[0001] 本发明涉及包含至少一种磷脂裂解酶和至少一种蛋白酶的组合物。此外，本发明涉及使用根据本发明的组合物使含有甘油三酯的组合物脱胶的方法，以及根据本发明的组合物用于使含有甘油三酯的组合物脱胶的用途。

[0002] 从植物原料尤其是原料植物油获得的甘油三酯包括磷脂、含有蛋白质和碳水化合物的物质、植物胶物质和胶状化合物，其极大降低油的保质期，并降低纯化油的产量。因此，必须除去这些物质。

[0003] 在精炼植物油期间，去除使得油不可用的不需要的杂质。化学和物理精炼有区别。化学精炼由以下过程组成：1.脱胶，期间从油中除去磷脂和金属离子；2.用碱中和，其中提取脂肪酸；3.漂白，除去染料、进一步的金属离子和残留胶物质；4.除臭，蒸气蒸馏，其中进一步去除对油的气味和味道有不利影响的化合物。在物理精炼期间，脱酸在精炼过程结束时与除臭一起进行。

[0004] 可以用水或酸的水溶液提取磷脂来进行油的脱胶，所述酸与Ca2+和Mg2+离子络合，如柠檬酸或磷酸。通常在本文中，首先进行水性的所谓的预脱胶，其去除水溶性磷脂。本文所用的术语是可水合磷脂。

[0005] 可水合和不可水合磷脂的主题描述于例如Nielsen,K.,Composition of difficultly extractable soy bean phosphatides,J.Am.Oil.Chem.Soc.1960,37,217-219和A.J.Dijkstra,Enzymatic degumming,Eur.J.Lipid Sci.Technol.2010,112,1178-
1189。这些尤其是磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇。根据现有技术，用稀释的水性钙和镁络合酸，例如柠檬酸或磷酸处理使不可水合磷脂转化为可水合磷脂。对于食品应用，必须定期说明油中的磷含量降低至10或更少ppm的磷(根据油的ICP-AES分析测定的现有技术)。对于用于例如生产生物柴油的油，要求甚至更加严格。根据EU标准，生物柴油中的磷含量限定为
5ppm，且已经在油方面实施磷降低是有利的。

[0006] 常规的油脱胶方法的一个缺点是水性预脱胶和用水性酸处理均导致油的损耗，其由转移至水中的磷脂在水相中是乳化一些植物油的乳化剂这一事实引起，从而导致植物油的损耗。基于初始使用的原油，这些损耗可以是几个百分点的范围。一般而言，每两个磷脂分子乳化约一个甘油三酯分子(描述于WO08/094847)。

[0007] 所谓的酶促脱胶避免现有方法的一些缺点和/或改进提取方法。

[0008] 使用磷脂酶，主要是磷脂酶A来脱胶原油描述于例如EP 0513709 B1(来自Lurgi,Frankfurt的所谓的 方法)。认为脂肪酸裂解产生溶血卵磷脂，其具有显著较低的乳化油的能力且在水中也具有显著较高的溶解度。因此，提高了油产量，并且改善了难以水合的磷脂在水中的溶解度。涉及油的酶促脱胶的现有技术总结于两篇文献：A.J.Dijkstra,Recent developments in edible oil processing,Eur.J.Lipid Sci.Technol.2009,111,857-864和A.J.Dijkstra,Enzymatic degumming,Eur.J.Lipid Sci.Technol.2010,112,1178-1189。它们讨论了用于油的酶促脱胶的各个磷脂酶以及使用各种酸的预处理方法的优点和缺点。

[0009] 从油产量的角度来看，酶促脱胶使用高度有效的磷脂酶C最有利，所述磷脂酶C产生的产物是溶于油的甘油二酯和非常易溶于水的磷脂酰自由基，例如磷脂酰胆碱(始于卵磷脂)。Verenium在US 7,226,771中描述了这种酶。在Dijkstra的名为“Enzymatic degumming”的综述文献中，列出的该系统的一个缺点是它没有转化所有磷脂，而只转化磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇，而难以水合的乙醇胺和磷脂酸仍然不变。该缺点导致在随后发展中磷脂酶C与磷脂酶A或脂质酰基转移酶的组合。用于使油脱胶的磷脂酶A和磷脂酶C的组合描述于WO 08/094847。该专利的说明书描述，混合磷脂酶A和磷脂酶C一方面对于油产量有协同效应，另一方面可容忍的反应时间下油中的磷含量非常低。

[0010] 磷脂酶C和脂质酰基转移酶的组合描述于WO 2009/081094。同样，它也描述酰基转移酶和磷脂酶C的组合导致油产量增加。油的酶促脱胶的进一步变体是在通过常规方法，例如用水和/或柠檬酸将油脱胶后，酶促处理分离的胶相。借助该处理，可能回收在胶相中乳化的一些植物油。这种方法也在例如综述文献A.J.Dijkstra,Enzymatic degumming,Eur.J.Lipid Sci.Technol.2010,112,1178-1189,p.1184中讨论。

[0011] 此外，PCT/EP2013/053199描述了其中用磷脂裂解酶和糖苷酶的酶组合使原油脱胶的方法。描述于EP 13166529.1的另一种现有技术的方法在酶促脱胶过程中使用磷酸酶。

[0012] 最后，使用磷脂酶与其他脱胶方法相比的持续性方面描述于文献L.De Maria&J.Vind&K.M. &A.Svendsen&S.Patkar,Phospholipases and their industrial applications,Appl Microbiol Biotechnol(2007)74:290-300,pp.96-97。以已经从常规脱胶工艺转化为用磷脂酶A的工艺且其中每年纯化266 000t大豆油的油厂为例，已经表明每年可以节约120 000GJ能量和120 000t CO2当量。节约的CO2当量对应于1600个普通居民的排放量。

[0013] 由于全球食用油消费量增加以及越来越多使用植物油作为化工行业的原料和作为燃料，不断地进一步需要改进含有甘油三酯的组合物，尤其是植物油和/或植物油胶的脱胶。

[0014] 因此，本申请的发明人为他们自己布置了任务：开发替代现有技术中已知的用于使含有甘油酯的组合物，尤其是原植物油脱胶的方法的酶促方法，其进一步降低待脱胶的甘油三酯或含有甘油三酯的组合物中的磷含量、增加油产量和/或提高酶促脱胶的反应速率。同时，在工业规模上应当允许经济地实施该方法。

[0015] 在本发明的上下文中，酶活性定义为由一种或多种催化蛋白质(酶)催化的化学反应。在过程中，酶底物转化为一种或多种产物。特定的酶或酶组合物具有一种或甚至多种酶活性。纯的酶可以催化例如超过一种反应(将底物转化为产物)，因而具有超过一种酶活性。很多酶组合物不是生物化学上的纯产物，因此具有多种酶活性。酶活性与反应速率相关。它表明在酶组合物中有多少活性酶。酶活性的单位是单位(U)，其中1U定义为所述条件下每分钟转化1微摩尔底物的酶的量：1U＝1μmol/min。

[0016] 已经用组合物实现该目的，所述组合物包含含有至少一种磷脂裂解酶的第一酶组分和含有至少一种蛋白酶的第二酶组分(“根据本发明的组合物”)。

[0017] 在本发明的上下文中，“磷脂裂解酶”优选是能够从磷脂切割脂肪酸自由基或磷脂酰自由基或头基的磷脂酶。并且，“磷脂裂解酶”优选酰基转移酶，其中切割脂肪酸自由基的同时转移该自由基，随后在油相中与游离固醇形成酯。

[0018] 磷脂酶是属于水解酶且水解磷脂的酯键的酶。根据其在磷脂中的区域选择性，磷脂酶分为5组：

[0019] 磷脂酶A1(PLA1)，其切割在sn1位点的脂肪酸，形成2-溶血磷脂。

[0020] 磷脂酶A2(PLA2)，其切割在sn2位点的脂肪酸，形成1-溶血磷脂。

[0021] 磷脂酶C(PLC)，其切割磷酸单酯。

[0022] 磷脂酶D(PLD)，其切割或交换头基。

[0023] 磷脂酶B(PLB)，其切割在sn1位点和sn2位点两者上的脂肪酸，形成1,2-溶血磷脂。

[0024] 在本发明的上下文中，酰基转移酶理解为是指将酰基(例如脂肪酸)从磷脂转移至合适受体(例如固醇)形成酯的酶。

[0025] 在一个优选的实施方案中，本发明涉及其中第一酶组分选自以下的组合物：磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶B、磷脂酶D、酰基转移酶及其混合物。本文的酶可以源自任何所需生物(例如也分离自适温生物)或人工来源。本文的酶可以是动物来源(例如来自胰腺)、植物来源或微生物来源(例如来自酵母、真菌、藻类或细菌)。在本发明的上下文中，在各种情况下的酶组分中，可以使用相同类型但来自不同来源或物种的酶。同样还涵盖具有酶活性的两种或多种不同物种的重组嵌合融合蛋白。

[0026] 在本发明的上下文中，使用的磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶B、磷脂酶D、酰基转移酶及其混合物优选来自以下物种：猪胰腺、牛胰腺、蛇毒、蜂毒、曲霉(Aspergillus)、芽孢杆菌(Bacillus)、柠檬酸杆菌(Citrobacter)、梭状芽孢杆菌(Clostridium)、盘基网柄菌(Dictyostelium)、爱德华氏菌(Edwardsiella)、肠杆菌(Enterobacter)、埃希氏菌(Escherichia)、欧文氏菌(Erwinia)、镰刀菌(Fusarium)、克雷伯菌(Klebsiella)、李斯特氏菌(Listeria)、毛霉(Mucor)、眼镜蛇(Naja)、脉孢菌(Neurospora)、毕赤酵母(Pichia)、变形杆菌(Proteus)、假单胞菌(Pseudomonas)、普罗威登斯菌(Providencia)、根毛霉(Rhizomucor)、根霉(Rhizopus)、沙门氏菌(Salmonella)、核盘菌(Sclerotinia)、沙雷氏菌(Serratia)、志贺氏菌(Shigella)、链霉菌(Streptomyces)、嗜热真菌(Thermomyces)、木霉(Trichoderma)、毛癣菌(Trichophyton)、维氏核盘菌(Whetzelinia)、耶尔森氏菌(Yersinia)。

[0027] 特别优选使用来自以下的磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶B、磷脂酶D、酰基转移酶及其混合物：泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、蜂房芽孢杆菌(Bacillus alvei)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、幼虫芽孢杆菌(Bacillus larvae)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)、巴氏芽孢杆菌(Bacillus pasteurii)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、耐热芽孢杆菌(Bacillus sporothermodurans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)、假炭疽芽孢杆菌(Bacillus pseudoanthracis)、无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)、布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)、法氏柠檬酸杆菌(Citrobacter farmeri)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、吉林柠檬酸杆菌(Citrobacter gillenii)、柯氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)、莫林柠檬酸杆菌(Citrobacter murliniae)、鼠柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium)、塞氏柠檬酸杆菌(Citrobacter sedlakii)、魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)、杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)、毛霉状网柄菌(Dictyostelium mucoroides)、多头网柄菌(Dictyostelium polycephalum)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella hoshinae)、鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、栖水肠肝菌(Enterobacter amnigenus)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、日勾维肠杆菌(Enterobacter gergoviae)、中间肠杆菌(Enterobacter intermedius)、梨形肠杆菌(Enterobacter pyrinus)、阿尔伯蒂埃希氏菌(Escherichia albertii)、蟑螂埃希氏菌(Escherichia blattae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、弗格森埃希氏菌(Escherichia fergusonii)、赫氏埃希氏菌(Escherichia hermannii)、塞内加尔埃希氏菌(Escherichia senegalensis)、伤口埃希氏菌(Escherichia vulneris)、梨火疫病菌(Erwinia amylovora)、Erwinia aphidicola、比林欧文氏菌(Erwinia billingiae)、软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、油酸欧文氏菌(Erwinia oleae)、野梧桐欧文氏菌(Erwinia mallotivora)、木瓜欧文氏菌(Erwinia papayae)、桃色欧文氏菌(Erwinia persicina)、Erwinia piriflorinigrans、番石榴欧文氏菌(Erwinia psidii)、亚洲梨火疫病菌(Erwinia pyrifoliae)、大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)、塔斯马尼亚欧文氏菌(Erwinia tasmaniensis)、Erwinia toletana、嗜气管欧文氏菌(Erwinia tracheiphila)、燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)、燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)、厚孢镰刀菌(Fusarium chlamydosporum)、蓝色镰刀菌(Fusarium coeruleum)、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)、双胞镰刀菌(Fusarium dimerum)、变红镰刀菌(Fusarium incarnatum)、异孢镰刀菌(Fusarium heterosporum)、串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)、芜菁状镰刀菌(Fusarium napiforme)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、梨孢镰刀菌(Fusarium poae)、小侧孢镰刀菌镰刀菌(Fusarium sporotrichiella)、三线镰刀菌(Fusarium tricinctum)、层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)、甘蔗镰刀菌(Fusarium sacchari)、茄镰刀菌(Fusarium solani)、拟枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)、亚粘团镰刀菌(Fusarium subglutinans)、烟草镰刀菌(Fusarium tabacinum)、轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、活动克雷伯菌(Klebsiella mobilis)、新加坡克雷伯菌(Klebsiella singaporensis)、肉芽肿杆菌(Klebsiella granulomatis)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、两栖毛霉菌(Mucor amphibiorum)、卷枝毛霉菌(Mucor circinelloides)、冻土毛霉(Mucor hiemalis)、印度毛霉菌(Mucor indicus)、爪哇毛霉菌(Mucor javanicus)、蜂毛霉菌(Mucor mucedo)、Mucor paronychius、梨形毛霉菌(Mucor piriformis)、细孢毛霉菌(Mucor subtilissimus)、总状毛霉菌(Mucor racemosus)、莫桑比克射毒眼镜蛇(Naja mossambica)、非洲脉胞菌(Neurospora Africana)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、Neurospora discrete、Neurospora dodgei、Neurospora galapagosensis、间型脉孢菌(Neurospora intermedia)、Neurospora lineolata、Neurospora pannonica、好食脉孢菌(Neurospora sitophila)、Neurospora sublineolata、陆生脉孢菌(Neurospora terricola)、四孢脉孢菌(Neurospora tetrasperma)、Pichia  barkeri、喜仙人掌毕赤酵母(Pichia cactophila)、Pichia cecembensis、Pichia cephalocereana、Pichia deserticola、角百灵毕赤酵母(Pichia eremophilia)、Pichia exigua、发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)、Pichia heedii、克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)、库德毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)、盔形毕赤酵母(Pichia manshurica)、膜璞毕赤酵母(Pichia membranifaciens)、中濑毕赤酵母(Pichia nakasei)、挪威毕赤酵母(Pichia norvegensis)、东方毕赤酵母(Pichia orientalis)、巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris(Komagataella pastoris))、假喜仙人掌毕赤氏酵母(Pichia pseudocactophila)、Pichia scutulata、Pichia sporocuriosa、陆生毕赤酵母(Pichia terricola)、变形杆菌(Proteus hauseri)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、产黏液变形杆菌(Proteus myxofaciens)、潘纳变形杆菌(Proteus penneri)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)、斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)、内生根毛霉(Rhizomucor endophyticus)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、巴基斯坦根毛霉(Rhizomucor pakistanicus)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、公牛根毛霉(Rhizomucor tauricus)、多变根毛霉(Rhizomucor variabilis)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、无接合孢子根霉(Rhizopus azygosporus)、卷柄根霉(Rhizopus circinans)、日本根霉(Rhizopus japonicus)、小孢根霉(Rhizopus microsporus)、黑色根霉菌(Rhizopus nigricans)、少孢根霉(Rhizopus oligosporus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、希伯来根霉(Rhizopus schipperae)、有性根霉(Rhizopus sexualis)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、木波罗根霉(Rhizopus artocarpi)、邦戈尔沙门氏菌(Salmonella bongori)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)、北方贝核盘霉(Sclerotinia borealis)、币斑病菌(Sclerotinia homoeocarpa)、大豆核盘霉(Sclerotinia libertiana)、小核盘菌(Sclerotinia minor)、Sclerotinia ricini、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、Sclerotinia spermophila、三叶草核盘菌(Sclerotinia trifoliorum)、嗜虫沙雷氏菌(Serratia entomophila)、无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、居泉沙氏雷菌(Serratia fonticola)、格氏沙雷氏菌(Serratia grimesii)、液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、臭味沙雷氏菌(Serratia odorifera)、普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)、变形斑沙雷氏菌(Serratia proteamaculans)、Serratia quinivorans、深红沙雷氏菌(Serratia rubidaea)、Serratia symbiotica、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、产二素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)、金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)、制癌链霉菌(Streptomyces carcinostaticus)、鹿色链霉菌(Streptomyces cervinus)、带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)、达窝链霉菌(Streptomyces davawensis)、弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)、淡紫链霉菌(Streptomyces lavendulae)、林肯链霉菌(Streptomyces lincolnensis)、纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)、结节链霉菌(Streptomyces nodosus)、诺尔斯链霉菌(Streptomyces noursei)、波赛链霉菌(Streptomyces peuceticus)、普拉特链霉菌(Streptomyces platensis)、龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)、壮观链霉菌(Streptomyces spectabilis)、毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)、委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)、紫黑链霉菌(Streptomyces violaceoniger)、紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)、绵毛嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosa)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)、拟康氏木霉(Trichoderma  pseudokoningii)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、绿色木霉(Trichoderma viride)、同心性毛癣菌(Trichophyton concentricum)、Trichophyton eboreum、马发癣菌(Trichophyton equinum)、格威里毛癣菌(Trichophyton gourvilii)、Trichophyton kanei、麦格尼氏发癣菌(Trichophyton megninii)、须疮癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、豆形毛癣菌(Trichophyton phaseoliforme)、鲁比切克毛癣菌(Trichophyton raubitschekii)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、许兰氏毛癣菌(Trichophyton schoenleinii)、猴发癣菌(Trichophyton simii)、苏丹奈斯发癣菌(Trichophyton soudanense)、土发癣菌(Trichophyton terrestre)、断发毛癣菌(Trichophyton tonsurans)、范布瑞西米毛癣菌(Trichophyton vanbreuseghemii)、疣发癣菌(Trichophyton verrucosum)、紫色发癣菌(Trichophyton violaceum)、杨德氏发癣菌(Trichophyton yaoundei)、维氏核盘菌(Whetzelinia schlerotiorum)、阿氏耶尔森氏菌(Yersinia aldovae)、阿里克谢耶尔森氏菌(Yersinia aleksiciae)、伯氏耶尔森氏菌(Yersinia bercovieri)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、费氏耶尔森氏菌(Yersinia frederiksenii)、中间耶尔森氏菌(Yersinia intermedia)、克氏耶尔森氏菌(Yersinia kristensenii)、Yersinia massiliensis、莫氏耶尔森氏菌(Yersinia mollaretii)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)、罗氏耶尔森氏菌(Yersinia rohdei)、鲁氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckeri)、Yersinia similis。

[0028] 在特别优选的实施方案中，使用的磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶B、磷脂酶C和/或磷脂酶D来自：黑曲霉、米曲霉、蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、迟缓爱德华氏菌、草生欧文氏菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、盘基网柄菌、尖孢镰刀菌、肺炎克雷伯菌,单核细胞增生李斯特氏菌、爪哇毛霉菌、蜂毛霉菌、细孢毛霉菌、莫桑比克射毒眼镜蛇、粗糙脉孢菌、巴氏毕赤酵母、假单胞菌属、普通变形杆菌、斯氏普罗威登斯菌、微小根毛霉、少根根霉、日本根霉、匍枝根霉、鼠伤寒沙门氏杆菌、粘质沙雷氏菌、液化沙雷氏菌、大豆核盘霉、福氏志贺氏菌、紫红链霉菌、红色毛癣菌、绵毛嗜热丝孢菌、里氏木霉、维氏核盘菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、猪胰腺、牛胰腺、蛇毒或蜂毒。

[0029] 本文的第一酶组分的至少一种酶可以来自相同或不同来源，优选来自一种或者几种上述生物，特别优选来自黑曲霉、米曲霉、尖孢镰刀菌、莫桑比克射毒眼镜蛇、巴氏毕赤酵母、紫红链霉菌、绵毛嗜热丝孢菌、里氏木霉、猪胰腺或牛胰腺。

[0030] 在本文的上下文中，术语“蛋白酶”理解为是指来自3.4类酶(肽水解酶)的一种或多种酶或酶组合物。这包括术语肽酶和/或蛋白酶。蛋白酶催化肽键水解。本文的酶可以来自动物来源(例如来自胃粘膜)、植物来源或微生物来源(例如来自酵母、真菌、藻类或细菌)。特别地，它可以优选为以下蛋白酶类的一种或多种酶：氨肽酶、天冬氨酸内肽酶、二肽酶、二肽基肽酶、三肽基肽酶、肽基二肽酶、丝氨酸型羧肽酶、金属羧肽酶、半胱氨酸型羧肽酶、Ω肽酶、丝氨酸内肽酶、半胱氨酸内肽酶、天冬酰胺内肽酶、金属内肽酶、苏氨酸内肽酶、内肽酶，特别优选使用天冬酰胺内肽酶、丝氨酸内肽酶或金属内肽酶。

[0031] 在本发明的上下文中，优选使用来自以下物种的特定蛋白酶：哺乳动物的胃粘膜、猪胰腺、牛胰腺、曲霉、芽孢杆菌、柠檬酸杆菌、梭状芽孢杆菌、盘基网柄菌、爱德华氏菌、肠杆菌、埃希氏菌、欧文氏菌、镰刀菌、克雷伯菌、李斯特氏菌、毛霉、眼镜蛇、脉孢菌、毕赤酵母、变形杆菌、假单胞菌、普罗威登斯菌、根毛霉、根霉、沙门氏菌、核盘菌、沙雷氏菌、志贺氏菌、链霉菌、嗜热真菌、木霉、毛癣菌、维氏核盘菌、耶尔森氏菌。

[0032] 特别优选使用来自以下的蛋白酶及其混合物：泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、黑曲霉、米曲霉、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、蜂房芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、幼虫芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、巴氏芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、耐热芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金杆菌、假炭疽芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、无丙二酸柠檬酸杆菌、布氏柠檬酸杆菌、法氏柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、吉林柠檬酸杆菌、柯氏柠檬酸杆菌、莫林柠檬酸杆菌、鼠柠檬酸杆菌、塞氏柠檬酸杆菌、魏氏柠檬酸杆菌、杨氏柠檬酸杆菌、产气荚膜梭菌、盘基网柄菌、毛霉状网柄菌、多头网柄菌、迟钝爱德华氏菌、鮰爱德华氏菌、迟缓爱德华氏菌、栖水肠肝菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、日勾维肠杆菌、中间肠杆菌、梨形肠杆菌、阿尔伯蒂埃希氏菌、蟑螂埃希氏菌、大肠杆菌、弗格森埃希氏菌、赫氏埃希氏菌、塞内加尔埃希氏菌、伤口埃希氏菌、梨火疫病菌、Erwinia aphidicola、比林欧文氏菌、软腐欧文氏菌、草生欧文氏菌、油酸欧文氏菌、野梧桐欧文氏菌、木瓜欧文氏菌、桃色欧文氏菌、Erwinia piriflorinigrans、番石榴欧文氏菌、亚洲梨火疫病菌、大黄欧文氏菌、塔斯马尼亚欧文氏菌、Erwiniatoletana、嗜气管欧文氏菌、燕麦镰刀菌、燕麦镰刀菌、厚孢镰刀菌、蓝色镰刀菌、黄色镰刀菌、双胞镰刀菌、变红镰刀菌、异孢镰刀菌、串珠镰刀菌、芜菁状镰刀菌、尖孢镰刀菌、梨孢镰刀菌、小侧孢镰刀菌镰刀菌、三线镰刀菌、层生镰刀菌、甘蔗镰刀菌、茄镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、亚粘团镰刀菌、烟草镰刀菌、轮枝镰刀菌、产酸克雷伯菌、活动克雷伯菌、新加坡克雷伯菌、肉芽肿杆菌、肺炎克雷伯菌、变栖克雷伯菌、单核细胞增生李斯特氏菌、两栖毛霉菌、卷枝毛霉菌、冻土毛霉菌、印度毛霉菌、爪哇毛霉菌、蜂毛霉菌、Mucor paronychius、梨形毛霉菌、细孢毛霉菌、总状毛霉菌、莫桑比克射毒眼镜蛇、非洲脉胞菌、粗糙脉孢菌、Neurospora discrete、Neurospora dodgei、Neurospora galapagosensis、间型脉孢菌、Neurospora lineolata、Neurospora pannonica、好食脉孢菌、Neurospora sublineolata、陆生脉孢菌、四孢脉孢菌、Pichia barkeri、喜仙人掌毕赤氏酵母、Pichia cecembensis、Pichia cephalocereana、Pichia deserticola、角百灵毕赤酵母、Pichia exigua、发酵毕赤酵母、Pichia heedii、克鲁维毕赤酵母、库德毕赤酵母、盔形毕赤酵母、膜璞毕赤酵母、中濑毕赤酵母、挪威毕赤酵母、东方毕赤酵母、巴氏毕赤酵母、假喜仙人掌毕赤氏酵母、Pichia  scutulata、Pichia sporocuriosa、陆生毕赤酵母、变形杆菌、奇异变形杆菌、产黏液变形杆菌、潘纳变形杆菌、普通变形杆菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、丁香假单胞菌、雷氏普罗威登斯菌、斯氏普罗威登斯菌、内生根毛霉、米黑根毛霉、巴基斯坦根毛霉、微小根毛霉、公牛根毛霉、多变根毛霉、无根根霉菌、无接合孢子根霉、卷柄根霉、日本根霉、小孢根霉、黑色根霉菌、少孢根霉、米根霉、希伯来根霉、有性根霉、匍枝根霉、木波罗根霉、邦戈尔沙门氏菌、肠道沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏杆菌、北方贝核盘霉、币斑病菌、大豆核盘霉、小核盘菌、Sclerotinia ricini、油菜菌核病菌、Sclerotinia spermophila、三叶草核盘菌、嗜虫沙雷菌、无花果沙雷氏菌、居泉沙雷菌、格氏沙雷氏菌、液化沙雷氏菌、粘质沙雷氏菌、臭味沙雷氏菌、普城沙雷氏菌、变形斑沙雷菌、Serratia quinivorans、深红沙雷氏菌、Serratia symbiotica、痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌、不产色链霉菌、产二素链霉菌、金色链霉菌、阿维链霉菌、制癌链霉菌、鹿色链霉菌、带小棒链霉菌、天蓝色链霉菌、天蓝淡红链霉菌、达窝链霉菌、弗氏链霉菌、灰色链霉菌、吸水链霉菌、淡紫链霉菌、林肯链霉菌、纳塔尔链霉菌、结节链霉菌、诺尔斯链霉菌、波赛链霉菌、普拉特链霉菌、龟裂链霉菌、壮观链霉菌、毒三素链霉菌、委内瑞拉链霉菌、紫黑链霉菌、紫红链霉菌、绵毛嗜热丝孢菌、哈茨木霉、康氏木霉、长梗木霉、拟康氏木霉、里氏木霉、绿色木霉、同心性毛癣菌、Trichophyton eboreum、马发癣菌、格威里毛癣菌、Trichophyton kanei、麦格尼氏发癣菌、须疮癣菌、豆形毛癣菌、鲁比切克毛癣菌、红色毛癣菌、许兰氏毛癣菌、猴发癣菌、苏丹奈斯发癣菌、土发癣菌、断发毛癣菌、范布瑞西米毛癣菌、疣发癣菌、紫色发癣菌、杨德氏发癣菌、维氏核盘菌、阿氏耶尔森氏菌、阿里克谢耶尔森氏菌、伯氏耶尔森氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、费氏耶尔森氏菌、中间耶尔森氏菌、克氏耶尔森氏菌、Yersinia massiliensis、莫氏耶尔森氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、罗氏耶尔森氏菌、鲁氏耶尔森氏菌、Yersinia similis。

[0033] 在本发明的上下文中，优选使用来自以下物种的蛋白酶：来自哺乳动物的胃粘膜、猪胰腺、牛胰腺、黑曲霉、米曲霉、斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)、酱油曲霉、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、巴氏毕赤酵母、假单孢菌属、微小根毛霉、少根根霉、日本根霉、匍枝根霉、鼠伤寒沙门氏杆菌、粘质沙雷氏菌、液化沙雷氏菌、灰色链霉菌、紫红链霉菌、绵毛嗜热丝孢菌、里氏木霉、小肠结肠炎耶尔森氏菌的蛋白酶。

[0034] 本文的第二酶组分的至少一种酶可以来自相同或不同来源，优选来自一种或者几种上述生物。

[0035] 在优选的实施方案中，基于油的含量，第一酶组分的酶的含量选自1ppm-1000ppm，更优选1-250ppm，特别优选5-200ppm。在进一步优选的实施方案中，基于油的含量，第二酶组分的酶活性选自1ppm-1000ppm，更优选1-250ppm，特别优选5-200ppm。

[0036] 在优选的实施方案中，第一酶组分的酶的酶活性选自0.01-10单位/g油，更优选0.1-5单位/g油，特别优选0.2-3单位/g油，最优选0.3-2单位/g油。在进一步优选的实施方案中，第二酶组分的酶活性选自0.01-10单位/g油，更优选0.1-5单位/g油，特别优选0.2-3单位/g油，最优选0.3-2单位/g油。(单位：酶活性的国际单位；1单位等于1μmol/min的底物转化)。

[0037] 在本发明的上下文中，特别优选其中第一酶组分的酶活性与第二酶组分的酶活性的比例为0.001:20-20:0.001，优选0.1:10-10:0.1，进一步优选0.25:7.5-7.5:0.25，进一步优选0.5:5-5:0.5，最优选1:1-1:5的组合物。

[0038] 优选根据本发明，通过观察第一酶组分与第二酶组分的比例能够进一步降低胶相的体积。这显著增加了油产量。

[0039] 第一和/或第二酶组分的酶可以例如冷冻干燥并溶解于相应的酶缓冲液中(文献中描述了每种酶的标准缓冲液)，例如0.1M，pH5的柠檬酸缓冲液或0.1M，pH5的醋酸缓冲液。在优选的实施方案中，将酶容纳于酶缓冲液中，并添加至原油。为了使酶的溶解度更高-特别是在根据本发明的含有磷脂酶的组合物中-也可以添加有机溶剂。这些例如用于分离磷脂，且描述于文献中。优选使用非极性有机溶剂例如己烷和丙酮或混合物，优选含量为1-
30％重量(潜在溶剂的实例描述于EP 1531182 A2)。

[0040] 在进一步优选的实施方案中，第一和/或第二酶组分以支持形式使用。本发明的上下文中，优选的支持材料是无机支持材料，例如硅胶、沉淀二氧化硅、硅酸盐或硅铝酸盐，和有机支持材料，例如甲基丙烯酸酯或离子交换树脂。支持材料促进来自随后工艺步骤的油/水乳液的酶的可重用性且有助于该方法的经济可行性。

[0041] 在同样优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含一种或多种进一步的成分，特别优选选自柠檬酸缓冲液和醋酸缓冲液。

[0042] 本发明组合物的发明人出乎意料地发现，上述定义的酶组分(第一和第二酶组分)的组合以特别有效的方式降低水相中甘油三酯的乳化性。因此，根据本发明的组合物用于含有甘油三酯的组合物例如原植物油或植物油胶的脱胶特别有利。

[0043] 因此，在进一步的方面，本发明涉及用于使含有甘油三酯的组合物脱胶的方法，包括以下步骤：

[0044] a)将含有甘油三酯的组合物与如上定义的根据本发明的组合物接触；

[0045] b)将胶物质与含有甘油三酯的组合物分离。

[0046] 出乎意料地，在这方面已经发现，借助于根据本发明的方法，与仅使用磷脂裂解酶相比，能够进一步降低含有甘油三酯的组合物的磷脂含量、增加油产量、提高酶促脱胶期间的反应速率、降低胶体积和/或改进形成的胶相的可分离性。在本文中，磷值降低至20ppm以下，特别优选10ppm以下，尤其特别优选4ppm以下的磷。

[0047] 此外，用根据本发明的方法能够将含有甘油三酯的组合物，尤其是原植物油中的钙和镁含量降低至20ppm以下，特别优选15ppm以下，尤其特别优选10ppm以下，同样优选8ppm以下，最优选4ppm以下。在进一步优选的实施方案中，钙和镁含量降低至3ppm以下。

[0048] 在这种情况下本发明的方法特别有利，因为通过使用蛋白酶改进了磷脂裂解酶的作用。使用蛋白酶的结果是油的胶相粘度下降，并且磷脂的流动性增加。并且，磷脂裂解酶对位于胶相/油界面的磷脂分子的可达性增加。

[0049] 此外，至少一种磷脂裂解酶和至少一种蛋白酶的根据本发明的组合能够降低磷脂裂解酶的计量添加，例如磷脂酶A1或A2任选与磷脂酶C组合，这样做除了具有上述优势还能节约成本。

[0050] 在本发明的上下文中，术语“甘油三酯”理解为是指甘油和脂肪酸的三酯，其是植物或动物来源的天然脂肪和油的主要成分。在本发明的上下文中，含有甘油三酯的组合物包括植物或动物脂肪和油，及其与一种其他的或合成的或修饰的脂肪和油的混合物。以下更详细地定义该术语。

[0051] 在本发明的上下文中，术语“植物油”理解为是指植物来源的任何油。特别优选合适的油是大豆油、菜籽油、芥花籽油、葵花油、橄榄油、棕榈油、麻风树油、亚麻荠油(false flax oil)、棉籽油及其混合物。特别合适的是“原植物油”。本文术语“原”是指油还没有经历脱胶、中和、漂白和/或除臭步骤这一事实。在根据本发明的方法的上下文中，也可以使用两种或多种原油的混合物，或用酶处理预处理(例如预脱胶和/或预调制)的油。

[0052] 在本发明的上下文中，“胶相”、“胶物质”、“植物油胶”理解为是指用含有酸的溶液和/或水性溶液处理后，从含有甘油三酯的组合物中作为重相沉淀出来的所有物质(Michael Bokisch:Fats and Oils Handbook,AOCS Press,Champaign,Illinois,1998,pages 428-444)。术语“胶相”、“胶物质”、“植物油胶”在本发明的上下文中作为同义词使用。使用这种植物油胶作为原料对于获得卵磷脂尤其重要，因为卵磷脂是植物油胶的重要成分。

[0053] 在本发明的上下文中，术语“预脱胶”或“湿脱胶”理解为是指用水或水性酸溶液处理原油以尽可能从油中去除水溶性磷脂。在本发明的上下文中，术语“预脱胶”或“湿脱胶”作为同义词使用。同样，在预-或湿脱胶过程中，添加酸之后，也可以添加碱以中和酸。在添加酶之前，分离水相。预脱胶后，例如大豆和菜籽原油中的磷含量从约500-1500ppm降低至预脱胶油中的200ppm以下。预脱胶的结果是，例如可以从所得胶相中获得卵磷脂/或胶相可以作为进料加工。然而，分离水相或降低磷含量的缺点是对于油而言产量损失。转移至水相的磷脂具有乳化作用，导致一些油在水相中被乳化并随之分离。因此，可以进一步用酶处理油。

[0054] 在本发明的上下文中，油的“预调制”理解为是指向未处理油中添加水和/或水性酸溶液。然后，通过添加碱，例如氢氧化钠溶液，形成随后进行酶促反应的pH。理想地，形成酶反应的最佳pH3.5-7。然而，随后不分离水相，而是直接添加酶。因此，存在的胶物质暂时留在油或乳液中。因此，仅在酶作用于(任选预调制的)原油后，分离水相和酶。

[0055] 在优选的实施方案中，可以向原油添加水或水性酸溶液和任选的碱(就预调制以中和酸而言)，但省略了添加酶之前的分离水相。通过省却添加酶之前的分离步骤，可以进一步提高油产量。油产量增加一个百分点具有巨大的经济意义，因为基于例如大豆油的年产量，该百分点等于约400000t油。因此，在这种优选的实施方案中，根据本发明的方法允许直接使用磷含量为100-1500ppm磷的大豆或菜籽的原油。此外，它简化了方法，因为省略了添加酶之前的分离步骤。

[0056] 在进一步优选的实施方案中，在根据本发明方法的步骤a)中，不添加额外的乳化剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)-除了任何已经存在的乳化剂，例如卵磷脂。类似地，根据本发明的方法优选不添加盐，例如氯化钙(CaCl2)。

[0057] 对于大豆油或菜籽油或葵花油的脱胶，特别优选使用来自绵毛嗜热丝孢或菌尖孢镰刀菌的磷脂酶A1和/或来自猪胰腺或牛胰腺或里氏木霉或紫红链霉菌或黑曲霉的磷脂酶A2和/或来自巴氏毕赤酵母的磷脂酶C与胃蛋白酶或解淀粉芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌或黑曲霉或米曲霉的组合。

[0058] 在根据本发明方法的上下文中，可以用本领域技术人员已知的适用于根据本发明目的的任何方式进行根据本发明方法的步骤a)的“接触”。根据本发明方法的步骤a)的接触的优选类型是混合含有甘油三酯的组合物和根据本发明的组合物。

[0059] 将含有甘油三酯的组合物和根据本发明的组合物按照根据本发明方法的步骤a)接触后，优选搅拌含有甘油三酯的组合物和根据本发明的组合物的混合物，特别优选使用200-800rpm，优选250-600rpm，最优选300-500rpm的桨式搅拌器。

[0060] 根据本发明方法的步骤a)的接触期间，混合物的温度优选15-99℃，更优选20-95℃，进一步优选22-75℃，同样优选25-65℃，进一步优选30-60℃，最优选32-55℃。在这方面，必须一直选择混合物的温度从而不超过酶的变性温度，优选混合物的温度比酶的变性温度至少低5℃。

[0061] 根据本发明方法的步骤a)的接触时间优选1分钟至12小时，更优选5分钟至10小时，同样优选10分钟至6小时，进一步优选10分钟至3小时。

[0062] 根据本发明方法的步骤a)的接触期间，混合物的pH优选pH3-pH7.5，更优选pH4-pH6，特别优选pH4.0-pH5.5。

[0063] 含有甘油三酯的组合物和根据本发明的组合物的第一和第二酶组分的根据本发明方法的步骤a)的接触可以同时或依次进行。如果接触依次进行，在本发明的上下文中，优选将含有甘油三酯的组合物先与第二酶组分接触。如果含有甘油三酯的组合物先与第二酶组分接触，然后与第一酶组分接触，特别优选在添加一个组分后，在添加其它组分前，将混合物搅拌30-300分钟，优选60-240分钟，同样优选70-120分钟。

[0064] 可以用本领域技术人员已知的适用于根据本发明目的的任何方式进行根据本发明方法的步骤b)的“分离”胶物质。然而，优选通过任何分离器，例如离心机或过滤单元进行分离。根据本发明方法的优选分离器是喷嘴分离器、螺旋压力机分离器、室式分离机、盘式分离机、固体壁盘分离器、两相滗水器、三相滗水器、三支柱式离心机、单缓冲液离心机、滑动振动离心机、振动离心机、固体壁刀式离心机、固体壁螺旋离心机、管式离心机、篮子刀式离心机、推送式离心机、屏幕螺旋离心机、切屑离心机、翻袋式离心机和通用离心机。在离心期间，含有甘油三酯的组合物发生相分离，例如在其中使用原植物油作为含有甘油三酯的组合物的优选实施方案中，使得经处理的植物油、胶物质和酶组分存在于容易彼此分离的不同的相中。

[0065] 在优选的实施方案中，从经处理的油中分离包含胶物质的相和包含根据本发明的组合物的相。在这方面特别优选将第一和/或第二酶组分同时作为胶物质而分离。

[0066] 分离后，酶可以再生和/或纯化并用于例如新的脱胶方法。酶任选可以通过吸附剂或通过对应的柱层析方法来再生。使用从根据本发明的方法进一步使油脱胶分离的一些重相是进一步的选择。

[0067] 此外，本发明的进一步优选的实施方案涉及如上所述的方法，进一步包括以下步骤：

[0068] c)将根据步骤b)的含有甘油三酯的组合物与第一和/或第二酶组分重新接触。

[0069] 根据本发明方法的步骤c)的“接触”优选在与如上所述的根据本发明方法的步骤a)的相同条件下进行。本文中，在特别优选的实施方案中，第一和/或第二酶组分在重新接触之前进行再生。

[0070] 在特别优选的实施方案中，含有甘油三酯的组合物在进行根据步骤c)的接触之前，进行如上定义的预调制。

[0071] 在根据本发明方法的优选的实施方案中，根据步骤c)的接触如以上对根据本发明方法的步骤a)的接触已经定义的进行。

[0072] 在进一步的方面，本发明涉及如上详细定义的根据本发明的组合物用于使含有甘油三酯的组合物脱胶的用途。

[0073] 以下描述本发明的特别优选的实施方案，尽管并不限制本发明的范围而仅仅作为进一步的阐述。

[0074] 优选实施方案A)

[0075] a)将选自原大豆油、菜籽油和/或葵花油的含有甘油三酯的组合物与包含第一酶组分和第二酶组分的组合物接触，所述第一酶组分含有至少一种选自磷脂酶A1、磷脂酶A2和磷脂酶C的酶，所述第二酶组分含有至少一种选自内切蛋白酶的酶；

[0076] b)通过离心从含有甘油三酯的组合物分离胶物质。

[0077] 在根据优选实施方案A)的根据本发明方法的特别有利的实施方案中，在方法的步骤a)之前，进行所谓的预调制，其中原油在单独的方法步骤中与含量为1.5-3ml/L油的有机酸，优选柠檬酸混合。优选将混合物的温度调节为35-60℃，特别优选为48℃。在30分钟至2小时，优选1小时的反应时间后，通过添加含量优选为0.5-2mol/l，特别优选为1mol/l的化学计量的碱溶液，优选氢氧化钠溶液将混合物的pH调节至5。只有到那时才继续进行根据本发明方法的步骤a)。

[0078] 优选的实施方案B)

[0079] a)将选自原大豆油和/或菜籽油的含有甘油三酯的组合物与包含第一酶组分和第二酶组分的组合物接触，所述第一酶组分含有至少一种选自磷脂酶A1、磷脂酶A2和磷脂酶C的酶，所述第二酶组分含有至少一种选自内切蛋白酶的酶，特别优选第一酶组分的至少一种酶固定在支持物上；

[0080] b)通过离心从含有甘油三酯的组合物分离胶物质。

[0081] 在根据优选实施方案B)的根据本发明方法的特别有利的实施方案中，特别优选第一和/或第二酶组分的酶在浓度为0.05-5％v/v的水相(缓冲液优选为pH4.0-5.5，特别优选pH4.0-5.0)中使用。根据步骤a)的接触优选在22-70℃，更优选25-65℃的温度进行。

[0082] 此外，在根据本发明方法的优选实施方案B)中，通过添加有机酸和/或碱溶液(在步骤b)之后)进行后脱胶。优选将此处的混合物的温度调节为35-60℃，特别优选为48℃。在30分钟至2小时，优选1小时的反应时间后，通过添加浓度优选为0.5-2mol/l，特别优选为
1mol/l的碱溶液，优选氢氧化钠溶液将混合物的pH调节至5。

[0083] 优选的实施方案C)

[0084] a)将选自植物油胶的含有甘油三酯的组合物与包含第一酶组分和第二酶组分的组合物接触，所述第一酶组分含有至少一种选自磷脂酶A1、磷脂酶A2和磷脂酶C的酶，所述第二酶组分含有至少一种选自蛋白酶，优选内切蛋白酶的酶，特别优选第一酶组分的至少一种酶固定在支持物上；

[0085] b)通过离心从含有甘油三酯的组合物分离胶物质。

[0086] 优选的实施方案D)

[0087] a)将选自原大豆油和/或原菜籽油的含有甘油三酯的组合物与包含第一酶组分和第二酶组分的组合物接触，所述第一酶组分含有至少一种选自磷脂酶A1、磷脂酶A2和磷脂酶C的酶，所述第二酶组分含有至少一种选自蛋白酶，优选内切蛋白酶的酶，特别优选第一酶组分的至少一种酶固定在支持物上；

[0088] b)通过离心从含有甘油三酯的组合物分离胶物质。

[0089] 在根据优选实施方案D)的根据本发明方法的特别有利的实施方案中，特别优选在方法的步骤a)之前通过以下进行预调制：将原油在单独的方法步骤中与含量为50-1500ppm的有机酸，优选100-1200ppm的柠檬酸混合。优选将此处的混合物的温度调节为40-90℃，特别优选为45-85℃。在5分钟至2小时，优选10-30分钟的反应时间后，通过添加含量优选为0.5-5mol/l，特别优选为1mol/l的碱溶液，优选氢氧化钠溶液调制混合物。只有到那时才继续进行根据本发明方法的步骤a)。

[0090] 此外，可以通过降低根据本发明方法处理的油的Ca和/或Mg含量进一步降低仍然溶解于含有甘油三酯的组合物中且没有被磷脂酶裂解的任何磷脂酸。因此，以上列出的根据本发明方法的优选实施方案A)-D)可以有利地包含后续步骤，其中通过重新添加络合剂(例如柠檬酸或磷酸或草酸或乳酸或苹果酸)进一步降低油中的二价离子的含量(与此平行的是P的含量)。

[0091] 方法

[0092] 使用以下的分析方法：

[0093] 测定植物油中的磷含量

[0094] 根据DEV E-22通过ICP测定磷。

[0095] 测定植物油中的钙和镁含量

[0096] 根据DEV E-22通过ICP测定钙和镁。

[0097] 测定游离脂肪酸(FFA)的含量

[0098] 通过皂化反应中氢氧化钠或氢氧化钾的消耗来测定游离脂肪酸的含量。获得研究的油中游离脂肪酸的百分比含量。测定根据DIN 53402(方法DGF C-V 2)进行。

[0099] 测定胶体积

[0100] 借助于这种测定来测量油中存在的未用酶促处理和酶促处理的胶的胶相。将10ml玻璃离心管加热至反应混合物的工作温度，加入样品(2X 2ml)，在控制温度下以3000rpm离心至少4分钟以从油中分离胶相。从上层油相中取出样品用于分析。出于记录的目的，对相形成结果额外拍照。

[0101] 变体1：

[0102] 将待处理的400-600g量的原油引入1000ml Duran反应器DN120，取出样品用于分析。通过加热板的方式将Duran反应器中的油加热至40-85℃，尤其是48-80℃的温度。达到温度后，开始预调制。对于此，根据油量，向油中计量加入适量的柠檬酸(例如1000ppm)。然后通过 将混合物充分混合1分钟。或者，在约600rpm的搅拌下孵育混合物15分钟以等待酸反应。然后，添加规定量的氢氧化钠溶液(1mol/L，减去来自酸添加和酶添加的水的残留量为2％v/v或3％v/v)直到达到pH约为4，将混合物在搅拌下进一步孵育10分钟。冷却至48℃后，添加优选溶解于水或缓冲液的酶、酶混合物或固定物。搅拌酶，出于一种目的可以暂时提高搅拌速度(900rpm下1分钟)，然后以较低速度继续搅拌。

[0103] 在预定的时间间隔取样。通过移液管取出样品，转移至加热的玻璃离心管(反应混合物的温度)，并在控制温度下以3000rpm离心至少4分钟以从油中分离胶相。出于记录的目的，对相形成的结果拍照，取出上清液样品以测定磷、钙和镁的含量。

[0104] 变体2：

[0105] 在进一步的程序中，向原油中添加合适组合的磷脂酶和其他酶(作为游离酶或固定酶)和0.05-5％w/v的水相(酶缓冲液，pH4-5)。充分混合由水、酶、可能的酶支持物和油组成的乳液。理想地，反应在20-70℃，更好在40-65℃的控制温度下进行。然后，等待相分离，固体沉淀出来或可以通过本领域技术人员已知的标准方法，例如通过离心或过滤去除。处理后，可以通过本领域技术人员已知的“脱胶”方法用稀酸(例如柠檬酸)或碱溶液将油剩余脱胶。

[0106] 变体3：

[0107] 在进一步的程序中，用酶处理胶相。除磷脂酶外，向通过本领域技术人员已知的“脱胶”方法获得的胶相添加其他酶。这些可以以溶解形式存在于水相中或悬浮于有机溶剂中。理想地，将混合物加热至20-70℃，更好35-60℃的温度。将混合物充分混合物直至工艺结束。这可以通过测量粘度或通过肉眼观察，通过固体胶相的溶解来监测。可以通过离心实现相分离；可以分离单独的相。通常，上层相由所得油组成，中层相是磷脂，下层相是水相且包含酶。通过重新使用水相，可以回收并重新使用酶。取决于二价离子的含量，在随后的使用之前，可以通过添加络合剂从油或含有酶的水相中去除离子。

[0108] 以下通过参考附图和实施例更详细地解释本发明。在此强调实施例和附图仅仅是说明性的，说明本发明特别优选的实施方案。实施例或附图均不限制本发明的范围。

[0109] 图1表示原菜籽油：3％的总含水率的预调制。

[0110] 图2表示原菜籽油：添加0.3单位/g油的酶PLA1和3％的总含水率的预调制。

[0111] 图3表示原菜籽油：添加0.3单位/g油的酶PLA1和1单位/g油的胃蛋白酶，3％的总含水率的预调制。

[0112] 根据反应变体1，使用具有以下起始含量的原菜籽油：磷1200ppm，钙365ppm，镁155ppm和游离脂肪酸含量1.99％。借助于水性柠檬酸(1000ppm)和水性氢氧化钠溶液(1mol/L)将原油进行预调制。定期取样(参见图1，表1)。反应结束时，离心掉胶相，根据Soxhlet测定其中的残余油含量。

[0113] 作为比较，添加一种酶，来自生物绵毛嗜热丝孢菌的磷脂酶A1(Sigma-Aldrich)进行预调制(参见图2，表2)。图3，表3显示添加来自绵毛嗜热丝孢菌的磷脂酶A1和另一种酶，来自猪胃粘膜的胃蛋白酶(Sigma-Aldrich)的预调制的结果。

[0114] 表1.3％的总含水率的预调制，磷、钙、镁和FFA含量

[0115]时间[分钟] 10 60 120 180 240
Ca[ppm] 76 11 9.5 9.4 9.5
Mg[ppm] 31 2.8 1.7 1.6 1.7
P[ppm] 247 20 14 13 14
FFA[％] 1.73     1.68 1.72
胶[％]3分钟 5.8 6.5 6.0 6.0 6.0

[0116] 表2.添加0.3单位/g油的来自绵毛嗜热丝孢菌的PLA1和3％的总含水率的预调制，磷、钙、镁和FFA含量

[0117]时间[分钟] 10 60 120 180 240
Ca[ppm] 26 9.7 8.7 7.9 7.9
Mg[ppm] 9.7 2.1 1.8 1.4 1.5
P[ppm] 82 17 15 12 12
FFA[％] 1.76     2.35 2.14
胶[％]3分钟 6.5 5.6 5.0 4.5 5.5

[0118] 表3.添加0.3单位/g油的PLA1(来自绵毛嗜热丝孢菌)和1单位/g油的胃蛋白酶，3％的总含水率的预调制，磷、钙、镁和FFA含量

[0119]时间[分钟] 10 60 120 180 240
Ca[ppm] 55 10 9.3 6.4 5.7
Mg[ppm] 23 3.1 3 1.9 1.6
P[ppm] 199 26 25 16 14
FFA[％] 1.86     2.14 2.17
胶[％]3分钟 4.3 5.0 4.2 4.0 4.0

[0120] 从图1可以看出，对原油使用酸和碱作为预调制产生不可忽视的胶体积，这随后尽管使用600rpm的搅拌也基本上没有降低。仅有的照片对应于一次取样。在时间点10、60、120、180和240分钟(从左至右)取样。表1给出相关分析数据：240分钟后，磷含量从247ppm降低至14ppm；二价离子钙和镁的浓度对于钙而言从76ppm降低至9.5ppm，镁浓度在反应过程中从31ppm降低至1.7ppm。游离脂肪酸的含量几乎保持不变。预调制作为使油脱胶的准备反应，同时作为参考处理。

[0121] 在图2中，当使用来自绵毛嗜热丝孢菌的磷脂酶A1(Sigma-Aldrich)时，反应过程中胶体积的降低很明显(每次测量/取样一张照片)。表2示出了相关数据和取样时间点。表2显示，在240分钟的反应时间后的每种情况下，钙浓度从26ppm降低至7.9ppm，镁浓度从9.7ppm降低至1.5ppm，磷含量从82ppm降低至12ppm；游离脂肪酸含量从1.76％增加至
2.14％。游离脂肪酸含量的增加和磷含量的降低表明PLA1是酶促活性的，因而油的脱胶成功进行。游离脂肪酸的增加是PLA1活性的标志，所述PLA1从磷脂分子切割脂肪酸，并且胶体积持续降低。

[0122] 图3显示用PLA1和额外的胃蛋白酶处理的预调制原油的胶相的体积。从表3的相关分析数据明显可见，与仅使用PLA1时5.0％的胶体积(表2)相比，出乎意料地仅在120分钟后即达到4.2％的降低的胶体积。此外，离子值(表3)与仅用PLA1的反应的那些相当，参见表2。游离脂肪酸的含量从1.86％增加至2.17％，因而显示磷脂酶的活性。结果表明，进一步添加单个酶，胃蛋白酶，出乎意料地导致胶相的更大降低，从而增加反应的油产量。