Protein hydrolysates produced using marine proteases

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】 本発明は、タンパク質を加水分解する方法と、この方法により得られるタンパク質加水分解物と、本発明による加水分解物を含む食品および非食品製造物に関する。 【０００２】 【従来の技術】 タンパク質を加水分解する方法は、当該分野において良く知られている。 従来、タンパク質加水分解物は、環流条件下に塩酸を用いて、例えば脱脂大豆粉または小麦グルテンのようなタンパク質またはタンパク質性材料の加水分解により化学的に製造されている。 得られる加水分解物は廉価であり、満足できる感覚刺激特性を有することができる。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】 しかしながら、化学的加水分解は、例えば、その存在が食品において望ましくないモノクロロジヒドロキシプロパノール（ＭＣＤＰ）およびジクロロプロパノール（ＤＣＰ）のようなクロロヒドリンの形成を引き起こす非特異的副反応により達成される。 食品産業は、食品を変性させて、過酷な化学反応条件の必要性および副反応産物および残留試薬の除去の必要性を低下させる穏やかな方法を必要としている。 【０００４】 また、タンパク質またはタンパク質性材料は酵素的に加水分解することができる。 典型的には、適切なタンパク質源は、一種または二種以上の適当なエンドプロテアーゼを用いて（部分的）加水分解に付される魚である。 得られるタンパク質フラグメントは、エキソペプチダーゼの使用により個々のアミノ酸またはジペプチドもしくはトリペプチドに完全または部分的に分解することができる。 あるいは、エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼとが酵素混合物中で同時に作用して、タンパク質またはタンパク質性材料を同様に完全または部分的に分解させることができる。 【０００５】 タンパク質およびタンパク質性材料の酵素的加水分解における基本的問題は、
短いペプチドフラグメントの形成に起因する苦味の形成である。 苦味は、疎水性側鎖を有するアミノ酸においてタンパク質が分解し、その三次構造によりタンパク質および長いペプチドにおいて典型的には接触することができない露出された疎水性側鎖を有するペプチドが形成される結果であると考えられている。 【０００６】 この問題を解決するために、今の技術において、特別のプロテアーゼを用いて、加水分解の程度を制限し好ましい末端側鎖を得ることが提案されている。 例えば、米国特許５，８６６，３５７は、加水分解物の調製のためにＧｌｕ／Ａｓｐ
特異的プロテアーゼを用いること、任意にさらなる特異的プロテアーゼを用いることを記載している。 さらに、例えばＷＯ９８／２７８２７号公報は、この問題を解決するために、１つのエキソペプチダーゼのみを含むタンパク質分解性酵素混合物を用いることを提案しており、このエキソペプチダーゼは、ｒＤＮＡ技術を用いて製造され、Ｆｒｏｍａｓｅ（登録商標）（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ
、仏）およびＭａｘａｔａｓｅ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ、ベルギー）のような適当なエンドペプチダーゼの一種または二種以上と組み合わせて用いることができる。 米国特許第５，５３２，００７号は、精製された酵素、バチルス菌株により製造し得る中性プロテアーゼおよびバチルス菌株により製造し得るアルカリ性プロテアーゼを組み合わせて用いることを開示している。 この発明の目的のために、エンド活性を排他的に有するプロテアーゼを用いて生肉を好ましく処理して肉水解物を得ることが述べられている。 Ｗ
Ｏ９４／２５５８０号公報に開示された方法は、エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼとの混合物を含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ菌（Ｆｌａ
ｖｏｒｚｙｍｅ（登録商標））から誘導されるタンパク質分解性酵素製剤を用いている。 【０００７】 また、欧州特許０ ８２３ ９９８ Ａ２は、苦い味のしないタンパク質加水分解物の生成のためのタンパク質またはタンパク質性材料としてのスモークされた肉を酵素的に加水分解することを提案している。 この方法においては、加水分解のために、１つのみの酵素、好ましくはエンドペプチダーゼ効果を有する中性またはアルカリ性プロテアーゼ、例えば、Ｐｅｓｃａｌａｓｅ（Ｇｉｓｔ Ｂｒ
ｏｃａｄｅｓ）、Ａｌｃａｌａｓｅ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）またはＰｒｏ
ｍｏｄ３１（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ）を用いることが好ましい。 【０００８】 ＷＯ８９／１０９６０号公報は、産業プロセスにおける生物学的材料のタンパク質、ペプチドおよび／または脂質成分を変性させるために、オキアミからの複合酵素混合物を用いることを提案している。 開示された酵素組成物は、細断された南極オキアミ全体（Ｅｕｐｈａｓｉａ ｓｕｐｅｒｂａ）を５０℃で２０時間インキュベーションすることにより調製される。 魚および肉の加水分解のような種々の用途の例が記載されている。 オキアミ酵素製剤は、異なるプロテアーゼおよび脂質分解酵素、例えば、かなりの量のホスホリパーゼを含むといわれている。 そのような製剤は、食品級加水分解物の製造のために商業的規模で使用されてはいなかったようである。 これらの従来技術の参考例の全てにおいて、加水分解物は５０〜６５℃の酵素的インキュベーションにより得られていることに注目すべきである。 【０００９】 例えば、海産食品スープおよびソースのような天然産物から得られるまたは天然産物を擬似する多くの風味のある加工された食品製品の製造において、香味剤抽出物は、苦くない特性を有するのみならず、天然産物の特徴的風味と同じまたは非常に類似の風味も呈しなければならない。 最も質の高いレストランは、なお、殻、はさみ、頭部などから貯蔵品を作る従来の方法を用いて例えば貝スープの抽出物を調製している。 酵素的に調製された香味剤は、満足できる天然風味を提供しないようなので、通常、広く用いられてはいなかった。 【００１０】 魚および他の海産食物種の臭いは、揮発性化合物の複合混合物により生み出され、種の新鮮さに影響を与える条件に非常に敏感である。 新しい魚における種に関する臭気化合物は、非常に低水準で存在するが、そのような化合物の多くが、
低い臭気境界を有し、そのために、低水準（ｐｐｂ）で存在しても、魚種の香り全体になお影響を及ぼし、その濃度の変化は香り全体に劇的な影響を与える。 これらの化合物は、６、８または９個の炭素原子を有する不飽和カルボニル化合物およびアルコールを含む。 また、低濃度のブロモフェノールが、海産食物の天然の、海の、ヨウ素のおよび海洋性の風味と関係していた。 魚の損傷時に微生物化合物が微生物的に生成される。 これらは、短鎖アルコール、ケトン、アルデヒド、アミン、硫黄化合物、芳香族および酸を含み、主に、アミノ酸および脂肪酸の分解により生じる。 タンパク分解活性は、小さなペプチドおよび遊離アミノ酸が細菌の栄養であるため、損傷を促進し、悪臭代謝が生じる。 従って、海産食物および関連するタンパク質材料の加水分解の条件を注意深く選択することは、望ましい感覚刺激特性を有する高品質食品製品用のそのような加水分解物の製造に非常に重要である。 ５０〜６５℃の範囲の温度における長時間のインキュベーションは、揮発性化合物の損失および望ましくない副反応産物の製造故に、特に魚および他の海産食物材料の、加水分解されるタンパク質含有材料の全体的な風味および芳香特性を低下させるようである。 【００１１】 穏やかな条件下にタンパク質を加水分解して、高い収率を得、優れた感覚刺激特性を有する加水分解物を得る、特に、海産食物のようなタンパク質含有出発材料の天然風味を保存しているが、タンパク質含有材料の従来の加水分解中に生じる苦い風味を有さない加水分解物を得るための方法が必要とされている。 低い酵素的インキュベーション温度で加水分解物を得るための方法は、おそらくは低水準の副反応および微生物的活性故に原料の新鮮さおよび風味（揮発性香味剤）を保存することができ、新鮮な腸から誘導され経済的かつ技術的に簡単な方法で得ることができる比較的非特異的な酵素製剤を、タンパク質性材料の効果的加水分解のために用いて、苦くない加水分解物を得ると共にタンパク質含有原料の優れた風味特性を維持することができるとわかった。 本発明の特に有利な局面は、そのような製剤がタンパク質分解的に活性である低い温度範囲である。 本発明の方法およびプロセスが好ましく実施される低い温度範囲は、得られる生成物の感覚刺激特性に寄与する重要な因子であると考えられる。 【００１２】 【課題を解決するための手段】 従って、第一の態様において、本発明は、天然タンパク質含有原料からタンパク質加水分解物を製造する方法を提供し、当該方法は、ａ）１〜１００重量％のタンパク質含有材料を含んで成る水性スラリーを製造する工程と、ｂ）魚に由来するタンパク質分解組成物を使用してスラリーをインキュベートする工程と、ｃ
）約０℃〜約６０℃の温度で１５分〜４８時間にわたってスラリーを撹拌する工程と、ｄ）任意に、タンパク質分解混合物を不活性化する工程と、ｅ）任意に、
固体物質から溶液部分を分離する工程とを含んで成る方法である。 【００１３】 他の態様において、本発明は、本発明の方法によって得られるタンパク質加水分解物を提供する。 【００１４】 さらに他の態様において、本発明は、本発明によって得られるタンパク質加水分解物を含んで成る食品を提供する。 【００１５】 さらに他の態様において、本発明は、本発明によってタンパク質加水分解物を得る工程と、当該加水分解物を使用して食品を配合する工程を含んで成る食品の製造方法を提供する。 【００１６】 本発明の他の態様において、香味剤の製造方法を提供し、当該方法は、ａ）１
〜１００重量％のタンパク質含有材料を含んで成る水性スラリーを製造する工程と、ｂ）魚に由来するタンパク質分解組成物を使用してスラリーをインキュベートする工程と、ｃ）約２℃〜約４０℃の温度において１５分〜４８時間にわたってスラリーを撹拌する工程と、ｄ）任意に、タンパク質分解混合物を不活性化する工程と、ｅ）固体物質から溶液部分を分離する工程と、ｆ）該溶液を、約１０
重量％〜約９８重量％の乾燥重量分に濃縮する工程とを含んで成る方法である。 【００１７】 本発明のさらに他の態様において、本発明のタンパク質加水分解物を含んで成る非食品製造物を提供する。 【００１８】 さらに他の態様において、本発明は、アスタキサンチン含有貝物質から少なくとも一部のアスタキサンチンを分離する方法を提供し、当該方法は、貝物質を含んで成る水性スラリーを出発物質として製造する工程と、魚に由来するタンパク質分解組成物を使用してスラリーをインキュベートする工程と、約２℃〜６０℃
の温度でスラリーを撹拌する工程と、タンパク質分解混合物を不活性化して、出発物質と比較してより多い含有量の分離アスタキサンチンを含有するタンパク質加水分解物を得る工程とを含んで成る方法である。 【００１９】 【発明の実施の形態】 本発明のタンパク質分解組成物は、冷水魚の腸から誘導され、特に、低温での高活性のような特別の特徴を提供する。 タラ（Ｇａｄｕｓ Ｍｏｒｈｕａ）の腸からのタンパク質分解製剤の詳細な特徴として、製剤が複数のタンパク質分解成分を含む。 この製剤は、少なくとも５種類またはそれ以上のタンパク質分解酵素成分または群を含むことがわかった。 これらのタンパク質分解成分または群は、
エンドペプチダーゼのトリプシン、少なくとも３つのアイソザイム（Ａｓｇｅｉ
ｒｓｓｏｎら、１９８９年）、キモトリプシン、少なくとも２つのアイソザイム（ＡｓｇｅｉｒｓｓｏｎおよびＢｊａｒｎａｓｏｎ、１９９１年）、およびエラスターゼ、少なくとも１つのアイソザイム（ＡｓｇｅｉｒｓｏｎおよびＢｊａｒ
ｎａｓｏｎ、１９９３年）、およびアミノペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼ型のエキソペプチダーゼを含む。 【００２０】 そのような製剤は、前記個々の酵素成分の有用な供給源として作用するのみならず、驚くべきことに、それらを、特別の特性を有するタンパク質加水分解物、
すなわち苦くなくタンパク質含有原料の風味特性を維持するタンパク質加水分解物の製造に効率良く用い得ることがわかった。 【００２１】 前述したように、本発明は、天然タンパク質含有原料からタンパク質加水分解物を製造する方法を提供する。 この方法は、第１段階として、タンパク質含有材料を約１〜１００重量％、好ましくは約１０〜１００重量％、例えば、約２５〜
１００重量％含む水性スラリーの調製することを含む。 この材料は、機械的破砕、切断、きざみまたは粉砕のような従来の手段により前処理することができる。
スラリー中のタンパク質含有材料の含量は、水含量および材料のきめに依存し、
例えば、乾燥重量含量が約１８〜２５重量％である白身魚の身を加水分解する際、さらなる水は必要とされない場合がある。 しかしながら、高乾燥重量含量の材料を加水分解する際、スラリーの乾燥重量含量を約１〜３０％、好ましくは約５
〜２５％、例えば、約１０〜２０％とするためにスラリーに水を加える。 【００２２】 その後、スラリーは、魚から誘導されたタンパク質分解製剤と共にインキュベーションされ、スラリーは１５分〜４８時間、好ましくは約１〜１０時間、より好ましくは約１〜６時間、例えば、２〜４時間撹拌される。 インキュベーションは、酵素組成物が熱不活性化されない任意の従来の温度、すなわち、約０℃〜約６０℃、好ましくは、約２℃〜約４０℃、例えば、約５℃〜３５℃、より好ましくは約５℃〜３０℃、例えば、約１０℃〜２５℃、例えば、約１５℃、約１７℃
、約２０℃で行われる。 ある態様において、例えば約２〜１０℃、特に約２〜８
℃のような特に低い温度範囲が望ましいことがある。 通常、より低いインキュベーション温度はより長いインキュベーション時間またはタンパク質分解組成物のより高い相対的濃度または両者で補償される。 約４０℃を下回る温度、特に、約２５〜３０℃を下回る温度のような低いインキュベーション温度は、前述のような食品級加水分解物用に用いられる新鮮な風味のあるタンパク質含有材料の風味よび芳香の維持に寄与する重要な因子であるらしい。 【００２３】 達成された内容によれば、インキュベーション混合物中のプロテアーゼは、タラから誘導されるタンパク質分解製剤についての図２および図３に見られるように、例えば、約７０℃のような約６０℃を超える温度まで迅速に加熱することにより、または、プロテアーゼが不活性化されるｐＨ、例えば、約５より低いｐＨ
までインキュベーション混合物のｐＨを低下させることにより、任意に適当に不活性化することができる。 【００２４】 次に、溶解された加水分解されたペプチドを含む溶液部分を、任意に、例えば、沈殿、濾過または遠心分離により固体材料から分離する。 溶液部分単独においてまたは両方の部分で別々に、そのような分離後に酵素不活性化を任意に行うことができる。 【００２５】 特定のタンパク質含有材料について、加水分解の段階前に材料を加熱して、偶発的な微生物汚染を最少化するおよび／または望ましくは反応を起す他の酵素を不活性化することができる。 発明者は、例えば、ロブスターの身を加水分解するとき、約７０〜９０℃の温度に迅速に加熱すると、さもなければロブスターの身を暗くするフェニルオキシダーゼの活性、および得られる加水分解が除去される。 【００２６】 さらに任意の段階として、減圧下の蒸発的加熱または凍結乾燥のような任意の適用可能な手段により、溶液部分を濃縮して所望の乾燥材料含量にすることができる。 加水分解産物の乾燥材料含量は、所望の形態および生成物の液体含量により、約１〜１００％である。 液体または半液体水解物製剤は、典型的に乾燥材料含量が約５〜４０％、例えば約１５〜３５％である。 加水分解産物は、ゲルまたはペーストである、あるいは、例えばフレーク、粉末または圧縮体のような固体または半固体状態、例えば、錠剤、棒、立方体またはブロックである。 【００２７】 インキュベーションは、約６〜約１１、好ましくは約７〜１０の範囲のｐＨで行われる。 図１および図２のタラ誘導タンパク質分解組成物で示したように、本発明の方法は、かなり極端な条件においても、すなわち６〜１１の全範囲におけるｐＨにおいても、合理的に行われる。 【００２８】 タンパク質分解組成物は、Ｇａｄｉｄａｅ（タラ種およびメルルーサ）およびソコダラを含むＧａｄｉｆｏｒｍ種から誘導される態様において有用である。 Ａ
ｔｌａｎｔｉｃ Ｃｏｄ（Ｇａｄｕｓ Ｍｏｒｈｕａ）は、組成物の容易に入手され特に有用な供給源である。 さらなる態様においてタンパク質分解組成物の供給源として用いられる他の魚類は、ハドック、ポラック（セイス）、サーモン、
マス、パーチ、サバ、サーディン、ニシンおよびカラフトシシャモを含む。 好ましい種は、特に、他の内臓器官から腸を容易に分離することができる種である。 【００２９】 特に有用な態様において、水を魚の内臓と混合する工程と、混合物を０．５時間以上、例えば、約１〜１０時間、好ましくは約２〜６時間撹拌する工程と、例えば、沈殿、濾過または遠心分離により溶液から固体残留物を分離する工程、および水溶液を濃縮してタンパク質分解組成物を得る工程を含んでなる方法によりタンパク質分解組成物が提供される。 この態様における魚の内臓は、魚の腸、例えば、幽門垂を含むが、好ましい態様においては、肝臓、精巣、しらこおよび胃が、調製前に内蔵から除去される。 発明者は、好ましい活性プロテアーゼの大部分が、酸性の低い腸から誘導され、より酸性の強い胃からは誘導されないことを観察した。 濃縮段階は、例えば、限外濾過のような当業者に良く知られた任意の適当な手段により行われ、実施例１に記載のように測定される約０．１〜１００
ＢＡＰＮＡ単位／ｍＬの範囲、より好ましくは、約０．５〜１０ＢＡＰＮＡ単位／ｍＬ、例えば、約１〜５ＢＡＰＮＡ単位／ｍＬのような所望の単位体積当たり活性が得られる。 【００３０】 水−内蔵混合物の撹拌は、所望のプロテアーゼの安定性がその最適値から実質的に低下しないｐＨおよび温度、例えば、０〜２０℃の範囲の温度および６〜１
１の範囲のｐＨにおいて行われる。 好ましい態様において、水−内蔵混合物の撹拌は、約６〜約９の範囲、例えば、約６〜８のような約６〜８の範囲において、
好ましくは約０〜約１５℃、例えば、約０〜１０℃、より好ましくは約０〜５℃
の範囲の温度において行われる。 【００３１】 本発明の一の実施の態様において、タンパク質分解組成物は、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、コラゲナーゼ、アミノペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼ型酵素から選択される少なくとも１つの酵素を含む。 好ましくは、組成物は、前記酵素の二種またはそれ以上、例えば、酵素全てを含む。 しかしながら、ある有用な態様において、タンパク質分解組成物は、その酵素成分の少なくとも一種を除去することによりさらに精製される。 実施例２は、タラから誘導されたタンパク質分解組成物からエラスターゼおよびセリンコラゲナーゼが如何に除去されて、実施例１の基本組成物と同じ特性の多くを有する変性タラ誘導酵素組成物が得られるかを示している。 【００３２】 本発明により用いられるタンパク質分解組成物は、好ましくは、実施例１のアッセイにおいて測定される、約０．１〜１００ＢＡＰＮＡ単位／ｍＬの範囲、より好ましくは、約０．５〜２０ＢＡＰＮＡ単位／ｍＬ、さらにより好ましくは、
約１〜１０単位／ｍＬ、例えば、約１〜５単位／ｍＬのような酵素活性を有する。 タンパク質材料スラリーをインキュベートするための酵素組成物の適当な量は、酵素組成物の特異的活性、加水分解インキュベーション用の所望の時間範囲、
および用いられる特定のタイプのタンパク質原料に依存する。 １つの態様において、スラリーは、タンパク質含有原料１ｋｇ当たり約１〜１００００ＢＡＰＮＡ
タンパク質分解単位、好ましくは約１０〜５００単位／ｋｇ、例えば、約２５〜
２５０単位／ｋｇ、例えば約２５〜１００単位／ｋｇの量でタンパク質分解組成物と共にインキュベートされる。 【００３３】 さらにもう一つの態様において、少なくとも一種の非魚酵素製剤が、タンパク質含有原料とのインキュベーションの前に、魚誘導タンパク質分解組成物に添加される。 そのような、非魚酵素製剤は、市販のプロテアーゼ製剤であるＮｅｕｔ
ｒａｓｅ（登録商標）、Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）およびＦｌａｖｏｒｚｙ
ｍｅ（登録商標）（デンマーク在Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ製）、Ｐｅｓｃａｌ
ａｓｅ（登録商標）およびＦｒｏｍａｓｅ（登録商標）（いずれも、フランス在Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ製）、Ｍａｘａｔａｓｅ（登録商標）（ベルギー在Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）、およびＰｒｏｍｏｄ ３
１（登録商標）（英国在Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ製）のような中性またはアルカリ性プロテアーゼ、真菌リパーゼのようなリパーゼ製剤、例えば、市販のリパーゼ製剤であるＰａｌａｔａｓｅ（登録商標）ＭおよびＰａｌａｔａｓｅ（登録商標）Ａ（いずれも、デンマーク在Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ製）、少なくとも一種のアミラーゼ、グルカナーゼ、グルタミナーゼ、フィターゼ、グリコシダーゼ、セルラーゼ、チキナーゼまたはペクチナーゼを含む糖分解製剤、および前記化合物の任意の組み合わせを含む。 【００３４】 本発明のさらに有用な態様において、魚誘導タンパク質分解組成物での処理の前および／または後に、例えば、前記製剤の一種のような少なくとも一種の酵素製剤を用いて水性スラリーを処理する。 【００３５】 本発明の方法により加水分解されるタンパク質含有材料は、一つの態様において、魚タンパク質、貝タンパク質、乳タンパク質、乳清タンパク質、カゼイン肉タンパク質、血液タンパク質、卵タンパク質、エラスチンおよびゼラチンからなる群より選択される動物タンパク質である。 もう一つの態様において、タンパク質含有材料は、大豆タンパク質、穀類タンパク質、例えば、小麦グルテンまたはゼイン、菜種タンパク質、アルファルファタンパク質、エンドウタンパク質、マメタンパク質、綿実タンパク質、およびゴマタンパク質からなる群より選択される食物タンパク質である。 【００３６】 本発明の特に有用な態様において、タンパク質含有材料は、魚全体、魚身、魚内臓、魚皮膚、魚骨またはその任意の部分または混合物、一種または二種以上の甲殻類から誘導される海洋生物材料、または、エビ、ロブスター、イセエビ、カニ、クラム、カキおよびイガイを含む軟体動物種のような海洋生物材料であり、
材料は、動物全体、身、殻または、その任意の部分、混合物または組み合わせを含む。 【００３７】 さらに有用な態様において、タンパク質含有原料は、魚からのようなタンパク質膜または皮膚、魚肝臓、魚のうきぶくろ、魚の体内腔、魚の卵又はしらこを含む。 【００３８】 もう一つの有用な態様は、子羊、豚、牛、鶏および七面鳥のような動物誘導タンパク質含有原料を使用し、材料は生または、煮沸、油揚または加熱（ｃｕｒｉ
ｎｇ）により料理され、筋肉組織、腱、他の結合組織、骨、くず肉、またはその任意の部分または混合物が含まれる。 【００３９】 本発明の方法は、発酵方法と組み合わせて用いることができる、すなわち、タンパク質材料が発酵条件下に加水分解されて発酵されたタンパク質加水分解物が得られる、および／または、本発明の方法により得られたタンパク質加水分解物が発酵プロセスに付されることがわかった。 そのような発酵方法の例は、魚（例えば、魚ソースの製造において）、ココア豆または大豆（醤油、テンペ、ミソ）
を発酵する方法である。 タンパク質分解酵素製剤の添加またはタンパク質加水分解物の添加は、ニシンの加熱のような発酵の全工程時間を低下させるのに有用である。 【００４０】 もう一つの態様において、本発明は、本発明の方法により得られるタンパク質加水分解物を提供する。 有用な態様において、タンパク質加水分解物は、前述の任意のタンパク質のような動物タンパク質から誘導される。 他の態様は、前述の全てのタンパク質のような食物タンパク質から誘導されるタンパク質加水分解物を含む。 【００４１】 本発明のさらなる態様において、本発明によるタンパク質加水分解物を含む食品製品が提供される。 食品製品に混入されるタンパク質加水分解物の量は、典型的に、約０．１〜５０重量％、例えば、約０．１〜５重量％の範囲である。 【００４２】 本発明の特に有用な態様において、食品製品は、例えば、スープ、ソース、ブロス、パテ、ムース、スフレ、チーズ、揚げ生地、オルリー生地（ｏｒｌｙ ｄ
ｏｕｇｈ）およびペストリーのような食品製品において用いる香味剤である。 【００４３】 本発明のもう一つの食品は、幼児のための母乳代替物の成分である。 本発明の方法により得られる高度の加水分解のために、本発明のタンパク質加水分解物は、母乳代替物に有利に混入することができ、この加水分解物は、非加水分解乳タンパク質よりもアレルゲン性が非常に低い。 【００４４】 本発明のさらにもう一つの食品用製品は本発明のタンパク質加水分解物を含むものであり、タンパク質サプリメントとして食品の他の性質を提供するものである。 すなわち、食品製品に混入されるタンパク質加水分解物は、例えば、魚または魚くず肉、肉または破砕肉に基づき、破砕骨を本発明の方法に付することにより骨から得られる。 魚産業から他のタンパク質性副生物を、本発明の方法により使用して、食品製品の他の特定を提供するためのタンパク質サプリメントとしての本発明のタンパク質加水分解物を得ることもできる。 【００４５】 本発明のさらなる態様は、本発明のタンパク質加水分解物を得る工程、およびこのタンパク質加水分解物を用いて食品製品を調製する工程を含んでなる食品製品を製造する方法を提供する。 本発明の方法により好適に調製される食品製品は、前述の製品の全てを含む。 【００４６】 もう一つの態様において、本発明は、水含量および材料のきめに依存して、１
〜１００重量％、例えば、約２５〜１００重量％のタンパク質含有材料を含む水性スラリーを調製する工程と、魚に由来する誘導されたタンパク質分解組成物と共にスラリーをインキュベーションする工程と、約２〜約４０℃の範囲の温度でスラリーを１５分〜４８時間、例えば、約１〜１０時間、好ましくは約１．５〜
６時間拡販する工程と、任意にタンパク質分解混合物を不活性化する工程と、固体物質から溶液部分を分離する工程と、溶液を約１０重量％〜約９８重量％の乾燥重量含量に濃縮する工程を含んでなる香味剤を製造する方法を提供する。 【００４７】 任意の不活性化工程は、前述のように好適に実施され、同様に、前述したような適当な方法を用いて、撹拌工程および濃縮工程を実施することができる。 魚誘導タンパク質分解組成物は、前述の任意の方法により有利に得られる。 【００４８】 好ましい実施の態様において、タンパク質インキュベーション中の温度は、約５〜３０℃、例えば、約１０〜２０℃または約１０〜３０℃、例えば、１５〜２
５℃である。 インキュベーションは、タンパク質分解組成物が活性である任意のｐＨにおいて行うことができ、一つの態様において、インキュベーション中のｐ
Ｈは約６〜１１、好ましくは約６〜約９である。 【００４９】 有用な実施の態様において、本発明は、タンパク質含有材料が、タラ、ハドック、セイス、オヒョウ、カレイ、ウナギ、アンコウ、サーモン、マス、およびオーシャンパーチ、ニシン、カラフトシシャモから由来する材料のような海洋食物または海洋食物副産物、およびウニ、エビ、ロブスター、イセエビ、カニ、クラム、カキおよびイガイを含む他の海洋食品種から誘導される、海洋食物香味剤用の方法を提供する。 【００５０】 さらなる態様において、本発明の方法は肉香味剤を製造するものであり、タンパク質材料が肉または肉副産物から誘導される。 有利な態様において、タンパク質含有材料は、牛、子羊、豚、トナカイおよび、鶏、七面鳥、アヒルおよびダチョウを含む家禽類の一種または二種以上から誘導される。 【００５１】 さらなる態様において、本発明は、本発明のタンパク質加水分解物を含んでなる非食品製品を提供する。 本発明の方法により得られる風味特性は、飼料製品およびペットフードの製造に有利である。 【００５２】 さらに、魚ゼラチンから由来する高度に加水分解されたタンパク質加水分解物の生成は、クリームおよびシャンプーのような化粧製剤中に組み込むためのゼラチン生成物を改良することができる。 【００５３】 前述の発酵媒体としての本発明のタンパク質加水分解物の使用は、本発明の加水分解物を、他の発酵、例えば、ブロスの発酵のために、特に、薬剤製造のための医薬分野において、さらに有用である。 【００５４】 さらなる態様において、本発明は、アスタキサンチン含有貝物質から少なくとも一部のアスタキサンチンを分離する方法であって、当該方法が、貝物質を含んでなる水性スラリーを出発物質として製造する工程と、魚に由来するタンパク質分解組成物を使用してスラリーをインキュベートする工程と、約２℃〜約６０℃
の温度でスラリーを撹拌する工程、および、タンパク質分解混合物を不活性化して、出発物質と比較してより多い含有量の分離アスタキサンチンを含有するタンパク質加水分解物を得る工程とを含んでなる方法を提供する。 【００５５】 さらなる任意の工程として、この方法は、沈殿、濾過または遠心分離のような任意の適当な手段により、アスタキサンチン含有水性相を分離する工程を含む。 【００５６】 【実施例】 以下の実施例により本発明を説明するが、決して特許請求の範囲を制限するものではない。 【００５７】 実施例１：タラからのプロテアーゼの混合物の調製 肝臓、精巣およびしらこを含まない凍結タラ内臓約１００ｋｇを溶解し、抽出タンク内の４倍体積の飲料水に添加し、水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを８
〜９に調節した。 短時間（約３０分間）の粗沈殿の後、ポンプを用いて水性抽出液を流して残りの不溶性内蔵を取り除き、沈殿タンクに集めた。 水性抽出液を冷却した沈殿タンク中に放置して、約２４〜６０時間沈殿させた。 ポンプを用いて上澄みを上澄みタンクから傾斜して保持タンクに入れた。 上澄みを限外濾過により１０〜２０倍に濃縮し、ダイアフィルトレーションして、約３ｍＳ／ｃｍより低い導電性の許容できるイオン強度水準にした。 約１０〜１５Ｌの限外濾過されダイアフィルトレーションされたプロテアーゼ製剤が得られ、これをＣｒｙｏｔ
ｉｎを称する。 プロテアーゼ製剤は、タンパク質分解活性が約１．５ＢＡＰＮＡ
単位／ｍＬであった。 前述の手順を用いた繰り返し調製により、活性が約１〜５
ＢＡＰＮＡ単位／ｍＬであるバッチ製剤を得た。 【００５８】 ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ，ｐＨ８．１（２５℃）中での最終的基質濃度を１ｍＭとして、合成基質のＢｅｎｚｙｌ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（ＢＡＰＮＡ）を用いるアッセイで活性を測定する。 吸光度増加を４０５ｎｍで測定し、モル吸光度定数８８００Ｍ ^-1 ｃｍ ^-1でＢＡＰＮＡ活性を算出する。 【００５９】 実施例２：濃縮したタラ内臓抽出物からのタラエラスターゼおよびタラ血清コラーゲナーゼの精製 実施例１で得られた限外濾過されダイアフィルトレーションされた濃縮物約１
０〜１５Ｌを、一対の並べて連結した１Ｌ充填クロマトグラフィーカラムに適用した。 一方は、ＣＭファーストフローカチオン交換樹脂（スウェーデン在Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ製）を含み、他方は、ＤＥＡＥファーストフローアニオン交換樹脂（スウェーデン在Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を含んでいた。 カラムを、２．５ｍＭ
塩化カルシウムを含むｐＨ７．８の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（緩衝液Ａ）の１
０カラム体積で予備平衡させた。 濃厚液を、ポンプにより約１００ｍｌ／分の流速でカラムに送った。 カラムへの濃厚溶液の適用が完了すると、約８Ｌの緩衝液Ａを用いて、連続カラムシステムから残留材料を洗い流した。 トリプシン、キモトリプシンおよびエキソペプチダーゼを含む部分を通過する流れを集めて、これをＣｒｙｏｔｉｎ Ｘとする。 【００６０】 この洗浄の完了後、０．５Ｍ ＮａＣｌおよび２．５ｍＭ塩化カルシウムを含むｐＨ７．８の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液の高塩溶液の約５カラム体積で、カラムを個々に溶出した。 このように、タラエラスターゼをＣＭカラムから脱着し、
セリンコラーゲナーゼをＤＥＡＥカラムから脱着した。 【００６１】 実施例３：Ｃｒｙｏｔｉｎを用いるエビ殻由来のタンパク質およびタンパク質性材料の放出および加水分解 エビ殻３０００ｇを水２２５０ｇに添加することによりエビ殻と水を約１：０
． ７５（重量／重量）の比で混合した。 実施例１のＣｒｙｏｔｉｎ酵素混合物１
３０ｍｌは１．４Ｕ／ｍｌ（ＢＡＰＮＡ単位）を含む、すなわち、エビ殻３００
０ｇ当たり合計１８２単位、またはエビ殻１ｇ当たり約０．０６のＢＡＰＮＡ加水分解単位である。 この混合物を、回転ドラム中で、室温（約２０℃）で１分当たり４０サイクルのスピードで５時間撹拌することにより反応させた。 溶液を、
粗いふるいを通す濾過および続いてチーズクロス濾過により、固体残留物から分離した。 ５時間の反応時間中に、反応をモニターするために反応混合物からサンプルを取り出した。 比較の目的から、Ｃｒｙｏｔｉｎ酵素混合物の代わりに水１
３０ｍｌを添加した以外は、同じ材料を用いて反応を繰り返し、測定のためにサンプルを取り出した。 【００６２】 可溶性アミノ酸およびペプチドのためのアッセイにて、ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）沈殿および続いてＦｏｌｉｎ Ｃｉｏｃａｌｅｔｕ'ｓ試薬との反応を用いて、Ｃｒｙｏｔｉｎ反応は、Ｃｒｙｏｔｉｎを用いないバッチと比べて、５時間で６倍を超える可溶性アミノ酸およびペプチドの量を発生したことを示した。 さらに、Ｃｒｙｏｔｉｎ含量バッチは、５時間の反応期間を通して、可溶性アミノ酸およびペピチドを略線形的に発生したが、Ｃｒｙｏｔｉｎを含まないバッチは、反応の最初の１時間のみに可溶性アミノ酸およびペプチドを爆発的に放出した。 このことは、可能性アミノ酸およびペプチドが既に放出されているが、タンパク質が加水分解されていないことを示す。 【００６３】 ４６８ｎｍでの吸光度測定を用いるアスタキサンチンのアッセイを用いて、エビ殻からのその放出をモニターした。 これらの測定は、酵素的Ｃｒｙｏｔｉｎ法を用いると、おそらく機械的せん断力により顔料を最初に放出したＣｒｙｏｔｉ
ｎ非含有法よりも、２．５倍を超える顔料が放出されることを示した。 【００６４】 実施例４：ＣｒｙｏｔｉｎおよびＡｌｃａｌａｓｅ２．４Ｌを用いるエビ殻由来のタンパク質およびタンパク質性材料の可溶化および加水分解の比較 エビ殻６０００ｇを水４５００ｇに添加することによりエビ殻と水を１：０．
７５（重量／重量）の比で混合した。 実施例１のＣｒｙｏｔｉｎ酵素混合物２６
６ｍｌは１１０Ｕ／ｍｌ（Ａｚｏｃｏｌｌ単位）を含む、すなわち、エビ殻６０
００ｇ当たり合計２９２４７Ａｚｏｃｏｌｌ単位、またはエビ殻１ｇ当たり約４
． ８７のＡｚｏｃｏｌｌ加水分解単位である。 この混合物を、回転ドラム中で、
室温（約２０℃）で１分当たり４０サイクルのスピードで５時間撹拌することにより反応させた。 溶液を、粗いふるいを通す濾過および続いてチーズクロス濾過により、固体残留物から分離した。 ５時間の反応時間中に、反応をモニターするために反応混合物からサンプルを取り出した。 【００６５】 比較の目的から、エビ殻−水混合物をＡｌｃａｌａｓｅ２．４Ｌと反応させた以外は、同じ材料を用いて反応を繰り返した。 エビ殻２５００ｇを水１８７５ｇ
に添加することによりエビ殻と水を１：０．７５（重量／重量）の比で混合した。 Ａｌｃａｌａｓｅ２．４Ｌ酵素混合物０．２５ｍｌは４６７９４．６Ｕ／ｍｌ
（Ａｚｏｃｏｌｌ単位）を含む、すなわち、エビ殻２５００ｇ当たり合計１１６
９９Ａｚｏｃｏｌｌ単位、またはエビ殻１ｇ当たり約４．６８のＡｚｏｃｏｌｌ
加水分解単位である。 この混合物を、回転ドラム中で、室温（約２０℃）で１分当たり４０サイクルのスピードで５時間撹拌することにより反応させた。 溶液部分を、粗いふるいを通す濾過および続いてチーズクロス濾過により、固体残留物から分離した。 ５時間の反応時間中に、反応をモニターするために反応混合物からサンプルを取り出した。 【００６６】 ＡｌｃａｌａｓｅはＢＡＰＢＡまたはＧＰＲに非常に低い活性を有することが知られているので、Ａｚｏｃｏｌｌアッセイを用いて、Ａｌｃａｌａｓｅと実施例１のＣｒｙｏｔｉｎの匹敵する活性を測定した。 活性は、以下のようにして測定する。 １５０ｍｇのＡｚｏｃｏｌｌサンプルを秤量して小さなガラス管に入れ、アッセイすべき酵素サンプルの各濃度について２つのＡｚｏｃｏｌｌサンプルとした。 燐酸塩緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）を、最終的合計体積が５ｍｌ
になるように各管に入れた。 緩衝液およびＡｚｏｃｏｌｌのみを用いて管を５〜
１０分間放置した後、アッセイすべき酵素サンプルを管に加えた。 アッセイ混合物に酵素サンプルを添加した後、系を室温で１５分間インキュベートさせ、その後、５２０ｎｍで吸光度を測定した。 結果は、最初は、５２０ｎｍでの吸光度と酵素の量との線形関係として示され、そこから、酵素１ｍｌ当たりのＡｚｏｃｏ
ｌｌ加水分解単位の数を計算した。 １Ａｚｏｃｏｌｌ単位（ＡＵ）は、０．１単位の吸光度の増加を引き起こす。 【００６７】 可溶性アミノ酸およびペプチドのためのアッセイにて、ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）沈殿および続いてＦｏｌｉｎ Ｃｉｏｃａｌｅｔｕ'ｓ試薬との反応を用いて、Ｃｒｙｏｔｉｎ反応は、Ａｌｃａｌａｓｅを用いるバッチと比べて、４時間で８倍を超える可溶性アミノ酸およびペプチドの量を発生したことを示した。 ４
６８ｎｍでの吸光度の測定を用いるアスタキサンチンについてのアッセイを用いて、エビ殻からのその放出をモニターした。 これらの測定は、Ａｌｃａｌａｓｅ
反応と比較して、酵素的Ｃｒｙｏｔｉｎ法を用いると顔料の放出量が１．６倍を超えることを示した。 【００６８】 実施例５：Ｃｒｙｏｔｉｎを用いるエビ殻由来の食品風味剤の製造 エビ殻３９８０ｇを水２５２５ｇに添加することによりエビ殻（約２０％乾燥材料）と水を約１：０．６３（重量／重量）の比で混合した。 実施例１のＣｒｙ
ｏｔｉｎ酵素混合物１６５ｍｌは１．４Ｕ／ｍｌ（ＢＡＰＮＡ単位）を含む、すなわち、エビ殻３９８０ｇ当たり合計２３１単位、またはエビ殻１ｇ当たり約０
． ０５８のＢＡＰＮＡ加水分解単位である。 この混合物を、回転ドラム中で、約１５℃の温度で１分当たり４０サイクルのスピードで４時間撹拌することにより反応させた。 溶液部分を、粗いふるいを通す濾過および続いてチーズクロス濾過により、固体残留物から分離した。 固体残留物を用いてキチン質を製造した。 水性部分を７０℃で１０分間加熱して、酵素を不活性化し、液体を低温殺菌した。
次に、水相を、減圧下に４５℃で蒸発させることにより乾燥材料含量３０％まで濃縮した。 【００６９】 実施例６：Ｃｒｙｏｔｉｎを用いるエビ殻由来の原料としてのタンパク質性材料の放出および加水分解 エビ殻３０００ｇを水１５００ｇに添加することによりエビ殻と水を約１：０
． ５（重量／重量）の比で混合した。 実施例１のＣｒｙｏｔｉｎ酵素混合物１３
０ｍｌは１．４Ｕ／ｍｌ（ＢＡＰＮＡ単位）を含む、すなわち、エビ殻３０００
ｇ当たり合計１８２単位、またはエビ殻１ｇ当たり約０．０６のＢＡＰＮＡ加水分解単位である。 この混合物を、回転ドラム中で、約３０℃の室温で１分当たり４０サイクルのスピードで１０時間撹拌することにより反応させた。 溶液部分を、粗いふるいを通す濾過および続いてチーズクロス濾過により、固体残留物から分離した。 固体残留物を用いてキチン質を製造した。 水性部分を７０℃で１０分間加熱して、酵素を不活性化し、液体を低温殺菌した。 次に、水相を、減圧下に４５℃で蒸発させることにより乾燥材料含量４０％まで濃縮し、その後、濃縮物をドライヤー中でさらに脱水した。 【００７０】 実施例７：エビ全体由来の香味剤 凍結したエビ全体（２２．２％乾燥材料）をグラインダー中で切り刻んだ。 粉砕エビ６７００ｇを水５０１０ｇに添加することにより、粉砕エビと水とを１：
０．７５（重量／重量）の比で混合した。 実施例１のＣｒｙｏｔｉｎ酵素製剤３
１１ｍｌは１．４Ｕ／ｍｌ（ＢＡＰＮＡ単位）を含む、すなわち、粉砕エビ全体６７００ｇ当たり合計４３５．４単位、または粉砕エビ全体１ｇ当たり約０．０
６５のＢＡＰＮＡ加水分解単位である。 この混合物を、回転ドラム中で、約１７
℃の温度で１分当たり４０サイクルのスピードで４時間撹拌することにより反応させた。 溶液部分を、粗いふるいを通す濾過および続いてチーズクロス濾過および１０〜２０分間の沈殿により、固体残留物から分離した。 固体残留物を用いてキチン質を製造した。 水性部分を７０℃で１０分間加熱して、酵素を不活性化し、液体を低温殺菌した。 次に、水相を、減圧下に４５℃で蒸発させることにより乾燥材料含量３０〜４０％まで濃縮した。 【００７１】 インキュベーション温度を２０℃に保ち蒸発的乾燥を５０℃で行った以外は、
同じ割合の原料、水および酵素製剤を用いて実験を繰り返して、本質的に同様の品質の製品を得た。 【００７２】 実施例８：ロブスター由来の香味剤 この製剤においてはロブスターの頭部およびつめを用い、原料は新鮮なものまたは凍結品とする。 凍結したロブスター全体をグラインダー中で切り刻んだ。 粉砕ロブスター８５４０ｇを水６４１０ｇに添加することにより、粉砕ロブスターと水とを１：０．７５（重量／重量）の比で混合した。 ロブスターと水との混合物を９０℃で短時間加熱し（特にロブスター中に存在するフェニルオキシダーゼを不活性化するため）、次に、このサンプルでは３５℃であるプロセス温度まで冷却した。 実施例１のＣｒｙｏｔｉｎ酵素製剤３８５ｍｌは１．４Ｕ／ｍｌ（Ｂ
ＡＰＮＡ単位）を含む、すなわち、粉砕ロブスター全体８５４０ｇ当たり合計５
３９単位、または粉砕ロブスター全体１ｇ当たり約０．０６３のＢＡＰＮＡ加水分解単位である。 この混合物を、回転ドラム中で、約３５℃の温度で１分当たり４０サイクルのスピードで１．５時間撹拌することにより反応させた。 溶液抽出物を、粗いふるいを通す濾過および続いてチーズクロス濾過および１０〜２０分間の沈殿により、固体残留物から分離した。 固体残留物を用いてキチン質を製造した。 水性部分を７０℃で１０分間加熱して、酵素を不活性化し、液体を低温殺菌した。 次に、水相を、減圧下に４５℃で蒸発させることにより乾燥材料含量４
０〜５０％まで濃縮した。 【００７３】 続いて、予備加熱温度を７０℃とし、インキュベーション温度を３０℃に維持した以外は、同じ割合の原料、水および酵素製剤を用いて実験を繰り返して、本質的に同様の品質の製品を得た。 最終濃度段階を５０℃で行って同じ結果を達成して、乾燥材料含量約３０〜４０％の生成物を得た。 【００７４】 実施例９：ポラック由来の香味剤 材料として、ポラックの身、すなわち、ポラックの剥いだヒレ、またはポラックの骨を用いることができ、原料は新鮮なものまたは凍結品とする。 新鮮な剥いだポラックのヒレをグラインダー中で切り刻んだ。 乾燥重量含量が２１％である粉砕ポラックヒレ４７５０ｇを水４６８５ｇに添加することにより、粉砕ポラックヒレと水とを混合した。 実施例１のＣｒｙｏｔｉｎ混合物２９２ｍｌは１．４
Ｕ／ｍｌ（ＢＡＰＮＡ単位）を含む、すなわち、粉砕ポラックヒレ４７５０ｇ当たり合計４０９単位、または粉砕ポラックヒレ１ｇ当たり約０．０８６のＢＡＰ
ＮＡ加水分解単位である。 この混合物を、回転ドラム中で、約２６℃の温度で１
分当たり４０サイクルのスピードで４時間撹拌することにより反応させた。 溶液抽出部分を、粗いふるいを通す濾過および続いてチーズクロス濾過により、固体残留物から分離した。 水性部分を７０℃で１０分間加熱して、酵素を不活性化し、液体を低温殺菌した。 次に、水相を、減圧下に４５℃で蒸発させることにより乾燥材料含量２５〜３５％まで濃縮した。 【００７５】 インキュベーション温度を３０℃に保ち蒸発的乾燥を行って１８〜２５乾燥重量％の生成物を得た以外は、同じ割合の原料、水および酵素製剤を用いて実験を繰り返して、本質的に同様の品質の製品を得た。 【００７６】 実施例１０：エビ全体由来の香味料を用いるエビスープの調製 以下のスープレシピーは、ヒト消費用の食品香味料の抽出物の適用の実施例である。 スープの調製において、抽出物を、以下のレシピーにおけるようにベース材料として用いる、または殆ど調製されたスープに少量添加して最終的な味を得るためのトップ材料として用いることができる。 【００７７】 １２人用のエビスープ 成分： 玉ねぎ ２個 ニンジン ２本 水 ２．５Ｌ（または魚貯蔵物） 魚ブイヨン テーブルスプーン２杯 カレー粉末 テーブルスプーン１杯 実施例７のエビ抽出物 ２５０ｇ 切断したガーリッククラブ（ｇａｒｌｉｃ ｃｌｏｖｅ）１個 溶けたバター １００ｇ＋粉末 １００ｇ クリーム ２００ｍＬ 白ワイン １００ｍＬ 玉ねぎとニンジンを切断し、ソースパンで撹拌しながらいためた。 ソースパンに、水２．５Ｌ（または、魚貯蔵物）、魚ブイヨンをテーブルスプーン２杯、カレー粉末をテーブルスプーン１杯、実施例７のエビ抽出物２５０ｇ、切断したガーリッククラブ１個を添加し、一緒に混合し、２０分間ぐつぐつ煮、次に、スープ貯蔵物をこす。 スープ貯蔵物を、溶けたバター１００ｇと溶融バターに添加した粉末１００ｇの混合物を用いて増粘させる。 クリームを、スープに撹拌して入れ、スープを再び加熱する。 次に、ホワイトソースを加え、エビ全体を装飾のために加えた。 スープは、配膳の用意できている。 【００７８】 実施例１１：タラからのタンパク質分解製剤を用いたイカからの薄膜の除去 各３００ｇの２本の凍結イカ全体を、水４５０ｍＬおよび、実施例１のように製造したタラ由来タンパク質分解組成物約３００ｍＬと一緒に回転ドラム中に入れた、そのｐＨを８．２に調節した。 タンパク質分解組成物は活性が約１０５Ｇ
ＰＲ単位／ｍＬであり、それにより、全タンパク質分解活性が約３１４００ＧＰ
Ａ単位、またはイカ１ｇ当たり約５２ＧＰＲ単位（１．７ＢＡＰＮＡ単位／ｇ）
であった。 インキュベーション中に、数回、ｐＨを８．０に調節した。 温度を１
０℃以下に維持し、イカを調べ、１５、３０、６０、１５０、２１０および３３
０分後にサンプルを採取した。 【００７９】 ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ，ｐＨ８．１（２５℃）中での基質濃度を０．３ｍＭとして、合成基質のＧｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ
−ｐ−ニトロアニリド（ＧＰＲまたはｓＧＰＲｐｎａ）を用いるアッセイで活性を測定する。 吸光度増加を４１０ｎｍで測定し、モル吸光度定数８８００Ｍ ^-1 ｃ
ｍ ^-1でＧＰＲ活性を算出する。 ＧＰＲ単位は、Ｕ _BAPNA ＝Ｕ _GPR ／３１の式に従ってＢＡＰＮＡ単位に換算する。 【００８０】 以下の表は、実験中に行われた観察および測定を列挙する 【００８１】 【表１】

【００８２】 タンパク質分解組成物が、イカの表面上の膜のような粘着性組織からタンパク質性皮膚および膜を効率的に除去する。 タラのしらこの膜袋を分解して、相当する実験を行った。 【００８３】 実施例１２：子羊肉由来の加水分解物の調製 揚げて粉砕した子羊肉１０７ｇを、水１６３ｍＬと混合した。 スラリーの温度は約２５℃であった。 活性が約１．４ＢＡＰＮＡ単位／ｍＬであるＣｒｙｏｔｉ

ｎ７ｍＬをスラリーと混合（すなわち、肉１ｇ当たり０．０９Ｕ）し、ｐＨをＮ

ａＯＨの添加により７．３に調節した。 スラリーを２０℃で４時間撹拌し、分析のために１時間感覚でサンプルを除去した（ｐＨ測定および２８０ｎｍでの吸光度）。 ４時間のインキュベーションの完了後、加水分解物は子羊肉の特徴的風味および芳香を有していた。 表１２．１は、サンプルについての吸光度測定を示し、可溶性ペプチドおよびアミノ酸の放出を示している。 【００８４】 【表２】 【００８５】 生の粉砕子羊肉を用いて実験を繰り返し、同様の結果を得た。 【００８６】 実施例１３：エビおよびロブスター加水分解物の感覚試験実施例７によるエビ香味剤のサンプルを、６人のパネリストからなる試験パネルによる感覚試験に付した。 試験前に、２００ｍＬの水に試験製剤２０ｇを加えることにより製剤を希釈し、約５０℃に加熱した。 サンプルを、小さなプラスチックカップに入れた。 パネリストは、まず、芳香、色および味を判断することによりサンプルを個々に評価し、描写的特徴を記載し、続いて、試験サンプルの全般的感覚特徴を論議した。 実施例１３．１ 個々のパネリストによるコメント列挙 【００８７】 【表３】 【００８８】 続いてパネルは以下の併せた結果となった：エビ味製剤は、非常に特徴的な味およびエビの臭いを有しており、特に、エビ身（魚身も）の味がした。 【００８９】 実施例１４：エラスターゼおよびセリンコラーゲナーゼを含まない精製されたタンパク質分解組成物を用いたタンパク質含有材料の加水分解 加水分解剤として実施例２のタラ由来タンパク質分解組成物（Ｃｒｙｏｔｉｎ

Ｘと称する）を用いる以外は、実施例３〜１３の全ての実験を繰り返す。 実施例１のように測定される実質的に同じタンパク質分解活性の比を用いて、実施例３

〜１３に記載のような対応する結果を得る。 【図面の簡単な説明】 【図１】 実施例１のタラ由来タンパク質分解組成物の安定性を、ｐＨ値６、８および１

０および温度１０℃、３０℃および４５℃での２４時間のインキュベーション後の残留酵素活性を観察することにより、温度および時間の関数として測定した結果を示す図である。 この図から、タンパク質分解組成物が、３つのｐＨ値において同様の安定性特定を有するが、低い温度では高い温度よりも安定性がかなり優れていることがわかる。 酵素活性を、トシルアルギニンメチルエステル（ＴＡＭ

Ｅ）を用いて２４７ｎｍで吸光度を測定することによりモニターした。 最終濃度０．０７５ｍＭとしてＴＡＭＥを用いて２５℃で活性を決め、アッセイ緩衝液は４０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．１および１０ｍＭ ＣａＣｌ

₂からなる。 活性の１単位は、２４７ｎｍでの５４０Ｍ

^-1 ｃｍ

^-1のモル消光係数を用いて１

分当たり加水分解基質１μモルの割合で算出する。 【図２】 実施例１のタラ由来タンパク質分解組成物の活性を、ＴＡＭＥを基質として用いてｐＨの関数として示す図である。 ０．１Ｍの最終濃度で用いた緩衝液は、Ｈ

ｅｐｅｓ／ＨＣｌ（ｐＨ５．４〜８．０）および塩化カルシウム１０ｍＭを含むグリシネート（ｐＨ８．３〜１０．８）であった。 この図から、７〜１０．８のｐＨ領域においてこの組成物が比較的良好なＴＡＭＥ加水分解活性を有しており、約８．０〜１０．５のｐＨで最大となることがわかり、活性は図１の説明に記載のように決められる。 【図３】 実施例１のタラ由来タンパク質分解組成物の活性の温度依存性。 酵素活性を、

最終濃度０．７５ｍＭとしてトシルアルギニンメチルエステル（ＴＡＭＥ）を用いてモニターした図である。 アッセイ緩衝液は４０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐ

Ｈ８．１）および１０ｍＭ塩化カルシウムからなり、活性は２４７ｎｍで吸光度を追跡することによりモニターした。 この図から、組成物の加水分解活性が５０

℃前後で最大に達し、その後、活性は温度変化により迅速に低下することが分かる（実施例１の説明のように活性を決定する）。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書【提出日】平成１３年１０月３日（２００１．１０．３） 【手続補正１】 【補正対象書類名】明細書【補正対象項目名】特許請求の範囲【補正方法】変更【補正の内容】 【特許請求の範囲】 【請求項１】 天然タンパク質含有材料からタンパク質加水分解物を製造する方法であって、当該方法が、 ａ）１〜１００湿潤重量％のタンパク質含有物質を含んで成る水性スラリーを製造する工程と、 ｂ） タラ科に由来するタンパク質分解組成物を使用して前記スラリーをインキュベートする工程と、 ｃ）約２℃〜約６０℃の温度で１５分〜４８時間にわたって前記スラリーを撹拌する工程と、 ｄ）任意に、タンパク質分解混合物を不活性化する工程と、 ｅ）任意に、固体物質から溶液部分を分離する工程とを含んで成ることを特徴とする方法。 【請求項２】 前記タンパク質分解組成物が、タラ、ハドックおよびポラッ<br>クから成る群より選択される魚に由来することを特徴とする請求項１に記載の方法。 【請求項３】 前記タンパク質分解組成物がタラに由来することを特徴とする請求項１に記載の方法。 【請求項４】 前記タンパク質分解組成物を、 ｉ） 水と魚の内臓とを混合する工程と、 ii） 前記混合物を０.５時間またはそれ以上にわたって撹拌する工程と、 iii） 溶液から固体残留物を分離する工程と、 iv） 水溶液を濃縮して、タンパク質分解組成物を得る工程とを含む方法により得ることを特徴とする請求項１に記載の方法。 【請求項５】 約０℃〜約１０℃の温度および約６〜約９のｐＨにおいて前記撹拌を行うことを特徴とする請求項４に記載の方法。 【請求項６】 前記タンパク質分解組成物が、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、コラゲナーゼ、アミノペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼ型酵素から成る群より選択される少なくとも１の酵素を含んで成ることを特徴とする請求項１に記載の方法。 【請求項７】 前記タンパク質分解組成物が、本発明の実施例１の分析において測定した場合に約０.１〜約５０ＢＡＰＮＡ単位/ｍＬのタンパク質分解活性を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。 【請求項８】 前記タンパク質分解組成物が、約０.５〜約１０ＢＡＰＮＡ
単位/ｍＬのタンパク質分解活性を有することを特徴とする請求項６に記載の方法。 【請求項９】 前記タンパク質含有材料が２５〜２５０ＢＡＰＮＡタンパク質分解単位/ｋｇを含む約１０〜１０００ＢＡＰＮＡタンパク質分解単位／ｋｇ
の量にて前記タンパク質分解組成物を用い、前記スラリーをインキュベートすることを特徴とする請求項１に記載の方法。 【請求項１０】 前記タンパク質分解組成物を、その酵素成分の少なくとも一を除去することによってさらに精製することを特徴とする請求項１に記載の方法。 【請求項１１】 少なくとも一の非魚酵素剤を魚類誘導タンパク質分解組成物に添加することを特徴とする請求項１に記載の方法。 【請求項１２】 魚誘導タンパク質分解組成物で処理する前後に、前記水性スラリーを少なくとも一の酵素剤で処理することを特徴とする請求項１に記載の方法。 【請求項１３】 少なくとも一の前記酵素剤がリパーゼ剤であることを特徴とする請求項１１または１２に記載の方法。 【請求項１４】 少なくとも一の前記酵素剤が、アミラーゼ、グルカナーゼ、グルタミナーゼ、フィターゼ、グリコシダーゼ、セルラーゼ、キチナーゼおよびペクチナーゼから成る群より選択される１またはそれ以上の酵素成分を含んで成ることを特徴とする請求項１１または１２に記載の方法。 【請求項１５】 前記工程ｃ）を約２℃〜約４０℃の温度で行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。 【請求項１６】 前記工程ｃ）を約５℃〜約３０℃の温度で行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。 【請求項１７】 前記工程ｃ）を約６ 〜約１１ｐＨ、好ましくは約６〜約９のｐＨで行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。 【請求項１８】 前記タンパク質含有材料が、魚タンパク質、貝タンパク質、乳タンパク質、乳清タンパク質、カゼイン、肉タンパク質、血液タンパク質、
卵タンパク質、エラスチンおよびゼラチンから成る群より選択される動物性タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。 【請求項１９】 前記タンパク質含有材料が、大豆タンパク質、穀類タンパク質、例えば、小麦グルテンまたはゼイン、菜種タンパク質、アルファルファタンパク質、エンドウタンパク質、マメタンパク質、綿実タンパク質、およびゴマタンパク質から成る群から選択される植物性タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。 【請求項２０】 前記タンパク質含有材料が海洋生物物質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。 【請求項２１】 前記海洋生物物質が、魚全体、魚肉、魚の臓物、魚の内臓、魚の皮、魚の骨およびあらゆる部分またはそれらの混合物から成る群より選択される物質であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。 【請求項２２】 前記タンパク質含有材料が、甲殻類および軟体動物から成る群より選択される海洋生物に由来する動物全体、肉、貝殻またはあらゆる部分、それらの混合物または組合せを包含する物質であることを特徴とする請求項２
０に記載の方法。 【請求項２３】 前記甲殻類または軟体動物が、小エビ、ロブスター、イセエビ、カニ、クラム、カキおよびイガイから成る群より選択されることを特徴とする請求項２２に記載の方法。 【請求項２４】 前記タンパク質含有原料が、例えば魚のタンパク質膜または皮、魚の肝、魚のウキブクロ、魚の内部体腔、魚卵または魚精を含んで成ることを特徴とする請求項１８に記載の方法。 【請求項２５】 前記タンパク質含有原料が、子羊肉、豚肉、牛肉、鶏肉および七面鳥を含んで成る群より選択されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。 【請求項２６】 前記タンパク質含有材料が、未処理かまたは調理され、筋肉組織、腱、他の結合組織、骨、臓物およびあらゆる部分またはそれらの混合物を含んで成ることを特徴とする請求項２５に記載の方法。 【請求項２７】 前記タンパク質含有材料を醗酵条件下で加水分解して、醗酵タンパク質加水分解物を得ることを特徴とする請求項１〜２６のいずれか１つに記載の方法。 【請求項２８】 前記タンパク質加水分解物を醗酵工程に付すことを追加工程として含んで成ることを特徴とする請求項１〜２６のいずれか１つに記載の方法。 【請求項２９】 請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法によって得られることを特徴とするタンパク質加水分解物。 【請求項３０】 加水分解タンパク質が、魚タンパク質、貝タンパク質、乳タンパク質、乳清タンパク質、カゼイン、肉タンパク質、血液タンパク質、卵タンパク質、エラスチンおよびゼラチンから成る群より選択される動物性タンパク質に由来することを特徴とする請求項２９に記載のタンパク質加水分解物。 【請求項３１】 前記加水分解タンパク質が、大豆タンパク質、穀類タンパク質、例えば、小麦グルテンまたはゼイン、菜種タンパク質、アルファルファタンパク質、エンドウタンパク質、マメタンパク質、綿実タンパク質、およびゴマタンパク質から成る群から選択される植物性タンパク質に由来することを特徴とする請求項２９に記載のタンパク質加水分解物。 【請求項３２】 請求項２９〜３１のいずれか１項に記載のタンパク質加水分解物を含んで成ることを特徴とする食品。 【請求項３３】 スープ、ソース、ブロス、パテ、ムース、スフレ、チーズ、揚げ生地、オルリー生地およびペストリーから成る群より選択される製品に使用される香味剤であることを特徴とする請求項３２に記載の食品。 【請求項３４】 食品の製造方法であって、当該方法が、（ｉ）請求項２９
〜３２のいずれか１つに記載のタンパク質加水分解物を得る工程と、（ii）当該加水分解物を使用して食品を配合する工程とを含んで成ることを特徴とする食品の製造方法。 【請求項３５】 香味剤の製造方法であって、当該方法が、 ａ）１〜１００湿潤重量％のタンパク質含有材料を含んで成る水性スラリーを製造する工程と、 ｂ） タラ科に由来するタンパク質分解組成物を使用してスラリーをインキュベートする工程と、 ｃ）約２℃〜約４０℃の温度において、１５分〜４８時間にわたって前記スラリーを撹拌する工程と、 ｄ）任意に、タンパク質分解混合物を不活性化する工程と、 ｅ）固体物質から溶液部分を分離する工程と、 ｆ）溶液を、約１０重量％〜約９８重量％の乾燥重量分に濃縮する工程とを含んで成ることを特徴とする方法。 【請求項３６】 前記香味剤が海産食物香味剤であり、前記タンパク質含有材料が海産食物または海産食物副産物に由来することを特徴とする請求項３５に記載の方法。 【請求項３７】 前記香味剤が肉香味剤であり、前記タンパク質含有材料が肉または肉副産物に由来することを特徴とする請求項３５に記載の方法。 【請求項３８】 前記工程ｃ）におけるインキュベーションを、約５℃〜約３０℃の温度で行うことを特徴とする請求項３５に記載の方法。 【請求項３９】 前記工程ｃ）におけるインキュベーションを、約６〜約９
のｐＨで行うことを特徴とする請求項３５に記載の方法。 【請求項４０】 タンパク質分解組成物を請求項４に記載の方法により得ること特徴とする請求項３５に記載の方法。 【請求項４１】 前記タンパク含有物質が、タラ、ハドック、ポラック、オヒョウ、カレイ、ウナギ、アンコウ、サーモン、マス、オーシャンパーチ、ニシン、カラフトシシャモ、ウニ、小エビ、ロブスター、イセエビ、カニ、クラム、
カキおよびイガイを含む群より選択される一またはそれ以上の種類に由来することを特徴とする請求項３６に記載の方法。 【請求項４２】 前記タンパク質含有材料が、牛肉、子羊肉、豚肉、トナカイならびに鶏、七面鳥、アヒルおよびダチョウを包含する家禽を含む群より選択される一またはそれ以上の種類に由来することを特徴とする請求項３７に記載の方法。 【請求項４３】 請求項２９〜３１のいずれか１項に記載のタンパク質加水分解物を含んで成ることを特徴とする非食品製品。 【請求項４４】 前記製品が、飼料製品、ベットフード、化粧品、醗酵ブロスおよび医薬品から成る群より選択されることを特徴とする請求項４３に記載の非食品製品。 【請求項４５】 アスタキサンチン含有貝物質から少なくとも一部のアスタキサンチンを分離する方法であって、当該方法が、貝物質を含んで成る水性スラリーを出発物質として製造する工程と、 タラ科に由来するタンパク質分解組成物を使用して前記スラリーをインキュベートする工程と、約２℃〜６０℃の温度で前記スラリーを撹拌する工程と、タンパク質分解混合物を不活性化して、出発物質と比較してより多い含有量の分離アスタキサンチンを含有するタンパク質加水分解物を得る工程とを含んで成ることを特徴とする方法。 【請求項４６】 アスタキサンチン含有水性相を分離する工程を追加工程として含んで成ることを特徴とする請求項４５に記載の方法。 【手続補正２】 【補正対象書類名】明細書【補正対象項目名】０００８ 【補正方法】変更【補正の内容】 【０００８】 ＷＯ８９／１０９６０号公報は、産業プロセスにおける生物学的材料のタンパク質、ペプチドおよび／または脂質成分を変性させるために、オキアミからの複合酵素混合物を用いることを提案している。 開示された酵素組成物は、細断された南極オキアミ全体（Ｅｕｐｈａｓｉａ ｓｕｐｅｒｂａ）を５０℃で２０時間インキュベーションすることにより調製される。 魚および肉の加水分解のような種々の用途の例が記載されている。 オキアミ酵素製剤は、異なるプロテアーゼおよび脂質分解酵素、例えば、かなりの量のホスホリパーゼを含むといわれている。 そのような製剤は、食品級加水分解物の製造のために商業的規模で使用されてはいなかったようである。 これらの従来技術の参考例の全てにおいて、加水分解物は５０〜６５℃の酵素的インキュベーションにより得られていることに注目すべきである。 ＷＰＩ要約ＡＮ１９９６−４９５７６２（ＲＵ−Ｃ−２ ０５５ ４８２）は 、タンパク質−核酸水解物の製造のためにサーモン由来の幽門部酵素（ｐｙｌｌ ｏｒｉｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）を用いることを記載しているが、低温加水分解は 開示または予測されていない。 米国特許３，８５２，４７９は、タンパク質分解 酵素と共にグルタミナーゼを用いてタンパク質材料を加水分解することにより、 グルタミン酸含量の高いタンパク質水解物を製造する方法を記載している。 ここ でも、５０℃を超える温度が好ましい。 ＣＡ１３１３８５は、甲殻類廃棄物から カロテノイドタンパク質を酵素的に抽出するために、ブタトリプシンまたはＥｎ ｚｅｃｏ ＡＰ−１（登録商標）プロテアーゼ（細菌起源のアルカリホスファタ ーゼ）を用いることを記載している。 これらの参考文献のいずれも、タンパク質 水解物を製造するためにＧａｄｉｆｏｒｍ魚類から由来のプロテアーゼを用いる ことを開示していないし、そのようなまたは他の類似の酵素組成物が低温で効果 的であることを示唆していない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. ⁷識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ２３Ｌ 1/39 Ａ２３Ｌ 1/39 ４Ｃ０８４ Ａ６１Ｋ 7/00 Ａ６１Ｋ 7/00 Ｊ Ｋ Ｎ 7/075 7/075 38/00 Ａ６１Ｐ 3/00 Ａ６１Ｐ 3/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ， ＺＷ Ｆターム(参考） 2B005 AA08 KA02 MA08 MB09 2B150 AB04 AD01 BB03 BC01 CD02 CD19 CD26 CE08 CJ01 CJ04 4B036 LC01 LE02 LF01 LG05 LH37 LK01 LP24 4B047 LB06 LE06 LG54 LG57 LP01 LP07 LP18 4C083 AA071 AD411 AD421 CC01 CC05 CC38 DD31 4C084 AA06 BA03 CA45 CA47 CA62 ZC21