一种含有天然成分的食品添加剂 |
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| 申请号 | CN201010151124.1 | 申请日 | 1998-08-05 | 公开(公告)号 | CN101849675B | 公开(公告)日 | 2013-02-20 |
| 申请人 | 麦莱琉卡有限公司; | 发明人 | 林恩·珀克斯; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供用于抑制 哺乳动物 体内血小板活性和低 密度 脂蛋白胆固醇 氧 化的 食品添加剂 ，其包括有效量的至少一种黄 酮 类物质来源和消化酶，其中所述黄酮类物质来源选自葡萄籽提取物、葡萄皮提取物、越桔提取物、 银 杏提取物和槲皮素。本发明还提供用于抑制哺乳动物体内血小板活性和低密度脂蛋白胆固醇氧化的食品添加剂，其包括有效量的葡萄籽提取物、葡萄皮提取物、银杏提取物、越桔提取物、槲皮素、 真菌 蛋白酶、酸性稳定蛋白酶和菠萝蛋白酶。本发明还提供含有所述添加剂的产品以及添加剂的应用。 | ||||||
| 权利要求 | 1.用于抑制哺乳动物体内血小板活性和低密度脂蛋白胆固醇氧化的食品添加剂，其包括至少一种黄酮类物质来源和消化酶，其中所述黄酮类物质来源选自葡萄籽提取物、葡萄皮提取物、越桔提取物、银杏提取物和槲皮素，其中所述食品添加剂在以30mg/kg或更小剂量能有效抑制哺乳动物体内血小板活性和低密度脂蛋白胆固醇氧化。 |
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| 说明书全文 | 一种含有天然成分的食品添加剂技术领域[0002] 本发明涉及一种含有天然成分的食品添加剂。 背景技术[0003] 冠心病、心肌梗死、中风和其它血管栓塞性疾病是威胁健康的主要因素。这类疾病的共同特征是动脉的粥样硬化或者狭窄。血小板是导致动脉粥样硬化形成和发生的因素，它释放生长因子、化学聚合物质和其它因子，加速动脉粥样硬化过程。另外，血小板在动脉损伤部位或附近的聚集导致动脉粥样硬化的形成和急性血小板血栓形成。 [0004] 低密度脂蛋白(LDL)胆固醇也与动脉粥样硬化有关。已有报道指出血液循环中的非致动脉粥样硬化性低密度脂蛋白胆固醇通过多不饱和脂类的氧化转化为致动脉粥样硬化性低密度脂蛋白胆固醇，导致对脱辅基蛋白质的修饰。 [0005] 医生使用各种药物，如阿司匹林，来治疗动脉粥样硬化性疾病。但是，阿司匹林具有副作用，包括胃肠道刺激症状等。还有一些介入疗法如血管成形术可以使狭窄的动脉扩张以增加血流量。但是，介入技术会产生动脉内膜或中层的损伤，并将血栓形成表面暴露。正是这种原因，对于已知或怀疑有冠心病的病人来说，主要关心的是血管形成术后的再狭窄和突发性冠心病死亡。 [0006] 鉴于动脉粥样硬化的严重后果和有关的医疗费用，需要药物和营养的共同介入，以适用于防止这类疾病的发生或再发生。 [0008] 已经发现某些黄酮类物质，包括存在于葡萄籽和葡萄皮提取物中的黄酮类物质，与阿司匹林表现出的有益健康作用相关，但是没有阿司匹林的副作用。尽管如此，但是许多黄酮类物质来源中的黄酮类物质生物利用度或活性较低。鉴于这种原因，某些食品来源的黄酮类物质需要大剂量才实用。结果是，基于每天可利用的黄酮类物质来说，许多黄酮类物质来源不切实用，太昂贵，或者二者兼有。 发明内容[0009] 本发明涉及如下发现，即将某些黄酮类物质与酶组合制成食品添加剂的形式，可以减少为有效降低哺乳动物体内血小板活性和低密度脂蛋白胆固醇氧化所需的添加剂剂量。本发明还涉及一种与血小板活性和低密度脂蛋白胆固醇氧化有关的疾病的治疗方法，其通过给药黄酮类物质和酶的组合物以减少血小板活性和低密度脂蛋白胆固醇氧化。 [0010] 一方面，本发明的特征在于一种食品添加剂，它包括至少一种黄酮类物质来源和一种酶，其中该添加剂在以大约30mg/kg或更小剂量能有效抑制哺乳动物体内血小板活性TM和低密度脂蛋白胆固醇氧化。根据本发明，食品添加剂的一个例子是PROVEXCV 。应当理解为本发明所使用的添加剂剂量是指黄酮类物质来源和酶的结合重量。另外，作为添加剂还可以包括其它成分如填充剂、润滑剂、载体等。 [0011] 该食品添加剂中的黄酮类物质来源可以是来源于葡萄籽提取物、葡萄皮提取物、越桔(bilberry)提取物、银杏(ginkgo biloba)提取物或槲皮素。酶可包括真菌蛋白酶、酸稳定性蛋白酶、中性稳定蛋白酶、碱性稳定蛋白酶或菠萝蛋白酶。 [0012] 另一方面，本发明的特征在于提供一种食品添加剂，它包括至少一种黄酮类物质来源，其中该添加剂在以大约30mg/kg或更小剂量能有效抑制哺乳动物体内血小板活性和低密度脂蛋白胆固醇氧化。优选的是，根据本发明的食品添加剂还包括一种酶，它可以基本上减少达到这种抑制所需的剂量。 [0013] 另一方面，本发明的特征是提供一种抑制哺乳动物体内血小板活性或低密度脂蛋白胆固醇氧化或同时抑制二者的方法，该方法是通过给药一种包括黄酮类物质来源和酶的食品添加剂，其中该添加剂可以在以大约30mg/kg或更小剂量有效减少血小板活性和低密度脂蛋白胆固醇氧化。该方法也可以用来治疗与血小板活性或低密度脂蛋白胆固醇氧化有关的疾病，该方法是通过给药一种包括能有效减少血小板活性或低密度脂蛋白胆固醇氧化的黄酮类物质和酶的食品添加剂。 [0014] 另一方面，本发明的特征是提供一种包装在一种包装材料之中的、含有能有效减少血小板活性和低密度脂蛋白胆固醇氧化的食品添加剂的产品。其中的包装材料标示有该食品添加剂在大约30mg/kg或更小剂量可以有效减少血小板活性或低密度脂蛋白胆固醇氧化或抑制二者的标记。在该产品的另一个实施方案中，包装材料可以标示有该食品添加剂适用于治疗与血小板活性或低密度脂蛋白胆固醇氧化有关的疾病的标记。 [0015] 除非另有定义，本发明使用的所有科技术语和缩写与本发明相关领域中的普通技术人员所通常理解的含义相同。尽管在实施或检验本发明的过程中可以使用与本发明所述相似或相同的方法和材料，但是下面还是描述了合适的方法或材料。本发明所涉及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均被本发明作为参考文献全部引用。如果有所不清楚，本发明的说明书，包括定义，将用于解释和说明。附图说明 [0017] 图1表示用于制备动物模型的示意图，该模型形成狭窄的动脉，用于测量当间歇性血栓形成时所观察到的冠状动脉血流变化，以便模仿因动脉粥样硬化所致冠状动脉狭窄的病人体内所发生的疾病。 [0018] 图2是一种带状记录图，表示反复的血小板介导性血栓形成，之后形成栓塞，通过测量Folts模型形成的狭窄动脉中的血流发现这种栓塞产生了循环血流减少(CFR’s)。 [0019] 图3是一种带状记录图，显示摄入PROVEXCVTM后循环血流减少消失，这是因为TMPROVEXCV 这种本发明的优选食品添加剂在体内具有血小板抑制活性。 [0020] 图4是一种带状记录图，显示在给药PROVEXCVTM后的2个半小时当给以肾上腺素TM时，通过摄入PROVEXCV 消除的循环血流减少不再重新出现。 [0021] 图5表示一种描述本发明用以测定体外血小板活性的全血集合度计量方法的示意图。 [0022] 图6是用于表示在维生素E、ProVex PlusTM或PROVEXCVTM存在下于234nm下测定的低密度脂蛋白胆固醇氧化时间过程的曲线图。 [0023] 图7是表示由PROVEXCVTM产生的抗低密度脂蛋白胆固醇氧化的预防水平图。 [0024] 图8是表示低密度脂蛋白胆固醇氧化速率的曲线图。 具体实施方式[0025] 本发明涉及如下发现，即将某些黄酮类物质与酶组合制成食品添加剂的形式，可以减少为有效降低哺乳动物体内血小板活性和低密度脂蛋白胆固醇氧化所需的添加剂剂量。本发明还涉及一种与血小板活性和低密度脂蛋白胆固醇氧化有关的疾病的治疗方法，其通过给药黄酮类物质、提取物和酶的组合物以减少血小板活性和低密度脂蛋白胆固醇氧化。 [0026] 冠心病、脑血管疾病和外周血管闭塞的特征是动脉狭窄。如果动脉狭窄再合并血栓栓塞，血流将进一步减少，可能会发生心肌梗死或中风。这些疾病与血小板活性和低密度脂蛋白胆固醇氧化有关。目前治疗这类血管栓塞性疾病的方法，如血管成形术，会引起动脉内膜和中层的损伤，这会引起再狭窄、急性血栓形成、心肌梗死和病人突发性冠心病死亡。而且，血小板介导性血栓形成对于血管成形术或动脉切除术后的不稳定性心绞痛、心肌梗死和再狭窄的发生也有一定的作用。本发明提供了一种防止新生血栓和再形成血栓的食品添加剂和方法，即通过施用一种能抑制血小板活性和低密度脂蛋白胆固醇氧化的食品添加剂。 [0027] 评价血小板活性的方法 [0028] 1、Folts模型 [0029] Folts冠脉血栓模型(“Folts模型”)用于研究各种动物模型中的血小板聚集和血栓形成。Folts，J.D.，循环杂志(增刊4)，83：3-14(1991)；Folts，J.D.，心血管药物和疗法杂志，9：31-43(1995)；Folts等人，循环杂志，54：365-370(1976)。Folts模型模仿了因动脉粥样硬化引起的冠状动脉狭窄在病人体内出现的一些问题。 [0030] 使用Folts模型时，需要全部打开麻醉动物的胸腔并暴露心脏。虽然本发明描述的实验使用的是狗，但是可以建立Folts模型的其它动物还包括猪、兔子、猴子和其它类似动物。而且，Folts模型是一种模拟不稳定性心绞痛临床症状和人体内其它血小板介导性血栓疾病的模型。Samama等人，Thromb.Haeost.，68：500-05(1992)；Raeder等人，Am.HeartJ.，104：249-253(1983)；Sherry，s.，Cardiovasc.Rev.Rep.，5：1208-19(1984)；Ikeda等人，J.Am.Coll.Cardiol.，21：1008-1017(1993)。 [0031] 如图1所示，将弯曲冠状动脉切断，并将冠状动脉流量探针置于动脉上。冠状动脉流量探针连续不断地测量通过动脉的血流量而不影响该动脉。然后将该动脉用钳夹后造成冠状动脉的内膜和中层损伤。将一种塑料限制性环置于在动脉损伤处的冠状动脉外环以减小冠状动脉的内径。使用血管成形气囊或其它合适的方法改变狭窄程度或由塑料环造成的内径减小。 [0032] 用冠状动脉流量探针测定血栓间歇性形成时冠状动脉血流的变化。当动脉狭窄时，血小板周期性的聚集在狭窄处，并损伤部分冠状动脉。血小板聚集产生血栓(血凝块)，其形状增大，并逐渐切断冠状动脉的血流量。当动脉变得闭塞时，血小板聚集后引起血压升高，这样可以推动血块迫使其通过狭窄处，引起狭窄动脉中冠状动脉血流的突然恢复。在损伤动脉中足以能减少血流量的血小板聚集被称为急性血小板血栓形成(APTF)。 [0033] 人体内血栓性动脉闭塞被认为是由动脉内膜下的血栓形成表面暴露引发。另外，最新资料提示各种不同的刺激因素激活血小板粘附和聚集在暴露的血栓形成表面。尽管如此，应当指出的是本发明的范围并不受该特定病理理论的限制。 [0034] 反复的血小板性血栓形成，之后出现栓塞，和观察到伴发血流变化被称作为循环血流减少(CFR’s)或循环血流改变(CFV’s)。本申请文件将使用术语CFR’s。人体股动脉或冠状动脉疾病造成的动脉损伤和狭窄也发现有CFR’s。Folts等人，Tex.Heart Int.J.，9：19-27(1982)；Eichom等人，J Am.Coll.Cardiol.，17：43-52(1991)。如图2所示，通过测量冠状动脉血流可以测得和监测CFR’s。尽管图2表示的是由冠脉血流观察到的CFR’s，但是应当理解为Folts模型适用于一般的动脉血流(例如，股动脉血流)。另外，使用Folts模型及其改进模型所需的方法记载于Folts，J.D.，循环杂志(增刊4)，83：3-14(1991)； Folts，J.D.，心血管药物和疗法杂志，9：31-43(1995)，本文作为文献引用。 [0035] 每单位时间内出现CFR’s的频率或次数是对体内血小板活性的直接测定。Folts，J.D.，心血管药物和疗法杂志，9：31-43(1995)。通过测定狭窄动脉中CFR’s的频率和程度，可以用Folts模型评价能够改变血小板活性的因素，Folts，J.D.，心血管药物疗法杂志，9：31-43(1995)。正是如此，利用Folts模型可以鉴别血小板抑制因子、抑制因子活性的程度、抑制因子的有效剂量、抑制周期和抑制因子拮抗血小板机动剂的能力。 [0036] 阿斯匹林提供了一种Folts模型的解释性举例。Folts模型显示阿斯匹林抑制血小板活性并在实验条件下消除CFR’s。Folts等人，临床研究杂志，22：595(1974)(摘要)；Folts J.，循环杂志(增刊4)，83：3-14(1991)；Folts，J.D.，心血管药物和疗法杂志，9： 31-43(1995)。已知阿斯匹林在5mg/kg剂量下抑制血小板活性。当在Folts模型中所用条件下使用阿斯匹林抑制血小板活性时，通过增加血液中的肾上腺素或去钾肾上腺素浓度可以恢复血小板活性。当人体处于紧张、惊吓、焦虑或兴奋时，许多人自然出现这种肾上腺素的增加。Folts，J.D.&Rowe，G.G.，Thromb.Res.，50：507-516(1988)。另外，动脉狭窄的增加也会使得由阿斯匹林消除的CFR’s再出现。Folts，J.，循环杂志(增刊4)，83：3-14(1991)。 因此，Folts模型提供了一种评价血小板活性抑制的有效工具。 [0037] 2、血小板集合度试验 [0038] 测量人体或动物体内血小板活性的第二种方法是全血血小板集合度试验。本发明所述和使用的进行全血血小板集合度评价的设备和方法记载于Chronolog Inc.，2West Park Rd.，Haverton，PA 19083。为了进行该试验，通过常规方法抽取血样，然后将血样置于塑料试管中。将一对电极置于血样中测量血样中的电阻。由于血液中存在的大量离子和电解质，通常血液中的电阻较低。将一种已知的血小板聚集刺激因子，如肾上腺素二磷酸盐(ADP)或胶原蛋白，加入到血样中以激活血小板。激活的血小板粘附在血小板集合度试验中所用的电极上。如图5所示(右边)，当血小板聚集在电极上时血样中的电阻通常会以S形增加。如果受试者施用一种抑制血小板活性的物质，加入血小板刺激因子后出现的电阻增加将会减小。 [0039] 阿斯匹林提供一种使用血液集合度试验的说明性举例。来源于人体的血样具有一定基础水平的血小板活性。加入ADP会增加血样的电阻。参见图5，右边，“ADP”曲线。在人体给药325mg阿斯匹林片剂后2小时抽取第二份血样。加入ADP后的血小板激活不会使血小板活性增加到开始血样所观察到的水平。参见图5，右边，“ADP+ASA”曲线。所观察到的血样中电阻的降低被表述为由阿斯匹林引起的血小板体外活性降低百分率。当一个服用阿斯匹林的人在抽取血样之前使其肾上腺素水平升高，所观察到的阿斯匹林的抑制活性已经消失。参见图5，右边，“ADP+ASA+EPI”曲线。Folts，J.D.，心血管药物和疗法杂志，9：31-43(1995)；Ingerman-Wojenski &Silver，Thromb.Haemost.，51：154-156(1984)。 [0040] 当使用胶原蛋白刺激血小板活性时，阿斯匹林也会有类似的反应。当在血液集合度试验中使用胶原蛋白激活血小板活性时，阿斯匹林降低了血小板活性大约30-40％。因此，血液集合度技术也可以用来作为测定由药物或黄酮类物质产生的血小板抑制效果的另一种方法。 [0041] 3、评价低密度脂蛋白胆固醇氧化 [0042] 可以通过几种方法确定低密度脂蛋白胆固醇氧化或对其的预防。Kleinveld等人，Clin.Chem.，38(10)：2066-2072(1992)描述了本发明所述和使用的低密度脂蛋白氧化实验方法。所述该方法的优选方式包括使用常规技术从受试者采集的全血血样中提取低密度脂蛋白胆固醇。将提取的低密度脂蛋白胆固醇分为对照组和实验组样本。通过向每一种低密度脂蛋白胆固醇样本中加入铜离子溶液催化低密度脂蛋白的氧化。已知铜离子可以催化和加强低密度脂蛋白胆固醇的氧化。 [0043] 对照组低密度脂蛋白胆固醇样本含有提取的低密度脂蛋白胆固醇和铜离子。对照组样本提供了一种对抽取血液的受试者饮食中和由该血液制备的低密度脂蛋白胆固醇中抗氧化剂的基础测试。将试验低密度脂蛋白胆固醇样本在其它可以作为抗氧化剂的化合物如食品添加剂存在或不存在下与铜离子结合。 [0044] 另外，在对受试者采集血样之前通过常规方法给药一种抗氧化剂，这可以有助于体内测定抗氧化剂的活性。为了测定体内的低密度脂蛋白胆固醇抗氧化剂活性，在给药一种被检测的抗氧化剂来源之前或之后采集全血样本。 [0045] 铜离子加速低密度脂蛋白胆固醇氧化中共轭二烯的产生，其光谱在234nm处有吸收峰。因此，按照如图6所示的随着时间推移跟踪234nm处吸收率的增加可以监测低密度脂蛋白胆固醇的氧化。抗氧化剂可以推延低密度脂蛋白胆固醇中二烯产生的启动。结果，可以通过对低密度脂蛋白胆固醇氧化之前观察到的时间推移(延迟时间)进行计算来比较含有抗氧化剂的低密度脂蛋白胆固醇样本。参见图7。延迟时间是在本发明所述低密度脂蛋白氧化实验条件下防止低密度脂蛋白胆固醇被氧化损伤的最佳信号。延迟时间越长表示抗氧化剂性能越好。 [0046] 抑制血小板活性和减少低密度脂蛋白胆固醇氧化 [0047] 许多复杂因素导致动脉粥样硬化、冠心病和相关疾病。在这些因素当中，已知血小板与动脉内壁的相互作用会加速动脉粥样硬化的过程。而且，血小板活性增加是与动脉粥样硬化的发展和暂时性及持续性血栓形成密切相关的。因此，基于每天都能减少血小板活性的因素应当可以抑制动脉粥样硬化、冠心病和相关疾病的发展或发生。Folts等人，J.Myocard.Ischemia，6(8)：33-40(1994)。 [0048] 流行病学研究表明在摄入富含抗氧化剂黄酮类物质或维生素E食品的消耗和冠心病减少之间存在负相关性。Hertog等人，Lancet，342(8878)：1007-11，(1993)；Waterhouse等人，HypernutritiousFoods，Agscience，Inc.，Auburndale，Fl.，219-238(1997)。已知含有黄酮类物质的食品来源包括红葡萄酒、啤酒、葡萄汁、水果和蔬菜。从葡萄籽、葡萄皮、银杏、越桔和其它类似水果、蔬菜和草药中获得的提取物也是黄酮类物质和抗氧化剂的来源。 [0049] 尽管如此，为了有效地获得与黄酮类物质和抗氧化剂有关的益处，还必须克服许多障碍。障碍之一是食品来源的黄酮类物质中活性成分的生物利用度。如果生物利用度或活性较低，人体必须消耗大量的血小板抑制剂或抗氧化剂食品添加剂以获得血小板抑制剂或抗氧化剂带来的益处。结果是，低生物利用度会导致食品添加剂对于许多消费者来说不实用、太昂贵，或二者兼有。 [0050] 另外，与不同的黄酮类物质有关的血小板抑制和抗氧化剂特征的有效性在特定的黄酮类物质之间也有所不同，例如，来源于葡萄的黄酮类物质比来源于柑桔类水果汁的黄酮类物质在自愿者人体和动物体内的是更好的血小板抑制剂。Folts等人，J.Am.Coll.Cardiology，29(2)(增刊A)：303A(1997)；Folts，J.D.，J.Am.Coll.Cardiology，29(2)(增刊A)：226A(1997)；Folts等人，J.Am.Coll.Cardiology，29(2)(增刊A)：180A(1997)。 [0051] 而且，血流中的环境条件是不稳定的。要达到有效，一种食品添加剂必须在各种条件下，包括不同程度的紧张、兴奋和劳累等这些倾向于升高血小板活性水平的条件下，都是有效的。 [0052] 最后，许多黄酮类物质的食品来源，还含有不需要的成分，如葡萄酒和啤酒中的酒精、葡萄汁中的糖分和热量。对于各种黄酮类物质和药物还存在相关的毒性。例如，许多文献记载阿司匹林具有副作用，包括胃肠道刺激、在肾上腺素存在下有效性的丧失和在极度动脉狭窄环境下不能抑制CFR’s。 [0053] 因此，希望创制一种实用和价值有效而适用的食品添加剂，它能够在各种不同条件下抑制血小板活性和低密度脂蛋白胆固醇氧化。还希望这种适用的食品添加剂的主要特征是通过含有能增加吸收该食品添加剂活性成分的组分来增加该食品添加剂的生物利用度。本发明已经发现了这样一种添加剂，并且本文对该添加剂进行了描述和提请专利保护。 [0054] 在第一个实施方案中，本发明提供了一种食品添加剂，它含有至少一种黄酮类化合物来源和一种酶，该食品添加剂给哺乳动物以大约30mg/kg或更少的剂量服用时，可以有效地抑制体内血小板活性和低密度脂蛋白胆固醇氧化。该食品添加剂可以进一步含有黄酮类物质来源，如葡萄籽提取物、葡萄皮提取物、银杏提取物、槲皮素、越桔提取物或其它任何特定的黄酮类物质。“该黄酮类物质来源”可以是来源于任何来源，并且可以包括合成或从已知来源中纯化的黄酮类物质。该黄酮类物质来源也可以是，例如，被确定为单独或作为结合物具有高活性的一种或多种黄酮类物质，其中该黄酮类物质是从含有多种黄酮类物质的复合混合物中，如从一种植物提取物中分离得到的。 [0055] 虽然不受特定作用理论的限制，应当相信本发明公开的食品添加剂通过增加生物利用度或药理相互作用以发挥协同作用，抑制血小板活性和抑制低密度脂蛋白胆固醇氧化。在本发明的有关方面，该食品添加剂在血小板激动剂(如，肾上腺素)浓度升高的情况下仍能保持有效地降低血小板活性和抑制低密度脂蛋白胆固醇氧化。 [0056] 食品添加剂的制剂的实例包括下述一种或多种成分：水果提取物、蔬菜提取物、消化酶、草药、黄酮类物质、抗氧化剂和其它类似物。 [0057] 适用消化酶举例说明的实例包括胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、真菌蛋白酶、酸稳定蛋白酶、中性稳定蛋白酶、碱性稳定蛋白酶和菠萝蛋白酶。 [0058] 适用黄酮类物质的举例说明的实例包括黄酮类物质的儿茶素、矢车菊苷配质、原花色素、槲皮素、芸香苷和糖苷的形式。 [0059] 本发明的食品添加剂可以作为一种植物类(phytosome)成分通过口服、静脉内、皮下、舌下、胃内或通过任何其它可接受的给药方法给药。另外，该食品添加剂可以与任何合适的载体结合使用以便于给药。本发明使用Folts模型检测的食品添加剂可以通过静脉内或胃内给药。通过胃内膜吸收通常需要2-4小时。因此，胃内给药食品添加剂在该食品添加剂摄入后2-4小时才会影响CFR’s。 [0060] 市场上的食品添加剂一般制成可口服给药的剂型。适合于食品添加剂的给药的剂型包括丸剂、膏剂、粉剂、液体制剂和其它普通口服制剂。对于本发明所述的各种剂型的食品添加剂可以使用常规的生产技术进行生产。本发明所述的食品添加剂另外还可以含有硬脂酸镁作为润滑剂以便将该食品添加剂制备成胶囊。硬脂酸镁一般的使用浓度为1-4mg/每胶囊，优选1-2mg/每胶囊。 [0061] 可以用Folts模型来鉴别能够降低血小板活性的食品添加剂的制剂。按照本发明所述，制备狗的冠状动脉使其表现出CFR’s。然后通过一种认可的方法以测定的剂量对狗给药。监测该食品添加剂的剂量对观察到的CFR’的影响。通过使用Folts模型可以确定有效剂量、半衰期和吸收程度。从狗体采集的血样提供了有关该添加剂浓度和血流内血小板活性水平的信息。 [0062] 可以使用其它的实验来评价适用的食品添加剂的特征。例如，通过在给药食品添加剂后可使狭窄程度增加来确定是否有CFR’s的再出现。另外，通过在给药食品添加剂之前或之后的不同时间点施用血小板激动剂可以鉴别出能够在血小板激活条件下保持CFR消除作用的食品添加剂。适用的激动剂包括肾上腺素和去钾肾上腺素。用于此目的的肾上腺素适用剂量包括静脉内以0.2μg/kg/分钟的剂量给药肾上腺素15分钟。 [0063] 也可以对患有人类冠心病的自愿者或病人给以本发明所述的和要求专利保护的食品添加剂及其类似产品，使用本发明所述的血小板集合度实验和低密度脂蛋白胆固醇氧化实验来评价该食品添加剂的效果。 [0064] 适用的食品添加剂的制剂可以包括下述一种或几种成分：葡萄籽提取物、葡萄皮提取物、银杏提取物、越桔提取物、槲皮素和一种酶混合物。可以按照下述的重量比制备该食品添加剂：葡萄籽提取物12％w/w，葡萄皮提取物20％w/w，银杏提取物10％w/w，越桔提取物10％，槲皮素24％w/w和酶混合物24％w/w。 [0065] 根据本发明含有黄酮类物质和酶的适用食品添加剂是PROVEXCVTM。PROVEXCVTM可以从Melaleuca，Inc.，Idaho Falls，Idaho获得。 [0066] PROVEXCVTM每380mg胶囊含有下述组分： [0067] [0068] 根据本发明，制备该添加剂时也可以包括除酶混合物之外的上述全部组分。TM [0069] 每380mg PROVEXCV 胶囊中所用的酶混合物含有如下酶： [0070] [0071] 真菌蛋白酶20053和20054是酸性、中性和碱性蛋白酶的酶混合物。HUT活性是在基于水解变性血红蛋白的FCC HUT测试中测得的一种酶的活性。一个HUT单位被定义为在一分钟内产生一种水解物(hydrosylate)所用酶的量，且该水解物在275nm的吸收率等于一种1.10mg/ml的酪氨酸的0.006N盐酸溶液的吸收率。SAPU活性是在基于水解Hammarstan酪蛋白底物的FCCSAPU测试中测得的SAPU活性。一个SAPU单位被定义为在PHU3和37℃条件下每分钟释放出1微摩尔酪氨酸所需酶的量。PU活性是在基于水解酪蛋白的FCC PU测试中测得的一种酶的活性。一个PU单位被定义为在PH6.0和40℃条件下每小时释放出1微克酪氨酸所需酶的量。关于上述有关酶的更多信息可以从National EnzymeCompany，Forsyth，Missouri，(417)-546-4796的有关酶的技术期刊获得。 [0072] PROVEXCVTM中含有的组分可以从下述来源获得。使用的实际来源以下划线将厂商标出。 [0073] [0074]TM [0075] ProVex Plus 每125mg胶囊含有下述组分： [0076] [0077]TM [0078] 在使用含有除酶混合物以外的PROVEXCV 全部组分的添加剂的Folts模型中的实验，发现这种添加剂在大约20mg/kg或更少剂量下能够有效地消除CFR’s。已经发现在Folts模型中观察到的消除CFR’s所需剂量在将食用黄酮类物质与一种酶结合时还可以进一步减少。将含有等份的两种真菌蛋白酶、一种酸稳定性蛋白酶和菠萝蛋白酶的酶混合物TM加入到含有除酶混合物以外全部PROVEXCV 组分的添加剂当中，可以将消除本发明所用动物模型中CFR’s所需的剂量由大约20mg/kg减少到大约10mg/kg。 [0079] PROVEXCVTM的效率为它可以将本发明动物模型中消除CFR’s所需的剂量由ProVex TM TMPlus 所需的大约30mg/kg减少到PROVEXCV 所需的大约10mg/kg。结果是，本发明食品添加剂的适用剂量是大约30mg/kg或更少。优选的有效剂量是大约20mg/kg或更少。更优选的有效剂量是大约10mg/kg或更少。 [0080] 正是如此，使用具有抗氧化和血小板抑制特性的PROVEXCVTM能够预防发生冠心病、急性栓塞、心肌梗死性死亡和与血小板活性和低密度脂蛋白胆固醇氧化有关的疾病。 [0081] 本发明的另一个实施方案包括一种命名为PROVEXCV2TM的食品添加剂。如同TM TM TMProVex Plus 和PROVEXCV ，PROVEXCV2 可以被用作一种抑制血小板活性或低密度脂蛋白TM 胆固醇氧化的食品添加剂。每1638mg的PROVEXCV2 含有下述组分： [0082] [0083] 本发明所述的食品添加剂，包括PROVEXCV2TM的组分可以从任何供货方获得。例如，可以从上述所列举的厂商获得用于PROVEXCV2TM的全部组分。另外，该组分可以从未经发酵过的来源获得。例如，未发酵过的葡萄籽提取物和未发酵过的葡萄皮提取物可以用作本发明所述的食品添加剂的组分。这种未发酵过的组分可以从任何供货方如Polyphenolics(Canandaigua，NY)获得。 [0084] 简而言之，在制备葡萄酒的过程中使用了发酵方法。如果该组分是来源于生产葡萄酒的厂商，那么该组分可是发酵过的组分，例如，发酵过的组分，如发酵过的葡萄籽提取物或发酵过的葡萄皮提取物，可以是从经过发酵的来源，如葡萄，分离的任何组分。相对而言，未经发酵过的组分可以是从未经发酵的的来源分离获得的任何组分。这种未发酵过的组分与发酵过的组分相比是更有效的黄酮类物质来源。例如，未发酵过的葡萄籽提取物或未发酵过的葡萄皮提取物比发酵过的葡萄籽提取物或发酵过的葡萄皮提取物能够更有效地抑制血小板活性或低密度脂蛋白胆固醇氧化。 [0085] 应当指出，ProVex PlusTM、PROVEXCVTM和PROVEXCV2TM中的每一组分的百分含量可以改变，只要最终的组合物能够抑制血小板活性或低密度脂蛋白胆固醇氧化。例如，银杏提取物的百分含量可以增加到大于10％。 [0086] 另一方面，本发明提供了一种抑制哺乳动物体内血小板活性或低密度脂蛋白胆固醇氧化的方法，该方法是通过给药一种含有能有效减少血小板活性或低密度脂蛋白胆固醇氧化或者抑制二者的至少一种黄酮类物质来源和一种酶的食品添加剂。 [0087] 本发明的另一方面，提供了一种在哺乳动物中治疗与血小板活性或低密度脂蛋白胆固醇氧化有关的疾病的方法。该方法包括给药一种含有至少一种黄酮类物质来源和一种酶的食品添加剂的步骤，该添加剂能在大约30mg/kg或更小剂量有效减少血小板活性和低密度脂蛋白胆固醇氧化。 [0088] 为了实施所述方法，对哺乳动物通过一种可接受的给药方法给药一定剂量的本发明所述的食品添加剂。该剂量可以根据情况确定为按小时、天、周或其部分阶段给药。在给药食品添加剂后，可以对该哺乳动物的血小板活性和低密度脂蛋白胆固醇氧化程度进行评价。可以将其血小板活性和低密度脂蛋白胆固醇氧化程度与给药该食品添加剂之前的程度加以比较。 [0089] 本发明另一方面，提供了一种含有能有效降低血小板活性和低密度脂蛋白胆固醇氧化的食品添加剂的产品。该产品的包装材料上标示有该食品添加剂适用于在大约30mg/kg或更小剂量能减少哺乳动物体内血小板活性或低密度脂蛋白胆固醇氧化或二者的标记。在本发明产品的另一个实施方案中，该包装材料上标示有该食品添加剂适用于治疗与血小板活性或低密度脂蛋白胆固醇氧化有关的疾病的标记。 [0090] 可以使用任何普通的包装和印刷方法制备该该产品。 [0091] 参照下述的说明性实施例可以进一步理解本发明，这些实施例纯属举例性的，不应当理解为限制本发明权利要求当中所要求保护的真实范围。 [0092] 实施例 [0093] 实施例1-评价食品添加剂的血小板抑制活性 [0094] 使用Folts，J.，循环杂志(增刊4)，83：3-14(1991)中公开的Folts模型方法建立10只患有冠状动脉狭窄和中层膜损伤的被麻醉的狗模型，以用于进行评价。连续监控整个TM 实验过程当中的血压和冠状动脉血流情况。如图2所示，在给药PROVEXCV 前，10只狗在30分钟的时间段内出现了8±3次因急性血小板血栓形成而表现出与图2中的CFR’s相似的CFR’s。所有表示带状记录图的数据是基于相同水平，即每12个方格表示10分钟。给每一TM 只狗通过胃管给药10mg/kg的PROVEXCV 。如图3所示，在10只狗中，有9只狗在174±24TM TM 分钟内观察到胃饲给药10mg/kg PROVEXCV 可以消除CFR’s。在给药10mg/kg PROVEXCV 3TM 小时后，在30分钟的时间段内第十只狗中出现的CFR’s减少为2个CFR’s。PROVEXCV 中的食用黄酮类物质并没有产生心率和动脉血压的变化。 [0095] 在Folts模型中的评价提示，由阿司匹林抑制的血小板活性在静脉内以0.2μg/kg/分钟给药肾上腺素后可以被再激活，Folts，J.，循环杂志(增刊4)，83：3-14(1991)。对TM于给药10mg/kg PROVEXCV 的而消除了CFR’s的8只狗，静脉内以0.2μg/kg/分钟给药肾上腺素15分钟。图4的右边显示，静脉内在以0.2μg/kg/分钟给药肾上腺素15分钟后，TM 所有8只狗中因胃饲给药10mg/kg PROVEXCV 消除的CFR’s没有再出现。 [0096] 使用本文所述的全血集合度方法确定全部10只狗的体外血小板活性。在给药TM10mg/kg PROVEXCV 之前和之后采集每一只狗的血样并进行检测。当使用胶原蛋白激活血TM 小板聚集时，在给药10mg/kg PROVEXCV 的所有10只狗的体外全血血小板聚集降低了40％TM ±9％。不象图5中所示的阿司匹林，因肾上腺素而引起的血小板聚集增加在PROVEXCV 实验中没有出现。 [0097] 实施例2-评价食品添加剂对低密度脂蛋白胆固醇氧化的影响 [0098] 如上所述，当将低密度脂蛋白胆固醇暴露于氧化条件下时，通常通过观察一定时TM间内234nm处(Abs234nm)的吸收率来测定低密度脂蛋白胆固醇的氧化。测定PROVEXCV 和其它物质的抗氧化效率。 [0099] 从自愿者人体的血样中制备低密度脂蛋白胆固醇。然后将分离的低密度脂蛋白胆TM TM固醇与一种缓冲液、维生素E、ProVex Plus (图6中的“orig”)或PROVEXCV (图6中的TM TM “Curr”)混合。将ProVex Plus 和PROVEXCV 的实验溶液制备成0.5和1.0mg/ml的最终TM TM 浓度。选择的ProVex Plus 和PROVEXCV 的浓度是基于可接受的血液吸收模型而估计的食品添加剂的预期血浓度水平。向每一份样本中加入测定量的铜离子。所使用的维生素E的量相当于以400IU的维生素E给人体给药而预期的血中含量。 [0100] 混合之后，监测一定时间内每种溶液的Abs234nm。如图6所示，将低密度脂蛋白胆固TM TM醇与0.5mg/L或1.0mg/L的ProVex Plus 或PROVEXCV 一起孵育，其对低密度脂蛋白胆固醇氧化的防止作用比5.3IU/L的公知抗氧化剂维生素E观察到的作用更长。 [0101] 如图7所示，低密度脂蛋白胆固醇在加入铜离子后的45分钟才表现出可观的氧化作用。上述浓度的维生素E可以防止低密度脂蛋白胆固醇进行氧化的时间达大约95分TM钟。1.0mg/L的ProVex Plus 防止低密度脂蛋白胆固醇的氧化超过100分钟。最后，在这TM 些实验条件下，1.0mg/L的PROVEXCV 防止低密度脂蛋白胆固醇氧化超过150分钟。因此，TM TM ProVex Plus 和PROVEXCV 是比维生素E更好的抗氧化剂。 [0102] 实施例3-对PROVEXCV2TM的评价 [0103] 使用Folts模型评价狗体内PROVEXCV2TM对血小板活性的作用，并用全血血小板集合度实验评价其体外的作用。简言之，将10只具有两种性别的mongrel成年狗麻醉，在第5肋间打开胸腔。将左侧弯曲的冠状动脉切开，并在动脉周围设置一个电磁流量探针，以测定冠状动脉的血流量。在该流量探针的末端，用一种特定的外科钳夹该动脉3次以造成内膜和中层膜的损伤。用一个合适内径的塑料环置于动脉外环以形成70％的动脉内径狭窄。 [0104] 在CFR’s出现过程中，采集血样用于体外全血血小板集合度测试。在监测CFR’s的TM持续形成过程20分钟之后，通过胃管给药15mg/kg的PROVEXCV2 。监测CFR’s 3小时。当CFR’s消失后，抽取第二份血样以重复体外血小板聚集实验。然后输注肾上腺素(0.2μg/kg/分钟)20分钟以观察CFR’s是否再出现。 [0105] 患有冠状动脉狭窄和内膜损伤的10只狗由于急性血小板血栓形成，以每30分钟TM7±3的频率出现了CFR’s。通过胃管给药15mg/kg的PROVEXCV2 后，CFR’s消失了164±29分钟。静脉输注肾上腺素(0.2μg/kg/分钟给药20分钟)不会使任何狗内再出现CFR’s。 但是，在5-10mg/kg的阿斯匹林消除CFR’s后输注肾上腺素会导致50-60％的实验狗再出TM 现CFR’s。因此，PROVEXCV2 似乎比阿斯匹林表现出更强的血小板抑制活性。 [0106] 使用全血血小板集合度实验来评价在给药PROVEXCV2TM前和后所采集的全血血样TM中血小板的活性。在给药PROVEXCV2 后，由ADP(20微摩尔/毫升)引起的血小板聚集降TM 低了42±10％(P＜0.03)。另外，在PROVEXCV2 给药后，由肾上腺素和ADP结合引起的血小板聚集降低了32±11％(P＜0.05)。 [0107] 使用全血血小板集合度实验，也在体外评价了PROVEXCV2TM在人体内对血小板活性的影响。具体讲，使12名年龄在22-50岁的健康志愿者(8个男性，4个女性)充实体力。在研究之前的1周和研究过程中，受试者均戒除茶、酒精饮料、葡萄产品、黄酮类物质和维生素添加剂，以及包括阿斯匹林在内的所有医药制剂。素食者从本实验中排除。 [0108] 在实验的第1天上午8点和中午12点之间，采集每一位空腹志愿者的18毫升静脉血样用于体外全血血小板集合度测试。然后，让每一位志愿者根据其体重服用5-7个胶TM囊(大约20mg/kg/天)的PROVEXCV2 ，共服用7-14天。7-14天之后，每一位志愿者空腹TM 回到实验室，但是服用当天剂量的PROVEXCV2 ，采集第2次血样。此血样在最后一次剂量TM 的PROVEXCV2 后大约2-4小时之后采集。 [0109] 简言之，将18毫升的全血抽取到装有2毫升3.8％的柠檬酸钠作为抗凝剂的注射器中。马上用等量的不含防腐剂的盐水稀释血液。将1毫升的稀释血液加入到带有硅化搅拌棒的小杯当中，并加热至37℃保持5分钟。向小杯中放入一个电极以测量电阻的变化，它与血小板聚集成比例。一旦记录了基准的血小板活性，便向该预热的血样中加入大剂量的胶原蛋白(12.5微克)，并置于集合度计中以获取最大的血小板聚集反应。跟踪由血小板聚集产生的电阻变化7分钟。使用次高剂量的胶原蛋白(0.5微克/毫升)、12-肉豆蔻酸13-乙酸佛波醇酯(PMA)(0.5nmol/ml)，和ADP(20微摩尔/毫升)作为血小板激动剂。另外在用肾上腺素(0.5微克/毫升)孵育1分钟的1毫升血样中也使用ADP(20微摩尔/毫升)作为激动剂以聚集血小板。这种聚集反应在对照样本中重复检测两次，并与每天服用TM PROVEXCV2 7-14天后的反应进行比较。 [0110] 在每天服用PROVEXCV2TM7-14天后采集的血样中，血小板聚集对胶原蛋白(0.5微克/毫升)、ADP(20微摩尔/毫升)和一种佛波醇酯，12-肉豆蔻酸13-乙酸佛波醇酯(PMA 0.5nmol/ml)的反应表现为分别降低51.6±41.1％(P＜0.005)、39.8±41.5％(PTM＜0.005)和17.9±10.0％(P＜0.002)。另外，在每天服用PROVEXCV2 7-14天后采集的血样中，血小板聚集对肾上腺素(0.5微克/毫升)和ADP(20微摩尔/毫升)的结合的反应TM 表现为降低了14.9±8.5％(P＜0.05)。这些结果表明PROVEXCV2 的血小板活性抑制机TM 制可能是通过抑制血小板的蛋白激酶C而起作用，因为在每天给药PROVEXCV2 7-14天后，PMA诱导的血小板聚集减少。 [0111] 除了评价PROVEXCV2TM对血小板活性的作用之外，还要研究PROVEXCV2TM对低密度脂蛋白胆固醇氧化的作用。简言之，从健康空腹的自愿者采集的血样中分离低密度脂蛋白，方法是使用连续超速离心在1.006g/ml的密度离心去除VLDL/乳糜微粒和在1.063g/ml(KBr)从更高密度的HDL和血清蛋白中分离低密度脂蛋白。使用Beckman Optima系统以100,000rpm(＞4,000,000xg)每次离心3小时。使用含有EDTA的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)透析该低密度脂蛋白48小时，其中更换几次不同的缓冲液。然后通过电泳(琼脂凝胶)检测透析的物质表明已经去除了其它的脂蛋白成分和血清蛋白。测定分离的低密度脂蛋白的蛋白浓度，并用含有EDTA的PBS来稀释调节至0.5g/L。然后将低密度脂蛋白溶液按0.7ml的量分成等份装入小的玻璃容器内，并用旋盖拧紧。将小瓶和低密度脂蛋白溶液用氮气冲洗以去除微量氧气，以确保稳定，并在使用之前储存于-80℃下。 [0112] 如上所述使低密度脂蛋白氧化。简言之，用不含EDTA的PBS稀释该低密度脂蛋白，方法是在氧化实验之前，将100微升融化的低密度脂蛋白与900微升的PBS混合。将新制备的CuCl2(最终浓度5微摩尔/L)10微升加入到低密度脂蛋白溶液中，以启动氧化。在30℃234nm处通过分光光度计监测共轭二烯的形成速率，监测5小时，每3分钟读取一次吸收率。该分光光度计带有6个自动样本存放处，可以在一次分析中提供最多6个样本的分TM 析。在使用体外实验直接混合方法测试PROVEXCV2 的活性时，用低密度脂蛋白单独与PBS和CuCl2作为对照。 [0113] 低密度脂蛋白的氧化时间过程表现出3个连续阶段：第一是延迟期，其中几乎没有任何共轭二烯形成，然后是旺盛期，其中共轭二烯的形成快速增加，最后是分解期。延迟期定义为CuCl2的加入和旺盛期开始之间的时间段，它被认为是反映了低密度脂蛋白对于氧化作用的敏感性。 [0114] 低密度脂蛋白胆固醇样本中共轭二烯的产生速率表示在图8中。将天然的低密TM度脂蛋白胆固醇与等量的已经与维生素E(5.3mg/L)或PROVEXCV2 (1.0mg/L)孵育的低密度脂蛋白胆固醇进行比较。在氧化开始之前，延迟时间是通过维生素E来延迟，而通TM 过PROVEXCV2 可延迟至明显的较强程度。该结果表明当暴露于铜离子强氧化条件下时，TM PROVEXCV2 是一种比维生素E更强的抗氧化剂。 [0115] 本发明的其它方面、优点和变化描述在下述的权利要求书中。 |
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