[0001] 本发明涉及软骨细胞增殖促进剂、软骨障碍的预防或改善剂、及关节痛等软骨相关疾病的预防或改善剂，详细而言涉及以蛋黄蛋白水解物为有效成分的软骨细胞增殖促进剂、软骨障碍的预防或改善剂、及关节痛等软骨相关疾病的预防或改善剂。

[0002] 在各种软骨疾病的预防及治疗的过程中，软骨细胞的增殖、分化功能的表达是重要的。即，通常认为软骨细胞的增殖、成熟化引起了骨的正常成长以及骨折时的修复。作为软骨细胞增殖的诱导因子，已经报道了TGF－β1(Transforming Growth Factor：转化生长因子)、IGF－1(Insulin-like Growth Factor：胰岛素样生长因子)、bFGF(basic Fibroblast Growth Factor：碱性成纤维细胞生长因子)、PTHrP(PTH-related peptide：甲状旁腺素相关蛋白)、HGF(Hepatocyte Growth Factor：肝细胞生长因子)、BMP(bone morphogenetic protein，骨形态发生蛋白)等。但是，安全性、稳定性、有效性优异的软骨细胞增殖促进药的临床应用尚未建立起来。

[0003] 软骨疾病中，患者数最多的疾病为变形性关节症。通常认为其原因之一是年龄增长，预期今后的高龄化社会中本症例会增加。在关节疾病等以软骨变性为主要病变的软骨障碍的预防和治疗中，一直以来主要使用雌激素、降钙素等骨吸收抑制物质、阿司匹林、非甾类消炎剂(NSAID)，但这样的方法不仅无法获得充分的效果，而且已知具有消化道障碍等有害作用。因此，强烈需要一种在软骨损伤、软骨障碍的治疗中能够安全使用的预防或改善剂。

[0004] 另一方面，本申请的发明人等一直在研究蛋黄蛋白水解物的功能，发现其具有抗氧化作用(专利文献1)、骨强化作用(专利文献2)等。但是，蛋黄蛋白对软骨的作用尚没有报道。

[0005] 现有技术文献

[0006] 专利文献

[0007] 专利文献1:日本特开2001－328919号公报

[0008] 专利文献2:国际公开第WO2006/075558号

[0009] 发明要解决的课题

[0010] 本发明的课题在于，提供一种在软骨损伤、软骨障碍等软骨相关疾病的预防、改善或治疗中能够安全使用的新颖的有效成分。

[0011] 用于解决课题的手段

[0012] 本发明为了解决上述课题而包含以下的各发明。

[0013] [1]一种软骨细胞增殖促进剂，其特征在于，含有蛋黄蛋白水解物作为有效成分。

[0014] [2]一种软骨障碍和/或关节痛的预防或改善剂，其特征在于，含有蛋黄蛋白水解物作为有效成分。

[0015] [3]一种含有前述[1]所述的软骨细胞增殖促进剂的药物，其为用于软骨障碍和/或关节痛的预防或治疗的药物。

[0016] [4]一种含有前述[1]所述的软骨细胞增殖促进剂的补充剂，其为用于软骨障碍和/或关节痛的预防或改善的补充剂。

[0017] [5]一种含有前述[1]所述的软骨细胞增殖促进剂的食品添加剂，其为用于软骨障碍和/或关节痛的预防或改善的食品添加剂。

[0018] [6]蛋黄蛋白水解物用于制作软骨细胞增殖促进剂的用途。

[0019] [7]蛋黄蛋白水解物用于制造软骨障碍和/或关节痛的预防或改善剂的用途。

[0020] [8]一种非治疗目的的软骨障碍或关节痛的预防或改善方法，其特征在于，使有软骨细胞增殖促进需求的人经口摄取蛋黄蛋白水解物。

[0021] [9]一种软骨细胞增殖促进剂的制造方法，其特征在于，包括：对蛋黄进行脱脂处理的工序、将获得的脱脂蛋黄用蛋白水解酶水解而获得蛋黄蛋白水解物的工序、使获得的蛋黄蛋白水解物作为有效成分而含有的工序。

[0022] 发明的效果

[0023] 根据本发明，能够提供软骨细胞增殖促进剂、软骨障碍的预防或改善剂、及关节痛的预防或改善剂。作为有效成分的蛋黄蛋白水解物为来自于天然物质的安全物质，因此能够广泛用作日常能够摄取的饮食品、药物、饲料等。附图说明

[0024] 图1为表示实施例1中制造的蛋黄蛋白水解物的利用凝胶过滤色谱获得的分子量分析的结果图。

[0025] 图2为表示将兔子软骨缺损模型的膝关节缺损处置部的石蜡切片进行阿辛蓝(Alcian blue)染色并将阿辛蓝染色面积与对照组比较的结果图。

[0026] 图3为表示将兔子软骨缺损模型的膝关节缺损处置部的石蜡切片进行番红O染色并将番红O染色面积与对照组比较的结果图。

[0027] 图4为表示服用蛋黄蛋白水解物所产生的、膝关节痛患者的疼痛改善效果的研究结果图。

[0028] 图5为表示实施例1中制造的蛋黄蛋白水解物的利用凝胶过滤色谱获得的分子量分析的结果图。

[0029] 图6为对实施例1中制造的蛋黄蛋白水解物进行分级而获得的分级物的、利用凝胶过滤色谱获得的分子量分析的结果图。

[0030] 本发明提供含有蛋黄蛋白水解物作为有效成分的软骨细胞增殖促进剂、软骨障碍和/或关节痛的预防或改善剂。

[0031] 蛋黄蛋白水解物没有特别限定，优选将蛋黄蛋白水解而获得。用作蛋黄蛋白水解物的原料的蛋黄，可以列举鸡、鸭、鹌鹑等的蛋黄，从生产性的观点出发，优选使用鸡的蛋黄。蛋黄可以使用蛋黄液、蛋黄粉末、脱脂蛋黄粉末等，其中优选使用蛋黄粉末、脱脂蛋黄粉末。此外，从资源的有效利用、成本的观点出发，优选使用由蛋黄制造蛋黄油、蛋黄卵磷脂时作为副产物产生的脱脂蛋黄。蛋黄的脱脂处理优选使能够用于食品加工的有机溶剂(例如，乙醇、异丙醇、己烷等中的至少一种)作用于蛋黄而实施。从简便性和安全性的观点出发，优选使用乙醇。

[0032] 作为用于将蛋黄蛋白水解的蛋白水解酶，没有特别限定，优选具有蛋白酶活性或羧肽酶活性且能够用于食品制造的酶。例如，可以列举胃蛋白酶(EC.3.4.23.1)、胰蛋白酶(EC.3.4.21.4)、凝乳酶(EC.3.4.23.15)、包含凝乳酶的用于乳酪用途的干胃膜、羧肽酶A(EC.3.4.17.1)、来自杆菌属细菌的蛋白酶(商品名“Alcalase”诺维信公司制、商品名“Orientase22BF”HBI Enzymes Inc.制、商品名“ヌクレイシン”HBI Enzymes Inc.制、商品名“蛋白酶S‘Amamo’G”Amano Enzyme inc.制、商品名“THERMOASE PC10”大和化成株式会社制等)、来自曲霉菌属菌的蛋白酶(商品名“Orientase ONS”HBI Enzymes Inc.制、商品名“Orientase 20A”HBI Enzymes Inc.制、商品名“蛋白酶P‘Amamo’3G”Amano Enzyme inc.制、商品名“Flavourzyme”诺维信公司制等)等。蛋白水解酶既可以仅使用1种，也可以将2种以上组合使用。优选来自杆菌属细菌的蛋白酶、胃蛋白酶或它们的组合。

[0033] 蛋白水解酶的浓度根据所使用的原料蛋黄及酶而适当改变，在使用脱脂蛋黄作为原料时，酶和脱脂蛋黄的质量比优选在约1：20～约1：1000的范围。此外，酶反应温度、反应时间也根据所使用的原料蛋黄及酶而不同，优选在约25～约75℃下进行约1～约24小时的水解。

[0034] 获得的蛋黄蛋白水解物可以适当脱盐后直接使用。此外，也可以通过使用超滤膜、凝胶过滤、各种柱色谱、膜滤器、等电点的方法等进行精制、分级后使用。例如，可以通过实施例2所述的方法来确认精制、分级后的蛋黄蛋白水解物具有软骨细胞增殖促进作用。

[0035] 获得的蛋黄蛋白水解物的、利用凝胶过滤色谱进行的分子量分布分析中，相对于蛋白质、肽、氨基酸的面积比的总和，优选分子量为约100以上且约20,000以下的部分的面积比占约65％以上，更优选前述面积比占约75％以上，进而优选前述面积比占约85％以上，进而优选前述面积比占约90％以上。

[0036] 此外，作为更优选的蛋黄蛋白水解物，可以列举如下蛋黄蛋白水解物：通过使用分子量1,000的超滤膜的分级而获得，在利用凝胶过滤色谱进行的分子量分布分析中，相对于蛋白质、肽、氨基酸的面积比的总和，分子量为约500以上且约20,000以下的部分的面积比占约85％以上、优选约90％以上。

[0037] 这样获得的蛋黄蛋白水解物具有软骨细胞增殖促进作用、软骨障碍的预防、治疗或改善作用、关节痛的预防、治疗或改善作用等，因此能够适合作为软骨细胞增殖促进剂、软骨障碍的预防、治疗或改善剂、及关节痛的预防、治疗或改善剂等的有效成分使用。作为软骨障碍，可以列举例如变形性关节症、软骨的缺损、软骨损伤、半月板损伤等。

[0038] 本发明的软骨细胞增殖促进剂、软骨障碍和/或关节痛的预防或改善剂中，蛋黄蛋白水解物的含量没有特别限定，优选含有蛋黄蛋白水解物约0.05～约50质量％，更优选含有约0.1～约25质量％。此外，蛋黄蛋白水解物的每天施予量根据施予对象而不同，例如在对象为成人时，通常为约0.05～约2000mg/天，优选为约0.1～约1000mg/天。

[0039] 本发明提高用于软骨障碍和/或关节痛的预防或治疗的药物。本发明的药物只要含有上述本发明的软骨细胞增殖促进剂即可。本发明的药物可以通过经口或非经口的任意途径施予至哺乳动物。作为经口剂，可以列举颗粒剂、散剂、片剂(包括糖衣片)、丸剂、胶囊剂、糖浆剂、乳剂、悬浊剂等。作为非经口剂，可以列举注射剂(例如，皮下注射剂、静脉内注射剂、肌肉内注射剂、腹腔内注射剂)、点滴剂、外用剂(例如，经鼻施予制剂、经皮制剂、软膏剂)、栓剂(例如，直肠栓剂、肛栓剂)等。这些制剂可以通过本领域通常使用的手法利用药学上允许的载体而制剂化。作为药学上允许的载体，可以列举赋形剂、结合剂、稀释剂、添加剂、香料、缓冲剂、增稠剂、着色剂、稳定剂、乳化剂、分散剂、悬浊化剂、防腐剂等，例如，可以使用碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、砂糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等作为载体。

[0040] 经口用的固形剂(片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂等)可以将有效成分与赋形剂(乳糖、甘露醇、葡萄糖、微晶纤维素、淀粉等)、结合剂(羟丙基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、偏硅酸铝酸镁等)、崩解剂(纤维素乙醇酸钙等)、润滑剂(硬脂酸镁等)、稳定剂、助溶剂(谷氨酸、天冬氨酸等)等混合后利用常规方法制剂化。可以根据需要用包衣剂(白糖、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯等)包覆，此外，还可以用2层以上的层进行包覆。

[0041] 经口用的液剂(水剂、悬浊剂、乳剂、糖浆剂、酏剂等)可以将有效成分溶解、悬浊或乳化于通常使用的稀释剂(精制水、乙醇或它们的混合液等)中而制剂化。进而，该液剂还可以含有润湿剂、悬浊化剂、乳化剂、甜味剂、风味剂、芳香剂、保存剂、缓冲剂等。

[0042] 注射剂包括溶液、悬浊液、乳浊液、及在使用时溶解或悬浊在溶剂中后使用的固态注射剂。注射剂可以将有效成分溶解、悬浊或乳化于溶剂中而制剂化。作为溶剂，可以使用例如注射用蒸馏水、生理盐水、植物油，丙二醇、聚乙二醇、乙醇之类的醇类等，及它们的组合。进而该注射剂还可以含有稳定剂、助溶剂(谷氨酸、天冬氨酸、polysorbate 80(注册商标)等)、悬浊化剂、乳化剂、无痛化剂、缓冲剂、保存剂等。这些可以通过在最终工序中灭菌或通过无菌操作法而制造。此外，也可以制造无菌的固形剂如冻干品，在其使用前溶解于无菌化或无菌的注射用蒸馏水或其它溶剂中后使用。

[0043] 本发明提供用于软骨障碍和/或关节痛的预防或改善的补充剂。本发明的补充剂只要含有上述本发明的软骨细胞增殖促进剂即可。本发明的补充剂可以以经口用的固形剂(片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂等)或经口用的液剂等形态而实施。这些制剂可以通过与上述的药物同样的手法而制剂化。

[0044] 本发明提供用于软骨障碍和/或关节痛的预防或改善的饮食品。本发明的饮食品只要含有上述本发明的软骨细胞增殖促进剂即可。饮食品包括健康食品、功能性食品、特定保健用食品、病人用食品。对饮食品的形态没有特别限定。可以列举例如茶饮料、清凉饮料、碳酸饮料、营养饮料、果肉饮料、乳酸饮料等饮料，荞麦面、乌冬面、中国面条、方便面等面类，糖块、糖果、口香糖、巧克力、小吃、饼干、果冻、果酱、奶油、烘焙点心、面包等点心及面包类，鱼糕、火腿、香肠等水产-畜产加工食品，加工乳、发酵乳等乳制品，色拉油、炸制用油、人造黄油、蛋黄酱、起酥油、搅打奶油、调味酱(dressing)等油脂及油脂加工食品，调味汁、浇汁等调味料，咖喱、焖炖菜、盖饭、粥、菜粥等高温蒸煮袋装食品，冰激凌、果汁冰激凌、刨冰等冰制食品，等。

[0045] 本发明提供用于软骨障碍和/或关节痛的预防或改善的食品添加剂。本发明的食品添加剂只要含有上述本发明的软骨细胞增殖促进剂即可。本发明的食品添加剂的形态没有特别限定，可以列举例如液状、糊状、粉末状、片状、颗粒状等。本发明的食品添加剂中也包括饮料用添加剂。本发明的食品添加剂可以基于一般的食品添加剂制造方法来制造。

[0046] 本发明提供用于软骨障碍和/或关节痛的预防或改善的饲料。本发明的饲料只要含有上述本发明的软骨细胞增殖促进剂即可。作为饲料，可以列举例如牛、马、猪等家畜用饲料，鸡等家禽用饲料，狗、猫等宠物用饲料等。本发明的饲料除了在饲料中添加本发明的软骨细胞增殖促进剂等以外，可以使用一般饲料的制造方法来加工制造。

[0047] 作为本发明的软骨细胞增殖促进剂、软骨障碍和/或关节痛的预防或改善剂的有效成分的蛋黄蛋白水解物为存在于食用历史很久的蛋黄中的成分，因此安全性高、作用也温和，能够长期摄取或使用。此外，作为有效成分的蛋黄蛋白水解物为兼具多种作用的多功能成分，通过与用于软骨疾病治疗的其它有效成分组合使用，可以期待相加效果或协同效果的提高。作为用于软骨疾病治疗的其它有效成分，可以列举例如葡糖胺、软骨素、I型胶原、II型胶原、N－乙酰葡糖胺等。

[0048] 本发明包括将有效量的蛋黄蛋白水解物施予至有软骨细胞的增殖促进需求的人的、软骨障碍或关节痛的预防、治疗或改善方法。此外，还包括使有软骨细胞增殖促进需求的人经口摄取蛋黄蛋白水解物的非治疗目的的软骨障碍或关节痛的预防或改善方法。需要说明的是，“非治疗的”是指不包括通过医疗行为、即治疗对人体或动物体进行处置的行为的概念。

[0049] 本发明包括软骨细胞增殖促进剂的制造方法。本发明的制造方法具有：对蛋黄进行脱脂处理的工序、将获得的脱脂蛋黄用蛋白水解酶进行水解而获得蛋黄蛋白水解物的工序、使获得的蛋黄蛋白水解物作为有效成分而含有的工序。

[0050] 实施例

[0051] 以下通过实施例详细说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。

[0052] 〔实施例1：蛋黄蛋白水解物的制造〕

[0053] (1)脱脂蛋黄的制备

[0054] 在蛋黄粉末1kg中加入乙醇5L，用搅拌机搅拌30分钟后回收固形物。重复进行3次该操作，对蛋黄进行脱脂，风干，获得568g的脱脂蛋黄粉末。

[0055] (2)蛋黄蛋白水解物的制备

[0056] 在(1)中获得的脱脂蛋黄粉末500g中加入水2.5kg及诺维信公司制的Alcalase(商品名，来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的蛋白酶)25g，将pH调至7，在55℃下进行3小时酶反应，然后，在80℃下进行15分钟的热处理使酶失活，以
3000×g离心分离20分钟，除去不溶物，过滤，然后对滤液进行喷雾干燥，获得约140g的蛋黄蛋白水解物。

[0057] 对获得的蛋黄蛋白水解物，按照以下的条件进行凝胶过滤色谱，进行分子量的分析。

[0058] 柱：Diol 60(6.0×300mm)(商品名，YMC CO.,LTD.制)

[0059] 洗脱液：0.2M磷酸钾缓冲液、0.2M NaCl(pH6.9)/乙腈(70：30)

[0060] 流速：0.7ml/分钟

[0061] 检测波长：280nm

[0062] 分子量分析的结果示于图1。由图1可知，实施例1的蛋黄蛋白水解物中，相对于表示蛋白质、肽、氨基酸的合计的总面积，分子量为100以上且20,000以下的部分的面积比占约90％。

[0063] 〔实施例2：蛋黄蛋白水解物对软骨细胞增殖的效果的研究〕

[0064] 使用上述实施例1中制造的蛋黄蛋白水解物作为蛋黄蛋白水解物。

[0065] 作为细胞，使用来自小鼠胚细胞的软骨细胞样分化的ATDC5(RIKENBANK、RBC0565)4 2
培养细胞株。将ATDC5以2×10个/cm 的密度播种到96孔板，用含5％FCS(胎牛血清)的Eagle MEM培养基在5％CO2下、37℃下进行培养。在培养1天后，用不含血清的Eagle MEM培养基洗涤1次，在各孔中添加95μl的Eagle MEM培养基后，加入5μl的试验液，在
37℃下培养3天。作为试验液，使用将蛋黄蛋白水解物溶解于EagleMEM培养基后用0.45μm过滤器进行了过滤灭菌的试验液。制备的试验液的蛋黄蛋白水解物浓度为如下浓度：当在每孔中添加5μl时，终浓度达到1mg/ml或10mg/ml。培养3天后，用MTT法测定细胞数。

[0066] 结果示于表1。以％值(增殖值)形式计算出将蛋黄蛋白水解物无添加组的细胞数设为100％时的、添加组的细胞数。如表1所示，蛋黄蛋白水解物使ATDC5细胞用量依赖性地增加，即表明其对软骨细胞具有增殖促进作用。

[0067] [表1]

[0068]终浓度(mg/ml) 增殖率(％)
0 100
1 111
10 132

[0069] 〔实施例3：蛋黄蛋白水解物对兔子软骨缺损模型的效果〕

[0070] 3－1试验方法

[0071] (1)施予待测物

[0072] 使用上述实施例1中制造的蛋黄蛋白水解物作为蛋黄蛋白水解物。在使用时，将该蛋黄蛋白水解物用精制水调整至50mg/15mL(50mg/天组)、200mg/15mL(200mg/天组)，将悬浊液作为施予待测物。

[0073] (2)试验动物及试验条件

[0074] 购买22周龄的兔子(Slc：JW、SPF、雄、日本SLC株式会社)。获得的动物设置5天的检疫期，然后设置1天或7天的驯化期。动物饲养在保持设定温度23℃、设定湿度55％的饲养室。获得动物后用铝制笼子单个地饲养。关于饲料，喂给固体饲料(LRC4，Oriental Yeast Co.,ltd.)120g/天。关于饮用水，使其自由摄取自来水。

[0075] (3)兔子软骨缺损模型的制作

[0076] 将氯胺酮盐酸盐及甲苯噻嗪盐酸盐的混合液肌肉内给药至大腿肌进行麻醉。剪掉大腿部周边的毛，将动物固定为仰卧位，用5％洗必泰液(ヒビテン液)(注册商标、大日本住友制药株式会社)的约10倍稀释液、消毒用醇及10％聚烯吡酮碘液(イソジン液)消毒后，将利多卡因盐酸盐2～3mL施予至左右大腿部皮下。对于左右大腿部，用手术刀切开外侧的皮肤及肌膜，使膝关节露出。沿着内侧的膝盖韧带切开关节囊，使膝盖骨脱臼。在各大腿骨关节沟的2处(Φ2mm、Φ4mm)，用转头沿着垂直于骨面的方向制作骨孔。需要说明的是，在损伤时，用添加恩诺沙星(0.05％)的生理盐水(株式会社大塚制药工场)清洗手术区及骨孔。用缝合线(尼龙缝合线、4－0、3－0、Alfresa Pharma Corporation)将切开的左右大腿部的肌膜、皮肤缝合。缝合后涂布聚烯吡酮碘凝胶(明治制果制药股份有限公司)。术后两天对颈背部皮下施予恩诺沙星。为了防止切开部感染，在术后一周内佩戴伊丽莎白颈圈(Elizabethan collar)。

[0077] (4)组构成及试验日程

[0078] 设置对照组(施予精制水)、50mg/天组及200mg/天组共3个组。每组使用3只兔子。损伤第二天起至剖检前一天为止的3周，每天强制经口施予一次(15mL/只)。施予期间内每天观察一次一般状态及有无死亡。

[0079] 在所有个体的剖检日，在耳廓静脉内施予4％戊巴比妥钠麻醉的条件下，从腹大动脉放血致死后，剖检，肉眼观察损伤部位及其周围。

[0080] (5)病理组织学评价及统计学的方法

[0081] 摘出大腿骨(包含损伤部位)，用4％多聚甲醛/磷酸缓冲液固定、脱脂，然后用K－CX脱钙。按照常规方法进行石蜡包埋，将缺损处置部的中心部作为标本，进行HE染色、阿辛蓝染色及番红O染色，制作标本。在阿辛蓝染色及番红O染色标本中，使用市售软件(Microsoft Office Excel2003)测定染色部位的面积。

[0082] 对各组的阿辛蓝染色面积及番红O染色面积求出平均及标准偏差，进行对照组和50mg/天组、以及对照组和200mg/天组之间的差异显著性检验(t检验)。显著性水平设为
5％，将小于5％(P＜0.05)和小于1％(P＜0.01)分开表示。

[0083] 3－2结果

[0084] 全部个体都未见死亡例及濒死例，整个施予期内一般状态方面未见异常。剖检时的损伤部位的肉眼所见中，50mg/天组及200mg/天组均观察到骨孔的修复正在进行。尤其是Φ2mm的骨孔的修复明显在进行。

[0085] 将阿辛蓝染色面积的结果示于图2。由图2可知，50mg/天组及200mg/天组中，Φ2mm的骨孔中，与对照组相比可见显著增加。由该结果可知，通过经口施予蛋黄蛋白水解物，软骨底物成分即酸性粘多糖类增加。

[0086] 将番红O染色面积的结果示于图3。由图3可知，在200mg/天组的Φ2mm及Φ4mm的骨孔中，与对照组相比可见显著增加。由该结果可知，通过经口施予蛋黄蛋白水解物，作为软骨底物成分的蛋白聚糖类增加。

[0087] 〔实施例4：蛋黄蛋白水解物对膝关节痛患者的效果〕

[0088] 4－1试验方法

[0089] (1)待测物

[0090] 使用上述实施例1中制造的蛋黄蛋白水解物作为蛋黄蛋白水解物。将含有50mg该蛋黄蛋白水解物的硬胶囊作为待测物。使用不含蛋黄蛋白水解物的硬胶囊(仅含有赋形剂)作为安慰剂。

[0091] (2)试验组及受试者的选择基准

[0092] 将按照以下的选择基准1～5选出的膝关节痛患者(平均年龄56.9岁)，分为蛋黄蛋白水解物施予组(50mg/天)及安慰剂组这2组，开始试验。

[0093] 〔选择基准〕

[0094] 1.自觉膝关节疼痛并经医生确认的患者

[0095] 2.40岁～70岁

[0096] 3.在试验实施日能来医院的人

[0097] 4.未接受过膝关节给药治疗的人

[0098] 5.没有需要治疗的精神性疾病的健康者

[0099] 6.听取了试验相关说明并同意的人

[0100] (3)服用期

[0101] 各组每天早饭后用适量水将硬胶囊1粒一次性服用，持续摄取8周。

[0102] (4)评价

[0103] 通过WOMAC(Western Orntario and McMaster Universities Osteoarthritis Index)问卷调查来评价。WOMAC为对变形性膝关节症的主观疼痛、主观的身体功能的世界通用指标，医生询问后判断状态并记录。在服用开始前、服用开始第4周及第8周实施。按照服用开始前的评价无偏差地进行分组。

[0104] 4－2结果

[0105] 结果示于图4。最终受试者数为：蛋黄蛋白水解物施予组16名、安慰剂组17名。由图4可知，在服用开始第4周及第8周，蛋黄蛋白水解物施予组可确认到显著的膝关节痛的改善。

[0106] 〔实施例5：蛋黄蛋白水解物的分子量分析〕

[0107] 对于实施例1中制备的蛋黄蛋白水解物，在与实施例1不同的以下的条件下通过凝胶过滤色谱进行分子量分析。

[0108] 柱：Diol 60(8.0×500mm)(商品名、YMC CO.,LTD.制)

[0109] 洗脱液：0.1M磷酸钾缓冲液、0.2M NaCl(pH6.9)/乙腈(70：30)

[0110] 流速：0.7ml/分钟

[0111] 检测波长：215nm

[0112] 分子量分析的结果示于图5。分子量为100以上且20,000以下的部分相对于总面积的面积比占约90％。

[0113] 〔实施例6：蛋黄蛋白水解物的分级〕

[0114] 将通过与实施例1相同的方法制备的蛋黄蛋白水解物用分子量1,000的超滤膜进行分级。对于获得的分级物，用与上述实施例5相同条件的凝胶过滤色谱进行分子量分析。

[0115] 分子量分析的结果示于图6。由图6可知，分级物中，相对于表示蛋白质、肽、氨基酸的合计的全面积，分子量为500以上且20,000以下的部分的面积比占约90％。

[0116] 〔实施例7：分级物对软骨细胞增殖的效果的研究〕

[0117] 使用上述实施例6中制备的分级物，用与实施例2相同的方法研究对软骨细胞增4 2
殖的效果。即，将ATDC5细胞以2×10个/cm 的密度播种在96孔板中，用含有5％FCS的Eagle MEM培养基在5％CO2下、37℃下进行培养。在培养1天后，用不含血清的Eagle MEM培养基洗涤1次，在各孔中添加95μl的Eagle MEM培养基后，加入5μl的试验液，在37℃下培养3天。作为试验液，使用将上述分级物溶解于Eagle MEM培养基后用0.45μm过滤器进行了过滤灭菌的试验液。制备的试验液的分级物浓度为如下浓度：当在每孔中添加5μl时，终浓度达到1mg/ml或10mg/ml。培养3天后，用MTT法测定细胞数。

[0118] 结果示于表2。以％值(增殖值)形式计算出将无添加组的细胞数设为100％时的、添加组的细胞数。如表2所示，分级物使ATDC5细胞用量依赖性地增加，即表明其对软骨细胞具有增殖促进效果。

[0119] [表2]

[0120]终浓度(mg/ml) 增殖率(％)
0 100
1 118
10 145

[0121] 〔实施例8：清凉饮料水〕

[0122] 制备含有实施例1中制造的蛋黄蛋白水解物的清凉饮料水。即，将组成为混合异构化糖15.0％、果汁10％、蛋黄蛋白水解物2.0％、香料0.1％、钙0.1％、水72.8％的原料混合，用板式杀菌机在90℃下杀菌15秒钟，由此制造清凉饮料水。

[0123] 〔实施例9：酸奶〕

[0124] 制备含有实施例1中制造的蛋黄蛋白水解物的酸奶。即，将组成为蛋黄蛋白水解物3.0％、蔗糖7％、香料0.1％、酸奶89.9％的原料混合，填充到容器中，由此制造酸奶。

[0125] 〔实施例10：奶酪〕

[0126] 制备含有实施例1中制造的蛋黄蛋白水解物的加工奶酪。即，按照包含高达奶酪35％、切达奶酪35％、帕尔玛奶酪20％、蛋黄蛋白水解物2.0％、磷酸钙1.0％、水7.0％的组成而混合各原料后，在乳化温度85℃下进行乳化，制造加工奶酪。

[0127] 〔实施例11：胶囊剂〕

[0128] 按照包含实施例1中制造的蛋黄蛋白水解物60％、玉米淀粉30％、乳糖10％的组成配合各原料后，填充到明胶胶囊(每个胶囊中200mg)中，制造胶囊剂。

[0129] 〔实施例12：片剂〕

[0130] 按照包含实施例1中制造的蛋黄蛋白水解物60％、还原麦芽糖18％、结晶纤维素18％、蔗糖酯4％的方式配合各原料后，压片(每片300mg)，由此制造片剂。

[0131] 需要说明的是，本发明不受上述各实施方式及实施例限定，可以在权利要求所示的范围内进行各种变更，在不同的实施方式中分别公开的技术手段适当组合而成的实施方式也包含在本发明的技术范围内。