多点置换的蛋白酶变体

发明背景

丝氨酸蛋白酶是羰基水解酶的一个亚组。其包括多种类别的具有广泛 特性和生物功能的酶。Stroud,R.,科学美国人(Sci.Amer.)131:74-88。 尽管其功能的多样性，但丝氨酸蛋白酶的催化机制至少由两种遗传分离 的酶家族来完成：1)枯草杆菌蛋白酶和2)哺乳动物胰凝乳蛋白酶相关 的丝氨酸蛋白酶及同源细菌丝氨酸蛋白酶(例如胰蛋白酶和灰色链霉菌 (S.gresius)胰蛋白酶)。这两个丝氨酸蛋白酶家族显示非常相似的催化 机理。Kraut,J.(1977)，生物化学年述(Annu.Rev.Biochem.),46: 331-358。此外，尽管一级结构不相关，但这两个酶家族的三级结构存在 由丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸组成的氨基酸保守催化三联体。

枯草杆菌蛋白酶是由多种芽孢杆菌属的种及其它微生物大量分泌的丝 氨酸蛋白酶(分子量约为27,500)。已经测定了芽孢杆菌属至少九个不同 种的枯草杆菌蛋白酶的蛋白质序列。Markland,F.S.等人(1983), Hooppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.,364:1537-1540。曾经报道了来源 于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和迟缓芽孢杆菌(B.lentus)几种天然变体的枯草杆菌蛋 白酶的三维晶体结构。这些研究表明，尽管枯草杆菌蛋白酶与哺乳动物 丝氨酸蛋白酶在遗传上是不相关的，但它具有相似的活性部位结构。含 有共价结合的肽抑制剂的枯草杆菌蛋白酶(Robertus,J.D.等人(1972)， 生物化学(Biochemistry),11:2439-2449)或产物复合物(Robertus,J.D. 等人(1976)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.),251:1097-1103)的x- 射线晶体结构也提供了关于枯草杆菌蛋白酶的活性部位和推断的底物结 合裂隙的信息。另外，曾经报道了关于枯草杆菌蛋白酶的大量动力学和 化学修饰研究(Svendsen,B.(1976),Carlsberg研究通讯(Carlsberg Res. Commun.),41:237-291；Markland,F.S.,同前)，并且至少有一条报 道，其中枯草杆菌蛋白酶残基222的甲硫氨酸的侧链被过氧化氢转化为 甲硫氨酸-亚砜(Stauffer,D.C.等人(1965)，生物化学杂志，244:5333- 5338)，并进行了广泛的位点专一诱变(Wells和Estell(1988)TIBS 13: 291-297)。

发明概述

本发明的一个目的在于提供在一个或多个残基位置处含有氨基酸置换 的蛋白酶变体，残基位置相应于选自解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶位 置62、212、230、232、252和257的残基。

尽管可利用任何上述所列氨基酸置换的任一组合，本发明优选的蛋白 酶变体酶包括如下组合的氨基酸残基的置换。所有的残基位置相应于解 淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶位置：

(1)一种蛋白酶变体，包括在位置62以及在一个或多个如下位置：

   103、104、109、159、213、232、236、245、248和252中的

   氨基酸残基的置换；

(2)一种蛋白酶变体，包括在位置212以及在一个或多个如下位

   置：12、98、102、103、104、159、232、236、245、248和252

   中的氨基酸残基的置换；

(3)一种蛋白酶变体，包括在位置230以及在一个或多个如下位置：

   68、103、104、159、232、236、和245中的氨基酸残基的置

   换；

(4)一种蛋白酶变体，包括在位置232以及在一个或多个如下位置：

   1、9、12、61、62、68、76、97、98、101、102、103、104、

   109、130、131、159、183、185、205、209、210、212、213、

   217、230、236、245、248、252、257、260、270和275中的

   氨基酸残基的置换；

(5)一种蛋白酶变体，包括在位置232以及在一个或多个如下位置：

   103、104、236和245中的氨基酸残基的置换；

(6)一种蛋白酶变体，包括在位置232和103以及在一个或多个如

   下位置：1、9、12、61、62、68、76、97、98、101、102、103、

   104、109、130、131、159、183、185、205、209、210、212、

   213、217、230、236、245、248、252、257、260、270和275

   中的氨基酸残基的置换；

(7)一种蛋白酶变体，包括在位置232和104以及在一个或多个如

   下位置：1、9、12、61、62、68、76、97、98、101、102、103、

   104、109、130、131、159、183、185、205、209、210、212、

   213、217、230、236、245、248、252、257、260、270和275

   中的氨基酸残基的置换；

(8)一种蛋白酶变体，包括在位置232和236以及在一个或多个如

   下位置：1、9、12、61、62、68、76、97、98、101、102、103、

   104、109、130、131、159、183、185、205、209、210、212、

   213、217、230、236、245、248、252、257、260、270和275

   中的氨基酸残基的置换；

(9)一种蛋白酶变体，包括在位置232和245以及在一个或多个如

   下位置：1、9、12、61、62、68、76、97、98、101、102、103、

   104、109、130、131、159、183、185、205、209、210、212、

   213、217、230、236、245、248、252、257、260、270和275

   中的氨基酸残基的置换；

(10)一种蛋白酶变体，包括在位置232、103、104、236和245

   以及在一个或多个如下位置：1、9、12、61、62、68、76、97、

   98、101、102、103、104、109、130、131、159、183、185、

   205、209、210、212、213、217、230、236、245、248、252、

257、260、270和275中的氨基酸残基的置换；

(11)一种蛋白酶变体，包括在位置252以及在一个或多个如下位

   置：1、9、12、61、62、68、76、97、98、101、102、103、104、

   109、130、131、159、183、185、210、212、213、217、236、

   245、248、和270中的氨基酸残基的置换；

(12)一种蛋白酶变体，包括在位置252以及在一个或多个如下位

   置：103、104、236和245中的氨基酸残基的置换；

(13)一种蛋白酶变体，包括在位置252和103以及在一个或多个

   如下位置：1、9、12、61、62、68、97、98、101、102、103、

   104、109、130、131、159、183、185、210、212、213、217、

   232、236、245、248、和270中的氨基酸残基的置换；

(14)一种蛋白酶变体，包括在位置252和104以及在一个或多个

   如下位置：1、9、12、61、62、68、97、98、101、102、103、

   104、109、130、131、159、183、185、210、212、213、217、

   232、236、245、248和270中的氨基酸残基的置换；

(15)一种蛋白酶变体，包括在位置252和236以及在一个或多个

   如下位置：1、9、12、61、62、68、97、98、101、102、103、

   104、109、130、131、159、183、185、210、212、213、217、

   232、236、245、248、和270中的氨基酸残基的置换；

(16)一种蛋白酶变体，包括在位置252和245以及在一个或多个

   如下位置：1、9、12、61、62、68、97、98、101、102、103、

   104、109、130、131、159、183、185、210、212、213、217、

   232、236、245、248和270中的氨基酸残基的置换；

(17)一种蛋白酶变体，包括在位置252、103、104、236和245

   以及在一个或多个如下位置：1、9、12、61、62、68、97、98、

   101、102、103、104、109、130、131、159、183、185、210、

   212、213、217、232、236、245、248和270中的氨基酸残基

   的置换；和

(18)一种蛋白酶变体，包括在位置257以及在一个或多个如下位

   置：68、103、104、205、209、210、232、236、245、270和

   275中的氨基酸残基的置换。

更优选的蛋白酶变体的置换选自相应于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋 白酶的表1中位置的残基位置。

                              表1     76     103     104     212     271     76     103     104     252     261     76     103     104     212     258     4     76     103     104     159     217     252     12     62     76     103     104     159     76     103     104     212     268     271     76     87     103     104     212     271     76     103     104     212     245     271     76     103     104     134     141     212     271     76     103     104     212     236     243     271     20     62     76     103     104     68     76     103     104     159     232     236     245     76     103     104     232     245     24     68     76     103     104     159     232     236     245     68     103     104     159     232     236     245     252     68     76     103     104     159     213     232     236     245  260     68     103     104     159     232     236     245     248     252     68     103     104     159     232     236     245     68     103     104     140     159     232     236     245     252

表1(续)     43     68     103     104     159     232     236     245     252     43     68     103     104     159     232     236     245     43     68     103     104     159     232     236     245     252     68     87     103     104     159     232     236     245     252     275     68     103     104     159     232     236     245     257     68     103     104     116     159     232     236     245     68     103     104     159     232     236     245     248     10     68     103     104     159     232     236     245     68     103     104     159     203     232     236     245     68     103     104     159     232     236     237     245     68     76     79     103     104     159     232     236     245     68     103     104     159     183     232     236     245     68     103     104     159     174     206     232     236     245     68     103     104     159     188     232     236     245     68     103     104     159     230     232     236     245     68     98     103     104     159     232     236     245     68     103     104     159     215     232     236     245     68     76     103     104     159     210     232     236     245     68     76     103     104     159     232     236     245     257     76     103     104     232     236     245  257     68     103     104     159     232     236     245     257     275     76     103     104     257     275     68     103     104     159     224     232     236     245     257     76     103     104     159     232     236     245     257     68     76     103     104     159     209     232     236     245     68     76     103     104     159     211     232     236     245     12     68     76     103     104     159     214     232     236     245     68     76     103     104     159     215     232     236     245     12     68     76     103     104     159     232     236     245     20     68     76     103     104     159     232     236     245     259     68     87     76     103     104     159     232     236     245     260     68     76     103     104     159     232     236     245     261     76     103     104     232     236     242     245     68     76     103     104     159     210     232     236     245     12     48     68     76     103     104     159     232     236     245     76     103     104     232     236     245

表1(续)     76     103     104     159     192     232     236     245     76     103     104     147     159     232     236     245     248     251     12     68     76     103     104     159     232     236     245     272     68     76     103     104     159     183     206     232     236     245     68     76     103     104     159     232     236     245     256     68     76     103     104     159     206     232     236     245     27     68     76     103     104     159     232     236     245     68     76     103     104     116     159     170     185     232     236     245     61     68     103     104     159     232     236     245     248     252     43     68     103     104     159     232     236     245     248     252     68     103     104     159     212     232     236     245     248     252     68     103     104     99     159     184     232     236     245     248     252     103     104     159     232     236     245     248     252     68     103     104     159     209     232     236     245     248     252     68     103     104     109     159     232     236     245     248     252     20     68     103     104     159     232     236     245     248     252     68     103     104     159     209     232     236     245     248     252     68     103     104     159     232     236     245     248     252     261     68     103     104     159     185     232     236     245     248     252     68     103     104     159     210     232     236     245     248     252     68     103     104     159     185     210     232     236     245     248     252     68     103     104     159     212     232     236     245     248     252     68     103     104     159     213     232     236     245     248     252     68     103     104     213     232     236     245     248     252     68     103     104     159     215     232     236     245     248     252     68     103     104     159     216     232     236     245     248     252     20     68     103     104     159     232     236     245     248     252     68     103     104     159     173     232     236     245     248     252     68     103     104     159     232     236     245     248     251     252     68     103     104     159     206     232     236     245     248     252     68     103     104     159     232     236     245     248     252     55     68     103     104     159     232     236     245     248     252     68     103     104     159     232     236     245     248     252     255     68     103     104     159     232     236     245     248     252     256     68     103     104     159     232     236     245     248  252     260     68     103     104     159     232     236     245     248     252     257     68     103     104     159     232     236     245     248     252     258     8     68     103     104     159     232     236     245     248     252     269

表1(续)     68     103     104     116     159     232     236     245     248     252     260     68     103     104     159     232     236     245     248     252     261     68     103     104     159     232     236     245     248     252     261     68     76     103     104     159     232     236     245     248     252     68     103     104     232     236     245     248     252     103     104     159     232     236     245     248     252     68     103     104     159     232     236     245     248     252     18     68     103     104     159     232     236     245     248     252     68     103     104     159     232     236     245     248     252     68     76     101     103     104     159     213     218     232     236     245     260     68     103     104     159     228     232     236     245     248     252     33     68     76     103     104     159     232     236     245     248     252     68     76     89     103     104     159     210     213     232     236     245     260     61     68     76     103     104     159     232     236     245  248     252     103     104     159     205     210     232     236     245     61     68     103     104     130     159     232     236     245  248     252     61     68     103     104     133     137     159     232     236     245     248     252     61     103     104     133     159     232     236     245     248     252     68     103     104     159     232     236     245     248     252     68     103     104     159     218     232     236     245     248     252     61     68     103     104     159     160     232     236     245     248     252     3     61     68     76     103     104     232     236     245     248     252     61     68     103     104     159     167     232     236     245     248     252     97     103     104     159     232     236     245     248     252     98     103     104     159     232     236     245     248     252     99     103     104     159     232     236     245     248     252     101     103     104     159     232     236     245     248     252     102     103     104     159     232     236     245     248     252     103     104     106     159     232     236     245     248     252     103     104     109     159     232     236     245     248     252     103     104     159     232     236     245     248     252     261     62     103     104     159     232     236     245     248     252     103     104     159     184     232     236     245     248     252     103     104     159     166     232     236     245     248     252     103     104     159     217     232     236     245     248     252     20     62     103     104     159     213     232     236     245     248     252     62     103     104     159     213     232     236     245     248     252     103     104     159     206     217     232     236     245     248     252

表1(续)     62     103     104     159     206     232     236     245     248     252     103     104     130     159     232     236     245     248     252     103     104     131     159     232     236     245     248     252     27     103     104     159     232     236     245     248     252     38     103     104     159     232     236     245     248     252     38     76     103     104     159     213     232     236     245     260     68     76     103     104     159     213     232     236     245     260     271     68     76     103     104     159     209     213     232     236     245     260     68     76     103     104     159     210     213     232     236     245     260     68     76     103     104     159     205     213     232     236     245     260     68     76     103     104     159     210     232     236     245     260     68     103     104     159     213     232     236     245     260     76     103     104     159     213     232     236     245     260     68     103     104     159     209     232     236     245     68     103     104     159     210     232     236     245     68     103     104     159     230     232     236     245     68     103     104     159     126     232     236     245     68     103     104     159     205     232     236     245     68     103     104     159     210     232     236     245     103     104     159     230     236     245     68     103     104     159     232     236    245     260     103     104     159     232     236     245     68     103     104     159     174     232     236     245     257     68     103     104     159     194     232     236     245     257     68     103     104     159     209     232     236     245     257     103     104     159     232     236     245     257     68     76     103     104     159     213     232     236     245     260     261     68     103     104     159     232     236     245     257     261     103     104     159     213     232     236     245     260     103     104     159     210     232     236     245     248     252     103     104     159     209     232     236     245     257     68     76     103     104     159     210     213     232     236     245     260     12     103     104     159     209     213     232     236     245     260     103     104     209     232     236     245     257     103     104     159     205     210     213     232     236     245     260     103     104     159     205     209     232     236     245     260     68     103     104     159     205     209     210     232     236     245     103     104     159     205     209     210     232     236     245     257

表1(续)     103     104     159     205     209     232     236     245     257     68     103     104     159     205     209     210     232     236     245     260     103     104     159     205     209     210     232     236     245     103     104     159     209     210     232     236     245     103     104     159     205     210     232     236     245     68     103     104     128     159     232     236     245     48     103     104     159     230     236     245     48     68     103     104     159     209     232     236     245     48     68     103     104     159     232     236     245     248     252     48     68     103     104     159     232     236     245     257     261     102     103     104     159     212     232     236     245     248     252     12    102    103     104     159     212     232     236     245     248     252     101     102     103     104     159     212     232     236     245     248     252     98     102     103     104     159     212     232     236     245     248     252     102     103     104     159     213     232     236     245     248     252     103     104     131     159     232     236     245     248     252     103     104     159     184     232     236     245     248     252     103     104     159     232     236     244     245     248     252     62     103     104     159     213     232     236     245     248     252     256     12     62     103     104     159     213     232     236     245     248     252     101     103     104     159     185     232     236     245     248     252     101     103     104     159     206     232     236     245     248     252     101     103     104     159     213     232     236     245     248     252     98     102     103     104     159     232     236     245     248     252     101     102     103     104     159     232     236     245     248     252     98     102     103     104     159     212     232     236     245     248     252     98     102     103     104     159     212     232     236     248     252     62     103     104     109     159     213     232     236     245     248     252     62     103     104     159     212     213     232     236     245     248     252     62     101     103     104     159     212     213     232     236     245     248     252     103     104     159     232     245     248     252     103     104     159     230     245     62     103     104     130     159     213     232     236     245     248     252     101     103     104     130     159     232     236     245     248     252     101     103     104     128     159     232     236     245     248     252     62     101     103     104     159     213     232     236     245     248     252     62     103     104     128     159     213     232     236     245     248     252     62     103     104     128     159     213     232     236     245     248     252

表1(续)     101     103     104     159     232     236     245     248     252     260     101     103     104     131     159     232     236     245     248     252     98     101     103     104     159     232     236     245     248     252     99     101     103     104     159     232     236     245     248     252     101     103     104     159     212     232     236     245     248     252     101     103     104     159     209     232     236     245     248     252     101     103     104     159     210     232     236     245     248     252     101     103     104     159     205     232     236     245     248     252     101     103     104     159     230     236     245     101     103     104     159     194     232     236     245     248     252     76     101     103     104     159     194     232     236     245     248     252     101     103     104     159     230     232     236     245     248     252     62     103     104     159     185     206     213     232     236     245     248     252     271

更优选的蛋白酶变体的置换选自相应于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋 白酶的表2中位置的残基位置。

                                表2  N76D  S103A  V104I  S212P  E271V  N76D  S103A  V104I  N252K  N261Y  N76D  S103A  V104I  S212P  G258R  V4E  N76D  S103A  V104I  G159D  L217E  N252D  Q12H  N62H  N76D  S103A  V104I  G159D  N76D  S103A  V104I  S212P  V268F  E271V  N76D  S87R  S103A  V104I  S212P  E271V  N76D  S103A  V104I  S212P  Q245L  E271V  N76D  S103A  V104I  T134S  S141N  S212P  E271V  N76D  S103A  V104I  S212P  Q236L  N243S  E271V  G20V  N62S  N76D  S103A  V104I  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N76D  S103A  V104I  A232V  Q245R  S24T  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N252K  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  N140D  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N252K

表2(续)  N43S  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N252K  N43K  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N43D  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N252K  V68A  S87G  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N252K  R275S  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  L257V  V68A  S103A  V104I  N116D  G159D  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  R10C  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  V203E  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  K237E  Q245R  V68A  N76D  179N  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  N183D  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  A174V  Q206L  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  S188C  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  A230T  A232V  Q236H  Q245R  V68A  A98T  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  A215T  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248S  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R

表2(续)  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  P210R  A232V  Q236H  Q245R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  L257V  N76D  S103A  V104I  A232V  Q236H  Q245R  L257V  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  L257V  R275H  N76D  S103A  V104I  L257V  R275H  V68A  S103A  V104I  G159D  T224A  A232V  Q236H  Q245R  L257V  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  L257V  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Y209W  A232V  Q236H  Q245R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  G211R  A232V  Q236H  Q245R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  G211V  A232V  Q236H  Q245R  Q12R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Y214L  A232V  Q236H  Q245R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A215R  A232V  Q236H  Q245R  Q12R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  G20R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  S259G  V68A  S87R  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  T260V  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N261G  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N261W  N76D  S103A  V104I  A232V  Q236H  S242P  Q245R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  P210L  A232V  Q236H  Q245R

表2(续)  Q12R  A48V  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N76D  S103A  V104I  A232V  Q236H  Q245R  N76D  S103A  V104I  G159D  Y192F  A232V  Q236H  Q245R  N76D  S103A  V104I  V147I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248S  K251R  Q12R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  A272S  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  N183K  Q206L  A232V  Q236H  Q245R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  S256R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Q206R  A232V  Q236H  Q245R  K27R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  V68A  N76D  S103A  V104I  N116T  G159D  R170S  N185S  A232V  Q236H  Q245R  G61E  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N43D  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  S212P  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  S99N  G159D  N184D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  Y209W  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  Q109R  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  G20R  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  Y209F  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K

表2(续)  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N261D  V68A  S103A  V104I  G159D  N185D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  P210R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  P210T  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  P210S  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  N185D  P210L  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  P210L  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  S212A  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  S212E  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  T213E  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  T213S  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  A103V  V104I  G159D  T213E  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  T213G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  A215V  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  A215R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  S216T  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  S216V  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K

表2(续)  V68A  S103A  V104I  G159D  S216C  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  G20A  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  N173D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  K251V  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  Q206R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252F  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252L  P55S  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252F  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  T255V  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S256N  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S256E  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S256R  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  T260R  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  L257R  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  G258D  I8V  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N269D  V68A  S103A  V104I  N116S  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  T260E  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N261R  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N261D

表2(续)  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  A232S  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236R  Q245R  N248D  N252K  N18S  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245V  N248D  N252K  V68A  N76D  S101T  S103A  V104I  G159D  T213R  N218S  A232V  Q236H  Q245R  T260A  V68A  S103A  V104I  G159D  A228V  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  T33S  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  N76D  E89D  S103A  V104I  G159D  P210L  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  G61E  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  V205I  P210I  A232V  Q236H  Q245R  G61E  V68A  S103A  V104I  S130A  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  G61E  V68A  S103A  V104I  A133S  Q137R  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  G61E  S103A  V104I  A133V  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248G  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  N218S  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  G61E  V68A  S103A  V104I  G159D  S160V  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S3L  G61E  V68A  N76D  S103A  V104I  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K

表2(续)  G61E  V68A  S103A  V104I  G159D  S167F  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  G97E  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  A98D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S99E  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101E  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  G102A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  S106E  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  Q109E  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N261R  S103A  V104I  Q109R  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N62D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  N184D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  S166D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  L217E  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  G20R  N62D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N62D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  Q206R  L217E  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N62D  S103A  V104I  G159D  Q206R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K

表2(续)  S103A  V104I  S130G  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  P131V  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  K27N  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  T38G  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  T38A  N76D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  E271G  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Y209W  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  P210I  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  V205I  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  P210I  A232V  Q236H  Q245R  T260A  V68A  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  N76D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  V68A  S103A  V104I  G159D  Y209W  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  P210I  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  A230V  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104 I  G159D  L126F  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  V205I  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  P210L  A232V  Q236H  Q245R  S103A  V104I  G159D  A230V  Q236H  Q245R

表2(续)  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  T260A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  A174V  A232V  Q236H  Q245R  L257V  V68A  S103A  V104I  G159D  A194S  A232V  Q236H  Q245R  L257V  V68A  S103A  V104I  G159D  Y209W  A232V  Q236H  Q245R  L257V  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  L257V  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  N261W  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  L257V  N261W  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  S103A  V104I  G159D  P210I  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  Y209W  A232V  Q236H  Q245R  L257V  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  P210L  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  Q12R  S103A  V104I  G159D  Y209W  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  S103A  V104I  Y209W  A232V  Q236H  Q245R  L257V  S103A  V104I  G159D  V205I  P210I  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  S103A  V104I  G159D  V205I  Y209W  A232V  Q236H  Q245R  T260A  V68A  S103A  V104I  G159D  V205I  Y209W  P210I  A232V  Q236H  Q245R  S103A  V104I  G159D  V205I  Y209W  P210I  A232V  Q236H  Q245R  L257V  S103A  V104I  G159D  V205I  Y209W  A232V  Q236H  Q245R  L257V

表2(续)  IV68A  S103A  V104I  G159D  V205I  Y209W  P210I  A232V  Q236H  Q245R  T260A  S103A  V104I  G159D  V205I  Y209W  P210I  A232V  Q236H  Q245R  S103A  V104I  G159D  Y209W  P210I  A232V  Q236H  Q245R  S103A  V104I  G159D  V205I  P210I  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  S128L  G159D  A232V  Q236H  Q245R  A48V  S103A  V104I  G159D  A230V  Q236H  Q245R  A48V  V68A  S103A  V104I  G159D  Y209W  A232V  Q236H  Q245R  A48V  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  A48V  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  L257V  N261W  G102A  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  Q12R  G102A  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  G102A  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  A98L  G102A  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  G102A  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  P131V  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  N184S  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  N184G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  V244T  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  V244A  Q245R  N248D  N252K

表2(续)  N62D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S256R  Q12R  N62D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  G159D  N185D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  G159D  Q206E  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  G159D  T213Q  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  A98L  G102A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  G102A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  A98L  G102A  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  A98L  G102A  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  N248D  N252K  N62D  S103A  V104I  Q109R  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N62D  S103A  V104I  G159D  S212G  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N62D  S101G  S103A  V104I  G159D  S212G  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  A232V  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  A230V  Q245R  N62D  S103A  V104I  S130G  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  S130G  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  S128G  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  S128L  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N62D  S101G  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N62D  S103A  V104I  S128G  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N62D  S103A  V104I  S128L  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  T260A  S101G  S103A  V104I  P131V  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  A98V  S101G  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S99G  S101G  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  G159D  Y209W  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  G159D  P210I  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  G159D  V205I  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  G159D  A230V  Q236H  Q245R  S101G  S103A  V104I  G159D  A194P  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N76D  S101G  S103A  V104I  G159D  A194P  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  G159D  A230V  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N62D  S103A  V104I  G159D  N185D  Q206E  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  E271Q

本发明另外一个目的在于提供编码这些蛋白酶变体的DNA序列，以 及含有这些变异体DNA序列的表达载体。

更进一步，本发明的另一目的在于提供用这些载体转化的宿主细胞， 以及能够表达这种DNA而在细胞内或细胞外产生蛋白酶变体的宿主细 胞。

进一步提供一种含有本发明的蛋白酶变体的清洁用组合物。

另外，也提供一种含有本发明的蛋白酶变体的动物饲料。

还提供了一种用于处理纺织品的含有本发明的蛋白酶变体之组合物。

附图简述

图1A-C描述解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的DNA及氨基酸序列， 和该基因的部分限制酶切图谱。

图2描述解淀粉芽孢杆菌(BPN)’和迟缓芽孢杆菌(野生型)枯草 杆菌蛋白酶之间的保守氨基酸残基。

图3A和3B描述四种枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列。最上一行代表 来源于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(有时也称为枯草杆菌蛋白酶 BPN’)的枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列。第二行描述来源于枯草芽孢杆 菌的枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列。第三行描述来源于地衣芽孢杆菌的 枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列。第四行描述来源于迟缓芽孢杆菌的枯草 杆菌蛋白酶(在PCT WO89/06276中也称为枯草杆菌蛋白酶309)的氨 基酸序列。符号*表示与枯草杆菌蛋白酶BPN’相比特定氨基酸残基缺如。

发明详述

蛋白酶是通常用来切割蛋白质或肽的肽键的羰基水解酶。在此使用 时，“蛋白酶”意思是天然存在的蛋白酶或重组蛋白酶。天然存在的蛋白 酶包括α-氨酰肽水解酶、肽酰氨基酸水解酶、酰基氨基水解酶、丝氨酸 羧基肽酶、金属羧基肽酶、巯基蛋白酶、羧基蛋白酶和金属蛋白酶。包 括丝氨酸、金属、巯基和酸性蛋白酶，以及内切蛋白酶和外切蛋白酶。

本发明包括非天然存在的羰基水解酶变体的蛋白酶(蛋白酶变体)， 与衍生出该变体氨基酸序列的前体羰基水解酶相比，其具有不同的蛋白 水解活性、稳定性、底物特异性、pH分布曲线和/或性能特征。特别是， 这些蛋白酶变体具有自然界中未知的氨基酸序列，它是由于前体蛋白酶 的大多数氨基酸残基被替换为不同氨基酸而产生的。前体蛋白酶可以是 天然存在的蛋白酶或重组蛋白酶。

此处有用的蛋白酶变体包含19种天然存在的L-氨基酸中任一种在指 定氨基酸残基位置处的置换。这些置换能在任何前体枯草杆菌蛋白酶(原 核、真核、哺乳动物等)中进行。在整个申请中，以常用的单字母及三 字母密码的形式提及不同的氨基酸。这些密码由Dale,M.W.(1989)，《细 菌分子遗传学》(Molecular Genetics of Bacteria),John Wiley&Sons, Ltd.,附录B确定。

此处有用的蛋白酶变体优选地来源于芽孢杆菌属的枯草杆菌蛋白酶。 更优选地，蛋白酶变体来源于迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶和/或枯草杆 菌蛋白酶309。

枯草杆菌蛋白酶是一般用来切割蛋白质或肽的肽键的细菌或真菌蛋白 酶。在此使用时，“枯草杆菌蛋白酶”意思是天然存在的枯草杆菌蛋白酶 或重组枯草杆菌蛋白酶。已知一系列天然存在的枯草杆菌蛋白酶是由不 同微生物种产生且常常为分泌的。该系列成员的氨基酸序列不是完全同 源的。然而，该系列中的枯草杆菌蛋白酶显示相同或相似类型的蛋白水 解活性。该类丝氨酸蛋白酶具有一种共同的氨基酸序列，该序列定义了 有别于胰凝乳蛋白酶相关种类丝氨酸蛋白酶的催化三联体。枯草杆菌蛋 白酶和胰凝乳蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶都含有包括天冬氨酸、组氨酸 和丝氨酸的催化三联体。在枯草杆菌蛋白酶相关蛋白酶中，这些氨基酸 从氨基端向羧基端阅读的相对顺序是天冬氨酸-组氨酸-丝氨酸。但是， 在胰凝乳蛋白酶相关蛋白酶中相对顺序为组氨酸-天冬氨酸-丝氨酸。 因此，枯草杆菌蛋白酶在此是指含有枯草杆菌蛋白酶相关蛋白酶的催化 三联体的丝氨酸蛋白酶。实例包括但不限于此处图3中所确定的枯草杆 菌蛋白酶。一般而言，并且对于本发明，蛋白酶中氨基酸的编号对应于 分配给图1所示成熟解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶序列的编号。

“重组枯草杆菌蛋白酶”或“重组蛋白酶”是指一种枯草杆菌蛋白酶 或蛋白酶，其中编码枯草杆菌蛋白酶或蛋白酶的DNA序列受到修饰，产 生一种变异(或突变)DNA序列，该序列编码天然存在的氨基酸序列中 一种或多种氨基酸的置换、缺失或插入。产生这种修饰、并且可与此处 公开的方法结合的适当方法包括美国专利RE34,606、美国专利5,204,015 和美国专利5,185,258、美国专利5,700,676、美国专利5,801,038和美国 专利5,763,257中公开的方法。

“非人类的枯草杆菌蛋白酶”及其编码DNA可以从多种原核及真核 生物中获得。原核生物的合适实例包括革兰氏阴性生物如大肠杆菌或假 单胞菌(Pseudomonas)、革兰氏阳性菌如微球菌(Micrococcus)或芽孢 杆菌。可从中获得枯草杆菌蛋白酶及其基因的真核生物的实例包括酵母 如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、真菌如曲霉(Aspergillus)属 的种。

“蛋白酶变体”具有由“前体蛋白酶”的氨基酸序列衍生的氨基酸序 列。前体蛋白酶包括天然存在的蛋白酶和重组蛋白酶。蛋白酶变体的氨 基酸序列通过前体氨基酸序列中一种或多种氨基酸的置换、缺失或插入 而由前体蛋白酶氨基酸序列“衍生”。这种修饰是编码前体蛋白酶氨基酸 序列的“前体DNA序列”的修饰，而不是前体蛋白酶自身的操作。对前 体DNA序列进行这种操作的适当方法包括此处公开的方法，以及本领域 技术人员公知的方法(参见，例如，EP0 328299、WO89/06279和已经 在此引用的美国专利及申请)。

此处鉴定了在相应于选自解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶残基位置 62、212、230、232、252和257处的一个和多个残基位置的定点置换。

优选的变体是具有在相应于表1中解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶位 置的残基位置上置换的组合的那些变体。

更优选的变体是具有在相应于表2中解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶 位置的残基位置上置换的组合的那些变体。

更为优选的变体是具有在相应于表3中解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白 酶位置的残基位置上置换的组合的那些变体。

                              表3  68  103  104  159  232  236  245  252  68  76  103  104  159  213  232  236  245  260  68  103  104  159  232  236  245  248  252  68  103  104  159  232  236  245  68  103  104  140  159  232  236  245  252  43  68  103  104  159  232  236  245  252  43  68  103  104  159  232  236  245  68  103  104  159  232  236  245  257  68  76  103  104  159  210  232  236  245  68  103  104  159  224  232  236  245  257  76  103  104  159  232  236  245  257  68  76  103  104  159  211  232  236  245  12  68  76  103  104  159  214  232  236  245  68  76  103  104  159  215  232  236  245  12  68  76  103  104  159  232  236  245  20  68  76  103  104  159  232  236  245  259  68  76  87  103  104  159  232  236  245  260  68  76  103  104  159  232  236  245  261  12  48  68  76  103  104  159  232  236  245  76  103  104  159  192  232  236  245  76  103  104  147  159  232  236  245  248  251  12  68  76  103  104  159  232  236  245  272  68  76  103  104  159  183  206  232  236  245  68  76  103  104  159  232  236  245  256  68  76  103  104  159  206  232  236  245  27  68  76  103  104  159  232  236  245  68  103  104  159  212  232  236  245  248  252  103  104  159  232  236  245  248  252  68  103  104  159  209  232  236  245  248  252  68  103  104  109  159  232  236  245  248  252  20  68  103  104  159  232  236  245  248  252  68  103  104  159  209  232  236  245  248  252  68  103  104  159  210  232  236  245  248  252  68  103  104  159  212  232  236  245  248  252  68  103  104  159  213  232  236  245  248  252

表3(续)  68  103  104  213  232  236  245  248  252  68  103  104  159  215  232  236  245  248  252  68  103  104  159  216  232  236  245  248  252  20  68  103  104  159  232  236  245  248  252  68  103  104  159  232  236  245  248  252  255  68  103  104  159  232  236  245  248  252  256  68  103  104  159  232  236  245  248  252  260  68  103  104  159  228  232  236  245  248  252  68  76  89  103  104  159  210  213  232  236  245  260  68  103  104  159  218  232  236  245  248  252

这些氨基酸位置编号是指那些分配给图1所示成熟解淀粉芽孢杆菌枯 草杆菌蛋白酶序列的编号。然而，本发明不限于该特定枯草杆菌蛋白酶 的突变，而是扩展到在一定位置处含有这样的氨基酸残基的前体蛋白酶， 该残基“等同”于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶中特别确定的残基。 在本发明的一个优选实施方案中，前体蛋白酶是迟缓芽孢杆菌枯草杆菌 蛋白酶，并在迟缓芽孢杆菌中对应于以上所列位点的等同氨基酸残基位 置处进行置换。

如果前体蛋白酶的残基(氨基酸)位置与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋 白酶中的特定残基或该残基的一部分同源(即，在一级或三级结构中位 置相对应)或类似(即，具有相同或相似的化学结合、反应或相互作用 的功能能力)，则它相当于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的残基。

为了建立与一级结构的同源性，将前体蛋白酶的氨基酸序列直接与解 淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶一级序列相比较，特别与公知在序列已知 的枯草杆菌蛋白酶中不变的一组残基相比较。例如，在此图2显示解淀 粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶与迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶之间的保守 残基。对比保守残基，为维持序列对比进行必要的插入和缺失(即，避 免保守残基由于任意缺失和插入而消除)之后，确定等同于解淀粉芽孢 杆菌枯草杆菌蛋白酶一级序列中特定氨基酸的残基。保守残基的对比优 选地应当保持100％的这些残基。然而，超过75％或低至50％的保守残 基的对比也足以确定等同的残基。催化三联体Asp32/His64/Ser221的保 守性应当保持。Siezen等人(1991)蛋白质工程(Protein Eng.)4(7):719-737 显示了大量丝氨酸蛋白酶的序列对比。Siezen等人将此分组称为枯草杆 菌酶(Subtilase)或枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。

例如，图3中，排列对比了解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽 孢杆菌(carlsbergensis)和迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶之氨基酸序 列，以提供氨基酸序列之间最大量的同源性。这些序列的比较显示，在 每种序列中含有许多保守残基。图2中确定了这些保守残基(BPN’与迟 缓芽孢杆菌之间)。

因此，可用这些保守残基确定其它枯草杆菌蛋白酶，诸如迟缓芽孢杆 菌枯草杆菌蛋白酶(1989年7月13日公布的PCT公开文本WO 89/06279)、此处优选的蛋白酶前体酶或被称为PB92的枯草杆菌蛋白酶 (EP0 328 299，它与优选的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶高度同源)中 与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶相应的等同氨基酸残基。在图3A和3B 中将这些枯草杆菌蛋白酶中某些氨基酸序列与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌 蛋白酶的序列相对比，产生保守残基的最大同源性。如所能看到的，与 解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶相比，迟缓芽孢杆菌序列中存在大量缺 失。因此，例如，在其它枯草杆菌蛋白酶中与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌 蛋白酶中的Val165等同的氨基酸对于迟缓芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌而言 是异亮氨酸。

也可以通过测定已经通过x-射线晶体分析法确定三级结构的前体蛋白 酶在三级结构水平上的同源性，来确定“等同的残基”。等同的残基被定 义为前体蛋白酶和解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶特定氨基酸残基的两 个或多个主链原子的原子坐标(N对N、CA对CA、C对C和O对O) 经对比后在0.13nm优选地0.1nm之内的残基。在定向并定位最佳模型之 后完成对比，得到所述蛋白酶与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的非氢 蛋白质原子的原子坐标的最大重叠。最佳模型是在可获得的最高分辨力 时对于实验衍射数据可得到最低R因子的晶体模型。

与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶特定残基功能类似的等同残基被定 义为前体蛋白酶的如下氨基酸，它们可采取一种构象，使得它们以一种 确定的方式改变、修饰或贡献于蛋白质结构、底物结合或催化，且其归 因于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的特定残基。此外，它们是前体蛋 白酶的那类残基(通过x-射线晶体分析法已获得其三级结构)，其占据了 类似位点，使得尽管基于占据同源位点，特定残基的主链原子也许不能 满足等同的标准，但该残基的至少两个侧链原子之原子坐标位于解淀粉 芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶相应侧链原子的0.13nm内。在EPO公开文本 0 251 446(相当于美国专利5,182,204，其公开内容在此引用作为参考) 中阐述了解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的三维结构的坐标，并能如上 所述用来在三级结构水平上确定等同的残基。

为了置换所确定的某些残基是保守残基，而其它的则不是。对于不保 守的残基而言，一种或多种氨基酸的置换限于产生这样一种变体的置换， 该变体具有一种与自然中所发现的氨基酸序列不对应的序列。对于保守 残基而言，这些置换不能产生天然存在的序列。本发明的蛋白酶变体包 括蛋白酶变体的成熟形式，以及这些蛋白酶变体的原-形式和前原-形式。 前原-形式是优选的结构，因为其有利于蛋白酶变体的表达、分泌和成熟。

“原序列”是指与蛋白酶成熟形式的N端部分结合的氨基酸序列， 当它被去除后，导致该蛋白酶“成熟”形式的出现。实质上发现许多蛋 白水解酶为翻译酶原产物，在不存在翻译后加工的情况下以该方式表达。 用于产生蛋白酶变体的一种优选原序列是解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白 酶的推定的原序列，尽管也可使用其它蛋白酶原序列。

“信号序列”或“前序列”是指与蛋白酶N端部分结合或与原蛋白 酶N端部分结合的任何氨基酸序列，它们可能参与蛋白酶成熟形式或原 形式的分泌。信号序列的这种定义是一种功能性定义，意为包括蛋白酶 基因N端部分所编码的所有氨基酸序列，其在天然条件下参与蛋白酶分 泌的实现。本发明利用这些序列实现此处所述蛋白酶变体的分泌。一种 可能的信号序列包含枯草芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶信号序列的前7个氨 基酸残基，这些残基与迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶信号序列(ATCC 21536)的剩余部分相融合。

蛋白酶变体的“前原”形式由含有与蛋白酶氨基端有效连接的原序列 的蛋白酶成熟形式和与原序列氨基端有效连接的“前”序列或“信号” 序列组成。

“表达载体”是指一种DNA构建体，其含有与能实现该DNA在适 当宿主中表达的适当控制序列有效连接的DNA序列。这类控制序列包括 实现转录的启动子、控制这种转录的任意操纵子序列、编码适当mRNA 核糖体结合位点的序列和控制转录与翻译终止的序列。载体可以是质粒、 噬菌体颗粒，或者仅仅是有效的基因组插入片段。一旦转化到适当宿主 中，载体可不依赖于宿主基因组复制并起作用，或者在某些情况中可能 整合到基因组自身中。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时交换使用， 因为质粒是目前最常用的载体形式。然而，本发明意在包括表达载体的 其它形式，它们具有等同的功能，并且是或者可成为本领域所公知的。

本发明中所用的“宿主细胞”通常是原核或真核宿主，它们优选地用 美国专利RE34,606中公开的方法操作，以使其不能分泌酶促活性的内 切蛋白酶。表达蛋白酶的一种优选宿主细胞是芽孢杆菌株BG2036，它缺 乏具有有酶活性的中性蛋白酶和碱性蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶)。美国专 利5,264,366中详述了菌株BG2036的构建。表达蛋白酶的其它宿主细胞 包括枯草芽孢杆菌I168(在美国专利RE34,606和美国专利5,264,366中 也有描述，其公开内容在此引用作为参考)，以及任何合适的芽孢杆菌属 的菌株，如地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌等。

用以重组DNA技术构建的载体转化或转染宿主细胞。这些转化的宿 主细胞能复制编码蛋白酶变体的载体或表达希望的蛋白酶变体。对于编 码蛋白酶变体前-形式或前原-形式的载体而言，这些变体当表达时一般由 宿主细胞向宿主细胞培养基中分泌。

当描述两个DNA区域之间的关系时，“有效连接”仅意味着它们在 功能上彼此相关。例如，如果一种前序列作为信号序列参与蛋白质成熟 形式的分泌，最可能的是参与信号序列的切割，则该前序列与肽有效连 接。如果一种启动子控制一种编码序列的转录，则该启动子与该序列有 效连接；如果一种核糖体结合位点位于一定位置使得翻译成为可能，则 它与编码序列有效连接。

编码天然存在的前体蛋白酶的基因可依照本领域技术人员公知的通用 方法获得。这些方法一般包括：合成含有编码目标蛋白酶区推定序列的 标记探针、由表达该蛋白酶的生物制备基因组文库，以及通过与该探针 杂交为了获得目标基因筛选该文库。然后对阳性杂交克隆作图并测定。

然后用克隆的蛋白酶转化宿主细胞，以表达该蛋白酶。然后将蛋白酶 基因连接于高拷贝数质粒中。该质粒在宿主中复制，在此意义上它含有 质粒复制所必需的众所周知的元件：与所述基因有效连接的启动子(如 果它可被宿主识别，即转录，则可作为基因本身的同源启动子)、转录终 止区和聚腺苷酸化区(在某些真核宿主细胞中，它对于由宿主从蛋白酶 基因转录的mRNA的稳定性是必需的)，它是外源的或由蛋白酶基因的 内源终止区所提供的，质粒中还期望含有选择性基因，如抗生素抗性基 因，它使得质粒感染的宿主细胞通过在含有抗生素的培养基中生长以维 持连续培养成为可能。高拷贝数质粒也含有宿主的复制起点，从而能在 细胞质中不受染色体限制地产生大量质粒。然而，宿主基因组中整合多 拷贝的蛋白酶基因也处于本发明之内。利用对同源重组特别敏感的原核 和真核生物利于此过程。

该基因可能是天然迟缓芽孢杆菌基因。此外，也可以产生编码天然存 在的或突变的前体蛋白酶的合成基因。这种方法中，测定前体蛋白酶的 DNA和/或氨基酸序列。之后合成多个、重叠的合成单链DNA片段，杂 交并连接后产生编码前体蛋白酶的合成DNA。在美国专利5,204,015的 实施例3中描述了合成的基因构建体的一个实例，其公开内容在此引用 作为参考。

一旦克隆了天然存在的或合成的前体蛋白酶基因，即进行大量修饰， 以增强天然存在的前体蛋白酶合成之外的基因用途。这些修饰包括如美 国专利RE34,606和EPO公布号0 251 446所公开的重组蛋白酶的产生 和此处所述的蛋白酶变体的产生。

可用下列盒式诱变法促进本发明的蛋白酶变体的构建，尽管也可使用 其它方法。首先，获得天然存在的编码蛋白酶的基因，并全部或部分测 序。然后为了寻找希望在编码的酶中进行一个或多个氨基酸突变(缺失、 插入或置换)的位点，扫描该序列。评价侧翼于该位点的序列是否存在 估计限制酶切位点的存在，用于将基因的短片段替换为表达时编码不同 突变体的寡核苷酸集合体。这些限制酶切位点优选地是蛋白酶基因内的 唯一位点，以便于基因片段的置换。然而，可使用在蛋白酶基因中不过 度丰余的任何适宜的限制酶切位点，只要限制酶切消化产生的基因片段 能够在适当的序列中重新装配即可。如果在与所选位点适当距离内(10-15 个核苷酸)的位置处不存在限制酶切位点，则可通过以在最终构建中不 改变读框也不改变所编码氨基酸的方式置换基因中的核苷酸来产生这些 位点。为了改变其序列以符合目标序列，基因突变依照公知的方法通过 M13引物延伸来实现。根据遗传密码的丰余性、基因的限制酶图谱和大 量不同的限制酶，常规进行定位适当侧翼区并估计所需改变以得到两种 适宜的限制酶切位点序列的工作。注意到如果可获得适宜的侧翼限制酶 切位点，则上述方法需要仅仅与不含该位点的侧翼区结合应用。

一旦克隆了天然存在的DNA或合成的DNA，即用同源的限制酶消化 侧翼于待突变位点的限制酶切位点，并将多数末端互补的寡核苷酸盒连 接于该基因中。该方法简化了诱变，因为能合成所有寡核苷酸使其具有 相同的限制酶切位点，且合成的接头不是产生限制酶切位点所必需的。

在此使用时，蛋白水解活性被定义为每毫克活性酶的肽键水解率。测 定蛋白水解活性有许多众所周知的方法(K.M.Kalisz，“微生物蛋白酶” 《生物化学工程/生物技术进展》(Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology),A.Fiechter编，1988)。除了改进的蛋白水 解活性之外，或者作为一种备择，本发明的变异蛋白酶可能具有其它改 进的性质，如Km、kcat或kcat/Km比值和/或改进的底物特异性和/或改进的 pH活性分布曲线。这些酶能量身定做般地用于例如预计在肽制剂中存在 的特定底物，或适于水解过程如洗衣用途。

本发明的一个方面，目的在于获得一种与前体蛋白酶相比，在至少一 种去污剂配方中和、或在至少一种洗涤条件下具有改变的，优选的改善 的洗涤性能的蛋白酶变体。

洗涤条件多种多样，包括不同的去污剂配方、洗涤用水体积、洗涤用 水温度和可接触蛋白酶变体的洗涤时间。例如，在不同领域中使用的去 污剂配方在洗涤用水(wash water)中含有不同浓度的有关成分。例如， 欧洲去污剂体系一般在洗涤用水中含有大约4500-5000ppm的去污剂成 分，而日本去污剂体系一般在洗涤用水中含有大约667ppm的去污剂成 分。在北美洲，尤其在美国，去污剂体系一般在洗涤用水中含有约975ppm 的去污剂成分。

低去污剂浓度体系包括在洗涤用水中存在低于大约800ppm的去污 剂成分的去污剂。日本去污剂一般被认为是低去污剂浓度体系，因为它 们在洗涤用水中存在大约667ppm的去污剂成分。

中去污剂浓度包括在洗涤用水中存在大约800ppm到约2000ppm的 去污剂成分的去污剂。北美去污剂一般被认为是中去污剂浓度体系，因 为它们在洗涤用水中存在大约975ppm的去污剂成分。巴西的体系一般 在洗涤用水中存在大约1500ppm的去污剂成分。

高去污剂浓度体系包括在洗涤用水中存在高于大约2000ppm的去污 剂成分的去污剂。欧洲去污剂一般被认为是高去污剂浓度体系，因为它 们在洗涤用水中存在大约4500-5000ppm的去污剂成分。

拉丁美洲去污剂一般是高泡沫磷酸盐助洗去污剂，在拉丁美洲使用的 去污剂范围可能处于中及高去污剂浓度，因为在洗涤用水中它们有 1500ppm到6000ppm的去污剂成分。如上所述，巴西的体系一般在洗涤 用水中含有大约1500ppm的去污剂成分。然而，其它高泡沫磷酸盐助洗 去污剂地区，不限于其它拉丁美洲国家，可能有在洗涤用水中存在可达 大约6000ppm的去污剂成分的高去污剂浓度体系。

根据前述，显然典型洗涤溶液中去污剂组合物的浓度在全世界范围内 各不相同，从低于大约800ppm的去污剂组合物(“低去污剂浓度地区”)， 例如在日本为大约667ppm，到约800ppm-约2000ppm(“中去污剂浓度 地区”)，例如在美国约为975ppm、在巴西约为1500ppm，到高于大约 2000ppm(“高去污剂浓度地区”)，例如在欧洲为大约4500ppm-约 5000ppm，在高泡沫助洗剂地区约为6000ppm。

典型洗涤溶液的浓度由经验确定。例如，在美国，一种典型的洗涤机 可容纳大约64.4升体积的洗涤溶液。因此，为了获得在洗涤溶液中大约 975ppm去污剂的浓度，必须向64.4升洗涤溶液中加入大约62.79克去污 剂组合物。这种量是由消费者用去污剂所带量杯测量的加入洗涤用水中 的典型量。

作为又一实例，不同地理区域使用不同洗涤温度。在日本的洗涤用水 温度一般低于在欧洲使用的温度。

根据本发明的一个方面，包括了在至少一种洗涤条件下显示具有改善 的洗涤性能的蛋白酶变体。

本发明的另一方面中，已确定在选自相应于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌 蛋白酶之62、212、230、232、252和257残基位置的氨基酸置换对于酶 之洗涤性能的改善十分重要。

这些置换优选地在迟缓芽孢杆菌(重组的或天然型)枯草杆菌蛋白酶 中进行，尽管该置换也可在任何芽孢杆菌蛋白酶，优选地在芽孢杆菌属 的枯草杆菌蛋白酶中进行。

根据用变异蛋白酶获得的筛选结果，解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶 中的显著突变对于这些酶的蛋白水解活性、性能和/或稳定性以及这些变 异酶的清洁或洗涤能力至关重要。

本发明的许多蛋白酶变体可用于配制不同的去污剂组合物或个人护理 制剂如洗发剂或洗涤剂。许多公知的化合物是在含有本发明之蛋白酶突 变体的组合物中有用的适当表面活性剂。其包括非离子、阴离子、阳离 子或两性离子去污剂，如Barry J.Anderson的US4,404,128和Jiri Flora 等人的US4,261,868中所公开的。一种合适的去污剂制剂是美国专利 5,204,015(前文引用作为参考)的实施例7中所述的制剂。本领域技术 人员熟悉能用作清洁用组合物的不同制剂。除了典型的清洁用组合物之 外，易于理解本发明的蛋白酶变体也可用于使用天然或野生型蛋白酶的 任何目的。因此，例如，这些变体能用于固体肥皂或液体肥皂的用途、 餐具清洁(dishcare)剂、隐形眼镜清洁液或产品、肽水解、废物处理、 纺织品用途、用作蛋白质生产中的融合-切割酶，等等。本发明的变体可 在去污剂组合物中具有增强的性能(与前体相比)。在此使用时，在去污 剂中的增强性能定义为某些酶敏感性污迹如草或血液的清除加强，如在 标准洗涤循环后通过通用评估所测定的。

本发明的蛋白酶能以大约0.01％到大约5％(优选地0.1％-0.5％)的 重量百分比水平配制于已知的pH6.5-12.0的粉末及液体去污剂中。这些 去污剂清洁用组合物也能包含其它的酶如已知的蛋白酶、淀粉酶、纤维 素酶、脂肪酶或糖苷内切酶，以及助洗剂和稳定剂。

本发明的蛋白酶向常规清洁用组合物中的添加不产生任何特殊的应用 限制。换句话说，适合于去污剂的任何温度和pH也适合于该组合物，只 要pH位于上述范围之内，而温度低于所述蛋白酶的变性温度。另外，本 发明的蛋白酶也能在不含去污剂的清洁用组合物中使用，单独或与助洗 剂和稳定剂结合使用。

本发明也涉及含有本发明的蛋白酶变体的清洁用组合物。清洁用组合 物另外也可含有常用于清洁用组合物的添加剂。其能选自但不限于：漂 白剂、表面活性剂、助洗剂、酶和漂白催化剂。本领域的一名普通技术 人员可容易地理解何种添加剂适合包含于组合物中。此处提供的列表绝 不是完全的，而只是作为适当添加剂的实例。本领域的一名普通技术人 员可容易地理解，应当只使用那些与该组合物中的酶及其它成分如表面 活性剂相适合的添加剂。

制成后，清洁用组合物中存在的添加剂的量为大约0.01％-约99.9％， 优选地约1％-约95％，更优选地约1％-约80％。

本发明的变异蛋白酶能包含于动物饲料中，如作为动物饲料添加剂部 分，例如，如US5,612,055、US5,314,692和US5,147,642所述。

本发明的一个方面是含有本发明的变异蛋白酶的用于纺织品处理的组 合物。如出版物如RD216,034、EP134,267、US4,533,359和EP344,259 中所述，能用该组合物处理如丝绸或毛。

以下以实施例的方式描述，而不应理解为对权利要求书范围的限制。

此处引用的所有出版物和专利在此都完全引入作为参考。 实施例1

用本领域众所周知的方法生产并纯化大量蛋白酶变体。所有突变都在 迟缓芽孢杆菌GG36枯草杆菌蛋白酶中进行。变体示于表4。

                                表4  N76D  S103A  V104I  M222S  N76D  A98E  S103A  V104I  N76D  S78T  S103A  V104I  N76D  S103A  V104I  I107V  V4E  N76D  S103A  V104I  N76D  S103A  V104I  I246V  N76D  N77D  S103A  V104I  N76D  S103A  V104I  N183D  N218I  A16T  N76D  S103A  V104I  N248D  A1E  N76D  S103A  V104I  N76D  S103A  V104I  N261D  N76D  S103A  V104I  S160T  N76D  S103A  V104I  S216C  H17Q  N76D  S103A  V104I  S37T  N76D  S103A  V104I  N76D  N77D  S103A  V104I  A174V

表4(续)  T38S  N76D  S103A  V104I  T38S  N76D  S103A  V104I  K237Q  I8V  N76D  S103A  V104I  N76D  S103A  V104I  N183D  R19L  N76D  S103A  V104I  A13V  N76D  S103A  V104I  R19C  N76D  S103A  V104I  N76D  S103A  V104I  N184D  N76D  S103A  V104I  N252D  N76D  S103A  V104I  S259C  N76D  S103A  V104I  K251T  N76D  P86S  S103A  V104I  I72V  N76D  S103A  V104I  N185D  N76D  S103A  V104I  K237E  T274A  N76D  S103A  V104I  S160L  N76D  S103A  V104I  A228V  P55S  N76D  S103A  V104I  S240T  N76D  S103A  V104I  A254T

表4(续)  N76D  S103A  I104N  N204T  N76D  S103A  V104I  N204D  N43S  N76D  S103A  V104I  N76D  S103A  V104I  G159D  R10H  N76D  S103A  V104I  V177A  T58S  N76D  S103A  V104I  N76D  S103A  V104I  A270V  N76D  S103A  V104I  N185D  K27N  N76D  S103A  V104I  N76D  S103A  V104I  L262M  N76D  S78P  S103A  V104I  S24P  N76D  S103A  V104I  N76D  S103A  V104I  S166G  Q236R  K251R  H17L  N76D  S103A  V104I  K237E  N76D  S103A  V104I  S130L  N76D  S103A  V104I  Q109R  N76D  S99R  S103A  V104I  N204T  N76D  S103A  V104I  D181N

表4(续)  Q12R  N76D  S103A  V104I  N76D  S103A  V104I  S212P  E271V  N76D  S103A  V104I  N252K  N261Y  N76D  S103A  V104I  S242T  N76D  S103A  V104I  E271Q  Q12R  N76D  S103A  V104I  S242T  N43S  N76D  S103A  V104I  N116K  N183I  N76D  S103A  V104I  G258R  N76D  S103A  V104I  E271G  G61R  N76D  S103A  V104I  T38S  N76D  S103A  V104I  Q182R  Y263H  N76D  S103A  V104I  Q182R  A272S  N76D  S103A  V104I  Q109R  I246V  N76D  S87G  S103A  V104I  Q206R  H249Q  S265G  N76D  S103A  V104I  Q137R  N238Y  E271V  S103A  V104I  A228T  N76D  S103A  V104I  Q182R  I198V  L21M  N76D  S103A  V104I  Q182R

表4(续)  N76D  S103A  V104I  M119I  Q137R  N76D  S103A  V104I  Q137R  N248S  A13T  N76D  S103A  V104I  Q206R  N76D  S103A  V104I  Q206R  N76D  S103A  V104I  S212P  G258R  T58S  N76D  S103A  V104I  E271G  N76D  S103A  V104I  Q206E  N261D  V4E  N76D  S103A  V104I  Q206E  N76D  N77D  S103A  V104I  Q206E  N76D  S103A  V104I  A158E  N76D  S103A  V104I  Q206E  V4E  N76D  S103A  V104I  G159D  L217E  K251Q  V4E  N76D  S103A  V104I  G159D  L217E  N252D  N76D  N77D  S103A  V104I  A133T  N185D  K251T  N76D  S103A  V104I  G159D  Q206E  V244A  V4E  N76D  S103A  V104I  S188E  V4E  N76D  S103A  V104I  A158E  N76D  N77D  S103A  V104I  N185D

表4(续)  N76D  S103A  V104I  Q206E  K251T  A48T  N76D  S103A  V104I  L111M  G159D  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Q236H  L42V  N76D  S103A  V104I  G159D  Q12H  N62H  N76D  S103A  V104I  G159D  L42I  N76D  S103A  V104I  G159D  N76D  S103A  V104I  G146S  G159D  N76D  S103A  V104I  G159D  N238S  N76D  S103A  V104I  G159D  T224A  N76D  S103A  V104I  S212P  V268F  E271V  N76D  E89A  S103A  V104I  N76D  S87R  S103A  V104I  S212P  E271V  N76D  S103A  V104I  S212P  Q245L  E271V  N76D  S103A  V104I  T134S  S141N  S212P  E271V  N76D  S103A  V104I  S212P  Q236L  N243S  E271V  N76D  S103A  V104I  Q109R  Q245R  N76D  S103A  V104I  Q109R  P210L  G20V  N62S  N76D  S103A  V104I

表4(续)  V68A  N76D  S103A  V104I  Q236H  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Q236H  E271V  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Q236H  Q245R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  L217I  Q236H  E271V  H17Q  V68A  N76D  S103A  V104I  V68A  N76D  S103A  V104I  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Q236R  V68A  L75R  N76D  S103A  V104I  G159D  Q236H  V68A  N76D  N76D  S103A  A114V  V121I  G159D  Q236H  Q245R  Q12R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Q236H  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Y209S  Q236H  T253K  V68A  N76D  S103A  V104I  N117K  G159D  N184S  Q236H  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Q236H  N243I  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Q236H  Q245L  V68A  N76D  S103A  V104I  A142V  G159D  V68A  N76D  S103A  V104I  N123S  G159D  Q236H  H249Y  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Q236H  H249Q  N76D  S103A  V104I  M222S  Q245R

表4(续)  N76D  S103A  V104I  Q12R  M222S  H249R  N76D  S103A  V104I  N173R  M222S  N76D  S103A  V104I  M222S  Y263F  L21M  N76D  S103A  V104I  M222S  K237R  Y263F  N76D  S103A  V104I  Q109R  M222S  N76D  S103A  V104I  Q109R  M222S  E271D  G61R  N76D  S103A  V104I  M222S  N76D  S103A  V104I  Q137R  M222S  N76D  S103A  V104I  Q109R  M222S  N248S  N76D  S103A  V104I  M222S  H249R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Q236H  Q245R  N261D  V68A  N76D  S103A  V104I  S141N  G159D  Q236H  Q245R  T255S  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Q236H  Q245R  R247H  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A174V  N204D  Q236H  Q245R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  N204D  Q236H  Q245R  V68A  N76D  S103A  V104I  A133V  G159D  N218D  Q236H  Q245R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A194I  V203A  Q236H  Q245R

表4(续)  Q12R  N76D  S103A  V104I  M222S  Q245R  N76D  S103A  V104I  A232V  Q245R  S24T  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N252K  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  Q12R  N76D  S103A  I104T  M222S  V244I  Q245R  Q12R  N76D  S103A  M222S  P210T  Q245R  Q12R  N76D  S103A  I104T  S130T  M222S  Q245R  T22K  V68A  N76D  S103A  V104I  V68A  N76D  S103A  N184D  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  N140D  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N252K  N43S  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N252K  N43K  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N43D  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N252K  V68A  S87G  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N252K  R275S  Q12R  N76D  S103A  I104T  S130T  M222S  Q245R  N248S  L262M

表4(续)  Q12R  N76D  S103A  I104T  S130T  A215V  M222S  Q245R  Q12R  N76D  S103A  I104T  S130T  M222S  V227A  Q245R  L262S  Q12R  N76D  S103A  I104T  S130T  A215T  M222S  Q245R  Q12R  N76D  S103A  I104T  S130T  M222S  Q245R  N261D  N76D  S103A  I104T  S130T  M222S  Q245R  Q12R  N76D  S103A  I104T  S130T  N218D  M222S  Q245R  L262S  N269D  Q12R  S57P  N76D  S103A  I104T  S130T  M222S  Q245R  K251Q  Q12R  N76D  S103A  I104T  S130T  R170S  N185D  M222S  N243D  Q245R  Q12R  N76D  S103A  I104T  S130T  M222S  Q245R  V268A  Q12R  N76D  S103A  I104T  S130T  M222S  P210S  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  L257V  V68A  S103A  V104I  N116D  G159D  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  R10C  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  V203E  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  K237E  Q245R  V68A  N76D  I79N  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  N183D  A232V  Q236H  Q245R

表4(续)  V68A  S103A  V104I  G159D  A174V  Q206L  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  S188C  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  A230T  A232V  Q236H  Q245R  V68A  A98T  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  A215T  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248S  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  P210R  A232V  Q236H  Q245R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  L257V  N76D  S103A  V104I  A232V  Q236H  Q245R  L257V  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  L257V  R275H  N76D  S103A  V104I  L257V  R275H  V68A  S103A  V104I  G159D  T224A  A232V  Q236H  Q245R  L257V  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  L257V  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Y209W  A232V  Q236H  Q245R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  G211R  A232V  Q236H  Q245R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  G211V  A232V  Q236H  Q245R  Q12R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Y214L  A232V  Q236H  Q245R

表4(续)  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A215R  A232V  Q236H  Q245R  Q12R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  G20R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  S259G  V68A  S87R  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  T260V  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N261G  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N261W  N76D  S103A  V104I  A232V  Q236H  S242P  Q245R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  P210L  A232V  Q236H  Q245R  Q12R  A48V  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N76D  S103A  V104I  A232V  Q236H  Q245R  N76D  S103A  V104I  G159D  Y192F  A232V  Q236H  Q245R  N76D  S103A  V104I  V147I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248S  K251R  Q12R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  A272S  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  N183K  Q206L  A232V  Q236H  Q245R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  S256R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Q206R  A232V  Q236H  Q245R  K27R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  V68A  N76D  S103A  V104I  N116T  G159D  R170S  N185S  A232V  Q236H  Q245R

表4(续)  G61E  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N43D  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  S212P  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  S99N  G159D  N184D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  Y209W  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  Q109R  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  G20R  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  Y209F  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N261D  V68A  S103A  V104I  G159D  N185D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  P210R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  P210T  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  P210S  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  N185D  P210L  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  P210L  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  S212A  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K

表4(续)  V68A  S103A  V104I  G159D  S212E  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  T213E  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  T213S  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  A103V  V104I  G159D  T213E  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  T213G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  A215V  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  A215R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  S216T  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  S216V  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  S216C  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  G20A  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  N173D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  K251V  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  Q206R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252F  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252L  P55S  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252F

表4(续)  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  T255V  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S256N  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S256E  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S256R  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  T260R  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  L257R  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  G258D  I8V  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N269D  V68A  S103A  V104I  N116S  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  T260E  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N261R  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N261D  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  A232S  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236R  Q245R  N248D  N252K  N18S  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245V  N248D  N252K  V68A  N76D  S101T  S103A  V104I  G159D  T213R  N218S  A232V  Q236H  Q245R  T260A

表4(续)  V68A  S103A  V104I  G159D  A228V  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  T33S  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  N76D  E89D  S103A  V104I  G159D  P210L  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  G61E  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  V205I  P210I  A232V  Q236H  Q245R  G61E  V68A  S103A  V104I  S130A  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  G61E  V68A  S103A  V104I  A133S  Q137R  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  G61E  S103A  V104I  A133V  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248G  N252K  V68A  S103A  V104I  G159D  N218S  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  G61E  V68A  S103A  V104I  G159D  S160V  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S3L  G61E  V68A  N76D  S103A  V104I  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  G61E  V68A  S103A  V104I  G159D  S167F  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  G97E  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  A98D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S99E  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101E  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K

表4(续)  G102A  S103A V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  S106E  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  Q109E  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N261R  S103A  V104I  Q109R  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N62D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  N184D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  S166D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  L217E  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  G20R  N62D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N62D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  Q206R  L217E  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N62D  S103A  V104I  G159D  Q206R A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  S130G  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  P131V  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  K27N  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  T38G  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  T38A  N76D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A

表4(续)  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  E271G  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Y209W  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  P210I  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  V205I  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  P210I  A232V  Q236H  Q245R  T260A  V68A  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  N76D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  V68A  S103A  V104I  G159D  Y209W  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  P210I  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  A230V  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  L126F  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  V205I  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  P210L  A232V  Q236H  Q245R  S103A  V104I  G159D  A230V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  T260A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  G159D  A174V  A232V  Q236H  Q245R  L257V  V68A  S103A  V104I  G159D  A194S  A232V  Q236H  Q245R  L257V

表4(续)  V68A  S103A  V104I  G159D  Y209W  A232V  Q236H  Q245R  L257V  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  L257V  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  N261W  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  L257V  N261W  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  S103A  V104I  G159D  P210I  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  Y209W  A232V  Q236H  Q245R  L257V  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  P210L  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  Q12R  S103A  V104I  G159D  Y209W  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  S103A  V104I  Y209W  A232V  Q236H  Q245R  L257V  S103A  V104I  G159D  V205I  P210I  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  S103A  V104I  G159D  V205I  Y209W  A232V  Q236H  Q245R  T260A  V68A  S103A  V104I  G159D  V205I  Y209W  P210I  A232V  Q236H  Q245R  S103A  V104I  G159D  V205I  Y209W  P210I  A232V  Q236H  Q245R  L257V  S103A  V104I  G159D  V205I  Y209W  A232V  Q236H  Q245R  L257V  V68A  S103A  V104I  G159D  V205I  Y209W  P210I  A232V  Q236H  Q245R  T260A  S103A  V104I  G159D  V205I  Y209W  P210I  A232V  Q236H  Q245R  S103A  V104I  G159D  Y209W  P210I  A232V  Q236H  Q245R

表4(续)  S103A  V104I  G159D  V205I  P210I  A232V  Q236H  Q245R  V68A  S103A  V104I  S128L  G159D  A232V  Q236H  Q245R  A48V  S103A  V104I  G159D  A230V  Q236H  Q245R  A48V  V68A  S103A  V104I  G159D  Y209W  A232V  Q236H  Q245R  A48V  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  A48V  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  L257V  N261W  G102A  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  Q12R  G102A  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  G102A  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  A98L  G102A  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  G102A  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  P131V  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  N184S  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  N184G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  V244T  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  V244A  Q245R  N248D  N252K  N62D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S256R  Q12R  N62D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K

表4(续)  S101G  S103A  V104I  G159D  N185D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  G159D  Q206E  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  G159D  T213Q  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  A98L  G102A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  G102A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  A98L  G102A  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  A98L  G102A  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  N248D  N252K  N62D  S103A  V104I  Q109R  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N62D  S103A  V104I  G159D  S212G  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N62D  S101G  S103A  V104I  G159D  S212G  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  A232V  Q245R  N248D  N252K  S103A  V104I  G159D  A230V  Q245R  N62D  S103A  V104I  S130G  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  S130G  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  S128G  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  S128L  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N62D  S101G  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N62D  S103A  V104I  S128G  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K

表4(续)  N62D  S103A  V104I  S128L  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  T260A  S101G  S103A  V104I  P131V  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  A98V  S101G  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S99G  S101G  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  G159D  Y209W  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  G159D  P210I  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  G159D  V205I  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  G159D  A230V  Q236H  Q245R  S101G  S103A  V104I  G159D  A194P  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N76D  S101G  S103A  V104I  G159D  A194P  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S101G  S103A  V104I  G159D  A230V  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N62D  S103A  V104I  G159D  N185D  Q206E  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  E271Q 实施例2

用美国系列号60/068,796“一种测定优选的酶和/或优选的去污剂组合 物的改进方法”中所述的微观(microswatch)测定法检测如实施例1所 述制备的大量蛋白酶变体在两种类型的去污剂及洗涤条件中的表现。

表5中列出检测的变体以及在两种不同去污剂中测试的结果。A栏； 0.67g/l过滤的Ariel Ultra(Procter&Gamble,Cincinnati,OH，美国)， 溶于每加仑含有3格令混合Ca2+/Mg2+硬度的溶液中，20℃下每孔使用 0.3ppm的酶。B栏；3.38g/l过滤的Ariel Futur(Procter&Gamble, Cincinnati,OH，美国)，溶于每加仑含有15格令混合Ca2+/Mg2+硬度的溶 液中，40℃下每孔使用0.3ppm的酶。

                              表5     A     B  N76D  S103A  V104I     1     1  S103A  V104I  A228T  0.56  1.11  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N252K  1.41  1.85  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.77  1.20  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  2.26  1.67  V68A  S103A  V104I  N140D  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N252K  2.96  1.42  N43S  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N252K  1.91  1.80  N43K  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  2.05  1.78  N43D  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N252K  2.00  1.34  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  L257V  2.38  1.67  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  2.83  0.53  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  K237E  Q245R  2.87  0.20  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N252S  2.56  1.41  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  L257V  R275H  3.97  0.47  V68A  S103A  V104I  G159D  T224A  A232V  Q236H  Q245R  L257V  3.35  1.28  G61E  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  3.77  0.09 表5(续)  N43D  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  3.50  0.47  V68A  S103A  V104I  G159D  S212P  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.81  1.46  N76D  A98E  S103A  V104I  1.56  0.28  V4E  N76D  S103A  V104I  1.22  0.33  N76D  N77D  S103A  V104I  1.13  0.36  A16T  N76D  S103A  V104I  N248D  1.22  0.43  A1E  N76D  S103A  V104I  1.12  0.32  N76D  S103A  V104I  N261D  1.54  0.33  N76D  S103A  V104I  S216C  1.04  0.13  N76D  N77D  S103A  V104I  A174V  1.09  0.35  T38S  N76D  S103A  V104I  K237Q  1.11  0.55  N76D  S103A  V104I  N183D  1.50  0.25  R19L  N76D  S103A  V104I  1.11  0.48  R19C  N76D  S103A  V104I  1.05  0.19  N76D  S103A  V104I  N184D  1.32  0.29  N76D  S103A  V104I  N252D  1.19  0.53  N76D  S103A  V104I  S259C  0.92  0.12  N76D  S103A  V104I  K251T  1.31  0.43 表5(续)  N76D  P86S  S103A  V104I  1.00  0.98  I72V  N76D  S103A  V104I  N185D  1.70  0.37  N76D  S103A  V104I  K237E  T274A  1.12  0.16  N76D  S103A  V104I  A228V  1.13  0.99  N76D  S103A  V104I  G159D  1.88  0.23  H17L  N76D  S103A  V104I  K237E  1.29  0.28  N76D  S103A  V104I  S130L  0.52  0.71  N76D  S103A  V104I  Q109R  0.23  1.26  N76D  S99R  S103A  V104I  N204T  0.21  0.87  N76D  S103A  V104I  D181N  0.24  1.07  Q12R  N76D  S103A  V104I  0.61  1.31  N76D  S103A  V104I  S212P  E271V  0.69  1.35  N76D  S103A  V104I  N252K  N261Y  0.37  1.02  N76D  S103A  V104I  S242T  0.98  0.92  N76D  S103A  V104I  E271Q  0.63  1.25  Q12R  N76D  S103A  V104I  S242T  0.49  1.32  N43S  N76D  S103A  V104I  N116K  N183I  0.39  1.10  N76D  S103A  V104I  G258R  0.34  1.17 表5(续)  N76D  S103A  V104I  E271G  0.57  1.25  N76D  S103A  V104I  Q182R  I198V  0.22  0.95  L21M  N76D  S103A  V104I  Q182R  0.24  0.98  N76D  S103A  V104I  M119I  Q137R  0.13  0.91  N76D  S103A  V104I  Q137R  N248S  0.16  1.02  A13T  N76D  S103A  V104I  Q206R  0.31  1.01  N76D  S103A  V104I  Q206R  0.33  1.02  N76D  S103A  V104I  S212P  G258R  0.38  1.06  T58S  N76D  S103A  V104I  E271G  0.84  1.26  N76D  S103A  V104I  Q206E  N261D  1.97  0.04  V4E  N76D  S103A  V104I  Q206E  1.51  0.05  N76D  N77D  S103A  V104I  Q206E  1.40  0.04  N76D  S103A  V104I  A158E  1.95  0.16  N76D  S103A  V104I  Q206E  2.41  0.88  N76D  N77D  S103A  V104I  A133T  N185D  K251T  1.34  0.03  N76D  S103A  V104I  Q206E  N261D  1.78  0.04  N76D  S103A  V104I  G159D  Q206E  V244A  2.16  0.04  V4E  N76D  S103A  V104I  S188E  1.91  0.04 表5(续)  V4E  N76D  S103A  V104I  A158E  2.06  0.04  N76D  S103A  V104I  Q206E  K251T  1.73  0.06  A48T  N76D  S103A  V104I  L11M  G159D  2.04  0.16  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Q236H  3.20  0.09  L42V  N76D  S103A  V104I  G159D  1.83  0.17  Q12H  N62H  N76D  S103A  V104I  G159D  1.42  0.14  L42I  N76D  S103A  V104I  G159D  1.86  0.18  N76D  S103A  V104I  G146S  G159D  1.87  0.19  N76D  S103A  V104I  G159D  N238S  1.90  0.15  N76D  S103A  V104I  G159D  T224A  1.61  0.07  N76D  S103A  V104I  S212P  V268F  E271V  0.44  1.42  N76D  S87R  S103A  V104I  S212P  E271V  0.39  2.03  N76D  S103A  V104I  S212P  Q245L  E271V  0.62  1.79  N76D  S103A  V104I  Q109R  Q245R  0.11  1.78  N76D  S103A  V104I  Q109R  P210L  0.12  1.21  G20V  N62S  N76D  S103A  V104I  1.63  0.78  V68A  N76D  S103A  V104I  Q236H  2.37  0.44  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Q236H  E271V  2.97  0.45 表5(续)  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Q236H  Q245R  3.00  0.61  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  L217I  Q236H  E271V  2.71  0.12  H17Q  V68A  N76D  S103A  V104I  2.46  0.38  V68A  N76D  S103A  V104I  2.46  0.61  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Q236R  3.31  0.11  V68A  L75R  N76D  S103A  V104I  G159D  Q236H  3.06  0.14  V68A  N76D  S103A  V104I  A114V  V121I  G159D  Q236H  Q245R  3.11  0.40  Q12R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Q236H  3.12  0.34  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Y209S  Q236H  T253K  3.18  0.03  V68A  N76D  S103A  V104I  N117K  G159D  N184S  Q236H  2.78  0.06  V68A  N76D  S103A  V104I  Q236H  2.49  0.57  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Q236H  Q245L  3.37  0.03  V68A  N76D  S103A  V104I  N123S  G159D  Q236H  H249Y  3.11  0.03  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Q236H  H249Q  3.15  0.04  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Q236H  Q245R  N261D  3.31  0.03  V68A  N76D  S103A  V104I  S141N  G159D  Q236H  Q245R  T255S  3.26  0.62  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Q236H  Q245R  R247H  2.78  0.03  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A174V  N204D  Q236H  Q245R  3.28  0.02 表5(续)  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  N204D  Q236H  Q245R  3.34  0.02  V68A  N76D  S103A  V104I  A133V  G159D  N218D  Q236H  Q245R  3.28  0.03  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  2.91  0.58  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A194I  V203A  Q236H  Q245R  2.86  0.13  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  1.30  1.73  T22K  V68A  N76D  S103A  V104I  1.83  1.13  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  P210R  A232V  Q236H  Q245R  1.28  1.54  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  L257V  3.72  0.8  N76D  S103A  V104I  A232V  Q236H  Q245R  L257V  0.6  1.5  N76D  S103A  V104I  L257V  R275H  1.91  0.15  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  L257V  1.92  1.09  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Y209W  A232V  Q236H  Q245R  3.57  0.99  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  G211R  A232V  Q236H  Q245R  1.74  1.76  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  G211V  A232V  Q236H  Q245R  3.15  1.06  Q12R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Y214L  A232V  Q236H  Q245R  2.33  1.92  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A215R  A232V  Q236H  Q245R  1.67  1.45  Q12R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  2.16  1.72  G20R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  S259G  2.77  1.59 表5(续)  V68A  N76D  S87R  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  T260V  2.62  1.49  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N261G  2.92  0.68  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N261W  2.17  1.37  N76D  S103A  V104I  A232V  Q236H  S242P  Q245R  0.48  1.2  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  P210L  A232V  Q236H  Q245R  2.92  0.76  Q12R  A48V  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  2.09  1.86  N76D  S103A  V104I  A232V  Q236H  Q245R  0.51  1.44  N76D  S103A  V104I  G159D  Y192F  A232V  Q236H  Q245R  1.60  1.14  N76D  S103A  V104I  V147I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248S  K251R  1.35  1.29  Q12R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  A272S  1.92  1.81  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  N183K  Q206L  A232V  Q236H  Q245R  1.17  1.53  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  S256R  2.01  1.72  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  Q206R  A232V  Q236H  Q245R  2.09  1.62  K27R  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  3.00  1.08  V68A  N76D  S103A  V104I  N116T  G159D  R170S  N185S  A232V  Q236H  Q245R  ND  ND  N76D  S103A  V104I  M222S  Q245R  1.01  1.23  Q12R  N76D  S103A  V104I  M222S  H249R  0.57  1.65  N76D  S103A  V104I  N173R  M222S  0.86  0.46 表5(续)  N76D  S103A  V104I  M222S  Y263F  1.24  0.77  L21M  N76D  S103A  V104I  M222S  K237R  Y263F  1.18  0.76  N76D  S103A  V104I  Q109R  M222S  0.52  1.16  N76D  S103A  V104I  Q109R  M222S  E271D  0.56  1.12  G61R  N76D  S103A  V104I  M222S  0.43  0.96  N76D  S103A  V104I  Q137R  M222S  0.42  1.25  N76D  S103A  V104I  M222S  H249R  1.15  1.01  Q12R  N76D  S103A  V104I  M222S  Q245R  0.53  1.46  N76D  S103A  V104I  A232V  Q245R  0.69  1.56  Q12R  N76D  S103A  I104T  M222S  V244I  Q245R  0.66  1.74  Q12R  N76D  S103A  V104I  M222S  P210T  Q245R  0.52  1.56  Q12R  N76D  S103A  I104T  S130T  M222S  Q245R  0.70  1.61  Q12R  N76D  S103A  I104T  S130T  A215V  M222S  Q245R  0.79  1.85  Q12R  N76D  S103A  I104T  S130T  M222S  V227A  Q245R  L262S  0.78  1.56  Q12R  N76D  S103A  I104T  S130T  M222S  Q245R  N261D  1.25  1.30  N76D  S103A  I104T  S130T  M222S  Q245R  1.29  1.30  Q12R  S57P  N76D  S103A  I104T  S130T  M222S  Q245R  K251Q  1.44  0.16  Q12R  N76D  S103A  I104T  S130T  R170S  N185D  M222S  N243D  Q245R  2.01  0.04 表5(续)  Q12R  N76D  S103A  I104T  S130T  M222S  Q245R  V268A  0.77  1.60  Q12R  N76D  S103A  I104T  S130T  M222S  P210S  Q245R  0.73  1.66  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  2.09  0.86 实施例3

表6中列出检测的来自实施例1中的变体以及在四种不同去污剂中测 试的结果。进行如实施例2中的相同操作考察了变体蛋白酶在下列去污 剂中的洗涤性能。A栏；0.67g/l过滤的Ariel Ultra(Procter&Gamble, Cincinnati,OH，美国)，溶于每加仑含有3格令混合Ca2+/Mg2+硬度的溶 液中，20℃下每孔使用0.3ppm的酶。B栏；3.38g/l过滤的Ariel Futur (Procter&Gamble,Cincinnati,OH，美国)，溶于每加仑含有15格令 混合Ca2+/Mg2+硬度的溶液中，40℃下每孔使用0.3ppm的酶。C栏，3.5g/L HSP1去污剂(Procter&Gamble,Cincinnati,OH，美国)，溶于每加仑含 有8格令混合Ca2+/Mg2+硬度的溶液中，20℃下每孔使用0.3ppm的酶 D栏，1.5ml/l Tide KT去污剂(Procter&Gamble,Cincinnati,OH，美国)， 溶于每加仑含有3格令混合Ca2+/Mg2+硬度的溶液中，20℃下每孔使用 0.3ppm的酶。

                                表6     A     B     C     D  N76D  S103A  V104I     1     1     1     1  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  1.44  1.41  1.39  1.26  V68A  S103A  V104I  G159D  Y209W  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.34  1.49  1.65  2.35  V68A  S103A  V104I  Q109R  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  1.05  1.41  1.20  1.19  G20R  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  1.81  1.72  1.66  1.31  V68A  S103A  V104I  G159D  Y209F  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.19  1.38  1.60  2.02  V68A  S103A  V104I  G159D  N185D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.91  0.91  1.48  2.70  V68A  S103A  V104I  G159D  P210R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  0.93  1.39  1.23  0.80  V68A  S103A  V104I  G159D  N185D  P210L  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.67  0.86  1.41  2.88  V68A  S103A  V104I  G159D  P210L  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.22  1.43  1.55  1.78  V68A  S103A  V104I  G159D  S212C  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.30  1.43  1.63  2.07  V68A  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.31  1.47  1.62  2.01  V68A  S103A  V104I  G159D  S212E  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.63  0.56  1.36  2.66  V68A  S103A  V104I  G159D  T213E  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.75  0.50  1.27  2.78  V68A  S103A  V104I  T213S  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  1.11  1.38  1.31  0.75

表6(续)  V68A  A103V  V104I  G159D  T213E  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.27  0.15  1.12  2.01  V68A  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  1.37  1.42  1.37  1.06  V68A  S103A  V104I  G159D  A215V  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.14  1.40  1.53  1.54  V68A  S103A  V104I  G159D  A215R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  1.22  1.58  1.47  1.20  V68A  S103A  V104I  G159D  S216T  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.12  1.36  1.56  1.56  V68A  S103A  V104I  G159D  S216V  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  1.88  1.36  1.47  1.87  V68A  S103A  V104I  G159D  S216C  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.24  0.33  1.07  2.89  V68A  S103A  V104I  G159D  N173D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.43  0.46  1.29  2.42  V68A  S103A  V104I  G159D  Q206R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  0.98  1.46  1.24  0.95  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252F  2.52  1.00  1.42  2.42  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252L  2.05  1.13  1.30  1.85  P55S  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252F  2.61  0.91  1.43  3.22  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  T255V  2.18  1.36  1.58  1.72  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S256N  2.14  1.46  1.59  1.65  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S256E  2.46  0.77  1.33  2.58  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S256R  1.31  1.52  1.46  0.94  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  T260R  1.21  1.41  1.31  1.05  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  L257R  1.51  1.41  0.85  1.18

表6(续)  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  G258D  2.56  0.59  1.30  2.64  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N261R  1.02  1.47  1.37  0.84  V68A  S103A  V104I  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  1.04  1.50  1.32  0.73  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245V  N248D  N252K  2.60  0.93  1.41  2.67  V68A  S103A  V104I  G159D  A228V  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.31  1.38  1.53  1.57  G61E  V68A  S103A  V104I  S130A  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.83  0.25  1.33  2.44  G61E  S103A  V104I  A133V  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.10  0.97  1.36  2.29  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248G  N252K  1.37  1.54  0.89  1.27  V68A  S103A  V104I  G159D  N218S  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.30  1.50  1.62  1.56  G20R  V68A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  1.72  1.72  1.67  1.15  V68A  N76D  E89D  S103A  V104I  G159D  P210L  T213R  A232V  Q236H  Q245R  T260A  1.32  1.30  1.11  1.28  V68A  N76D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.50  0.83  1.43  2.25  G61E  V68A  S103A  V104I  G159D  S160V  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  4.20  0.07  ND  1.28  S3L  G61E  V68A  N76D  S103A  V104I  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  3.47  0.60  ND  1.45  G61E  V68A  S103A  V104I  G159D  Y167F  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  4.32  0.79  ND  1.55  G97E  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  3.14  0.41  ND  1.40  A98D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.71  0.68  ND  1.72  S99E  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.97  0.68  ND  1.71

表6(续)   S101E  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  3.50  0.27  ND  1.90  S101G  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.24  1.80  ND  1.33  G102A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  3.35  1.33  ND  1.69  S103A  V104I  S106E  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  4.88  0.55  ND  2.71  S103A  V104I  Q109E  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  4.22  1.05  ND  2.40  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N261R  5.45  2.19  ND  2.58  S103A  V104I  Q109R  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  3.76  2.16  ND  1.82  N62D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  7.42  0.13  ND  2.46  S103A  V104I  G159D  N184D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  5.43  1.36  ND  2.84  S103A  V104I  G159D  S166D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  5.12  1.21  ND  3.97  S103A  V104I  G159D  L217E  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  6.38  0.95  ND  3.09  G20R  N62D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  3.17  2.83  ND  2.60  N62D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  4.38  1.92  ND  2.54  S103A  V104I  G159D  Q206R  L217E  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  3.05  2.61  ND  1.10  N62D  S103A  V104I  G159D  Q206R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  4.09  2.46  ND  2.55  S103A  V104I  G159D  N184G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.32  2.08  ND  2.40  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  V244T  Q245R  N248D  N252K  2.34  2.04  ND  1.86  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  V244A  Q245R  N248D  N252K  2.24  2.11  ND  1.95

表6(续)  K27N  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.81  1.56  ND  1.82  T38G  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.30  2.09  ND  1.82  N62D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S256R  2.63  2.66  ND  1.44  Q12R  N62D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.01  2.78  ND  1.99  N62D  S103A  V104I  G159D  N185D  Q206E  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  E271Q  7.74  0.94  ND  5.39  S101G  S103A  V104I  G159D  N185D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  5.14  1.41  ND  1.92  S101G  S103A  V104I  G159D  Q206E  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  4.97  0.57  ND  1.36  S101G  S103A  V104I  G159D  T213Q  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.41  1.86  ND  1.01  A98L  G102A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  4.42  0.50  ND  2.88  S101G  G102A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  5.86  1.20  ND  3.84  G102A  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  5.87  2.10  ND  3.19  Q12R  G102A  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.98  2.67  ND  2.17  A98L  G102A  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  4.02  0.41  ND  2.25  S101G  G102A  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  6.63  2.07  ND  2.08  G102A  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.03  2.48  ND  2.25  N62D  S103A  V104I  Q109R  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.96  2.76  ND  2.34  S103A  V104I  G159D  A232V  Q245R  N248D  N252K  2.74  2.10  ND  1.86  S103A  V104I  G159D  A230V  Q245R  2.11  2.35  ND  1.49

表6(续)  N62D  S103A  V104I  S130G  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  3.42  0.71  ND  2.58  S101G  S103A  V104I  S130G  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.59  1.32  ND  1.61  S101G  S103A  V104I  S128G  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  1.30  1.23  ND  9.0  S101G  S103A  V104I  S128L  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.94  0.71  ND  1.08  N62D  S101G  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  3.17  0.83  ND  2.35  N62D  S103A  V104I  S128G  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.15  1.38  ND  1.77  N62D  S103A  V104I  S128L  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  3.07  0.07  ND  1.45  S101G  S103A  V104I  P131V  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.26  1.16  ND  3.05  A98V  S101G  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  1.82  1.34  ND  1.08  S99G  S101G  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.16  1.47  ND  1.20  S101G  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  1.79  1.38  ND  1.01  S101G  S103A  V104I  G159D  Y209W  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  1.15  1.18  ND  8.7  S101G  S103A  V104I  G159D  P210I  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  1.47  1.23  ND  1.03  S101G  S103A  V104I  G159D  V205I  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  1.90  1.38  ND  1.05  S101G  S103A  V104I  G159D  A230V  Q236H  Q245R  1.55  1.51  ND  1.23  S101G  S103A  V104I  G159D  A194P  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  1.96  1.30  ND  1.10  N76D  S101G  S103A  V104I  G159D  A194P  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  2.49  0.80  ND  1.25  G61E  V68A  S103A  V104I  G159D  S160V  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  420   7  128  ND 表6(续)  S3L  G61E  V68A  N76D  S103A  V104I  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  347  60  145  ND  G61E  V68A  S103A  V104I  G159D  Y167F  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  432  79  155  ND  G97E  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  314  41  140  ND  A98D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  271  68  172  ND  S99E  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  297  68  171  ND  S101E  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  350  27  190  ND  S101G  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  224  180  133  ND  G102A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  335  133  169  ND  S103A  V104I  S106E  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  488  55  271  ND  S103A  V104I  Q109E  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  422  105  240  ND  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  N261R  545  219  258  ND  S103A  V104I  Q109R  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  376  216  182  ND  N62D  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  742  13  246  ND  S103A  V104I  G159D  N184D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  543  136  284  ND  S103A  V104I  G159D  S166D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  512  121  397  ND  S103A  V104I  G159D  L217E  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  638  95  309  ND  G20R  N62D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  317  283  260  ND  N62D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  438  192  254  ND 表6(续)  S103A  V104I  G159D  Q206R  L217E  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  305  261  110  ND  N62D  S103A  V104I  G159D  Q206R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  409  246  255  ND  S103A  V104I  G159D  N184G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  232  208  240  ND  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  V244T  Q245R  N248D  N252K  234  204  186  ND  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  V244A  Q245R  N248D  N252K  224  211  195  ND  K27N  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  281  156  247  ND  T38G  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  230  209  182  ND  N62D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  S256R  263  266  144  ND  Q12R  N62D  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  201  278  199  N62D  S103A  V104I  G159D  N185D  Q206E  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  E271Q  774  94  539  ND  S101G  S103A  V104I  G159D  N185D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  514  141  192  ND  S101G  S103A  V104I  G159D  Q206E  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  497  57  136  ND  S101G  S103A  V104I  G159D  T213Q  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  241  186  101  ND  A98L  G102A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  442  50  288  ND  S101G  G102A  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  586  120  384  ND  G102A  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  587  210  319  ND  Q12R  G102A  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  298  267  217  ND  A98L  G102A  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  402  41  225  ND 表6(续)  S101G  G102A  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  663  207  208  ND  G102A  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  203  248  225  ND  N62D  S103A  V104I  Q109R  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  296  276  234  ND  S103A  V104I  G159D  A232V  Q245R  N248D  N252K  274  210  186  ND  S103A  V104I  G159D  A230V  Q245R  211  235  149  ND  N62D  S103A  V104I  S130G  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  342  71  258  ND  S101G  S103A  V104I  S130G  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  259  132  161  ND  S101G  S103A  V104I  S128G  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  130  123  90  ND  S101G  S103A  V104I  S128L  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  294  71  108  ND  N62D  S101G  S103A  V104I  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  317  83  235  ND  N62D  S103A  V104I  S128G  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  215  138  177  ND  N62D  S103A  V104I  S128L  G159D  T213R  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  307  7  145  ND  S101G  S103A  V104I  P131V  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  226  116  305  ND  A98V  S101G  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  182  134  108  ND  S99G  S101G  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  216  147  120  ND  S101G  S103A  V104I  G159D  S212G  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  179  138  101  ND  S101G  S103A  V104I  G159D  Y209W  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  115  118  87  ND  S101G  S103A  V104I  G159D  P210I  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  147  123  103  ND 表6(续)  S101G  S103A  V104I  G159D  V205I  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  190  138  105  ND  S101G  S103A  V104I  G159D  A230V  Q236H  Q245R  155  151  123  ND  S101G  S103A  V104I  G159D  A194P  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  196  130  110  ND  N76D  S101G  S103A  V104I  G159D  A232V  Q236H  Q245R  N248D  N252K  249  80  125  ND

相关申请

本申请是1998年10月23日提交的美国专利申请08/956,323、1998 年10月23日提交的美国专利申请08/956,564和1998年10月23日提交 的美国专利申请08/956,324的部分继续申请，所有这些申请在此都完整 引用。