고압내성 효소를 이용하는 방법

고압내성 효소를 이용하는 방법{Method to use enzyme having high pressure resistance}

본 발명은 고압 조건 하에서 효소를 이용하는 방법, 효소 활성을 증진시키는 방법, 및 효소 활성을 측정하는 방법에 관한 것이다.

효소(enzyme)는 물리화학적 가수분해 중 부가반응이 없고, 촉매 활성이 크기 때문에 에너지 소모가 적으며, 가공 후 제거할 필요가 없어, 다양한 산업으로 이용이 확대되고 있다.

효소는 전분을 당화시키는 당분해를 이용한 식품제조에 주로 사용하다가, 근래에는 의약품제조, 정밀화학품제조, 특수용도의 식품의약품 및 화학품을 제조하는데 사용되면서, 그 사용범위가 확대되었다. 구체적으로, 식품용 효소는 시럽제조, 맥주 등의 알콜 발효, 낙농, 제빵, 과일 및 야채 쥬스 제조, 곡물 가공, 식품 보존, 계란 가공, 식품 유지 가공, 생선 가공, 향미 제조, 동물 사료 제조 등 다양한 분야에 사용되고 있다. 또한, 세제용으로도 사용되고 있는바, 최근에는 식기세척용으로 효소 세제를 사용하려는 움직임이 커지고 있으며 여기에 대한 세제용 효소의 시장도 점차 커지고 있다. 또한, 섬유산업에서도 최근 효소의 사용이 점차 증가하고 있는바, 양모의 경우 섬유에 존재하는 불순물을 효소를 사용해 제거하는 biocarbonsation 공정이 개발되고 있으며, 직물에 있는 보플을 제거하는 연마공정(polishing)에서도 효소를 이용함으로써 염색의 명확도, 색상의 선명도, 표면 촉감, 구김 저항도 및 유연도를 향상시킬 수 있다. 펄프의 경우에도 불순물 제거를 위해 효소를 이용하며, 인쇄된 종이를 재생시킬 때 잉크를 제거하는 탈묵 과정에서도 효소를 이용할 수 있고, 피혁 공업은 대표적인 환경공해유발 산업이어서 이 문제를 해결하기 위해 침지, 탈모, 또는 탈지 공정에 강산을 이용하는 대신 효소를 이용하는 공정이 개발되고 있다. 아울러, 아미노산공업, 스테로이드 전환, 항생 물질 제조, 펩티드 합성, 에스터 전환 및 합성, 및 유기화학에의 이용 등 다양한 화학공업에서 효소를 이용한다. 뿐만 아니라, 치료용 효소로 소화 효소, 항소염 효소, 혈전 분해 효소, 항종양 효소, 및 순환계용 효소 등이 개발되고 있으며, 효소를 이용한 임상진단분야도 점차 발전 중에 있다. 특히, 우리나라에서는 전통적인 천연조미료의 제조를 위해, 효소를 원료에 직접 첨가하여 단백질 분해를 통한 동물성 및 식물성 단백질 가수분해물을 제조하는 효소분해법이 사용되고 있어, 효소가 자주 이용된다.

한편, 고압 상태에서는 LE Chartelier의 법칙에 따라 부피가 줄어드는 방향으로 화학 반응이 촉진된다. 따라서 압력 증가에 따라 부피가 감소하게 되면 반응이 가속화될 수 있다. 따라서, 상기 기재한 바와 같은 다양한 효소 이용 반응에서 반응 가속화를 목적으로 고압 상태 공정을 이용한다. 특히, 식품 제조 공정시 고압 조건 하에서 반응을 수행하면, 수소결합에 영향을 주어 분자의 3차원 거대분자의 구조가 변하게 되어 천연의 향미, 맛, 색상 및 영양성분 등은 유지하면서 수용화 및 추출율 증대 효과를 발휘하며 보존성을 향상시킬 수 있다. 뿐만 아니라 고압 상태 공정을 이용하면 관능적 특성이 우수하고 영양성분이 그대로 보존되는 고품질 식품의 제조가 가능하며, 고압 상태 공정은 에너지 소모가 적은 경제적이고 친환경적인 공정이다. 그러므로 고압 상태 공정을 이용하면, 미생물의 증식을 억제하고 효소 작용을 촉진시킴과 동시에 처리 공정이 간편하며, 아울러 부가적인 식염 및 알콜 등의 첨가를 배제할 수 있다는 장점이 있다. 예컨대, 홍삼 추출물, 녹차 추출물, 대나무 추출물, 및 율무 추출물 등의 추출물 제조시 고압 효소 반응을 이용하면 추출물의 효능과 물성이 달라진다.

그러나 일반적으로 고압 조건 하에서는 효소의 3차 구조 내에 물이 침투하여 효소의 3차 구조를 유지하는 결합력(예, 소수성결합)을 파괴하고 결과적으로 3차 구조가 파괴되어 효소 활성을 잃게 되는바, 고압 조건 하에서 효소를 이용하는 데에 어려움이 있었다.

이에, 본 발명자들이 해결하고자 하는 과제는 고압내성 효소를 고압 조건이 수반되는 데에 이용하는 방법, 고압 처리에 의해 고내압성 효소의 열안정성을 증진시켜 효소 활성을 증진시키는 방법, 고압내성 효소를 포함하는 고압 조건 하 단백질 분해용 조성물, 이를 포함하는 천연조미소재 제조용 조성물, 이를 포함하는 고압 처리 용기, 및 고압 조건 하에서 고내압성 효소를 이용하여 아조카세인 용액을 기질로서 분해하는 단계를 포함하는 고내압성 효소의 효소 활성을 측정하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 일 양태로 본 발명은 고압 조건이 수반되는 효소를 이용하는 방법에 있어서 상기 효소는 알파-키모트립신(α-chymotrypsin), 펩신(pepsin), 트립신(trypsin), 아세틸화된 트립신(trypsin acetylated), 플라보자임(flavourzyme), 프로테아제 E(protease E, 바람직하게는 Marugoto E ^TM ) 및 알칼라제(alcalase)로 이루어진 군에서 선택된 1이상인 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.

보다 바람직하게, 상기 고압 조건은 100-400 MPa이다.

본 발명자들은 알파-키모트립신, 펩신, 트립신, 및 아세틸화된 트립신의 내압성이 우수하고, 그 중에서도 트립신의 내압성이 우수하여 300 MPa에서 300분간 고압 처리하였을 때 상압 처리 트립신보다 효소 활성이 40% 증가할 뿐만 아니라 300 MPa에서 시간 경과에 따라 효소 활성이 증가하는 경향을 나타냄을 확인하였다. 또한, 알파-키모트립신은 300 MPa에서 시간 경과에 따라 효소 활성이 증가하는 경향을 나타냈으며 300분간 고압 처리하였을 때 상대활성이 100%를 넘어서는 결과를 나타냈다. 또한, 아세틸화된 트립신 역시 300 MPa에서 시간 경과에 따라 효소 활성이 증가하는 경향을 나타냈으며 300분간 고압 처리하였을 때 상대활성이 거의 100%에 달하여 300분간 상압 처리한 경우와 거의 동일한 효소 활성을 나타냈다. 또한, 펩신 역시 고압 처리한 경우에도 상압 처리한 경우와 거의 동일한 효소 활성을 나타냈다.

아울러, 플라보자임, 프로테아제 E, 및 알칼라제도 내압 특성이 우수함을 확인하였다. 플라보자임 및 프로테아제 E를 300분간 고압 처리한 경우에도 상압 처리한 경우와 거의 동일한 효소 활성을 나타냈으며, 상대활성이 약 100%에 달하였다. 또한, 알칼라제의 내압성도 우수하여 300 MPa에서 300분간 고압 처리하였을 때 상압에서 동일한 시간동안 처리한 알칼라제와 거의 동일한 효소 활성을 보여주었을 뿐만 아니라 300 MPa에서 시간 경과에 따라 상대 활성이 증가하는 경향을 나타냄을 확인하였다.

이로써, 발명자들은 알파-키모트립신, 펩신, 트립신, 아세틸화된 트립신, 플라보자임, 프로테아제 E 및 알칼라제가 고압내성을 가짐을 확인하고 본 발명을 완성하였다(도 7 내지 도 10 참고).

본 발명에 따르면, 고압내성 효소들을 이용함으로써 효소 활성이 유지되는 상태에서 고압 조건이 수반되는 효소를 이용하는 방법, 바람직하게 고압 조건이 수반되는 단백질 분해 반응, 탄수화물 분해 반응, 지질 분해 반응, 생리활성물질 추출 반응, 단백질 효소 변형 반응, 또는 기능성 성분의 효소 합성 반응 등을 수행할 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 생리활성물질 추출은 세포벽이 두터운 식물체로부터 생리활성물질을 추출하는 것일 수 있으며, 상기 단백질 효소 변형 반응은 소화율 개선 등을 목적으로 할 수 있으며, 또는 상기 기능성 성분의 효소 합성 반응에서 상기 기능성 성분에는 감미료, 펩티드, 및 enantioselective ester 등이 포함될 수 있다.

아울러, 상기 효소 이용하는 방법은 효소 활성이 증진되는 경우 효소 이용에 따른 목적 달성에 보다 유리할 것이다. 따라서 상기 효소 이용 방법, 바람직하게 고압 조건이 수반되는 단백질 분해 반응, 탄수화물 분해 반응, 지질 분해 반응, 생리활성물질 추출 반응, 단백질 효소 변형 반응, 또는 기능성 성분의 효소 합성 반응은 효소 활성 증진 방법 시에도 적용될 수 있다.

이에, 다른 양태로 본 발명은 알파-키모트립신, 펩신, 트립신, 아세틸화된 트립신, 플라보자임, 프로테아제 E 및 알칼라제로 이루어진 군에서 선택된 1이상의 효소를 포함하는 고압 조건 하 단백질 분해용 조성물, 탄수화물 분해용 조성물, 지질 분해용 조성물, 생리활성물질 추출용 조성물, 단백질 효소 변형 반응용 조성물, 또는 기능성 성분의 효소 합성 반응용 조성물을 제공한다. 바람직하게, 상기 고압 조건은 100-400 MPa이다.

본 발명에서 사용되는 용어, "단백질 분해"는 단백질과 펩티드의 펩티드 결합을 가수분해하여 아미노산 또는 펩티드 혼합물을 만드는 화학반응을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "고압내성"은 고압 조건 하에서 활성이 유지 또는 증가되는 특성을 의미하며, 상기 고압은 100 MPa 이상, 바람직하게 100-400 MPa, 더욱 바람직하게 100-300 MPa인 것을 말한다.

알파-키모트립신, 펩신, 트립신, 아세틸화된 트립신, 플라보자임, 프로테아제 E 및 알칼라제는 효소로써 공지된 것이며, 상업적 루트를 통해 당업계에서 용이하게 수득할 수 있고, 이에 제한되지 않지만 상기 알파-키모트립신은 소 췌장 유래, 상기 펩신은 돼지 위 점막 유래, 상기 트립신은 소 췌장 유래, 상기 아세틸화된 트립신은 소 췌장 유래, 상기 플라보자임은 아스페르길루스 오리제( Aspergillus oryzae ) 유래, 상기 프로테아제 E는 미생물 유래, 또는 상기 알칼라제는 바실러스 리헤니포르미스( Bacillus licheniformis ) 유래인 것이 바람직하다. 바람직하게, 상기 프로테아제 E로는 Marugoto E ^TM 가 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명자들은 상기 효소들 중 세린계 효소인 알칼라제, 알파-키모트립신, 트립신, 및 아세틸화된 트립신은 모두 공통적으로 covalent intermediate로서의 acyl-enzyme intermediate을 나타내고, 이들의 활성 부위의 공유결합은 고압 처리에도 불구하고 파괴되지 않아 효소활성을 유지하는데 기여하는 것으로 추측된다 (도 11 참고). 이에 반해, 메탈로프로테아제(metalloprotease)인 테르몰리신(thermolysin)의 경우 아연 이온이 효소의 활성발현에 필수적인데, 상기 아연 이온은 활성부위 아미노산에 배위결합에 의하여 결합되어 있으며, 고압 처리에 의하여 배위결합이 파괴되어 효소 활성이 소실되는 것으로 추측된다 (도 12 참고). 다만, 이로부터 알파-키모트립신, 펩신, 트립신, 아세틸화된 트립신, 플라보자임, 프로테아제 E 및 알칼라제 모두의 활성 부위에 공유결합만 존재해야 하는 것으로 한정되지는 않으며, 본 발명은 이러한 추측 또는 가정들에 한정되는 것으로 해석되지는 않는다.

기질의 종류 등에 따라 적절한 효소가 선택되어 사용될 수 있으며, 알파-키모트립신, 펩신, 트립신, 아세틸화된 트립신, 플라보자임, 프로테아제 E 및 알칼라제로 이루어진 군에서 선택된 1이상이 단독 또는 혼합하여 사용될 수 있으며, 혼합하여 사용되는 경우 동시 또는 순차적으로 사용될 수 있다. 본 발명자들은 상기 고내압성 효소를 단독으로 사용하는 경우에 비해 혼합하여 사용하는 경우 효소 분해능이 향상되며, 특히 혼합 효소의 가지수에 비례하여 효소 분해능이 향상됨을 확인하였다 (표 8 내지 10 참고). 이에, 바람직하게, 알파-키모트립신, 펩신, 트립신, 아세틸화된 트립신, 플라보자임, 프로테아제 E 및 알칼라제로 이루어진 군에서 선택된 2이상을 혼합하여 사용하며, 더욱 바람직하게 3이상, 4이상, 5이상, 6이상, 가장 바람직하게 7가지를 혼합하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 사용되는 상기 효소는 활성이 유지된 상태라면, 물리적화학적 사전 처리된 것도 포함되며 이에는 사전 고압 처리된 것도 포함될 수 있다.

본 발명에 있어서, 고압 조건의 pressurizing time(PT, 특정압에 도달한 후 압력을 유지하는 시간)은 분해하고자 하는 기질의 종류, 효소 이용 방법, 효소의 종류, 및 용매의 종류 등에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있으며, 상기 효소는 100-400 MPa에서 60분 이상, 보다 바람직하게 60-300분 동안 고압내성을 유지할 수 있는바, PT는 60분 이상, 예를 들어 60-300분일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 고압은 기체, 열, 및 액체 등 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 형성될 수 있으나, 바람직하게는 물에 의해 형성된 수압일 수 있다.

본 발명은 개방형 반응계 및 밀폐형 반응계 모두에서 수행될 수 있으나, 천연조미소재 제조 과정에서는 향미증진을 위해 밀폐형 반응계를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 도 1에 도시된 고압 효소분해시스템 내에서 반응을 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에 있어서, 반응온도는 분해하고자 하는 기질의 종류, 효소 이용 방법, 효소의 종류, 및 용매의 종류 등에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있으나 효소 및 기질이 변성되지 않는 온도 범위 내에서 열처리함으로써 반응속도 및/또는 반응수율을 향상시킬 수 있다.

특히, 본 발명자들은 고압 처리 결과 효소의 열안정성이 크게 향상됨을 확인하였고, 이에 따라 고압 조건 하에서 열처리하는 경우 상압 조건과 비교하여 효소의 효소 활성이 증진됨을 확인하였다(표 3-6, 도 13-16). 따라서 상기 고압내성 효소를 이용하는 경우, 고압 조건 하에서 열처리시 반응 수율, 예를 들어 단백질 분해물 수득 수율을 향상시킬 수 있다.

상기 열처리는 40℃ 이상에서 2분 이상 가열하는 것을 포함할 수 있고, 보다 구체적으로 40-85 ℃ 이상에서 2분 이상 가열하는 것을 포함할 수 있으며, 더욱 구체적으로 40-85 ℃ 이상에서 2-120분 동안 가열하는 것을 포함할 수 있다.

이에, 다른 양태로 본 발명은 고압 처리하는 것을 특징으로 하는, 열처리시 알파-키모트립신, 펩신, 트립신, 아세틸화된 트립신, 플라보자임, 프로테아제 E 및 알칼라제로 이루어진 군에서 선택된 1이상의 효소의 효소 활성을 증진시키는 방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 고압 조건은 100-400 MPa이며, 더욱 바람직하게는 100-300 MPa이다.

상기 고압 처리와 열처리는 동시 또는 개별 수행될 수 있으며, 개별 수행되는 경우 순차적으로 수행되며 고압 처리가 열처리에 선행할 수도 있으나, 바람직하게는 동시 수행되는 경우이다.

본 발명에 따른 방법 및 조성물을 이용하여 천연조미소재를 제조할 수 있는바, 다른 양태로 본 발명은 고압 조건 하 고압내성 단백질 분해 효소를 이용하여 단백질을 분해하는 단계를 포함하는 천연조미소재를 제조하는 방법 및 고압 조건 하 단백질 분해용 조성물을 포함하는 천연조미소재 제조용 조성물에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 고압에서 알파-키모트립신(α-chymotrypsin), 펩신(pepsin), 트립신(trypsin), 아세틸화된 트립신(trypsin acetylated), 플라보자임(flavourzyme), 프로테아제 E(protease E) 및 알칼라제(alcalase)로 이루어진 군에서 선택된 1이상의 효소를 이용하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 천연조미소재의 제조 방법 및 이러한 제조 방법으로 만들어진 천연조미소재를 제공하며, 바람직하게는 이러한 제조 방법에 있어 상기 언급한 열처리(예를 들어, 40℃ 이상에서 2분 이상 가열)가 동시에 수행될 수 있다. 바람직하게, 상기 고압 조건은 100-400 MPa이다.

제조 과정 중, 단백질 분해 효소에 의한 단백질 분해 단계가 포함될 수 있는 천연조미소재는 모두 상기 천연조미소재에 포함될 수 있다.

단백질 분해 과정 외 다른 과정은 제조하고자 하는 천연조미소재의 종류에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다.

본 발명에 따른 단백질 분해 방법 및 단백질 분해용 조성물의 용도로써 천연조미소재 제조 방법 및 천연조미소재 제조용 조성물을 들었으나, 이 예시적인 용도에 한정됨이 없이 추후 예상되는 다양한 용도에 응용, 적용될 수 있으며, 이들의 용도가 본 발명의 범주를 벗어나는 것은 아니다.

또 다른 양태로 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 고압 처리 용기에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 고압 조건은 100-400 MPa이다.

상기 용기는 고압 처리에 내구성을 가지며 용기 내부로 고압이 전달될 수 있다면 어떠한 형태, 구조 및 소재이든 불문하며, 모두 본 발명에 포함될 수 있다.

상기 고압 처리 용기는 고내압성 효소들을 포함하고 있으므로 고압 처리 조건 하에서도 상기 고내압성 효소들을 이용하는 처리들이 가능하므로 다양한 용도로 응용, 적용될 수 있다.

또 다른 양태로 본 발명은 고압처리한 알파-키모트립신, 펩신, 트립신, 아세틸화된 트립신, 플라보자임, 프로테아제 E 및 알칼라제로 이루어진 군에서 선택된 1이상의 효소를 이용하여 아조카세인 용액을 기질로서 분해하는 단계를 포함하는 상기 효소의 효소 활성을 측정하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 고압 조건은 100-400 MPa이다.

본 발명자들은 아조카세인 용액을 기질로 하여, 고압처리한 상기 효소의 효소 활성을 측정함으로써, 용이하고 정확하게 상기 효소들의 활성을 측정할 수 있음을 확인하였다 (도 4). 상기 효소들은 아조카세인을 포함한 다양한 기질에 대해 기질특이성을 가진다.

상기 아조카세인 용액의 농도는 2-5%, 바람직하게는 3%일 수 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따르면 효소를 이용하는 방법의 반응속도 및/또는 반응수율을 향상시킬 수 있으므로, 본 발명이 다양한 분야의 산업에 응용될 수 있을 것으로 기대되며, 특히 식품조미소재 생산에 활용된다면 효소를 이용하는 식품소재 산업 전반에 큰 변화를 가져올 것으로 기대된다.

도 1은 고압 효소분해시스템(high pressure bio-hydrolysis enzyme reactor)을 나타낸 것이다.
도 2는 효소 활성 평가 방법을 나타낸 것이다. 샘플은 효소를 활성화시킨 경우이고 balnk는 효소를 불활성화시킨 경우이다.
도 3은 기질로써 아조카세인(azocasein)을 사용하여 효소 활성도를 측정하는 방법을 나타낸 것이다.
도 4는 효소 분석을 위해 최적화된 기질 농도를 나타낸 것이다. 트립신 농도(Trypsin concentrations (mg/mL) : A, 0.5; B, 5; C, 0.5; D, 5
도 5는 아조카세인 분석에 의해 측정된 카타로그 분해 효소 농도가 활성도에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 아조카세인 분석에 의해 측정된 산업용 분해 효소 농도가 활성도에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 7은 100 MPa 압력 처리 시간에 따른 효소 활성도를 나타낸 것이다.
도 8은 300 MPa 압력 처리 시간에 따른 효소 활성도를 나타낸 것이다.
도 9는 고압 처리하는 동안 개별 카타로그 분해 효소의 효소 활성도 변화를 나타낸 것이다.
도 10은 고압 처리하는 동안 산업용 분해 효소의 효소 활성도 변화를 나타낸 것이다.
도 11은 트립신과 테르몰리신의 활성 부위를 비교한 것이다.
도 12는 고압 처리에 따라 아연에 의한 배위결합이 파괴되는 촉매기전을 나타낸 것이다.
도 13은 트립신의 열 불활성화 프로파일을 나타낸 것이다.

도 14는 트립신의 열 불활성화 프로파일을 동력학 분석한 것이다. , 40℃; , 45℃; , 50℃; , 55℃; , 60℃.

도 15는 프로테아제 E의 열 불활성화 프로파일을 나타낸 것이다. , 40℃; , 45℃; , 50℃; , 55℃; , 60℃.

도 16은 프로테아제 E의 열 불활성화 프로파일을 동력학 분석한 것이다. , 40℃; , 45℃; , 50℃; , 55℃; , 60℃.

도 17은 상압 및 고압에서의 비-촉매 반응 및 효소 촉매 반응을 비교한 것이다.

도 18은 1효소 처리에 따른 효소 가수분해물의 전기영동 패턴을 나타낸 것이다. 1, 마커; 2, 비-효소 처리한 12% 단백질 (AP); 3, F (AP); 4, F (HP); 5, A (AP); 6, A (HP); 7, P (AP); 8, P (HP); 9, M (AP); 10, M (HP). AP, 상압; HP, 300 MPa. F, 플라보자임; A, 알칼라제; P, 프로타멕스; M, 마루고토 E.

도 19는 2효소 처리에 따른 효소 가수분해물의 전기영동 패턴을 나타낸 것이다. 1,10, 마커; 2, 비-효소 처리한 12% 단백질 (AP); 3, FA (AP); 4, FA (HP); 5, FP (AP); 6, FP (HP); 7, FM (AP); 8, FM (HP); 9, 12% 비-효소 처리한 12% 단백질. AP, 상압; HP, 300 MPa. F, 플라보자임; A, 알칼라제; P, 프로타멕스; M, 마루고토 E.

도 20은 3효소 처리에 따른 효소 가수분해물의 전기영동 패턴을 나타낸 것이다. 1,10, 마커; 2, 비-효소 처리한 12% 단백질 (AP); 3, FAP (AP); 4, FAP (HP); 5, FAM (AP); 6, FAM (HP); 7, FPM (AP); 8, FPM (HP); 9, 비-효소 처리한 12% 단백질 (HP). AP, 상압; HP, 300 MPa. F, 플라보자임; A, 알칼라제; P, 프로타멕스; M, 마루고토 E.

도 21은 4효소 처리에 따른 효소 가수분해물의 전기영동 패턴을 나타낸 것이다. 1,10, 마커; 2, 비-효소 처리한 12% 밀 글루텐 (AP); 3, 비-효소 처리한 12% 밀 글루텐 (HP); 4, WG (AP); 5, WG (HP); 6, AFP (AP); 7, AFP (HP); 8, 비-효소 처리한 12% 멸치 미세분말 (AP); 9, 비-효소 처리한 12% 멸치 미세분말 (HP). AP, 상압; HP, 300 MPa. F, 플라보자임; A, 알칼라제; P, 프로타멕스; M, 마루고토 E.

도 22는 효소 처리하지 않은 경우의 전기영동 패턴을 나타낸 것이다. 1,8, 마커; 2, 12% WG; 3, 12% WG (AP); 4, 12% WG (HP); 5, 12% AFP; 6, 12% AFP (AP); 7, 12% AFP (HP). AP, 상압; HP, 300 MPa. F, 플라보자임; A, 알칼라제; P, 프로타멕스; M, 마루고토 E.

도 23은 밀 글루텐의 효소 가수분해물의 전기영동도 맵을 나타낸 것이다. AP, 상압; HP, 300 MPa.

도 24는 멸치 미세분말의 효소 가수분해물의 전기영동도 맵을 나타낸 것이다. AP, 상압; HP, 300 MPa.

도 25는 1효소 처리에 따른 효소 가수분해물의 가용성 고형물 측정 결과를 나타낸 것이다.

도 26은 2효소 처리에 따른 효소 가수분해물의 가용성 고형물 측정 결과를 나타낸 것이다.

도 27은 3효소 처리에 따른 효소 가수분해물의 가용성 고형물 측정 결과를 나타낸 것이다.

도 28은 4효소 처리에 따른 효소 가수분해물의 가용성 고형물 측정 결과를 나타낸 것이다.

도 29는 밀 글루텐 및 멸치 미세분말의 효소 가수분해물의 가용성 질소 함량을 측정한 것이다. , Total soluble N (AP); , TCAsoluble N (AP); , Total soluble N (HP); , TCAsoluble N (HP). AP, 상압; HP, 300 MPa.

도 30은 밀 글루텐 및 멸치 미세분말의 효소 가수분해물의 DHN을 나타낸 것이다. , 밀 글루텐 (AP); , 밀 글루텐 (HP); , 멸치 미세분말 (AP); , 멸치 미세분말 (HP). AP, 상압; HP, 300 MPa.

도 31은 밀 글루텐 및 멸치 미세분말의 효소 가수분해물의 용해도를 나타낸 것이다. , 밀 글루텐 (AP); , 밀 글루텐 (HP); , 멸치 미세분말 (AP); , 멸치 미세분말 (HP). AP, 상압; HP, 300 MPa.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 비교예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 이들만으로 한정하는 것은 아니다.

실시예 1. 고압 효소분해시스템( high pressure bio - hydrolysis enzyme reactor) 구축 및 이용

물을 압력매개체로 하여 이로부터 발생하는 수압을 이용하여 효소에 의한 고압 생물분해 반응을 수행할 수 있도록 고압 효소분해시스템을 구성하였다(도 1 참고). 본 시스템은 작업 가능한 최대반응온도 및 압력이 각각 70℃와 4000 bar(400 MPa)로서 본 연구에서 추진하고자 하는 식품 효소에 의한 다양한 고압 분해 반응을 수행할 수 있으며, 고압 조건 하에서의 효소 활성 촉진, 분해 기질의 구조 변화를 통한 단시간 내의 효소 분해 및 분해 산물의 생산 수율 증대가 가능하였다. 밀폐형 반응계를 채택함으로써 효소 반응 산물인 무염 천연조미소재 등의 향미 증진이 가능하였다.

실시예 2. 다양한 효소군 확보

고압 생물분해기술을 이용한 천연조미소재 생산에 사용될 효소를 산업용 효소와 카타로그 효소 위주로 다음과 같이 확보하였다.

가. 카타로그 효소

펩신(pepsin)(from porcine gastric mucosa), 트립신(trypsin)(from bovine pancreas), 알파-키모트립신(α-chymotrypsin)(from bovine pancreas), 테르몰리신(thermolysin)(from Bacillus thermoproteolyticus rokko), 파파인(papain)(from papaya latex), 파파인(papain) (from Carica papaya ), 브로멜라인(bromelain) (from pineapple), 트립신(trypsin)(아세틸화된(acetylated)), 피신(ficin)(from fig tree)

나. 산업용 효소

알칼라제(alcalase) 2.4L (subtilisin, from Bacillus licheniformis , Novozyme), 플라보자임(flavourzyme) (aminopeptidase, from Aspergillus oryzae , Novozyme), 프로타멕스(Protamex) (from Bacillus licheniformis and B. amyloliquefaciens , Novozyme), 프로테아제 E(protease E) (미생물 유래, 초임계기술연구소, 동양고압 Group)

실시예 3. 효소 활성 평가시스템 구축

효소의 활성을 색원체 (chromogen)로 아조 염료(azo dye)가 결합된 아조알부민(azoalbumin)과 아조카세인(azocasein)을 대상으로 검색하였다. 이 방법의 장점은 효소의 활성평가를 간편하고 정확하게 행할 수 있다는 것이다. 이때 blank는 효소 용액을 30% TCA 용액으로 미리 불활성화시킨 후 시료와 같이 처리하였으며 (도 2 참고), 실험 전 과정을 scheme으로 도 3에 도시하였다.

실시예 4. 반응변수 및 고압 조건별 효소 활성 변화 측정

가. 효소반응을 위한 기질 농도의 최적화

상기에서 확보한 분해 효소군에 대하여 고압 조건별 효소 활성 변화 실험을 하기 위하여 효소 활성 측정을 위한 기질 농도를 최적화하였다. 트립신을 0.1 M 인산완충용액 (pH 7.5)에 0.5 및 5 mg/mL 농도로 용해한 후 기질의 농도를 0.2-9.5% (w/v)로 변화시키면서 도 3에 도시한 공정을 거쳐 효소 활성을 측정하였다.

기질의 농도를 증가시키면서 효소 활성을 측정한 결과 전형적인 포화곡선을 나타냈다(도 4). 기질의 증가에 따른 활성 변화 폭이 큰 구간인 K _M 구역을 피하여 포화곡선이 나타나기 시작하는 기질 농도 중 낮은 농도를 최적 기질 농도로 선정하였다. 아조알부민의 경우 트립신 농도가 5 mg/mL일 때 3% 농도에서 효소 활성이 포화되는 반면 아조카세인의 경우 0.5 mg/mL의 트립신 농도에서도 효소 활성이 포화되었으므로, 아조카세인의 반응성이 보다 양호한 것으로 관찰되었다. 따라서 이 후의 실험에서는 3% 아조카세인 용액을 기질 용액으로 사용하였다.

나. 고압반응을 위한 효소 농도의 최적화

그 다음 단계로 고압 처리를 위한 효소 농도를 결정하기 위하여, 표 1의 조건에서 3% 아조카세인을 기질 용액으로 하여 농도별 효소 활성을 측정하였다.

그 결과를 도 5 및 도 6에 도시하였다. 카타로그 효소 및 산업용 효소로 구분하여 효소 농도에 따른 활성 변화를 측정한 결과, 기질 증가 시와 비슷하게 효소 농도의 증가에 따라 효소 활성이 포화되는 패턴이 관찰되었다. 이 경우 효소 농도의 선정 시 주로 고려해야 할 사항은 효소 활성이 증가하는 구간의 효소 농도를 선정해야 한다는 점이며 이러한 효소 농도에서 고압 처리효과가 효소 활성에 제대로 반영될 수 있을 것으로 판단하였다. 이와 같은 과정을 거쳐 선정한 효소 농도는 펩신, 알파-키모트립신, 파파인(from papaya latex), 파파인(from Carica papaya ), 브로멜라인, 아세틸화된 트립신, 테르몰리신, 트립신, 피신, 플라보자임, 프로타멕스, 알칼라제 및 프로테아제 E의 경우 각각 5, 5, 5, 5, 5, 0.5, 0.1, 0.5, 1, 5, 2.5, 0.5 및 2.5mg/mL이었다.

다. 고압 처리 조건별 효소의 활성 변화

상기의 실험에서 선정한 효소 농도에서 고압 처리 조건별 효소 활성을 상압 (ambient pressure, 0.1 MPa)하에서의 효소 활성과 비교하였다. 구체적인 실험 조건은 표 2와 같으며, 100 및 300 MPa에서 고압 처리 시간을 60, 120 및 300분으로 하였을 때의 효소 활성의 변화는 도 7 및 도 8에 도시하였다.

효소의 활성 패턴은 100 및 300 MPa에서 대체적으로 비슷하였다. 그러나 일부 효소는 고압내성을 나타내는 반면, 다른 효소는 고압내성을 나타내지 않았다. 대표적으로, 트립신의 경우에는 300 MPa에서 고압 처리 시간에 따라 효소 활성이 보다 증가한 반면, 테르몰리신의 경우에는 300 MPa에서 효소 활성이 거의 완전히 소실되어 고압에 특히 약한 특성을 보여주었다.

일부 효소의 내압 특성을 보다 명확하게 규명하기 위하여 개별 효소별로 100 및 300 MPa에서 고압 처리 시간에 따른 효소 활성을 상압에서의 효소 활성을 100으로 하여 상대활성(relative activity, %)으로 표시하였다 (도 9 및 도 10 참고). 카타로그 효소 중에서는 알파-키모트립신, 펩신, 트립신, 및 아세틸화된 트립신의 내압성이 우수하였고 그 중에서도 트립신의 내압성이 우수하였는바, 300 MPa에서 300분간 고압 처리하였을 때 상압 처리 트립신보다 효소 활성이 40% 증가하였다. 반면 테르몰리신은 300 MPa에서 300분간 고압 처리 한 경우 잔존활성이 5% 이하에 불과하였다. 산업용 효소의 경우에는 프로타멕스가 비교적 고압 처리에 약한 반면 플라보자임, 프로테아제 E, 및 알칼라제의 경우에는 내압 특성이 우수하였다. 이로써, 발명자들은 알파-키모트립신, 펩신, 트립신, 아세틸화된 트립신, 플라보자임, 프로테아제 E 및 알칼라제가 고압내성을 가짐을 알 수 있었다.

이때, 트립신과 테르몰리신간의 극단적인 내압 특성 차는 두 효소의 작용기작과 밀접하게 관련되어 있는 것으로 판단하였다(도 11 참고). 이들 효소의 활성 부위 구조를 비교해보면 세린계 효소인 트립신의 활성부위에는 공유결합만 존재하므로 고압 처리에 의해 파괴되지 않은 것으로 판단하였다. 이에 반해, 금속성 효소 중 하나인 테르몰리신의 경우에는 아연(Zn) 이온이 배위결합에 의하여 활성부위의 아미노산인 히스티딘과 글루탐산과 결합할 뿐만 아니라 효소의 촉매작용에 있어서 중요한 역할을 담당하므로(도 12 참고), 고압 처리는 아연에 의한 배위결합을 파괴하고 그 결과로서 테르몰리신이 효소 활성을 잃는 것으로 추정하였다.

라. 고내압성 효소를 이용한 고압 및 상압 하에서의 열불활성화

앞선 실험에서 선정된 고압내성효소 중 카타로그 효소인 트립신과 산업용 효소인 프로테아제 E에 대하여 상압 및 고압 조건 하에서 시간의존적인 열불활성화 실험을 수행하였으며, 이때 각 온도에서의 열처리 시간은 2, 5, 10, 15, 20, 30, 45 및 60분으로 하였다.

표 3과 4에는 트립신에 대하여 고압 및 상압 하에서의 열불활성화 실험을 행한 결과가 표시되어 있다. 하기 표에서 알 수 있는 것처럼 모든 온도 조건에서 고압 처리는 효소의 열안정성을 크게 증대시키는 것으로 나타났다.

효소 용액을 조제한 후 바로 효소 활성을 측정한 대조군의 활성을 100으로 할때 열처리에 따른 잔존활성(residual activity, %)을 구하여 도 13에 도시하였다. 이 결과를 반-대수좌표 (semi-logarithmic scale)상에서 도시하여 열불활성화에 따른 온도별 1차반응 속도상수를 구하였다(도 14).

표 5와 6에는 프로테아제 E에 대하여 고압 및 상압 하에서의 열불활성화 실험을 행한 결과를 표시하였다. 트립신의 경우와 마찬가지로 모든 온도조건에서 고압 처리결과 효소의 열안정성이 크게 증대되는 것으로 나타났으며 그 증가 정도는 트립신의 경우보다 큰 것으로 나타났다.

대조군의 활성을 100이라 할때 열처리에 따른 잔존활성을 구하여 도 15에 도시하였다. 이 결과를 반-대수좌표 상에서 도시하여 열불활성화에 따른 온도별 1차반응 속도상수를 구하였다(도 16).

도 14 및 도 16의 1차 반응속도상수로부터 아레니우스 플롯(Arrhenius plot)에 의하여 활성화에너지(activation energy, Ea)를 구한 결과를 표 7에 나타냈다. 트립신 및 프로테아제 E에 있어 고압반응의 활성화에너지는 38.9와 51.5 kcal/mol로서 상압반응의 60.2 및 76.5 kcal/mol보다 낮아졌다. 결과적으로, 고압 조건은 효소반응의 활성화에너지를 낮춤에 의하여 효소의 반응속도를 증진시키는 것으로 나타났으며(도 17 참고), 이는 반응산물의 수율 증진으로 나타날 것으로 예상되었다.

실시예 5. 농수산 단백질을 대상으로 한 고압 분해 조건하에서의 효소 가수 분해물 제조

밀 글루텐(wheat gluten) 및 멸치 미세분말(anchovy fine pawder)을 반응기질로 사용하고 물을 반응용매계로 하여 아래와 같이 효소 종류별 가수분해실험을 행하였다. 밀 글루텐과 멸치분말을 증류수에 녹여 12% 용액 상태로 만들었다. 사용된 분해효소는 알칼라제, 프로타멕스, 마루고토(Marugoto) E (프로테아제 E) 및 플라보자임이며, 이들을 각각 1효소, 2효소, 3효소, 및 4효소 조합처리 하였다. 효소 처리 방법으로서, 상압 처리는 50℃ 수조(water bath)에서 1시간 동안 비커 내에서 분해하였으며 고압 처리의 경우는 50℃, 300 MPa에서 1시간 동안 비닐파우치 내에서 분해하였다. 열 불활성화는 90℃ 수조(water bath)에서 10분간 열처리하여 행하였다. 효소 분해 후 원심분리는 10000 g에서 30분간 10℃로 행하였다. 효소 가수분해물에 대하여 전기영동을 행하며 105℃ 드라이 오븐에서 해사를 사용하는 수분측정법에 의하여 가용성고형물(suspended solid, SS)을 측정하였다. 또한, 가수분해물 중 TCA-soluble fraction과 total soluble fraction, 효소처리를 행하지 않은 12% 시료현탁액에 대하여 Kjeldahl 분석에 의하여 질소함량을 측정하여 가수분해도(degree of hydrolysis nitrogen, DHN)를 측정하였다.

가. 효소 가수분해물의 전기영동 패턴 결과

상기 과정에 의해 실행한 가수분해 실험으로부터 얻은 효소 가수분해물의 전기영동 패턴을 조사하였다. 그 결과, 1효소 처리한 경우(도 18), 2효소 처리한 경우(도 19), 3효소 처리한 경우(도 20), 및 4효소 처리한 경우(도 21)와 효소를 처리하지 않은 경우(도 22)의 밴드를 비교하였을 때, 효소를 처리하지 않은 경우보다 효소를 처리한 가수분해물에 있어서 분자질량 수천 이하의 밴드 패턴이 더욱 잘 나타남을 확인할 수 있었다.

밀 글루텐에 1효소 및 3효소를 처리하여 얻은 효소 가수분해물의 전기영동 패턴으로부터 전기영동도 맵을 그려본 결과는 도 23과 같다. 효소 처리구에 따라 약간의 차이가 있지만 효소를 처리하지 않은 경우와 비교했을 때 가수분해에 의한 전기영동도 변화의 효과를 확연히 알 수 있었다.

멸치 미세분말의 전기영동도 맵에서도 밀 글루텐에서 보여준 결과와 비슷한 패턴을 보여주고 있다 (도 24).

나. 효소 가수분해물의 가용성 고형물(soluble solid, SS) 측정 결과

1효소, 2효소, 3효소, 4효소를 처리한 효소 가수분해물에 해사를 이용한 105℃ 건조법에 의하여 가용성 고형물(soluble solid, SS)을 측정한 결과는 하기 표 8과 같다. 1효소 보다는 4효소에서, 상압보다는 고압에서 더 높은 값을 나타내고 있으며, 이것으로부터 효소 분해에 사용된 효소의 가짓수가 많을수록 효소 가수분해가 잘 이루어진다는 것을 알 수 있었고, 고압 조건에서 효소 분해능이 더 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.

표 8의 관계를 그래프로 표시하여 도 25-28을 얻었는바, SS함량과 고압 및 상압 조건하에서의 효소 가수분해와의 관계를 시각적으로 잘 보여주고 있다.

다. 효소 가수분해물의 가수분해도(DHN) 측정 결과

프로테아제에 의해 분해된 가수분해물의 가수분해도(DHN)를 측정한 결과는 표 9 및 표 10과 같다. DHN은 분해된 펩티드 결합의 수가 전체 펩티드 결합의 수에서 차지하는 비율의 척도의 하나로서 사용되는데, SS 측정결과와 마찬가지로 효소처리구의 가짓수가 많을수록, 상압보다는 고압 조건에서 분해된 펩티드의 수가 많기 때문에 DHN과 용해도(solubility)의 값이 높게 나타났다. Blank 값과 비교했을 때 처리한 효소의 수가 늘어날수록 가수분해의 효과가 크다는 것을 알 수 있었다. 하기 표 9에는 상압 처리 결과를 나타내었으며, 하기 표 10은 고압(300 MPa) 처리 결과를 나타내었다.

표 9 및 표 10의 관계를 그래프로 표시하여 도 29-31을 얻었는바, DHN 및 용해도(solubility)와 고압 및 상압 조건하에서의 효소 가수분해와의 관계를 시각적으로 잘 보여주고 있다.

이상에서 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술사상과 아래에 기재될 특허청구범위의 균등범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.