包含天冬氨酸蛋白酶的液体组合物

本发明涉及包含天冬氨酸蛋白酶的液体组合物。

众所周知，乳酪(cheese)的制备涉及天冬氨酸蛋白酶的使用。天冬 氨酸蛋白酶引起乳(milk)凝结，得到固体凝乳(curd)，该固体凝乳被 进一步加工为乳酪。

天冬氨酸蛋白酶可以从动物中回收，例如从牛、骆驼和海豹的胃中回 收。它们也可以由微生物(例如Rhizomucor，Cryphonectria)或宿主菌株 (例如Aspergillus或Kluyveromyces)生产。

在乳酪制造工业中，通常使用包含天冬氨酸蛋白酶的液体组合物。这 类液体组合物典型地含有某些添加剂，以获得想要的稳定性。人们能够区 别酶稳定性和微生物稳定性。酶稳定性是酶活性降低速率的度量。微生物 稳定性是组合物中微生物能够增殖和生长的度量。

组合物的微生物特征可以使用明确定义的标准步骤通过标准平板计 数、酵母数和霉菌数来表达。例如，标准平板计数可以是≤1ml中100 个，酵母计数可以是≤1ml中10个，霉菌计数可以是≤1ml中10个。因 为在使用前组合物通常被储存，所以期望平板计数、酵母数和霉菌数在延 长的周期中(例如在至少3个月的周期中)维持低于某界限值(例如上述 值)。

使用山梨酸盐或苯甲酸盐作为防腐剂来获得想要的微生物稳定性是公 知的。也可以使用对羟基苯甲酸酯(对羟基苯甲酸的烷基酯)。

例如，US-A-3763010公开了包含天冬氨酸蛋白酶、山梨酸钾和苯甲酸 钠的组合物。WO-A-9015865和WO-A-9529999公开了在含天冬氨酸蛋白 酶的组合物中使用苯甲酸钠。包含天冬氨酸蛋白酶和3g/l到5g/l之间 (0.02mol/l和0.035mol/l之间)苯甲酸钠的商业组合物是已知的。

然而，人们期望有不含或含少量山梨酸盐、苯甲酸盐和对羟基苯甲酸 酯的产品。

本发明的目的是提供下述组合物，所述组合物在无山梨酸盐、苯甲酸 盐和对羟基苯甲酸酯时具有良好的微生物稳定性。

本发明提供了具有惊人高的微生物稳定性的组合物，甚至在没有上述 这些化合物时或这些化合物以低于现有技术中已知的量存在时也是如此。 另外，该组合物可具有惊人高的酶稳定性。根据本发明的组合物可具有比 预期的更长的保质期。

根据本发明的第一方面，提供了包含(i)天冬氨酸蛋白酶；和(ii)无机盐 和/或多元醇的液体组合物，在该组合物中：

山梨酸盐、苯甲酸盐和对羟基苯甲酸烷基酯的总浓度小于0.010 mol/l；

标准平板计数≤1ml中100个；

酵母计数≤1ml中10个；和

霉菌计数≤1ml中10个。

应当理解山梨酸以及山梨酸的盐对山梨酸盐浓度作出贡献。苯甲酸以 及苯甲酸的盐对苯甲酸盐浓度作出贡献。对羟基苯甲酸烷基酯可以是盐的 形式，也可以不是盐的形式。因此，本文使用山梨酸盐、苯甲酸盐和对羟 基苯甲酸烷基酯的总浓度是指组合物中山梨酸、山梨酸盐、苯甲酸、苯甲 酸盐、对羟基苯甲酸烷基酯和对羟基苯甲酸烷基酯的盐的总浓度。山梨酸 盐的例子是山梨酸钠、山梨酸钾和山梨酸钙。苯甲酸盐的例子是苯甲酸 钠、苯甲酸钾和苯甲酸钙。对羟基苯甲酸烷基酯的例子是对羟基苯甲酸甲 酯、对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯。对羟基苯甲酸烷基酯的盐的 例子是对羟基苯甲酸甲酯的钠盐、对羟基苯甲酸乙酯的钠盐和对羟基苯甲 酸丙酯的钠盐。

本文使用的标准平板计数根据ISO 4833：1991(E)(微生物学—微生物 计数的综合指导-30℃下的菌落计数技术)测定。

酵母计数根据ISO 7954：1987(E)(微生物学—酵母和霉菌计数的综合 指导-25℃下的菌落计数技术)测定。

霉菌计数根据ISO 7954：1987(E)(微生物学—酵母和霉菌计数的综合 指导-25℃下的菌落计数技术)测定。

根据本发明的第二方面，提供了包含天冬氨酸蛋白酶和下述化合物的 液体组合物，所述化合物选自甲酸盐、乙酸盐、乳酸盐、丙酸盐、苹果酸 盐或富马酸盐。这些化合物可对微生物稳定性作出贡献。应当理解这些化 合物是相应的有机酸(甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、苹果酸和富马酸)的阴 离子，这些化合物可以作为有机酸或其盐被补充进组合物中。盐可以是例 如钾盐、钠盐或钙盐。

有机酸和/或其盐可以以任何合适的浓度使用。在一个优选的实施方案 中，组合物中甲酸盐、乙酸盐、乳酸盐、丙酸盐、苹果酸盐或富马酸盐或 其组合的浓度为至少0.02mol/l，例如至少0.05mol/l，例如至少0.1 mol/l，例如至少0.2mol/l。应当理解可能这些化合物中至少一种以本文定 义的优选的浓度存在。还可能这些化合物中两种或更多种的组合以本文定 义的优选的浓度存在。如果使用组合，则浓度是指这些化合物的总浓度。 浓度没有特定的上限。甲酸盐、乙酸盐、乳酸盐、丙酸盐、苹果酸盐或富 马酸盐或其组合的浓度可以是小于2mol/l，例如小于1mol/l。

在一个优选的实施方案中，组合物包含乙酸盐。优选地，组合物包含 至少0.02mol/l的乙酸盐，例如至少0.05mol/l，例如至少0.1mol/l，例如 至少0.2mol/l的乙酸盐。乙酸盐的浓度没有特定的上限。组合物可例如包 含少于2mol/l、例如少于1mol/l的乙酸盐。

根据本发明的第三方面，提供了包含(i)天冬氨酸蛋白酶、(ii)无机盐和 (iii)多元醇的液体组合物。

根据本发明的第四方面，提供了包含天冬氨酸蛋白酶和无机盐的液体 组合物，在该组合物中，无机盐的浓度小于180g/l，优选地小于170g/l， 更优选地小于160g/l。应当理解组合物可含有一种或多种无机盐。无机盐 浓度的优选的上限值是指组合物中无机盐的总浓度。

根据本发明的第五方面，提供了包含天冬氨酸蛋白酶和多元醇的组合 物，其中组合物具有小于0.83、例如小于0.80的水分活度(water activity)。

根据本发明的第六方面，提供了包含天冬氨酸蛋白酶和甘油的液体组 合物。

根据本发明的第七方面，提供了包含天冬氨酸蛋白酶的液体组合物， 其中该组合物具有至少0.80、例如至少0.85的水分活度。

根据本发明的第八方面，提供了包含天冬氨酸蛋白酶的组合物，其中 该组合物具有4和7之间的pH。

根据本发明的第九方面，提供了用于制备包含天冬氨酸蛋白酶的液体 组合物的方法，该方法包括：

(a)提供发酵液，所述发酵液含有(i)生产蛋白酶的微生物和(ii)含有蛋白 酶的上清液；

(b)通过固液分离，将上清液与发酵液分离；

(c)纯化经分离的上清液，获得经纯化的溶液；

(d)任选地向经纯化的溶液中添加一种或多种添加剂，其中所述一种或 多种添加剂的至少一种是无机盐、多元醇或选自甲酸盐、乙酸盐、乳酸 盐、丙酸盐、苹果酸盐或富马酸盐的化合物；和

(e)过滤任选地含有所述一种或多种添加剂的经纯化的溶液。

根据本发明的第十方面，提供了可以通过根据第九方面的方法获得的 组合物。

优选的实施方案将在下文描述，并可适用于本发明的所有方面。还应 当明白本发明还包括本发明的多种方面和/或优选的特征的任何组合。

根据本发明，苯甲酸盐、山梨酸盐或对羟基苯甲酸酯的使用不是必需 的，且苯甲酸盐、山梨酸盐或对羟基苯甲酸盐可以以更少的量使用。在一 个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含少于0.010mol/l的苯甲酸 盐，优选地少于0.005mol/l、优选地少于0.002mol/l、优选地少于0.001 mol/l、优选地少于0.0005mol/l、优选地少于0.0001mol/l、优选地少于 0.00005mol/l、优选地少于0.00001mol/l、优选地为不可检测的量。在又 一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物中山梨酸盐、苯甲酸盐和对 羟基苯甲酸烷基酯的总浓度为小于0.010mol/l，优选地小于0.005mol/l， 优选地小于0.002mol/l，优选地小于0.001mol/l，优选地小于0.0005 mol/l，优选地小于0.0001mol/l，优选地小于0.00005mol/l，优选地小于 0.00001mol/l，优选地为不可检测的量。已知苯甲酸盐、山梨酸盐和对羟 基苯甲酸酯可以被用于在发酵后杀死微生物。因此，少量的这些化合物可 能存在于得自这类杀伤步骤的组合物中。

在本发明的另一个实施方案中，根据本发明的组合物中防腐剂的总浓 度为小于0.010mol/l，优选地小于0.005mol/l，优选地小于0.002mol/l， 优选地小于0.001mol/l，优选地小于0.0005mol/l，优选地小于0.0001 mol/l，优选地小于0.00005mol/l，优选地小于0.00001mol/l，优选地为不 可检测的量。术语防腐剂是本领域技术人员充分理解的，在本文中使用是 指抑制微生物生长和/或阻止孢子萌发和/或杀死营养细胞和/或孢子的化合 物。在本发明的上下文中，防腐剂的定义不包含多元醇或无机盐。

优选地，液体组合物是水性组合物，例如水性溶液。本文使用的水性 组合物或水性溶液包括含水(例如至少20重量％的水，例如至少40重量 ％的水)的任何组合物或溶液。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物具有低于0.95的水分 活度，例如低于0.92，例如低于0.9，例如低于0.85，例如低于0.8。本文 使用的水分活度是指在25℃下测量的值。相对低的水分活度可有助于达到 想要的微生物稳定性。可以通过添加无机盐和/或多元醇影响水分活度。水 分活度可以高于0.7，例如高于0.8，例如高于0.83，或高于0.85或高于 0.86。出人意料地发现具有高于这些值的水分活度的组合物可以具有比预 期的更高的微生物稳定性。在一个优选的实施方案中，水分活度在0.85和 0.95之间。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含无机盐。无机盐 可起到降低组合物的水分活度的作用。可使用任何合适的无机盐。无机盐 可以是例如包含下述阳离子和下述阴离子的盐，所述阳离子选自由 (CH3)4N+、NH4+、K+、Na+、Ca2+和Ba2+组成的组，所述阴离子选自由 SO42-、Cl-、Br-、NO3-、ClO4-和SCN-组成的组。优选的无机盐为NaCl、 KCl、Na2SO4或(NH4)2SO4。组合物可含有一种或多种无机盐。

在一个优选的实施方案中，组合物包含至少80g/l的无机盐或无机盐 的组合，优选的至少100g/l，更优选地至少120g/l，更优选地至少140 g/l。提高的盐浓度具有提高组合物水分活度的作用，这可有助于达到想要 的微生物稳定性。应当理解可能至少一种无机盐以本文定义的优选的浓度 存在。还可能无机盐的组合以本文定义的浓度存在。如果使用无机盐的组 合，则浓度是指无机盐的总浓度。在一个优选的实施方案中，组合物包含 至少80g/l的NaCl，优选的至少100g/l，更优选地至少120g/l，更优选地 至少140g/l。

在一个优选的实施方案中，组合物中无机盐的浓度小于200g/l，优选 地小于190g/l，优选地小于180g/l，优选地小于170g/l，例如小于160 g/l。在一个优选的实施方案中，组合物包含少于200g/l、优选地少于190 g/l、优选地少于180g/l、优选地少于170g/l，例如少于160g/l的NaCl。 降低无机盐的浓度可有助于酶稳定性。本发明允许使用相对低浓度的无机 盐，这可有助于达到高微生物稳定性和高酶稳定性的组合。应当理解组合 物可含有一种或多种无机盐。无机盐浓度的优选的上限值是指组合物中无 机盐的总浓度。

在一个优选的实施方案中，组合物包含多元醇。多元醇可起到降低组 合物的水分活度的作用。降低水分活度可有助于达到想要的微生物稳定 性。可使用任何合适的多元醇。多元醇可以是例如乙撑二醇(乙二醇)、 亚丙基二醇(丙二醇)、甘油、赤藻糖醇、木糖醇、甘露醇、山梨醇、肌 醇、半乳糖醇。优选地，多元醇为甘油、山梨醇或丙二醇，更优选地为甘 油或丙二醇。组合物可包含一种或多种多元醇。

在一个优选的实施方案中，组合物包含至少40g/l的多元醇或多元醇 组合，优选地至少80g/l。应当理解可能至少一种多元醇以本文定义的优 选的浓度存在。还可能多元醇的组合以本文定义的浓度存在。如果使用多 元醇的组合，则浓度是指无机盐的总浓度。

在本发明的一个实施方案中，组合物中多元醇的浓度小于300g/l，例 如小于200g/l，例如小于150g/l。然而也可使用更低的浓度，例如小于 100g/l、例如小于50g/l、例如小于10g/l或甚至为0g/l的浓度。上限是指 组合物中多元醇的总浓度。

在一个实施方案中，组合物包含90g/l到120g/l之间的多元醇或多元 醇的组合，优选地为140g/l和180g/l之间的NaCl。

组合物可具有任何合适的pH。在一个优选的实施方案中，组合物具 有小于7的pH，优选地小于6。优选地，pH为至少3，优选地至少4，优 选地至少5。pH可以例如在4.8和5.5之间。

在优选的实施方案中，组合物包含还原剂，优选地为甲硫氨酸。优选 地，组合物包含至少1g/l的甲硫氨酸，优选地至少2g/l，更优选地至少5 g/l，例如小于100g/l，例如小于30g/l。

在一个优选的实施方案中，酶活性为至少100IMCU每ml组合物，优 选地至少200IMCU每ml组合物，优选地至少500IMCU每ml组合物。 酶活性没有特定的上限。酶活性可以是低于5000IMCU每ml组合物，例 如小于2000IMCU每ml，例如小于1000IMCU每ml组合物。IMCU是指 由International Dairy Federation(IDF)，protocol 176：1996定义的国际乳凝结 单位(International Milk Clotting Unit)。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物具有≤1ml中100个 的标准平板计数。优选地，酵母计数≤1ml中10个。优选地，霉菌计数 ≤1ml中10个。

根据本发明的组合物具有比预期的更高的微生物稳定性。在本发明的 一个实施方案中，当组合物在黑暗中4℃的温度下于封闭容器中储存时， 在至少4个月、优选地至少6个月、优选地至少9个月、优选地至少12个 月、优选地至少18个月、优选地至少24个月的周期中，标准平板计数维 持≤1ml中100个，酵母计数维持≤1ml中10个，霉菌计数维持≤1ml 中10个。

在本发明的一个实施方案中，当组合物在黑暗中30℃的温度下于封闭 容器中储存时，在至少4个月、优选地至少6个月、优选地至少9个月、 优选地至少12个月、优选地至少18个月、优选地至少24个月的周期中， 标准平板计数维持≤1ml中100个，酵母计数维持≤1ml中10个，霉菌 计数维持≤1ml中10个。

在本发明的一个实施方案中，当组合物在黑暗中4℃的温度下于封闭 容器中储存时，在至少4个月、优选地至少6个月、优选地至少9个月、 优选地至少12个月、优选地至少18个月、优选地至少24个月的周期中， 酶活性至多降低5％。

在本发明的一个实施方案中，当组合物在黑暗中30℃的温度下于封闭 容器中储存时，在至少4个月、优选地至少6个月、优选地至少9个月、 优选地至少12个月、优选地至少18个月、优选地至少24个月的周期中， 酶活性至多降低5％。

对于这些测试而言可以使用瓶子作为封闭容器，所述瓶子在填充之前 被灭菌，并用螺纹封闭。可以使用具有50ml体积的瓶子，其用20ml待 测试的组合物填充。

组合物可含有任何合适的天冬氨酸蛋白酶。优选地，天冬氨酸蛋白酶 是乳凝结酶(milk clotting enzyme)。乳凝结酶的特征是具有针对κ-酪蛋白中 残基105苯丙氨酸和残基106甲硫氨酸之间的肽键或与该肽键相邻的键的 特异性。

天冬氨酸蛋白酶可以是动物来源的。优选地，天冬氨酸蛋白酶由微生 物生产(由微生物生产的天冬氨酸蛋白酶)。

微生物可以是例如Rhizomucor(例如Rhizomucor miehei或Rhizomucor pussilus)，或Cryphonectria(例如Cryphonectria parasitica)。微生物也 可以选自Aspergillus、Trichoderma、Penicillium、Fusarium、Humicola或 Kluyveromyces的属。这些微生物可以例如被用作宿主菌株。在一个优选的 实施方案中，微生物是Aspergillus niger、Aspergillus nidulans、Aspergillus oryzae、Kluyveromyces lactis或Escherichia coli。

在本发明的一个实施方案中，天冬氨酸蛋白酶是Rhizomucor miehei天 冬氨酸蛋白酶。术语“Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶”包括在 Rhizomucor miehei中同源生产的天冬氨酸蛋白酶。通过发酵制备该酶的一 种方法描述于US-A-3,988,207中。术语“Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白 酶”还包括重组的Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶，例如在用编码 Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶DNA转化的宿主生物(例如不同于 Rhizomucor miehei)中生产的Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶。用于在 宿主生物中生产重组的Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶的一种方法描述 于EP-A-700253中。

在本发明的另一个实施方案中，天冬氨酸蛋白酶是凝乳酶 (chymosin)。凝乳酶可例如从牛、骆驼或海豹的胃中提取。在本发明的一 个优选的实施方案中，凝乳酶由微生物生产，例如通过重组DNA技术在 细菌(例如Escherichia coli)、酵母(例如Kluyveromyces lactis)或丝状 真菌(例如在Aspergillus niger中)中生产。

根据本发明的组合物可以被包装在任何合适的封闭容器中。因此，本 发明还提供了包含根据本发明的组合物的封闭的和/或密封的容器。

根据本发明的组合物可以使用用于制备含天冬氨酸蛋白酶的液体组合 物的方法制备，所述方法包括：

(a)提供发酵液，所述发酵液含有(i)生产蛋白酶的微生物和(ii)含有蛋白 酶的上清液；

(b)通过固液分离，将上清液与发酵液分离；

(c)纯化经分离的上清液，获得经纯化的溶液；

(d)任选地向经纯化的溶液中添加一种或多种添加剂，其中所述一种或 多种添加剂的至少一种是无机盐、多元醇或选自甲酸盐、乙酸盐、乳酸 盐、丙酸盐、苹果酸盐或富马酸盐的化合物；和

(e)过滤任选地含有所述一种或多种添加剂的经纯化的溶液。

步骤(a)可以以任何合适的方式进行，并可包括在适合生产蛋白酶的条 件下培养微生物得到发酵液，所述发酵液包含微生物和含蛋白酶的上清 液。合适的方法例如描述于EP-A-1365019中。

步骤(b)可以以任何合适的方式进行，并优选地包括离心和/或过滤。 步骤(b)包括使用膜压滤器或抛光滤器进行过滤。

步骤(c)可包括任何步骤，所述步骤导致相对于其他组份而言酶浓度的 提高。优选地，步骤(c)包括色谱法或超滤。用于进行色谱法的优选的方法 描述于WO-A-03100048和WO-A-0250253中，其内容通过参考并入本 文。

步骤(d)包括向经纯化的溶液中添加一种或多种添加剂，其中所述一种 或多种添加剂的至少一种是无机盐、多元醇，或选自甲酸盐、乙酸盐、乳 酸盐、丙酸盐、苹果酸盐或富马酸盐的化合物。也可以添加其他添加剂。 优选地，不向经纯化的溶液中添加选自苯甲酸盐、山梨酸盐或对羟基苯甲 酸烷基酯的化合物。

步骤(e)优选地包括抛光过滤或无菌过滤。抛光过滤是本身公知的。步 骤(e)中的抛光过滤起到去除痕量的未溶颗粒的作用，所述未溶颗粒例如细 胞碎片和/或污染的微生物。抛光过滤典型地具有相对小的滤孔半径(微米 范围)和浅的主动过滤层深度(毫米到厘米范围)。

优选地，得自(e)的经过滤的溶液具有以下的特性：标准平板计数≤1 ml中100个；酵母计数≤1ml中10个；霉菌计数≤1ml中10个。

优选地，在设备与经过滤的溶液接触之前，与得自(e)中的经过滤的溶 液接触的设备与蒸汽接触。这避免了污染。

在根据本发明的方法的一个实施方案中，步骤(a)、(b)、(c)、(d)或(e) 中的一个或多个在低于10℃、优选地低于5℃的温度下进行。

在一个优选的实施方案中，得自(e)的经过滤的溶液中山梨酸盐、苯甲 酸盐和对羟基苯甲酸烷基酯的总浓度小于0.010mol/l，优选地小于0.005 mol/l，优选地小于0.002mol/l，优选地小于0.001mol/l，优选地小于 0.0005mol/l，优选地小于0.0001mol/l，优选地小于0.00005mol/l，优选地 小于0.00001mol/l，优选地为不可检测的量。

本发明还提供了根据本发明的组合物在乳酪生产中作为促凝剂的用 途。

本发明还提供了用于制备乳酪的方法，包括(i)用根据本发明的组合物 补充乳，来实现乳的凝固，其中获得了凝乳；和(ii)将所述凝乳加工为乳 酪。

本发明将参考以下的实施例(包括但不仅限于此)阐述。

实施例

实施例1-5

如EP-A-1365019中所述培养Rhizomucor miehei的培养物。在发酵结 束时，冷却发酵液，消灭真菌并使用膜压滤器和抛光过滤将其与液体分 离。随后使用如WO03/100048中所述的色谱法纯化乳凝结蛋白酶。通过添 加NaCl、乙酸钠、甲硫氨酸(10g/l)和任选的苯甲酸钠，和通过调节pH (见表1)配制含有乳凝结蛋白酶的柱洗脱液。特定地选择条件从而避免 污染，所述条件包括对桶(vat)和管道(piping)通入蒸汽。

表1.来自Rhizomucor miehei的乳凝结蛋白酶的配制物。

  exm pH NaCl  (g/l) 乙酸钠(g/l) 水分活 度     初始酶活性 (IMCU)     苯甲酸钠(g/l) 1 5.0 150 30 0.88 616 4.5 2 5.0 150 30 0.88 624 - 3 5.3 165 30 0.86 688 - 4 4.8 165 30 0.86 714 - 5 4.2 165 30 0.86 724 -

使用Thermoconstanter TH-200(Novasina，Axair Ltd，Switzerland)在25 ℃下测定水分活度，并用制造商提供的11、33、53、75、90和98％相对 湿度的6个校准盐校准。

稳定性测试

样品(20ml)在用螺旋盖封闭的瓶中储存于预设为30℃的培养箱内。在 不同的时间间隔(0、1、2、4周，2、8个月)下根据ISO 4833：1991(E) (微生物学—微生物计数的综合指导-30℃下的菌落计数技术)测定标准 平板计数，并根据ISO 7954：1987(E)(微生物学—酵母和霉菌计数的综合 指导-25℃下的菌落计数技术)测定酵母计数和霉菌计数。除这些测定 (其使用不含NaCl的培养基进行)外，也以相同的方式进行下述测定， 但是这些测定使用含5％ NaCl的培养基。

在所有的样品中，对于细菌、酵母和霉菌而言菌落计数<每ml10个， 无论是在含有NaCl或不含NaCl的平板上进行细胞计数。

该稳定性测试显示在所有不含苯甲酸盐的配制物中，当样品在30℃储 存时，在至少8个月的周期内，标准平板计数维持≤1ml中100个；酵母 维持≤1ml中10个；霉菌维持≤1ml中10个。当样品在4℃储存时，在 至少12个月的周期内，标准平板计数维持≤1ml中100个；酵母维持≤1 ml中10个；霉菌维持≤1ml中10个。

攻击测试

对来自Rhizomucor miehei的乳凝结蛋白酶的5种配制物进行攻击测 试，其中接种耐干旱的细菌、酵母和霉菌的选定的微生物。发现所有的配 制物具有对微生物的良好抗性。

在该储存周期中，配制物1、2和3中以IMCU(由International Dairy Federation(IDF)，protocol 176：1996定义的国际乳凝结单位)为单位测定的 乳凝结蛋白酶的酶活性每个月降低小于0.5％。在配制物4和5中降低更 多。

实施例6-9

如实施例1-5中所述生产Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶。产品如 表2中所示配制。初始酶活性为760IMCU/ml。

表2.来自Rhizomucor miehei的乳凝结蛋白酶的配制物。

  Ex pH NaCl(g/l) 乙酸钠(g/l) 苯甲酸钠(g/l) 6 5.4 140 30 4.5 7 5.4 140 30 - 8 5.4 140 - - 9 5.1 200 - -

稳定性测试

样品(50ml)在用螺旋盖封闭的瓶中储存于设置为20℃的培养箱内。在 不同的时间间隔(0、1、2、4周，和从那时起每4周直到8个月)下如实 施例1-5中所述测定标准平板计数。除这些测定(其使用不含NaCl的培养 基进行)外，也以相同的方式进行下述测定，但是这些测定存在使用含10 ％ NaCl的培养基的差异。培养基中不含10％ NaCl的标准平板计数显示从 开始到整个储存周期每ml小于10个菌落形成单位，而对于不含乙酸盐和 苯甲酸盐的配制物8和9而言，在储存2周后达到该水平，然后在整个储 存周期中保持恒定。对于所有的配制物而言，从开始直到储存周期的结 束，培养基中含有10％ NaCl的标准平板计数显示每ml小于10个菌落形 成单位。

该稳定性测试显示乙酸盐给予了良好的微生物稳定性，甚至在无苯甲 酸盐时也是如此。

攻击测试

以约每ml 2E+3个菌落形成单位的浓度，用耐干旱的微生物(嗜盐的 Micrococcus、Torulopsis candida和Hansenula anomala)的混合物接种表2 中给出的Rhizomucor miehei的天冬氨酸蛋白酶的4种配制物。样品在用螺 旋盖封闭的瓶中储存于设置为20℃的培养箱内。发现与不含苯甲酸盐或乙 酸盐的实施例8相比，实施例6 & 7的配制物(含苯甲酸盐或乙酸盐)具 有对微生物的提高的抗性。尽管发现实施例9的配制物具有针对微生物的 良好抗性，但是发现乙酸盐的使用使得能够使用更低的盐浓度，这可改进 酶稳定性。

总而言之，稳定性测试和攻击测试二者均证明了乙酸盐的有效防腐作 用，甚至在无苯甲酸盐时也是如此。

实施例10-11

如实施例1-5中所述生产Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶。产品如 表3中所示配制，包含10g/l的甲硫氨酸。在pH校正和添加多种化合物 后，对配制的产物再次进行抛光过滤。在抛光过滤之前，对接触经过滤的 产品的桶和管道通入蒸汽。然后将经过滤的产品包装在20升密封的鼓形 桶中。

表3.Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶的配制物。

  Ex pH NaCl(g/l) 乙酸钠(g/l) 苯甲酸钠(g/l) 初始酶活性 (IMCU/ml)   10 5.25 149 31 - 762 11 5.20 149 31 - 228

稳定性测试

样品在201的封闭鼓形桶中储存于设定为5℃或20℃的培养箱中。在 该稳定性测试中使用一桶的配制物10和三桶的配制物11。通过标准平板 计数，以规则的时间间隔检查这些样品的微生物稳定性，直到8个月为 止。通过实施例1-5中所述的标准平板计数或酵母和霉菌计数方法测定， 在所有的容器中于5℃和20℃二者下均未检测到细菌、酵母或霉菌的生 长。

不含苯甲酸盐的这些配制物的微生物稳定性在8个月的储存周期中自 始至终都是良好的。

攻击测试

以约每ml 2E+3个菌落形成单位的浓度，用耐干旱的微生物(嗜盐的 Micrococcus、Torulopsis candida和Hansenula anomala)的混合物接种每 种配制物的一个样品(50ml)。这些样品在带有螺旋盖的瓶中储存于设置为 20℃的培养箱中。配制物均显示针对微生物的良好抗性。

稳定性测试和攻击测试均证实含有乙酸盐的不含苯甲酸盐的配制物具 有有效的防腐作用。

实施例12-15

如EP0301670中所述，从经遗传修饰的Kluyveromyces宿主菌株的发 酵过程中获得凝乳酶(chymosin)样品。发酵后将微生物消灭，通过pH2 处理激活凝乳酶，然后通过过滤和透析过滤从发酵液中将其回收。如表4 中所述配制凝乳酶。特定地选择条件从而避免污染，这包括对桶和管道通 入蒸汽。初始酶活性为645IMCU/ml。

表4.由Kluyveromyces lactis生产的凝乳酶的配制物

  Ex pH NaCl(g/l) 丙二醇(g/l) 苯甲酸钠(g/l) 12 5.6 130 - 4.5 13 5.6 130 - - 14 5.6 130 90 4.5 15 5.6 130 90 -

稳定性测试

4种配制物的标准平板计数<每ml 100个菌落形成单位，酵母和霉菌 计数为<每ml 10个菌落形成单位。

攻击测试

以约每ml 2E+3个菌落形成单位的浓度，用耐干旱的微生物(嗜盐的 Micrococcus、Torulopsis candida和Hansenula anomala)的混合物接种样 品(50ml)。将样品在用螺旋盖封闭的瓶中储存于设置为20℃的培养箱 中。

发现与不含苯甲酸盐或丙二醇的实施例13的配制物相比，样品12、 14、15的配制物(含苯甲酸盐或丙二醇)具有对微生物的改进的抗性。

该实验清楚地显示了含有丙二醇的无苯甲酸盐的配制物具有良好的微 生物稳定性和清楚的微生物抗性。

发明内容