一种提高植物蛋白溶解性的方法

技术领域

本发明涉及一种提高植物蛋白溶解性的方法。更具体地说，本 发明涉及植物蛋白来源的蛋白质溶解的方法，它们包括用足量的一 种或多种肌醇六磷酸酶处理植物蛋白源，并且用足量的一种或多种 蛋白分解酶处理植物蛋白源。另一方面，本发明提供了含有一种肌 醇六磷酸酶及一种或多种蛋白分解酶的动物饲料添加剂。

技术背景

蛋白质对于a．o．哺乳动物及产蛋鸡是一种必需营养物质。大 多数牲畜及人类从植物蛋白来源得到所必需的蛋白质。重要的植物 蛋白源为例如谷物、豆科植物及油籽类作物。

水解的植物蛋白如大豆蛋白水解物可以作为营养物，如营养添 加剂，应用于食品及饮料中。水解蛋白比未水解蛋白更易吸收，这是 为什么蛋白水解物被认为具有最高营养价值的原因。已知有数种制 备蛋白水解物的方法并在文献中进行了描述，参见US4，324，805和 WO92／15696。

基本上所有来源于植物的食品及饲料均含有肌醇六磷酸盐及肌 醇六磷酸作为贮存的磷源[参见E．Graf(ed．)，Phytic Acid，Chem- istry and Applications，Minneapololis，U．S．A．1986综述]。谷类中约 75-78％的磷结合成肌醇六磷酸。肌醇六磷酸盐占所有坚果类、谷 类、豆类、油籽类、孢子及花粉的1-3％。肌醇六磷酸的复合盐称为 肌醇六磷酸钙镁。

肌醇六磷酸可以螯合矿物质如钙、锌、镁及铁，从而降低了营养 性重要的矿物质的生物利用度，因此被普遍认为是一种抗营养因子。 体外研究表明肌醇六磷酸抑制某些动物蛋白的胃酸消化，而胰蛋白 酶消化却未受影响[参见Knuckles et al．，Journal of Food Science， 1989，54：1348-1350]。

肌醇六磷酸酶为催化肌醇六磷酸盐向肌醇及无机磷转化的一组 酶。肌醇六磷酸酶已从如芽胞杆菌、假单孢菌、酵母菌及曲霉中得 到。

在美国专利US3，297，548中已经建议向单胃动物饲料中加入 微生物肌醇六磷酸酶以便向饲料中补充无机磷。

已有人认为肌醇六磷酸酶可以用于大豆的处理中。因此，EP- A-0420 358报告了大豆粗粉中含有高含量的抗营养因子肌醇六磷 酸盐，它使这种蛋白质来源不适合用于婴儿的食物中，也不适于鱼 类、小牛及其它的非反刍动物的饲料中，因为肌醇六磷酸盐螯合了饲 料中的重要矿物质。

总之，以前已有人提议用肌醇六磷酸酶利用在植物蛋白来源中 存在的、结合在肌醇六磷酸盐／肌醇六磷酸中的磷，或利用结合在肌 醇六磷酸复合物中营养性重要的矿物质。

然而，有必要改善植物来源如谷类、豆类及油籽作物中存在的蛋 白质的利用度，因为利用度的增加可以提高蛋白质水解过程的产量 以及获得更高的营养收益，即改善了蛋白质的利用。

本发明概述

如今已经发现用有效量的肌醇六磷酸酶处理植物源可以提高植 物源中蛋白质的溶解性。在蛋白质分解的过程中加入肌醇六磷酸 酶，可以获得更高程度的水解并提高了蛋白质的溶解性，而且产量也 得到了提高。

因此，本发明提供了一种用于溶解植物蛋白来源中蛋白质的方 法，该方法包括用有效量的一种或多种肌醇六磷酸酶处理植物蛋白 源，且用有效量的一种或多种蛋白分有酶处理植物蛋白源。

另一方面，本发明提供了一种包括一种肌醇六磷酸酶及一种蛋 白分解酶的动物饲料添加剂。 本发明详述 植物蛋白质的溶解性

本发明提供了一种溶解植物蛋白来源中蛋白质从而获得蛋白质 水解物的方法。该方法包括以下步骤：

(a)用有效量的一种或多种肌醇六磷酸酶处理植物蛋白源；且

(b)用有效量的一种或多种蛋白分解酶处理植物蛋白源。

与现有已知的获取蛋白质水解物的方法相比，本方法提高了蛋 白质的利用度，从而使提取增加，产量提高以及蛋白质的利用提高。

适于本发明方法的植物蛋白源可以是任何含蛋白质的植物，特 别是豆类、谷类、菊科植物或十字花植物。优选地，豆类植物包括大 豆、蚕豆、豌豆和白羽扇豆(羽扇豆属植物)，更优选地为大豆。优选 地，谷类包括小麦、玉米、大麦、黑麦、燕麦、大米、高粱、芝麻(Sesa- mum indicum)和小米(Panicum miliaceum)。有用的菊科植物的例子 是向日葵(Helianthus)，且有用的十字花科植物的例子是油菜(油菜 子，如Brassica napus)。

植物蛋白源优选大豆。

利用本发明方法的含蛋白质植物可以是任何形式的，包括“已处 理的形式”，其中在蛋白质进行本发明方法处理之前，干燥物质中的 蛋白质含量已增加。例如，大豆蛋白质粗制物可以从大豆、去脂大豆 片、豆粉或大豆分离物获得。这些含蛋白的粗制物一般含有约42％ -95％的蛋白质。

蛋白源在用本发明方法处理前可以以任何常规的方法进行预处 理。特别是可以将蛋白源干燥和／或磨碎，即处理成粗粉或片状(如 大豆粗粉或片)。

本发明方法的两个步骤(a)和(b)可以连续进行，或同时进行。

植物蛋白源也可用含有一种或多种肌醇六磷酸酶及一种或多种 蛋白分解酶的酶制备物处理，或者植物蛋白源可用两种或多种含有 一种或多种肌醇六磷酸酶和／或一种或多种蛋白分解酶的酶处理。

目前认为本发明的方法优选以混悬液的PH在约PH3-9的范 围内，更优选在约PH4-7的范围内进行。

也认为本发明的方法优选在约10℃-70℃，更优选在约35℃- 65℃的温度范围内进行。

在更具体的实施方案中，本方法包括如下连续步骤：

(ⅰ)将植物蛋白源混悬在水中；

(ⅱ)将混悬液用一种或多种肌醇六磷酸酶及一种或多种蛋白分 解酶进行酶处理以蛋白分解性的水解蛋白质；

(ⅲ)使酶失活，且可选择地

(ⅳ)从混悬物中分离水解的蛋白质。

使酶失活可以采用常规的酶失活法，如加热处理，即提高水解混 悬液或混合物的温度至可使酶变性的温度，一般至85℃以上。

分离步骤可以采用常规的从混悬物中分离水解蛋白的方法，例 如对含蛋白水解物的混悬液进行离心或膜过滤。

总的说来，本发明的方法可以以相似于常规的获得蛋白水解物 的方法进行，例如，在美国专利US4，324，805、US4，100，024和 WO92／15696中所描述，这些出版物引入本文作参考。 肌醇六磷酸酶

本发明的溶解植物蛋白源中蛋白质的方法包括用足量的一种或 多种肌醇六磷酸酶处理植物蛋白源。

在本发明的上下文中，肌醇六磷酸酶是一种催化肌醇磷酸盐上 的无机磷脱掉的酶。肌醇六磷酸酶优选来自于微生物如细菌、真菌 及酵母但也可为植物来源。

在一优选实施方案中，肌醇六磷酸酶来源于真菌株，尤其是曲霉 株，如黑曲霉、米曲霉、无花果曲霉、沧盛曲霉、无冠构巢曲霉和土曲 霉。更优选的是得自黑曲霉株或米曲霉株的肌醇六磷酸酶。

在另一优选实施方案中，肌醇六磷酸酶来自于细菌株，尤其是芽 胞杆菌株或假单孢菌株。优选地，肌醇六磷酸酶来自枯草杆菌株。

在另一优选实施方案中，肌醇六磷酸酶来自于酵母，尤其是克鲁 维酵母属菌株或酵母属菌株。优选地，肌醇六磷酸酶来自啤酒酵母 株。

在本发明的上下文中，“来自于……的酶”包括由一特殊菌株自 然产生的酶，或由该菌株回收的，或由来自该菌株DNA序列编码且 在以所说DNA序列转化的宿主生物体中产生的。

肌醇六磷酸酶可用任何适宜的技术从所谈到的微生物中获得。 特别地是可通过在适宜的营养培养基中进行产生肌醇六磷酸酶微生 物的发酵，然后再用已熟知的方法分离该酶来得到肌醇六磷酸酶。

用于培养的肉汤或培养基可以是任何适于使所谈到的宿主细胞 生长的常规培养基，并且可以根据现有技术的原则加以配制。优选 的培养基含有碳源和氮源以及其它无机盐。适宜的培养基如最低限 度或复合培养基可得商业供应商，或根据公开的收藏物如美国典型 微生物保藏中心(ATCC)菌株目录加以制备。

培养后，用从培养肉汤中分离和纯化蛋白质的常规方法回收肌 醇六磷酸酶。已熟知的纯化方法包括用离心或过滤将细胞与培养基 分离，用盐如硫酸铵的方法沉淀含蛋白质成分，以及层析法如离子交 换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。

另外的一种方法是也可用重组DNA技术优选地大量制备肌醇 六磷酸酶，该技术在EP-A1-0 420 358中得到描述，其公开物引入 本文作参考。

优选地，在如EP-A1-0 420 358所描述的有利于肌醇六磷酸 酶编码基因表达的条件下培养由无花果曲霉或黑曲霉属获得的肌醇 六磷酸酶编码基因转化的曲霉属之真菌。

优选地用过滤及超滤法将含肌醇六磷酸酶发酵肉汤于应用于本 发明(的配方)中之前进行处理。

目前认为足以改善植物蛋白溶解性的肌醇六磷酸酶的量相应于 每公斤植物蛋白源约2至约50000FYT(见下文定义)的量，优选每 公斤植物蛋白源从约50至约30000FYT，最优选每公斤植物蛋白源 从约100至10000FYT。 蛋白分解酶

本发明的溶解植物蛋白源中蛋白质的方法也包括用足量的一种 或多种蛋白分解酶处理植物蛋白源。

蛋白分解酶可以是微生物酶，优选源自细菌或真菌株的蛋白酶， 或者蛋白分解酶可以是胰蛋白酶或胃蛋白酶。在优选的实施方案 中，蛋白分解酶为源自芽胞杆菌株，优选枯草杆菌株或地衣芽胞杆菌 株的细菌蛋白酶。商售的芽胞杆菌蛋白酶为AlcalaseTM和Neu- traseTM(Novo Nordisk A／S，Denmark)。在另一优选的实施方案中， 蛋白分解酶为一源自曲霉株，优选棘孢曲霉株、黑曲霉株、米曲霉株 的真菌蛋白酶。商售的曲霉蛋白酶为FlavourzymeTM(Novo Nordisk A／S，Denmark)。

目前认为足以改善植物蛋白溶解性的蛋白分解酶的量相应于每 公斤植物蛋白源从约0．0001至约0．5AU(在下文定义)的量，优选 每公斤植物蛋白源从约0．001至约0．05AU，更优选每公斤植物蛋 白源从约0．005至0．03AU。 其它的酶

如上文所述，本发明提供了溶解植物蛋白源中蛋白质的一种方 法，该方法包括如下步骤：

(a)用足量的一种或多种肌醇六磷酸酶处理植物蛋白源；并且

(b)用足量的一种或多种蛋白分解酶处理植物蛋白源。

本发明方法的两个步骤(a)和(b)可以连续进行，也可同时进行。

在一优选的实施方案中，本发明的方法进一步包括下述步骤：

(c)用一种或多种选自脂解酶和葡糖苷酶的酶处理植物蛋白源。

本发明方法的三个步骤(a)、(b)和(c)可以连续进行，或同时进 行。或者，本发明方法的两个步骤(a)和(b)同时进行，然后进行(c) 步骤。

步骤(c)的脂解酶可以是任何三酰基甘油脂酶(EC3．1．1．3)。

步骤(c)的葡糖苷酶可以是任何葡糖苷酶(EC3．2，也称为糖 酶)。优选地，葡糖苷酶为淀粉酶，特别是α-淀粉酶或β-淀粉酶； 纤维素酶，特别是内-1，4-β-葡聚糖酶(EC3．2．1．4)或内-1，3- β-葡聚糖酶(EC3．2．1．6)；木聚糖酶，特别是内-1，4-β葡聚糖酶 (EC3．2．1．8)或木聚糖一内-1，3-β-木糖苷酶(EC3．2．1．32)；α- 半乳糖苷酶(EC3．2．1．22)；聚半乳糖醛酸酶(EC3．2．1．15，也称为 果胶酶)；纤维素-1，4-β-纤维素二糖酶(EC3．2．1．91，也称为cel- lobiohydrolases)；内葡聚糖酶，特别是内-1，6-β-葡聚糖酶(EC3． 2．1．75)、内-1，2-β-葡聚糖酶(EC3．2．1．71)、内-1，3-β-葡聚 糖酶(EC3．2．1．39)或内-1，3-α-葡聚糖酶(EC3．2．1．59)。

在一更优选的实施方案中，葡糖苷酶为聚半乳糖醛酸酶(EC3． 2．1．15)；纤维素-1，4-β-纤维素二糖酶(EC3．2．1．91)；或内葡聚 糖酶，优选内-1，6-β-葡聚糖酶(EC3．2．1．75)、内-1，2-β-葡 聚糖酶(EC3．2．1．71)，内-1，3-β-葡聚糖酶(EC3．2．1．39)或内- 1，3-α-葡聚糖酶(EC3．2．1．59)。 工业应用

本发明的溶解植物蛋白源之蛋白质的方法可在许多工业领域得 到应用。特别是本发明的方法可应用于用作营养物如加入食品及饮 料的营养添加物的蛋白水解性的制备。

因此，另一方面，本发明也可提供以本发明方法从植物蛋白源获 得的蛋白水解物。

本发明的蛋白水解物可以加入食品或饮料中，从而提高了其营 养价值。

尤其是本发明的蛋白水解物可以加至动物饲料中，如单胃动物 的饲料中。 动物饲料添加剂

本发明提供了一种包括一种或多种肌醇六磷酸酶和一种或多种 蛋白分解酶的动物饲料。

当加至动物饲料中时，一种或多种肌醇六磷酸酶及一种或多种 蛋白分解酶的联合应用提高了植物源动物饲料中蛋白质的利用度， 从而能够更好地提取植物蛋白、获得更多的蛋白质且提高蛋白质的 利用。因此，饲料氮的消化性和营养价值都得到了提高，而且动物的 生长率和／或饲料转换比(即摄入的饲料重量与体重增加的比)也得 到了改善。

在本发明的上下文中，动物饲料添加剂为含有一种或多种肌醇 六磷酸酶和一种或多种蛋白分解酶以及适宜的载体和／或赋形剂的 酶制备物，并且该酶制备物是以适于加入动物饲料的形式提供的。 本发明的动物饲料添加剂可以根据已知的方法制备，并且可以是干 燥或液状制备物的形式。制备物所含的酶可以按照已知的方法可选 择地加以稳定。

在一具体的实施方案中，本发明的动物饲料添加剂是一种颗粒 化的酶产物，它可以容易地与饲料成分混匀，或者更优选地形成预混 物(pre-mix)的成分。颗粒状的酶产物可以包衣或不包衣。酶颗粒 的大小优选为与饲料和预混物成分的颗粒相当。这提供了将酶掺入 饲料的一种安全和方便的方法。

在另一具体的实施方案中，本发明的动物饲料添加剂为一稳定 化的液状组合物，它可以是水性或油性基质的浆状物。

在另一具体的实施方案中，将一种或多种酶在将饲料压粒或压 碎前进行应用。

本发明的动物饲料添加剂可以在体外(通过改善饲料的成分)或 体内显示其效应。本发明的饲料添加剂特别适于加至含高含量蛋白 的植物的动物饲料组合物中，这些植物尤其是豆类、谷类、菊科植物 或十字花科植物。优选地豆类为大豆、蚕豆、豌豆和／或白羽扇豆(白 羽扇豆属植物)。最优选的豆类为大豆。优选地，谷类为小麦、玉米、 大麦、黑麦、燕麦、大米、高粱，芝麻(Sesamum indicum)和小米(Pan- icum milaceum)。葡科植物的一个例子是向日葵(helianthus)，有用 的十字花科植物的例子是油菜(油菜子，如Brassicanapus)。

在另一优选的实施方案中，本发明提供了一种含一种或多种选 自脂解酶及葡糖苷酶的添加酶的动物饲料添加剂。

脂解酶可以是任何三酰基甘油脂酶(EC3．1．1．3)。

葡糖苷酶可以是任何葡糖苷酶(EC3．2，也称为糖酶)。优选地， 葡糖苷酶为淀粉酶，特别是α-淀粉酶或β-淀粉酶；纤维素酶，特别 是内-1，4-β-葡聚糖酶(EC3．2．1．4)或由-1，3-β-葡聚糖酶 (EC3．2．1．6)；木聚糖酶，特别是内-1，4-β-葡聚糖酶(EC3．2．1． 8)或木聚糖-内-1，3-β-木糖苷酶(EC3．2．1．32)；α-半乳糖苷 酶(EC3．2．1．22)；聚半乳糖醛酸酶(EC3．2．1．15，也称为果胶酶)； 纤维素-1，4-β-纤维素二糖酶(EC3．2．1．91，也称为cellobiohy- drolases)；内葡聚糖酶，特别是内-1，6-β-葡聚糖酶(EC3．2．1． 75)、内-1，2-β-葡聚糖酶(EC3．2．1．71)、内-1，3-β-葡聚糖酶 (EC3．2．1．39)或内-1，3-α葡聚糖酶(EC3．2．1．59)。

在一更优选的实施方案中，葡糖苷酶为聚半乳糖醛酸酶(EC3． 2．1．15)；纤维素-1，4-β-纤维素二糖酶(EC3．2．1．91)；或内葡聚 糖酶，优选内-1，6-β-葡聚糖酶(EC3．2．1．75)、内-1，2-β-葡 聚糖酶(EC3．2．1．71)、内-1，3-β-葡聚糖酶(EC3．2．1．39)或内- 1，3-α-葡聚糖酶(EC3．2．1．59)。

目前认为动物饲料添加剂的PH应在约2-8的范围内。

目前认为动物饲料添加剂中肌醇六磷酸酶活性应在每克总组合 物中约200-50000FYT(如下文定义)的范围内，优选在每克总组合 物中约500-10000FYT的范围内，最优选在每克总组合物中约 2000-6000FYT的范围内。

优选地，加入动物饲料中添加剂的量应足以使每公斤饲料组合 物中至少含50FYT，优选在每公斤饲料组合物中含约100- 2000FYT的范围内。

可以理解，为增加营养价值(即氮的消化性)加入饲料的实际肌 醇六磷酸的量依赖于饲料自身的组成成分。含有大量肌醇六磷酸的 饲料一般需加入更大量的肌醇六磷酸酶活性。通过专业人员可很容 易地确定需加入的肌醇六磷酸酶的量。 肌醇六磷酸酶活性(FYT)

可以用肌醇六磷酸钠作为底物的方法测定肌醇六磷酸酶活性。 当受肌醇六磷酸酶作用时，无机磷从肌醇六磷酸钠上脱下。在含亚 铁／钼的试剂中，磷(PO4)形成复合物，用750nm的分光光度法加以 检测。

一个肌醇六磷酸酶单位(FYT)定义为在标准条件下每分钟将 1μmol磷释出的酶的量，所说标准条件为PH5．5，37℃，5．0mM肌醇 六磷酸钠的底物浓度，反应时间30分钟。

更详细地描述此分析方法的标准操作程序EAL-SM-0403． 01由Novo Nordisk A／S，Denmark备索，其公开物引入本文作参考。 蛋白酶活性(AU)

可以用变性血红蛋白作底物测定蛋白分解活性。在Anson- Hemoglobin测定蛋白分解活性的方法中，消化变性的血红蛋白，并 且用三氯乙酸(TCA)沉淀未消化的血红蛋白。TCA可溶性产物的 量用苯酚试剂测定，它与酪氨酸和色氨酸产生蓝色。

一个Anson单位(AU)定义为标准条件下以起始速率消化血红 蛋白，每分钟产生可如1毫克当量酪氨酸与苯酚试剂产生相同颜色 的TCA可溶液产物的酶的量。

更详细描述此分析方法的档案AF4／5由Novo Nordisk A／S， Denmark备索，其公开物引入本文作参考。

实施例

参考于下列实施例对本发明进行进一步描述说明，这些实施例 不应以任何方式限制本发明权利要求的范围。

实施例一 大豆蛋白水解

将大豆蛋白浓缩物(Unico 75，Loders Crosklaan，NL)混悬在 50℃的去离子水中。

于85℃对混合物热处理3分钟，再冷却至水解温度55℃。用 4N NaOH调节pH至8．5。

将混合物分至三只管中以进行三个比较实验： 1)用下述酶进行水解：

AlcalaseTM2．4L，剂量为蛋白浓度的2W／W％。

NeutraseTM0．5L，剂量为蛋白浓度的1W／W％。

肌醇六磷酸酶NovoTM(一种曲霉肌醇六磷酸酶，6900FYT／g)， 剂量为每克大豆浓缩液1mg。pH以HCl调节至4．5。在pH＜6．6 时加入肌醇六磷酸酶。 2)用下述酶进行水解：

AlcalaseTM2．4L，剂量为蛋白浓度的2W／W％。

NeutraseTM0．5L，剂量为蛋白浓度的1W／W％。 3)以HCl调节pH至6．2。加入肌醇六磷酸酶NovoTM(一种曲霉肌 醇六磷酸酶，6900FYT／g)，剂量为每克大豆浓缩物1mg。

通过检测水解的程度及渗透压对水解液进行监测。结果示于下 面的表1-2中。 表1 渗透压

 时间(分钟)  实验．1)  实验．2)  实验．3)     0     103     102     103     15     200     173     145     35     211     183     147     65     232     201     139     125     241     208     142     185     250     221     140 表2 水解程度

 时间(分钟)  实验．1)  实验．2)  实验．3)     20    12．2    11．9    -1．9     40    13．9    12．6    -1．6     70    13．2    12．8    -2．0     130    17．3    15．0    -2．6     190    19．5    18．2    -2．4 水解程度(％PH)的两种测量结果显示底物降解增加。与实验2 (77．3％)的结果相比，实验1产生了更多的可溶蛋白(78．8％)。

实施例2 体外大豆粗粉的N-消化性

制备两种样品：

样品A：

1克大豆粗粉

样品B：

1克大豆粗粉，加上0．032克肌醇六磷酸酶NovoTM(一种曲 霉肌醇六磷酸酶，5000FYT／g)。

每个样品与蛋白酶于pH2．4温育2小时，然后与胰酶于pH6．8 温育16小时。已悬浮的但未消化的蛋白质用磺基水杨酸进行沉淀。 通过过滤和干燥收集未消化的蛋白质(以及其它未消化的成分)。测 定滤饼及样品的干燥物质，并用Kjeldahl法测定氮(N)的量。

按下式计算N消化性：

将氮(N)消化性乘6．25计算出蛋白质消化性。

得到下列蛋白质消化性结果：

样品A(无肌醇六磷酸酶)：88．4％

样品B(含肌醇六磷酸酶)：89．9％。

实施例3 肌醇六磷酸对猪表现氮消化性及氮利用的影响

以大麦-小麦-大豆饮食对猪进行平衡试验。

饮食组成：

大麦                   50．8％

小麦                   20．0％

大豆                   24．0％

动物脂肪               2．0％

melasse                1．0％

矿物质、维生素及氨基酸 2．2％

饮食中不加任何无机磷。于60℃以上将食物制成丸状。

平衡试验包括5天的适应期和7天的收集期。

将12头猪分成2组，第一组用该饮食喂养，第二组用同样饮食 喂养但另于每100公斤饮料中加入20．3克肌醇六磷酸酶NovoTM (一种曲霉肌醇六磷酸酶，7370FYT／g)。

测定饮食、粪便及尿中的氮含量并计算表现氮消化性及氮利用。

结果示出表下中。 表3 氮的消化性及氮的利用

氮／(克／天) 不含肌醇六磷酸酶的饮食 含肌醇六磷酸酶的饮食 S．E．M．     已消耗的         44．5         44．5     粪便         6．8         6．2     O．1*     尿         20．3         19．5     O．8NS     沉积的         17．4         18．7     0．6NS     已消化的         37．6         38．3     0．1* 已消化的百分率         84．7         86．1     0．3* *p≤0．01 NS(不显著)：p＞0．05 S．E．M．：标准误平均数