脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)的调节剂及其用途

申请号 CN201380009571.5 申请日 2013-02-15 公开(公告)号 CN104302304A 公开(公告)日 2015-01-21
申请人 宾西法利亚州研究基金会; 发明人 玉光·施;
摘要 本 发明 提供了脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)表达、功能或活性的调节剂组合物。具体地,ALCAT1的 抑制剂 用于 治疗 代谢 疾病 、心脏病和一般而言与线粒体功能障碍相关的疾病。提供了用于鉴定新的ALCAT1调节剂的测定。
权利要求

1.一种鉴定脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)表达、功能或活性的调节剂的方法,包括:
使生物样品与测试剂接触
测量所述生物样品中线粒体融合蛋白分子的表达、功能或活性;从而,
鉴定脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)的调节剂。
2.权利要求1所述的方法,其中如果测试剂与基线对照相比增加所述线粒体融合蛋白分子的表达、功能或活性,则鉴定所述测试剂为ALCAT1表达、功能或活性的抑制剂
3.权利要求1所述的方法,其中ALCAT1表达、功能或活性与正常基线对照相比明显减少。
4.权利要求1所述的方法,其中所述线粒体融合蛋白是MFN2。
5.权利要求1所述的方法,其中生物样品包括:流体、肽、多肽、寡核苷酸、多核苷酸、细胞、组织或其组合。
6.权利要求1所述的方法,其中测量MFN2表达、功能或活性的测定包括:免疫测定、生物测定、生物芯片测定、印迹、杂交测定、基于细胞的测定、高通量筛选测定、色谱、化学测定、噬菌体展示测定或其组合。
7.一种鉴定脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)表达、功能或活性的调节剂的方法,包括:
使生物样品与测试剂接触;
测量(a)包括BNP、β-MHC、ANF或ACTA1的指示心肌病的肥大标志物的表达;(b)PTEN诱导的假定激酶1(PINK1)的表达、功能或活性;从而,
鉴定ALCAT1调节剂。
8.权利要求7所述的方法,其中如果所述测试剂与基线对照相比减少指示心肌病的肥大标志物的表达,则鉴定ALCAT1表达、功能或活性的抑制剂。
9.权利要求7所述的方法,其中如果所述测试剂与基线对照相比增加PTEN诱导的假定激酶1(PINK1)的表达、功能或活性,则鉴定ALCAT1表达、功能或活性的抑制剂。
10.权利要求8或9所述的方法,其中ALCAT1表达、功能或活性与正常基线对照相比明显减少。
11.权利要求7所述的方法,其中测量指示心肌病的肥大标志物的表达的测定包括:
免疫测定、生物测定、生物芯片测定、印迹、杂交测定、基于细胞的测定、高通量筛选测定、色谱、化学测定、噬菌体展示测定或其组合。
12.权利要求7所述的方法,其中生物样品包括:流体、肽、多肽、寡核苷酸、多核苷酸、细胞、组织或其组合。
13.一种在体外或体内预防治疗线粒体功能障碍的方法,包括:给细胞或患者施用治疗有效量的调节溶血心磷脂酰基转移酶的表达、功能、活性或其组合的药剂;从而,在体外或体内预防或治疗线粒体功能障碍。
14.权利要求13所述的方法,其中所述溶血心磷脂酰基转移酶是脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)。
15.权利要求14所述的方法,其中ALCAT1调节:线粒体多核苷酸线粒体多肽、线粒体蛋白、mtDNA拷贝数;线粒体质量;线粒体形态;线粒体融合和mtDNA突变率。
16.权利要求15所述的方法,其中所述线粒体蛋白包括:线粒体融合蛋白、线粒体融合蛋白-1(MFN1)、线粒体融合蛋白-2(MFN2)、抑制蛋白、肽、片段、变体、突变体或其组合。
17.权利要求16所述的方法,其中线粒体融合蛋白任选与通过权利要求1或7所述的方法鉴定的一种或多种ALCAT1抑制剂一起施用。
18.权利要求17所述的方法,其中ALCAT1的抑制剂与基线对照相比增加MFN2的表达、功能或活性。
19.权利要求17所述的方法,其中ALCAT1的抑制剂与正常基线对照相比减少如通过活性类(ROS)测量的氧化应激。
20.权利要求17所述的方法,其中ALCAT1的抑制剂调节心磷脂(CL)结构、功能、活性、表达或其组合。
21.权利要求17所述的方法,其中ALCAT1的抑制剂预防或治疗与线粒体功能障碍相关的疾病或疾患。
22.权利要求21所述的方法,其中与线粒体功能障碍相关的疾病或疾患包括:糖尿病、肥胖、心脏疾病或疾患、勃起功能障碍、绝经、神经退行性疾病或疾患、代谢疾病或疾患。
23.一种在体外或体内预防或治疗线粒体功能障碍的方法,包括:给细胞或患者施用治疗有效量的线粒体融合蛋白分子;从而,在体外或体内预防或治疗线粒体功能障碍。
24.权利要求23所述的方法,其中线粒体融合蛋白分子包括:线粒体融合蛋白-1(MFN1)、线粒体融合蛋白-2(MFN2)、片段、变体、突变体或其组合。
25.权利要求23所述的方法,其中脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)的抑制剂任选施用给细胞或患者。
26.权利要求25所述的方法,其中ALCAT1的抑制剂通过权利要求1或7所述的方法鉴定。
27.权利要求26所述的方法,其中ALCAT1的抑制剂与基线对照相比增加MFN2的表达、功能或活性。
28.权利要求26所述的方法,其中ALCAT1的抑制剂与正常基线对照相比减少如通过活性氧类(ROS)测量的氧化应激。
29.权利要求26所述的方法,其中ALCAT1的抑制剂调节心磷脂(CL)结构、功能、活性、表达或其组合。
30.一种治疗罹患心肌病或处于心肌病险的患者的方法,包括:给有相应需要的患者施用治疗有效量的脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)的抑制剂;从而,治疗罹患心肌病的患者。
31.权利要求30所述的方法,其中脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)的抑制剂通过权利要求1或7所述的方法鉴定。
32.权利要求30所述的方法,其中PTEN诱导的假定激酶1(PINK1)的调节剂任选施用给患者。
33.一种通过权利要求1或7所述的方法鉴定的脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶
1(ALCAT1)的抑制剂。
34.一种药物组合物,包括通过权利要求1或7所述的方法鉴定的脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)的抑制剂。
35.一种鉴定脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)表达、功能或活性的调节剂的方法,包括:
使生物样品与测试剂接触;
测量所述生物样品中ALCAT1分子的表达、功能或活性;从而,
鉴定脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)的调节剂。
36.权利要求35所述的方法,其中如果测试剂与基线对照相比增加了所述ALCAT1分子的表达、功能或活性,则鉴定所述测试剂为ALCAT1表达、功能或活性的抑制剂。
37.权利要求35所述的方法,其中ALCAT1表达、功能或活性与正常基线对照相比明显减少。
38.权利要求37所述的方法,其中ALCAT1分子包括:核酸、寡核苷酸、多核苷酸、基因、基酸、肽、多肽、蛋白、变体、片段、突变体或其组合。
39.权利要求35所述的方法,其中生物样品包括:流体、肽、多肽、寡核苷酸、多核苷酸、细胞、组织或其组合。
40.权利要求35所述的方法,其中测量ALCAT1表达、功能或活性的测定包括:免疫测定、生物测定、生物芯片测定、印迹、杂交测定、基于细胞的测定、高通量筛选测定、色谱、化学测定、噬菌体展示测定或其组合。
41.一种鉴定脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)表达、功能或活性的调节剂的方法,包括:
使生物样品与测试剂接触;
测量包括FAS、TNF、TGF-β、DGAT1、CHREBP1或SREBP1的指示糖尿病性肾病的核酸标志物或其编码产物的表达;从而,
鉴定ALCAT1调节剂。
42.权利要求41所述的方法,其中如果所述测试剂与基线对照相比调节FAS、TNF、TGF-β、DGAT1和SREBP1的表达,则鉴定ALCAT1表达、功能或活性的抑制剂。
43.权利要求41所述的方法,其中测量指示糖尿病性肾病的标志物表达的测定包括:
免疫测定、生物测定、生物芯片测定、印迹、杂交测定、基于细胞的测定、高通量筛选测定、色谱、化学测定、噬菌体展示测定或其组合。
44.权利要求41所述的方法,其中生物样品包括:流体、肽、多肽、寡核苷酸、多核苷酸、细胞、组织或其组合。
45.一种鉴定脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)表达、功能或活性的调节剂的方法,包括:
使生物样品与测试剂接触;
测量包括PPARα、Srebp1c、FAS、ACC1、DGAT1或CPT1α的指示脂肪肝疾病的核酸标志物或其编码产物的表达;从而,
鉴定ALCAT1调节剂。
46.权利要求45所述的方法,其中如果所述测试剂与基线对照相比调节PPARα、Srebp1c、FAS、ACC1、DGAT1或CPT1α的表达,则鉴定ALCAT1表达、功能或活性的抑制剂。
47.权利要求45所述的方法,其中ALCAT1表达、功能或活性与正常基线对照相比明显减少。
48.权利要求45所述的方法,其中测量指示脂肪肝疾病的标志物表达的测定包括:免疫测定、生物测定、生物芯片测定、印迹、杂交测定、基于细胞的测定、高通量筛选测定、色谱、化学测定、噬菌体展示测定或其组合。
49.权利要求45所述的方法,其中生物样品包括:流体、肽、多肽、寡核苷酸、多核苷酸、细胞、组织或其组合。
50.一种通过权利要求41或45所述的方法鉴定的脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶
1(ALCAT1)表达、功能或活性的调节剂。
51.一种药物组合物,包括通过权利要求41或45所述的方法鉴定的脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)的抑制剂。

说明书全文

脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)的调节剂及

其用途

[0001] 关于联邦资助研究的声明
[0002] 本发明根据美国国立卫生研究院提供的资助号DK076685由美国政府支持完成。美国政府可具有本发明的某些权利。
[0003] 相关申请的交叉引用
[0004] 本申请要求2012年2月16日提交的名称为“MODULATORS OF ACYL-COALYSOCARDIOLIPIN ACYLTRANSFERASE 1(ALCAT1)AND USES THEREOF(脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)的调节剂及其用途)”的美国临时专利申请号61/599,496的优先权,其通过引用整体并入本文。
发明领域
[0005] 本发明实施方案涉及用于治疗与线粒体功能障碍相关的疾病、代谢疾病、神经系统疾病和心脏病的组合物。提供了鉴定新药剂的方法以及治疗用途
[0006] 背景
[0007] 心磷脂(CL)是最初在心脏中鉴定的一种线粒体磷脂,在维持正常心脏功能中起关键作用。在哺乳动物中,通过代谢组织例如心脏、肝和骨骼肌中亚油酸占主导的脂肪酰基链的组成(18:2)来确定CL的生物功能。据信该独特的酰基组成支持线粒体膜质子梯度和各种线粒体酶和蛋白的活性。因此,在具有扩张性心肌病的啮齿类动物和人类中发生心衰竭期间出现四亚油酰基CL(TLCL)的缺失,四亚油酰氧基CL(TLCL)是健康哺乳动物心脏中的主要物类。CL是从磷脂酸以一系列步骤生物合成的。新合成的CL必须经历涉及磷脂酶和酰基转移酶/转酰酶的重塑过程,以使亚油酸整合进入其脂肪酰基链。因此,有缺陷的CL重塑引起Barth综合征中的扩张性心肌病,Barth综合征是一种X连遗传疾患,特征为CL中的亚油酸缺陷、线粒体功能障碍、生长延迟和中性粒细胞减少。而且,来自病理性CL重塑的异常CL酰基组成已经牵涉与衰老和年龄相关疾病中许多病理生理性病症相关的线粒体功能障碍的病因,所述衰老和年龄相关疾病包括糖尿病、肥胖、心血管疾病和神经变性,全部由以下表征:氧化应激、CL缺陷、CL中二十二六烯酸(DHA)的富集以及线粒体功能障碍。
[0008] 概述
[0009] 提供本概述以提出发明概述,以简要说明本发明的性质和主旨。要理解,其不是用于解释或限制权利要求的范围或含义。
[0010] 本发明实施方案尤其涉及调节溶血心磷脂、特别是脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)的表达、功能和/或活性的组合物。特别是,ALCAT1的抑制剂用于治疗代谢疾病、心脏病和一般而言与线粒体功能障碍相关的疾病。提供了用于鉴定新的ALCAT1调节剂的测定。
[0011] 在一个实施方案中,一种鉴定脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)表达、功能或活性的调节剂的方法,包括使生物样品与测试剂接触;测量所述生物样品中线粒体融合蛋白分子的表达、功能或活性。在一个实施方案中,如果测试剂与基线对照相比增加所述线粒体融合蛋白分子的表达、功能或活性,则鉴定所述测试剂为ALCAT1表达、功能或活性的抑制剂。优选地,ALCAT1分子表达、功能或活性与正常基线对照相比明显减少。
[0012] 在另一个实施方案中,测量线粒体融合蛋白分子(例如,MFN2)表达、功能或活性的测定包括:免疫测定、生物测定、生物芯片测定、印迹、杂交测定、基于细胞的测定、高通量筛选测定、色谱、化学测定、噬菌体展示测定或其组合。
[0013] 在另一个实施方案中,一种鉴定脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)表达、功能或活性的调节剂的方法,包括:使生物样品与测试剂接触;测量(a)包括BNP、β-MHC、ANF或ACTA1的指示心肌病的肥大标志物的表达;(b)PTEN诱导的假定激酶1(PINK1)的表达、功能或活性;并鉴定ALCAT1调节剂。
[0014] 在一个实施方案中,如果所述测试剂与基线对照相比减少指示心肌病的肥大标志物的表达,则鉴定ALCAT1表达、功能或活性的抑制剂。一方面,如果所述测试剂与基线对照相比增加PTEN诱导的假定激酶1(PINK1)的表达、功能或活性,则鉴定ALCAT1表达、功能或活性的抑制剂。
[0015] 在另一个优选的实施方案中,一种在体外或体内预防或治疗线粒体功能障碍的方法,包括:给细胞或患者施用治疗有效量的调节溶血心磷脂酰基转移酶的表达、功能、活性或其组合的药剂。在一个实施方案中,所述溶血心磷脂酰基转移酶是脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)。
[0016] 在另一个优选的实施方案中,ALCAT1调节:线粒体多核苷酸、线粒体多肽、线粒体蛋白、mtDNA拷贝数;线粒体质量;线粒体形态;线粒体融合和mtDNA突变率。
[0017] 在另一个优选的实施方案中,线粒体蛋白包括:线粒体融合蛋白、线粒体融合蛋白-1(MFN1)、线粒体融合蛋白-2、(MFN2)、抑制蛋白(prohibitin)、肽、片段、变体、突变体或其组合。
[0018] 在另一个实施方案中,线粒体融合蛋白任选与通过本文所述方法的任何一个鉴定的一种或多种ALCAT1抑制剂(包括还未确定的ALCAT1抑制剂的任何其他抑制剂)一起施用。
[0019] 在一个实施方案中,ALCAT1的抑制剂与基线对照相比增加MFN2的表达、功能或活性。
[0020] 在另一个实施方案中,ALCAT1的抑制剂与正常基线对照相比减少如通过活性氧类(ROS)测量的氧化应激。
[0021] 在另一个实施方案中,ALCAT1的抑制剂调节心磷脂(CL)结构、功能、活性、表达或其组合。
[0022] 在多个实施方案中,ALCAT1的抑制剂预防或治疗与线粒体功能障碍相关的疾病或疾患。实例包括但不限于:糖尿病、肥胖、心脏疾病或疾患、神经退行性疾病或疾患、代谢疾病或疾患。
[0023] 在另一个优选的实施方案中,一种在体外或体内预防或治疗线粒体功能障碍的方法,包括:给细胞或患者施用治疗有效量的线粒体融合蛋白分子;和,在体外或体内预防或治疗线粒体功能障碍。
[0024] 在另一个优选的实施方案中,一种治疗罹患心肌病或处于心肌病险的患者的方法,包括:给有相应需要的患者施用治疗有效量的脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)的抑制剂;和治疗罹患心肌病的患者。
[0025] 在另一个优选的实施方案中,脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)的抑制剂通过本文所述方法的任何一个鉴定。
[0026] 在另一个实施方案中,一种药物组合物,包括通过本文所述方法的任何一个鉴定的脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)的抑制剂。
[0027] 在另一个优选的实施方案中,一种鉴定脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)表达、功能或活性的调节剂的方法,包括使生物样品与测试剂接触;测量所述生物样品中ALCAT1分子的表达、功能或活性;和鉴定脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶
1(ALCAT1)的调节剂。优选地,如果测试剂与基线对照相比增加了ALCAT1分子的表达、功能或活性,则鉴定所述测试剂为ALCAT1表达、功能或活性的抑制剂。
[0028] 在多个实施方案中,ALCAT1分子包括:核酸、寡核苷酸、多核苷酸、基因、基酸、肽、多肽、蛋白、变体、片段、突变体或其组合。
[0029] 在多个实施方案中,生物样品包括:流体、肽、多肽、寡核苷酸、多核苷酸、细胞、组织或其组合。
[0030] 在其他实施方案中,测量任何分子的表达、功能或活性的测定包括:免疫测定、生物测定、生物芯片测定、印迹、杂交测定、基于细胞的测定、高通量筛选测定、色谱、化学测定、噬菌体展示测定或其组合。
[0031] 以下描述了其他方面。
[0032] 附图简述
[0033] 图1A-1I显示ALCAT1引起C2C12细胞中的线粒体片段化和mtDNA不稳定。图1A、1B:通过Mitotracker Red对稳定表达ALCAT1(图1B)或载体对照(图1A)的C2C12细胞中线粒体网络的共聚焦显微镜分析。插图代表框选区域的放大。比例尺代表5μm。图1C:
表达ALCAT1或载体对照的C2C12中线粒体形态的定量分析,三个类别:“管状”具有>90%延长的互连网络,“混合”具有混合的管状和短线粒体,和“片段化”具有>90%短点状线粒体,来自三个独立实验,N=300;图1D-1G:稳定表达载体对照(图1D,图1F中突出显示)或ALCAT1(图1E,图1G中突出显示)的C2C12细胞中线粒体形态的EM分析。比例尺代表
1μm。图1H-1I:稳定表达ALCAT1或载体对照的C2C12细胞中mtDNA拷贝数(图1H)和点突变率(图1I)的RT-PCR分析。*p<0.05,**p<0.01,N=3。
[0034] 图2A-2H显示ALCAT1缺陷显著增加线粒体质量并提高mtDNA保真性。图2A-2D:来自野生型对照小鼠(WT)(图2A,图2C中突出显示)和来自ALCAT1敲除小鼠(KO)(图2B,图2D中突出显示)的MEF细胞中线粒体形态的EM分析。图2E-2F:来自WT小鼠(图2E)和ALCAT1敲除小鼠(图2F)的胫骨前纵截面的EM分析。箭头分别指示A带、I带、Z线和线粒体(M)。图2G-2H:从KO小鼠和WT对照分离的MEF细胞中mtDNA拷贝数(图2G)和点突变率(图2H)的RT-PCR分析。**p<0.01,N=3。
[0035] 图3A-3E显示ALCAT1调节MFN1和MFN2的生物发生。图3A-3B:稳定表达ALCAT1或载体对照的C2C12细胞中(图3A)和从WT和KO小鼠分离的MEF中(图3B)MFN1、MFN2和OPA1的mRNA表达平的实时PCR分析。使用GAPDH表达作为内部对照。图3C:表达ALCAT1或载体对照的C2C12中MFN1、MFN2和OPA1蛋白水平的Western印迹分析。每个泳道下显示每条带的相对密度,使用肌动蛋白作为蛋白加载的内部对照。图3D:在从KO和WT对照小鼠分离的MEF中MFN1、MFN2、OPA1、联结蛋白和抑制蛋白的蛋白水平的Western印迹分析,使用机动蛋白作为蛋白加载的内部对照。N=3个胎儿每组。图3E:图E中显示数据的定量分析。与对照比较时,*P<0.05,**P<0.01。
[0036] 图4A-4L显示ALCAT1损害线粒体融合,其可以通过C2C12细胞中的MFN2表达来拯救。稳定表达ALCAT1或载体对照的C2C12细胞用线粒体靶向的GFP或DsRed(mtRFP)的表达质粒瞬时转染,共同铺板,并与PEG-1500融合,随后共聚焦显微镜成像。图4A-4D:稳定表达载体对照的C2C12细胞中线粒体的共聚焦图像,其说明完全融合,如通过图4C中黄色证明并在图4D中突出显示的。图4E-4H:稳定表达ALCAT1的C2C12细胞中线粒体的图像,其表现出融合缺陷,如通过图4G中分开的绿色和红色所示并在图4E中突出显示的。图4I-4L,MFN2(MFN2-YFP)的瞬时表达拯救了稳定表达ALCAT1的C2C12细胞中的融合缺陷(K,L中突出显示)。比例尺代表5μm。
[0037] 图5A-5J显示MFN1和MFN2而非OPA1的过表达恢复C2C12-A1细胞中线粒体网络。图5A-5D:稳定表达载体对照(图5A-5B)或ALCAT1(图5C-5D)的C2C12细胞中线粒体网络的共聚焦图像分析。稳定的C2C12细胞系用线粒体靶向的EGFP表达载体(图5A&5C)瞬时转染并在成像之前用Mitotracker Red染色(图5B&5D)。图5E-5J:稳定表达ALCAT1并分别用Myc标签化MFN1(图5E-5F)、MFN2-YFP(黄色荧光蛋白)(图5G-5H)或Myc标签化OPA1(图5I-5J)的表达载体瞬时转染的C2C12细胞中线粒体网络的共聚焦图像分析。对于Myc标签化蛋白,用抗Myc抗体免疫和随后山羊抗小鼠FITC-轭合抗体(绿色)和Mitotracker Red染色。比例尺代表5μm。
[0038] 图6A-6D显示MFN2恢复稳定表达ALCAT1的C2C12细胞中线粒体呼吸容量。稳定表达ALCAT1的C2C12细胞用MFN2或EGFP的表达载体瞬时转染,并与载体对照比较响应于各种线粒体抑制剂治疗的耗氧率(OCR)变化,所述线粒体抑制剂包括:图6A,FCCP,一种线粒体解偶联剂;图6B,鱼藤,一种复合物I抑制剂;图6C,抗霉素,一种复合物III抑制剂;和图6D,寡霉素,一种ATP酶抑制剂。使用MFN2抗体通过western印迹分析来分析外源性和内源性MFN2蛋白水平,如图6A所示。通过Seahorse X-24分析仪分析OCR,并从每个化学治疗的至少三次独立测量计算。与对照相比*p<0.05;与非转染的表达ALCAT1的细胞相比#p<0.05和##p<0.01。
[0039] 图7A-7H显示通过ALCAT1的氧化应激使ROS生成与MFN2缺陷关联。图7A-7D:来自用1mM H2O2治疗的WT小鼠(图7A,图7C中突出显示)或KO小鼠(图7B,图7D中突出显示)的MEF中线粒体形态的EM分析。图7E:稳定表达ALCAT1或载体对照的C2C12细胞用所示剂量的H2O2治疗,随后分析丙二(MDA)的水平,丙二醛(MDA)是来自氧化应激的脂质过氧化产物。与载体对照相比**p<0.01。图7F:稳定表达ALCAT1或载体对照的C2C12用图7E所示增加剂量的H2O2治疗,随后Western印迹分析MFN1和MFN2,使用β-肌动蛋白作为蛋白加载的内部对照。图7G:稳定变动啊载体、ALCAT1或ALCAT1但在用1.5mM H2O2治疗之前用各种剂量(0、1M和5M)二联苯碘(DPI)(一种NADPH氧化酶抑制剂)预治疗的C2C12细胞中MFN1和MFN2表达的Western印迹分析。图7H:描述ALCAT1在关联氧化应激与MFN2缺陷和线粒体片段化中的诱发作用的示意模型。
[0040] 图8显示稳定表达ALCAT1的C2C12细胞中ALCAT1 mRNA表达水平的RT-PCR分析。为个体克隆选择用ALCAT1表达载体或空载体稳定转染的C2C12细胞。通过RT-PCR分析来分析稳定表达ALCAT1或载体对照的C2C12细胞系的ALCAT1mRNA表达。
[0041] 图9A-9D显示ALCAT1缺陷预防响应于MEF中氧化应激的线粒体片段化。在0.5mM H2O2不存在(图9A&9B)或存在(图9C&9D)下培养从ALCAT1敲除(KO)小鼠(图9B&9D)和野生型(WT)对照小鼠(图9A和9C)分离的MEF持续2小时,随后通过用Mitotracker Red染色来分析线粒体网络。与载体对照相反,ALCAT1缺陷预防响应于氧化应激的线粒体片段化。
[0042] 图10显示C2C12细胞中ALCAT1的过表达引起线粒体膨胀。为个体克隆选择用ALCAT1表达载体或空载体稳定转染的C2C12细胞。通过电子显微镜分析稳定表达ALCAT1或载体对照的C2C12细胞系的线粒体形态。ALCAT1过表达引起严重的线粒体膨胀,如通过扩大的线粒体和受损的嵴证明的。
[0043] 图11A-11F显示ALCAT1调节心肌病中的氧化应激和脂质过氧化。分析稳定过表达ALCAT1或载体对照的H9c2细胞(图11A)的脂质过氧化副产物硫代巴比土酸反应性物质(TBARS)的细胞内水平,响应于用盐水(PBS)或盐水加2mM H2O2治疗2小时;图11B:来自分离的线粒体的H2O2实时生成;图11C:用所示剂量H2O2治疗之后的mtDNA拷贝数;平均值±SEM(n=3)。图11D:分析从用媒介物或T4治疗连续28天的野生型(WT)和ALCAT1敲除(KO)小鼠分离的心室中的TABRS水平;平均值±SEM(n=5)。图11E-11F:稳定表达载体对照(图11E)或ALCAT1(图11F)的H9c2细胞分化成心肌细胞。
[0044] 图12A-12E显示ALCAT1的靶向失活预防甲状腺机能亢进心肌病的发作。WT和KO小鼠用媒介物或T4治疗28天,并通过H&E染色分析完整心脏切片的形态,图12A;图12B:心脏体重比率;图12C-12E:回波心脏描记参数,包括室间隔缺陷(IVSD)、左室舒张末期内* **
径(LVEDD)和左室后壁厚度(LVPWD)。n=6-8,P<0.05,P<0.01。
[0045] 图13A-13G显示ALCAT1的消除减轻了T4诱导的心肌细胞的肥大生长。图13A-13D:WT和KO小鼠用媒介物治疗28天,并通过H&E染色分析心肌细胞形态。图13E-13F:
**
平均心肌细胞尺寸和直径的定量分析,n=250。 P<0.01。图13G:在T4治疗28天之后来自WT和KO小鼠的心肌细胞尺寸的分布分析,n=250。
[0046] 图14A-14F显示ALCAT1缺陷预防T4诱导的心室纤维化的发作。WT和KO小鼠用媒介物或T4治疗治疗28天,然后分析心室纤维化。图14A-14D,来自分别用媒介物(图14A,14C)和T4(图14B,14D)治疗的WT和KO小鼠的Masson三色染色的左心室的代表性切片。
通过箭头突出显示表现蓝色染色的纤维化区域。图14E-14F:来自图14A-14D中使用的相同样品的纤维化生物标志物(包括胶原蛋白I和胶原蛋白III)的mRNA水平的RT-PCR分* **
析。n=5,P<0.05;P<0.01。
[0047] 图15A-15D显示与心肌病相关的生物标志物的表达通过ALCAT1缺陷正常化。图15A-15D:WT和KO小鼠用媒介物或T4治疗治疗28天,然后分析左心室肥大和心力衰竭的生物标志物的mRNA表达水平,所述生物标志物包括脑利钠肽(BNP)、β-肌球蛋白重*
链(β-MHC)、心房利钠因子(ANF)和骨骼肌α-肌动蛋白(ACTA1)。n=6-8,P<0.05;
**
P<0.01。
[0048] 图16A-16G显示T4诱导的线粒体膨胀和线粒体自噬通过ALCAT1缺陷减轻。图16A-16D:在T-4治疗28天之后来自WT(图16A&16B)和KO(图16C&16D)的心肌细胞的代表性电子显微照片。箭头突出显示表现出受损结构和异常形态的线粒体。图16A和16B中的框选区域在图16C和16D中被放大,图16C和16D突出显示了正经历线粒体自噬的线粒体。
比例尺代表1μM。图16E:在从个体WT和KO小鼠分离的心室组织中自我吞噬的生物标志物LC3、p62和PINK1的Western印迹分析,使用GAPDH作为内部对照。图16F-16G:图16E* **
中所示LC3(图16F)和PINK1(图16G)蛋白的表达水平的定量分析。P<0.05;P<0.01。
[0049] 图17A-17C显示通过ALCAT1的氧化应激调节心肌细胞中的Akt-mTOR信号传导。图17A-17B:稳定表达ALCAT1或载体对照的H9c2心脏细胞用所示剂量的胰岛素(图17A)或100nM T3刺激所示时间(图17B),随后通过western印迹分析来分析Akt、Erk、S6K1和
4E-BP的磷酸化,使用β-肌动蛋白作为内部对照。图17C:WT和KO小鼠用媒介物或T4治疗28天,随后Western印迹分析心肌细胞中Akt、GSK3α/β和4E-BP的磷酸化,通过使用GAPDH作为内部对照的Western印迹分析。
[0050] 图18A-18B显示ALCAT1在H9c2细胞中的稳定过表达导致肥大生长和分化至心肌细胞的损伤。图18A,通过细胞计数分析稳定表达Flag标签化ALCAT1或载体对照的H9c2细胞连续7代(p1-p7)的生长速率。B,在正常培养基或分化培养基(DM)中培养稳定表达ALCAT1或载体对照的H9c2细胞以诱导分化至心肌细胞,随后使用抗肌细胞生成素和Flag抗体western印迹分析肌细胞生成素和ALCAT1表达。GAPDH是蛋白加载的内部对照。
[0051] 图19A-19F显示ALCAT1的消除预防线粒体损伤和与心肌病相关的线粒体自噬。用媒介物或T4治疗治疗ALCAT1敲除小鼠和WT对照28小时,随后电子显微镜分析心室肌肉的纵向切片。图19A-19B:来自媒介物治疗的WT(图19A)和KO(图19B)小鼠的心肌细胞的代表性电子显微照片。图19C-19F,与KO(图19E)相比,甲状腺机能亢进引起WT小鼠中受损线粒体数目的明显增加(图19C)。图19C和19E中的框选区域在图19D和19F中放大,图19D和19F突出显示正经历线粒体自噬的线粒体。比例尺大小为1μM。
[0052] 图20显示心肌细胞中响应于甲状腺激素急性治疗的Akt-mTOR信号转导途径的分析。用媒介物或T4治疗ALCAT1敲除(KO)和野生型对照小鼠(WT)2天,随后Western印迹分析Akt、S6K和mTOR的磷酸化,通过使用GAPDH作为蛋白加载内部对照的Western印迹分析。
[0053] 图21A-21D显示ALCAT1清除预防糖尿病性肾病的发作。用链唑霉素(STZ)以150mg/kg体重腹膜内注射ALCAT1敲除(KO)小鼠和野生型(WT)对照。STZ是通过清除胰岛β细胞而引起1型糖尿病的试剂。注射后三天,ALCAT1 KO和WT小鼠都发展了高血糖。
注射后12周,获得肾样品,切片,并用苏木精和曙红(H&E)染色以检查糖尿病诱导的肾病。
来自非糖尿病WT和KO小鼠的肾是正常的(图21A和21B)。然而,WT对照小鼠发展了糖尿病性肾衰竭,如糖尿病性肾病皮层中管状扩张、萎缩和胞质空泡变性(图21C)。相反,糖尿病性ALCAT1KO小鼠肾中预防了这些病理性变化(图21D)。
[0054] 图22A-22D显示ALCAT1清除预防了与糖尿病性肾病相关的肾纤维化。ALCAT1敲除(KO)小鼠和野生型(WT)对照用链唑霉素(STZ)以150mg/kg体重腹膜内注射。注射后三天,ALCAT1 KO和WT小鼠都发展了高血糖。注射后12周,获得肾样品,切片,并通过Masson三色染色检查,以分析糖尿病性肾病的主要指示器肾纤维化水平的变化。如图22A和22B所示,来自非糖尿病性WT和KO小鼠的肾表现出正常形态。相反,WT对照小鼠中糖尿病的发作引起肾衰竭(图22C),如用三色重染色(蓝色)所证明的。相反,糖尿病性ALCAT1 KO小鼠肾中预防了这些病理性变化(图22D)。
[0055] 图23A-23F显示ALCAT1清除抑制了与糖尿病性肾病相关的生物标志物的mRNA表达。ALCAT1敲除(KO)小鼠和野生型(WT)对照用链唑霉素(STZ)以150mg/kg体重腹膜内注射。注射后三天,ALCAT1 KO和WT小鼠都发展了高血糖。注射后12周,从肾样品提取总RNA,随后RT-PCR分析指示糖尿病性肾病的生物标志物的mRNA水平,包括FAS(图23A)、TNF(图23B)、TGF-β(图23C)、DGAT1(图23D)、CHREBP1(图23E)和SREBP1(图23F)。糖尿病性肾病的发作增加了WT糖尿病性小鼠肾中除了CHREBP1之外的所有生物标志物的mRNA表达。
相反,糖尿病性ALCAT1 KO小鼠肾中减轻了这些病理性变化。N=3-6,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。结果证明,ALCAT1抑制剂提供对糖尿病性肾病的新治疗,糖尿病性肾病是糖尿病患者中肾衰竭的最常见原因。
[0056] 图24A-24F显示ALCAT1清除预防了高脂肪饮食诱导的脂肪肝疾病发作。ALCAT1敲除(KO)小鼠野生型(WT)对照用高脂肪饮食(HFD)喂养连续18周以诱导肥胖及其相关脂肪肝疾病发作。在喂养研究结束时,通过H&E染色分析小鼠肝中与饮食诱导的肥胖相关的病理性变化。响应于饮食诱导的肥胖的发作,WT小鼠发展了典型的脂肪肝疾病,如通过扩大且苍白肝所证明的(图24A)。此外,H&E染色揭示了WT小鼠中细胞内波动和严重的肝细胞内空泡的存在(图24C,图24E中放大)。相反,这些病例缺陷在喂食HFD的ALCAT1 KO小鼠中完全消除(图24A、24D,24F中放大)。
[0057] 图25A-25F显示ALCAT1清除抑制了与脂肪肝疾病相关的生物标志物的mRNA表达。ALCAT1敲除(KO)小鼠和野生型(WT)对照用高脂肪饮食(HFD)喂食连续18周,以诱导肥胖及其相关脂肪肝疾病的发作。在喂食研究结束时,分析小鼠肝中与肝脂肪变性相关的脂肪生成基因的mRNA表达变化,所述脂肪生成基因包括PPARα(图25A)、Srebp1c(图25B)、FAS(图25C)、ACC1(图25D)、DGAT1(图25E)和CPT1α(图25F)。肝脂肪变性的发作显著增加WT对照小鼠的肝中PPARα、Srebp1c、FAS、ACC1和CPT1α的mRNA表达。相反,这些病理性变化在ALCAT1 KO小鼠的肝中完全缓解。N=3-6,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。结果证明,ALCAT1抑制剂提供了肥胖和2型糖尿病中最常见缺陷肝脂肪变性的新治疗。
[0058] 图26A-26D显示预防ALCAT1敲除小鼠患糖尿病诱导的心脏萎缩。ALCAT1敲除(KO)小鼠和野生型(WT)对照用链唑霉素(STZ)以150mg/kg体重腹膜内注射。注射后三天,ALCAT1 KO和WT小鼠都发展了高血糖。注射后12周,通过H&E染色分析小鼠心脏萎缩和形态的变化。1型糖尿病的发作引起WT对照小鼠中严重的心脏扩张和萎缩(图26A),如通过心脏重量(图26C)和心脏/体重比率(图26D)的显著降低所证明的。相反,这些病理性缺陷在表现出正常心脏形态(图26B)和心脏重量(图26C和图26D)的ALCAT1 KO糖尿病小鼠中减轻。N=3-6,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
[0059] 图27A-27D显示ALCAT1清除预防糖尿病性心脏纤维化的发作。ALCAT1敲除(KO)小鼠和野生型(WT)对照用链唑霉素(STZ)以150mg/kg体重腹膜内注射。注射后三天,ALCAT1 KO和WT小鼠都发展了高血糖。注射后12周,心脏样品经切片并通过Masson三色染色分析以检查ALCAT1缺陷对心脏纤维化的影响,心脏纤维化是糖尿病性心力衰竭的主要标志。WT对照小鼠和ALCAT1 KO小鼠在非糖尿病条件下都表现出正常的心脏结构(图27A&图27B)。然而,WT对照小鼠中糖尿病的发作引起了严重的心脏纤维化(图27C),如通过蓝色的重染色所证明的。相反,ALCAT1缺陷预防了ALCAT1 KO小鼠中心脏组织中胶原蛋白纤维的高血糖诱导的沉积(图27D)。结果表明,ALCAT1抑制剂提供了糖尿病性心力衰竭的新治疗,糖尿病性心力衰竭是糖尿病患者死亡的最常见原因。
[0060] 图28A-28F显示预防ALCAT1敲除小鼠患糖尿病诱导的睾丸萎缩。ALCAT1敲除(KO)小鼠和野生型(WT)对照用链唑霉素(STZ)以150mg/kg体重腹膜内注射。STZ是通过清除胰岛β细胞而引起1型糖尿病的试剂。注射后三天,ALCAT1 KO和WT小鼠都发展了高血糖。注射后12周,睾丸样品经切片并通过H&E染色分析以检查ALCAT1在调节糖尿病诱导的睾丸萎缩中的作用。如图28A所示,糖尿病发作引起WT对照小鼠中睾丸萎缩。此外,高血糖引起精原细胞的严重损失(图28C,图28D中放大)和WT对照小鼠中巨细胞的诱导(箭头所示)。相反,这些缺陷在ALCAT1 KO小鼠中完全消除(图28B和28E,图28F中放大)。
[0061] 图29A-29D显示预防ALCAT1敲除小鼠患糖尿病诱导的睾丸细胞凋亡。ALCAT1敲除(KO)小鼠和野生型(WT)对照用链唑霉素(STZ)以150mg/kg体重腹膜内注射。注射后12周,睾丸样品经切片并通过TUNEL染色分析高血糖诱导的细胞凋亡。在血糖正常条件下,ALCAT1 KO小鼠和WT对照的睾丸中细胞凋亡的水平是不能区分的(图29A和29B)。然而,糖尿病发作触发了WT对照小鼠睾丸中的明显细胞死亡,如通过对TUNEL染色阳性的细胞数目增加所证明的(图29C)。相反,ALCAT1缺陷预防ALCAT1 KO小鼠睾丸中与糖尿病相关的细胞凋亡的发作(图29D)。
[0062] 图30A-30F显示ALCAT1敲除小鼠表现出在睾丸中高水平的nauge形成。分析睾丸样品以获得3周大的WT(图30A,图30C中突出显示)和ALCAT1 KO小鼠(图30B,图30D中突出显示)中的中线粒体接合剂(nuage)形成。Nauge是睾丸中线粒体的独特特征。使用NIH ImageJ软件来定量nuage密度(图30E),其然后被标准化为相邻线粒体基质的密度,对比度和暗度以及相对nauge面积的对照(图30F)。平均值±SEM(n=24)。与之前图中观察一致,ALCAT1缺陷改善了睾丸中的线粒体功能,如通过ALCAT1 KO小鼠睾丸中增加的nauge形成所证明的。总之,结果证明,ALCAT1抑制剂提供了糖尿病诱导的生殖变性、例如糖尿病患者中常见缺陷勃起功能障碍的新治疗。*P<0.05,**P<0.01。
[0063] 详述
[0064] 以下参考供示例说明的实例应用来描述本发明的几个方面。应该理解,提出了许多具体细节、关系和方法,以提供对本发明的全面理解。然而,本领域普通技术人员容易理解,在没有所述具体细节的一个或多个,或者在使用其他方法的情况下,可以实施本发明。本发明不受动作或事件的示例顺序的限制,因为一些动作可以与其他动作或事件以不同顺序和/或共时发生。而且,并非所有示例动作或事件是实施根据本发明方法所必需的。
[0065] 可以在没有所提出的理论方面的情况下实施本发明的实施方案。而且,对提出理论方面的理解是申请人不寻求受所提出理论的束缚。
[0066] 本文公开的所有基因、基因名称和基因产物预期对应于本文公开的组合物和方法可应用的任何物种的同系物。因此,该术语包括但不限于来自人类和小鼠的基因和基因产物。要理解,当公开来自特定物种的基因或基因产物时,该公开预期仅是示例性的,而不要被解释为限制,除非在其出现的上下文中清楚指明。因此,例如,对于在一些实施方案中涉及哺乳动物核酸和氨基酸序列的本文公开的基因预期涵盖来自其他动物的同源和/或直系同源基因和基因产物,所述其他动物包括但不限于其他哺乳动物、鱼、两栖动物、爬行动物和。在优选实施方案中,基因或核酸序列是人的。
[0067] 定义
[0068] 本文使用的术语仅为了描述具体的实施方案,而并非为了限制本发明。如本文使用的,除非上下文明确指出相反,单数形式“一”、“一”和“该”也预期包括复数形式。而且,在术语“包括”、“包括”、“具有”、“具有”、“有”或其变体在详述和/或权利要求书中使用的程度上,此类术语预期是包含性的,类似于术语“包含”的方式。
[0069] 术语“约”或“大约”表示如通过本领域普通技术人员测定的特定值在可接受的误差范围内,这部分取决于该值是如何测量或测定的,即,测量系统的局限性。例如,根据本领域实践,“约”可以表示1之内或大于1个标准偏差。可选地,“约”可以表示给定值的最多20%、优选最多10%、更优选最多5%和还更优选最多1%的范围。可选地,特别就生物系统或方法而言,该术语可以表示一个值的一个数量级之内,优选5倍之内,且更优选2倍之内。
当申请和权利要求书中描述特定值时,除非另外说明,应该假设术语“约”表示特定值的可接受误差范围之内。
[0070] “任选的”或“任选”表示随后描述的状况可以发生或可以不发生,使得该描述包括了该状况发生的情况和该状况不发生的情况。
[0071] 术语“测定”、“测量”、“评价”、“检测”、“评估”和“分析”在本文可互换使用,指任何形式的测量,并且包括测定一个要素是否存。这些术语包括定量和/或定性的测定。分析可以是相对的或绝对的。“评估……的存在”包括测定存在的东西的量,以及测定其是存在还是不存在。
[0072] 如本文使用的,术语“剂”意思是涵盖能够预防、缓解或治疗疾病或其他医学病症的任何分子、化学实体、组合物、药物、治疗剂、化疗剂或生物剂。该术语包括小分子化合物、反义试剂、siRNA试剂、抗体、酶、肽有机或无机分子、天然或合成的化合物等。可以在临床试验期间、临床前试验期间或FDA批准之后的任何阶段根据本发明方法分析一种剂。
[0073] 术语“ALCAT1”意思是包括但不限于核酸、多核苷酸、寡核苷酸、有义和反义的多核苷酸链、互补序列、肽、多肽、蛋白、同源和/或直系同源ALCAT1分子、同种型、前体、突变体、变体、衍生物、剪接变体、等位基因、不同物种及其活性片段。
[0074] 术语“片段”或“变体”表示长度至少380个氨基酸残基并且与肽、多肽或蛋白的一个连续部分100%相同的片段,或者与达到并且包括全长肽、多肽或蛋白的片段至少90%、优选95%相同的变体。例如,变体可以包括如本领域定义的保守氨基酸取代或者非保守取代,条件是保留原始肽、多肽或蛋白活性的至少例如10%、25%、50%、75%或90%。还包括具有翻译后修饰的ALCAT1分子、片段或变体,所述翻译后修饰例如类泛素化(sumoylation)、磷酸化、糖基化、剪接变体等,其全部可以影响ALCAT1功能的效力。
[0075] 除非另外指明,术语“肽”、“多肽”或“蛋白”在本文可互换使用,尽管通常它们指不同大小的肽序列。
[0076] 当在多核苷酸序列上下文中使用时,术语“变体”可以涵盖与野生型基因相关的多核苷酸序列。该定义还可以包括例如“等位基因”、“剪接”、“物种”或“多态”变体。剪接变体可以具有与参考分子显著的同一性,但是由于mRNA加工期间外显子的交替剪接而一般具有或大或小数目的多核苷酸。相应的多肽可以具有其他功能结构域或结构域缺失。物种变体是一个物种与另一个物种不同的多核苷酸序列。本发明中特别有用的是野生型基因产物的变体。变体可以源自核酸序列中的至少一个突变,并且可以得到改变的mRNA或其结构或功能可以改变或可以不改变的多肽。任何咯啶天然或重组基因可以具有0、1或多个等位基因形式。产生变体的常见突变变化一般归因于核苷酸的天然缺失、添加或取代。这些变化类型的每一个可以在给定序列中单独或与其他变化类型组合发生一次或多次。
[0077] 得到的多肽一般具有相对于彼此显著的氨基酸同一性。多态变体是给定物种个体之间特定基因的多核苷酸序列变化。多态变体还可以涵盖“单核苷酸多态现象”(SNP)或其中多核苷酸序列变化一个基的单碱基突变。SNP的存在可以指示例如具有疾病状态倾向的某些人口,疾病状态倾向是相对于抗性的易感性。
[0078] 如本文使用的,“心脏病”指任何类型的心脏疾病,包括心肌病、肥大性心肌病、扩张性心肌病、粥样硬化、冠状动脉疾病、缺血性心脏病、心肌炎、病毒感染、创伤、高血压性心脏病、心瓣膜病、先天性心脏病、心肌梗死、充血性心力衰竭、心律失常、导致心脏重塑的疾病,等。心脏疾病可能是由于任何原因,例如心脏组织损伤,例如收缩性损失(例如,如可能通过降低的射血分数证明的)。
[0079] 由心脏功能不全表征的心脏损伤或疾患包括正常心脏功能的任何损伤或缺乏或者异常心脏功能的存在。异常心脏功能可能是疾病、损伤和/或衰老的结果。如本文使用的,异常心脏功能包括心肌细胞、心肌细胞群或心脏本身的形态和/或功能异常。形态和功能异常的非限制性实例包括心肌细胞的物理恶化和/或死亡、心肌细胞的异常生长模式、心肌细胞之间物理关联的异常、心肌细胞对一种物质或多种物质的过低或过高生成、心肌细胞不能产生它们正常会产生的一种物质或多种物质、以及电脉冲以异常模式或在异常时间的传输。更总体水平的异常包括运动障碍、射血分数降低、通过回波心脏描记术观察的变化(例如,扩张)、EKG变化、运动耐量变化、毛细管灌注减少、和通过血管造影术观察到的变化。对许多疾病观察到异常的心脏功能,所述疾病包括例如缺血性心脏病例如心绞痛、心肌梗死、慢性缺血性心脏病、高血压性心脏病、心病(肺原性心脏病)、瓣膜性心脏病例如风湿热、二尖瓣脱垂、二尖瓣环钙化、类癌心脏病、感染性心内膜炎、先天性心脏病,心肌病例如心肌炎、扩张性心肌病、高血压性心肌病、导致充血性心力衰竭的心脏疾患、和心脏肿瘤例如原发性肉瘤和继发性肿瘤。心脏损伤还包括创伤,例如刀伤;生物的(例如,病毒性;自身免疫疾病)或化学的(例如,化疗、药物);手术;移植等。
[0080] 如本文使用的,“血脂障碍”指其中脂质代谢异常的生物病症,包括脂蛋白过高生成或过低生成。其中脂蛋白过高生成的血脂障碍通常导致总胆固醇升高、低密度脂蛋白(LDL)胆固醇和甘油三酯浓缩,伴随血液中高密度脂蛋白(HDL)胆固醇浓度降低。
[0081] 如本文使用的,“脂肪肝疾病”或“肝脂肪变性”指其中肝在肝的肝细胞中累积了超过正常水平的甘油三酯的病症。肝细胞内小或大囊状液泡中含有甘油三酯。当肝的脂质含量超过5%-10%重量时进行诊断。FLD可以与或可以不与饮用乙醇有关(参见Reddy等人,Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.,2006,290:G852-G858)。
[0082] 如本文使用的,“酒精性脂肪肝疾病”指其中受试者平均每天饮用超过20克乙醇的脂肪肝疾病的病症。AFLD在基本上所有的每天饮用大约60或更多克乙醇的个体中发展。AFLD可以在摄入中度至大量乙醇甚至段时段之后发生。受试者可以是或可以不是过重或肥胖的。这包括肝硬化。
[0083] 如本文使用的,“非酒精性脂肪肝疾病”指其中受试者平均每天饮用少于20克乙醇的脂肪肝疾病的病症。受试者可以是或可以不是过重或肥胖的。
[0084] 如本文使用的,“非酒精性脂肪性肝炎”或NASH指其中已经发展了伴随肝中小叶炎症的脂肪大空泡的NA脂肪肝疾病发展阶段。其中发展了伴随肝中小叶炎症的脂肪大空泡的脂肪性肝炎也可以在酒精性脂肪肝疾病中发生。
[0085] 如本文使用的,“脂肪坏死”指其中已经发展了伴随肝中小叶炎症和气球样变性的脂肪大空泡的NA脂肪肝疾病的阶段。除了肝中脂肪大空泡、炎症和气球样变性的存在以外,NAFLD从脂肪坏死水平的进一步发展包括纤维化的发展。其中已经发展了伴随肝中小叶炎症和气球样变性的脂肪大空泡的脂肪坏死以及除了肝中脂肪大空泡、炎症和气球样变性的存在以外纤维化的发展也可以在酒精性脂肪肝疾病中发生。
[0086] 如本文使用的,短语“诊断”表示鉴定病理状态的存在或性质。诊断方法的灵敏度和特异性不同。诊断测定的“灵敏度”是测试阳性的患病个体的百分比(“真阳性”的百分比)。未通过所述测定检测的患病个体是“假阴性”。未患病并且在所述测定中测试阴性的受试者被称为“真阴性”。诊断测定的“特异性”是1减去假阳性率,其中“假阳性”率被定义为测试阳性而没有该疾病的哪些人的比例。虽然特定的诊断方法可能不提供确定的病症诊断,但是如果该方法提供辅助诊断的阳性指示,就足够了。
[0087] 如本文使用的,短语“诊断”指分类疾病或症状,确定疾病严重度,监测疾病进展,预测疾病结果和/或康复前景。术语“检测”还可以任选涵盖以上的任何一个。根据本发明的疾病诊断可以通过测定获自受试者的生物样品中本发明多核苷酸或多肽的水平来实现,其中测定的水平可以与疾病倾向、或疾病存在或不存在相关联。应该注意,“获自受试者的生物样品”还可以任选包括还没有从受试者物理取出的样品,如以下更详细描述的。
[0088] “治疗”是进行的干预,意图预防疾患发展或改变疾患病理或症状。因此,“治疗”指治疗性治疗和预防性或预防性措施。“治疗”还可以被规定为缓和护理。需要治疗的那些包括已经具有疾患的那些以及其中要预防疾患的那些。在肿瘤(例如,癌症)治疗中,治疗剂可以直接减少肿瘤细胞病理,或者使肿瘤细胞更容易受其他治疗剂例如放射和/或化疗的治疗。因此,病态、疾患或病症的“治疗”或“治疗”包括:(1)预防或延迟可能罹患或易患所述病态、疾患或病症但还没有经历或表现出所述病态、疾患或病症的临床或亚临床症状的人或其他哺乳动物中发展的病态、疾患或病症的临床症状的出现;(2)抑制所述病态、疾患或病症,即,停止、减少或延迟疾病发展或其复发(在维持治疗的情况下)或其至少一种临床或亚临床症状;或(3)减轻疾病,即,引起所述病态、疾患或病症或其临床或亚临床症状的至少一个的退行。对待治疗个体的益处是统计学上显著的或至少是患者或医师可察觉的。
[0089] 如本文定义的,“治疗有效”量的化合物(即,有效剂量)表示足以产生治疗上(例如临床上)想要结果的量。可以每天一次或多次到每周一次或多次来施用组合物;包括每两天一次。技术人员将理解,某些因素可以影响有效治疗受试者所需的剂量和时机,包括但不限于疾病或疾患严重度、之前治疗、受试者健康状况和/或年龄、和存在的其他疾病。而且,用治疗有效量的本发明化合物治疗受试者可以包括单次治疗或一系列治疗。
[0090] “预防有效量”可以指足以预防患者中代谢疾病或疾患的复发或扩散或者其出现的剂的量,所述患者包括但不限于易患代谢疾病的那些,例如遗传上易患或之前暴露于环境因素例如乙醇的那些。预防有效量还可以指在疾病预防中提供预防益处的预防剂的量。而且,相对于本发明剂的预防有效量表示单独或与其他剂组合的剂在疾病预防中提供预防益处的量。
[0091] 术语“样品”意思以其最广泛含义解释。“样品”指从个体分离或来自细胞培养成分的生物样品,例如;一种或多种细胞、组织或流体(包括但不限于血浆、血清、全血脑脊液、淋巴液、泪液、尿、唾液、乳汁、脓和组织渗出液和分泌物),以及获自例如实验程序的样品。生物样品可以包括分离自细胞的染色体(例如,中期染色体的散布),分离自细胞的细胞器或膜,完整细胞或组织,核酸例如溶液中或与固体支持体结合例如供Southern分析的基因组DNA,溶液中或与固体支持体结合例如供Northern分析的RNA,溶液中或与固体支持体结合的cDNA,溶液中或与固体支持体结合的寡核苷酸,溶液中或与固体支持体结合的多肽或肽,组织,组织拓印等。
[0092] 可以使用许多公知的组织或流体收集方法来从受试者收集生物样品以测定受试者中感兴趣的变体的DNA、RNA和/或多肽的水平。实例包括但不限于细针活检、针活检、芯针活检和手术活检(例如脑活检)和灌洗。不论采用的程序,一旦获得活检/样品,可以测定变体水平并且可以由此进行诊断。
[0093] 根据本发明,可以采用常规分子生物学、微生物学、重组DNA、免疫学、细胞生物学和本领域技术内的其他相关技术。参见例如,Sambrook等人,(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第3版.Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,New York;Sambrook等人,(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第2版.Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,New York;Ausubel等人编辑.(2005)Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley and Sons,Inc.:
Hoboken,NJ;Bonifacino等人编辑.(2005)Current Protocols in Cell Biology.John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,NJ;Coligan等人编辑.(2005)Current Protocols in Immunology,John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,NJ;Coico等人编辑.(2005)Current Protocols in Microbiology,John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,NJ;Coligan等人编 辑 .(2005)Current Protocols in Protein Science,John Wiley and Sons,Inc.:
Hoboken,NJ;Enna等人编辑.(2005)Current Protocols in Pharmacology John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,NJ;Hames等人编辑.(1999)Protein Expression:A Practical Approach.Oxford University Press:Oxford;Freshney(2000)Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique.第4版.Wiley-Liss;以及其他。上列最新方案每年更新数次。
[0094] ALCAT1的组合物和调节剂
[0095] 在一个优选实施方案中,药物组合物包括脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)的抑制剂。在另一个优选的实施方案中,药物组合物包括一个或多个剂量浓度的多种脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)抑制剂。在另一个优选的实施方案中,组合物包括脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)的至少一种抑制剂和至少一种其他治疗剂。例如,第二治疗剂可以是治疗特定症状的治疗剂。在另一实例中,所述剂靶向疾病另一方面,例如,异常的细胞增殖。在该例中,所述剂是用于治疗癌症患者的化疗剂。
[0096] 线粒体融合蛋白-2(MFN2)编码线粒体完整、融合、代谢和与ER拴结所需的线粒体蛋白。人类MFN2的突变引起外周神经病变和Charcot-Marie-Tooth疾病。MFN2缺陷还牵涉与肥胖和2型糖尿病相关的线粒体功能障碍。2型糖尿病患者中的肌肉MFN2表达减少。MFN2表达与肥胖负相关并且与胰岛素敏感性正相关。减肥手术对2型糖尿病中胰岛素抵抗的缓解增加了肌肉的MFN2表达。同样,已知提高胰岛素敏感性的中等身体锻炼显著增加MFN2表达和线粒体生物发生。此外,小鼠骨骼肌中MFN2的靶向缺失引起mtDNA不稳定性和高突变率,导致严重的mtDNA耗竭。
[0097] 心磷脂(CL)是氧化磷酸化所需的关键线粒体磷脂。CL由于其丰富的亚油酸含量和靠近内线粒体膜中ROS生成部位的定位而高度敏感于ROS对其双键的氧化损伤,一种还称为CL过氧化的过程。CL是线粒体经历细胞凋亡期间早期氧化的唯一磷脂,这触发了细胞色素c向胞质溶胶的释放,导致细胞凋亡性消耗。因此,源于病理性重塑的异常CL酰基组成已经牵涉通常与糖尿病、肥胖、心血管疾病、神经系统疾患、癌症、衰老和其他年龄相关的疾病相关的线粒体功能障碍的病因学(Claypool SM&Koehler CM(2012)The complexity of cardiolipin in health and disease.Trends Biochem Sci.Jan;37(1):32-41)。
[0098] ALCAT1是一种溶血心磷脂酰基转移酶,最近被鉴定为催化CL响应于糖尿病、肥胖和心肌病中氧化应激的病理性重塑,导致ROS生成、线粒体功能障碍和胰岛素抵抗。通过脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)的CL重塑还导致CL酰基组成的变化,提示年龄相关疾病,包括CL缺陷、亚油酸耗竭和CL中二十二碳六烯酸(DHA)含量富集。ALCAT1的靶向失活预防饮食诱导的肥胖及其相关代谢并发症的发作。
[0099] 在优选实施方案中,组合物包括脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)的调节剂。优选地,所述调节剂抑制ALCAT1的表达、功能和/或活性。
[0100] 在另一个优选的实施方案中,使用包括脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)的调节剂的组合物来预防或治疗患者的线粒体功能障碍。患者的线粒体功能障碍与其代谢疾病或疾患相关。实例包括但不限于:糖尿病、脂肪肝、不育、神经退行性疾病、神经炎性疾病、肥胖、癌症、自身免疫疾病、脑病、肾病、肝病、心脏病、肌肉疾病、勃起功能障碍、绝经、代谢疾病或疾患、衰老相关疾病等。
[0101] 在另一个优选的实施方案中,在体外或体内预防或治疗线粒体功能障碍的方法包括给细胞或患者施用治疗有效量的调节溶血心磷脂酰基转移酶表达、功能、活性或其组合的剂。优选地,溶血心磷脂酰基转移酶是脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)。
[0102] 在另一个优选的实施方案中,ALCAT1的调节剂调节:线粒体多核苷酸线粒体多肽、线粒体蛋白、mtDNA拷贝数;线粒体质量;线粒体形态;线粒体融合和mtDNA突变率。优选地,线粒体蛋白包括:线粒体融合蛋白、线粒体融合蛋白-1(MFN1)、线粒体融合蛋白-2、(MFN2)、抑制蛋白、肽、片段、变体、突变体或其组合。
[0103] 在一个实施方案中,线粒体融合蛋白分子任选与一种或多种ALCAT1抑制剂一起施用给患者,其中ALCAT1抑制剂与基线对照相比增加MFN2的表达、功能或活性。在另一个实施方案中,ALCAT1的抑制剂与正常基线对照相比减少如通过活性氧类(ROS)测量的氧化应激。在另一个优选的实施方案中,ALCAT1的抑制剂调节心磷脂(CL)结构、功能、活性、表达或其组合。
[0104] 在另一个优选的实施方案中,一种在体外或体内预防或治疗线粒体功能障碍的方法,包括:给细胞或患者施用治疗有效量的线粒体融合蛋白分子。在优选实施方案中,线粒体融合蛋白分子包括:线粒体融合蛋白-1(MFN1)、线粒体融合蛋白-2(MFN2)、片段、变体、突变体或其组合。优选地,线粒体融合蛋白是MFN2。
[0105] 在一个实施方案中,脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)的抑制剂任选施用给细胞或患者。在优选实施方案中,ALCAT1的抑制剂与基线对照相比增加MFN2的表达、功能或活性。ALCAT1抑制剂效力的其他测量包括测量如通过活性氧类(ROS)测量并与正常基线对照相比的氧化应激。在另一个优选的实施方案中,ALCAT1的抑制剂调节心磷脂(CL)结构、功能、活性、表达或其组合。
[0106] 心脏功能异常、神经退行性和其他疾病:似乎增加的氧化应激牵涉入心脏肥大和功能异常。氧化应激的减弱预防左心室重塑和功能异常。认为氧化应激是线粒体功能障碍和胰岛素抵抗的主要诱发因素,其已经牵涉入心肌病和心脏功能异常的发病机理。在所有磷脂中,CL由于丰富的多不饱和脂肪酸含量和靠近ROS生成部位的定位而高度敏感于活性氧类(ROS)对其双键的氧化损伤,一种还称为脂质过氧化的过程。因此,CL是线粒体中经历细胞凋亡期间早期氧化的唯一磷脂。虽然经历CL过氧化的分子机制依然不清楚,但是已经显示增加的DHA使得CL对氧化应激高度敏感,导致脂质过氧化和线粒体功能障碍的恶性循环。因此,CL中DHA含量在衰老心脏中增加,伴随CL缺陷。心肌细胞的缺血-再灌注损伤引起CL过氧化,导致细胞色素c氧化镁活性的显著降低,其只能通过外源添加的CL而不能通过其他磷脂或过氧化的CL恢复。具体地,人类甲状腺机能亢进的发作与升高的氧化应激和CL过氧化相关,其可以通过甲状腺功能正常化来减轻。人类甲状腺机能亢进刺激啮齿类动物的CL重塑,导致多不饱和脂肪酸和过氧化能力指数的显著增加。
[0107] 如上讨论的,ALCAT1催化CL响应于糖尿病、肥胖和心肌病中氧化应激的病理性重塑,导致ROS生成、线粒体功能障碍和胰岛素抵抗。通过ALCAT1的CL重塑还导致具有提示心脏疾病的酰基组成的CL生成,包括TLCL耗竭和DHA富集。本文结果证明了酶ALCAT1在氧化应激和心脏功能异常的病因学中的作用。
[0108] 在一个优选实施方案中,一种治疗罹患心肌病或处于心肌病风险的患者的方法,包括给有相应需要的患者施用治疗有效量的脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)的抑制剂。
[0109] 在另一个优选的实施方案中,罹患心肌病或处于心肌病风险的患者与正常健康对照相比缺乏PTEN诱导的假定激酶1(PINK1)。在优选实施方案中,如果抑制剂导致与基线对照相比增加的pink表达、功能或活性,则鉴定ALCAT1的抑制剂。
[0110] 在优选实施方案中,罹患心肌病或处于心肌病风险的患者表达肥大,包括:BNP、β-MHC、ANF或ACTA1。在多个实施方案中,ALCAT1的抑制剂调节这些标志物的一个或多个与基线对照相比的表达。
[0111] 在一些实施方案中,治疗罹患心肌病或处于心肌病风险的患者的方法包括给有相应需要的患者施用作为治疗方案的部分的、用于治疗心肌疾病、疾患或其症状的一种或多种治疗化合物。
[0112] 在另一个实施方案中,预防或治疗罹患神经系统疾病或疾患的患者的方法包括给患者施用治疗有效量的一种或多种ALCAT1调节剂。神经系统疾病或疾患指神经系统和/或视觉系统的任何疾患。“神经系统疾患”包括涉及中枢神经系统(脑、脑干和小脑)、外周神经系统(包括颅神经)和自主神经系统(其部分位于中枢和外周神经系统两者中)的疾患。神经退行性疾病包括例如阿尔茨海默病、中风、多发性硬化等。
[0113] 以下是可以使用根据本发明的组合物和方法治疗的几种神经系统疾患、症状、体征和综合征的列表:后天癫痫性失语;急性播散性脑脊髓炎;脑白质肾上腺萎缩症;年龄相关的黄斑变性;胼胝体发育不全;失认症卡迪综合征;亚历山大病;阿尔帕斯病;交叉性偏瘫;阿尔茨海默病;血管性痴呆;肌萎缩侧索硬化;无脑畸形;Angelma综合征;血管瘤病;缺氧;失语症;失用症;蛛网膜囊肿;蛛网膜炎;阿-基氏脑畸形(Anronl-Chiari malformation);动静脉畸形;阿斯佩各综合征;共济失调毛细血管扩张症;注意力缺乏多动症;孤独症;自主神经功能障碍;背痛;巴滕病;贝切特病;贝尔氏麻痹;良性自发性睑痉挛;良性灶;肌萎缩;良性颅内高血压;宾斯旺格病;睑痉挛;Bloch Sulzberger综合征;臂丛损伤;脑脓肿;脑损伤;脑肿瘤(包括多形性成胶质细胞瘤);脊髓肿瘤;布朗-塞卡尔综合征;卡纳万病;腕管综合征;灼痛;中枢性疼痛综合征;脑桥中央髓鞘溶解;头部疾患(cephalic disorder);脑动脉瘤;脑动脉硬化;脑萎缩;大脑性巨人症;大脑性瘫痪;
Charcot-Marie-Tooth疾病;化学疗法诱导的神经病和神经性疼痛;Chiari畸形;舞蹈症;
慢性炎性脱髓鞘性多神经病;慢性痛;慢性区域性疼痛综合征;科-勒综合征;昏迷,包括持续性植物状态;先天性面瘫;皮质基底节变性;颅动脉炎;颅缝早闭;克雅病;累积性创伤疾患;库兴综合征;巨细胞包涵体病;巨细胞病毒感染;舞蹈眼-舞蹈脚综合征;丹-沃综合征(Dandy-Walker syndrome);Dawson病;德摩西埃综合征;Dejerine-Klumke麻痹;
痴呆;皮肌炎;糖尿病神经病变;弥漫性硬化;自主神经功能异常;书写困难;诵读困难;张力失常;早期幼儿癫痫性脑病;空蝶鞍综合征;脑炎;脑膨出;脑三叉神经血管瘤病;癫痫;
欧勃麻痹;特发性震颤;法布里病;法尔综合征;昏厥;家族性痉挛性瘫痪;热性癫痫发作;
费希尔综合征;弗里德赖希共济失调;额颞痴呆和其他“tau蛋白病变(tauopathies)”;
高歇病;格斯特曼综合征;巨细胞动脉炎;巨细胞性包涵体病;球样细胞脑白质营养不良;
格-巴综合征;HTLV-1相关的脊髓病;哈-斯病;颅脑损伤;头痛;偏侧面肌痉挛;遗传性痉挛性截瘫;多神经炎型遗传性共济失调;部带状疱疹;带状疱疹;Hirayama综合征;HIV相关性痴呆和神经病(还是AIDS的神经表现);前脑无裂畸形;亨廷顿舞蹈病和其他聚谷氨酰胺重复疾病(polyglutamine repeat disease);积水性无脑畸形;脑积水;皮质醇增多症;缺氧;免疫介导的脑脊髓炎;包涵体肌炎;色素失调症;婴儿植烷酸贮积病;婴儿雷夫叙姆病;婴儿性痉挛;炎性肌病;颅内囊肿;颅内高血压;Joubert综合征;基-塞综合征(Kearns-Sayre syndrome);肯尼迪病Kinsboum综合征;克-费综合征(Klippel Feil syndrome);克拉伯病;库-韦病;库鲁病;拉福拉病;朗-爱肌无力综合征(Lambert-Eaton myasthenic syndrome);Landau-Kleffner综合征;侧髓(瓦伦伯格)综合征;学习无能;
利氏病;Lennox-Gustaut综合征;累-奈综合征;脑白质营养不良;路易体痴呆;无脑回;
闭锁综合征;Lou Gehrig病(即,运动神经元病或肌萎缩侧索硬化);椎间盘疾病;莱姆病-神经后遗症;-约病;巨脑(macrencephaly);巨脑(megalencephaly);梅-罗综合征;美尼尔症;脑膜炎;克斯病;异染性脑白质营养不良;小头畸形;偏头痛;米勒费希尔综合征;小中风;线粒体肌病;默比厄斯综合征;单肢肌萎缩;运动神经元病;脑底异常血管网病;粘多糖症;多发性梗死性痴呆;多病灶运动神经病;多发性硬化和其它脱髓鞘病症;多系统萎缩伴随直立性低血压;p型肌肉萎缩症;重症肌无力;髓鞘脱失弥漫性硬化;
婴儿肌阵挛性脑病;肌阵挛;肌病;先天性肌强直;发作性睡病;神经纤维瘤病;神经阻滞剂恶性综合征;AIDS的神经表现;狼疮的神经后遗症;神经性肌强直;神经元腊样脂褐质症;神经元迁移疾患;尼曼-皮克病;O'Sullivan-McLeod综合征;枕神经痛;隐性脊柱神经管闭合不全序列征;大田原综合征;橄榄体脑桥小脑萎缩;视性眼肌阵痉挛;视神经炎;直立性低血压;过度使用综合征;感觉异常;帕金森病;先天性副肌强直;类肿瘤性疾病;阵发性发作(paroxysmal attacks);帕-罗综合征;佩-梅病;周期性瘫痪;周围神经病;疼痛性神经病和神经性疼痛;持续性植物状态;全身性发育迟缓;感光性喷嚏反射;植烷酸贮积病;皮克病;神经挟捏;垂体瘤;多肌炎;脑穿通畸形;小儿麻痹症后期综合征;疱疹后神经痛;感染后脑脊髓炎;直立性低血压;普-韦综合征;原发性侧索硬化;朊病毒病;进行性一侧面萎缩;进行性多灶性白质脑病;进行性硬化性灰质萎缩;进行性核上性麻痹;脑假瘤;Ramsay-Hunt综合征(I型和II型);拉斯马森脑炎;反射性交感神经营养不良综合征;
雷夫叙姆病;反复性运动障碍;反复性应激损伤;腿多动综合征;反转录病毒相关性脊髓病;雷特综合征;雷耶综合征;舞蹈病;桑德霍夫病;谢耳德病;脑裂;中隔-视神经发育不良;惊吓婴儿综合征;带状疱疫;希-德综合征;斯耶格伦综合征;睡眠性呼吸暂停;索托斯综合征;疫挛状态;脊柱裂;脊髓损伤;脊髓瘤;脊髓性肌萎缩;僵人综合征;中风;斯-韦综合征;亚急性硬化性全脑炎;皮层下动脉硬化性脑病;西德纳姆舞蹈病;晕厥;脊髓空洞症;迟发性运动障碍;泰-萨克斯病;颞动脉炎;脊髓栓系综合征(tethered spinal cord syndrome);肌强直性白内障;胸廓出口综合征;三叉神经痛;Todd麻痹;图雷特综合症;短暂性脑缺血发作;传染性海绵状脑病;横贯性脊髓炎;外伤性脑损伤;震颤;三叉神经痛;
热带痉挛性轻截瘫;结节性硬化症;血管性痴呆(多发梗死性痴呆);血管炎,包括颞动脉炎;希-林病;瓦伦伯格综合征;韦-霍病;韦斯特综合征;急性颈部扭伤(whiplash);威廉斯综合征;Wildon病;以及泽尔韦格综合征。
[0114] 在另一个优选的实施方案中,ALCAT1调节剂的施用预防或治疗罹患自身免疫疾病的患者。自身免疫疾病的实例包括:类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、炎性肠病(IBD),包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC),其是具有多基因易感性的慢性炎性病症。
[0115] 在另一个优选的实施方案中,ALCAT1调节剂的施用预防或治疗罹患糖尿病性肾病及其相关疾患的患者。此类疾患的实例是糖尿病性心肌纤维化。其他实例是糖尿病诱导的睾丸中细胞凋亡和睾丸中nuage形成。
[0116] 在另一个优选的实施方案中,ALCAT1是疾病进展或结果或对代谢疾病疗法的响应或耐受或与线粒体功能障碍相关的任何疾病或疾患的预后标志物。
[0117] ALCAT1的调节剂:在优选实施方案中,鉴定脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)的调节剂的方法包括使生物样品与测试剂接触并测量所述生物样品中线粒体融合蛋白分子的表达、功能或活性。在优选实施方案中,如果测试剂与基线对照相比增加线粒体融合蛋白分子例如MFN2的表达、功能或活性,则鉴定所述测试剂为ALCAT1的抑制剂。
[0118] 在另一个优选的实施方案中,鉴定脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)的调节剂的方法包括使生物样品与测试剂接触并测量包括BNP、β-MHC、ANF或ACTA1的指示心肌病的肥大标志物的表达。在优选实施方案中,如果测试剂与基线对照相比减少指示心肌病的肥大标志物的表达,则鉴定所述测试剂为ALCAT1的抑制剂。
[0119] 在另一个优选的实施方案中,鉴定脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)表达、功能或活性的调节剂的方法包括使生物样品与测试剂接触;测量包括FAS、TNF、TGF-β、DGAT1、CHREBP1或SREBP1的指示糖尿病性肾病的核酸标志物或其编码产物的表达。在优选实施方案中,如果测试剂与基线对照相比调节FAS、TNF、TGF-β、DGAT1和SREBP1的表达,则鉴定所述测试剂为ALCAT1的抑制剂。
[0120] 在另一个优选的实施方案中,鉴定脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)表达、功能或活性的调节剂的方法包括使生物样品与测试剂接触;测量包括PPARα、Srebp1c、FAS、ACC1、DGAT1或CPT1α的指示脂肪肝疾病的核酸标志物或其编码产物的表达。在优选实施方案中,如果测试剂与基线对照相比调节PPARα、Srebp1c、FAS、ACC1、DGAT1或CPT1α的表达,则鉴定所述测试剂为ALCAT1的抑制剂。
[0121] 脂肪肝疾病的实例包括NAFLD、Alagille综合征、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、自身免疫性肝炎、胆道闭锁、慢性肝炎、肝癌、肝硬化、肝囊肿、脂肪肝、半乳糖血症、吉尔伯特综合征(Gilbert’s syndrome)、原发性胆汁肝硬化、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、原发性硬化性胆管炎、瑞氏综合征(Reye’s syndrome)、结节病、酪氨酸血症、I型糖原贮积症、威尔森氏病(Wilson’s disease)、血色素沉着症和新生儿肝炎。
[0122] 在其他优选实施方案中,通过本文具体实施的方法鉴定的脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)表达、功能或活性的调节剂。
[0123] 在其他优选实施方案中,药物组合物包括通过本文具体实施的方法鉴定的脂酰辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶1(ALCAT1)的抑制剂。
[0124] 生物样品可以获自患者,例如细胞、流体等。样品还可以是合成的,例如肽、寡核苷酸等。样品还可以是转化的细胞、经表达所需分子的载体转导的细胞、等。因此,在多个实施方案中,生物样品包括:流体、肽、多肽、寡核苷酸、多核苷酸、细胞、组织或其组合。
[0125] 许多剂可用于靶向ALCAT1和任何相关分子。例如,所述相关分子可以是参与ALCAT1机制的任何分子,并且可以在该途径的上游或下游。例如,所述剂可以调节基于cDNA的分子或调节区,使用例如基于DNA的剂,例如反义抑制剂和核酶,可用于靶向靶分子基因的内含子和外显子以及RNA水平。
[0126] 可选地,所述剂可以靶向基于氨基酸序列的分子,包括靶分子的三维蛋白结构。基于蛋白的剂,例如人类抗体、非人类单克隆抗体和人源化抗体可用于特异性靶向ALCAT1上的不同表位。肽或肽模拟物可用作高亲和力抑制剂来特异性结合ALCAT1的启动子位点,抑制例如ALCAT1的表达。可以通过许多方式,使用所需结果来鉴定所述剂,以鉴定哪些是适合的,例如调节MFN2、肥大标志物或PTEN诱导的假定激酶1(PINK1)表达的那些。此外,还可以通过本领域已知的任何测定法来测定ALCAT1表达、功能或活性。随后的实施例章节还提供了细节。
[0127] 标记的分子:在另一个优选的实施方案中,ALCAT1分子、ALCAT1调节剂等可以被放射性标记。用途包括治疗和为诊断和预后目的的成像。标记可以是放射性原子、酶或发色团部分。例如,Hunter和Greenwood,Nature,144:945(1962)以及David等人.Biochemistry 13:1014-1021(1974)已经描述了用于标记抗体的方法。美国专利号3,940,475和3,645,090已经描述了用于标记抗体的其他方法。例如,Leary等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80:4045;Renz 和 Kurz,Nucl.Acids Res.(1984)12:3435;
Richardson 和Gumport,Nucl.Acids Res.(1983)11:6167;Smith等人.Nucl.Acids Res.(1985)13:2399;以及Meinkoth和Wahl,Anal.Biochem.(1984)138:267已经描述了用于标记寡核苷酸探针的方法。
[0128] 标记可以是放射性的。有用的放射性标记的一些实例包括32P、125I、131I和3H。放射性标记的使用描述于U.K.2,034,323、美国专利号4,358,535和美国专利号4,302,204。
[0129] 非放射性标记的一些实例包括酶、发色团、可通过电子显微镜检测的原子和分子、以及可通过其磁性检测的金属离子
[0130] 一些有用的酶标记包括导致底物可检测变化的酶。一些有用的酶及其底物包括例如辣根过氧化物酶(邻苯三酚和邻苯二胺)、β-半乳糖苷酶(荧光素β-D-半乳吡喃糖苷)和碱性磷酸酶(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/氮蓝四唑)。U.K.2,019,404、EP63,879和Rotman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,47,1981-1991(1961)中已经描述了酶标记的使用。
[0131] 有用的发色团包括例如荧光、化学发光和生物发光分子,以及染料。用于本发明的一些特定发色团包括例如荧光素、若丹明、德克萨斯红、藻红蛋白、伞形酮和鲁米诺。
[0132] 可以通过本领域公知方法将标记轭合至抗体或核苷酸探针。标记可以通过探针上的官能团直接连接。探针含有或可以使其含有这样的官能团。合适的管官能团的一些实例包括例如氨基、羧基、硫氢基、马来酰亚胺、异氰酸根、异硫氰酸根。可选地,可借助偶联剂将诸如酶和发色团的标记轭合至抗体或核苷酸,所述偶联剂例如二醛、碳二亚胺、二马来酰亚胺等。
[0133] 可以借助通过上述方法连接至探针的配体和连接至标记的该配体的受体来将标记轭合至探针。任何已知的配体-受体组合是适合的。一些适合的配体-受体对包括例如生物素-亲和素或-链霉亲和素、和抗体-抗原
[0134] 在另一个优选的实施方案中,本发明的嵌合融合分子可用于成像。在成像用途中,复合物被标记,使得它们可以在体外被检测。典型的标记是放射性同位素,通常是具有短123 124 125 131 99m
半衰期的放射性同位素。可以使用通常的成像放射性同位素,例如 I、I、 I、I、 TC、
186 188 64 67 212 213 67 90 111 18 3 14 35 32
Re、 Re、Cu、Cu、Bi、 Bi、Ga、Y、In、F、H、C、S或 P。还可以使用核磁共振(NMR)成像增强剂例如钆-153来标记复合物,以通过NMR检测。认为用于在多核苷酸或蛋白部分中进行标记的方法和试剂是本领域已知的。
[0135] 小分子:剂的另一实例是小分子。为了鉴定作为ALCAT1调节剂的小分子,小分子测试化合物最初可以是有机或无机化学文库的成员。如本文使用的,“小分子”指分子量低于约3,000道尔顿的小的有机或无机分子。小分子可以是天然产物或组合化学文库的成员。应该使用一组不同的分子来涵盖许多功能,例如电荷、芳香性、氢键合、柔性、大小、侧链长度、疏水性和刚性。适合合成小分子的组合技术是本领域已知的,例如Obrecht 和 Villalgordo,Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries,Pergamon-Elsevier Science Limited(1998)所示例的,并且包括诸如以下那些:“混合裂分(split and pool)”或“平行”合成技术、固相和液相技术、和编码技术(参见例如Czarnik,Curr.Opin.Chem.Bio.,1:60(1997)。此外,许多小分子文库是可商业途径获得的。
[0136] 小分子可以包括环碳或杂环结构和/或芳香族或多环芳香族结构,经一个或多个上述官能团取代。还感兴趣的小分子有生物分子中存在的结构,包括肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或其组合。可以筛选此类化合物以鉴定感兴趣的那些,其中许多不同的筛选方案是本领域已知的。
[0137] 小分子可以衍生自天然存在的或合成的化合物,其可获自许多来源,包括合成或天然化合物的文库。例如,许多手段可用于随机和定向合成许多有机化合物和生物分子,包括制备随机化寡核苷酸和寡肽。可选地,细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库是可获得或容易产生的。此外,天然或合成产生的文库和化合物容易通过常规的化学、物理和生化手段修饰,并且可以用于产生组合文库。可以使已知的小分子经历定向或随机化学修饰,例如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等,以产生结构类似物。
[0138] 这样,小分子可以获自天然存在或合成分子的文库,包括通过组合手段产生的化合物文库,即,化合物多样性组合文库。组合文库以及用于产生和筛选的方法是本领域已知的。
[0139] 化学文库:组合化学的发展允许快速经济地合成数百至数千的分离化合物。这些化合物通常排列于设计用于有效筛选的小分子的中型文库中。组合方法可用于产生适于鉴定新化合物的无偏文库(unbiased libraries)。另外,可以产生从具有之前确定的生物活性的单一母体化合物衍生的更小、更少多样性的文库。在任一情况下,特异性靶向由组合化学产生的治疗相关生物分子(例如重要酶的抑制剂)的有效筛选系统的缺乏阻碍了这些资源的最佳利用。
[0140] 组合化学文库是通过化学合成或生物合成,通过组合大量化学“结构单元”例如试剂产生的多种化合物的集合。例如,直链组合化学文库,例如多肽文库,是通过将一组化学结构单元(氨基酸)以大量组合和潜在地以每种可能方式组合为给定化合物长度(即,多肽化合物中的氨基酸数目)而形成的。通过化学结构单元的这种组合混合,可以合成数百万的化合物。
[0141] “文库”可包括2至50,000,000个多样成员化合物。优选地,文库包括至少48个多样化合物,优选96或更多个多样化合物,更优选384或更多个多样化合物,更优选10,000或更多个多样化合物,优选超过100,000个多样成员,和最优选超过1,000,000个多样成员化合物。“多样”的意思是文库中超过50%的化合物具有不同于文库任何其它成员的化学结构。优选地,文库中超过75%的化合物具有不同于集合中任何其它成员的化学结构,更优选超过90%和最优选超过约99%。
[0142] 组合化学文库的制备是本领域技术人员公知的。关于综述,参见Thompson等 人,Synthesis and application of small molecule libraries,Chem Rev96:555-600,1996;Kenan 等 人,Exploring molecular diversity with combinatorial shape libraries,Trends Biochem Sci 19:57-64,1994;Janda,Tagged versus untagged libraries:methods for the generation and screening of combinatorial chemical libraries,Proc Natl Acad Sci USA.91:10779-85,1994;Lebl 等 人,One-bead-one-structure combinatorial libraries,Biopolymers 37:177-98,1995;
Eichler 等 人,Peptide,peptidomimetic,and organic synthetic combinatorial libraries,Med Res Rev.15:481-96,1995;Chabala,Solid-phase combinatorial chemistry and novel tagging methods for identifying leads,Curr Opin
Biotechnol.6:632-9,1995;Dolle,Discovery of enzyme inhibitors through combinatorial chemistry,Mol Divers.2:223-36,1997;Fauchere 等 人,Peptide and nonpeptide lead discovery using robotically synthesized soluble libraries,Can J.Physiol Pharmacol.75:683-9,1997;Eichler等人,Generation and utilization of synthetic combinatorial libraries,Mol Med Today 1:174-80,1995;和Kay等人,Identification of enzyme inhibitors from phage-displayed combinatorial peptide libraries,Comb Chem High Throughput Screen 4:535-43,2001。
[0143] 还可以使用产生化学多样性文库的其他化学物质。这样的化学物质包括但不限于类肽(PCT公布号WO91/19735);编码的肽(PCT公布WO93/20242);随机生物寡聚体(PCT公布号WO92/00091);苯并二氮卓类(美国专利号5,288,514);多样体(diversomer),例如乙内酰脲类、苯并二氮卓类和二肽类(Hobbs等人,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,90:6909-6913(1993)));插烯化(vinylogous)多肽(Hagihara等人,J.Amer.Chem.Soc.114:
6568(1992));具有β-D-葡萄糖支架的非肽的拟肽(Hirschmann等人,J.Amer.Chem.Soc.,
114:9217-9218(1992));小化合物文库的类似有机综合体(Chen等人,J.Amer.Chem.Soc.,
116:2661(1994));寡聚氨基甲酸酯(Cho等人,Science,261:1303(1993));和/或肽基膦酸酯(Campbell等人,J.Org.Chem.59:658(1994));核酸文库(参见,Ausubel,Berger和Sambrook,全部同上);肽核酸文库(参见例如美国专利号5,539,083;抗体文库(参见例如Vaughn等人,Nature Biotechnology,14(3):309-314(1996)和PCT/US96/10287);
碳水化合物文库(参见例如Liang等人,Science,274:1520-1522(1996)和美国专利号
5,593,853);小有机分子文库(参见例如,苯二氮卓类,BaumC&E News,1月18日,第33页(1993));异戊二烯类(美国专利号5,569,588);噻唑烷酮类和间噻嗪酮类(美国专利号
5,549,974);吡咯烷(美国专利号5,525,735和5,519,134);吗啉化合物(美国专利号
5,506,337)和苯并二氮卓类(美国专利号5,288,514);等。
[0144] 用于制备组合文库的装置可以商业途径获得(参见例如,357 MPS,390 MPS,Advanced Chem.Tech,Louisville Ky.,Symphony,Rainin,Woburn,Mass.,433A Applied Biosystems,Foster City,Calif.,9050 Plus,Millipore,Bedford,Mass.)。此外,许多组合文库本身可商业途径获得(参见例如,ComGenex,Princeton,N.J.,Asinex,Moscow,Ru,Tripos,Inc.,St.Louis,Mo.,ChemStar,Ltd.,Moscow,RU,3D Pharmaceuticals,Exton,Pa.,Martek Bio sciences,Columbia,Md.,等)。
[0145] 除了靶向ALCAT1和相关分子,还可以使用竞争结合位点或信号传导位点的剂。
[0146] 在多个实施方案中,剂调节ALCAT1启动子的相互作用。剂的实例包括但不限于:抗体、适体、RNAi、小分子、干扰转录因子-DNA结合组装并因此抑制复合物形成的特定合成或天然肽的高亲和力结合。在一些方面,所述剂抑制ALCAT1表达(例如,通过siRNA)。
[0147] 本发明一个实施方案包括结合例如ALCAT1的分离的抗体或这些抗体的片段。如本领域所示,抗体可以是例如多克隆、寡克隆、单克隆、嵌合、人源化和/或完整人抗体。本文描述的本发明的实施方案还提供了用于产生这些抗体的细胞。
[0148] 干扰RNA:可以使用本领域技术人员已知的许多技术来获得详细的生产方法。例如,使用本领域已知的方法,例如Tuschl等人的美国公开申请2002/0086356中描述的果蝇体外系统,可以化学合成或重组产生siRNA,其全部内容在此通过引用并入。
[0149] 可以使用测量细胞中RNA或蛋白水平的标准技术评价含有给定靶序列的RNAi引起RNAi介导的靶mRNA降解的能力。例如,可以将本发明的RNA递送至培养的细胞,并且可以通过Northern印迹或斑点印迹技术或者通过定量RT-PCR测量靶mRNA的水平。还可以使用动物模型例如小鼠模型来评价含有给定靶序列的siRNA对靶mRNA的RNAi介导的降解。使用如上所述分离和定量mRNA或蛋白的标准技术,通过测量受试者细胞中靶mRNA或蛋白的水平,可以检测靶mRNA的RNAi介导的降解。
[0150] 在一个优选实施方案中,siRNA分子靶向希望的有义/反义基因座的重叠区,从而调节有义和反义转录子,例如靶向石槲高碱。在另一个优选的实施方案中,组合物包括任一个或多个siRNA分子、和/或siRNA组合、重叠希望靶基因座和/或靶向有义和反义两者(重叠或以其他方式)的siRNA。这些分子可以涉及任何疾病或异常的潜在疗法所需的任何靶。理论上,对于待靶向的分子没有限制。而且,本文教导的技术允许为每个个体定制疗法。
[0151] 在优选实施方案中,可以为个体疗法定制寡核苷酸,例如,这些寡核苷酸可以是特异性针对个体中等位基因变体的序列,靶的上调或抑制可以在不同程度上操控,例如相对于对照10%、20%、40%、100%表达。即,在一些患者中,它可以有效增加或减少靶基因表达10%,而在另一患者中80%。
[0152] 通过测量内源靶RNA或者通过翻译靶RNA产生的蛋白,可以定量基因表达的调节(上调或抑制)。RNA和蛋白的定量技术是本领域普通技术人员所熟知的。在某些优选实施方案中,基因表达被抑制至少10%、优选至少33%、更优选至少50%、和更优选至少80%。在本发明的特别优选的实施方案中,基因表达在生物体细胞内被抑制至少90%、更优选至少95%、或至少99%至100%。在某些优选实施方案中,基因表达被上调至少10%、优选至少33%、更优选至少50%、和更优选至少80%。在本发明的特别优选的实施方案中,基因表达在生物体的细胞内被上调至少90%、更优选至少95%或至少99%至100%。
[0153] 通过使用自动比对核酸序列并指示同一性或同源性区域的计算机程序,帮助选择适合的RNAi。这类程序用于对比获得的核酸序列,例如通过搜索数据库例如GenBank或通过测序PCR产物。来自一定范围的物种的核酸序列的对比允许选择在物种间显示出适当同一性程度的核酸序列。对于还未测序的基因,进行Southern印迹以允许测定靶物种与其它物种的基因之间的同一性程度。如本领域所公知的,通过在不同严格程度下进行Southern印迹,可能获得同一性的近似测量。这些程序允许选择表现出与待控制的受试者靶核酸序列高度互补性以及与其它物种相应核酸序列较低程度互补性的RNAi。本领域技术人员会认识到,在选择用于本发明的适当基因区域时有相当大的自由度
[0154] 在一个优选实施方案中,使用适体或本领域已知的任何其他类型的递送媒介物将作为RNA本身或作为DNA的小干扰RNA(siRNA)递送至细胞。在某些实施方案中,本公开的核酸分子可以单独合成并在合成后结合在一起,例如通过连接(Moore等人,Science256:9923,1992;Draper等人,PCT公布号WO93/23569;Shabarova等人,Nucleic Acids Res.19:4247,1991;Bellon等人,Nucleosides&Nucleotides 16:951,1997;Bellon等人,Bioconjugate Chem.8:204,1997),或通过合成或脱保护后的杂交。
[0155] 在进一步实施方案中,介导干扰的寡核苷酸可以作为由编码一个或多个siRNA并指导其在宿主细胞内表达的多核苷酸载体表达的单一或多个转录产物制备。本公开的siRNA或其类似物可以进一步包括结合适体和siRNA的核苷酸、非核苷酸或混合核苷酸/非核苷酸连接体。在一个实施方案中,核苷酸连接体可以是超过约2个核苷酸长度至约50个核苷酸长度的连接体。在另一个实施方案中,核苷酸连接体可以是核酸适体。本文使用的“适体”或“核酸适体”表示特异性结合靶分子的核酸分子,其中所述核酸分子具有包括在其天然环境下被靶分子识别的序列的序列。可选地,适体可以是结合靶分子的核酸分子,其中所述靶分子天然不结合核酸。靶分子可以是任何感兴趣的分子。例如,可以使用适体结合蛋白的配体-结合结构域,从而预防天然存在的配体与蛋白的相互作用。这是非限制性的实例,并且本领域技术人员将理解,可以使用本领域公知的技术容易地产生其他实施方案(参见例如,Gold等人,Annu.Rev.Biochem.64:763,1995;Brody和 Gold,J.Biotechnol.74:5,2000;Sun,Curr.Opin.Mol.Ther.2:100,2000;Kusser,J.Biotechnol.74:27,2000;Hermann 和 Patel,Science 287:820,2000;和 Jayasena,Clinical Chem.45:1628,1999)。
[0156] 本发明可以针对蛋白编码基因产物以及非蛋白编码基因产物使用。非蛋白编码基因产物的实例包括编码以下的基因产物:核糖体RNA、转运RNA、小核RNA、小细胞质RNA、端粒末端转移酶RNA、参与DNA复制、染色体重排的RNA分子等。
[0157] 根据本发明,siRNA寡核苷酸疗法包括施用的siRNA寡核苷酸,其与来自所述基因的靶向mRNA接触(相互作用),由此调节该基因的表达。这种表达的调节适当地可以是相对于对照至少约10%或20%的差异,更优选相对于对照至少约30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%的表达差异。特别优选的是,与siRNA寡核苷酸的相互作用或接触导致相对于对照完全或基本完全的表达调节,例如相对于对照至少约95%、97%、98%、99%或100%的表达抑制或增加。用于测定这种调节的对照样品可以是还未与siRNA寡核苷酸接触的相当细胞(体外或体内)。
[0158] 在另一个优选的实施方案中,可以修饰siRNA中的核碱基以提供对靶mRNA较高的特异性和亲和力。例如,可以用LNA单体取代核碱基,其可以连续区段或在不同位置。修饰的siRNA优选具有比互补序列更高的对靶序列的结合常数(Ka)。使用杂交测定并如所附实施例中描述的,可以在多种严格条件下体外测定修饰或非修饰的siRNA对靶序列的结合。
[0159] 嵌合/修饰的siRNA:根据本发明,本领域普通技术人员将理解mRNA不仅包括携带利用三字母遗传密码子(包括翻译起始和终止密码子)编码蛋白的信息的编码区,还包括形成本领域普通技术人员已知作为5'非翻译区、3'非翻译区、5'帽区、内含子区和内含子/外显子或剪接点核糖核苷酸的区域的相关核糖核苷酸。因而,可以根据本发明配制完全或部分靶向这些相关核糖核苷酸以及编码核糖核苷酸的寡核苷酸。在优选实施方案中,寡核苷酸靶向mRNA的编码区翻译起始位点(AUG密码子)或序列、5'非翻译区或3'非翻译区。待干扰的信使RNA的功能包括所有重要功能,例如RNA转位至蛋白翻译位点、从RNA到蛋白的实际翻译、RNA的剪接或成熟、和可能甚至是RNA可参与的独立催化活性。对RNA功能的这种干扰的总体效应是引起蛋白表达的干扰。
[0160] 其他剂:这些可以包括任何合成或天然的肽、糖蛋白、酶、信号传导的调节剂、转录组装抑制剂或转录因子复合物、有机或无机分子等。
[0161] 本发明的其他实施方案包括编码本文描述的靶向结合剂、抗体或其片段的任何一个的分离的核酸分子、具有分离的核酸分子的载体或用此类核酸分子任何一个转化的宿主细胞。应该理解,本发明实施方案还包括编码本发明抗体或抗体片段的任何核酸分子,包括为了当转染进入宿主细胞供抗体生成时增加抗体或其片段产量而优化的核酸序列。
[0162] 微阵列:通过将核酸文库固定在基底表面使得每个独特核酸位于确定位置以形成阵列,可以实现能够结合ALCAT1和相关分子的核酸序列的鉴定。一般而言,使固定的核酸文库在有助于生物分子与核酸结合的条件下暴露于生物分子或候选剂。可以根据想要的结合特异性水平,使用温和至严格的缓冲液条件洗掉非特异性结合的生物分子。然后分析核酸阵列以确定哪些核酸序列结合至生物分子。优选地,生物分子将携带用于检测结合核酸定位的荧光标签。
[0163] 使用固定的核酸序列阵列的测定可用于测定未知核酸的序列;单核苷酸多态性(SNP)分析;从特定物种基因表达的分析、组织、细胞类型、基因鉴定;等。
[0164] 从编码想要的基因表达产物的序列设计的寡核苷酸的其他诊断用途可以涉及PCR的使用。这些寡聚体可以是化学合成的,酶法产生的,或者体外产生的。寡聚体优选含有编码表达产物的多核苷酸的片段,或者与该多核苷酸互补的多核苷酸的片段,并且在用于鉴定特定基因的优化条件下使用。寡聚体还可以在用于检测或定量密切相关的DNA或RNA序列的较不严格条件下使用。
[0165] 在其他实施方案中,从多核苷酸序列的任何一个衍生的寡核苷酸或更长片段可用作微阵列中的靶。微阵列可用于同时监测大量基因和基因产物的身份和/或表达水平,以鉴定与靶基因或其产物相互作用的基因和/或评估候选治疗剂在调节介导例如神经系统疾患的基因的表达产物中的效力。该信息可用于测定基因功能,并且开发和监测治疗剂活性。
[0166] 可以使用本领域已知的方法制备、使用和分析微阵列(参见例如,Brennan等人,1995,美国专利号5,474,796;Schena等人,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:10614-10619;Baldeschweiler等 人,1995,PCT申 请 WO95/251116;Shalon等 人,1995,PCT申请WO95/35505;Heller等人,1997,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:2150-2155;和Heller等人,1997,美国专利号5,605,662)。在其他实施方案中,微阵列包括肽或可以被测定以鉴定候选剂的其他所需分子。
[0167] 药物筛选的另一种技术提供了对感兴趣蛋白具有合适结合亲和力的化合物的高通量筛选(参见例如,Geysen等人,1984,PCT申请WO84/03564)。在该方法中,在固体基底上合成大量不同的小测试化合物。使所述测试化合物与鉴定的基因或其片段反应,并洗涤。然后通过本领域公知方法检测结合的分子。可选地,非中和抗体可用于捕获肽并将其固定在固体载体上。
[0168] 本发明的筛选方法包括使用筛选测定从多样分子文库鉴定一种或多种具有所需活性的化合物。“筛选测定”是被设计以鉴定、分离和/或测定具有预选活性的集合内的化合物结构的选择性测定。“鉴定”的意思是分离具有所需活性的化合物,测定其化学结构(包括但不限于分别测定核酸和多肽的核苷酸和氨基酸序列),以及附加或可选地,纯化具有筛选活性的化合物)。设计生化和生物测定以测试在范围从蛋白-蛋白相互作用、酶催化、小分子-蛋白结合到细胞功能的宽范围系统中的活性。此类测定包括自动化、半自动化测定和HTS(高通量筛选)测定。
[0169] 在HTS方法中,许多分离化合物优选通过机器、自动或半自动方法平行测试,以便根据所需活性同时或接近同时筛选大量测试化合物。使用本发明的集成系统,可能每天测定和筛选达约6,000至20,000和甚至达约100,000至1,000,000个不同的化合物。
[0170] 通常在HTS中,靶分子与具有调节受体的分离细胞(包括适当对照)一起施用或培养。
[0171] 在一个实施方案中,筛选包括使每个细胞培养物与多样文库的成员化合物(其中一些是感兴趣的配体)在其中靶和配体之间可以形成复合物的条件下接触,并鉴定文库中哪些成员存在于此类复合物中。在另一个非限制性模式中,筛选包括使靶酶与多样文库的成员化合物(其中一些是靶的抑制剂(或激活剂))在其中被所述酶催化的反应的产物或反应物产生可检测信号的条件下接触。在后一模式中,靶酶的抑制剂减少了来自可检测产物的信号或增加了来自可检测反应物的信号(或者对于激活剂而言是反过来的)。
[0172] 在一个实施方案中,本发明提供使用本文具体实施的任何分子(例如,ALCAT1或ALCAT1、MFN2、PTEN等的调节剂)或表达天然存在或重组的这些分子蛋白的任何一个的细胞或组织的适当测定。在另一个实施方案中,本发明提供了高通量形式的基于固相的体外测定,其中,例如,ALCAT1分子或其片段与固相基底连接。本文所述测定的任何一个可适于高通量筛选,例如配体结合、细胞增殖、细胞表面标志物通量、放射性标记的GTP结合、第二2+
信使通量,例如Ca 、IP3、cGMP或cAMP,细胞因子生成,等。在可溶或固体状态的本发明的高通量测定中,可能在一天筛选达数千种不同的调节剂或配体。
[0173] 本方法可在体外用于ALCAT1蛋白,或者用于基于细胞或基于膜的包括ALCAT1蛋白的测定。具体地,微量滴定板的每个孔可用于运行针对选定潜在调节剂的单独测定,或者如果要观察浓度或孵育时间的影响,每5-10个孔可测试单个调节剂。因此,单个标准微量滴定板可以测定约100(例如96)种调节剂。如果使用1536孔板,则单个板可容易测定约100至约1500个不同的化合物。可能每天测定许多板;使用本发明的集成系统测定筛选达约6,000、20,000、50,000或超过100,000个不同化合物是可能的。
[0174] 对于固态反应,感兴趣的蛋白或其片段,例如细胞外结构域,或者包括感兴趣的蛋白或其片段作为融合蛋白一部分的细胞或膜可以通过例如标签共价或非共价键直接或间接结合至固态组分。所述标签可以是许多组分的任何一种。一般而言,结合所述标签的分子(标签结合剂)固定至固体支持体,并且感兴趣的标签分子通过标签与标签结合剂的相互作用连接至固体支持体。
[0175] 基于文献中充分描述的已知的分子相互作用,可以使用许多标签和标签结合剂。例如,当标签具有天然结合剂时,例如生物素、蛋白A或蛋白G,其可以与适当的标签结合剂(亲和素、链霉亲和素、中和亲和素、免疫球蛋白的Fc区等)结合使用。针对具有天然结合剂的分子(例如生物素)的抗体也是广泛可获得且适当的标签结合剂;参见SIGMA Immunochemicals 1998 catalogue SIGMA,St.Louis Mo.)。
[0176] 类似地,任何半抗原或抗原化合物可以与适当抗体组合使用以形成标签/标签结合剂对。数百种特定抗体是可商业途径获得的,并且许多其他抗体描述于文献中。例如,在一个常见构型中,标签是第一抗体,并且标签结合剂是识别所述第一抗体的第二抗体。除了抗体-抗原相互作用,受体-配体相互作用作为标签和标签-结合剂对也是适当的。例如,细胞膜受体的激动剂和拮抗剂(例如,细胞受体-配体相互作用,例如运蛋白、c-kit、病毒性受体配体、细胞因子受体、趋化因子受体、白细胞介素受体、免疫球蛋白受体和抗体、钙粘素家族、整联蛋白家族、选择蛋白家族等;参见例如,Pigott&Power,The Adhesion Molecule Facts Book I(1993)。类似地,毒素和毒液、病毒性表位、激素(例如,阿片类、类固醇等)、细胞内受体(例如,其介导各种小配体的效应,所述小配体包括类固醇、甲状腺激素、维甲酸类和维生素D;肽)、药物、凝集素、糖、核酸(直链和环状聚合物构型)、寡糖、蛋白、磷脂和抗体都可以与各种细胞受体相互作用。
[0177] 合成的聚合物,例如聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯亚胺、聚芳撑硫、聚氧烷、聚酰亚胺和聚乙酸酯还可以形成适当的标签或标签结合剂。如对于参考本公开内容的技术人员而言明显的,许多其他标签/标签结合剂对还用于本文描述的测定系统。
[0178] 常用的连接体,例如肽、聚醚等也可以用作标签,并且包括多肽序列,例如约5至200个氨基酸的聚gly序列。此类柔性连接体是本领域技术人员已知的。例如,聚(乙二醇)连接体可获自Shearwater Polymers,Inc.Huntsville,Ala。这些连接体任选具有酰胺键、硫氢基键或杂官能键。
[0179] 使用目前可获得的许多方法的任何一个将标签结合剂固定至固体基底。通常通过将基底的全部或一部分暴露于使化学基团固定至与标签结合剂的一部分反应性的表面的化学试剂而衍生或官能化固体基底。例如,适合连接至长链部分的基团包括胺、羟基、巯基和羧基。氨基烷基硅烷和羟基烷基硅烷可用于官能化许多表面,例如玻璃表面。此类固相生物聚合物阵列的构建充分描述于文献。参见例如,Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963)(描述了例如肽的固相合成);Geysen等人,J.Immun.Meth.102:
259-274(1987)(描述了在针上的固相组分的合成);Frank&Doring,Tetrahedron 44:
60316040(1988)(描述了再纤维素盘上的各种肽序列的合成);Fodor等人,Science,251:
767-777(1991);Sheldon等人,Clinical Chemistry 39(4):718-719(1993);和Kozal等人,Nature Medicine 2(7):753759(1996)(全部描述固定至固体基底的生物聚合物的阵列)。将标签结合剂固定至基底的非化学方法包括其他常见方法,例如加热、通过UV辐射的交联等。
[0180] 给患者施用组合物
[0181] 可以任何适当制剂给包括人类的动物施用通过本文描述的方法鉴定的组合物或剂。例如,用于调节蛋白降解的组合物可以在药学可接受的载体或稀释剂(例如生理盐水或缓冲盐溶液)中配制。适当的载体和稀释剂可以根据施用的模式和途经以及标准药学实践来选择。示例性药学可接受的载体和稀释剂连同药物制剂的描述可以参见本领域的标准课文《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)以及USP/NF。可以向组合物中添加其他物质,以稳定和/或保存所述组合物。
[0182] 可以通过任何常规技术向动物施用本发明组合物。例如,通过手术递送至内部或外部靶部位或者通过导管至血管可及的部位,可以将组合物直接递送至靶部位。其他递送方法,例如脂质体递送或从充满组合物的装置扩散,是本领域已知的。组合物可以单次浓注、多次注射或通过连续输注(例如,静脉内)来施用。对于胃肠外施用,优选以无菌无热原形式配制组合物。
[0183] 剂或化合物可以与一种或多种疗法一起施用。可以节拍方案施用化疗剂。如本文使用的“节拍”疗法指连续低剂量治疗剂的施用。
[0184] 可以通过标准药学规程在细胞培养物或实验动物中测定此类化合物的剂量、毒性和治疗效力,例如以测定LD50(半数致死剂量)和ED50(半数治疗有效剂量)。毒性效应与治疗效应的剂量比是治疗指数,它可以表示为比率LD50/ED50。表现出高治疗指数的化合物是优选的。虽然可以使用表现出毒性副作用的化合物,但是应该小心设计递送系统,该递送系统靶向此类化合物至受累组织部位以最小化对未感染细胞的潜在损失并从而减少副作用。
[0185] 从细胞培养物测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人类的剂量范围。此类化合物的剂量优选处于循环浓度范围内,包括很少或没有毒性的ED50。剂量可以在该范围内变化,取决于采用的剂型和使用的施用途径。对于本发明方法中使用的任何化合物,可以从细胞培养物测定开始估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量以达到循环血浆浓度范围,包括如在细胞培养物中测定的IC50(即,实现症状的半最大抑制的测试化合物的浓度)。此类信息可用于更准确确定在人类中有用的剂量。例如,可以通过高效液相色谱测量血浆水平。
[0186] 如本文定义的,治疗有效量的化合物(即,有效剂量)表示足以产生治疗上(例如临床上)希望结果的量。可以每天一次或多次到每周一次或多次来施用组合物;包括每两天一次。技术人员将理解,某些因素可以影响有效治疗受试者所需的剂量和时机,包括但不限于疾病或疾患严重度、之前治疗、受试者健康状况和/或年龄、和存在的其他疾病。而且,用治疗有效量的本发明化合物治疗受试者可以包括单次治疗或一系列治疗。
[0187] 制剂:虽然单独施用的组合物是可能的,但是优选以药物制剂来提供组合物。对于局部施用,活性成分可以占制剂的0.001%至10%w/w、例如1%至2%重量,但是它可以占制剂的多如10%w/w但优选不超过5%w/w并且更优选0.1%至1%w/w。本发明的局部制剂包括活性成分及其一种或多种可接受的载体以及任选任何其他治疗成分。在与制剂的其他成分相容并且对其受体无害的意义上,载体必须是“可接受的”。
[0188] 适合局部施用的制剂包括适合穿过皮肤至需要治疗的部位的液体或半固体制品,例如擦剂、洗剂、乳霜、软膏或糊剂、以及适合施用至眼、耳或鼻的滴剂。根据本发明的滴剂可以包括无菌的水性或油性溶液或悬液,并且可以通过将活性成分溶解于杀细菌和/或杀真菌剂和/或任何其他适当防腐剂的适当水溶液中来制备,并且优选包括表面活性剂。然后,可以将得到溶液通过过滤澄清并除菌,并通过无菌技术转移至容器。适合加入滴剂的杀细菌和杀真菌剂的实例有硝酸醋酸苯汞(0.002%)、苯扎氯铵(0.01%)和醋酸氯己定(0.01%)。适合制备油性溶液的溶剂包括甘油、稀释的乙醇和丙二醇。
[0189] 根据本发明的洗剂包括适合应用至皮肤或眼的那些。眼洗剂可以包括任选含有杀菌剂的无菌水溶液,并且可以通过类似于滴剂制备的那些方法来制备。用于应用至皮肤的洗剂或擦剂还可以包括加速干燥和冷却皮肤的剂,例如乙醇或丙酮,和/或润湿剂,例如甘油或油,例如蓖麻油花生油
[0190] 根据本发明的乳霜、软膏或糊剂是用于外部应用的活性成分的半固体制剂。它们的制备可以通过单独混合细分或粉末形式的活性成分,或在适当机器辅助下与油脂或非油脂基底在水性或非水性流体中的溶液或悬液中混合。所述基底可以包括,例如硬、软或液体石蜡、甘油、蜂蜡、金属皂;粘液;天然来源例如杏仁、玉米、花生、蓖麻或榄橄油的油;羊毛脂或其衍生物,或脂肪酸,例如硬脂酸或油酸连同醇,例如丙二醇或大粒凝胶。制剂可以加入任何适当的表面活性剂,例如阴离子、阳离子或非离子表面活性剂,例如脱水山梨糖醇酯或其聚氧乙烯衍生物。还可以包括悬浮剂例如天然橡胶、纤维素衍生物或无机材料(例如硅质硅石)和其他成分例如羊毛脂。
[0191] 虽然上文已经描述了本发明的不同实施方案,但是应该理解,它们只是作为例子而非限制来提供。可以根据本文公开的内容在不背离本发明精神或范围的情况下对公开的实施方案做出许多变化。因此,本发明的宽度和范围不应受上述实施方案的任何一个的限制。
[0192] 本文提到的所有文件在此通过引用并入。本申请引用的所有出版物和专利文件为所有目的通过引用并入,如同每个单独出版物或专利文件如此单独表示的程度。对于各种参考文献在本文件中的引用,申请人不承认任何特定参考文献是其发明的“现有技术”。本发明组合物和方法的实施方案在以下实施例中示例说明。实施例
[0193] 以下非限制性实施例用于示例说明选定的本发明实施方案。要理解,所示组分的比例变化和要素选择对于本领域技术人员是明显的,并且在本发明实施方案的范围内。
[0194] 实施例1:通过ALCAT1的心磷脂重塑通过调节MFN2表达而控制线粒体生物发生和mtDNA保真性
[0195] 本研究寻求推进对ALCAT1调节与氧化应激相关的线粒体功能障碍的分子机制的理解。在该过程中,鉴定了ALCAT1调节线粒体融合和mtDNA保真性的预料不到的作用,暗示了ALCAT1在年龄相关疾病中的MFN2缺陷和线粒体片段化中的关键作用。
[0196] 材料和方法
[0197] ALCAT1敲除小鼠:ALCAT1敲除小鼠的产生和耗氧率(OCR)的测量如之前描述的(Li J等人.(2010).Cell Metab 12(2):154-165)。所有实验使用了匹配年龄和性别的同窝对照,并且依照根据NIH指南(NIH出版号86-23,1985)批准的机构动物护理和使用方案。
[0198] 试剂:本研究使用的抗体包括抑制蛋白和钙联结蛋白的单克隆抗体,购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA)。MFN1、MFN2和OPA1的单克隆抗体来自Abcam。驴抗兔和驴抗小鼠IgG辣根过氧化物酶轭合抗体购自GE Healthcare(Piscataway,NJ)。驴抗小鼠和驴抗兔FITC轭合的抗体来自Santa Cruz Biotechnology。羰基氰对三氟甲氧基苯基腙(FCCP)、鱼藤酮、抗霉素、寡霉素和二联苯硫酸碘(DPI)购自Invitrogen。
[0199] 动物护理:4至6周大的雄性和雌性C57BL/6J小鼠购自Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)。所有动物保持在环境受控的设施中,具有每日光循环,并自由获取水和标准啮齿类动物食物(Harland Teklad 2018,Madison,Wisconsin)或来自Research Diets的高脂肪饮食(New Brunswick,NJ;目录号D12492)。所有涉及动物的实验依照根据NIH指南(NIH出版号86-23,1985)批准的机构动物护理和使用方案进行。
[0200] 免疫荧光共聚焦显微镜和图像分析:对于免疫荧光染色,将细胞在4%低聚甲醛中固定10分钟,用PBS洗涤两次,然后用0.1%Triton X-100通透10分钟。固定的细胞在含有5%血清白蛋白的PBS中室温下预孵育30分钟。用一抗(抗Myc单克隆抗体,1:500稀释)在室温下对细胞染色3h,随后用与FITC轭合的二抗(1:1000稀释,Santa Cruz)孵育。对于线粒体染色,将细胞在37℃孵育器中用Mitotracker Red(终浓度100nM)染色细胞,用PBS洗涤三次,每次洗涤5分钟。然后在配备有双极温度控制器的共聚焦显微镜(Leica TCS SP2AOBS)下分析细胞。使用Adobe Photoshop 7.0处理图像,并使用ImageJ(National Institutes of Health)进行定量分析。所有实验进行至少三次,具有相似结果。
[0201] EM分析:在4%低聚甲醛和5%戊二醛中固定细胞,依次在2%OsO4和1%乙酸双氧中染色,通过一系列乙醇洗涤脱水,并包埋于Embed-812树脂中供切片和分析。使用JEOL 1200EX透射电子显微镜分析样品。
[0202] mtDNA突变测定:对于mtDNA分离,均化MEF和C2C12细胞并分离线粒体级分,如之前所述(Li等人,(2010).Cell Metab 12(2):154-165)。然后在0.5%SDS和0.2mg/ml蛋白酶K存在下在10mM Tris-HCl、0.15M NaCl和0.005M EDTA中裂解线粒体。通过苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀来纯化mtDNA。如之前所述进行随机突变捕获测定(Chen等人,2010.Cell 141(2):280-289)。简言之,用TaqI消化mtDNA持续5h,然后在96孔形式中稀释,并用侧翼具有TaqI限制酶位点的引物探测以检测含有TaqI限制酶位点突变的mtDNA基因组。TM
使用对照引物对来检测被考察的mtDNA基因组的量。使用ABI StepOnePlus 和
GREEN PCR Master Mix在20μl反应中进行PCR。使用以下程序进行定量PCR扩增:第1步,95℃持续10min;第2步,持续15s;第3步,60℃持续1min;第4步,进入第2步40次;
第5步,从65℃至95℃的熔解曲线。
[0203] 线粒体融合测定:稳定表达ACLAT1或载体对照的C2C12细胞以5×105每6cm2板接种,并分别用线粒体靶向的绿色荧光蛋白(mtEGFP)或线粒体靶向的dsRED2(mtDsred2)转染。30h之后,将分别表达mtEGFP和mtDsRed2的个体细胞池混合并以1:1比率共同铺板在13-mm圆形盖玻片上。6h之后,通过用50%(wt/vol)PEG1500在PBS(Sigma)中的溶液处理60秒钟而诱导融合,随后在补充了10%FCS的DMEM中充分洗涤。为了抑制蛋白合成,在融合之前30min添加环己酰亚胺(20μg/ml)并保持在随后使用的所有溶液和细胞培养介质中,直至细胞用冷的4%甲醛的PBS溶液固定10min。在用PBS洗涤三次之后,将盖玻片安装在载玻片上并保持在暗箱中4℃过夜。
[0204] 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)制品:第12.5胚胎日的雌性小鼠被安乐死。在具有HBSS的盘上解剖胚胎。去除头、四肢和内脏。剩余胚胎用柳叶刀或剃刀刀片切碎,转移至含有4ml胶原酶溶液的15ml管,然后用4ml洗涤盘以获得所有胚胎部分。将管在37℃孵育箱中旋转30-60min,直至所有组织消失。通过100μm网过滤消化的溶液至含有冷DMEM(30ml)的50ml管。以1200rpm离心样品5min,用25ml DMEM再次洗涤细胞沉淀。然后用完全培养基接种细胞。
[0205] XF24生物能量测定:使用Seahorse XF24分析仪(Seahorse Bioscience)测量耗氧率(OCR),如之前所述(Li等人,2010 Cell Metab 12(2):154-165)。平衡之后,将测试试剂预先加载到O2传感器筒的试剂递送室内,并在XF呼吸计读出基础耗氧率之后注射进孔中。获得耗氧率(皮摩尔/分钟)。基线测量之后,将70μl在测定介质中准备的测试剂注射进入每个孔,以达到所需终浓度。这之后,混合2分钟以加快化合物对细胞蛋白的暴露,然后进行OCR测量。
[0206] 统计分析:使用双尾非配对t检验进行统计对比以确定两种C2C12细胞系之间和-/-ALCAT1 与野生型小鼠之间的差异。数据表示为平均值±SEM。p<0.05被认为是统计学显著的。
[0207] 结果
[0208] ALCAT1在C2C12细胞中引起线粒体片段化和mtDNA不稳定。ALCAT1是催化病理性CL重塑的溶血心磷脂酰基转移酶,导致糖尿病和肥胖中的ROS产生和线粒体功能障碍。ROS引起线粒体片段化,其已经牵涉于年龄相关的疾病。这里,考察ALCAT1过表达在被flag标签化ALCAT1 cDNA(C2C12-A1)或载体对照(C2C12-V)稳定转染的C2C12细胞系中调节线粒体和ER形态的作用。C2C12-A1细胞中ALCAT1的mRNA表达水平仅三倍于C2C12-V细胞(图8),并且匹配糖尿病和肥胖发作诱导的ALCAT1表达水平。如图1A-1I(图11C中定量)所示,ALCAT1过表达引起线粒体片段化,如C2C12-A1细胞中超过95%片段化线粒体所证明的。此外,ALCAT1过表达导致C2C12-A1细胞中缩短的线粒体和线粒体膨胀(图1E,图1G中突出显示),如通过电子显微镜(EM)分析所分析的。而且,与载体对照相比,ALCAT1过表达还引起ER扩大(图1D,图1F中用虚线突出显示),这与之前报道的ALCAT1在线粒体相关膜(MAM)的定位一致。
[0209] 线粒体片段化经常与mtDNA不稳定相关。鉴于异常的线粒体形态,通过RT-PCR分析考察了ALCAT1在调节mtDNA拷贝数和突变率中的作用。显著地,ALCAT1过表达显著消耗了C2C12-A1细胞中的mtDNA拷贝数(图1H)。而且,ALCAT1过表达还显著增加了mtDNA突变率(图1I),提供了ALCAT1调节线粒体质量和mtDNA稳定性的主要作用的证据。
[0210] ALCAT1的消除增加了小鼠中的线粒体质量和mtDNA保真性。使用ALCAT1敲除小鼠,通过EM分析,在分离的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和骨骼肌中考察了ALCAT1缺陷对线粒体形态、mtDNA质量和mtDNA突变率的影响。支持C2C12细胞中的发现,ALCAT1缺陷显著增加了培养的MEF中的线粒体密度(图2B,图2D中突出显示)。ALCAT1的消除显著增加了胫骨前纵截面中肌肉纤维的厚度,如扩大的暗A带和亮I带所证明的,暗A带和亮I带分别代表肌球蛋白丝和肌动蛋白丝(图2F)。这些结果得到显示以下数据的支持:ALCAT1缺陷显著增加ALCAT1敲除小鼠中的瘦肉质量。而且,ALCAT1的消除显著增加mtDNA拷贝数(图2G)。显著地,ALCAT1缺陷还显著提高mtDNA保真性,如通过从ALCAT1敲除小鼠分离的MEF中显著降低的mtDNA突变率所证明的(图2H)。
[0211] ALCAT1调节MFN2表达的关键作用:MFN2是线粒体和内质网形态和作为功能桥的-/-栓系所需的。来自MFN2 小鼠的MEF展示出片段化线粒体和扩大的ER池,类似于ALCAT1过表达引起的缺陷。下一个问题是ALCAT1过表达和缺陷是否相反地影响MFN2和线粒体融合过程的其他调节剂的表达。如图3A所示,与载体对照相比,ALCAT1过表达引起C2C12-A1稳定细胞系中超过70%的MFN2 mRNA耗尽和50%的MFN1和OPA1 mRNA的减少。相反,ALCAT1缺陷显著增加MFN2 mRNA转录,同时从ALCAT1敲除小鼠分离的MEF中MFN1 mRNA水平显著增加(图3B)。然而,ALCAT1缺陷对内线粒体融合所需的OPA1的mRNA表达没有任何影响。
[0212] 与降低的mRNA水平一致,ALCAT1过表达也显著下调所有三种蛋白的表达。具体地,与载体对照相比,MFN2显示显著减少74.6%,随后是MFN1(38.0%)和OPA1(12%)(图3C)。相反,MFN2蛋白水平在从ALCAT1敲除小鼠分离的MEF中上调超过600%(图3D,图
3E中定量)。ALCAT1缺陷也显著增加了最佳线粒体形态和呼吸所需的MFN1和抑制蛋白、线粒体膜伴侣蛋白的表达。相反,ALCAT1缺陷没有影响OPA1或钙联结蛋白、ER驻留蛋白的表达(图3E)。
[0213] ALCAT1通过MFN2耗尽而损害线粒体融合:ALCAT1引起MFN2耗尽和线粒体片段化的发现促进了对ALCAT1调节线粒体融合的作用的考察。线粒体基质靶向EGFP(mtEGFP)或红色荧光蛋白(mtRFP)单独地在C2C12-A1和C2C12-V2细胞中转染,随后通过在共聚焦显微镜下测量EGFP和RFP的重叠进行融合分析。如图4A-4C所示,载体对照C2C12细胞中的线粒体说明了正常的线粒体融合,如图4C(图4D中突出显示)中合并图像的黄色所证明的,其证明了完全融合。相反,C2C12细胞中的ALCAT1过表达引起严重的融合缺陷(图4E-4H),如通过图4G(图4H中突出显示)中合并图像的完全分开的绿色和红色所证明的。
直接支持MFN2缺陷在融合缺陷中的诱发作用,C2C12-A1细胞中MFN2的瞬时表达完全拯救了融合缺陷,如图4K(图4L中突出显示)中合并图像的黄色所支持的。MFN2表达还引起线粒体的超级融合,这得到过表达MFN2的C2C12-A细胞中较厚线粒体管状网络的支持(图
4I-4K)。
[0214] MFN1/2而非OPA1拯救ALCAT1引起的线粒体片段化:因为MFN2可以拯救ALCAT1引起的融合缺陷,问题是发动蛋白相关家族的其他成员例如MFN1和OPA1是否也可以通过恢复C2C12-A1细胞中线粒体网络而拯救融合缺陷。如上所示,与载体对照(图5A&5B)相比,ALCAT1过表达引起C2C12-A1细胞中线粒体片段化(图5C&5D)。相反,C2C12-A1细胞中MFN1的瞬时表达几乎完全拯救融合缺陷,如管状线粒体的恢复所示(图5E&5F)。再次,MFN2的瞬时表达完全拯救融合缺陷,导致线粒体的超级融合(图5G&5H)。
[0215] 相反,OPA1的瞬时表达未能拯救任何融合缺陷(图5I&5J),这与ALCAT1缺陷缺乏对MEF中OPA1表达的任何效应相一致(图3B&3E)。结果证明,ALCAT1介导的融合缺陷限于其中ALCAT1定位的外线粒体膜。
[0216] MFN2拯救ALCAT1过表达引起的线粒体呼吸缺陷:接下来考察MFN2表达是否也能恢复C2C12-A1细胞中的线粒体呼吸功能。ALCAT1通过增加线粒体质子漏而引起线粒体功能障碍。通过分析响应于不同线粒体抑制剂治疗的耗氧率(OCR)变化而质问MFN2表达在C2C12-A1细胞中对质子漏的作用。使用Seahorse Extracellular Flux(XF-24)分析仪,显示ALCAT1过表达显著减少线粒体最大容量,如响应于线粒体解偶联剂FCCP治疗而减少的OCR所指示的(图6A)。MFN2而非EGFP载体对照的瞬时表达完全恢复线粒体呼吸容量,如OCR相对于载体对照的恢复所证明的(图6A)。与复合物I作为ROS生成的主要部位一致,响应于复合物I(NADH CoQ1还原酶)抑制剂鱼藤酮的治疗,ALCAT1过表达显著增加OCR,提供了线粒体质子漏的证据。支持MFN2缺陷在氧化应激中的诱发作用,MFN2在C2C12-A1细胞中的瞬时表达完全正常化OCR(图6B)。而且,响应于线粒体ATP酶抑制剂寡霉素的治疗,ALCAT1过表达还显著增加OCR,进一步指示质子漏。还通过MFN2的瞬时表达完全正常化该缺陷(图6D)。相反,响应于复合物III抑制剂抗霉素治疗,ALCAT1或MFN表达都没有对来自复合物III的OCR有任何影响。
[0217] ALCAT1关联氧化应激与线粒体片段化和MFN2缺陷:来自氧化应激的受损线粒体融合通过开放线粒体通透性转换孔而引起线粒体膨胀。受损的线粒体通常产生更多ROS,其进一步恶化线粒体功能障碍,导致恶性循环。因为通过ALCAT1的CL重塑引起氧化应激,问题是ALCAT1是否在该恶性循环中起作用,这在从ALCAT1敲除和对照小鼠分离的MEF中测试。如图7A(图7C中突出显示)所示,来自对照小鼠的MEF表现出响应于H2O2治疗的严重线粒体膨胀,如通过扩大线粒体和受损嵴所证明的。ALCAT1过表达在相对于载体对照表现出最高的ALCAT1表达的C2C12稳定细胞系之一中引起严重的线粒体膨胀(图10)。由于该极端特征,该C2C12细胞系不用于本研究。相反,ALCAT1缺陷完全预防了线粒体膨胀(图7B,图7D中突出显示)和响应于H2O2治疗的分离MEF中的线粒体片段化(图9A-9D)。
[0218] 支持通过ALCAT1的CL重塑作为氧化应激的主因,ALCAT1过表达显著增加C2C12-A1细胞中的脂质过氧化,其被H2O2治疗剂量依赖性恶化,如脂质过氧化终产物丙二醛(MDA)升高水平所示(图7E)。线粒体经历快速片段化,伴随ROS生成的增加。接下来的问题是,ALCAT1是否会通过ROS生成引起MFN2缺陷。用如图7E使用的增加剂量的H2O2治疗C2C12-A1细胞和载体对照,随后通过western印迹分析来分析MFN2表达。如图7F所示,H2O2剂量依赖性地减少载体对照细胞中的MFN1和MFN2表达。所述治疗还进一步恶化ALCAT1对MFN1和MFN2消耗的影响,导致C2C12-A1中MFN2表达的完全消失。最后,直接支持通过ALCAT1的氧化应激作为MFN消耗的主因,C2C12-A1细胞与抗氧化剂二亚苯基碘鎓(DPI)预孵育剂量依赖性地预防响应于与图7F使用相同的H2O2治疗的MFN表达损失(图
7G)。
[0219] 讨论:
[0220] 当线粒体经历引起参与线粒体区室变得连续的融合事件时形成动态网络。融合事件允许每个网络的组分分享溶质、代谢物和蛋白。因此,此类网络的分布引起氧化应激和线粒体片段化,其已经牵涉入衰老和年龄相关疾病的病因学。然而,关于潜在机制知之甚少。目前的研究考察了ALCAT1在调节常与年龄相关疾病有关的氧化应激和线粒体片段化中的作用。首次证明了ALCAT1调节线粒体生物发生和mtDNA保真性的关键作用。因此,ALCAT1过表达严重损害线粒体融合,导致线粒体片段化和mtDNA消耗。相反,小鼠中ALCAT1的靶向失活显著增加线粒体质量并预防线粒体ROS诱导的线粒体膨胀和片段化。惊人地,证明了ALCAT1调节mtDNA保真性的作用,这被之前的研究确证,线粒体融合是保证mtDNA保真性的所需的(Chen H等人.(2010)Cell 141(2):280-289)。
[0221] 支持ALCAT1在线粒体融合中的作用,目前研究鉴定MFN2为ALCAT1介导的线粒体功能障碍的下游靶。MFN2是哺乳动物中线粒体融合、与ER栓系、能量代谢和mtDNA保真性所需的(Chen H等人.(2010)Cell 141(2):280-289,22;de Brito OM&Scorrano L(2008).Nature 456:605-610)。ALCAT1过表达严重减少了C2C12细胞中的MFN2表达,而ALCAT1缺陷显著增加了从ALCAT1敲除小鼠分离的MEF中的MFN2表达。相反,ALCAT1缺陷对OPA1表达没有任何影响,OPA1表达是内线粒体膜融合所需的。结果提供证据,ALCAT1仅影响ALCAT1定位的外线粒体膜的融合(Li J等人.(2010)Cell Metab 12(2):154-165),这由之前报道进一步确证,25%CL位于发生活性CL重塑的外膜(Gebert N等人.(2009)Curr Biol19(24):2133-2139)。与MFN2作为ALCAT1介导的融合缺陷的下游靶一致,小鼠中MFN2的靶向失活引起多个暗示ALCAT1过表达的线粒体缺陷,包括高mtDNA突变率、mtDNA耗竭、片段化线粒体和线粒体与ER之间栓系的明显损失。MFN2缺陷还引起骨骼肌萎缩,这与ALCAT1缺陷显著增加ALCAT1敲除小鼠中骨骼肌质量的发现一致(Li J等人.(2010)Cell Metab
12(2):154-165,Chen H等人.(2010)Cell 141(2):280-289)。直接支持MFN2作为ALCAT1的下游靶,ALCAT1引起的融合缺陷可以通过MFN1或MFN2而非OPA1的表达来拯救。而且,MFN2表达还恢复了线粒体呼吸容量并预防C2C12细胞中ALCAT1过表达引起的质子漏。这些结果与MFN2缺陷显著增加质子漏的发现一致(Bach D等人.(2003)J Biol Chem 278(19):
17190-17197),而MFN2的过表达阻断高血糖诱导的ROS生成(Yu T,Robotham JL,&Yoon Y(2006)Proc Natl Acad Sci U S A 103(8):2653-2658)。
[0222] 线粒体分裂/融合机制控制高血糖相关疾患中ROS的急性和慢性生成(YuT,Robotham JL,&Yoon Y(2006)Proc Natl Acad Sci U S A 103(8):2653-2658)。线粒体经历快速片段化,伴随响应于氧化应激的增加的ROS生成,这可以通过抑制融合过程的分裂或刺激而减轻。目前的研究鉴定ALCAT1为代谢疾病中线粒体融合缺陷和ROS生成之间丢失的联系。首先,通过ALCAT1的CL重塑显著增加CL中的DHA含量,导致质子漏和氧化应激。线粒体膜中的DHA含量与寿命负相关,并且与哺乳动物中的ROS生成和脂质过氧化指数正相关。因此,CL中增加的DHA含量增加脂质过氧化指数,已经牵涉入衰老和年龄相关疾病中的线粒体功能障碍(Han X等人.(2007)Biochemistry 46(21):
6417-6428;Sparagna GC&Lesnefsky EJ(2009)J Cardiovasc Pharmacol 53(4):290-301;
Lee H-J,(2006)Lipids Health&Dis.5:2;Paradies G等人,(2010)Free Radic Biol Med
48(10):1286-1295;Shi Y(2010)J Biomed Res 24(1):6-15)。其次,ALCAT1过表达引起C2C12细胞中严重的脂质过氧化,这进一步通过氧化应激加剧。最后,直接支持通过ALCAT1的氧化应激作为融合缺陷的主因,ALCAT1过表达显著减少MFN2表达,这可以通过用抗氧化剂预治疗C2C12细胞来减轻。总之,这些发现支持ALCAT1通过年龄相关疾病中MFN2耗竭而联系ROS生产与线粒体片段化的关键作用,如图7H所示。
[0223] ALCAT1在线粒体融合中的调节作用通过最近对MitoPLD(CL代谢中涉及的一种线粒体PLD)的研究进一步强调(Choi SY等人.(2006)Nat Cell Biol8(11):1255-1262)。Mito-PLD定位于线粒体外膜,它在这里催化CL水解产生磷脂酸,线粒体融合所需的一种融合脂质。惊人地,MitoPLD缺陷引起暗示ALCAT1过表达的线粒体功能障碍,包括受损的融合和线粒体片段化。然而,潜在机制存在显著差异。例如,MitoPLD在MFN2下游发挥作用,并且MitoPLD表达可以拯救MFN缺陷引起的融合缺陷。此外,与ALCAT1相反,MitoPLD过表达或缺陷不改变MFN1和MFN2蛋白表达水平。而且,MitoPLD过表达引起超级融合,伴随温和CL缺陷。最后,MitoPLD最近已经证明了调节piRNA稳定性和小鼠雄性不育的作用(Huang H等人.(2011)Dev Cell 20(3):376-387)。本文发现证明,通过ALCAT1的CL重塑调节独立于磷脂酸生成的线粒体融合。
[0224] 衰老和年龄相关疾病的发作与氧化应激和增加的mtDNA突变率有关,已经提出氧化应激和增加的mtDNA突变率为衰老和年龄相关疾病的主因。此外,MFN2缺陷已经牵涉入年龄相关的代谢疾病。重要的是,目前研究已经鉴定了ALCAT1在控制mtDNA保真性和MFN2表达中的重要作用。本文的发现对阐释衰老和年龄相关疾病发作的潜在分子机制的未来研究具有重要意义。支持ALCAT1在年龄相关疾病发作中的作用,ALCAT1表达被氧化应激和年龄相关的代谢疾病发作所上调。ALCAT1的靶向失活预防肥胖及其相关线粒体功能障碍的发作。因此,可以想象,ALCAT1的化学抑制剂的开发将在未来提供对衰老和年龄相关疾病的潜在治疗。
[0225] 实施例2:通过ALCAT1的心磷脂重塑通过对氧化应激和线粒体自噬的作用而调节心肌病
[0226] 使用具有甲状腺机能亢进的小鼠作为氧化应激和线粒体功能障碍的啮齿类动物模型,本研究考察了ALCAT1在与甲状腺机能亢进相关的心肌病中的作用。结果首次证明,ALCAT1在调节经由氧化应激和线粒体自噬的甲状腺激素诱导的心脏肥大发作中的关键作用。
[0227] 材料和方法
[0228] 试剂:本研究中 使用的抗 体包括针 对以下的 多克隆抗 体:磷 酸基-AKT(Thr308)、AKT、磷酸基-S6K1(Thr389)、S6K1、磷酸基-S6(Ser240/244)、S6、磷酸基-4E-BP1(Thr37/46)、4E-BP1,其全部购自Cell Signaling Technology(Danvers,MA)。
抗LC3抗体购自Novus Biologicals,并且抗p62抗体购自American Research Products Inc(Belmont,MA)。PINK1多克隆抗体(A01)购自Abnova。猴抗兔IgG辣根过氧化物酶轭合的抗体购自GE Healthcare(Piscataway,NJ)。L-甲状腺素(T4)和3,3’,5-三碘代-L-甲状腺原氨酸钠盐(T3)来自Sigma。
[0229] H9c2稳定细胞系的产生:H9C2用FLAG标签化的ALCAT1表达载体或作为对照的空载体稳定转染。通过G418(1mg/ml)筛选稳定转染子并在Dulbecco改良的Eagle培养基(Gibco)中培养,所述培养基补充了10%热失活的胎牛血清、1%青霉素和链霉素,37℃下维持在95%空气和5%CO2中。
[0230] 动物护理:如之前描述产生靶向清除ALCAT1基因的小鼠(Li J等人.(2010)Cell Metab 12(2):154-165)。为了诱导甲状腺机能亢进心肌病,将雄性ALCAT1敲除小鼠年龄匹配的WT小鼠(8-9周大)分成两组。一组用0.01N NaOH和0.9%NaCl的媒介物中甲状腺激素(左旋甲状腺素,Sigma CAS 51-48-9,每天通过i.p.注射1mg/kg体重)治疗2天或4周。小鼠对照组用相同媒介物注射相同持续时间。所有动物维持在环境受控的设施中,具有每日光循环,并自由获取水和标准啮齿类动物食物(Harland Teklad 2018,Madison,Wisconsin)。所有涉及动物的实验依照根据NIH指南(NIH出版号86-23,1985)批准的机构动物护理和使用方案进行。
[0231] 回波心脏描记术:在4周的甲状腺激素治疗之后,腹膜内注射戊巴比妥钠(75μg/g体重)来轻度麻醉小鼠。使用具有14-MHz线性转换器的acuson sequoia模型512回波心脏描记术系统(Siemens,Malvern,PA)进行经胸腔的回波心脏描记术研究。测量以下参数:舒张末期心室内间隔壁厚度(IVSD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)、舒张末期后壁厚度(LVPWD)。
[0232] 定量PCR分析:如之前描述进行定量PCR分析(Li J等人.(2010)CellMetab12(2):154-165)。使用线粒体编码的NADH脱氢酶1(ND1)作为mtDNA标志物并使用亲环蛋白-A作为基因组标志物,进行载体和ALCAT1过表达H9c2细胞中线粒体
拷贝数的分析。用0.1、0.25、0.5mM的H2O2预治疗H9c2细胞2h,随后使用ND1(正向:
5’-TGACCCATAGCCATAATATGATTT-3’(SEQ ID NO:1) 和 反 向:5’-TTCTACGTTAAACCCTGATACTAA-3’(SEQ ID NO:2))和亲环蛋白-A(正向:5’-ACACGCCATAATGGCACTCC-3’(SEQ ID NO:3)) 和 反 向:5’-CAGTCTTGGCAGTGCAGAT-3’(SEQ ID NO:4)) 的 引 物对 进 行 RT-PCR 分 析。 使 用 β-MHC( 正 向:5'-AGGGCGACCTCAACGAGAT-3'(SEQ ID NO:5), 反 向:5'-CAGCAGACTCTGGAGGCTCTT-3'(SEQ ID NO:6))、BNP( 正 向:
5'-GCTGCTTTGGGCACAAGATAG-3'(SEQ ID NO:7), 反 向:5'-GGAGCTCTTCCTACAACAACTT-3'(SEQ ID NO:8))、ANF( 正 向:5'-GTGTACAGTGCGGTGTCCAA-3'(SEQ ID NO:9), 反 向:5'-ACCTCATCTTCTACCGGATC-3'(SEQ ID NO:10))、ACTA1( 正 向:
5'-GTTCGCGCTCTCTCTCCTCA-3'(SEQ ID NO:11),反向:5'-GCAACCACAGCACGATTGTC-3'(SEQ ID NO:12))、胶 原 蛋 白 I( 正 向:5'-GAGCGGAGAGTACTGGATCG-3'(SEQ ID NO:13),反 向:5'-GTTCGGGCTGATGTACCAGT-3'(SEQ ID NO:14))、 胶 原 蛋 白 III( 正 向:
5'-ACCAAAAGGTGATGCTGGAC-3'(SEQ ID NO:15),反向:5'-GACCTCGTGCTCCAGTTAGC-3'(SEQ ID NO:16))和GAPDH(正向:5'-AATGGTGAAGGTCGGTGTG-3'(SEQ ID NO:17),反向:5'-GTGGAGTCATACTGGAACATGTAG-3'(SEQ ID NO:18))的引物对进行生物标志物的定量PCR分析。
[0233] 脂质过氧化测定:使用TBARS试剂盒(Cayman Chemical Company,目录号10009055)根据生产商说明书,通过测量硫代巴比土酸反应性物质(TBARS)的水平来定量心室组织和H9c2细胞中脂质过氧化产物。
[0234] 活性氧类(ROS)测量:通过定量测量过氧化氢(H2O2),直接检测从线粒体的细胞内活性氧类(ROS)生成。
[0235] 线粒体的EM分析:使用电子显微照片评价小鼠心肌细胞中的线粒体超微结构。在每组三只小鼠的左心室相同部位取心脏样品以制备载玻片。将心脏左心室片段在含有
0.05%CaCl2的0.1M二甲胂酸钠缓冲液(pH7.4)中5%戊二醛和4%低聚甲醛中固定24h。
用0.1M二甲胂酸钠缓冲液洗涤之后,将组织在1%OsO4和0.1M二甲胂酸盐缓冲液中后固定过夜,脱水并包埋于Embed 812。切片用2%乙酸双氧铀、随后0.4%柠檬酸铅染色,并用Philips 400电子显微镜观察。
[0236] 统计分析:数据表示为平均值±SEM。使用双尾非配对t检验进行统计比较以评价两种H9c2细胞系之间和ALCAT1敲除小鼠与野生型小鼠之间的差异。为了在更多组中比较,使用单因素方差分析,并且考虑统计学显著性为p<0.05。
[0237] 结果
[0238] ALCAT1调节心脏脂质过氧化和mtDNA生物发生:心脏中的ALCAT1表达被氧化应激和甲状腺机能亢进心肌病的发作上调。本文研究显示,ALCAT1的异常表达在心肌病发作中起诱发作用。首先,考察了H9c2心脏细胞系中ALCAT1过表达对细胞形态和线粒体功能的作用。为此,产生了用flag标签化ALCAT1 cDNA(ALCAT1)或载体对照稳定转染的H9c2心脏细胞系。稳定的H9c2细胞系中ALCAT1的mRNA表达水平仅三倍于载体对照,其模拟分离的心肌细胞中氧化应激诱导的内源性ALCAT1的上调水平(Li J等人.(2010)Cell Metab12(2):154-165)。使用者两种稳定的H9c2细胞系作为基于细胞的模型,首先分析了ALCAT1对脂质过氧化和mtDNA拷贝数的作用。如图11A所示,与载体对照相比,ALCAT1过表达显著增加了脂质过氧化副产物硫代巴比土酸反应性物质(TBARS)的细胞内水平。响应于H2O2治疗进一步加剧了TBARS的产生,证明ALCAT1在心肌病中氧化应激中的诱发作用。
[0239] 为了揭示ALCAT1对线粒体ROS释放的直接作用,在表达ALCAT1的H9c2细胞系和载体对照中分析线粒体ROS生成率。在测定开始后的固定时间点,在从H9c2细胞分离的分离线粒体中分析H2O2生成率。结果显示,ALCAT1过表达使相对ROS释放率显著增加3.77倍(P<0.01)(图11B)。氧化应激引起mtDNA不稳定,其已经牵涉入年龄相关的代谢疾病中的线粒体功能障碍。进一步支持ALCAT1作为氧化应激的主要来源,响应于增加剂量的H2O2治疗,ALCAT1过表达导致H9c2细胞中mtDNA耗竭(图11C)。此外,ALCAT1过表达还引起H9c2细胞的肥大生长(图18A)。而且,ALCAT1过表达引起H9c2细胞缺陷性分化为心肌细胞(图11E&11F),如缺少肌细胞生成素的表达所证明的,肌细胞生成素是分化的H9c2细胞的关键指示剂(图18B)。
[0240] 甲状腺机能亢进引起氧化应激和脂质过氧化。使用ALCAT1敲除小鼠,分析了在与心肌病发作相关的条件下,ALCAT1缺陷对心脏脂质过氧化的影响。与报道的甲状腺机能亢进对氧化应激的影响一致,甲状腺机能亢进显著增加了心脏中脂质过氧化的水平(图11D)。相反,ALCAT1的靶向失活完全预防响应于甲状腺机能亢进心肌病发作的心脏脂质过氧化,进一步证实了ALCAT1在与心肌病相关的氧化应激中的诱发作用。
[0241] ALCAT1的靶向失活预防甲状腺机能亢进心肌病的发作:氧化应激和线粒体功能障碍已经牵涉入心肌病。使用敲除小鼠,接下来考察了ALCAT1在甲状腺机能亢进心肌病发作中的作用。ALCAT1敲除小鼠和WT(WT)小鼠用甲状腺激素(T4)治疗连续2或28天,以观察急性和慢性甲状腺机能亢进对心脏功能、线粒体功能障碍和与心脏肥大相关的信号传导途径的影响。通过在慢性治疗末期进行的回波心脏描记术来评估心脏功能。在媒介物组中,ALCAT1敲除小鼠和WT小鼠的心脏形态和回波心脏描记参数没有显著区别,所述回波心脏描记参数包括室间隔缺陷(IVSD)、左室舒张末期内径(LVEDD)和左室后壁厚度(LVPWD)。结果证明,ALCAT1不是心脏发育或正常心脏功能所需的(图12A-12E)。然而,WT小鼠在4周T4治疗之后发展了心脏肥大(图12A),如心脏重量与体重比率(图12B)、IVSD(图12C)、LVEDD(图12D)和LVPWD(图12E)的明显增加所证明的。相反,ALCAT1缺陷预防T4诱导的心脏肥大及其回波心脏描记参数的相关变化。结果提供证据,上调的ALCAT1表达促进甲状腺机能亢进诱导的心肌病发作。
[0242] ALCAT1的消除减轻心肌细胞的T4诱导的肥大生长:心脏肥大的特征为终末分化的心脏细胞的尺寸增加,作为对各种生理和病理生理刺激的适应反应。因为ALCAT1过表达引起H9c2细胞的肥大生长,接下来确定ALCAT1缺陷是否预防心肌细胞的T4诱导的肥大生长。如图13A-13G所示,ALCAT1敲除小鼠和WT小鼠在甲状腺机能正常条件下心肌细胞尺寸没有显著差异。与肥大生长一致,心肌病的发作显著增加WT小鼠中心肌细胞的尺寸(图13B)。相反,与具有甲状腺机能亢进的WT小鼠相比,ALCAT1敲除小鼠中心肌细胞的肥大生长显著减弱(图13D)。这些观察进一步得到细胞面积(图13E)、直径(图13F)和心肌细胞尺寸分布(图13G)的定量分析结果所支持。
[0243] ALCAT1缺陷预防T4诱导的心室纤维化:心脏肥大的发展引起心肌的结构重塑,导致I型和III型胶原蛋白纤维的过度累积。心室纤维化也是心力衰竭和其他心脏并发症发展的主要危险因素。为了提供ALCAT1作为心肌病调节剂的进一步证据,确定了ALCAT1在调节左心室中I型和III型胶原蛋白沉积的作用。通过来自ALCAT1敲除小鼠和WT小鼠的左心室切片的Masson三色染色来分析心脏纤维化。如图14B所示,与媒介物对照相比,如大面积蓝色染色所示,用甲状腺激素治疗WT小鼠28天,引起严重的心室纤维化,作为心肌病的后果(图14A)。相反,ALCAT1缺陷显著减少甲状腺机能亢进引起的纤维化(图14D),再次暗示ALCAT1表达在甲状腺机能亢进心肌病中心脏功能不全中的作用。与胶原蛋白沉积的发现一致,甲状腺机能亢进显著增加WT小鼠中I型和III型胶原蛋白的mRNA表达,但在ALCAT1敲除小鼠中没有(图14E&14F)。
[0244] ALCAT1消除使与心肌病相关的生物标志物的表达正常化:病理状态例如甲状腺机能亢进引起的持久性肥大最终导致心力衰竭,是工业化国家中主要的死亡原因。升高的脑利钠肽(BNP)是指示心力衰竭的特定测试。BNP是响应于心室体积膨胀、压力过度负荷和导致的增加的壁张力而特别从心室分泌的心脏神经激素。肥大性心肌病的发作还与胎儿基因子集的诱导有关,包括心房利钠因子(ANF)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)和骨骼肌α-肌动蛋白(ACTA1)。为了鉴定ALCAT1在心脏肥大进展中的作用,分析了心脏肥大和心力衰竭的这些标志的RNA表达。持久性甲状腺机能亢进显著增加了WT小鼠中所有肥大生物标志物的RNA表达(图15A-15D)。尽管甲状腺机能亢进还增加了ALCAT1敲除小鼠中生物标志物的表达,但是当与对照组比较时减少了该效应。相反,当用媒介物治疗时,WT和ALCAT1敲除小鼠的生物标志物表达没有显著差异,进一步证实了ALCAT1在甲状腺机能亢进心肌病病因学中的作用。
[0245] ALCAT1的失活通过刺激PINK1表达而预防线粒体膨胀和线粒体自噬:选择性线粒体自我吞噬还称为线粒体自噬,通过消除受损线粒体而有助于保持线粒体质量。线粒体自噬还通过减少线粒体ROS生成和线粒体DNA突变而在保持线粒体量和质量中发挥重要作用。因此,自噬的心脏特异性缺陷引起心肌病。使用心室切片的EM分析,确定了ALCAT1在线粒体功能障碍和与甲状腺机能亢进心肌病相关的自噬中的作用。与甲状腺机能亢进中严重的氧化应激一致,甲状腺机能亢进心肌病的发作与WT小鼠中线粒体膨胀、嵴断裂和线粒体异常结构相关(图16A,图16B中突出显示)。相反,这些损伤通过ALCAT1缺陷而大大减轻(图16C,图16D中突出显示)。作为对受损线粒体的补偿性反应,WT小鼠中自噬体标志物心脏LC3的表达水平被甲状腺机能亢进显著上调(图16E,图16F中定量)。而且,与自噬负相关的p62蛋白的表达在WT小鼠中显著更低。支持这些观察,当与ALCAT1敲除小鼠比较时,响应于甲状腺机能亢进的发作,WT小鼠中自噬线粒体的数目显著更高(图20)。
[0246] PTEN诱导的假定激酶1(PINK1)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其通过促进经由线粒体自噬对受损线粒体的清除而预防细胞应激过程中的线粒体功能障碍。PINK1缺陷引起氧化应激和线粒体自噬,导致小鼠中的心肌病。进一步支持ALCAT1在线粒体功能障碍中的诱发作用,心脏PINK1表达被ALCAT1缺陷显著上调,这与ALCAT1敲除小鼠中氧化应激和线粒体自噬水平降低一致(图16E,图16G中定量)。这些发现提供证据,通过ALCAT1的氧化应激在与甲状腺机能亢进心肌病相关的线粒体功能障碍和线粒体自噬中起关键作用。
[0247] 通过ALCAT1的氧化应激调节心肌病中的Akt-mTOR信号转导途径:甲状腺机能亢进通过刺激心肌细胞中的蛋白合成而导致心肌病。为了鉴定ALCAT1在肥大生长中作用的潜在分子机制,分析ALCAT1过表达和缺陷对细胞生长和增殖中涉及的信号转导途径的效应,包括H9c2细胞中和具有甲状腺机能亢进的小鼠中Akt、Erk、S6K和4E-BP1的磷酸化。增加的ROS水平导致胰岛素抵抗,其在心脏功能不全中发挥诱发作用。如图17A所示,用胰岛素治疗H9c2细胞,剂量依赖地刺激载体对照细胞中Akt和Erk的磷酸化。相反,ALCAT1过表达显著减少胰岛素刺激的Akt磷酸化,同时消除Erk磷酸化,提供了严重胰岛素抵抗的证据(图17A)。而且,通过ALCAT1的慢性氧化应激还完全预防H9c2细胞中Akt、S6K和4E-BP信号传导通路的T3诱导的激活(图17B)。与ALCAT1过表达引起的H9c2细胞的肥大生长一致,S6K和4E-BP的基础磷酸化显著高于表达ALCAT1的H9c2细胞。支持H9c2细胞中的发现,用甲状腺激素短期治疗小鼠刺激了ALCAT1敲除小鼠和WT小鼠中的心脏Akt-mTOR磷酸化(图20)。然而,慢性甲状腺机能亢进引起心肌病发作对Akt-mTOR信号传导途径的显著下调,如通过显著更低的Akt和4E-BP的磷酸化所证明的(图17C)。甲状腺机能亢进还下调了Gsk3的磷酸化,Gsk3的缺陷引起心脏病。与缺乏心脏肥大一致,ALCAT1缺陷完全预防了由心脏甲状腺机能亢进诱导的这些信号传导蛋白的磷酸化的下调。
[0248] 讨论
[0249] CL重塑在调节心脏功能中起重要作用,心脏是具有来自氧化磷酸化的持续高能量需求的组织。CL的生物功能由其脂肪酰基链的结构决定。心脏中,功能性的CL富集亚油酸,其在支持线粒体酶和蛋白活性中是重要的(Claypool SM&Koehler CM.Trends Biochem Sci.2012年1月;37(1):32-41)。因此,作为病理性重塑后果的TLCL(心脏的标签CL)的缺失已经牵涉入心肌病和心力衰竭的病因学。然而,负责心脏疾病中CL的病理性重塑的酶还不清楚。ALCAT1是催化有害的CL重塑的溶血心磷脂酰基转移酶,导致心脏病中常见的异常CL物类的产生(Li J等人.(2010)Cell Metab 12(2):154-165)。在本研究中使用稳定表达ALCAT1的H9c2心脏细胞和具有ALCAT1基因的靶向失活的小鼠,研究了ALCAT1过表达和缺陷在甲状腺机能亢进引起的心肌病发展中的作用。这些结果首次鉴定了ALCAT1在调节肥大性心肌病发作中的关键作用。因此,ALCAT1的过表达引起H9c2细胞的肥大生长,而ALCAT1的消除预防了T4诱导的心肌病及其相关心脏功能不全的发作,包括心室肥大、心室纤维化和I型和III型胶原蛋白升高的表达。此外,ALCAT1缺陷还正常化肥大生物标志物的表达,包括BNP、β-MHC、ANF和ACTA1,其通常被心肌病的发作上调。支持ALCAT1在肥大性心肌病病因学中潜在的诱发作用,ALCAT1 mRNA表达被心脏中发作心肌病显著上调。而且,通过ALCAT1的CL重塑引起TLCL清楚,这已经被鉴定为Barth综合征中心肌病的主要原因。
[0250] 甲状腺机能减退显著增加已知引起CL过氧化和心力衰竭的氧化应激(Drummond GR等人,(2011)Nat Rev Drug Discov 10(6):453-471;Lesnefsky EJ等人.(2004)Am J Physiol-Heart&Cir Physiol 287(1):H258-267)。认为年龄相关疾病中病理性CL重塑通过CL中DHA含量富集而加剧ROS生成。支持该假设,CL中DHA含量显著增加脂质过氧化指数,其已经牵涉入衰老和年龄相关疾病中的线粒体功能障碍。因此,衰老的发作还与心脏TLCL清除相关,同时伴随CL中DHA富集。此外,线粒体膜DHA含量与寿命负相关,并且与ROS生成和脂质过氧化指数正相关。因此,已经鉴定增加的DHA含量和CL过氧化为与甲状腺机能亢进、糖尿病、缺血-再灌注损伤和心力衰竭中心脏异常相关的常见缺陷。支持ALCAT1作为T4诱导的心肌病中氧化应激的关键调节剂,通过ALCAT1的CL重塑增加了CL中的DHA含量,而ALCAT1的靶向清除显著增加了ALCAT1敲除小鼠中TLCL的心脏水平。与这些发现一致,来自本研究的结果显示ALCAT1的过表达引起H9c2心脏细胞系中严重的氧化应激、脂质过氧化和mtDNA清除,导致受损分化成心脏肌管。直接支持ALCAT1作为甲状腺机能亢进中氧化应激的主要调节剂,ALCAT1表达的消除完全预防甲状腺机能亢进引起的心脏脂质过氧化。
[0251] 线粒体自噬靶向防御氧化应激、线粒体功能障碍和衰老。人和啮齿类动物中,心脏线粒体自噬被心脏肥大和心力衰竭发作上调。自我吞噬的缺失引起酵母中严重的氧化应激和小鼠心肌病。PINK1是突变时引起帕金森病的线粒体自噬的关键调节剂。PINK1还在正常心脏功能中起重要作用。PINK1通过调节线粒体自噬而促进受损线粒体的清除来防御线粒体功能障碍和氧化应激。因此,在人心力衰竭末期下调PINK1表达,而小鼠中的PINK1缺陷引起氧化应激、线粒体自噬和心肌病。进一步支持ALCAT1在心肌病发病中的诱发作用,本研究鉴定了ALCAT1作为心脏中线粒体自噬和PINK1表达的关键调节剂。证明,心肌病发作显著增加了线粒体自噬线粒体数目,这得到自我吞噬生物标志物的变化所支持,包括LC3和p62蛋白的表达。相反,ALCAT1的消除预防线粒体与甲状腺机能亢进心肌病相关的氧化应激。ALCAT1缺陷也显著下调LC3的表达,同时伴随p62蛋白增加的表达。惊人地,ALCAT1缺陷显著增加了PINK1的表达,这与PINK1抗氧化应激和心肌病的保护作用一致。这些发现进一步得到小鼠中升高的线粒体自噬水平和心肌病的支持,靶向清除TAZ基因,TAZ基因的突变引起Barth综合征中的TLCL缺陷。
[0252] 心肌病的发作通过激活Akt-mTOR和Erk途径而刺激心肌细胞的蛋白合成。Akt信号传导途径的激活预防细胞免受氧化应激诱导的细胞凋亡,而mTOR激活是心肌细胞肥大生长所需的。然而,慢性甲状腺机能亢进引起心力衰竭晚期Erk、Akt和mTOR途径的显著下调。因此,用雷帕霉素治疗预防T4诱导的心肌病的发作,而小鼠中mTOR的靶向失活导致特征为细胞凋亡、线粒体自噬和线粒体膨胀的严重扩张性心肌病。支持ALCAT1在心肌病中氧化应激中的作用,在过表达ALCAT1的H9c2细胞中和具有甲状腺机能亢进的小鼠中发现慢性氧化应激显著损害了T4诱导的Akt和下游信号传导组分例如GSK-3β、mTOR和S6激酶的磷酸化。H9c2细胞中通过ALCAT1的氧化应激还引起了严重的胰岛素抵抗,其在心肌病中起主要作用。相反,ALCAT1的消除预防了心肌病发作并恢复了ALCAT1敲除小鼠中的Akt-mTOR信号传导途径。
[0253] 重要的是,本发现对揭示其他形式心血管疾病例如糖尿病性心肌病、缺血性再灌注和心力衰竭的原因的潜在分子机制的进一步研究具有额外意义,因为氧化应激和病理性CL重塑已经牵涉入这些病理状态的病因学。支持该假设,ALCAT1通过氧化应激和糖尿病和肥胖的发作上调。ALCAT1的靶向失活预防线粒体功能障碍和肥胖发作,其是2型糖尿病和心血管疾病的主要诱发因素。ALCAT1的抑制剂的开发将提供对发达国家主要的死亡原因心脏肥大和其他心脏疾病的潜在治疗。
[0254] 本公开的摘要允许读者快速确定本技术公开的性质。要理解,其不是用于解释或限制以下权利要求的范围或含义。
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