新型毒素-抗毒素系统

申请号 CN200980137525.7 申请日 2009-08-20 公开(公告)号 CN102164950A 公开(公告)日 2011-08-24
申请人 新泽西内科与牙科大学; 发明人 井上正顺; 山口芳广;
摘要 在某些实施方案中公开了抑制细胞功能的方法,其包括诱导在GCU处切割mRNA的mRNA干扰酶的表达。
权利要求

1.一种抑制细胞功能的方法,其包括诱导在GCx处切割mRNA的mRNA干扰酶的表达,其中x为A、C、G或U。
2.权利要求1的方法,其中所述mRNA干扰酶在GCU处切割mRNA。
3.权利要求1的方法,其中所述mRNA干扰酶是MqsR或其同源物。
4.权利要求1的方法,其中所述mRNA干扰酶是不依赖于核糖体的。
5.权利要求1的方法,其中所述诱导能够被YgiT抑制。
6.权利要求1的方法,其包括体外抑制所述mRNA干扰酶。
7.权利要求1的方法,其包括体内抑制所述mRNA干扰酶。
8.权利要求1的方法,其中所述细胞是大肠杆菌。
9.权利要求1的方法,其中细胞是人(Homo sapiens)的细胞。
10.一种抑制细胞功能的方法,其包括诱导MqsR或其同源物的表达。
11.包含编码MqsR或其同源物的基因的质粒。
12.权利要求11的质粒,其中MqsR的表达可用IPTG来诱导。
13.权利要求11的质粒,其中所述质粒是pET28a质粒。
14.权利要求11的质粒,其中所述基因具有根据SEQ ID NO:1的序列。
15.用权利要求11的质粒转化的细胞。
16.权利要求15的细胞,其中所述细胞是大肠杆菌。
17.包含编码YgiT或其同源物的基因的质粒。
18.权利要求17的质粒,其中YgiT的表达可用阿拉伯糖来诱导。
19.权利要求17的质粒,其中所述质粒是pBAD24质粒。
20.权利要求17的质粒,其中所述基因具有根据SEQ ID NO:3的序列。
21.用权利要求17的质粒转化的细胞。
22.权利要求21的细胞,其中所述细胞是大肠杆菌。
23.用权利要求11的质粒和权利要求17的质粒转化的细胞。
24.一种质粒,其包含:
a.编码MqsR或其同源物的基因;和
b.编码YgiT或其同源物的基因。
25.权利要求24的质粒,其中编码MqsR的基因具有根据SEQ IDNO:1的序列,并且编码YgiT的基因具有根据SEQ ID NO:3的序列。
26.用权利要求24的质粒转化的细胞。
27.权利要求26的细胞,其中所述细胞是大肠杆菌。
28.一种抑制MqsR内切核糖核酸酶活性的方法,其包括将MqsR与YgiT接触
29.权利要求28的方法,其包括将MqsR与YgiT一起预温育。
30.YgiT用作MqsR的抗毒素的用途。
31.一种抑制大肠杆菌的细胞裂解的方法,其包括灭活MqsR。
32.权利要求31的方法,其中MqsR被YgiT灭活。
33.一种分离的YgiT多肽,其具有根据SEQ ID NO:4的基酸序列。
34.一种多肽,其具有与权利要求33所述多肽的氨基酸序列有90%同源性的氨基酸序列并且具有抗毒素活性。
35.一种分离的YgiT多核苷酸,其具有根据SEQ ID NO:3的DNA序列。
36.一种多核苷酸,其具有与权利要求35所述多核苷酸的DNA序列有90%同源性的DNA序列并且编码具有抗毒素活性的多肽。
37.包含MqsR和YgiT或其同源物的复合物。
38.包含根据SEQ ID NO:2的多肽和根据SEQ ID NO:4的多肽的复合物。
39.一种生产具有内切核糖核酸酶活性的多肽的方法,其包括:
a.通过将编码MqsR的多核苷酸引入细胞来转化细胞,和
b.培养转化的细胞。
40.一种生产具有抗毒素活性的多肽的方法,其包括:
a.通过将编码YgiT的多核苷酸引入细胞来转化细胞,和
b.培养转化的细胞。
41.切割mRNA的方法,其包括将mRNA干扰酶与mRNA接触,其中所述mRNA干扰酶与MazF不同源。
42.权利要求41的方法,其中所述mRNA在GCx处被切割,其中x为A、C、G或U。
43.权利要求42的方法,其中所述mRNA在GCU处被切割。
44.一种改变细胞功能的方法,其包括操纵MqsR和YgiT中的一个或两者的表达。
45.一种治疗患有疾病的患者的方法,其包括给所述患者施用在GCx处切割mRNA的mRNA干扰酶,其中x为A、C、G或U。
46.权利要求45的方法,其中所述mRNA在GCU处被切割。
47.权利要求45的方法,其中所述疾病是癌症、细菌感染或病毒感染
48.权利要求45的方法,其中所述病毒感染由HIV引起。
49.权利要求45的方法,其中所述病毒感染由具有单链RNA基因组的病毒引起。
50.一种治疗患有疾病的患者的方法,其包括给患者施用编码在GCx处切割mRNA的mRNA干扰酶的基因,其中x为A、C、G或U。
51.权利要求50的方法,其中所述mRNA在GCU处被切割。
52.权利要求50的方法,其中所述疾病是癌症、细菌感染或病毒感染。
53.权利要求50的方法,其中所述病毒感染由HIV引起。
54.权利要求50的方法,其中所述病毒感染由具有单链RNA基因组的病毒引起。

说明书全文

新型毒素-抗毒素系统

[0001] 优先权声明
[0002] 本申请要求2008年8月20日提交的美国临时申请案61/189,639的优先权,其公开内容以其全文通过引用合并入本文。
[0003] 序列表
[0004] 同时提交书面和计算机可读形式的序列表。以计算机可读形式记录的信息与书面序列表相同。
[0005] 发明背景
[0006] 已报导群体感应(quorum sensing)参与生物膜(biofilm)的形成(1-4)。发现MqsR的表达在生物膜中被诱导8倍(5),并且也被群体感应信号自体诱导
物-2(autoinducer-2)(AI-2)诱导,所述自体诱导物-2是由革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌(包括大肠杆菌(E.coli))均产生的非物种特异性信号转导分子(6)。已报导MqsR的诱导激活两组分系统qseBqseC操纵子,已知其在生物膜形成中起着重要作用(6)。因此,有人已提出MqsR(98个基酸残基)是生物膜形成的调节剂,因为其激活控制大肠杆菌中运动性和生物膜形成所必需的flhDC表达的qseB(6)。然而,MqsR的细胞功能仍然不清楚。
[0007] 有趣地,迄今为止所检查的所有自由生存的(free-living)细菌都在其基因组中包含许多自杀或毒素基因(7,8)。许多此类毒素与其关联抗毒素在一个操纵子(称为毒素-抗毒素或TA操纵子)中共转录,并且在细胞中形成稳定的复合物,以使它们的毒性在正常生长条件下被抑制(9-11)。然而,抗毒素的稳定性比它们的关联毒素的稳定性显著更低,这使得引起细胞损伤或生长抑制诱导蛋白酶的任何应激能够改变毒素与抗毒素之间的平衡,从而导致毒素在细胞中释放。
[0008] 迄今为止,在大肠杆菌基因组中已报导了16个(24)TA系统,包括relB-relE(12,13)、chpBI-chpBK(14)、mazE-mazF(15-17)、yefM-yoeB(18,19)、dinJ-yafQ(20,21)、hipB-hipA、hicA-hicB(25,26)、prlF-yhaV(27)和ybaJ-hha(28)。有趣地,所有此类TA操纵子似乎使用相似的调控模式:在抗毒素与其关联毒素之间形成复合物以中和毒素活性和TA复合物自调节(autoregulate)它们的表达的能。已鉴定了一些毒素的细胞靶:CcdB直接与促旋酶A相互作用并且阻断DNA复制(29,30);本身不具有内切核糖核酸酶活性的RelE似乎作为在核糖体A位置处促进mRNA切割的核糖体结合因子(ribosome-associating factor)起作用(12,31,32)。PemK(33)、ChpBK(14)和MazF(34)在毒素当中是独特的,因为它们靶向细胞mRNA,通过作为序列特异性内切核糖核酸酶起作用来将其降解,从而有效地抑制蛋白质合成,继而抑制细胞生长。
[0009] MazF、ChpBK和PemK已被表征为序列特异性内切核糖核酸酶,其分别在ACA、ACY(Y是U、A或G)和UAH(H是C、A或U)序列处切割mRNA。它们与其他已知的内切核糖核酸酶例如RNA酶E、A和T1完全不同,因为这些毒素通过干扰细胞mRNA的功能而发挥蛋白质合成抑制剂的作用。众所周知,小RNA例如micRNA(mRNA干扰性的互补RNA)(37)、miRNA(38)和siRNA(39)干扰特定RNA的功能。此类小RNA结合特定mRNA以抑制其表达。核酶也特异性地作用于它们的靶RNA,并且干扰其功能(40)。因此,MazF、ChpBK和PemK的同源物构成一个新型内切核糖核酸酶家族,其通过在特定序列处切割mRNA而展示新的mRNA干扰机制。因此,它们已被称为″mRNA干扰酶(interferase)″(2)。
[0010] 本文中所述的全部参考文献以其全文通过引用合并入本文,用于所有目的。
[0011] 本发明的目的和概述
[0012] 已在大肠杆菌基因组上发现:MqsR基因与下游基因YgiT共转录。这两个基因似乎作为TA系统起作用,因为它们的大小较小(对于MqsR而言为98个残基,对于YgiT而言为131个残基),并且它们各自的开放阅读框架被单个基对分隔。如本文中公开的,MqsR/YgiT是由毒素MqsR和抗毒素YgiT组成的新型大肠杆菌TA系统。此外,如本文中公开的,MqsR是未展示与MazF有同源性的新型mRNA干扰酶。该毒素在体内和体外于GCU序列处切割RNA,从而参与细胞生理和生物膜形成,如本文中公开的。
[0013] 如本文中公开的,MqsR诱导是高度有毒的,并且其毒性被YgiT的共表达所阻断,当MqsR被诱导时,细胞mRNA被降解。通过使用纯化的MqsR,该体内结果在体外得到证实。将大肠杆菌总RNA与MqsR一起在37℃下共温育30分钟,明确地显示了纯化的MqsR切割RNA。重要地,当其推定的抗毒素YgiT被加入反应混合物时,该内切核糖核酸酶活性被完全抑制。通过使用3.5-kb的噬菌体MS2RNA,我们已鉴定了被该毒素切割的主要切割位点。因此,其似乎是识别三联体序列GCU的高度序列特异性mRNA干扰酶。
[0014] 该序列在一些基因中可能存在较少或过度存在,并且所述基因可能与群体感应和/或生物膜的形成有关联。
[0015] 因此,本发明涉及大肠杆菌中的新型TA系统MqsR YgiT。MqsR的诱导在大肠杆菌中是高度有毒的,并且在体内引起mRNA的降解。纯化的MqsR显示内切核糖核酸酶活性,并且YgiT在体外中和该活性。MqsR在GCU处切割MS2噬菌体RNA。
[0016] 本发明可在原核和真核细胞例如大肠杆菌和哺乳动物细胞中用于单一蛋白质生产。通过使用MqsR/YgiT系统,其还可用于基因疗法以治疗多种人疾病,例如癌症、细菌感染和病毒感染,包括AIDS。本发明可作为RNA限制性酶用于RNA结构研究。
[0017] 在某些实施方案中,本发明涉及抑制细胞功能的方法,其包括诱导在GCx处切割mRNA的mRNA干扰酶的表达,其中x为A、C、G或U。该mRNA干扰酶可以是不依赖于核糖体的,并且优选是MqsR或其同源物。在可选择的实施方案中,诱导能够被抗毒素例如YgiT抑制。所述细胞可以是例如大肠杆菌或人(Homo sapiens)。
[0018] 在本文中公开的实施方案中,mRNA干扰酶的抑制可以是体外或体内抑制。
[0019] 在某些实施方案中,本发明涉及抑制细胞功能的方法,所述方法包括诱导MqsR或其同源物的表达。
[0020] 在某些实施方案中,本发明涉及包含编码MqsR或其同源物的基因的质粒。可以例如用IPTG诱导MqsR的表达,并且其可以是例如pET28a质粒。在可选择的实施方案中,所述基因具有根据SEQ ID NO:1的序列。
[0021] 在某些实施方案中,本发明涉及包含编码YgiT或其同源物的基因的质粒。可以使用例如阿拉伯糖诱导YgiT的表达,并且其可以是例如pBAD24质粒。在可选择的实施方案中,所述基因具有根据SEQ ID NO:3的序列。
[0022] 在某些实施方案中,本发明涉及质粒,其包含:a)编码MqsR或其同源物的基因;和b)编码YgiT或其同源物的基因。在可选择的实施方案中,所述编码MqsR的基因具有根据SEQ ID NO:1的序列,并且所述编码YgiT的基因具有根据SEQ ID NO:3的序列。
[0023] 在某些实施方案中,本发明涉及用本文中公开的一种或多种质粒转化的细胞(例如,大肠杆菌或人)。
[0024] 在某些实施方案中,本发明涉及抑制MqsR内切核糖核酸酶活性的方法,该方法包括将MqsR与YgiT接触。在可选择的实施方案中,所述方法包括将MqsR与YgiT一起预温育。
[0025] 在某些实施方案中,本发明涉及YgiT用作MqsR的抗毒素的用途。
[0026] 在某些实施方案中,本发明涉及抑制大肠杆菌的细胞裂解的方法,该方法包括灭活MqsR。在可选择的实施方案中,MqsR被YgiT灭活。
[0027] 在某些实施方案中,本发明涉及分离的YgiT多肽,所述多肽具有根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在可选择的实施方案中,所述多肽具有与该氨基酸序列有90%同源性的氨基酸序列并且具有抗毒素活性。
[0028] 在某些实施方案中,本发明涉及分离的YgiT多核苷酸,其具有根据SEQ ID NO:3的DNA序列。在可选择的实施方案中,所述多核苷酸具有与该DNA序列有90%同源性的DNA序列并且编码具有抗毒素活性的多肽。
[0029] 在某些实施方案中,本发明涉及包含MqsR和YgiT或其同源物的复合物。在可选择的实施方案中,所述复合物包含根据SEQ ID NO:2的多肽和根据SEQ ID NO:4的多肽。
[0030] 在某些实施方案中,本发明涉及产生具有内切核糖核酸酶活性的多肽的方法,该方法包括:a)通过将编码MqsR的多核苷酸引入细胞来转化所述细胞,和b)培养该转化的细胞。
[0031] 在某些实施方案中,本发明涉及产生具有抗毒素活性的多肽的方法,该方法包括:a)通过将编码YgiT的多核苷酸引入细胞来转化所述细胞,和b)培养该转化的细胞。
[0032] 在某些实施方案中,本发明涉及切割mRNA的方法,该方法包括将mRNA干扰酶与mRNA接触,其中所述mRNA干扰酶与MazF不同源。在可选择的实施方案中,所述mRNA在GCx处被切割,其中x为A、C、G或U。
[0033] 在某些实施方案中,本发明涉及改变细胞功能的方法,其包括操纵MqsR和YgiT中的一个或两者的表达。
[0034] 在某些实施方案中,本发明涉及治疗患有疾病的患者的方法,其包括给所述患者施用在GCx处切割mRNA的mRNA干扰酶,其中x为A、C、G或U。所述疾病可以是例如癌症、细菌感染或病毒感染。病毒感染可以例如由HIV或逆转录病毒引起。
[0035] 在某些实施方案中,本发明涉及治疗患有疾病的患者的方法,其包括给所述患者施用编码在GCx处切割mRNA的mRNA干扰酶的基因,其中其中x为A、C、G或U。所述疾病可以是例如癌症、细菌感染或病毒感染。病毒感染可以是由具有单链RNA基因组的病毒例如HIV或逆转录病毒引起的感染。
[0036] 在某些实施方案中,本发明涉及根据SEQ ID NOs 5-36中任一项的引物。
[0037] 附图概述
[0038] 图1显示大肠杆菌染色体上MqsR-YgiT操纵子的基因图谱。A.箭头标示qseC、qseB、ygiW、ygiV、mqsR、ygiT、ygiS和parC各基因的方向和大小。还显示了MqsRYgiT启动子序列,并且回文序列(1和2)加框标示。弯曲的箭头表示MqsR-YgiT操纵子的转录起始位点。MqsRYgiT启动子的-10和-35区域以粗体显示,并且Shine-Dalgarno序列GGAGG加框标示。将下划线标示的DNA序列用于EMSA测定,如图5中显示的。B.MqsRYgiT操纵子的RT-PCR分析。使用来自在37℃下培养至O.D.600为0.8的大肠杆菌BL21菌株的总RNA,利用逆转录酶合成cDNA。通过使用该cDNA产物作为模板,使用RT-Fw和RT-Rv引物进行PCR。泳道1,100-bp DNA梯度(Genscript);泳道2和4,cDNA和基因组DNA分别用作PCR的模板;以及泳道3,在不使用逆转录酶的情况下的PCR产物。C.MqsRYgiT的转录起始位点。使用图1B的图例中描述的相同RNA和PX-RT引物进行引物延伸分析。G、A、T和C(泳道1至
4)包括使用 2.1- -MqsRYgiT和相同引物的序列梯度(sequence ladder)。
转录起始位点用字符+1标示。
[0039] 图2显示MqsR的诱导对蛋白质合成和DNA合成以及mRNA稳定性的效应。A.将用pET-MqsR和pBAD-YgjT转化的大肠杆菌BL21划线在具有0.1mM IPTG、0.2%阿拉伯糖、0.1mM IPTG+0.2%阿拉伯糖或不具有这两种诱导物的M9(甘油,CAA)板上。将板在37℃下温育18小时。B.具有pBAD-MqsR的大肠杆菌BL21细胞的生长曲线。在0.2%阿拉伯糖存在(实心圆)或不存在(空心圆)的情况下于37℃将细胞培养在M9-甘油液体培养基中。
35
C.MqsR对[ S]甲硫氨酸的体内掺入的效应。在指定的不同时间间隔,将0.4ml的培养物
35
置于装有30μCi的[ S]甲硫氨酸的试管内,然后将混合物在37℃下温育30秒。在温育后,将50μl反应混合物施加于滤纸盘(Whatman 3mm,2.3cm直径)上。如之前所述在10%三氯乙酸溶液中处理滤纸盘(34)。用液体闪烁计数器测定滤纸上的放射性。D.来自C的产物的SDS-PAGE分析。在指定的时间点将400微升反应混合物置于装有100μg/ml非放射性甲硫氨酸的冷却的试管中,通过离心收集细胞。将沉淀溶解在40μlSDS-PAGE上样缓冲液中。将样品在沸浴中温育10分钟。在通过离心除去不溶性材料后,将上清液部分
3
(12.5μl)加载至15%SDS-PAGE凝胶上。E.MqsR对[H]胸苷的体内掺入的效应。将具有pBAD-MqsR的大肠杆菌BL21细胞于37℃下培养。当培养物的O.D.600值达到0.3时,用阿拉伯糖(0.2%)诱导MqsR。在指定的不同时间点,将0.4ml的培养物置于试管中并且与
3
10μCi的[H]胸苷+30μg非放射性胸苷一起温育。然后,将混合物在37℃下温育30秒。
在温育后,如之前所述测定掺入细胞的放射性(34)。F.MqsR对细胞mRNA稳定性的效应。在加入阿拉伯糖(0.2%)后在如指定的不同时间点从具有pBAD-MqsR的大肠杆菌BL21细胞提取总RNA,并且分别使用标记的ompA、ompF和lpp作为探针对其进行Northern印迹。在将RNA转移至膜上之前,用溴化乙锭对凝胶染色以检测23S rRNA和16S rRNA。
[0040] 图3显示体内ompF mRNA中MqsR切割位点的引物延伸分析。在诱导MqsR之前和之后在指定的时间点从具有pBAD-MqsR的大肠杆菌BL21细胞制备总RNA。使用2.1- -ompF作为模板获得序列梯度(34)。在底下标示切割位点周围的序列,并且用箭头标示切割位点。
[0041] 图4显示MqsR在体外的mRNA干扰酶活性。A.在无细胞体系中H-MqsR对蛋白质合成的影响。使用用于环状DNA(Promega)的大肠杆菌T7S 30提取系统,利用peTl1a-mazG来进行MazG蛋白质合成。泳道1,不具有H-MqsR;泳道2至6,分别加入5、10、20、40和80nM的H-MqsR;泳道7,80nM H-MqsR+40nM YgiT-H;以及泳道8,加入40nM YgiT-H。B.纯化的H-MqsR的体外mRNA干扰酶活性。将MS2噬菌体RNA(0.8μg)与H-MqsR一起在37℃下于含有1mM DTT的10mM Tris-HCl(pH 8.0)中温育10分钟。将产物在1.2%琼脂糖凝胶上分离。用溴化乙锭将凝胶染色。
[0042] 图5显示MqsR、MqsRYgiT和YgiT与MqsRYgiT 5′-UTR区域中的回文序列的结合。使用5′-末端-标记的回文序列1(泳道1至6)和2(泳道7至12)DNA片段进行电泳迁移率变动测定(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)(参见图1A),如实验方法中所述,将所述DNA片段与不同浓度的蛋白质一起温育。泳道1至6和泳道7至12分别表示0、5、10、20、40和80nM的H-MqsR(A)、YgiT-H(B)和H-MqsRYgiT(C)。
[0043] 图6显示TA基因座的一般遗传背景。
[0044] 图7显示大肠杆菌中MqsR对生物膜形成的调控的模型。
[0045] 图8显示MqsR对mRNA稳定性以及蛋白质和DNA合成的效应。
[0046] 图9显示His-MqsR对无原核细胞系统中蛋白质合成的效应。
[0047] 图10显示纯化的His-MqsR对总RNA和MS2噬菌体RNA的切割。
[0048] 图11显示MS2RNA中MqsR切割位点的体外引物延伸分析。
[0049] 实验方法
[0050] 本发明通过下列非限定性实验方法进一步描述。
[0051] MqsR在大肠杆菌中的毒性。
[0052] 用pET-MqsR和pBAD-YgiT或pBAD和pET质粒转化大肠杆菌BL21细胞。将细胞涂铺在含有或不含诱导物[阿拉伯糖(0.2%)和IPTG(0.1mM)]的甘油-M9-casamino acid琼脂板上,并且将这些板在37℃下温育24小时,如图2A中显示的。图2B显示在0.2%阿拉伯糖存在(实心圆)和不存在(空心圆)的情况下具有pBAD-MqsR质粒的大肠杆菌BL21在37℃于M9(甘油,CAA)液体培养基中的生长曲线。利用600nm处的A(吸光度)测量细胞生长。
[0053] MqsR对mRNA稳定性以及蛋白质和DNA合成的效应
[0054] 在加入阿拉伯糖后在所指定的不同时间点从含有pBAD-MqsR的大肠杆菌BL21细胞提取总细胞RNA,并且使用标记的lpp、ompF和ompAORF DNA作为探针对其进行Northern3
印迹分析。图4A显示MqsR对[H]dTTP的体内掺入的效应。图4B显示MqsR对细胞mRNA
35
的体内效应。在MqsR诱导后在所指定的不同时间点测量 S-甲硫氨酸在含有pBAD-MqsR的
35
大肠杆菌BL21细胞内的掺入。图4C显示MqsR对 S-甲硫氨酸的体内掺入的效应。(4C)中相同的培养物用于显示在MqsR诱导后体内蛋白质合成的SDS-PAGE分析,如图8D中显示的。
[0055] His-MqsR对无原核细胞系统中蛋白质合成的效应。
[0056] 使用pET-11a-MazG作为模板在大肠杆菌T7S 30提取系统(Promega)中进行MazG蛋白质合成。结果示于图9中。
[0057] 纯化的His-MqsR对总RNA和MS2噬菌体RNA的切割。
[0058] 将大肠杆菌总RNA与纯化的His-标记的MqsR在37℃下一起温育30分钟。在最后的泳道中,加入纯化的YgiT。在1.2%TBE琼脂糖凝胶中分析RNA并且用溴化乙锭(EtBr)对凝胶进行染色,如图10A中所显示的。
[0059] MS2 ssRNA的切割和其被YgiT的抑制。
[0060] 在37℃下于20中用His-MqsR降解MS2 ssRNA(0.8μg;3569个碱基;Roche)。将His-MqsR与纯化的YgiT在上一起预温育10分钟,然后与MS2RNA一起再温育30分钟。将尿素中的变性产物在1.2%TBE非变性琼脂糖凝胶上进行分离。使用EtBr对凝胶进行染色。结果示于图10B和10C中。
[0061] MS2RNA中MqsR切割位点的体外引物延伸分析。
[0062] 使用His-MqsR体外切割MS2 RNA。泳道1,使用His-MqsR切割的MS2RNA;泳道2,代表其中未加入蛋白质的对照反应;切割位点在RNA序列上用红色箭头标示,并且使用左边显示的RNA梯度来测定其。结果示于图11中。
[0063] 更详细的实验方法
[0064] 细胞菌株和质粒-使用大肠杆菌BL21(DE3)和C43。使用大肠杆菌基因组DNA作为模板,通过PCR分别扩增MqsRYgiT操纵子中的MqsR和YgiT基因,并且首先将其克隆入pET28a(Novagen)。还使用大肠杆菌基因组DNA作为模板,利用MqsR-Fw和YgiT-Rv引物通过PCR扩增MqsRYgiT操纵子,并且将其克隆入pET28a,以表达MqsR-YgiT复合物。然后,分别将MqsR和YgiT基因克隆入pBAD24,从而分别产生pBAD-MsR和pBAD-YgiT。使用RT-proF和RT-proR引物,通过PCR扩增MqsRYgiT的启动子区域,并且将其克隆入2.1- 载体(invitrogen)。
[0065] 体内DNA和蛋白质合成的测定-将具有pBAD-MqsR的大肠杆菌BL21(DE3)细胞培养在含有0.5%甘油(无葡萄糖)和1mM的每一种氨基酸(除了甲硫氨酸外)的M9培养基中。当培养物的O.D.600值达到0.3时,加入阿拉伯糖至0.2%的终浓度以诱导MqsR。35
在如图2中指示的时间间隔获取细胞培养物的等分(0.4ml),将其分别与30μCi[ S]-甲
3
硫氨酸或10μCi[H]胸苷+80μg非放射性甲硫氨酸和30μg非放射性胸苷混合。在于
37℃下温育30秒后,如之前所述测定蛋白质和DNA合成的速率(34)。为了进行总细胞蛋
35
白质合成的SDS-PAGE分析,在图1F中指示的时间间隔从含有[ S]-甲硫氨酸的反应混合物取出400μl样品,并且将其转移至装有100μl 100μg/ml非放射性甲硫氨酸溶液的冷却的试管中。通过离心收集细胞沉淀,将其重悬浮于40μl Laemmli缓冲液中,并且进行SDS-PAGE,然后进行放射自显影。
[0066] RNA分离和Northern印迹分析-将含有pBAD-MqsR的大肠杆菌BL21(DE3)细胞于37℃下培养在含有0.2%甘油(无葡萄糖)的M9培养基中。当O.D.600值达到0.4时,加入阿拉伯糖至0.2%的终浓度。在如图2中指示的不同时间间隔获取样品。使用如之前所述的热酚法(35)分离总RNA。如之前所述(36)进行Northern印迹分析。
[0067] 体内引物延伸分析-为了在体内进行mRNA切割位点的引物延伸分析,在如图3中指示的MqsR诱导后的不同时间点从含有pB AD-MqsR的大肠杆菌BL21(DE3)细胞提取总32
RNA。使用15μg总RNA和1pmol的使用T4多核苷酸激酶(Takara Bio)利用[γ P]-ATP标记的引物(表1),用10个单位的AMV逆转录酶(AMV-RT)(Roche)在47℃下进行引物延伸1小时。通过加入12μl测序上样缓冲液(95%甲、20mMEDTA、0.05%溴酚蓝和0.05%二甲苯蓝)并且在95℃下加热2分钟来终止反应,然后置于冰上。在含有8M尿素的6%聚丙烯酰胺凝胶(具有使用用相同引物制备的测序梯度(sequencing ladder))上分析产物。
[0068] 蛋白质纯化-为了纯化N末端组氨酸标记的MqsR(H-MqsR)和C末端组氨酸标记的YgiT(YgiT-H),将pET-MqsRYgiT和pET-YgiT引入大肠杆菌BL21(DE3)。使用1mM异丙基-b-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)分别诱导H-MqsRYgiT复合物和YgiT-H的表达3小时。按照制造商的方案使用Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)纯化H-MqsRYgiT复合物和YgiT-H。然后,用6M盐酸胍使H-MqsRYgiT复合物变性。然后用Ni-NTA琼脂糖纯化变性的H-MqsR,如之前针对MazF所描述的(16),利用分步透析进行H-MqsR的再折叠。
[0069] 蛋白质体外合成的测定-使用用于环状DNA的大肠杆菌T7 S30提取系统(Promega)进行无细胞蛋白质合成。如制造商的方案中所述制备反应混合物。然后,以
29μl的终体积加入不同量的H-MqsR和YgiT-H。通过加入pET 11a-mazG质粒DNA(18,37)起始反应,将混合物在37℃下温育。用丙沉淀蛋白质,通过15%SDS-PAGE分析蛋白质。
通过放射自显影对干燥的凝胶进行分析。
[0070] MqsR的mRNA干扰酶活性-将MS2噬菌体RNA(Roche)与H-MqsR一起在含有1mM二硫苏糖醇(DTT)的10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中于37℃下温育10分钟。为了检查YgiT的抗毒素功能,将H-MqsR与YgiT-H一起在冰上预温育10分钟,然后与MS2RNA一起再温育10分钟。在尿素中变性后,在0.5x TBE缓冲液(44.5mM Tris酸盐和1mM EDTA)中于1.2%琼脂糖凝胶上分离产物。
[0071] 体外引物延伸分析-将MS2RNA与或不与纯化的H-MqsR于含有1mM DTT的10mM Tris-HCl(pH 8.0)中在37℃下一起温育15分钟,如上所述,将经消化的MS2RNA(0.8μg)用于引物延伸。
[0072] 电泳迁移率变动测定(EMSA)-使互补链(表1)退火,然后纯化以分别获得回文序32
列1和2双链DNA。使用T4激酶(Takara Bio)利用[g- P]ATP末端标记该双链DNA片段。
在4℃下于含有50mM KCl、5%甘油、100ng poly(dI-dC)、标记的DNA片段和纯化的蛋白质的50mMTris-HCl(pH 7.2)缓冲液中进行结合反应30分钟。在5%丙烯酰胺/双丙烯酰胺(40∶1.2)凝胶中,在110V下,于TE缓冲液(10mMTris-HCl,1mM EDTA,pH 7.2)中4℃下进行电泳。电泳后,干燥凝胶,并且通过放射自显影分析凝胶。(39)。
[0073] 逆转录(RT)-PCR-如上所述在指数生长期(O.D.600为0.8)从大肠杆菌提取总RNA,然后在0.5μl(20个单位)RNA酶抑制(Roche)存在的情况下用100个单位的无RNA酶的DNA酶I(Promega)处理其。使用总RNA(20μg)和引物YT-Rv(20pmol),利用10个单位的AMV-RT(Roche)在4℃下进行RT反应。使用合成的cDNA作为模板,用RT-Fw和RT-Rv引物(表1)进行PCR。
[0074] 结果
[0075] MqsR和YgiT基因存在于同一个操纵子中-图1A显示了MqsRYgiT操纵子存在于大肠杆菌K-12染色体上68分钟处的位置。MqsR是98个残基的蛋白质,并且在其ORF(开放阅读框架)的起始密码子上游8个碱基处存在预测的Shine-Dalgarno序列(GGAGG)(图1A中加框标示的)。下游YgiT是131个残基的蛋白质,并且YgiT的起始密码子在MqsR的转录终止密码子的下游1个碱基处。为了确定MqsRYgiT是否作为一个操纵子转录,使用从大肠杆菌BL21(DE3)提取的总RNA进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。使用YT-Rv引物(表1)从总RNA合成cDNA,所述引物位于YgiT终止密码子上游31-bp处,如实验方法中所描述的。如图1B中所示:泳道2,使用RT-Fw和RT-Rv(表1)作为引物通过PCR在约600bp的位置处检测到条带。当将大肠杆菌基因组DNA用作使用相同引物的PCR的模板时,检测到预期的576-bp条带(图1B;泳道3)。在不加入逆转录酶的情况下进行的反应中未检测到该条带(图1B;泳道2)。这些结果证明了MqsR基因与下游基因YgiT共转录。为了鉴定转录起始位点,我们使用上述相同的RNA,利用PX-RT引物进行引物延伸。该引物位于MqsR基因的起始密码子的下游2bp处。如图1C中所示,转录起始位点位于MqsR起始密码子的上游109bp处,如用箭头标示的。因此,我们在转录起始位点的上游区域中鉴定到-10区域和-35区域(典型的RNA聚合酶启动子),如图1A中所显示的。在MqsR与YgiT之间的区域中未检测到转录起始位点(数据未显示),这表明对于YgiT基因不存在独立的转录单位。
同样地,在109个碱基的5′-非翻译区(5′-UTR)中还存在两个回文序列,如图1A中加框标示的。
[0076] MqsR对细胞生长的效应-将MqsR和YgiT基因分别克隆入IPTG可诱导的pET28a质粒(Novagen)和阿拉伯糖可诱导的pBAD24质粒(40)中。具有pET-MqsR和pBAD-YgiT的大肠杆菌C43细胞在阿拉伯糖(0.2%)存在的情况下不能在M9-甘油-casamino acid琼脂板上形成集落(图2A)。然而,在0.2%阿拉伯糖存在的情况下YgiT的共诱导中和了MqsR的毒性,从而导致集落的形成,这表明MqsR是毒素,而YgiT是MqsR的抗毒素。我们还检查了MqsR在液体培养物中的毒性(图2B)。当通过加入阿拉伯糖(0.2%)诱导MqsR时,在30分钟后细胞生长完全被抑制。
[0077] 接着,我们检查了如通过[35S]甲硫氨酸渗入测量的MqsR诱导对蛋白质合成的效应。在5分钟的MqsR诱导中,蛋白质合成几乎完全被抑制(图2C)。通过SDS-PAGE分析这35
些样品(图2D)。与图2C中的结果相符,MqsR完全阻止[ S]甲硫氨酸至细胞蛋白质内的掺入。在2分钟的时间点处存在的具有12kDa表观分子量的强条带(由箭头标示的)可能是MqsR(MW,11232)。这些结果显示MqsR是所有细胞蛋白质合成的一般抑制剂。事实上,
3
[H]胸苷的掺入在MqsR诱导时未受到显著影响(图2E),这表明MqsR抑制蛋白质合成但不抑制DNA合成。当在用阿拉伯糖诱导MqsR后不同的时间点通过Northern印迹分析具有pBAD-MqsR的大肠杆菌BL21(DE3)细胞的细胞mRNA(ompA、ompF和lpp)时,在所有情况下仅在第0时间点观察到全长mRNA(图2F)。在2分钟时,全长大小的mRNA被缩短一定的长度,这表明测试的全部mRNA具有位于5′末端或3′末端附近的优先起始切割位点。5分钟后,这些条带的强度显著减小。这些数据表明,MqsR具有内切核糖核酸酶活性,并且通过切割mRNA而抑制蛋白质合成。需要指出的是,16S和23S rRNA甚至在MqsR诱导后10分钟在体内仍非常稳定,因为未观察到它们条带强度的显著改变(图2F)。这与使用MazF mRNA干扰酶观察到的结果(34)相似。核糖体蛋白似乎保护了rRNA免受MqsR的切割。
[0078] MqsR对ompA、ompF和lpp mRNA的体内切割-接着,我们利用引物延伸实验检查MqsR-介导的ompA、ompF和lpp mRNA的切割。使用不同引物进行的ompA、ompF和lpp的引物延伸分析鉴定到在Mqs R诱导后2分钟出现的不同条带,其相应于每一mRNA中的特定切割位点(表2和图3A-D)。在第0分钟时未检测到这些条带。根据全部切割序列的比对,切割发生在GCU序列的G残基之前或之后,表明MqsR在体内在特定的序列GCU处切割mRNA。ompF mRNA中所有GCU序列无一例外地在MqsR诱导后被切割(表2)。
[0079] MqsR的体外mRNA干扰酶活性-为了获得纯化的MqsR,首先将N末端组氨酸标记的MqsR(H-MqsR)从具有pET-MqsRYgiT的大肠杆菌BL21(DE3)细胞表达为H-MqsRYgiT复合物,使用Ni-NTA琼脂糖纯化所述复合物。然后,使用6M盐酸胍使纯化的H-MqsRYgiT复合物变性。将变性的H-MqsR重新捕获在Ni-NTA琼脂糖上,洗脱,然后通过分步透析重折叠(16)。如实验方法中所述表达和纯化C末端组氨酸标记的YgiT(YgiT-H)。通过凝胶过滤测得纯化的H-MqsR、YgiT-H和H-MqsRYgiT复合物的分子量分别为26、32和90kDa(数据未显示)。结果表明MqsR和YgiT都以二聚体形式存在,并且MqsRYgiT复合物很可能由2个MqsR二聚体和1个YgiT二聚体组成,MazEMazF复合物也是如此(16)。
[0080] 我们接着使用大肠杆菌T7S 30提取系统(Promega)检查了H-MqsR和H-MqsRYgiT对无细胞蛋白质合成的效应。MazG蛋白质的合成几乎被40nM或更高浓度的MqsR完全抑制(图4A;泳道5和6)。在MazF(34)和YoeB(18)的情况下观察到体外蛋白质合成的抑制。YgiT-H和H-MqsRYgiT复合物不抑制蛋白质合成(图4A;泳道7和8)。
[0081] 为了进一步证明上文中观察到的ompA、ompF和lpp mRNA的体内切割是因MqsR的mRNA干扰酶活性引起的,使用纯化的MqsR-H体外切割MS2噬菌体RNA(3569个碱基)。纯化的MqsR制剂明确地显示出内切核糖核酸酶活性(图4B,泳道2和3)。当将纯化的YgiT-H与H-MqsR一起预温育时,其内切核糖核酸酶活性被完全抑制(图4B,泳道4)。纯化的YgiT-H本身对mRNA不具有可检测的效应(图4B,泳道5)。这些结果验证了YgiT作为抗毒素起作用并且阻断MqsR mRNA干扰酶活性。为了确认YgiT是MqsR的特异性抑制剂,我们检查了YgiT是否抑制在ACA序列处切割mRNA的MazF。MazF切割MS2RNA(图4B,泳道6),并且当将MazF与纯化的MazE(MazF的解毒剂)一起预温育时,其活性被完全抑制(图4B,泳道7)。然而,当将MazF与纯化的YgiT-H一起温育时,其活性不被抑制(图4B,泳道8)。此结果显示YgiT特异性抑制MqsR内切核糖核酸酶活性。
[0082] 在核糖体不存在的情况下MqsR切割RNA的能力与其mRNA干扰酶活性依赖于核糖体的RelE或YoeB显著不同(12,18,41)。如之前针对MazF所描述的(34),MqsR活性的活性被MgCl2抑制(数据未显示)。
[0083] 纯化的MqsR对MS2RNA的体外切割位点-还可通过引物延伸分析MqsR对MS2RNA的体外活性。将MS2RNA与MqsR在37℃下温育10分钟。将产物用作引物延伸的模板。MqsR在5个切割位点处切割MS2RNA,并且全部切割位点的序列被确定为GCU(表2)。综合起来,体内和体外引物延伸实验的结果(图3和表2)均表明MqsR是在GCU序列处特异性切割RNA的mRNA干扰酶。
[0084] MqsRYgiT复合物与MqsRYgiT启动子区域的结合-在许多其他TA系统包括ccdAB(42,43)、parDE(44)、mazEF(45)和relBE(46)的启动子区域中均存在回文序列。此类抗毒素或毒素-抗毒素复合物结合它们的关联回文序列以负调控其自身的操纵子。由于在MqsRYgiT操纵子的5′-UTR区中存在2个回文序列(图1A),我们接着检查MqsRYgiT复合物是否能够结合它们。如实验方法中所述制备回文序列1和2DNA片段,并且使用T4激酶32
利用[γ P]ATP标记其。将YgiT和MqsRYgiT复合物与标记的DNA混合,以测试它们结合回文序列的能力。YgiT能够在10和20nM或更高的浓度下分别改变回文序列1和2片段的迁移率(图5A;泳道3至6和10至12)。在5nM下,对于回文序列1或2片段未观察到改变的条带。值得注意的是,单独的H-MqsR蛋白不能结合(甚至在80nM浓度下)任一回文序列(图5A)。然而,向YgiT中加入MqsR增强了YgiT对两种回文序列的结合。以2∶1的摩尔比将MqsR加入YgiT。与单独的YgiT相比较,复合物更强地结合两个回文序列(图
5C;分别为泳道2至6和9至12)。在这些条件下,对于回文序列1和2片段而言,代表回文序列的条带的位置分别在5和10nMMqsRYgiT复合物下产生变化。结果表明与其他TA系统一样,YgiT和MqsRYgiT复合物都结合回文序列以负调控MqsRYgiT操纵子。
[0085] 讨论
[0086] 如本文中所公开的,我们证明了大肠杆菌染色体上的MqsR和YgiT基因共转录,并且MqsR-YgiT是一种新型毒素-抗毒素系统。与大多数其他TA系统相反,该操纵子上的第一基因编码毒素MqsR,第二基因编码抗毒素YgiT。虽然MqsR与已很好表征的mRNA干扰酶MazF(其在ACA序列处特异性切割mRNA(29))不具有同源性,但发现MqsR是一种在GCU序列处切割mRNA的mRNA干扰酶。值得注意地,与MazF一样,MqsR是一种不依赖于核糖体的mRNA干扰酶,其与依赖于核糖体的mRNA干扰酶例如RelE(12,46)、YoeB(18)和HigB(47)明显不同。
[0087] 已报导MqsR在生物膜的形成过程中被诱导(1),并且在加入群体感应自体诱导物-2,AI-2(2)后被诱导。MqsR的激活反过来激活两组分系统qseBC,已知所述系统在生物膜的形成中起着重要作用(2)。QseC是传感器组氨酸激酶,QseB是转录调节剂,其结合qseBC操纵子的5′-UTR区并且激活该操纵子的转录(48,49)。MqsR-YgiT复合物能够结合存在于MqsRYgiT操纵子的5′-UTR中的2个回文序列,并且似乎抑制MqsRYgiT的转录。我们检查了MqsR-YgiT复合物也可能调控qseBC操纵子的表达的可能性。然而,H-MqsR-YgiT复合物不能结合包含QseB结合位点的qseBC启动子区域(数据未显示)。发现这两个回文序列(回文序列1和2;图1A)在大肠杆菌染色体上是独特的,因为除了MqsRYgiT操纵子,没有其他大肠杆菌基因具有这两个回文序列中的任一个。同样地,纯化的QseB不结合MqsRYgiT操纵子的5′-UTR区(数据未显示)。这些结果表明MqsR不直接参与qseBC操纵子的激活。
[0088] 我们就GCU序列的存在情况分析了大肠杆菌基因组上全部4,226个ORF(NCBI RefSeq;登录号NC 000091),发现只有14个ORF不包含单个GCU序列(表3)。在这14个基因中,已显示6个基因pheL、tnaC、trpL、yciG、ygaQ和ralR在大肠杆菌中在生物膜的形成过程中被诱导(50)。特别有趣的是YgaQ(330bp),其在生物膜中被诱导32倍,并且已显示其参与大肠杆菌的群集运动(51)。由于这些基因对MqsR mRNA干扰酶活性有抗性,在生物膜的形成过程中MqsR的诱导可灭活除了这14个基因外的全部大肠杆菌mRNA,从而MqsR可能在生物膜的形成中起着重要作用。在绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中,在生物膜的形成过程中几乎全部细胞死亡(52)。在生物膜的形成过程中MqsR的诱导可能引起细胞进入与由MazF引起的状态相似的准休眠状态(quasi-dormantstate)(8,53),并且最终导致细胞死亡。
[0089] 本论文中MqsR-YgiT系统作为大肠杆菌中的新型TA系统的发现使大肠杆菌TA系统的总数增加至多达16个,其包括MazF-MazE(16,34)、RelE-RelB(12,13)、ChpBK-ChpBI(14)、YafQ-DinJ(21)、YoeB-YefM(18,19)、HipA-HipB(22,23)、HicA-HicB(25,26)、YhaV-PrlF(27)和YafO-YafN(24)。
[0090] 表1.用于本研究的引物
[0091]
[0092]
[0093] 表2.MqsR的体内和体外切割位点
[0094]
[0095] 表3.大肠杆菌基因中的MqsR抗性基因
[0096]
[0097] 本发明在范围上不限于实施例中公开的特定实施方案,这些实施例意欲作为本发明一些方面的举例说明,功能上等价的任何实施方案都在本发明的范围内。事实上,除了本文中显示的和描述的实施方案外,本发明的各种改动对于本领域技术人员来说是很显然的,并且意欲涵盖在所附权利要求的范围内。
[0098] 参考文献
[0099] 1.Balestrino,D.,Haagensen,J.A.,Rich,C,and Forestier,C.(2005)J Bacteriol 187,2870-2880
[0100] 2.Davies,D.G.,Parsek,M.R.,Pearson,J.P.,Iglewski,B.H.,Costerton,J.W.,and Greenberg,E.P.(1998)Science280,295-298
[0101] 3.Hammer,B.K.,and Bassler,B.L.(2003)MoI Microbiol50,101-104[0102] 4.McNab,R.,Ford,S.K.,E1-Sabaeny,A.,Barbieri,B.,Cook,G.S.,and Lamont,R.J.(2003)J Bacteriol 185,274-284
[0103] 5.Ren,D.,Bedzyk,L.A.,Thomas,S.M.,Ye,R.W.,and Wood,T.K.(2004)Appl Microbiol Biotechnol 64,515-524
[0104] 6.Gonzalez Barrios,A.F.,Zuo,R.,Hashimoto,Y.,Yang,L.,Bentley,W.E.,and Wood,T.K.(2006)J Bacteriol 188,305-316
[0105] 7.Pandey,D.P.,and Gerdes,K.(2005)Nucleic Acids Res33,966-976[0106] 8.Yamaguchi,Y.,and Inouye,M.(2009)Prog MoI Biol Transl Sci 85,467-500[0107] 9.Buts,L.,Lah,J.,Dao-Thi,M.H.,Wyns,L.,and Loris,R.(2005)Trends Biochem Sci 30,672-679
[0108] 10.Engelberg-Kulka,H.,Sat,B,,Reches,M.,Amitai,S.,and Hazan,R.(2004)Trends Microbiol 12,66-71
[0109] 11.Gerdes,K.,Christensen,S.K.,and Lobner-Olesen,A.(2005)Nat Rev Microbiol 3,371-382
[0110] 12.Pedersen,K.,Zavialov,A.V.,Pavlov,M.Y.,Elf,J.,Gerdes,K.,and Ehrenberg,M.(2003)Cell 112,131-140
[0111] 13.Takagi,H.,Kakuta,Y.,Okada,T.,Yao,M.,Tanaka,L,and Kimura,M.(2005)Nat Struct MoI Biol 12,327′-331
[0112] 14.Zhang,Y.,Zhu,L.,Zhang,J.,and Inouye,M.(2005)J Biol Chem 280,26080-26088
[0113] 15.Kamada,K.,Hanaoka,F.,and Burley,S.K.(2003)MoI Cell 11,875-884[0114] 16.Zhang,J.,Zhang,Y.,and Inouye,M.(2003)J Biol Chem278,32300-32306[0115] 17.Zhang,Y.,Zhang,J.,Hara,H.,Kato,L,and Inouye,M.(2005)J Biol Chem280,3143-3150
[0116] 18.Zhang,Y.,and Inouye,M.(2009)J Biol Chem 284,6627-6638
[0117] 19.Kamada,K.,and Hanaoka,F.(2005)MoI Cell 19,497-509
[0118] 20.Motiejunaite,R.,Armalyte,J.,Markuckas,A.,and Suziedeliene,E.(2007)FEMS Microbiol Lett 268,112-119
[0119] 21.Prysak,M.H.,Mozdzierz,C.J.,Cook,A,M,,Zhu,L.,Zhang,Y.,Inouye,M.,and Woychik,N.A.(2009)MoI Microbiol71,1071-1087
[0120] 22.Keren,L,Shah,D.,Spoering,A.,Kaldalu,N.,and Lewis,K.(2004)J Bacteriol 186,8172-8180
[0121] 23.Korch,S.B.,Henderson,T.A.,and Hill,T.M.(2003)MoI Microbiol 50,1199-1213
[0122] 24.Brown,J.M.,and Shaw,K.J.(2003)J Bacteriol 185,6600-6608[0123] 25.Jorgensen,M.G.,Pandey,D.P.,Jaskolska,M.,and Gerdes,K.(2009)J Bacteriol 191,1191-1199
[0124] 26.Makarova,K.S.,Grishin,N.V.,and Koonin,E.V.(2006)Bioinformatics 22,2581-2584
[0125] 27.Schmidt,O.,Schuenemann,V.J.,Hand,N.J.,Silhavy,T.J.,Martin,J.,Lupas,A.N.,and Djuranovic,S.(2007)J MoI Biol 372,894-905
[0126] 28.Wang,X.,Kim,Y.,and Wood,T.K.(2009)ISME J
[0127] 29.Bahassi,E.M.,O′ Dea,M.H.,Allali,N.,Messens,J.,Gellert,M.,and Couturier,M.(1999)J Biol Chem 274,10936-10944
[0128] 30.Kampranis,S.C,Howells,A.L,and Maxwell,A.(1999)JMol Biol 293,733-744
[0129] 31.Christensen,S.K.,and Gerdes,K.(2003)MoI Microbiol48,1389-1400[0130] 32.Hayes,C.S.,and Sauer,R.T.(2003)MoI Cell 12,903-911
[0131] 33.Zhang,J.,Zhang,Y.,Zhu,L.,Suzuki,M.,and Inouye,M.(2004)J Biol Chem279,20678-20684
[0132] 34.Zhang,Y.,Zhang,J.,Hoeflich,K.P.,Ikura,M,Qing,G.,and Inouye,M.(2003)MoI Cell 12,913-923
[0133] 35.Sarmientos,P.,Sylvester,J.E.,Contente,S.,and Cashel,M.(1983)Cell32,1337-1346
[0134] 36.Baker,K.E.,and Mackie,G.A.(2003)MoI Microbiol47,75-88
[0135] 37.Zhang,J.,and Inouye,M.(2002)J Bacteriol 184,5323-5329
[0136] 38.Liu,Y.C,and Chou,Y.C.(1990)Biotechniques 9,558,560
[0137] 39.Yoshida,T.,Qin,L.,Egger,L.A.,and Inouye,M.(2006)J Biol Chem 281,17114-17123
[0138] 40.Guzman,L.M.,Belin,D.,Carson,M.J.,and Beckwith,J.(1995)J Bacteriol111,4121-4130
[0139] 41.Christensen,S.K.,Pedersen,K.,Hansen,F.G.,and Gerdes,K.(2003)JMo/Biol 332,809-819
[0140] 42.Dao-Thi,M.H.,Charlier,D.,Loris,R.,Maes,D.,Messens,J.,Wyns,L.,and Backmann,J.(2002)J Biol Chem 277,3733-3742
[0141] 43.Madl,T.,Van Melderen,L.,Mine,N.,Respondek,M.,Oberer,M.,Keller,W.,Khatai,L.,and Zangger,K.(2006)JMoI Biol 364,170-185
[0142] 44.Oberer,M.,Zangger,K.,Gruber,K.,and Keller,W.(2007)Protein Sci 16,1676-1688
[0143] 45.Marianovsky,L,Aizenman,E.,Engelberg-Kulka,H.,and Glaser,G.(2001)J Biol Chem 276,5975-5984 46.Li,G.Y.,Zhang,Y.,Inouye,M.,and Ikura,M.(2008)JMo/Biol 380,107-119
[0144] 47.Hurley,J.M.,and Woychik,N.A.(2009)J Biol Chem
[0145] 48.Clarke,M.B.,and Sperandio,V.(2005)MoI Microbiol58,441-455[0146] 49.Sperandio,V.,Torres,A.G.,and Kaper,J.B.(2002)MoI Microbiol 43,809-821
[0147] 50.Domka,J.,Lee,J.,Bansal,T.,and Wood,T.K.(2007)Environ Microbiol 9,332-346
[0148] 51.Inoue,T.,Shingaki,R.,Hirose,S.,Waki,K.,Mori,H.,and Fukui,K.(2007)J Bacteriol 189,950-957
[0149] 52.Webb,J.S.,Thompson,L.S.,James,S.,Charlton,T.,Tolker-Nielsen,T.,Koch,B.,Givskov,M.,and Kjelleberg,S.(2003)J Bacteriol 185,4585-4592[0150] 53.Inouye,M.(2006)J Cell Physiol 209,670-676
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