5467–5475)。 [0162] 对来自于环己烷过程的非挥发性残留物废物流的高效分解代谢已经在许多微生物中揭示，例如代尔夫特食酸菌和钩虫贪铜菌(Ramsay等，Applied and Environmental Microbiology,1986,52(1),152–156)。 [0163] 在一些实施方案中，提供重组宿主微生物的基本纯的培养物。如本文使用的，重组宿主微生物的“基本纯的培养物”是这样的微生物的培养物，其中在培养物中活细胞的总数中少于约40％(即，小于约35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、2％、1％、0.5％、0.25％、0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％或甚至更少)是不同于重组微生物的活细胞，例如，细菌、真菌(包括酵母)、支原体或原生动物细胞。在上下文中术语“约”意指相关百分比可以是高于或低于规定百分比的15％规定百分比。因此，例如，约20％可以是17％至23％。重组微生物的这种培养物包括细胞和生长培养基，贮存培养基或转运培养基。培养基可以是液体、半固体(例如，凝胶状培养基)或冻结的。培养物包括在液体培养基中或在半固体培养基中/上生长的细胞或正在贮存或转运培养基(包括冷藏贮存或转运培养基)中贮存或转运。培养物是在培养容器或贮存容器或基质(例如，培养皿、烧瓶、或管或贮存管形瓶或管)中。 [0164] 代谢工程 [0165] 本申请提供方法，所述方法涉及少于所有上述途径所述的所有步骤。这些方法可涉及，例如，这些步骤的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或者更多。在这些方法涉及少于所有步骤的情况下，第一步骤可为所列步骤中的任意一个。 [0166] 此外，本文所述的重组宿主可包括上述酶的任意组合，使得一个或者多个所述步骤，例如，这些步骤的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或者更多，可以在重组宿主内实施。 [0167] 另外，本申请认识到，在酶已经被描述为接受CoA活化的底物的情况下，存在与[acp]结合底物相关的类似酶活性，其不一定为相同的酶种类。 [0168] 本申请还认识到，在酶已经被描述为接受底物的(R)-对映异构体的情况下，存在与(S)-对映异构体底物相关的类似酶活性，其不一定为相同的酶种类。 [0169] 本申请还认识到，在酶已经显示接受特定辅助因子如NADPH或者共底物如乙酰-CoA的情况下，许多酶在催化特定酶活性中接受一些不同辅助因子或者共底物方面是混杂的。此外，本申请认识到，在酶对例如特定辅助因子如NADH具有高特异性的情况下，对辅助因子NADPH具有高特异性的具有相似或者相同活性的酶可以是不同的酶种类。 [0170] 在一些实施方案中，本文所述的途径中的酶可以是经非直接的或者合理的酶设计方法的酶工程的结果，其目的在于改善活性、改善特异性、降低反馈抑制、降低阻抑、改善酶溶解性、改变立体特异性，或者改变辅因子特异性。 [0171] 在一些实施方案中，本文所述的途径中的酶可以经附加体或者染色体整合方法基因投入(例如，过表达)所得的遗传修饰的生物体中。 [0172] 在一些实施方案中，可以使用基因组级别(genome-scale)的系统生物学技术如通量平衡分析来设计用于将碳通量导向异戊二烯的基因组级别的弱化或者敲除策略。 [0173] 弱化策略包括但不限于：使用转座子、同源重组(双交换方法)、诱变、酶抑制剂和RNA干扰。 [0174] 在一些实施方案中，可以使用通量组(fluxomic)、代谢组(metabolomic)和转录组(transcriptomal)数据来告知或支持基因组级别的系统生物学技术，从而在将碳通量导向异戊二烯中设计基因组级别的弱化或者敲除策略。 [0175] 在一些使用天然积累聚烷基脂肪酸酯的宿主的实施方案中，在所述宿主菌株中可以弱化聚合物合成酶。 [0176] 在一些实施方案中，可以将来自甲羟戊酸途径的酶，EC 2.3.1.9，EC 2.3.3.10，EC 1.1.1.34或EC 1.1.1.88引入或基因投入到所述宿主微生物中，其利用非甲羟戊酸或2-C-甲基-D-赤藓糖醇4磷酸途径用于类异戊二烯合成。 [0177] 在一些实施方案中，将来自非甲羟戊酸或2-C-甲基-D-赤藓糖醇4磷酸途径，导致类异戊二烯合成的的酶引入宿主微生物中，其利用甲羟戊酸途径用于类异戊二烯合成，并弱化EC 2.7.1.36。 [0178] 在一些实施方案中，负责3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸(PAPS)合成，归类于EC 2.7.7.4&EC 2.7.1.25下的酶在所述宿主生物中组成型表达。 [0179] 在一些要求丙酮酸的细胞内可用度用于异戊二烯合成的实施方案中，可以弱化乙酸合成途径中编码乙酸激酶的基因，例如ack(Shen等，Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9),2905-2915)。 [0180] 在一些要求丙酮酸的细胞内可用度用于异戊二烯合成的实施方案中，可以弱化编码丙酮酸降解为乳酸的酶的基因，例如ldhA(Shen等，Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9),2905-2915)。 [0181] 在一些要求丙酮酸的细胞内可用度用于异戊二烯合成的实施方案中，可以弱化编码磷酸烯醇式丙酮酸降解为琥珀酸的酶的基因，例如frdBC(见，例如，Shen等，2011,supra)。 [0182] 在一些要求丙酮酸的细胞内可用度用于异戊二烯合成的实施方案中，可以弱化编码乙酰-CoA降解为乙醇的酶的基因，例如adhE(Shen等，2011,supra)。 [0183] 在一些实施方案中，在异戊二烯合成中途径需要过量的NADPH辅因子的情况下，可以在宿主生物体中过表达吡啶核苷酸转氢酶基因例如UdhA(Brigham等，Advanced Biofuels and Bioproducts,2012,Chapter 39,1065-1090)。 [0184] 在一些实施方案中，在异戊二烯合成中途径需要过量的NADPH辅因子的情况下，可以在宿主生物体中过表达甘油醛-3P-脱氢酶基因，例如GapN(Brigham等，2012,见上文)。 [0185] 在一些实施方案中，在异戊二烯合成中途径需要过量的NADPH辅因子的情况下，可以在宿主生物体中过表达重组苹果酸酶基因，例如maeA或maeB(Brigham等，2012,见上文)。 [0186] 在一些实施方案中，在异戊二烯合成中途径需要过量的NADPH辅因子的情况下，可以在宿主生物体中过表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因，例如zwf(Lim等，J.Bioscience and Bioengineering,2002,93(6),543-549)。 [0187] 在一些实施方案中，在异戊二烯合成中途径需要过量的NADPH辅因子的情况下，可以在宿主中过表达重组果糖1,6-二磷酸酶基因，例如fbp(Becker等，J.Biotechnol.,2007,132:99-109)。 [0188] 在一些实施方案中，可以在所述宿主中过表达归类于，例如EC 2.2.1.6下的乙酸乳酸合酶的反馈抑制抗性突变体，例如ilvB和/或ilvN的突变体，其对赖氨酸和亮氨酸的反馈抑制有抗性。 [0189] 在一些实施方案中，可以在不受支链氨基酸(例如，缬氨酸，亮氨酸，或异亮氨酸)基因抑制的启动子下表达乙酸乳酸合酶。 [0190] 在一些实施方案中，异戊二烯穿过细胞膜流出到细胞外基质可以通过对细胞膜遗传工程化结构修饰，或增加用于异戊二烯的任意相关的转运体活性来提高或放大。 [0191] 使用重组宿主生产异戊二烯 [0192] 通常来说，通过提供宿主微生物并使用含有上述适合碳源的培养基培养所提供的微生物，产生异戊二烯。一般来说，所述培养基和/或培养条件可以是使得所述微生物生长到足够密度，并高效生产异戊二烯。对于大规模生产流程，可以使用任意方法，例如别处所述的那些(Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology,第二版,编辑:A.L.Demain和J.E.Davies,ASM Press；以及Principles of Fermentation Technology,P.F.Stanbury和A.Whitaker,Pergamon)。简短的说，含有适当培养基的大型储罐(例如一个 100加仑、200加仑、500加仑或更多的罐)接种特定的微生物。接种后，孵育所述微生物，以允许生物质的生产。一旦达到所需的生物质，含有所述微生物的液体培养基可以转移到第二个储罐。第二个储罐可以是任意尺寸的。例如，所述第二个储罐可以比第一个储罐更大、更小、或相同尺寸。通常来说，第二个储罐比第一个储罐更大，使得可以向来自第一个储罐的液体培养基中添加另外的培养基。另外，第二个储罐中的培养基可以与第一个储罐中使用的相同或不同。 [0193] 一旦转移后，可以孵育所述微生物，来允许异戊二烯的生产。一旦生产后，可以使用任意方法来分离异戊二烯。 [0194] 一旦生产后，可以使用任意方法来分离异戊二烯。例如，由于异戊二烯的沸点为34.1℃，可以从发酵罐尾气流中回收作为挥发性产品的异戊二烯。在约30℃的典型发酵温度下，异戊二烯具有高的蒸气压，并可以由通过培养基的气体流速剥离，用于从尾气回收。 可以选择性地将异戊二烯吸附到例如吸附剂上，并从其它的尾气组分分离。异戊二烯可以选择性吸附到例如吸附剂，并且与其他尾气组分分开。也可以采用膜分离技术来将异戊二烯与其它的尾气组分分离。可以使用，例如氮气使异戊二烯从所述吸附剂去吸附，并在低温和高压下浓缩。 实施例 [0195] 实施例1 [0196] 接受3-甲基-3-羟基戊酰-CoA和4-甲基-3-羟基戊酰-CoA作为底物的R-特异性烯酰-CoA水合酶的酶活性 [0197] 将C-末端his标签的来自斑点气单胞菌的phaJ基因(SEQ ID NO:16)克隆到pE23a表达载体中，在T7启动子的控制下。将所述表达载体转化到BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。 [0198] 所得的重组大肠杆菌菌株在含有100mL Luria Broth(LB)培养基的1L摇瓶中在30℃培养，在200rpm下振荡。该培养物使用1mM IPTG诱导2小时。 [0199] 通过离心从所述诱导的摇瓶培养物收获沉淀物。将每个沉淀重悬于20mM HEPES(pH＝7.2)，1mM PMSF和29单元benzonase中。通过超声处理裂解重悬的沉淀物。通过离心将细胞碎片与上清分离并使用0.2μm滤器过滤。 [0200] 使用Ni亲和层析从上清纯化该phaJ酶并浓缩到1.25mg/mL。 [0201] 在由10mM乙酸铵(pH＝8)和1mM的巴豆酰-CoA(Sigma-Aldrich)组成的缓冲液中，在30℃进行正向(水合)的天然酶活性测定。通过向含有底物的测定缓冲液中添加0.4μM纯化的烯酰-CoA水合酶起始所述酶活性测定反应。由phaJ编码的酶接受巴豆酰-CoA作为底物，如通过在30℃在263nm分光光度法所确定的。仅底物的对照显示了巴豆酰-CoA最小限度的自发水合，如通过在263nm分光光度法所测定的。见图10。 [0202] 在由10mM乙酸铵(pH＝8)和1mM外消旋3-羟基丁酰-CoA组成的缓冲液中进行反向(脱水)的天然酶活性测定。通过向含有底物的测定缓冲液中添加5μM纯化的烯酰-CoA水合酶起始酶活性测定反应，并在30℃孵育1小时。如通过LC-MS确定，由phaJ编码的酶接受3-羟基丁酰-CoA作为底物。仅底物的对照显示了可忽略的3-甲基-3-羟基丁酰-CoA的自发水合。如先前所证明的(Lan and Liao,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2012,109(16),6018–6023)，由phaJ编码的烯酰-CoA水合酶是可逆的，虽然有利于正向(水合)。见图11。 [0203] 在由10mM乙酸铵(pH＝8)和1mM 3-甲基-3-羟基戊酰-CoA组成的缓冲液中进行反向(脱水)的非天然酶活性测定。通过向含有底物的测定缓冲液中添加5μM纯化的烯酰-CoA水合酶起始酶活性测定反应，并在30℃孵育1小时。如通过LC-MS确定，由phaJ编码的酶接受3-甲基-3-羟基戊酰-CoA作为底物。仅底物的对照显示了无3-甲基-3-羟基戊酰-CoA的自发水合。见图12。 [0204] 在由10mM乙酸铵(pH＝8)和1mM 4-甲基-3-羟基戊酰-CoA组成的缓冲液中进行反向(脱水)的非天然酶活性测定。通过向含有底物的测定缓冲液中添加5μM纯化的烯酰-CoA水合酶起始酶活性测定反应，并在30℃孵育1小时。如通过LC-MS确定，由phaJ编码的酶接受4-甲基-3-羟基戊酰-CoA作为底物。仅底物的对照显示了无4-甲基-3-羟基戊酰-CoA的自发水合。见图13。 [0205] 由来自斑点气单胞菌的phaJ基因编码的烯酰-CoA水合酶在脱水方向接受3-甲基-3-羟基戊酰-CoA和4-甲基-3-羟基戊酰-CoA作为底物。考虑到该酶反应的可逆性以及有利于水合方向，由来自斑点气单胞菌的phaJ基因编码的烯酰-CoA水合酶接受3-甲基-戊-2-烯酰-CoA和4-甲基-戊-2-烯酰-CoA作为底物。 [0206] 实施例2 [0207] 接受3-甲基-3-羟基戊-4-烯酸作为底物，形成异戊二烯的GHMP超家族酶甲羟戊酸二磷酸脱羧酶和甲羟戊酸-3-激酶的酶活性 [0208] 将各个编码C末端His标签的基因的序列克隆到PD681-CH表达载体中，在rhapBAD启动子的控制下，所述基因分别编码SEQ ID NOs:8，9，10和11的甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(见图9)和SEQ ID NO:12的甲羟戊酸3-激酶(见图9)，使得可以产生C-末端HIS标签的GHMP超家族酶。将各个表达载体转化到BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。所得的重组大肠杆菌菌株在含有1L Luria Broth(LB)培养基和卡那霉素抗生素选择压力的5L摇瓶中在37℃培养，在90rpm下振荡。当OD600在0.6至0.8之间时，该培养物使用终浓度为2g/L的L-鼠李糖诱导。所述培养物在37℃诱导6小时。通过离心从所述诱导的摇瓶培养物收获沉淀物并储存于-20℃。 [0209] 将各个冷冻的沉淀解冻，重悬，在含有50mM Tris·HCl(pH＝8.0),50mM NaCl,1mM MgCl2 1％(w/v)Triton X-100,1mg/mL溶解酵素和10U/mLbenzonase(benzonase)的裂解缓冲液中于30℃裂解1小时。通过离心除去细胞碎片。使用Ni-亲和色谱从所得上清纯化GHMP超家族酶，洗出液进行缓冲液交换并通过超滤(10kDa MWCO)浓缩到100mM HEPES(pH＝7.0),100mM KCl中，最终酶浓度为200μM。 [0210] 在由100mM HEPES(pH＝7.0),100mM KCl,30mM MgCl2,30mM ATP,2mM DTT和作为底物的10mM 3-甲基-3-羟基戊-4-烯酸组成的测定缓冲液中进行了各个酶活性测定。通过向10mL卷曲的玻璃小瓶中的0.5mL测定缓冲液添加0.5mL SEQ ID NOs：8，9，10，11或12的酶储液起始各个酶活性测定反应，并在30℃孵育24小时。通过GC-MS分析每个玻璃小瓶顶部空间的异戊二烯并与空载体对照比较。如通过GC-MS确定的(见图14)，SEQ ID NOs：8，9，10，11的12基因产物接受3-甲基-3-羟基戊-4-烯酸作为底物并合成异戊二烯作为反应产物。 [0211] 实施例3 [0212] 接受3-甲基-3-丁烯-2-醇作为底物形成异戊二烯的芳樟醇脱水酶的酶活性[0213] 将编码C-末端His标签且编码SEQ ID NO:13的芳樟醇脱水酶(见图9)的序列克隆到pET15表达载体中，在T7启动子的控制下，使得可以产生C-末端HIS标签的酶。将所述表达载体转化到BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。所得的重组大肠杆菌菌株在含有100mL自诱导培养基和抗生素选择压力的1L摇瓶中在30℃培养，以220rpm振荡过夜。通过离心从所述诱导的摇瓶培养物收获沉淀物并立即用于全细胞测定。 [0214] 洗涤所述沉淀并重悬于M9基本培养基中至160mg/mL(湿重)并以一式三样分配到10mL卷曲玻璃小瓶中。以20mM的终浓度添加底物3-甲基-3-丁烯-2-醇并以220rpm在30℃孵育48小时。通过GC-MS分析每个玻璃小瓶顶部空间的异戊二烯并与空载体对照比较(以一式三份进行)。如通过GC-MS确定的(见图15)，SEQ ID NO：13的基因产物接受3-甲基-3-丁烯- 2-醇作为底物并合成异戊二烯作为反应产物。 [0215] 其它实施例 [0216] 应理解的是，尽管协同发明的具体描述描述了本发明，但是前面的描述意图说明并且不限制发明的范围，发明的范围由所附权利要求的范围限定。其它方面、优点和修饰也在权利要求的范围内。 |
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