能够产生3-氨基-4-羟基苯甲酸的大肠杆菌 |
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| 申请号 | CN201380011332.3 | 申请日 | 2013-01-28 | 公开(公告)号 | CN104169415A | 公开(公告)日 | 2014-11-26 |
| 申请人 | 味之素株式会社; | 发明人 | 正瑞文; 田岛义教; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供一种用于通过利用大肠杆菌来方便且便宜地产生 氨 基-羟基苯 甲酸 型化合物如3-氨基-4-羟基 苯甲酸 的方法，所述大肠杆菌是常用于通过 生物 合成的生产过程的细菌。具体地，本发明提供具有产生3-氨基-4-羟基苯甲酸的能 力 的大肠杆菌，其经过修饰以降低N-羟基芳基胺O-乙酰基转移酶(NhoA)的活性；使用这类大肠杆菌来产生3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物的方法；等等。 | ||||||
| 权利要求 | 1.具有产生3-氨基-4-羟基苯甲酸的能力的大肠杆菌(Escherichia coli)，其经过修饰以增加从二羟基丙酮磷酸和天冬氨酸半醛形成3-氨基-4-羟基苯甲酸的活性，其中所述大肠杆菌经过修饰以降低N-羟基芳基胺O-乙酰基转移酶(NhoA)活性。 |
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| 说明书全文 | 能够产生3-氨基-4-羟基苯甲酸的大肠杆菌发明领域 [0002] 发明背景 [0003] 氨基羟基苯甲酸型化合物可用作染料、农业化学物、药物和其他合成的有机产物的中间体及可用作一种复杂且耐热性的聚合物聚苯并噁唑(polybenzoxazole)的单体。3-氨基-4-羟基苯甲酸(3,4-AHBA)使用二羟基丙酮磷酸(DHAP)和天冬氨酸半醛(ASA)作为底物通过GriI和GriH两者在两步中生物合成，GriI是催化具有氨基基团的C4化合物与C3或C4化合物之间的碳-碳结合反应的酶，GriH是催化在脱羧基化情况下C7化合物环化或C8化合物环化的酶。 [0004] [化学物1] [0005] [0006] 以下内容作为与本发明有关的现有技术是可获得的。 [0007] 在专利文献1中公开了一种使用其中引入griI和griH的灰色链霉菌(Streptomyces griseus)产生3,4-AHBA的方法。专利文献1还披露了形成作为3,4-AHBA副产物的3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸(3,4-AcAHBA)，且3,4-AcAHBA被脱乙酰化以形成3,4-AHBA。例示了使用强碱如氢氧化钠和强酸如盐酸作为将3,4-AcAHBA脱乙酰化的特定方法。然而，这类方法具有的问题在于必须使用强碱和强酸。 [0008] 在专利文献2中披露了通过使用其中引入griI和griH的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)来形成3,4-AHBA。 [0009] 在非专利文献1中披露了通过将griI和griH引入大肠杆菌来形成3,4-AHBA和3,4-AcAHBA。 [0010] 在非专利文献2中披露了当芳基胺N-乙酰基转移酶基因(natA)在灰色链霉菌中缺失时，培养物中不形成3,4-AcAHBA。 [0011] 在非专利文献3中披露了源自大肠杆菌的N-羟基芳基胺O-乙酰基转移酶基因(nhoA)作用为催化芳香族氨基基团的乙酰化。同时，在非专利文献4中披露了大肠杆菌BAP1菌株形成N-乙酰化形式(3,5-AcAHBA)作为3,5-AHBA(3,4-AHBA的结构异构体)的副产物，在大肠杆菌BAP1的nhoA基因缺失菌株(MAR1菌株)中也产生3,5-AcAHBA作为副产物，如此，NhoA似乎不是3,5-AHBA的N-乙酰化的主要因子。 [0012] 现有技术文献 [0013] 专利文献 [0014] 专利文献1：JP 2004-283163-A [0015] 专利文献2：国际公开文本WO2010/005099 [0016] 非专利文献 [0017] 非专利文献1：J.Biol.Chem.，281(2006)，36944-36951 [0018] 非专利文献2：J.Bacteriol.，189(2007)，2155-2159 [0019] 非专利文献3：Biochim.Biophys.Acta.，1475(2000)，10-16 [0020] 非专利文献4：J.Antibiot.，vol.59(2006)，p.464 [0021] 发明概述 [0022] 本发明要解决的问题 [0023] 本发明根据这类现有技术的实际情况完成，而且本发明的目的是提供一种用于通过利用大肠杆菌来方便且便宜地产生氨基羟基苯甲酸型化合物如3-氨基-4-羟基苯甲酸的方法，所述大肠杆菌是常用于通过生物合成方法的生产工艺的细菌。 [0024] 用于解决问题的手段 [0025] 由于大量研究，发明人已经发现了nhoA涉及大肠杆菌中从3,4-AHBA以副产物形成3,4-AcAHBA，如此可通过使用经修饰以降低NhoA活性的大肠杆菌大量产生未乙酰化的3,4-AHBA，并完成了本发明。 [0026] 亦即，本发明如下。 [0027] [1].具有产生3-氨基-4-羟基苯甲酸的能力的大肠杆菌，其经过修饰以增加从二羟基丙酮磷酸和天冬氨酸半醛形成3-氨基-4-羟基苯甲酸的活性，其中所述大肠杆菌经过修饰以降低N-羟基芳基胺O-乙酰基转移酶(NhoA)活性。 [0028] [2].依照[1]的大肠杆菌，其中通过使染色体上的nhoA基因突变或缺失来降低所述NhoA活性。 [0029] [3].依照[1]或[2]的大肠杆菌，其中所述产生3-氨基-4-羟基苯甲酸的能力是通过用掺入有DNA的重组载体进行转化而赋予的，所述DNA编码具有从二羟基丙酮磷酸和天冬氨酸半醛形成3-氨基-4-羟基苯甲酸的活性的蛋白质。 [0030] [4].依照[3]的大肠杆菌，其中所述具有形成3-氨基-4-羟基苯甲酸的活性的蛋白质是GriI和GriH。 [0031] [5].依照[4]的大肠杆菌，其中所述GriI是依照以下(A)至(C)中任一项的蛋白质，且所述GriH是依照以下(D)至(F)中任一项的蛋白质： [0032] (A)包含由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的蛋白质； [0033] (B)包含在上文(A)所示的氨基酸序列中具有一个或几个氨基酸取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列，且具有醛缩酶活性的蛋白质； [0034] (C)包含与上文(A)所示的氨基酸序列具有70％或更高同一性的氨基酸序列，且具有醛缩酶活性的蛋白质； [0035] (D)包含由SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的蛋白质； [0036] (E)包含在上文(D)所示的氨基酸序列中具有一个或几个氨基酸取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列，且具有3-氨基-4-羟基苯甲酸合酶活性的蛋白质；和[0037] (F)包含与上文(D)所示的氨基酸序列具有70％或更高同一性的氨基酸序列，且具有3-氨基-4-羟基苯甲酸合酶活性的蛋白质。 [0038] [6].依照[3]的大肠杆菌，其中所述编码具有形成3-氨基-4-羟基苯甲酸的活性的蛋白质的DNA包含griI基因和griH基因。 [0039] [7].依照[6]的大肠杆菌，其中所述griI基因是依照以下(a)至(c)中任一项的DNA，且所述griH基因是依照以下(d)至(f)中任一项的DNA： [0040] (a)包含由SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:15所示核苷酸序列的DNA； [0041] (b)在严格条件下与和上文(a)所示核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交，且编码具有醛缩酶的活性的蛋白质的DNA； [0042] (c)与上文(a)所示的核苷酸序列具有70％或更高同一性，且具有醛缩酶的活性的DNA； [0043] (d)包含由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:17所示核苷酸序列的DNA； [0044] (e)在严格条件下与和上文(d)所示核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交，且编码具有3-氨基-4-羟基苯甲酸合酶的活性的蛋白质的DNA；和 [0045] (f)与上文(d)所示的核苷酸序列具有70％或更高同一性，且具有3-氨基-4-羟基苯甲酸合酶的活性的DNA。 [0046] [8].依照[7]的大肠杆菌，其中所述griI基因和griH基因源自放线菌(actinomycete)。 [0047] [9].依照[7]的大肠杆菌，其中所述griI基因和griH基因源自链霉菌属(Streptomyces)。 [0048] [10].依照[7]的大肠杆菌，其中所述griI基因和griH基因源自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)。 [0049] [11].依照[7]的大肠杆菌，其中所述griI基因和griH基因源自Streptomyces murayamaensis。 [0050] [12].依照[1]至[11]中任一项的大肠杆菌，其具有编码突变的天冬氨酸激酶III的基因，该酶中的反馈抑制被消除。 [0051] [13].一种用于产生3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物的方法，包括培养依照[1]至[12]中任一项的大肠杆菌的步骤。 [0052] [14].一种用于产生含有3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物作为组分的聚合物的方法，包括将通过依照[13]的方法产生的3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物聚合的步骤。 [0053] [15].依照[14]的方法，其中所述聚合物是聚苯并噁唑聚合物。 [0054] 发明效果 [0056] 图1是显示通过下列各项的反相柱层析得到的分析结果的图：(a)大肠杆菌BW25113菌株的培养上清液，(b)大肠杆菌BW25113ΔnhoA菌株的培养上清液，和(c)3,4-AHBA的标准制备物。 [0057] 发明详述 [0058] 实施本发明的最佳模式 [0059] 本发明提供了作为具有产生3-氨基-4-羟基苯甲酸的能力的细菌的大肠杆菌。在本发明的细菌中可以抑制乙酰化副产物(3,4-AcAHBA)的形成。 [0060] <1>降低N-羟基芳基胺O-乙酰基转移酶(NhoA)的活性的修饰 [0061] 在本发明的细菌中，可通过修饰细菌以降低N-羟基芳基胺O-乙酰基转移酶(NhoA)的活性来抑制乙酰化副产物的形成。所述NhoA活性是N-羟基芳基胺O-乙酰基转移酶活性，而且指从3-氨基-4-羟基苯甲酸(3,4-AHBA)与3,4-AHBA相关地形成3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸(3,4-AcAHBA)的活性。 [0062] 短语“经修饰以降低NhoA活性”指NhoA活性变得低于未经修饰的菌株例如野生型大肠杆菌中的比活。NhoA活性优选相比于未经修饰菌株中的NhoA活性降低至每微生物细胞50％或更低，优选30％或更低，且更期望地10％或更低。“降低”包括其中活性完全消失的情况。在本发明的大肠杆菌中，仅需要NhoA活性低于野生型菌株或未经修饰的菌株中的，但3,4-AHBA的进一步累积相比于这些菌株是期望增强的。短语“经修饰以降低NhoA活性”对应于其中每细胞的NhoA分子数降低的情况和其中每分子NhoA活性降低的情况等。具体地，可通过常规诱变或基因工程处理引入降低NhoA活性的修饰。诱变的例子可以包括用X射线或紫外线辐射和用诱变剂如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍处理。这类修饰的例子可以包括将突变引入染色体上的nhoA基因(包含表达调控区)或缺失部分或全部的nhoA基因，从而NhoA活性相比于非突变菌株可以降低或消失。用于使基因突变或缺失的方法的例子可以包括表达调控区如启动子序列和Shine-Dalgarno(SD)序列的修饰，将错义突变、无义突变或移框突变引入到可读框中，以及基因的部分缺失(J.Biol.Chem.1997，272(13):8611-7)。可将nhoA基因的突变和缺失引入微生物中，其通过使用同源重组方法(其中将染色体上的野生型基因用具有突变或缺失的基因替换)或通过使用转座子或IS因子进行。同源重组方法可以包括使用线性DNA、温度敏感性质粒和非复制质粒的方法。这些方法记载于Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，2000Jun.6；97(12):6640-5、美国专利No.6,303,383，JP05-007491-A等中。 [0063] 可通过使用从候选微生物菌株获得的细胞提取物或从其纯化的级分测量酶活性，并将该活性与野生菌株或未经修饰菌株的活性进行比较来确认靶酶的活性和降低的活性的水平。例如，可通过非专利文献3中描述的方法来测量NhoA活性。 [0064] 经修饰以降低NhoA活性的大肠杆菌可以包括本质上具有产生3,4-AHBA的能力的大肠杆菌和本质上没有产生3,4-AHBA的能力，但已经被给予产生3,4-AHBA的能力的大肠杆菌。可通过后面描述的方法给予产生3,4-AHBA的能力。适宜的菌株可用作本发明中使用的大肠杆菌，并且其例子可以包括K12菌株(ATCC10798)或其次代菌株(substrain)(例如BW25113(CGSC7630)，DH1(ATCC33747)，MG1655(ATCC700926)，W3110(ATCC27325))，和B菌株或其次代菌株(例如BL21(ATCCBAA-1025)，REL606(CGSC12149))。在上述菌株中以CGSC编号指定的那些菌株可从大肠杆菌遗传储备中心(The Coli Genetic Stock Center)(http://cgsc.biology.yale.edu/)获得。在上述菌株中以ATCC编号指定的那些菌株可从美国典型培养物保藏中心(http://www.atcc.org/)获得。 [0065] NhoA可以包括以下蛋白质，其包含与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，仍更优选95％或更高，特别优选98％或99％或更高同一性的氨基酸序列且具有NhoA活性。nhoA基因还可以包含如下的基因，其包含与SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列具有70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，仍更优选95％或更高，特别优选98％或99％或更高同一性的核苷酸序列且编码具有NhoA活性的蛋白质。 [0066] 可通过使用Karlin和Altschul的算法BLAST(Pro.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873(1993))或Pearson的FASTA(Methods Enzymol.，183，63(1990))来测定氨基酸序列之间或核苷酸序列之间的同源性(例如同一性或相似性)。已基于此算法BLAST开发出称为BLASTP和BLASTN的程序(参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。如此，可使用具有缺省设置的这些程序来计算氨基酸序列之间和核苷酸序列之间的同源性。再例如，通过使用在ORF中编码的多肽的全长部分，使用具有比较单元大小(Unit Size to Compare)＝2的设置的软件GENETYX Ver.7.0.9(其可从Genetyx Corporation获得)，采用Lipman-Pearson方法计算为百分比获得的数值可用作氨基酸序列之间的同源性。可采用从这些计算得到的数值中的最低值作为氨基酸序列之间和核苷酸序列之间的同源性。 [0067] nhoA基因的核苷酸序列根据大肠杆菌的菌株有时是不同的。由nhoA基因编码的蛋白质的例子可以包括如下的蛋白质，其包含在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的一个或多个位置处具有一个或几个氨基酸取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列，且具有NhoA活性。这里，“几个”随蛋白质三维结构中的氨基酸残基的类型位置等而变化，但优选指1至50，更优选1至20，仍更优选1至10且特别优选1至5。这类取代、缺失、插入、添加等包括基于具有nhoA基因的微生物的个体差异从天然存在的突变(突变体或变体)得到的那些。 [0068] nhoA基因还可以是在严格条件下与和SEQ ID NO:23所示核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交，且编码具有NhoA活性的蛋白质的DNA。这里，“严格条件”指其中形成所谓的特异性杂合物而不形成非特异性杂合物的条件。一个例子是其中具有高同源性(例如同一性或相似性)，例如70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，仍更优选95％或更高，且特别优选98％或更高同源性的多核苷酸彼此杂交，而具有比它要低的同源性的多核苷酸彼此不杂交的条件。具体地，这类条件可以包括在约45℃在6xSSC(氯化钠/柠檬酸钠)中杂交，继之以在0.2xSSC和0.1％SDS中于50至65℃的一次或两次或更多次清洗。 [0069] <2>增加从二羟基丙酮磷酸和天冬氨酸半醛产生3-氨基-4-羟基苯甲酸的活性的修饰 [0070] 本发明的细菌可以是经修饰以增加从二羟基丙酮磷酸(DHAP)和天冬氨酸半醛(ASA)产生3-氨基-4-羟基苯甲酸(3,4-AHBA)的活性的细菌。这类修饰可通过例如将本发明的细菌用掺入编码蛋白质的DNA的重组载体转化来实现，所述蛋白质具有从DHAP和ASA形成3,4-AHBA的活性。具有从DHAP和ASA形成3,4-AHBA的活性的蛋白质不受具体限制，只要该蛋白质有助于从DHAP和ASA形成3,4-AHBA，且包括例如具有催化DHAP和ASA之间的碳-碳键形成的酶活性(下文中有时缩写为“醛缩酶活性”)和具有催化通过形成DHAP和ASA之间的碳-碳键而获得的C7化合物环化的酶活性(下文中有时缩写为3-氨基-4-羟基苯甲酸合酶活性)的蛋白质。在下文中，上述两种活性有时称为生物合成3,4-AHBA的能力。 [0071] 编码具有催化DHAP和ASA之间的碳-碳键形成的酶活性的蛋白质的基因可以包括源自灰色链霉菌的griI基因或griI基因同源物(griI基因和griI基因同源物两者有时一起简称为griI基因)。griI基因同源物指源自另一种微生物，与源自灰色链霉菌的上述基因展现出高同源性，且编码具有醛缩酶活性的蛋白质的基因。这类基因可通过BLAST搜索来搜寻。其例子可以包括源自Streptomyces murayamaensis的nspI基因(SEQ ID NO:14和15)，源自弗兰克氏菌(Frankia sp.)的果糖双磷酸醛缩酶(登录号YP_483282)和果糖双磷酸醛缩酶(登录号YP_481172)，源自疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)的果糖双磷酸醛缩酶(http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/blast/submitblast/s_scabies)，源自伯克氏菌(Burkholderia sp.)383的果糖双磷酸醛缩酶(登录号Q39NQ9)，源自詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的果糖双磷酸醛缩酶(登录号NP_247374)，和源自大肠杆菌的dhn基因(登录号NC_000913)(Journal of Biochemistry vol.281，NO.48，pp.36944-36951，补充数据)。 [0072] 编码具有催化通过形成DHAP和ASA之间的碳-碳键获得的C7化合物环化的酶活性的蛋白质的基因可以包括源自灰色链霉菌的griH基因或griH基因同源物(griH基因和griH基因同源物两者有时一起简称为griH基因)。griH基因同源物指源自另一种微生物，展现出与源自灰色链霉菌的基因的高同源性，且编码具有3-氨基-4-羟基苯甲酸合酶活性的蛋白质的基因。这类基因可通过BLAST搜索来搜寻。其例子可以包括源自Streptomyces murayamaensis的nspH基因(SEQ ID NO:16和17)，源自弗兰克氏菌的3-脱氢奎宁酸(dehydroquinate)合酶(登录号YP_483283)和3-脱氢奎宁酸合酶(登录号YP_481171)，源自伯克氏菌383的3-脱氢奎宁酸合酶(登录号YP_366552)和3-脱氢奎宁酸合酶(登录号YP_366553)，源自疮痂病链霉菌的3-脱氢奎宁酸合酶( [0073] 可在本发明中使用源自任何生物体的GriI和GriH或griI基因和griH基因。例如，它们可以源自微生物如上文描述的细菌或放线菌(actinomycete)，而且优选地可以源自放线菌。放线菌的例子可以包括属于链霉菌属的微生物。属于链霉菌属的微生物的例子可以包括灰色链霉菌、Streptomyces murayamaensis、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)和疮痂病链霉菌。GriI和GriH或griI基因和griH基因可以源自相同的微生物或不同的微生物。 [0074] 期望包含与作为由上述griI基因编码的蛋白质的氨基酸序列的SEQ ID NO:5或14具有70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，仍更优选95％或更高，特别优选98％或99％或更高同一性的氨基酸序列，且具有醛缩酶活性的蛋白质作为GriI同源物。 其例子可以包括专利文献2中的SEQ ID NO:9，11，13，15，17，19和21。还期望包含与作为griI基因的核苷酸序列的SEQ ID NO:6或15具有70％或更高，优选80％或更高，更优选 90％或更高，仍更优选95％或更高，特别优选98％或99％或更高同一性的核苷酸序列，且编码具有醛缩酶活性的蛋白质的核苷酸序列作为griI基因同源物。其例子可以包括专利文献2中的SEQ ID NO:8，10，12，14，16，18和20。 [0075] 期望包含与作为由上述griH基因编码的蛋白质的氨基酸序列的SEQ ID NO:7或16具有70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，仍更优选95％或更高，特别优选 98％或99％或更高同一性的氨基酸序列，且具有3-氨基-4-羟基苯甲酸合酶活性的蛋白质作为GriH同源物。其例子可以包括专利文献2中的SEQ ID NO:23，25，27，29，31，33和 35。还期望包含与作为griH基因的核苷酸序列的SEQ ID NO:8或17具有70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，仍更优选95％或更高，特别优选98％或99％或更高同一性的核苷酸序列，且编码具有3-氨基-4-羟基苯甲酸合酶活性的蛋白质的核苷酸序列作为griH基因同源物。其例子可以包括专利文献2中的SEQ ID NO:22，24，26，28，30，32和 34。 [0076] 对于本领域技术人员来说，氨基酸序列中对活性无影响的突变的氨基酸残基位置是明显的，但可以参照序列比对进一步制备蛋白质突变体。具体地，本领域技术人员能(1)比较多个同源物蛋白质的氨基酸序列，(2)证明相对保守的区域和相对不保守的区域，然后(3)从相对保守区域和相对不保守区域分别预测出能起功能性重要作用的区域和不能起功能性重要作用的区域，如此识别结构和功能的相关关系。专利文献2披露了上文griI基因同源物的氨基酸序列的比对(专利文献2中的图1和2)，上文griH基因同源物的氨基酸序列的比对(专利文献2中的图3和4)，及其共有(共同)序列(专利文献2中的SEQ ID NO:36和37)。上文griI基因同源物包括编码专利文献2中由SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的基因，而上文griH基因同源物包括编码专利文献2中由SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的基因。 [0077] 可以如上文描述的那样测定氨基酸序列之间和核苷酸序列之间的同源性(例如同一性或相似性)。 [0078] griI基因或griH基因的核苷酸序列可以随微生物的物种和微生物菌株而不同。如此，griI基因和griH基因仅必需能够通过将其在大肠杆菌中表达(例如提升其表达)增强在大肠杆菌中产生3,4-AHBA的能力。例如，期望在由griI基因编码的蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO:5或14)中的一个或多个位置处包含一个或几个氨基酸取代、缺失、插入、添加等，且具有醛缩酶活性的蛋白质作为由griI基因编码的蛋白质。其例子可以包括专利文献2中的SEQ IDNO:9，11，13，15，17，19和21。期望在由griH基因编码的蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO:7或16)中的一个或多个位置处包含一个或几个氨基酸取代、缺失、插入、添加等，且具有3-氨基-4-羟基苯甲酸合酶活性的蛋白质作为由griH基因编码的蛋白质。其例子可以包括专利文献2中的SEQ ID NO:23，25，27，29，31，33和35。本文中，“几个”根据蛋白质三维结构中的氨基酸残基的类型或位置而变化，但优选指1至50，更优选1至20，仍更优选1至10且特别优选1至5。这类氨基酸取代、缺失、插入、添加等包括基于具有griI基因或griH基因的微生物的个体差异或物种差异从天然存在的突变(突变体或变体)得到的那些。所述取代优选为保守取代，其为功能未被改变的中性取代。保守取代如上文所述。 [0079] 另外，griI基因和griH基因的简并性根据导入这类基因的宿主而变化。如此，可以用大肠杆菌中可用的密码子替换密码子。类似地，griI基因和griH基因可以是编码在N端侧和/或C端侧延伸或截短的蛋白质的基因，只要该基因具有增强在大肠杆菌中产生3,4-AHBA的能力的功能。例如，延伸或截短的残基的长度为50或更少，优选20或更少，更优选10或更少，特别优选5或更少个氨基酸残基。更具体地，所述基因可以是编码其中已延伸或截短N端侧的50至5个氨基酸残基或C端侧的50至5个氨基酸残基的蛋白质的基因。 [0080] 可以如下获得这类与griI基因或griH基因同源的基因，即例如通过定点诱变修饰编码氨基酸序列的基因，从而在所编码蛋白质的特定位置处的氨基酸残基可以包含取代、缺失、插入或添加。这类同源基因还可以通过常规已知的突变处理如下获得。用羟胺等体外处理griI基因或griH基因的方法和用紫外线或突变剂如一般用于突变处理的N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或乙基甲磺酸盐(EMS)处理携带该基因的微生物的方法，易错PCR(Cadwell，R.C.PCR Meth.Appl.2，28(1992))，DNA改组(Stemmer，W.P.Nature370，389(1994))，和StEP-PCR(Zhao，H.Nature Biotechnol.16，258(1998))可用作突变处理。利用这些处理，可以通过基因重组人工地将突变引入griI基因或griH基因中以获得编码具有高活性的酶的基因。 [0081] 所述griI基因还可以是在严格条件下与和griI基因或其同源物基因的核苷酸序列(例如专利文献2中的SEQ ID NO:6或15，或SEQ ID NO:8，10，12，14，16，18或20)互补的核苷酸序列杂交，且编码具有醛缩酶活性的蛋白质的DNA。所述griH基因还可以是在严格条件下与和griH基因或其同源物基因的核苷酸序列(例如专利文献2中的SEQ ID NO:8或17，或SEQ ID NO:22，24，26，28，30，32或34)互补的核苷酸序列杂交，且编码具有3-氨基-4-羟基苯甲酸合酶活性的蛋白质的DNA。“严格条件”与上文的描述相同。 [0082] 将关于上述基因同源物和保守取代的描述以相同方式应用于本文描述的其他基因。 [0083] 这些griI基因和griH基因及其同源物基因是否编码增强产生3,4-AHBA的能力的蛋白质可通过将这些基因引入具有编码反馈抑制被消除的突变天冬氨酸激酶的基因的细菌等中，并检查形成3,4-AHBA的活性是否增强来确认。在此类情况中，可通过使用依照例如Suzuki等的方法[J.Bio.Chem.，281，823-833(2006)]的反相层析量化3,4-AHBA来更清楚地确认该影响。 [0084] <3>重组载体 [0085] 可以通过将期望基因引入表达载体来获得可在本发明中使用的重组载体。例如，当使用griI和griH两者时，可将它们在分别用于转化的分开的重组载体中携带，或可经由适宜的间隔区连接并在同一重组载体中携带以用于转化，只要它们分别以可表达状态包含在转化体中。griI基因和griH基因可源自相同的微生物或不同的微生物。当griI基因和griH基因源自相同的微生物且在染色体上极其紧密定位时，可将包含griI和griH两者的DNA片段切出并在载体中携带。 [0086] 用于本发明的重组载体一般具有启动子，本发明的前述DNA例如griI和griH，和基因在大肠杆菌中表达必需的、在适宜位置处使得其能起作用的调控区(操纵基因和终止子)。 [0087] 可用作重组载体的表达载体不受具体限制，仅必需能在大肠杆菌中起作用，且可以是那些在染色体外自身复制(如质粒)，或者可以整合到细菌中的染色体中的表达载体。具体地，表达载体的例子可以包括pSTV(例如pSTV28)，pUC(例如pUC18，pUC19)，pBR(例如pBR322)，pHSG(例如pHSG298，pHSG299，pHSG399，pHSG398)，pACYC(例如pACYC177，pACYC184)，pMW(例如pMW118，pMW119，pMW218，pMW219)，pQE(例如pQE)及其衍生物。 [0088] 可用于本发明的启动子不受具体限制，且可以使用一般用于在大肠杆菌中产生外来蛋白质的启动子。其例子可以包括有力的启动子如T7启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、lambda噬菌体的PR启动子和PL启动子、T5启动子等。 [0089] <4>转化体 [0090] 本发明的细菌不受具体的限制，只要这是经修饰以具有产生3-氨基-4-羟基苯甲酸和降低N-羟基芳基胺O-乙酰基转移酶(NhoA)活性的能力的大肠杆菌，且优选地是转化体。本发明的转化体优选通过用重组载体转化获得，在所述重组载体中已经引入编码具有从二羟基丙酮磷酸和天冬氨酸半醛形成3-氨基-4-羟基苯甲酸的活性的蛋白质的DNA。 [0091] 用作宿主的大肠杆菌优选为能有效供应作为3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物生物合成底物的二羟基丙酮磷酸和天冬氨酸半醛的菌株。大肠杆菌具有为非偶联酶并单独起作用的天冬氨酸激酶III(AKIII)。大肠杆菌中的AKIII最初经历通过赖氨酸的反馈抑制。本发明的大肠杆菌优选具有如下的AKIII基因，其具有能消除赖氨酸的反馈抑制的突变。 [0092] 已对源自多种微生物如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的天冬氨酸激酶报告了能消除氨基酸如赖氨酸的反馈抑制的突变。例如，在位置250的谷氨酸到赖氨酸的突变(E250K)、在位置318的甲硫氨酸到异亮氨酸的突变(M318I)、在位置344的苏氨酸到甲硫氨酸的突变(T344M)、在位置345的丝氨酸到亮氨酸的突变(S345L)、和在位置352的苏氨酸到异亮氨酸的突变(T352I)已报告为能消除大肠杆菌的AKIII中的赖氨酸反馈抑制的突变(参见例如Kikuchi等，FEMS Microbiology Letters173，211-215(1999)，和Falco等，BioTechnology 13，577-582(1995))。因此，具有其中已引入这类突变的AKIII基因的大肠杆菌可用于本发明中。几个氨基酸残基随AKIII来源的大肠杆菌菌株而不同，即使在野生型AKIII中，而且可以使用这类等位突变体。可以鉴定出等位突变体中要修饰以用于消除反馈抑制的位置，其通过进行本领域技术人员公知的序列比对进行。可以通过本领域技术人员已知的方法来实现消除AKIII中的反馈抑制的修饰，例如通过获得对赖氨酸类似物如2-氨乙基半胱氨酸具有抗性的突变体菌株，或通过利用同源重组的基因替换引入位点特异性突变。还有，可通过用包含其中消除反馈抑制的突变AKIII基因的质粒转化大肠杆菌来获得具有提升的其中反馈抑制被消除的突变AKIII的活性的大肠杆菌。 [0093] 在具有其中反馈抑制被消除的突变AKIII的大肠杆菌中，可以进一步增加丙酮酸羧化酶基因的表达。 [0094] 依照本领域中已知的方法，可用掺入编码以下蛋白质的DNA的重组载体来转化大肠杆菌，所述蛋白质具有从二羟基丙酮磷酸和天冬氨酸半醛形成3-氨基-4-羟基苯甲酸的活性。例如，可以使用原生质体方法(Gene，39，281-286(1985))、电穿孔方法(Bio/Technology，7，1067-1070(1989))等。当进行用于消除AKIII中的反馈抑制的转化时，可以首先实施赋予形成3,4-AHBA活性的转化或用于消除AKIII中的反馈抑制的转化。 [0095] <5>用于产生3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物和包含其作为组分的聚合物的方法[0096] 本发明还提供一种用于产生3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物的方法，包括培养本发明的细菌的步骤。 [0097] 本发明中的3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物包括具有以下结构的3-氨基-4-羟基苯甲酸(下文有时缩写为“3,4-AHBA”)以及其衍生物和盐。 [0098] [化学物2] [0099] [0100] 在3-氨基-4-羟基苯甲酸的衍生物中，(1)选自下组的至少一个基团是衍生化的：在位置1的羧基基团，在位置3的氨基基团和在位置4的羟基基团，(2)保留在位置1的羧基基团、在位置3的氨基基团和在位置4的羟基基团，且在从位置2、5和6的碳原子选择的至少一个碳原子上的氢原子被其他原子或基团取代，或(3)组合(1)和(2)。上文(2)中其他原子或基团的例子可以包括卤素原子(例如氟原子、溴原子、氯原子、碘原子)、烃基(alkyl)基团(例如具有1至6个碳原子的烃基基团，如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基)、羟基基团、烷氧基(alkoxyl)基团(烃基模块与上文的描述相同)、氨基基团、单烃基氨基或双烃基氨基基团(烃基模块与上文的描述相同)、氰基基团、硝基基团、磺酰基基团和羧基基团。具体地，上文(1)中衍生物的例子可以包括其中位置1的羧基基团被衍生化的衍生物(例如3-氨基-4-羟基苯醛，其中3-氨基-4-羟基苯甲酸中的羧基基团是醛化的)，其中位置3的氨基基团被如上述烃基基团的基团衍生化的衍生物(例如3-烃基氨基衍生物)，和其中位置4的羟基基团被如上述烃基基团衍生化的衍生物(例如4-单烃基氨基或双烃基氨基衍生物)。 [0102] 可通过培养本发明的细菌并回收培养基中产生的3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物来产生3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物。 [0103] 用于培养本发明细菌的培养基并不受具体限制，只要大肠杆菌得到培养，而且可依照本领域中公开已知的方法来培养所述细菌。例如，可在含有碳源、氮源和无机离子的普通培养基中培养细菌。根据需要，可以添加有机痕量营养物如维生素和氨基酸以获得更高的增殖。培养温度一般为25至42℃，且期望将pH控制为5至8。培养时间段通常为20至90小时。 [0104] 期望在控制氧气供应的条件下实施本发明细菌的培养。具体地，期望在细菌生长变为对数生长期时将氧气保持为2.0ppm或更低。 [0105] 可从公开已知的方法中适宜地选择用在从培养基回收和纯化3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物的步骤中的回收方法。例如，优选从在将培养基的pH调整为3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物的溶解度较高的酸性pH后通过离心或膜过滤除去微生物细胞获得的培养基上清液回收。从已除去微生物细胞的培养基上清液中的3-氨基-4-羟基苯甲酸的回收方法可以包括通过多孔吸附剂、结晶和沉淀的纯化。 [0106] 用于本发明的多孔吸附剂是具有较大表面积的多孔固体吸附剂，且具体地包括亲水性吸附剂，典型为硅胶、矾土(alumina)、沸石、铝矾土(bauxite)、氧镁(magnesia)、活性白土(activated white earth)、丙烯酸合成吸附剂(acrylic synthetic adsorbent)等，和疏水性吸附剂，典型为木炭(vegetable charcoal)、骨碳、活性炭和芳香合成吸附剂。在本发明中，可以无具体限制地使用任意吸附剂，只要能通过吸附杂质增加3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物的纯度。然而，在此方面，由多孔吸附剂吸附的杂质丰富地含有主要在生物化学合成过程中产生的芳香族化合物。如此，在本发明中适宜地使用疏水性吸附剂，典型为这些化合物容易吸附的活性炭和芳香族合成吸附剂。这些疏水性吸附剂可单独使用或两种或更多种组合使用。 [0107] 当使用活性炭时，其原材料不受具体限制，且可以包括但不具体限于，植物原材料如木粉和棕榈壳，基于煤/石油的原材料如无烟煤、石油沥青(petroleum pitch)和焦炭，基于合成树脂的原材料如丙烯酸树脂、酚树脂、环氧树脂和聚酯树脂。活性炭的形状是粉末、颗粒和纤维状，和次级加工商品如滤器(filter)和筒(cartridge)，并且可适当选择容易操作的。 [0108] 同时，当使用芳香族合成吸附剂时，其原材料不受具体限制，例如可以使用多孔树脂如1)未取代的芳香族树脂，2)具有疏水性取代基的芳香族树脂，和3)通过对未取代的芳香族树脂给予特别处理获得的芳香族树脂。特定的化合物可以包括例如基于苯乙烯和二乙烯基苯的树脂。 [0109] 如上文提述的，使培养基中的3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物与多孔吸附剂接触的一个目的是将杂质吸附到多孔吸附剂上并改进3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物的纯度。然而，在一些情况中，作为目的产物的3-氨基-4-羟基苯甲酸并非小部分地与杂质一起被吸附到多孔吸附剂上。如此，还可以通过使培养基中的3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物与多孔吸附剂接触，然后使多孔吸附剂与极性有机溶剂接触以将3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物脱离并溶解于该极性有机溶剂中来分离并回收3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物。本发明中使用的极性有机溶剂指由具有高介电常数的极性分子构成的有机溶剂，而且可以不受具体限制的使用，只要3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物可从多孔吸附剂脱离且3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物可溶解于该极性有机溶剂中。所述极性有机溶剂可以单独地或两种或更多种以期望的组合比组合地使用。 [0110] 本发明中的结晶或沉淀指产生晶体或沉淀物的操作，该操作通过蒸发其中溶解有目的物质的溶剂以浓缩，或降低温度，或通过向其中溶解有目的物质的溶剂添加不良溶剂来保持浓度高于饱和溶解度，且不受具体限制，包括常规和公知的方法。可通过沉淀、过滤、离心等分离产生的晶体或沉淀物。 [0111] 本发明还提供一种产生包含3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物作为组分的聚合物的方法。依照本发明的聚合物的产生方法包括将3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物作为聚合物的至少一种成分进行聚合的步骤。 [0112] 例如，通过在非氧化性溶剂酸如甲磺酸或聚磷酸中于高温缩合聚合来聚合其纯度已通过使用多孔吸附剂或通过结晶、沉淀等从本发明细菌的培养基改善的3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物(例如WO91/01304)。在依照本发明的聚合物的产生方法中，3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物可与聚合物的其他成分聚合。其他成分的例子包括对苯二甲酸和双酚A、或对苯二甲酸和对苯二胺。聚合方法可通过利用多种已知的方法实践(美国专利No.5,142,021，5,219,981和5,422,416,和Kricheldorf等，(1992)Makromol.Chem.，193，2467-2476,和Marcos-Fernandez等，(2001)Polymer，42，7933-7941)。通过本发明的方法产生的包含3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物作为组分的聚合物的例子包括聚苯并噁唑聚合物、聚酯和聚酰胺。 实施例 [0113] 实施例1：搜寻催化大肠杆菌中3,4-AHBA转化的酶 [0114] (1)基于大肠杆菌的基因组信息搜寻3,4-AHBA转化酶 [0115] 已报告芳基胺N-乙酰基转移酶(同义术语：NatA；NCBI登录ID:BAF46971.1)催化灰色链霉菌IFO13350菌株中3,4-AHBA的N-乙酰化反应，而且NatA的氨基酸序列是公众已知的[Suzuki等，(2007)J.Bacteriol.，189，2155-2159]。 [0116] NatA的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:1。为了搜寻与NatA具有相同功能的酶，从大肠杆菌K-12菌株的基因组信息搜寻与NatA序列具有同源性的序列。利用公开的数据库(EcoCyc，http://ecocyc.org/，Keseler等，(2005)Nucleic Acids Res.，33，334-337)并使用BLASTP搜寻的结果是，发现大肠杆菌K-12菌株中的N-羟基芳基胺O-乙酰基转移酶(同义术语：NhoA，EC:2.3.1.118，NCBI登录ID:NP_415980.1)与源自灰色链霉菌IFO13350菌株的NatA展现49％的同源性。NhoA的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:2。 [0117] (2)分析大肠杆菌中nhoA基因缺失的突变体菌株和野生型菌株的3,4-AHBA转化能力 [0118] 使用大肠杆菌BW25113ΔnhoA(相同菌株：JW1458，Keio Collection)作为具有编码NhoA(同义术语：nhoA，GenBank登录号：NC_000913.2，GI:947251)的基因缺失的菌株。大肠杆菌BW25113ΔnhoA菌株是通过缺失大肠杆菌BW25113菌株中的nhoA基因所获得的菌株(Haldimann等，(2001)J.Bacteriol.，183，6384-6393)(CGSC7630)(Baba等，(2006)Mol.Syst.Biol.，2，2006-2008)。大肠杆菌BW25113ΔnhoA菌株可从国家遗传研究所(National Institute of Genetics(http://www.nig.ac.jp/))获得。大肠杆菌BW25113菌株可从大肠杆菌遗传库存中心(http://cgsc.biology.yale.edu/)获得。 [0119] 依照以下规程计算大肠杆菌BW25113ΔnhoA菌株和BW25113菌株中转化3,4-AHBA的能力。将每种菌株的微生物细胞均一地施加到LB板上，并在37℃培养24小时。将来自所得板的一全环微生物细胞接种到试管中的4mL MS葡萄糖/3,4-AHBA培养基中，并在往复式摇动培养装置上于30℃培养30小时。MS葡萄糖/3,4-AHBA培养基的组成如下表1中所描述的。 [0120] [表1] [0121] 表1.MS葡萄糖/3,4-AHBA培养基 [0122]组分 终浓度(g/L) 葡萄糖 40 (NH4)2SO4 24 3,4-AHBA 2 KH2PO4 1 MgSO4·7H2O 1 FeSO4·7H2O 0.01 MnSO4·7H2O 0.0082 酵母提取物 2 CaCO3 50 [0123] 将培养基的pH值用KOH调整为7.0，并将培养基在120℃高压灭菌20分钟。还有，将葡萄糖和MgSO4·7H2O分开混合和灭菌。在干热灭菌后添加CaCO3。将3,4-AHBA以20g/L溶解于蒸馏水，然后用KOH调整为pH 7.0，经由滤器过滤，随后以终浓度2.0g/L添加。 [0124] 在完成培养后，使用分光光度计(HITACHI U-2900)以600nm测量培养基的光密度(OD)值。使用反相柱层析分离培养上清液中的3,4-AHBA，并量化其浓度(Suzuki等，(2006)J.Biol.Chem.，281，36944-36951)。在600nm处的OD值，培养上清液中3,4-AHBA的浓度，和从每种微生物菌株获得的3,4-AHBA的转化率显示于表2。通过以下公式计算3,4-AHBA的转化率： [0125] [3,4-AHBA的转化率(％)]＝100×{2(g/L)-[完成培养后培养基上清液中的3,4-AHBA浓度(g/L)]}/2(g/L) [0126] [表2] [0127] 表2.nhoA缺失对转化3,4-AHBA的能力的影响 [0128] [0129] 结果，在培养大肠杆菌BW25113菌株后培养上清液中3,4-AHBA的浓度降低至起始浓度的30％。另一方面，大肠杆菌BW25113ΔnhoA菌株培养后在培养上清液中3,4-AHBA浓度的降低为约10％。因此，强烈表明NhoA催化3,4-AHBA的转化反应。 [0130] 对于大肠杆菌BW25113菌株的培养上清液、大肠杆菌BW25113ΔnhoA菌株的培养上清液、和3,4-AHBA标准制备物(从Tokyo Chemical Industry CO.，Ltd.供应，货号：A0859)的反相柱层析的图显示于图1。这表明3,4-AHBA在大肠杆菌BW25113菌株中转化成在9.5分钟保留时间(R.T.)处检测到的化合物。 [0131] (3)鉴定从3,4-AHBA转化的产物的分子量(R.T.，9.5分钟) [0132] 通过LC/MS鉴定在实施例1(2)中描述的从3,4-AHBA转化(R.T.，9.5分钟)且包含在BW25113菌株培养后的培养上清液中的产物的分子量。分析条件如下。 [0133] 柱：Inertsil ODS-3 2μm 2.1×75mm(从GL Science供应) [0134] 流动相：A＝0.1％甲酸/H2O [0135] B＝0.1％甲酸/乙腈 [0136] 梯度程序：0分钟：A/B＝100/0 [0137] 3分钟：A/B＝100/0 [0138] 23分钟：A/B＝20/80 [0139] 25分钟：A/B＝20/80 [0140] 流速：0.2mL/分钟 [0141] 柱温：室温(25℃) [0142] 检测波长：254nm(PDA) [0143] MS离子化模式：ESI [0144] 分析仪型号：Agilent Infinity1290(LC) [0145] Agilent Quadrupole LC/MS 6130(MS) [0146] 分析结果为，转化产物(R.T.，9.5分钟)的m/z值为195.1，这与3,4-AHBA的乙酰化产物的计算的m/z值(195.1)一致。下文中将该转化产物(R.T.，9.5分钟)称为3,4-AcAHBA。 [0147] 实施例2：通过引入源自灰色链霉菌的3,4-AHBA合成酶基因群构建产生3,4-AHBA的细菌和对累积的3,4-AHBA和3,4-AcAHBA量的评估 [0148] (1)构建质粒pSTV28-Ptac-Ttrp用于表达 [0149] 随后，在产生3,4-AHBA的细菌中验证nhoA缺失对3,4-AHBA累积的影响。首先，构建用于表达的质粒pSTV28-Ptac-Ttrp以给予产生3,4-AHBA的能力。 [0150] 开始时，化学合成一种DNA片段，其包含tac启动子(同义术语：Ptac)区(deBoer等，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80，21-25)和源自大肠杆菌的色氨酸操纵子的终止子(同义术语：Ttrp)区(Wu等，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75，5442-5446)，且在5’端具有KpnI位点，在3’端具有BamHI位点(其核苷酸序列显示于SEQ ID NO:3)。将所得DNA片段用KpnI和BamHI消化以获得含有Ptac和Ttrp的DNA片段。将纯化DNA片段和用KpnI和BamHI消化的pSTV28(从Takara Bio Inc.供应)通过使用DNA连接酶的连接反应连接。所得质粒称为pSTV28-Ptac-Ttrp(其核苷酸序列显示于SEQ ID NO:4)。可以通过将目的基因克隆到该质粒中Ptac的下游来表达和扩增该目的基因。 [0151] (2)对应于大肠杆菌中密码子选择的griI基因和griH基因(griIH基因)的化学合成 [0152] 已知3,4-AHBA的合成由3,4-AHBA合成酶组催化，该组的组成为灰色链霉菌IFO13350菌株中的醛缩酶(同义术语：SGR_4249，GriI)和3,4-AHBA合酶(同义术语：SGR_4248，GriH)，而且编码这些酶的基因的序列是公开已知的(Suzuki等，(2006)J.Biol.Chem.，281，36944-36951)。GriI由griI基因(GenBank登录号AB259663.1，核苷酸：13956至14780；GI:117676060)编码。GriI蛋白的氨基酸序列和griI基因的核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。GriH由griH基因(GenBank登录号AB259663.1，核苷酸：12690至13880；GI:117676059)编码。GriH蛋白的氨基酸序列和griH基因的核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。 [0153] 为了在大肠杆菌中有效表达griI基因和griH基因，将序列设计为使得通过改变griI基因和griH基因的序列以对应于大肠杆菌中的密码子选择并以操纵子表达，且该序列称为EcGriIH。通过向EcGriIH(其序列显示于SEQ ID NO:9)的5’端添加EcoRI限制酶识别序列和向3’端添加HindIII限制酶识别序列来化学合成DNA片段。将两端添加有限制酶识别序列的EcGriIH用EcoRI和HindIII消化，然后克隆到用相同酶消化的pUC57(从GenScript供应)中。所得载体称为pUC57-EcGri。pUC57-EcGri的全长序列显示于SEQ ID NO:10。 [0154] (3)构建用于表达griI基因和griH基因(griIH基因)的质粒 [0155] 通过以下规程构建用于在大肠杆菌中表达griI基因和griH基因的表达质粒。以pUC57-EcGri作为模板使用由SEQ ID NO:11表示的合成寡核苷酸和由SEQ ID NO:12表示的另一合成寡核苷酸作为引物并使用PrimeStar GXL聚合酶(从Takara Bio Inc.供应)来实施PCR。依照附在试剂盒上的组成制备反应溶液，并以30个循环实施98℃达10秒、55℃达15秒和68℃达150秒的反应。结果，获得约2.1kbp的含EcGriIH基因片段的PCR产物。随后，使用融合HD克隆试剂盒(In-Fusion HD Cloning Kit)(从Clontech供应)将纯化的EcGriIH基因片段和用SmaI消化的pSTV28-Ptac-Ttrp连接。用于表达griIH基因的所得质粒称为pSTV28-EcGri。pSTV28-EcGri的全长序列显示于SEQ ID NO:13。 [0156] (4)构建产生3,4-AHBA的细菌 [0157] 制备大肠杆菌BW25113菌株和BW25113ΔnhoA菌株的感受态细胞，随后通过电穿孔向其导入pSTV28-EcGri，接着将细胞均一地施加到含30mg/L氯霉素的LB板上，并在37℃培养24小时。从所得板获得对氯霉素抗性的转化体。其中已将pSTV28-EcGri导入BW25113菌株的菌株称为BW25113/pSTV28-EcGri菌株，而其中已将pSTV28-EcGri导入大肠杆菌BW25113ΔnhoA菌株的菌株称为BW25113ΔnhoA/pSTV28-EcGri菌株。 [0158] (5)评估用于产生3,4-AHBA的培养 [0159] 将BW25113ΔnhoA/pSTV28-EcGri菌株和BW25113/pSTV28-EcGri菌株的微生物细胞均一地施加到含30mg/L氯霉素的LB板上，并在37℃培养24小时。将来自所得板的一全环微生物细胞接种到试管中的4mL含有30mg/L氯霉素和0.1mM异丙基-β-硫代半乳糖苷的MS葡萄糖/Asp培养基中，并在往返式摇动培养装置上于30℃培养48小时。MS葡萄糖/Asp培养基的组成如下表3中所描述的。 [0160] [表3] [0161] 表3.MS葡萄糖/Asp培养基 [0162]组分 终浓度(g/L) 葡萄糖 40 (NH4)2SO4 24 天冬氨酸 5 KH2PO4 1 MgSO4·7H2O 1 FeSO4·7H2O 0.01 MnSO4·7H2O 0.0082 酵母提取物 2 CaCO3 50 [0163] 将培养基的pH值用KOH调整为7.0，并将培养基在120℃高压灭菌20分钟。但是，将葡萄糖和MgSO4·7H2O分开混合和灭菌。在干热灭菌后添加CaCO3。 [0164] 在培养后，使用分光光度计(HITACHI U-2900)测量600nm处培养基的OD值。使用反相柱层析分离3,4-AHBA和3,4-AcAHBA，并量化其浓度(Suzuki等，(2006)J.Biol.Chem.，281，36944-36951)。培养基中在600nm处的OD值和培养上清液中3,4-AHBA和3,4-AcAHBA的浓度显示于表4。在BW25113ΔnhoA/pSTV28-EcGri菌株中，没有检测到3,4-AcAHBA，而且3,4-AHBA的浓度比在作为对照的BW25113/pSTV28-EcGri菌株中的浓度高得多。 [0165] [表4] [0166] 表4.nhoA缺失对累积的3,4-AHBA和3,4-AcAHBA量的影响 [0167] [0168] N.D.：未检出 [0169] 每个值均为一式三份培养的均值。 [0170] 实施例3：通过引入源自Streptomyces murayamaensis的3,4-AHBA合成酶基因群构建产生3,4-AHBA的细菌和对累积的3,4-AHBA和3,4-AcAHBA量的评估 [0171] (1)对应于大肠杆菌中密码子选择的nspI基因和nspH基因的化学合成[0172] 已知3,4-AHBA的合成由3,4-AHBA合成酶组催化，该组的组成为Streptomyces murayamaensis中的醛缩酶(同义术语：NspI；NCBI登录ID:BAJ08171.1)和3,4-AHBA合酶(同义术语：NspH；NCBI登录ID:BAJ08172.1)，而且编码这些酶的基因的序列是公开已知的(Noguchi等，(2010)Nat.Chem.Biol.，6，641-643)。NspI由nspI基因(GenBank登录号AB530136，核苷酸：8730至9584；GI:296784943)编码。NspI蛋白的氨基酸序列和nspI基因的核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15。NspH由nspH基因编码(GenBank登录号AB530136，核苷酸9599至10702；GI:296784944)。NspH蛋白的氨基酸序列和nspH基因的核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17。 [0173] 为了在大肠杆菌中有效表达nspI基因和nspH基因，将序列设计为使得通过改变nspI基因和nspH基因的序列以对应于大肠杆菌中的密码子选择并以操纵子表达，且该序列称为EcNspIH。通过向EcNspIH的5’端添加EcoRI限制酶识别序列和向3’端添加HindIII限制酶识别序列来化学合成DNA片段(其序列显示于SEQ ID NO:18)。将两端添加有限制酶识别序列的EcNspIH用EcoRI和HindIII消化，然后克隆到用相同限制酶消化的pUC57(从GenScript供应)中。所得载体称为pUC57-EcNsp。pUC57-EcNsp的全长序列显示于SEQ ID NO:19。 [0174] (2)构建用于表达nspI基因和nspH基因(nspIH基因)的质粒 [0175] 通过以下规程构建用于在大肠杆菌中表达nspI基因和nspH基因的表达质粒。以pUC57-EcNsp作为模板使用由SEQ ID NO:20表示的合成寡核苷酸和由SEQ ID NO:21表示的另一合成寡核苷酸作为引物并使用PrimeStar GXL聚合酶(从Takara Bio Inc.供应)实施PCR。依照附在试剂盒上的组成制备反应溶液，并以30个循环实施98℃达10秒、55℃达15秒和68℃达150秒的反应。结果，获得约2.1kbp的含EcNspIH基因片段的PCR产物。随后，使用融合HD克隆试剂盒(从Clontech供应)将纯化的EcNspIH基因片段和用SmaI消化的pSTV28-Ptac-Ttrp(记载于实施例2)连接。用于表达nspIH基因的所得质粒称为pSTV28-EcNsp。pSTV28-EcNsp的全长序列显示于SEQ ID NO:22。 [0176] (3)构建产生3,4-AHBA的细菌 [0177] 制备大肠杆菌BW25113菌株和BW25113ΔnhoA菌株的感受态细胞，随后通过电穿孔向其导入pSTV28-EcNsp，接着将细胞均一地施加到含30mg/L氯霉素的LB板上，并在37℃培养24小时。从所得板获得对氯霉素抗性的转化体。其中已将pSTV28-EcNsp导入BW25113菌株的菌株称为BW25113/pSTV28-EcNsp菌株，而其中已将pSTV28-EcNsp导入大肠杆菌BW25113ΔnhoA菌株的菌株称为BW25113ΔnhoA/pSTV28-EcNsp菌株。 [0178] (4)评估用于产生3,4-AHBA的培养 [0179] 将BW25113/pSTV28-EcNsp菌株和BW25113ΔnhoA/pSTV28-EcNsp菌株的微生物细胞均一地施加到含30mg/L氯霉素的LB板上，并在37℃培养24小时。将来自所得板的一全环微生物细胞接种到试管中4mL含有30mg/L氯霉素和0.1mM异丙基-β-硫代半乳糖苷，且在表3中描述的MS葡萄糖/Asp培养基中，并在往返式摇动培养装置上于30℃培养48小时。 [0180] 在培养后，使用分光光度计(HITACHI U-2900)测量600nm处培养基的OD值。使用反相柱层析分离3,4-AHBA和3,4-AcAHBA，并量化其浓度(Suzuki等，(2006)J.Biol.Chem.，281，36944-36951)。培养基中在600nm处的OD值和培养上清液中3,4-AHBA和3,4-AcAHBA的浓度显示于表5。在BW25113ΔnhoA/pSTV28-EcNsp菌株中，没有检测到3,4-AcAHBA，而且3,4-AHBA的浓度比在作为对照的BW25113/pSTV28-EcNsp菌株中的浓度高得多。 [0181] [表5] [0182] 表5.nhoA缺失对累积的3,4-AHBA和3,4-AcAHBA量的影响 [0183] [0184] N.D.：未检出 [0185] 每个值均为一式三份培养的均值。 [0186] 工业适用性 [0187] 依照本发明，可以方便和便宜地产生氨基-羟基苯甲酸型化合物，其可用作染料、农业化学物、药物和其他有机合成商品的中间物和作为聚苯并噁唑的单体。如此，例如通过聚合由本发明获得的3-氨基-4-羟基苯甲酸来获得聚苯并噁唑(PBO)，由此使得能便宜地提供具有高强度、高弹性模量和高耐热性的PBO纤维和PBO膜。还可以通过生物合成产生作为原材料的3-氨基-4-羟基苯甲酸型化合物。如此，本发明的方法是具有低环境负荷的工艺和环境友好的生产方法。 |
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