진균 감염 또는 뇌수막염 치료를 위한 ＵＰＲ 신호전달 유전자 ＩＲＥ1 및 ＨＸＬ1의 용도

진균 감염 또는 뇌수막염 치료를 위한 ＵＰＲ 신호전달 유전자 ＩＲＥ1 및 ＨＸＬ1의 용도{Use of IRE1 gene and HXL1 gene in UPR signal pathway for treating mycoses or meningoencephalitis}

본 발명은 진균 감염 또는 뇌수막염 치료를 위한 UPR 신호전달 유전자 Ire1및 Hxl1의 용도에 관한 것이다.

UPR(Unfolded protein response) 신호전달경로는 진핵세포에서 소포체 스트레스를 유발하는 다양한 환경 조건에 대항하여 소포체의 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 효모의 UPR 신호전달 경로에서 세포막 Ser/Thr 키나아제 및 엔도리보뉴클라아제인 Ire1은 소포체 스트레스를 감지하고 활성화를 위하여 자기 인산화를 시킨 후, bZIP 전사인자를 코딩하는 HAC1 mRNA의 독특한 인트론을 제거함으로써, 전사인자를 활성화시켜서 소포체 스트레스에 대응하게 한다. 한편, 병원성 진균인 아스퍼질러스 푸미가터스 ( Aspergillus . fumigatus )에서 UPR 신호전달 경로와 관련된 HacA (Homologous to Hac1 transcription factor of S. cerevisiae)가 결실이 된 경우 항진균제에 대한 민감성을 보였다(PLoS Pathogens1, Vol 5, Issue 1, January 2009 참조). 하지만, 병원성 진균인 크립토코쿠스 네오포만스( C.neoformans )에서 UPR에 관련된 Ire1이나 목적 전사인자에 대하여 알려진 바가 없었다.

과거에 진균 감염은 건포상백선, 완선, 아구창 같은 국소적 감염이 많이 발생하였고, 전신적 진균 감염은 드물게 발생했지만, 최근 들어 전체 병원 내 감염에서 네 번째 빈도를 차지할 정도로 흔하게 발생하고 있다. 현재까지 개발된 항진균제는 크게 화학적으로 아졸(azole) 구조를 갖는 항진균제와 아졸 구조를 갖지 않는 항진균제로 분류할 수 있다. 아졸 계열의 항진균제로 케토코나졸(ketoconazole), 플루코나졸(fluconazole), 이트라코나졸(itraconazole), 보리코나졸(voriconazole) 등이 있고, 비-아졸 계열의 항진균제로 테르비나핀(terbinafine),플루사이토신(flucytosine), 암포테리신 B(Amphotericin B), 카스포푼긴(caspofungin) 등이 있다. 아졸 구조를 갖는 케토코나졸, 플루코나졸, 이트라코나졸, 보리코나졸과 알릴아민(allylamines) 계열인 나프티핀, 테르비나핀은 유사한 작용기전을 지니고 있다. 두 계열의 항진균제는 라노스테롤이 진균 세포막의 주성분인 에르고스테롤로 전환되는 과정에 필요한 효소를 억제하는 작용을 나타낸다. 아졸 계열 항진균제는 미세소체 효소를 억제하고, 알릴아민 계열의 항진균제는 스쿠알렌 에폭시데이즈(epoxidase)를 억제하여 위와 같은 효과를 나타낸다. 플루사이토신(5-FC)은 핵산합성을 억제하는 대사길항제로서 진균 RNA의 오부호전달 유발 및 DNA 합성을 비경쟁적으로 길항하여 항진균작용을 나타내며, 폴리엔(Polyenes) 구조를 가진 암포테리신 B는 진균 세포막 내부의 에르고스테롤에 결합하여 세포막의 탈분극을 유발하고, 구멍을 형성하여 세포 내 함유물의 손실을 유발하여 항진균작용을 나타낸다. 에키노칸딘(Echinocandins) 계열의 항진균제인 카스포푼긴은 진균 세포벽 형성을 가역적으로 억제하는 작용을 지니고 있으며, 세포벽에 작용한다는 점에서 위에 언급한 세포막에 작용하는 항진균제와 차이가 있다. 아졸 계열의 약물은 간기능 저하 환자에게 사용 시 간염에 의한 사망을 초래할 수도 있으므로 투여 전에 반드시 간기능 검사가 선행되어야 한다. 플루사이토신은 용량의존적으로 골수 억제 작용, 간독성이 나타나고 소장결장 염이 발생 가능한 것으로 보고되었고, 이런 부작용은 신기능이 저하된 경우 더 증가하므로 환자의 신기능 모니터링이 매우 중요하다. 또한 임산부에서 금기이다. 암포테리신 B의 대표적 독성은 신동맥 수축에 따른 사구체 신독성으로, 용량 의존적이어서 평생 누적 용량이 4~5g 이상일 경우 영구적인 신기능 손실 발생률이 상승한다. 또한, 세뇨관 독성에 의한 칼륨, 마그네슘, 중탄산염의 과도한 소실 및 조혈호르몬 생산 저하 등의 신독성이 일어날 수 있다. 그 외, 급성 반응으로 혈전정맥염, 오한, 떨림, 과호흡 등의 증상이 나타날 수 있다.

이와 같이, 기존에 개발된 항진균제들은 약물의 종류에 따라 각종 부작용을 나타내고 있어, 이러한 부작용은 낮추면서도 항진균 효과는 증진시킬 수 있는 새로운 치료법의 개발이 요구되는바, 본 발명의 발명자는 병원성 진균인 크립토코쿠스 네오포만스( C. neoformans )에서 Ire I 및 이와 관련된 전사인자를 새롭게 동정하여 항균 및 뇌수막염에 효과가 있음을 확인함으로써 발명을 완성하였다.

본 발명은 신규한 Ire1 및 Hxl1( H AC1 and X BP1- L ike gene 1) 단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 제공하여, 새로운 항균제 또는 뇌수막염 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 데 목적이 있다.

또한, 본 발명은 기존의 항균제 또는 뇌수막염 치료제와 병용투여시 상승효과를 가질 수 있는 스크리닝 방법을 제공하는 데 목적이 있다.

또한, 본 발명은 신규한 Ire1 및 Hxl1( H AC1 and X BP1- L ike gene 1) 단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 억제하여 항균 또는 뇌수막염 치료효과가 있는 약학조성물을 제공하는데 목적이 있다.

본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시료"는 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 양 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

유전자의 발현량 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 노던블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRCpress), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))을 이용하여 실시할 수 있다.

RT-PCR 프로토콜에 따라 실시하는 경우에는 우선, 시료를 처리한 세포에서 총 RNA를 분리한 다음, 올리고 dT 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 단일가닥 cDNA를 제조한다. 이어, 단일가닥 cDNA를 주형으로 이용하고, 유전자-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 유전자-특이적 프라이머 세트는 하기 표 2에서 열거 되어 있다. 그런 다음, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 유전자의 발현량 변화를 측정한다.

단백질의 양의 변화는 당업계에 공지된 다양한 면역분석 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 그리고 샌드위치 분석을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, ET Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, JM ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C ¹⁴ , I ¹²⁵ , P ³² 및 S ³⁵ )로 표지된 단백질-특이 항체가 이용될 수 있다. 본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 시료가 처리된 세포로부터 추출물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계 (ⅱ) 일차항체로서의 Ire1 혹은 단백질-특이 항체와 상기 세포 추출물을 반응시키는 단계 (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다. 상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시 퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), TMB(3,3,5,5-tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]) 및 o-페닐렌디아민(OPD)과 같은 기질이 이용될 수 있다. 상기 ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드 및 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명의 항진균용 의약 조성물 또는 항진균 복합 제제는 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 항진균용 의약 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 의약 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, MackPublishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 저해제는 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 안티센스올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNAi, miRNA일 경우 0.01ng/kg~10g/kg의 용량으로 투여할 수 있다.

본 발명에 있어서, 그 대상은 인간, 오랑우탄, 침팬지, 마우스, 랫트, 개, 소, 닭, 돼지, 염소, 양 등을 포함하나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 핵산의 길이는 6내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기이다. 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55(1995)). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-Me 피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호 참조). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 한 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 용어 "siRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(참조: WO00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. siRNA는 식물, 벌레, 초파리 및 기생충에서 처음으로 발견되었으나, 최근에 siRNA를 개발/이용하여 포유류 세포 연구에 응용되었다(8-10). 본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한, 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기이다. siRNA 말단 구조는 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다. 본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 in vitro 또는 in vivo에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.

한편, 본 발명에서 용어 ""shRNA(small hairpin RNA)""는 목적유전자 siRNA 염기서열의 sense와 상보적인 nonsense 사이에 3-10개의 염기 linker를 연결하는 올리고 DNA를 합성한 후 프라스미드 벡터에 클로닝하거나 또는 shRNA를 레트로바이러스인 렌티바이러스(lentivirus) 및 아데노바이러스(adenovirus)에 삽입하여 발현시키면 loop가 있는 헤어핀 구조의 shRNA (short hairpin RNA)가 만들어지고 세포 내의 Dicer에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타내는 것을 말한다. 상기 shRNA는 siRNA에 비해 비교적 장기간 RNAi 효과를 나타낸다.

일 구체예에서, 본 발명은 (a) 서열번호 1 로 표시되는 Hxl1 단백질 또는 서열번호 3으로 표시되는 Ire1 단백질를 포함하는 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계 (b) 상기 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 단계 및 (c) 상기 Hxl1 단백질의 양 또는 활성이 감소조절(down regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 항균제임을 판별하는 단계를 포함하는 항균제 스크리닝 방법을 제공한다. 또한, 일 구체예에서, 본 발명은 (a) 서열번호 2로 표시되는 HXL1 유전자 또는 서열번호 4로 표시되는 IRE1 유전자를 포함하는 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계 (b) 상기 유전자의 발현량을 측정하는 단계 및 (c) 상기 유전자의 발현량이 감소조절(down-regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 항균제임을 판별하는 단계를 포함하는 항균제 스크리닝 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 (a) 서열번호 1로 표시되는 Hxl1 단백질 또는 서열번호 3으로 표시되는 Ire1 단백질을 포함하는 세포에 항균제를 접촉시키고, 상기 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 제 1 측정 단계 (b) 서열번호 1로 표시되는 Hxl1 단백질 또는 서열번호 3으로 표시되는 Ire1 단백질을 포함하는 세포에 분석할 시료 및 상기 항균제를 접촉시키고, 상기 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 제 2 측정 단계 및 (c) 제 1 및 제 2 측정 단계의 측정값을 비교하여, 제 2 측정 단계의 측정값이 제 1 측정 단계의 측정값보다 감소조절(down-regulation)될 때, 상기 시료가 병용 투여용 항균제임을 판별하는 병용 투여용 항균제 스크리닝 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 (a) 서열번호 2로 표시되는 HXL1 유전자 또는 서열번호 4로 표시되는 IRE1 유전자를 포함하는 세포에 항균제를 접촉시키고, 상기 유전자의 발현량을 측정하는 제 1 측정 단계 (b) 서열번호 2로 표시되는 HXL1 유전자 또는 서열번호 4로 표시되는 IRE1 유전자를 포함하는 세포에 분석할 시료 및 상기 항균제를 접촉시키고, 상기 유전자의 발현량을 측정하는 제 2 측정 단계 및 (c) 제 1 및 제 2 측정 단계의 측정값을 비교하여, 제 2 측정 단계의 측정값이 제 1 측정 단계의 측정값보다 감소조절(down-regulation)될 때, 상기 시료가 병용 투여용 항균제임을 판별하는 병용 투여용 항균제 스크리닝 방법을 제공한다. 이때, 서열번호 1은 UPR이 유도되어 스플라이싱이 일어난 mRNA가 번역된 단백질의 아미노산 서열이고, 서열번호 2는 UPR이 유도되어 스플라이싱이 일어난 mRNA의 cDNA이다. 또한, 서열번호 3은 Ire1 단백질의 아미노산 서열이고, 서열번호 4는 Ire1 단백질을 코딩하는 유전자 뉴클레오티드 서열이다.

일 구체예에서 본 발명의 스크리닝 방법의 항균제는 아졸계열 또는 비 아졸계열 항균제인 병용투여용 항균제를 스크리닝하는 방법을 제고한다. 이러한 구체예에서, 본 발명의 아졸계열 항균제는 플루코나졸(fluconazole),이트라코나졸(itraconazole), 보리코나졸(voriconazole) 및 케토코나졸(ketoconazole) 중 어느 하나 이상인 병용투여용 항균제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 또한, 이러한 구체예에서, 본 발명의 비 아졸계열 항균제는 암포테라신 B 또는 플루디옥소닐(fludioxonil)인 병용투여용 항균제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

일 구체예에서 본 발명의 스크리닝 방법은 (a) 단계를 35℃ 내지 40℃에서 수행하는 항균제 스크리닝 방법을 제공하고, (a) 단계의 세포는 크립토코쿠스 네오포만스인 항균제 스크리닝 방법을 제공한다.

일 구체예에서, 본 발명은 서열번호 2 또는 4로 표시되는 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 또는 siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 약제학적 조성물을 제공하고, 상기 안티센스 또는 siRNA 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열 88 -617번째 뉴클레오타이드에 상보적인 서열을 가지는 항균용 약제학적 조성물을 제공하며, 상기 안티센스 또는 siRNA 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열 1935-2421번째 뉴클레오타이드에 상보적인 서열을 가지는 항균용 약제학적 조성물을 제공한다.

일 구체예에서, 본 발명은 (a) 서열번호 1 로 표시되는 Hxl1 단백질 또는 서열번호 3으로 표시되는 Ire1 단백질를 포함하는 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계 (b) 상기 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 단계 및 (c) 상기 Hxl1 단백질의 양 또는 활성이 감소조절(down regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 뇌수막염 치료제임을 판별하는 단계를 포함하는 뇌수막염 치료제 스크리닝 방법을 제공한다. 또한, 일 구체예에서, 본 발명은 (a) 서열번호 2로 표시되는 HXL1 유전자 또는 서열번호 4로 표시되는 IRE1 유전자를 포함하는 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계 (b) 상기 유전자의 발현량을 측정하는 단계 및 (c) 상기 유전자의 발현량이 감소조절(down-regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 뇌수막염 치료제임을 판별하는 단계를 포함하는 뇌수막염 치료제 스크리닝 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 (a) 서열번호 1로 표시되는 Hxl1 단백질 또는 서열번호 3으로 표시되는 Ire1 단백질을 포함하는 세포에 뇌수막염 치료제를 접촉시키고, 상기 단백질의 양 또는 활성을측정하는 제 1 측정 단계 (b) 서열번호 1로 표시되는 Hxl1 단백질 또는 서열번호 3으로 표시되는 Ire1 단백질을 포함하는 세포에 분석할 시료 및 상기 뇌수막염 치료제를 접촉시키고, 상기 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 제 2 측정 단계 및 (c) 제 1 및 제 2 측정 단계의 측정값을 비교하여, 제 2 측정 단계의 측정값이 제 1 측정 단계의 측정값보다 감소조절(down-regulation)될 때, 상기 시료가 병용 투여용 뇌수막염 치료제임을 판별하는 병용 투여용 뇌수막염 치료제 스크리닝 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 (a) 서열번호 2로 표시되는 HXL1 유전자 또는 서열번호 4로 표시되는 IRE1 유전자를 포함하는 세포에 뇌수막염 치료제를 접촉시키고, 상기 유전자의 발현량을 측정하는 제 1 측정 단계 (b) 서열번호 2로 표시되는 HXL1 유전자 또는 서열번호 4로 표시되는 IRE1 유전자를 포함하는 세포에 분석할 시료 및 상기 뇌수막염 치료제를 접촉시키고, 상기 유전자의 발현량을 측정하는 제 2 측정 단계 및 (c) 제 1 및 제 2 측정 단계의 측정값을 비교하여, 제 2 측정 단계의 측정값이 제 1 측정 단계의 측정값보다 감소조절(down-regulation)될 때, 상기 시료가 병용 투여용 뇌수막염 치료제임을 판별하는 병용 투여용 뇌수막염 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

일 구체예에서 본 발명의 스크리닝 방법의 뇌수막염 치료제는 아졸계열 또는 비 아졸계열 뇌수막염 치료제인 병용투여용 뇌수막염 치료제를 스크리닝하는 방법을 제고한다. 이러한 구체예에서, 본 발명의 아졸계열 뇌수막염 치료제는 플루코나졸(fluconazole), 이트라코나졸(itraconazole), 보리코나졸(voriconazole) 및 케토코나졸(ketoconazole) 중 어느 하나 이상인 병용투여용 뇌수막염 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 또한, 이러한 구체예에서, 본 발명의 비 아졸계열 뇌수막염 치료제는 암포테라신 B 또는 플루디옥소닐(fludioxonil)인 병용투여용 뇌수막염 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

일 구체예에서 본 발명의 스크리닝 방법은 (a) 단계를 35℃ 내지 40℃에서 수행하는 뇌수막염 치료제 스크리닝 방법을 제공하고, (a) 단계의 세포는 크립토코쿠스 네오포만스인 뇌수막염 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

일 구체예에서, 본 발명은 서열번호 2 또는 4로 표시되는 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 또는 siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 약제학적 조성물을 제공하고, 상기 안티센스 또는 siRNA 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열 88 -617번째 뉴클레오타이드에 상보적인 서열을 가지는 항균용 약제학적 조성물을 제공하며, 상기 안티센스 또는 siRNA 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열 1935-2421번째 뉴클레오타이드에 상보적인 서열을 가지는 항균용 약제학적 조성물을 제공한다.

일 구체예에서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 Hxl1( H AC1 and X BP1 L ike gene 1) 단백질을 제공하고, 이 단백질을 코딩하는 HXL1 유전자을 제공하며, 서열번호 2로 표시되는 HXL1 유전자를 제공하며, 이 유전자가 결실된 숙주를 제공한다.

본 발명의 "항균제"는 세균 및/또는 곰팡이류의 번식을 억제하는 것으로, 무기계 항균제, 유기계 천연물 추출계 항균제, 유기계 지방족 화합물 항균제 및 유기계 방향족 화합물 항균제를 포함한다. 또한, 이에 한정되지 않지만, 무기계 항균제로서는, 차아염소 나트륨으로 대표되는 염소 화합물 과산화 수소로 대표되는 과산화물 붕산, 붕산 나트륨으로 대표되는 붕산 화합물 황산동으로 대표되는 동화합물 황산 아연, 염화 아연으로 대표되는 아연 화합물 유황, 다황산 석회, 수화 유황으로 대표되는 유황계물 산화 칼슘으로 대표되는 칼슘 화합물 티오술파이트 은착염, 질산은으로 대표되는 은화합물 그 밖에, 옥소(沃素), 실리코플루오리드 나트륨 등을 들 수 있고, 유기계 천연물 추출계 항균제로서는, 히노키티올, 맹종죽(孟宗竹) 추출액, 크레오소트유(油) 등을 들 수 있다.

본 발명의 "뇌수막염"은 거미막과 연질막 사이에 존재하는 거미막밑 공간(subarachnoid space)에 염증이 발생하는 다양한 질환으로, 거미막밑공간에 바이러스나 세균이 침투하여 발생하는 수막염이지만, 특정 화학 물질에 의한 염증, 암세포의 뇌척수액공간으로의 파종에 의해 발생하는 것을 말한다.

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본 발명은 신규한 Ire1 및 Hxl1( H AC1 and X BP1 L ike gene 1) 단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 저해시키는 항균 또는 뇌수막염 치료효과를 가지는 효과적인 후보물질을 탐색할 수 있다. 나아가, 기존의 항균제 또는 뇌수막염 치료제와 병용투여시 상승효과를 가질 수 있는 후보물질을 스크리닝 방법을 제공하며, 신규한 Ire1 및 Hxl1( H AC1 and X BP1 L ike gene 1) 단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 억제하여 항균 또는 뇌수막염 치료효과가 있는 약학조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 RT-PCR을 수행하기 위한 프라이머 제조 방법에 대한 개괄적인 그림을 도시하고 있다.
도 2는 RT-PCR을 통한 Ire1 센서 키나아제/리보뉴클레아제(kinase/ribonuclease)의 목적 유전자 동정에 대한 것이다. RT-PCR을 통하여 특이적인 스플라이싱 패턴을 RT-PCR1 과 RT-PCR2을 통해 확인하였다. KAR2와 ACT1은 대조군으로 확인하였다.
도 3은 ire1 Δ 돌연변이 균주에서의 HXL1 유전자의 특이적인 스플라이싱 패턴 변화를 보여주고 있다. UPR 스트레스를 유발하는 DTT와 투니카마이신(tunicamycin)을 처리한 후 RT-PCR2을 통하여 ire1 Δ 돌연변이 균주에서 HXL1 유전자의 특이적인 스플라이싱 패턴 변화가 일어나지 않음을 확인하였고 이는 HXL1 이 Ire1 센서 키나아제/리보뉴클레이즈(kinase/ribonclease)의 목적임을 보여준다.
도 4는 Ire1 센서 키나아제(kinase)의 목적 단백질의 계통수를 보여준다.
[An: Aspergillus nidulans , Af: Aspergillus fumigatus , Tr : Trichoderma reesei , Sc: Saccharomyces cerevisiae , Ca: Candida albicans , Yl: Yarrowia lipolytica , Hs: Homo sapiens , Mm: Mus musculus , Ce: Caenorhabditis elegans , Cn: Cryptococcus neoformans ]
도 5는 UPR 신호전달 경로 유전자 결실이 온도 감수성에 미치는 영향을 보여준다. UPR 신호전달 경로 유전자인 IRE1 또는 HXL1 이 결실이 일어났을 때 온도 감수성이 증가한다는 것을 알 수 있다. 특히, hxl1 Δ 돌연변이 균주가 ire1 Δ 돌연변이 균주보다 더 낮은 온도에서도 온도 감수성이 나타남을 알 수 있다. 실험에 사용된 균주는 다음과 같다 [야생형(WT), ire1 Δ (YSB552), ire1 Δ + IRE1 (YSB1000), hxl1 Δ (YSB723), hxl1 Δ + HXL1 (YSB762), ire1 Δ + HXL1 ^U (YSB1125), ire1 Δ + HXL1 ^S (YSB1127), mpk1Δ (KK3), cna1 Δ (KK1), ras1 Δ (YSB53)]
도 6은 UPR 신호전달 경로 유전자 결실이 항진균제 감수성에 미치는 영향을 보여준다. UPR 신호전달 경로 유전자인 IRE1 또는 HXL1 이 결실이 일어났을 때 항진균제의 감수성이 증가한다는 것을 알아 내었다. 실험에 사용된 약물의 농도는 다음과 같다. [케토코나졸(ketoconazole, 0.1μg/ml) 플루코나졸(fluconazole, 14μg/ml), 이트라코나졸(itraconazole, 0.5μg/ml), 암포테라신 B(amphotericin B, 0.8μg/ml), 플루디옥소닐(fludioxonil, 0.5μg/ml)] 실험에 사용된 균주는 다음과 같다 [야생형(WT), ire1 Δ (YSB552), ire1 Δ + IRE1 (YSB1000), hxl1 Δ (YSB723), hxl1 Δ + HXL1 (YSB762), ire1 Δ + HXL1 ^U (YSB1125), ire1 Δ + HXL1 ^S (YSB1127)]
도 7은 IRE1 유전자 발현을 억제하기 위한 siRNA 설계를 보여준다. ACT1 프로모터와 GAL7 프로모터를 이용하여 IRE1 유전자의 센스와 안티센스 부분 앞 쪽에 삽입시켰으며 센스와 안티센스가 스템 루프(Stem-loop)을 형성할 수 있도록 연결고리(lineker)을 삽입시켜 주었다. 이 연결고리는 참조문헌에서 언급한 바와 같이 GFP 단백질을 이용할 수 있다.
도 8은 HXL1 유전자 발현을 억제하기 위한 siRNA 설계를 보여준다. ACT1 프로모터와 GAL7 프로모터를 이용하여 HXL1 유전자의 센스와 안티센스 부분 앞 쪽에 삽입시켰으며 센스와 안티센스가 스템 루프(Stem-loop)을 형성할 수 있도록 연결고리(lineker)을 삽입시켜 주었다. 이 연결고리는 참조문헌에서 언급한 바와 같이 GFP 단백질을 이용할 수 있다.
도 9는 UPR 신호전달 경로 유전자인 IRE1 결실이 In vivo상의 병원성에 미치는 영향을 보여준다. UPR신호전달 경로 유전자인 IRE1 이 결실 되었을 경우 In vivo상에서 병원성이 약화되었음을 보여준다. [야생형(WT), ire1 Δ (YSB552), ire1 Δ + IRE1 (YSB1000)]
도 10은 UPR 신호전달 경로 유전자인 HXL1 결실이 In vivo상의 병원성에 미치는 영향을 보여준다. UPR신호전달 경로 유전자인 HXL1 이 결실 되었을 경우 In vivo상에서 병원성이 약화되었음을 보여준다. [야생형(WT), hxl1 Δ (YSB723), hxl1 Δ + HXL1 (YSB762)]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

<균주 및 배양 조건>

본 실시예는 하기 표 1에 나타낸 크립토코쿠스 네오포만스를 균주로 사용하였다. 액체 배지로는 이스트 추출물-펩톤-덱스트로스(YPD)을 이용하였고, 30℃에서 210rpm으로 상기 균주들을 배양하였다.

(* 각 NAT - STM # 는 고유 서명 태그(unique signature tag)를 가진 Nat ^r 마커를 의미함)

<스트레스 민감도 테스트 방법>

"Bahn YS, Kojima K, Cox GM, Heitman J (2005) Mol Biol Cell 16: 2285-2300." 및 "Bahn YS, Kojima K, CoxGM, Heitman J (2006) Mol Biol Cell 17: 3122-3135"에서 기술한 방법과 같이, 각 균주를 5ml의 YPD 배지에서 16시간 동안 30℃로 배양하고 세척한 후, dH ₂ O에서 순차적으로 희석하였다(1내지 10 ⁴ 희석도). 그 다음에, 지시된 농도의 항진균제를 포함하는 고체 YPD배지에 스팟팅하였다.

항진균제에 대한 약제 민감도를 확인하기 위하여, 균주들을 폴리엔계 약물인 암포테라신B(Sigma), 아졸계 약물인 플루코나졸(Sigma), 이트라코나졸(Sigma), 및 케토코나졸(Sigma), 및 페닐피롤계 약물인 플루디옥소닐을 포함하는YPD 배지에 스팟팅하였다. 스팟팅 이후에 30℃로 배양하고, 2-4일 동안 관찰한 내용을 사진 촬영하였다.

온도 민감도를 확인하기 위하여 상기와 마찬가지로 각 균주를 5ml의 YPD 배지에서 16시간 동안 30℃로 배양하여 세척한 후, dH ₂ O에서 순차적으로 희석하고 (1내지 10 ⁴ 희석도), 고체 YPD배지에 스팟팅하였다. 스팟팅 이후에 각 균주를 30℃, 35℃ 및 37℃에서 배양하고 2-4일 동안 관찰한 내용을 사진 촬영하였다.

< RNA 추출 및 RT - PCR 방법>

RNA를 추출하기 위하여, 균주들을YPD 배지에서 16시간 동안 30℃로 배양하였다. 그 후 초기 균주를 100 ml의 신선한 YPD배지로 접종하고, 600nm에서의 광학밀도(OD ₆₀₀ )를 0.15로 조정한 후 OD ₆₀₀ 가 0.5에 이를 때까지 30℃에서 배양하였다. 제로-타임 샘플을 얻기 위하여 100ml 중 50ml의 배양액을 표본으로 추출하여 DEPC가 처리된 dH ₂ O로 두 번 세척한 후에 액체 질소에서 급속히 냉동시켰다. 남은 50ml의 배양액에 8 μg/ml의 튜니카마이신(tunicamycin), 또는 20mM의 DTT을 처리하여 1시간 또는 2시간 후에 균주를 수득하였다. 이 균주를 DEPC가 처리된 dH ₂ O로 두 번 세척한 후에 액체 질소에서 급속히 냉동시켰다. 전체 RNA는 RNeasy Mini Kit (Qiagen)을 이용하여 추출하였고 MMLV 리버스 트랜스크립타아제 (Invitrogen)를 이용하여cDNA을 합성하였다. Maxime™™ PCR PreMix (i-Taq) (iNtRON Biotechnology)을 이용하여, RT-PCR(Reverse transcriptase polymerase chain reaction)을 수행하였다.

< UPR 신호전달 유전자의 기능파괴 방법>

유전자의 기능파괴(disruption)를 위하여, 각각의 유전자에 대한 게놈 DNA 구조의 정보를 항원형 A C. neoformans 의 게놈 데이터베이스( http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/cryptococcus_neoformans/MultiHome.html )로부터 수득하였고, ""Davidson RC, et al. (2002) A PCR-based strategy to generate integrative targeting alleles with large regions of homology. Microbiology 148:2607-2615"" 및 ""Kim MS, et al. (2009) An efficient gene-disruption method in Cryptococcus neoformans by double-joint PCR with NAT-split markers. Biochem Biophys Res Commun 390:983-988""에 기재된 방법과 같이, 스플릿 마커(split-marker)와 유전자주입 형질전환(biolistic transformation)을 통해 오버랩 PCR과 더블 조인트 PCR에 의해 C. neoformans 항원 A H99균주에서 IRE1 (CNAG_03670.2) 및 HXL1 (CNAG_06134.2)의 기능을 파괴하였다. 유전자 기능파괴에 필요한 프라이머는 하기 표 2에 나타내었다. 금 마이크로캐리어 비드 (0.6 μm [Bio-Rad])에 오버랩 PCR 또는 더블 조인트 PCR에 의해 생산된 젤-추출된 제거 카세트 (gel-extracted deletion cassettes)를 코팅하고 항원 A H99균주를 형질전환시켰다. 노르세오트리신(Nourseothricin)을 포함하는 YPD 배지에서 성장이 잘 되는 균주를 선택하여 진단용 PCR을 통해 일차적으로 선별한 후, 유전자 특이적 프로브를 이용한 서던 블롯 분석을 통해 유전자 결실의 형질전환 균주를 확인하였다.

^a 프라이머에서 밑줄 친 서열은 이후의 서브클로닝에 대한 제한 효소 부분이고, 볼드체로 표시된 서열은 융합 PCR에 대한 상보 서열이다.

< UPR 신호전달 유전자 결실에 대한 보충균의 제조 방법>

UPR 신호전달 유전자의 결실로 인한 항진균제에 대한 민감성을 확인하기 위하여, 각각의 UPR 신호전달 유전자 결실 형질전환 균주에 대한 보충균을 제조하였다. 그 중 IRE1 보충균주를 제조하기 위하여, 0.78 킬로베이스(kb)의 프로모터, 3.52 킬로베이스(kb)의 ORF (Open Reading Frame), 및 0.53 킬로베이스(kb)의 터미네이터를 포함하는 IRE1 유전자 단편을 제한효소 사이트가 포함된 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 증폭하고, 이것을 pTOP-V2 플라즈미드(Enzynomics 구입)에 서브클로닝한 후 DNA 염기서열을 확인하였다. 염기서열이 일치하는 플라즈미드를 이용하여 4.8 킬로베이스(kb)의 IRE1 유전자 삽입물을 NEO 마커(Neomycin/G418-resistant marker)를 가지고 있는 pJAF12 벡터(James A. Fraser제공, Centre for Infectious Disease Research, School of Chemistry and Molecular Biosciences, The University of Queensland, Brisbane, QLD 4072, Australia)에 서브클로닝하였다. 이 서브클로닝한 플라즈미드를 Mlu1 제한효소로 잘라주고, 이것으로 IRE1 결실 돌연변이 균주를 형질전환시켰다

.

마찬가지로 HXL1 보충균주를 제조하기 위하여, HXL1 유전자의 1 킬로베이스(kb)의 프로모터, 1.8 킬로베이스(kb)의 ORF (Open Reading Frame), 및 0.6 킬로베이스(kb)의 터미네이터 부분을 프라이머(C35/C38)를 이용하여 PCR을 통하여 증폭하고, NEO 마커를 가지고 있는 벡터 pJAFS1(pJAF12의 숨겨진 Sac1 제한효소 부분을 제거한 벡터)에 서브클로닝하였다. 이 서브클로닝한 플라즈미드를 Sac1 제한효소로 잘라주고, 이것으로 HXL1 결실 돌연변이 균주를 형질전환시켰다.

< HXL1 스플라이싱 ( splicing ) 유전자 및 언스플라이싱 ( unsplicing ) 유전자의 IRE1 결실 돌연변이균주로의 형질전환>

IRE1 결실에 따른 항진균제에 대한 민감성이 HXL1 의존성인지 알아보기 위하여, UPR(Unfolded protein response) 유도체인 튜니카마이신(tunicamycin)이 처리되거나 비처리된 세포로부터 분리된 전체 RNA 유래의 cDNA로부터 HXL1 유전자의 스플라이싱(splicing) mRNA와 언스플라이싱(unsplicing) mRNA을 각각 수득하였다. 얻어낸 mRNA을 통하여 DNA을 얻어내고 이것을 HXL1 프로모터와 터미네이터가 있는 pJAFS1-HXL1PT(pJAF12의 숨겨진 SacI 제한효소 부분을 제거한 후 HXL1 프로모터와 터미네이터가 있는 벡터) 플라즈미드에 서브클로닝하여 pJAFS1-HXL1U 플라즈미드와 pJAFS1-HXL1S 플라즈미드를 얻었다. 이 플라즈미드를 Sac1 제한효소로 자른 후, 이것으로 IRE1 결실 돌연변이 균주를 형질전환시켰다.

< 크립토코쿠시스 마우스 모델을 통한 In vivo 상의 HXL1 유전자 및 IRE1 유전자 결실 돌연변이의 병원성 확인>

UPR 신호전달 경로에 중요한 역할을 하는 Ire1 센서 키나아제/리보뉴클레아제(kinase/ribonuclease)및 그의 목적 유전자인 HXL1 이 In vivo상의 병원성에 대하여 어떠한 영향을 알아보기 위하여 4-6주의 A/Jcr mice(Jackson Laboratory, 18-22g)을 이용하였다. 야생형 및 ire1 Δ hxl1 Δ 돌연변이 균주및 회복균 균주를 YPD 배지에 24℃에서 16시간 배양한 후에 PBS(phosphate buffered saline) 버퍼 용액에 세척을 한 후에 ㎖당에 10 ⁶ cell이 되도록 cell수를 맞추어 주었다. 각 야생형, 돌연변이 균주, 및 회복균주당 마우스를 10마리씩 이용하였고 비강안쪽에 10 ⁵ cell 수 만큼 주입시키는 방법으로 감염을 시켰다. 마우스의 생존은 하루에 2번씩, 6주 동안 관찰하였다.

< 실시예 1> IRE1 의 목적 유전자 HXL1 의 동정

UPR 신호전달 경로에서 Ire1 키나아제/ 리보뉴클레아제 의 목적 유전자를 찾기 위해, S. cerevisiae에서 목적으로 알려진 Hac1 전사인자의 bZIP 도메인 서열을 이용하여 항원형 A C. neoformans 게놈(genome) 데이터베이스(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/cryptococcus_neoformans/MultiHome.html)를 통하여 후보 유전자를 탐색하였다. 그 결과 5개의 CNAG_00671.2, CNAG_03670.2, CNAG_07560.2, CNAG_07940.2 및 CNAG_03976.2 후보 유전자를 선별하였다.

Ire1키나아제/ 리보뉴클레아제는 비전통적인 방법으로 목적 mRNA를 특이적 스플라이싱하는 특징이 있다. 따라서, 스플라이싱 양상을 알아보기 위하여 표 2와 같이 RT-PCR 프라이머를 제조하였다. RT-PCR 1 및 2로 나누어 실험을 진행하였다(도 1 참조). UPR 스트레스를 유발하는 DTT와 튜니카마이신을 처리하였을 때 1번과 2번에서 나타나는 스플라이싱 패턴변화를 통해 목적 유전자를 동정하였다(도 2 참조). 이 실험 결과에서 특이적인 스플라이싱이 일어난 CNAG_03670.2이 ire1 Δ 돌연변이 균주에서 스플라이싱이 일어나는지 확인하기 위하여, 위와 동일한 UPR 스트레스를 유발하는 DTT와 튜니카마이신을 처리하고 RT-PCR2을 실행하였다. 그 결과 특이적인 스플라이싱이 야생형에서는 나타났지만 ire1 Δ 돌연변이 균주에서는 나타나지 않았다(도 3 참조) 이 실험 결과를 통해 CNAG_03670.2 mRNA는 Ire1 센서 키나아제/리보뉴클레아제의 목적 유전자라는 것을 확인하였다. 이 실험 결과 밝혀진 CNAG_03670.2이 기존에 알려진 Ire1 센서 키나아제/리보뉴클레아제의 목적 단백질과의 단백질 서열 유사성을 알아보기 위해 계통수 조사(phylogenetic tree)를 실시하였다. 그 결과 기존에 알려진 Ire1 센서 키나아제/리보뉴클레아제의 목적 유전자와의 단백질 서열 유사성이 상당히 상이했다(도 4 참조). 비록 단백질 서열 유사성이 많이 부족하지만 유전자의 이름을 진균에서의 Hac1 전사인자와 인간에서의 Xbp1 전사인자와 특이적인 스플라이싱 유사한 특징을 근거로 HXL1 ( H AC1 and X BP1 L ike gene 1 )이라고 명명하였다.

< 실시예 2> ire1 Δ 돌연변이 균주와 hxl1 Δ 돌연변이 균주의 UPR 신호전달 경로 저해에 따른 온도 감수성 확인

크립토코쿠스 네오포만스의 병원성에 영향을 미치는 병원성 결정인자로는 식균작용(phagocytosis)을 방해하는 캡슐, 항산화 작용을 하는 멜라닌 및 숙주인 인간의 체온에서 자랄 수 있는 능력이다. 그 중 숙주의 온도인 37℃에서 자랄 수 있는 능력은 병원성을 일으키는데 매우 중요한 요소라고 할 수 있다.

이러한 온도 민감성이 UPR 신호전달 경로상에서 어떠한 역할을 하는지 알아보기 위하여, 온도 민감성 실험을 수행하였다. 그 결과 ire1 Δ 돌연변이 균주와 hxl1 Δ 돌연변이 균주 모두가 야생형에 비해 37℃에서 상당히 생장이 저해되었다.

ire1 Δ 돌연변이 균주의 경우, HXL1 스플라이싱(splicing) 유전자를 형질전환하더라도 37℃에서의생장이 야생형과 같이 회복되지 않았다. hxl1 Δ 돌연변이 균주의 경우, 35℃에서도 생장이 야생형에 비해 많이 감소된다는 점에서 보다 높은 온도 민감성을 보였다(도 5 참조).

< 실시예 3> ire1 Δ 돌연변이 균주와 hxl1 Δ 돌연변이 균주의 UPR 신호전달 경로 저해에 따른 종래 항진균제의 작용 확인

크립토코쿠스 네오포만스의 UPR 신호전달 경로 돌연변이 균주들의 항진균제에 대한 약물 감수성이 있는지를 조사하였다. 그 결과 폴리엔계열의 암포테라신 B 에서 야생형에 비하여 ire1 Δ 돌연변이 균주와 hxl1 Δ 돌연변이 균주 모두 암포테라신 B 감수성이 나타났다. ire1 Δ 돌연변이 균주에 HXL1 스플라이싱(splicing) 유전자를 형질전환시킨 균주에서는 야생형 수준으로 회복되었다. ire1 Δ 돌연변이 균주의 암포테라신 B 감수성은 Hxl1에 의존한다는 것을 보여주었다(도 6).

아졸계열의 약물인 플루코나졸(fluconazole), 이트라코나졸(itraconazole), 케토코나졸(ketoconazole)에 대한 약물 민감성 실험을 한 결과 야생형에 비해 상당히 높은 민감성이 나타났다. 특히 플루코나졸에 대해서는 hxl1 Δ 돌연변이 균주가 ire1 Δ 돌연변이 균주보다 10배 이상의 민감성을 보였다. 이러한 사실은 Hxl1의 조절이 Ire1 뿐만 아니라 다른 상위 조절 단백질에 의해 조절된다는 것을 보여준다고 할 수 있다. ire1 Δ 돌연변이 균주에 HXL1 스플라이싱(splicing) 유전자를 형질전환시킨 균주에서는 야생형 수준으로 회복되는 것을 볼 수 있다. 마찬가지로 아졸계열의 약물 감수성 또한 UPR 신호전달 경로에서 Hxl1에 의존한다는 것을 보여준다(도 6).

페닐피롤 계열의 플루디옥소닐(fludioxonil)에 대한 약물 감수성 실험 결과에서도 마찬가지로 ire1 Δ 돌연변이 균주와 hxl1 Δ 돌연변이 균주 모두 감수성을 보였고, 플루코나졸과 마찬가지로 hxl1 Δ 돌연변이가 ire1 Δ 돌연변이 균주에 비해 100배 정도 민감성이 더 나타났다. 이는 위에서 언급한 바와 같이 Hxl1의 조절이 Ire1 뿐만 아니라 다른 상위 조절 단백질에 의해 조절된 다는 것을 보여준다고 할 수 있다.(도 6).

< 실시예 4> IRE1 및 HXL1 유전자에 대한 siRNA 를 이용한 UPR 신호전달 경로 저해에 따른 항균 효과 확인

IRE1 및 HXL1 유전자 발현의 사일런싱 실험을 수행할 목적으로 Silencer ^TM siRNA 칵테일 키트(RNase III; Ambion사)를 이용하여 siRNA를 합성할 수 있다. IRE1 에 대한 dsRNA 합성을 위해 사용된 올리고뉴클레오티드는 아래와 같다:

5'-GATCTCAGATACTATCATTGGTTTTGGATC-3' 및 5'- CAAGTTGTTCGCCGTCGGCGCAAAGGAT-3

또한, HXL1 에 dsRNA 합성을 위해 사용된 올리고뉴클레오티드는 아래와 같다:

5'- CCTATCAAGCGTCCTCGTCAATCTAGT -3' 및 5'- CCTATCAAGCGTCCTCGTCAATCTAGT -3'.

siRNA 염기서열은 IRE1 의 경우 431bp(서열번호 4의 서열 1935-2421번째), HXL1 의 경우 530bp(서열번호 3의 88 -617번째 뉴클레오타이드) 크기 범위에서 선발하였다(Ahn JH, et al: Identification of the genes differentially expressed in human dendritic cell subsets by cDNA subtraction and microarray analysis. Blood 2002, 100(5):1742-1754 및 Yang YHet al: Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation. Nucleic Acids Res 2002, 30(4):e15. 20, 21) 참조). IRE1 및 HXL1 siRNA 설계는 도 7 및 8과 같다. (Hong Liu, et al: RNA interference in the pathogenic fungus Cryptococcus neoformans . Genetics, 2002, 160:463-470 참조) 위와 같이 설계한 siRNA을 이용하여 선형화된 siRNA을 전기천공법(electroporation)을 이용하여 야생형 균주을 형질전환시켰다. 이러한 siRNA을 이용한 IRE1 또는 HXL1 유전자의 발현 억제는 유전자 결실에 따른 항진균제 민감성과 병원성, 온도 민감성과 같은 효과가 나타났다.

< 실시예 5> IRE1 유전자 및 HXL1 유전자 결실에 따른 UPR 신호전달 경로 저해가In vivo 상의 병원성에 미치는 영향 확인

크립토코쿠스 네오포만스의 UPR 신호전달 경로 돌연변이 균주들의 병원성을 마우스모델을 통해 조사하였다. 그 결과 UPR 신호전달 경로 돌연변이인 ire1 Δ 및 hxl1 Δ 돌연변이 균주의 병원성이 야생형에 비해 현저히 저하됨을 확인할 수 있었다. 이는 UPR 신호전달 경로가 크립토코쿠스의 병원성에 중요한 역할을 함을 알 수 있다.(도9 및 10).

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Use of IRE1 gene and HXL1 gene in UPR signal pathway for treating mycoses or meningoencephalitis <130> IPDB39767 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 426 <212> PRT <213> Cryptococcus neoformans <400> 1 Met Ala Thr Ala Val Ala Ser Pro Ser Ser Phe Ser Pro Ile Pro Ser 1 5 10 15 Thr Ser Lys Arg Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Ser Gln Pro Ile Lys 20 25 30 Arg Pro Arg Gln Ser Ser Ser Ser Pro Arg Asp Glu Asp Glu Ala Ala 35 40 45 Ala Ser Asp Glu Asp Leu Asp Glu Glu Ala Arg Ala Lys Leu Ala Arg 50 55 60 Lys Glu Ala Arg Thr Ile Arg Asn Arg Glu Ser Ala Gln Arg Ser Arg 65 70 75 80 Asn Ala Arg Lys Ala His Val Ala Trp Leu Glu Lys Arg Val Val Glu 85 90 95 Leu Glu Ala Glu Asn Arg Ser Leu Lys Gly Glu Pro Pro Thr Ser Thr 100 105 110 Asp Pro Val Pro Ala Ala Ala Thr Pro Glu Pro Thr Ala Gln Pro Leu 115 120 125 Thr Arg Glu Ala Ser Thr Glu His Asp Val Leu Ser Phe Ala Asn Asp 130 135 140 Leu Gly Ile Pro Thr Glu Ile Val Ser Ser Gly Val Ser Leu Ser Asn 145 150 155 160 Val Ala Pro Pro Pro Ser Ser Val Asp Val Asp Val Lys Pro Ile Ile 165 170 175 Glu Pro Ser Pro Leu Thr Leu Ala Ser Pro Ala Val Val Leu Thr Ser 180 185 190 Asn Asp Asp Leu Val Ala Ile Lys Thr Glu Asn Ala Ser Leu Arg Gln 195 200 205 Arg Val Thr Leu Leu Glu Asn Leu Val Lys Gln Val Val Ala Ile Ala 210 215 220 Asn Phe Ser Pro Pro Val Pro Ser Thr Ser Gln Arg Thr Pro Val Asn 225 230 235 240 Gln Phe Ala Ser Leu Pro Ser Gln Ser Ser Leu Asp Trp Ser Ser Thr 245 250 255 Leu Ser Ala Thr Ser Val Leu Pro Ala Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ser 260 265 270 Pro Gly Leu Pro Ala Arg Asn Ser Thr Val Ser Thr Thr Ser Ala Ser 275 280 285 Gln Leu Thr His His Ala Gln Thr Ser Gln Pro Glu Leu Ala Ser Ser 290 295 300 Gln Asn Val Ser Asn Pro Val Ala Cys His Ser Ala Ala Gly Glu Gly 305 310 315 320 Glu Leu Phe Asp Ala Leu Phe Gly Val Gly Val Gly Glu Gly Arg Glu 325 330 335 Ala Asn Gly Ala Gly Ser Glu Val Asn His Arg Leu Gly Glu Thr Gln 340 345 350 Gly Leu Asp Ile Ser Ser Ser Thr Ile Gln Ser Thr Ser Gly His Gly 355 360 365 Val Glu Gly Met Phe Gly Arg Glu Glu Met Gln Ala Ala Val Glu Ser 370 375 380 Trp Asp Glu Ala Met Lys Ala Leu Ile Glu Asp Leu Glu Gly Gly Gln 385 390 395 400 Lys Glu Glu Lys Ala Asp Asp Arg Glu Glu Glu Gln Lys Gly Met Glu 405 410 415 Trp Leu Asn Val Glu Arg Gly Ile Met Ala 420 425 <210> 2 <211> 1281 <212> DNA <213> Cryptococcus neoformans <400> 2 atggctaccg ctgtcgcttc tccttcctca ttctccccta ttccttcgac ttccaagcga 60 tctgccccct ctccttcatc atcgcaacct atcaagcgtc ctcgtcaatc tagttcatca 120 cccagggatg aggacgaggc agccgcaagt gatgaagatc tggatgaaga agcccgtgca 180 aagctggccc gtaaagaagc tagaaccatc cgtaaccgcg aatcagctca aagatcacgt 240 aacgcccgca aagcccatgt tgcatggcta gagaagcgcg tagtcgagtt ggaggccgaa 300 aatcgctccc tgaaaggaga gccaccaacg tcgacggatc cggttccggc tgcggctacc 360 cccgagccca ctgcacagcc tcttacccga gaagcttcca cagagcacga cgtattgtcc 420 ttcgccaacg accttggtat cccaacagaa atcgttagca gtggtgtaag cttgtcaaac 480 gtcgcacctc ctccgtcgag cgtagatgta gacgtcaagc caataatcga gccttcacct 540 ctcacactcg catcgcctgc ggtagtgttg acctcgaatg acgatctagt ggctatcaag 600 acggagaacg caagcctgag acaaagagta acgttgctgg agaacctcgt taagcaggtt 660 gtggccattg ccaatttcag cccgcctgtc ccttctacat ctcaacggac cccagtcaac 720 caatttgcat cattaccttc gcagtcgtct cttgattggt cgtcgacgct ctcggcgaca 780 tccgttttgc ccgccggtct ttcttctacc ctttcgcctg gcctccctgc ccgtaactcc 840 actgtgtcca ccacctcggc ttctcagctt acgcaccatg cccagacctc ccaaccggaa 900 ctggcgtctt cccaaaatgt atcgaacccc gtcgcttgcc actcagcagc gggcgagggg 960 gaattattcg atgcactctt tggcgttggc gttggcgaag gacgagaagc gaatggcgca 1020 ggtagcgagg ttaatcatcg ccttggcgag acacaagggc tggatatctc atcctcgacg 1080 atccaatcaa cctctggaca cggcgtggaa gggatgtttg gaagggagga gatgcaggca 1140 gcggtcgaga gttgggatga ggcgatgaag gcgttaattg aggatcttga gggagggcag 1200 aaggaggaga aggcagatga cagagaggaa gagcagaaag gaatggagtg gttgaatgtt 1260 gagaggggta ttatggcttg a 1281 <210> 3 <211> 1072 <212> PRT <213> Cryptococcus neoformans <400> 3 Met Leu Tyr Phe Leu Phe Leu Leu Pro Leu Leu Ile Ala Tyr Ala Ala 1 5 10 15 Pro Glu Pro Ala Ala Leu Ile Pro Phe Pro His His Thr Leu Arg Ala 20 25 30 Leu Ala Pro Ser Ser Thr Ala Thr Leu Pro Val Gln Ile Asp His Asp 35 40 45 Leu His Pro Leu Val Leu Val Ser Thr Ile Asp Gly Ala Leu His Ala 50 55 60 Leu Glu Arg Ser Thr Gly Lys Glu Lys Trp Val Leu Glu Gly Asp Pro 65 70 75 80 Leu Val Gly Gly Lys Met Lys Gly Gly Val Glu Glu Tyr Ile Val Glu 85 90 95 Pro Leu Ser Gly Ser Leu Tyr Val His Glu Asp Lys Asp Gly Glu Met 100 105 110 Arg Met Arg Lys Leu Pro Leu Ser Val Asp Gln Leu Ile Glu Leu Ser 115 120 125 Pro Phe Thr Phe Pro Glu Ser Pro Thr Gln Ile Phe Thr Gly Ser Lys 130 135 140 His Thr Ser Leu Met Ser Val Asp Leu Arg Thr Gly Glu Gln Val Asp 145 150 155 160 Cys Phe Ser Pro Thr Ala Asn Leu Ser Gln Tyr Asp Gly Ser Ser Val 165 170 175 Cys Asp Asp Leu Asp Asp Leu Glu Arg Arg Gly Ser Ser Gln Arg Asp 180 185 190 Thr Leu Phe Ile Gly Arg Thr Asp Tyr Arg Leu Thr Ile His Ser Pro 195 200 205 Ser Ser Ser Gln Gly Leu Ser Thr Tyr Thr Ser Ala Ala Tyr Pro Ala 210 215 220 Glu Lys Lys Ser Ala Pro Ala Val Gln Glu Ile Ser Tyr Ser Thr Tyr 225 230 235 240 Thr Pro Asn Ala Tyr Asn Arg Pro Leu Ala Glu Ser Trp Val Lys Ala 245 250 255 Gly Val Ala His Gln Ser Trp Gly Pro Asp Asn Glu Glu Pro Arg Ile 260 265 270 Arg Ile Glu Leu Gly Phe Asn Gly Lys Ala Leu Gly Val Lys Pro Gly 275 280 285 Gly Gly Leu Ile Trp Asn Arg Glu Leu Glu His Ile Gly Val Gly Val 290 295 300 Tyr Glu Ile Leu Ile Pro Arg Glu Asn Pro Leu Gly Ala Pro Ile Leu 305 310 315 320 Val Pro Gln Pro Pro Ala His Leu Pro Ala Leu Phe Pro Gly Gln Asn 325 330 335 Asp Pro Arg Ala Phe Asn Ile His Asp Ala Pro Pro Ser Thr Tyr Ile 340 345 350 Ala Thr Leu Pro Glu Cys Leu Thr Leu Pro Ser Ser Asn Thr Thr Ser 355 360 365 Gly Asn Ala Thr Ala Gly Asn Lys Asp Thr Lys Pro Leu His Phe Ala 370 375 380 Leu Ser Ser Ser Ser Tyr Pro Leu Ile Asn Phe Ala Arg Pro Pro Pro 385 390 395 400 Pro Gly His Leu Ser Asp Gly Leu Phe Tyr Asn Ala Asp Asp Gly Asp 405 410 415 Ser Ser Asp Leu Asp His Ser Arg Gly Arg Gly Leu Leu Ser Gly Leu 420 425 430 Ile Asp Pro Pro Arg Glu His Glu Thr Ile Asp Pro Pro Phe Ile Glu 435 440 445 Arg Gln Ala Gly Pro Ala Lys Asn Gly Trp Trp Arg Trp Val Val Ala 450 455 460 Leu Gly Met Leu Leu Ile Leu Leu Gly Gly Val Met Val Arg Phe Gly 465 470 475 480 Arg Gly Lys Gly Ser Val Pro Gly Ser Val Glu Ser Lys Val Asp Glu 485 490 495 Lys Met Pro Leu Leu Ala Val Pro Val His Glu Val Arg Leu Glu Glu 500 505 510 Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Val Leu Pro Val Val Lys Ser Ala 515 520 525 Pro Val Val Arg Ile Gln Glu Pro Ser Ser Thr Pro Glu Asp Ser Pro 530 535 540 Pro Arg Ser Glu Gly Thr Pro Glu Thr His Gln Thr Ala Thr Pro Pro 545 550 555 560 Pro Lys Lys Lys Ser Thr Arg Arg Arg Val Arg Gly Lys Lys Lys Lys 565 570 575 Pro Asp Ala Thr Thr Thr Ala Thr Ala Ala Gly Leu Thr Ala Glu Glu 580 585 590 Arg Asp Gly Glu Asn Glu Asp Glu Asp His Glu Lys Asp Lys Glu Asp 595 600 605 Phe Ser Pro Arg Ala Thr Pro Lys Gly Gly Asn Lys Pro Leu Pro Glu 610 615 620 Leu Pro Arg Glu Leu Ser Ser Thr Asp Leu Leu Asp Tyr Asp Gln Asp 625 630 635 640 Lys Glu Arg Leu Ala Ile Ser Asp Thr Ile Ile Gly Phe Gly Ser His 645 650 655 Gly Thr Val Val Leu Lys Gly Thr Trp Gly Gly Arg Pro Val Ala Val 660 665 670 Lys Arg Leu Leu Ser Asp Phe Thr Arg Leu Ala Ser Gln Glu Val Lys 675 680 685 Leu Leu Gln Ala Ser Asp Asp His Pro Asn Val Ile Arg Tyr Tyr Cys 690 695 700 Gln Glu Lys Arg Asp Asn Phe Leu Tyr Ile Ala Leu Asp Leu Cys Gln 705 710 715 720 Ala Ser Leu Ala Asp Leu Ile Glu Ser Pro Glu Lys His Arg Glu Leu 725 730 735 Ala Asp Gln Leu Asp Arg Lys Arg Ala Leu Met Glu Val Thr Lys Gly 740 745 750 Leu Lys His Leu His Gly Met Lys Ile Ile His Arg Asp Ile Lys Pro 755 760 765 Gln Asn Val Leu Val Ser Gln Thr Pro Ser Gly Leu Arg Ile Leu Val 770 775 780 Ser Asp Phe Gly Leu Ala Arg Arg Leu Gly Gln Asp Gln Ser Ser Phe 785 790 795 800 Ala Pro Thr Ala Asn Asn Leu Ala Gly Ser Leu Gly Trp Arg Ala Pro 805 810 815 Glu Cys Ile Arg Gly Val Val Arg Leu Asn Glu Gly Phe Asp Ala Ser 820 825 830 Ser Ser Val Gly Ser Ser Gly Gly Ile Ala Asn Ala Glu Asp Gly Val 835 840 845 Ala 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