형질도입 완충제专利检索- 作用于酯键的水解酶专利检索查询-专利查询网

형질도입 완충제
申请号	KR1020167008225	申请日	2014-08-28	公开(公告)号	KR1020160056899A	公开(公告)日	2016-05-20
申请人	코닌클리즈케 네덜란드세 아카데미 반 베텐샤펜;			发明人	지센,니엘스; 다스톨포,디에고,세바스티안;
摘要	본발명은세포에분자를도입시키기위한형질도입화합물, 완충제및 방법에관한것이다. 본발명은또한치료방법, 약학조성물및 상기형질도입화합물및 완충제의다른용도에관한것이다. 본발명은또한본 발명의형질도입화합물, 완충제및 방법에의해수득할수 있는변형된세포에관한것이다.
权利要求	세포에 관심 분자를 형질도입시키는 방법으로, 상기 세포를 상기 관심 분자 및 형질도입 완충제와 접촉시킴을 포함하며, 상기 형질도입 완충제가 (i) 형질도입 화합물, (ii) 염 또는 나트륨-수소 수송체의 활성제/촉진제, 및 바람직하게는 (iii) 삼투억제제를 포함하는 방법. 제 1 항에 있어서, 형질도입 완충제가 (i) 형질도입 화합물, (ii) 염, 및 바람직하게는 (iii) 삼투억제제를 포함하는 방법. 제 2 항에 있어서, 형질도입 완충제가 (i) 형질도입 화합물, (ii) 염, 및 (iii) 삼투억제제를 포함하는 방법. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 염이 나트륨, 리튬, 칼륨, 세슘 또는 루비듐염인 방법. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 염이 염화 나트륨인 방법. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 형질도입 화합물이 a. 하기 화학식을 갖거나; 상기 식에서, R ₁ 은 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실 또는 이들의 유도체이고; R ₂ 는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실 또는 이들의 유도체이고; R ₃ 은 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실 또는 이들의 유도체이고; R ^- 은 SO ₃ ^- 또는 COO ^- 또는 POO ^- 이고/이거나; n은 1 내지 6, 즉 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다; 또는 b. 하기 화학식 I 및 그의 토오토머, 용매화물, 쯔비터이온 및 염을 갖는 방법: 화학식 I 상기 식에서, X는 NR ¹ R ² , NR ¹ R ² R ³ +, OH 및 COOR ⁴ 이고; Y는 SO ₃ H, SO ₃ ^- , COO ^- , CONH ₂ , COOR ¹² , CONR ⁵ R ⁶ , 테트라졸, OH, NR ¹⁰ R ¹¹ , 및 H 중에서 선택되고; n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고; R ¹ , R ² 및 R ³ 은 각각 독립적으로 H, C1-6 알킬, C5-10 아릴, C6-15 아르알킬, COR ⁹ 중에서 선택되고; C1-6 알킬, C5-10 아릴, C6-15 아르알킬은 R ^Y , OH 또는 COOH로 임의로 치환될 수도 있거나; 또는 R ¹ 및 R ² 는 이들이 결합된 질소와 함께 헤테로사이클릴을 형성할 수도 있거나; 또는 X가 NR ¹ R ² R ³ +일 때, R ³ 은 존재하지 않을 수도 있고 R ¹ 및 R ² 는 이들이 결합된 질소와 함께 헤테로아릴을 형성할 수도 있으며; R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , R ⁹ , R ¹⁰ , R ¹¹ , R ¹² 는 독립적으로 H 및 C1-6 알킬 중에서 선택되고; R ⁷ 및 R ⁸ 은 독립적으로 H, C1-6 알킬 및 OH 중에서 선택되거나; 또는 R ⁷ 은 R ¹ 과 함께 헤테로사이클릴을 형성할 수도 있고; 헤테로사이클릴은 가능한 경우 N, NR ¹³ , NR ¹³ R ¹⁴ + 및 O 중에서 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 고리원, 및 탄소수 2 내지 5를 함유하는, 포화되거나 부분적으로 불포화된 모노사이클릭 고리이고; 헤테로사이클릴은 C1-C6 알킬, C1-C6 카복실산 또는 R ^Y 로 치환된 C1-C6 알킬로 임의로 치환될 수도 있고; 헤테로아릴은 가능한 경우 N, NR ¹³ , NR ¹³ R ¹⁴ + 및 O 중에서 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 고리원을 함유하는 5 또는 6원 방향족 고리이고; 헤테로아릴은 C1-C6 알킬, C1-C6 카복실산 또는 R ^Y 로 치환된 C1-C6 알킬로 임의로 치환될 수도 있고; R ¹³ 및 R ¹⁴ 는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C1-C6 카복실산 및 R ^Y 로 치환된 C1-C6 알킬 중에서 선택되고; 알킬은 선형 또는 분지된 포화된 탄화수소이고; R ^Y 는 SO ₃ H, SO ₃ ^- , COO ^- , CONH ₂ , COOR ¹² , CONR ⁵ R ⁶ , 테트라졸, OH, 및 NR ¹⁰ R ¹¹ 중에서 선택되고; C1-6 카복실산은 -COOH 또는 COOH로 치환된 C1-5 알킬쇄를 의미한다. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 형질도입 화합물이 비-세정성 베타인(NDB) 또는 그의 유도체인 방법. 제 7 항에 있어서, 형질도입 화합물이 하기 화학식 II를 갖는 방법: 화학식 II 상기 식에서, X는 NR ¹ R ² , 및 NR ¹ R ² R ³ + 중에서 선택되고; Y는 SO ₃ H, SO ₃ ^- , COO ^- , CONH ₂ , COOR ¹² , 및 CONR ⁵ R ⁶ 중에서 선택되고; R ¹ , R ² 및 R ³ 은 각각 독립적으로 H, 및 OH 또는 COOH로 임의로 치환될 수도 있는 C1-6 알킬이거나; 또는 R ¹ 및 R ² 는 이들이 결합된 질소와 함께, 임의로 치환될 수도 있는 헤테로사이클릴, 바람직하게는 피페리딘, 피페라진 또는 모르폴린을 형성할 수도 있거나; 또는 X가 NR ¹ R ² R ³ +일 때, R ³ 은 존재하지 않을 수도 있고 R ¹ 및 R ² 는 이들이 결합된 질소와 함께, 임의로 치환될 수도 있는 헤테로아릴, 바람직하게는 피리딜을 형성할 수도 있고; 모든 다른 기는 상기 화학식 I에 정의된 바와 같다. 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 형질도입 화합물이 4급 질소기를 함유하고 상기 4급 질소가 지방족 또는 방향족 고리 구조의 부분인 방법. 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 형질도입 화합물이 X가 하기 화학식 a인 화학식 I 또는 II의 화합물인 방법: 화학식 a ; 상기 식에서, Z는 C(R ¹⁵ ) ₂ , NR ¹³ , NR ¹³ R ¹⁴ + 및 O 중에서 선택되고; 각각의 R ¹⁵ 는 독립적으로 H, C1-6 알킬, C1-C6 카복실산 및 R ^Y 로 치환된 C1-C6 알킬 중에서 선택되고; R ³ 은 H, C1-6 알킬, C5-10 아릴, C6-15 아르알킬, COR ⁹ 중에서 선택되고; C1-6 알킬, C5-10 아릴 및 C6-15 아르알킬은 R ^Y , OH 또는 COOH로 임의로 치환될 수도 있다. 바람직하게는 R ₃ 은 -CH ₃ 이고; R ¹³ 및 R ¹⁴ 는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C1-C6 카복실산 및 R ^Y 로 치환된 C1-C6 알킬 중에서 선택된다. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 형질도입 화합물이 표 1의 화합물들 중에서 선택되는 방법. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 형질도입 화합물이 표 1의 기준 화합물 #1에 비해 30% 이상의 형질도입 효율을 갖는 임의의 화합물인 방법. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 삼투억제제가 글리신 및/또는 글리세롤인 방법. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 형질도입 완충제가 생물학적 pH 완충제, 점도 증가제 및/또는 성장 인자를 또한 포함하는 방법. 제 14 항에 있어서, 생물학적 pH 완충제가 PBS, TES 또는 HEPES인 방법. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 점도 증가제가 폴리비닐피롤리돈(PVP)인 방법. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 성장 인자가 EGF, FGF, HGF, BDNF, PDGF, VEGF 및 IGF 중에서 선택되거나, 또는 이들의 임의의 조합인 방법. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 형질도입 완충제의 오스몰랄 농도가 약 300 mOsm/㎏ 내지 약 1000 mOsm/㎏, 또는 약 300 mOsm/㎏ 내지 약 2000 mOsm/㎏ 또는 약 300 mOsm/㎏ 내지 약 3000 mOsm/㎏의 범위인 방법. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 형질도입 화합물이 약 0.1 mM 내지 약 500 mM의 농도로 존재하는 방법. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 삼투억제제가 약 5 내지 약 500 mM의 농도로 존재하는 방법. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 분자가 펩타이드, 단백질, 핵산, 폴리사카라이드, 소분자, 소낭, 나노입자, 바이러스 또는 단세포 유기체인 방법. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 분자가 약 30 내지 약 200 kDa, 또는 약 1 내지 약 400 kDa인 방법. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 분자가 핵산을 변형시키기 위한 효소, 예를 들어 엔도뉴클레아제, 또는 예를 들어 아연 집게 뉴클레아제 중에서 선택된 뉴클레아제, TALEN, Cas9, Cas9 유사체, DNA-표적화된 FokI-뉴클레아제-관련 단백질, 캐스케이드, TtAgo 또는 아고너트 단백질 또는 이들의 유도체인 방법. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포인 방법. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 줄기세포, 예를 들어 배아줄기세포 또는 신경줄기세포, 또는 분화된 세포, 예를 들어 뉴런 또는 수지상 세포인 방법. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 1차 세포인 방법. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 2, 3, 4 또는 그 이상의 관심 분자와 접촉시키는 방법. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내에서 수행되는 방법. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 생체내에서 수행되는 방법. 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 형질도입이 대음세포작용(macropinocytosis)에 의한 것인 방법. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 형질도입된 세포 또는 세포 집단. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 인용된 바와 같은 형질도입 완충제. 제 32 항에 있어서, 형질도입을 위한 관심 분자를 또한 포함하는 형질도입 완충제. 관심 분자를 세포에 형질도입시키기 위한 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 따른 방법에서, 제 32 항 또는 제 33 항에 따른 형질도입 완충제의 용도. 제 32 항 또는 제 33 항에 따른 형질도입 완충제를 포함하는 약학 조성물. 치료 또는 진단에 사용하기 위한, 제 32 항 또는 제 33 항에 따른 형질도입 완충제 또는 제 35 항에 따른 약학 조성물. 관심 분자를 예를 들어 세포에 형질도입시키기 위한, 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 따른 방법에서, 삼투억제제, 임의로 글리신 및/또는 글리세롤의 용도. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 따른 방법에서, 관심 분자를 예를 들어 세포에 형질도입시키기 위한 표 1 중에서 선택된 형질도입 화합물의 용도. 표 1의 화합물 #10, #11, #16, #42, #34, #41, #40, #39, #33, #15, #11, #29, #36 및 #46 중에서 선택되는 화합물. 세포 중의 핵산, 예를 들어 유전자 서열의 변형 방법으로, 상기 세포를 핵산을 변형시킬 수 있는 단백질 및 형질도입 완충제와 접촉시킴을 포함하고, 상기 형질도입 완충제가 (i) 형질도입 화합물, (ii) 염 또는 나트륨-수소 수송체의 활성제/촉진제, 및 바람직하게는 (iii) 삼투억제제를 포함하는 방법. 제 40 항에 있어서, 핵산을 변형시킬 수 있는 단백질을 본질적으로 특정한 표적 서열에 표적화시키고, 예를 들어 상기 단백질이 아연 집게 뉴클레아제 또는 TALEN, Cas9, Cas9 유사체, DNA-표지된 FokI-뉴클레아제-관련 단백질, 캐스케이드 복합체, TtAgo 단백질 또는 다른 아고너트 단백질 또는 이들의 유도체인 방법. 제 40 항에 있어서, 세포를, 단백질을 표적 유전자 서열로 향하게 하는 안내 분자와 추가로 접촉시키는 방법. 제 40 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 오스몰랄 농도를 약 1000 mOsm/㎏ 내지 약 1500 mOsm/㎏, 바람직하게는 약 1250 mOsm/㎏으로 조절하는 방법. 제 40 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 형질도입 화합물을 약 200 nM 내지 약 400 nM, 바람직하게는 약 250 mM의 농도로 사용하는 방법. 제 40 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 형질도입 완충제가 인터페론 반응 경로의 억제제, 예를 들어 B18R을 또한 포함하는 방법. 제 40 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포를 단리하거나 또는 사용함을 또한 포함하는 방법. 제 40 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 변형된 세포.
说明书全文	형질도입 완충제{TRANSDUCTION BUFFER} 본 발명은 세포에 분자를 도입시키기 위한 형질도입 완충제 및 방법에 관한 것이다. 세포에 소분자 또는 거대분자를 도입시키는 능력은 연구 및 의학에서 중요한 용도를 갖는다. 불행하게도, 세포막은 많은 생물 활성 분자들의 도입에 큰 장애가 된다. 단백질을 세포에 도입시키는 능력은 연구 및 의학에서 다수의 용도를 갖지만, 그렇게 하기에 신뢰할만한 무독성의 효율적인 방법은 여전히 없다. 카스텔로트(Castellot) JJ Jr 등(Proc Natl Acad Sci USA. 1978 Jan;75(1):351-5)은 4.2%(w/v) 염화 나트륨을 함유하는 배지를 사용하여 소분자를 세포에 도입시키는 방법을 고려하였다. 상기 저자는 고장성 처리시 불멸화된 햄스터 BHK 세포에 의한 트립판 블루 흡수를 설명하였다. 그러나, 상기 저자는 상기 트립판 블루가 흡수에 이어서 세포질이나 다른 세포 구획내로 방출됨을 설명하지 않았다. 더욱 또한, 트립판 블루는 소분자이며 상기 과정이 거대분자의 흡수도 또한 허용하는지는 명확하지 않았다. 본 출원에 제공된 데이터로부터, 특히 도 2G 및 3E에서, 우리는 NaCl-매개된 고장성이 대음세포작용을 통해 세포외 공간으로부터 거대분자의 흡수를 유도하지만, 세포내강 내로의 마크로피노솜의 방출에 본 출원에 개시된 비-세정성 설포베타인과 같은 형질도입 화합물 또는 다른 화합물의 첨가가 요구됨을 설명하고 있다. 또한, 배지 100 ㎖당 4.2 그램의 염화 나트륨은 대략 1727 mOsm/㎏의 배지 오스몰랄농도로 번역되는데, 이는 1차 세포에 의해 통상적으로 허용되지 않는다. 이와 같이, 카스텔로트와 동료들에 의해 개시된 방법을, 거대세포를 1차 세포 및/또는 줄기세포주에 형질도입시키는데 적용할 수 없다. 1982년에, 오카다와 레흐슈타이너(Okda and Rechsteiner)는 0.5M 슈크로스 및 10% PEG1000에 의해 유도된 고장성 처리에 이은 간단한 저장성 처리가 거대분자 및 단백질의 불멸화된 세포주내로의 세포내 흡수를 유도함을 설명하였다 ¹ . 불행하게도, 상기 기법은 불멸화된 세포주로 제한되는 것으로 입증되었으며, 1차 세포에서 불량한 단백질 형질도입 효율을 생성시킨다. 우리는 상기 오카다 방법을 사용하여 CRE 리콤비나제 단백질의 쥐 배아줄기세포(mESC)내로의 형질도입을 시험하였다. 우리는 CRE-리콤비나제 유도성 리포터가 ColA1 유전자좌에 안정하게 삽입된 트랜스제닉 mESC 주를 사용하였다 ² . 상기 리포터는 CMV 프로모터에 이어서 LoxP-인접된 Stop-카세트 및 eGFP 리포터 유전자를 포함한다(도 1A). eGFP 발현은 상기 Stop 카세트의 성공적인 CRE-리콤비나제 매개된 절제시에 유도된다(도 1A). 유식 세포측정에 의해 입증되는 바와 같이, 5 μM CRE-리콤비나제 단백질에 의한 mESC의 형질도입은 6% GFP-양성 mESC를 생성시켰으며, 이는 상기 오카다와 동료들에 의해 개시된 복합 고장성/저장성 형질도입 방법이 1차(줄기) 세포의 형질도입에 비효율적임을 암시한다(도 1B). 몇 년 후에, 그린(Green) ³ 과 프랭켈(Frankel) ⁴ ^,5 로부터의 독립적인 발견은 HIV TAT 단백질이 자신을 세포막을 가리질러 형질도입시킬 수 있음을 최초로 설명하였다. 이러한 자기-형질도입을 매개하는 펩타이드 서열은 후속적으로 식별되었으며 상기 서열은 이종 단백질에 화학적으로 융합시 세포 형질도입을 구동하는 것으로 나타났다 ⁶ . 최종적으로, 나가하라(Nagahara)와 동료들은 TAT-펩타이드 매개된 단백질 형질도입이 또한 상기 TAT 펩타이드를 인-프레임 융합으로서 관심 '수송' 단백질에 클로닝시킬 때 실행됨을 설명하였다 ⁷ . TAT-펩타이드 매개된 단백질 형질도입의 분명한 이점은 상기 방법이 1차 세포를 포함한 모든 세포 유형들에 대해 실행되는 것으로 보이며, 일반적으로 무독성이라는 것이다. 그러나, 상기 TAT 펩타이드의 강한 양전하는 이 콜라이에서 고유의 재조합 TAT-융합 단백질의 생산을 방해하며, 이때 상기 재조합 단백질 중 다수는 봉입체로 끝난다. 또한, 후속의 연구는 자기-형질도입 단백질에 대한 일부 선행의 보고서들이 실제로는 세포의 고정 중에 도입된 실험 인공물의 결과임을 설명하였다 ⁸ . 또한, 상기 기술은 상기 TAT 펩타이드를 재조합 단백질에 융합시킬 것을 요하며 따라서 형질도입될 수 있는 단백질의 유형 및 수를 제한한다. 상기 TAT 펩타이드 자체가 상기 재조합 단백질의 기능 또는 국소화를 붕괴시켜 뜻밖의 또는 불필요한 결과를 도출할 수 있다. 최종적으로, 및 추정상 가장 중요하게는, 상기 TAT-융합 단백질의 형질도입 효율은 매우 가변적이며 상기 단백질 수송물의 성질 및 물성에 의존한다. 뉴클레오타이드(DNA, RNA, siRNA) 및/또는 치료학적 분자의 세포내 도입에 상당한 노력이 투자되었으며, 1차 세포는 여전히 도전이지만, 막관통 담체로서 양이온성 지질, 나노입자 또는 바이러스 벡터를 사용한 진보가 이루어졌다. 예를 들어, US 6124207은 리포솜(세정성 미셀)을 생성시키기 위한 융합유도 성질을 갖는 양이온성 양친성 형질감염제의 용도를 개시한다. 상기 리포솜을 후속적으로 DNA와 혼합시켜, 세포내로의 형질감염전에 리포솜-DNA 복합체를 형성시킨다. 생체내에서 수행시, "생리" 식염수(9 g/ℓ의 수성 NaCl 용액)(또한 "식"염수로서 공지되고 혈중 NaCl의 오스몰랄 농도에 근접하다)를 상기 형질감염 제형에 첨가한다. 이러한 적용은 "네이키드" DNA의 형질감염 효율이 낮음을 설명한다. 상기와 같은 "담체" 방법은 또한 표적화된 유전자 변형에 사용되었는데, 여기에서 상기 유전자 변형 단백질, 예를 들어 TALENS, CRISPR/CAS 및 다른 유전자 편집 시스템을 암호화하는 DNA 또는 mRNA가 세포내로 형질감염된다. 대개 상기와 같은 유전자 변형은 바이러스 형질도입에 의해 수행된다. 상기 방법은 주입된 바이러스의 고용량으로 인한 급성 면역 거부 및 바이러스 삽입 위치 효과로부터 생성되는 종양 형성을 포함한 부반응들의 상당한 위험을 생성시킨다. 더욱 또한, 상기 핵산은 수일간 세포내에서 발현되어 효소의 높은 발현 및 보다 큰 표적-밖 효과의 가능성, 예를 들어 상기 세포내 비-표적 서열의 유전자 변형을 생성시킨다. 바이러스 형질도입은 또한 몇몇 세포 유형에 대해서 여전히 비효율적이다. 이러한 어려움은 상기 언급한 유전자 편집 시스템의 임상 적용을 방해한다. 대조적으로, 단백질의 세포내 전달을 위한 신기술의 개발은 실제로 정체상태이다. 그럼에도 불구하고, 세포에 단백질을 도입시키는 능력은 백신 개발, 게놈 편집, 후성적 리프로그래밍, (줄기)세포 분화 및 세포내 과정의 조작에 다수의 용도를 가질 것이다. 따라서, 특히 1차 세포에서, 단백질 및 다른 거대분자의 효율적인 세포내 전달을 위한 보다 양호한 기술의 개발이 대단히 필요하다. 따라서, 단백질 및 다른 분자들을 세포에 형질도입시키기 위한 보다 효율적인 방법이 필요하다. 분자의 세포내로의 형질도입은 유전자 요법을 포함한 다수의 치료학적 및 과학적 목적에 바람직하다. 여기에서 우리는 염-유발된 고장성, 소분자 화합물 및 삼투억제제의 조합이 세포 생육력에 영향을 미치지 않으면서 소분자 및 거대분자의 1차 세포내로의 확고하고 효율적인 도입을 구동함을 개시한다. 우리는 단백질, 뉴클레오타이드, 나노구 및 거대분자가 어떻게 광범위하게 다양한 1차 세포, 줄기 세포주 및 이들의 유도체에 도입될 수 있는지에 대한 예를 제공한다. 또한, 우리는 단백질 및 뉴클레오타이드의 세포내로의 동시적인 형질도입을 개시한다. 발명의 요약 본 발명은 관심 분자를 세포내에 형질도입시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 세포를 상기 관심 분자 및 형질도입 완충제와 접촉시킴을 포함하고, 여기에서 상기 형질도입 완충제는 염, 형질도입 화합물 및 바람직하게는 삼투억제제를 포함한다. 상기 "관심 분자를 세포에 형질도입시키는 방법"을 또한 본 발명에서 "형질도입 방법" 또는 "형질도입을 위한 방법"이라 칭한다. 이들 용어는 동일한 방법을 지칭하는 것으로 호환가능하게 사용된다. 본 발명은 또한 염 및 형질도입 화합물을 포함하는 형질도입 완충제를 제공한다. 본 발명은 또한 염, 형질도입 화합물 및 임의로 삼투억제제 및/또는 세포 배양 배지를 포함하는 형질도입 완충제를 제공한다. 본 발명은 또한 관심 분자를 세포에 형질도입시키기 위한, 본 발명의 형질도입 완충제의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 유전자 변형, 예를 들어 특정한 표적 서열의 유전자 변형(또한 본 발명에서 "유전자 편집"이라 칭한다)을 위한 본 발명의 형질도입 완충제의 용도를 제공한다. 본 발명의 형질도입 화합물, 완충제 및 방법을 사용하여 세포에 도입시킬 수 있는 유전자 편집 시스템의 예는 일반적으로 뉴클레아제 활성, 예를 들어 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 단백질을 수반한다. 상기 뉴클레아제 활성은 상기 단백질의 야생형 버전 중에 존재하거나, 또는 예를 들어 융합 단백질을 생성시키는 재조합 방법에 의해 부가될 수도 있다. 본 발명의 형질도입 화합물, 완충제 및 방법을 사용하여 세포에 도입시킬 수 있는 유전자 편집 시스템의 예는 특정 서열을 "본질적으로" 표적화하는 단백질, 예를 들어 아연 집게 뉴클레아제(ZFN) 및 TALEN, 및 또한 예를 들어 CRISPR-Cas9 시스템, 캐스케이드 시스템, TtAgo 및 다른 아고너트 시스템의 일부로서 핵산을 사용하여 표적 서열로 "안내되는" 단백질(예를 들어 작은 안내 RNA[sgRNA] 또는 안내 DNA[gDNA]), 및 다른 FOKI-뉴클레아제 관련 단백질을 포함한다. "본질적으로"는 단백질이 그의 표적 서열에 도달하기 위해서 추가적인 안내 분자를 필요로 하지 않음을 의미한다. 본 발명은 또한 치료법에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 형질도입 완충제를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 형질도입 완충제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 관심 분자를 세포에 형질도입시키기 위한 삼투억제제의 용도를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 관심 분자를 세포에 형질도입시키기 위한 삼투억제제로서 글리신 및/또는 글리세롤의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 관심 분자를 세포에 형질도입시키기 위한, 본 발명에 개시된 바와 같은 형질도입 화합물, 예를 들어 비-세정성 베타인 또는 표 1에 개시된 임의의 화합물의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 관심 분자를 세포에 형질도입시키기 위한, 표 1 중에서 선택된 형질도입 화합물의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 하기의 화합물들: #10, #11, #16, #42, #34, #41, #40, #39, #33, #15, #11, #29, #36 및 #46(표 1에 넘버링된 바와 같이)을 제공한다. 본 발명은 또한 세포 중의 핵산, 예를 들어 유전자 서열의 변형 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 세포를 핵산을 변형시킬 수 있는 단백질 및 형질도입 완충제와 접촉시킴을 포함하고, 여기에서 상기 형질도입 완충제는 (i) 형질도입 화합물, (ii) 염 또는 나트륨-수소 수송체의 활성제/촉진제, 및 바람직하게는 (iii) 삼투억제제를 포함한다. 도 1: 오카다(Okada) 등에 의해 개시된 방법을 사용하는 Cre 리콤비나제 단백질 형질도입. (A) Cre 리콤비나제 리포터의 도식적 표현. CMV-Lox-Stop-Lox-eGFP 리포터가 쥐 ESC의 ColA1 유전자좌에 표적화되었다 ² . 세포내 CRE-리콤비나제는 상기 Stop 카세트를 절제하고 이에 의해 eGFP 발현을 유도한다. (B) 오카다의 방법을 사용하여 형질도입되지 않은 세포(좌측 패널)와 비교된 5 uM의 재조합 CRE 단백질(우측 패널)로 형질도입된 mESC의 FACS 플롯. 성공적으로 형질도입된 GFP-양성 세포의 백분율을 나타낸다. 도 2: 형질도입 펩타이드 도메인과 독립적인 단백질 형질도입 (A) 재조합 단백질의 도식적 표현. 재조합 단백질 중의 도메인들을 나타낸다: H6: 6x히스티딘 정제 태그; LFn: 안트락스 LF 단백질의 N-말단 형질도입 도메인; SUMO-1: 수모(Sumo) 절단 도메인; Oct4: 쥐 Oct4(Pou5f1) 단백질; VP16: VP16 전사촉진 도메인. (B) 본 연구에 사용된 루시페라제 리포터 구조물의 도식적 표현. 상부: Oct4 DNA 인식 서열의 6개의 나란한 반복부를 함유하는 Oct4-리포터. 중간: Oct4 결합 서열이 없는 대조용 구조물; 기부: 레닐라-루시페라제를 발현하는, 형질감염 효율을 모니터하기 위한 대조용 구조물. (C) 단백질 형질도입 분석의 타임라인의 도식적 묘사. (D) COS7 세포가 6xOCT4-TK-Luc 리포터에 의해 형질감염된 다음 단백질 형질도입되었다. 특이성 대조용은 빈 또는 OCT4 발현 렌티바이러스와 함께 TK-Luc 리포터(흑색 막대) 또는 6xOct4-TK-Luc(회색 막대)로 형질감염된 세포였다. 개똥벌레 루시페라제 활성이 동시-형질감염된 레닐라 루시페라제 구조물로 표준화되었다. PA; 보호 항원, LFn-매개된 형질도입에 필요한 보조-인자. (E) 본 연구에 사용된 OCT4 재조합 단백질의 도식적 표현. (F) COS7 세포가 6xOCT4-TK-Luc 리포터로 형질감염되었고 12시간 후에 도면에 나타낸 바와 같이 증가하는 농도에서 지시된 OCT4 단백질로 형질도입되었다. 개똥벌레 루시페라제 활성이 (D)에서와 같이 레닐라 루시페라제 구조물을 동시-형질감염시킴으로써 표준화되었다. 대조용으로서, 세포가 빈 및 OCT4 발현 렌티바이러스로 형질도입되었다(각각 "EV" 및 "OCT-4"). (G) COS7 세포가 OCT4-TK-Luc 리포터로 형질감염되었고 OCT4-VP16 단백질(흑색 막대 "+")로 또는 단백질 없이(백색 막대 "+") 형질도입되었다. 막대 AG는 형질도입 배지 - 하나의 성분하에서 OCT4-VP16 단백질로 형질도입된 세포들을 나타낸다. 개똥벌레 루시페라제 활성이 동시-형질감염된 레닐라 루시페라제 구조물로 표준화되었다. (H) 비-세정성 설포베타인 201(NDSB-201) 화합물의 구조. 도 3: 단백질 형질도입은 시간, 단백질 농도, 염-유발된 고장성 및 NDSB-201에 의존한다. (A) β-락타마제 리포터 분석의 도식적 개요. 비-형광성 CCF2/AM은 확산을 통해 세포막을 가로지르며 세포내 에스테르화(이는 또한 현재 CCF2라 칭하는 형광 성질을 활성화시킨다)를 통해 세포질에 포착된다. CCF2가 409 ㎚에서 여기시 520 ㎚에서 형광 신호를 방출한다(녹색 신호). 세포내 β-락타마제에 의한 CCF2의 절단은 남아있는 절단 산물의 방출 파장을 447 ㎚로 이동시킨다(청색 신호). 상기 녹색과 청색 신호간의 비는 (형질도입된) 세포내 β-락타마제의 양의 크기이다. (B) β-락타마제 리포터 분석. 쥐 배아섬유아세포(MEF)가 지시된 시간 동안 NaCl에 의해 유도된 700 mOsm/㎏의 오스몰랄 농도에서 1 μM β-락타마제 단백질, 25 mM NDSB-201로 형질도입되었다(짙은색 막대). 대조용 세포는 상기와 같이 처리되었으나, 등장성 배지(300 mOsm/㎏, 빈 원) 중에 있었다. (C) 3시간 동안 NaCl에 의해 유도된 700 mOsm/㎏ 오스몰랄 농도에서 증가하는 농도의 β-락타마제 단백질(지시된 바와 같은), 25 mM NDSB-201로 형질도입된 MEF상에서의 β-락타마제 리포터 분석(짙은색 막대). 대조용 세포는 상기와 같이 처리되었으나, 등장성 배지(300 mOsm/㎏, 빈 원) 중에 있었다. (D) 3시간 동안 NaCl에 의해 유도된 상이한 오스몰랄 농도에서 1 μM의 β-락타마제 단백질, 25 mM NDSB-201로 형질도입된 MEF상에서의 β-락타마제 리포터 분석(적색 막대). 대조용 세포는 상기와 같이 처리되었으나, 등장성 배지(300 mOsm/㎏, 빈 원) 중에 있었다. (E) NaCl에 의해 유도된 700 mOsm/㎏ 오스몰랄 농도에서 1 μM의 β-락타마제 단백질, 상이한 농도의 NDSB-201(지시된 바와 같은)로 형질도입된 MEF상에서의 β-락타마제 리포터 분석(적색 막대). 대조용 세포는 상기와 같이 처리되었으나, 등장성 배지(300 mOsm/㎏, 빈 원) 중에 있었다. 도 4: 형질도입 배지에의 삼투억제제의 첨가는 고장성-유도된 세포-주기 억제를 개선시킨다. (A) β-락타마제 분석(짙은색 막대) 및 세포 증식(BrdU 통합) 분석(백색 사각형). MEF가 상이한 오스몰랄 농도 및 시점(지시된 바와 같은)에서 25 mM NDSB-201과 함께 1 μM β-락타마제의 존재 또는 부재하에서 형질도입되었다. 300 mOsm/㎏에서 β-락타마제 단백질 없이 처리된 세포의 상대적인 β-락타마제 활성을 1로 정하였다. BrdU 통합 분석에 대해서, 처리되지 않은 세포 및 미토마이신 C 처리된 세포의 상대적인 BrdU 통합 값을 각각 100% 및 0%로 정하였다. (B) 세포 증식에 대한 삼투억제제의 효과의 분석. MEF는 NaCl로 조절된 700 mOsm/㎏에서 25 mM NDSB-201을 함유하는 형질도입 배지를 사용하여 1 μM β-락타마제로 형질도입되었거나(대조용, 좌측에서 세 번째 막대) 또는 지시된 삼투억제제의 첨가와 함께 동일한 조건에서 형질도입되었다. 처리되지 않은 세포(막대 #1) 및 미토마이신 C(막대 #2) 처리된 세포는 각각 100% 및 0%의 상대적인 Brdu 통합 값으로서 간주되었다. (C) 글리세롤 및 글리신의 병행 첨가는 MEF에서 형질도입 완충제-유도된 세포주기 억제를 개선시킨다. MEF는 30 mM의 글리세롤 및 15 mM의 글리신(+2G)의 첨가와 함께 지시된 바와 같이 β-락타마제로 또는 β-락타마제 없이 형질도입되었다. 300 mOsm/㎏에서 β-락타마제 단백질 없이 처리된 세포의 상대적인 β-락타마제 활성을 1로 정하였다. BrdU 통합 분석에 대해서, 처리되지 않은 세포 및 미토마이신 C 처리된 세포의 상대적인 Brdu 통합 값을 각각 100% 및 0%로 정하였다. (D) 쥐 ESC가 (C)에 개시된 바와 같이 형질도입되었다. (E) 쥐 ESC의 반복된 형질도입. mESC를 30 mM의 글리세롤 및 15 mM의 글리신을 첨가하여 500 mOsm/㎏에서 1 μM β-락타마제, 25 mM NDSB-201로 12시간(라운 1) 동안 형질도입시킨 다음 12-시간 회수 기간 및 두 번째 12시간 형질도입이 이어졌다. β-락타마제 형질도입 및 BrdU 통합이 지시된 바와 같이 각 라운드의 형질도입 후에 측정되었다. 300 mOsm/㎏에서 β-락타마제 단백질 없이 처리된 세포의 상대적인 β-락타마제 활성을 1로 정하였다. BrdU 통합 분석에 대해서, 처리되지 않은 세포 및 미토마이신 C 처리된 세포의 상대적인 Brdu 통합 값을 각각 100% 및 0%로 정하였다. 실시예 5: 단백질 형질도입이 대음세포작용에 의해 매개되고 대음세포작용 유도제 및 마크로피노솜 탈출의 촉진제에 의해 증대된다. (A) 상이한 고장성 화합물들의 형질도입 활성의 분석. MEF가 지시된 바와 같이 상이한 화합물들에 의해 유도된 700 mOsm/㎏의 오스몰랄 농도에서 1 μM β-락타마제 단백질(짙은색 막대, NDSB에 의한 형질도입, 빈 원, NDSB-201 부재하에서의 대조용 형질도입), 및 30 mM 글리세롤 및 15 mM 글리신의 첨가로 3시간 동안 형질도입되었다. 등장성 배지에서 상대적인 β-락타마제 단백질 흡수(좌측 막대)를 1로 정하였다. (B) 상이한 식작용 경로의 억제제들의 효과의 분석. MEF가 지시된 바와 같이 클라트린-매개된 세포이물흡수(핏스탑2 및 클로르프로마진), 카베올린-매개된 세포이물흡수(다이나소어 및 니스타틴), 대음세포작용(5-(N-에틸 N-아이소프로필)-아밀로라이드(EIPA), 또는 5-(N,N-다이메틸)아밀로라이드 하이드로클로라이드(DMA)) 또는 액틴 중합(사이토칼라신D 및 라트런컬린 A)의 소분자 억제제의 존재하에서 25 mM NDSB201, 30 mM의 글리세롤 및 15 mM의 글리신을 함유하는 형질도입 완충제 중의 700 mOsm/㎏의 NaCl 조절된 오스몰랄 농도에서 1 μM β-락타마제 단백질로 3시간 동안 형질도입되었다. 등장성 배지에서 상대적인 β-락타마제 단백질 흡수(좌측 막대)를 1로 정하였다. (C) 단백질 형질도입에서 Nhe1의 역할. MEF는 야생형, Nhe1 이종접합성(+/-) 및 Nhe1 녹아웃(-/-) 배아로부터 단리되었고 25 mM NDSB201, 30 mM의 글리세롤 및 15 mM의 글리신을 함유하는 형질도입 완충제 중의 700 mOsm/㎏의 NaCl 조절된 오스몰랄 농도에서 1 μM β-락타마제 단백질로 3시간 동안 형질도입되었다. 야생형 세포의 상대적인 형질도입을 100%로 정하고 등장성 배지에서 야생형 세포에 의한 β-락타마제 통합(좌측 막대)을 0%로 정하였다. (D) MEF의 단백질 형질도입에 대한 성장 인자 및 마크로피노솜 탈출의 펩타이드 촉진제의 효과. MEF는 지시된 성장 인자(좌측으로부터 3 내지 10개 막대) 또는 상이한 농도의 dTAT-HA2 융합유도 펩타이드(좌측으로부터 11 내지 13 막대)의 존재하에서 25 mM NDSB201, 30 mM의 글리세롤 및 15 mM의 글리신을 함유하는 형질도입 완충제 중의 700 mOsm/㎏의 NaCl 조절된 오스몰랄 농도에서 1 μM β-락타마제 단백질로 3시간 동안 형질도입되었다. 등장성 배지에서 상대적인 β-락타마제 단백질 흡수(좌측 막대)를 1로 정하였다. 빈 원은 상기 형질도입된 세포에 의한 상대적인 BrdU 통합을 가리킨다. 형질도입되지 않은 세포의 BrdU 통합을 100%로 정하고 미토마이신 C-처리된 세포의 BrdU 통합을 0%로 정하였다. (E) 쥐 ESC의 단백질 형질도입에 대한 성장 인자 및 마크로피노솜 탈출의 펩타이드 촉진제의 효과. MEF는 지시된 성장 인자(좌측으로부터 3 내지 8개 막대) 또는 상이한 농도의 dTAT-HA2 융합유도 펩타이드(좌측으로부터 9 내지 11 막대)의 존재하에서 25 mM NDSB201, 30 mM의 글리세롤 및 15 mM의 글리신을 함유하는 형질도입 완충제 중의 500 mOsm/㎏의 NaCl 조절된 오스몰랄 농도에서 1 μM β-락타마제 단백질로 12시간 동안 형질도입되었다. 등장성 배지에서 상대적인 β-락타마제 단백질 흡수(좌측 막대)를 1로 정하였다. 빈 원은 상기 형질도입된 세포에 의한 상대적인 BrdU 통합을 가리킨다. 형질도입되지 않은 세포의 BrdU 통합을 100%로 정하고 미토마이신 C-처리된 세포의 BrdU 통합을 0%로 정하였다. 도 6: 단백질 형질도입 화합물의 구조-활성 관계. (A) 상부 패널. 시험된 형질도입 화합물의 화학 구조. 기부 패널. 상이한 형질도입 화합물을 사용하는 β-락타마제 및 BrdU 통합 분석. MEF는 30 mM의 글리세롤 및 15 mM의 글리신 및 25 mM의 지시된 형질도입 화합물을 함유하는 형질도입 완충제 중의 700 mOsm/㎏의 NaCl 조절된 오스몰랄 농도에서 1 μM β-락타마제 단백질로 3시간 동안 형질도입되었다. 기준 화합물(NDSB201, #01)의 β-락타마제 통합을 100%로 정하였다. 빈 원은 상기 형질도입된 세포에 의한 상대적인 BrdU 통합을 가리킨다. 형질도입되지 않은 세포의 BrdU 통합을 100%로 정하고 미토마이신 C-처리된 세포의 BrdU 통합을 0%로 정하였다. (B) 상부 패널. 첫 번째 열: 설폰기를 갖는 화합물들의 예. 두 번째 열: 카복시기를 갖는 화합물들의 예. 세 번째 열: 아미드기를 갖는 화합물들의 예. 네 번째 열: 2차 아미드기를 갖는 화합물들의 예. 다섯 번째 열: 3차 아미드기를 갖는 화합물들의 예. 기부열은 생물등배전자체 변체 및 이량체 변체를 함유하는 추가적인 변체들이다. 기부 패널. 상이한 형질도입 화합물을 사용하는 β-락타마제 및 BrdU 통합 분석. MEF는 30 mM의 글리세롤 및 15 mM의 글리신 및 25 mM의 지시된 형질도입 화합물을 함유하는 형질도입 완충제 중의 700 mOsm/㎏의 NaCl 조절된 오스몰랄 농도에서 1 μM β-락타마제 단백질로 3시간 동안 형질도입되었다. 기준 화합물(NDSB201, #01)의 β-락타마제 통합을 100%로 정하였다. 빈 원은 상기 형질도입된 세포에 의한 상대적인 BrdU 통합을 가리킨다. 형질도입되지 않은 세포의 BrdU 통합을 100%로 정하고 미토마이신 C-처리된 세포의 BrdU 통합을 0%로 정하였다. (C) 상부 패널. 좌측 컬럼의 화합물들은 아민 및 설포네이트 또는 카복시기를 함유한다. 가운데 컬럼은 아민기 없이 좌측에서와 동일한 화합물들을 나타낸다. 우측 컬럼은 설포네이트 또는 카복시기 없이 좌측에서와 동일한 화합물들을 나타낸다. 기부 패널. 상이한 형질도입 화합물을 사용하는 β-락타마제 및 BrdU 통합 분석. MEF는 30 mM의 글리세롤 및 15 mM의 글리신 및 25 mM의 지시된 형질도입 화합물을 함유하는 형질도입 완충제 중의 700 mOsm/㎏의 NaCl 조절된 오스몰랄 농도에서 1 μM β-락타마제 단백질로 3시간 동안 형질도입되었다. 기준 화합물(NDSB201, #01)의 β-락타마제 통합을 100%로 정하였다. 빈 원은 상기 형질도입된 세포에 의한 상대적인 BrdU 통합을 가리킨다. 형질도입되지 않은 세포의 BrdU 통합을 100%로 정하고 미토마이신 C-처리된 세포의 BrdU 통합을 0%로 정하였다. (D) 상부 패널. 탄소-쇄 길이의 역할의 분석. 2개의 형질도입 화합물(#1 및 #20, 회색 영역)의 예 및 이들의 탄소-쇄 길이 변화를 나타낸다. 기부 패널. 상부 패널에 나타낸 형질도입 화합물을 사용하는 β-락타마제 및 BrdU 통합 분석. MEF는 30 mM의 글리세롤 및 15 mM의 글리신 및 25 mM의 지시된 형질도입 화합물을 함유하는 형질도입 완충제 중의 700 mOsm/㎏의 NaCl 조절된 오스몰랄 농도에서 1 μM β-락타마제 단백질로 3시간 동안 형질도입되었다. 기준 화합물(NDSB201, #01)의 β-락타마제 통합을 100%로 정하였다. 빈 원은 상기 형질도입된 세포에 의한 상대적인 BrdU 통합을 가리킨다. 형질도입되지 않은 세포의 BrdU 통합을 100%로 정하고 미토마이신 C-처리된 세포의 BrdU 통합을 0%로 정하였다. (E) MEF에서 β-락타마제 단백질 형질도입시 45개의 상이한 형질도입 화합물들의 형질도입 활성 및 BrdU 통합. MEF는 30 mM의 글리세롤 및 15 mM의 글리신 및 25 mM의 지시된 형질도입 화합물을 함유하는 형질도입 완충제 중의 700 mOsm/㎏의 NaCl 조절된 오스몰랄 농도에서 1 μM β-락타마제 단백질로 3시간 동안 형질도입되었다. 기준 화합물(NDSB201, #01)의 β-락타마제 통합을 100%로 정하였다. 빈 원은 상기 형질도입된 세포에 의한 상대적인 BrdU 통합을 가리킨다. 형질도입되지 않은 세포의 BrdU 통합을 100%로 정하고 미토마이신 C-처리된 세포의 BrdU 통합을 0%로 정하였다. (F) 전체 단백질 형질도입 활성에 대한 상이한 형질도입 화합물들의 병용 효과. MEF는 30 mM의 글리세롤 및 15 mM의 글리신 및 완충제 중의 형질도입 화합물의 최종 농도가 25 mM이 되도록 하는 동몰량의 지시된 형질도입 화합물을 함유하는 형질도입 완충제 중의 700 mOsm/㎏의 NaCl 조절된 오스몰랄 농도에서 1 μM β-락타마제 단백질로 3시간 동안 형질도입되었다. 기준 화합물(NDSB201, #01)의 β-락타마제 통합을 100%로 정하였다. 빈 원은 상기 형질도입된 세포에 의한 상대적인 BrdU 통합을 가리킨다. 형질도입되지 않은 세포의 BrdU 통합을 100%로 정하고 미토마이신 C-처리된 세포의 BrdU 통합을 0%로 정하였다. (G) 단백질 형질도입에 대한 GABA 수용체 작용물질의 평가. MEF는 30 mM의 글리세롤 및 15 mM의 글리신 및 25 mM의 NDSB201 + 지시된 GABA 작용물질을 함유하는 형질도입 완충제 중의 700 mOsm/㎏의 NaCl 조절된 오스몰랄 농도에서 1 μM β-락타마제 단백질로 3시간 동안 형질도입되었다. 기준 화합물(NDSB201, #01)의 β-락타마제 통합을 100%로 정하였다. 빈 원은 상기 형질도입된 세포에 의한 상대적인 BrdU 통합을 가리킨다. 형질도입되지 않은 세포의 BrdU 통합을 100%로 정하고 미토마이신 C-처리된 세포의 BrdU 통합을 0%로 정하였다. 표 1: 형질도입 화합물들 이들의 단백질 형질도입 활성 및 형질도입 완충제에서 세포 증식에 대한 효과의 목록. 첫 번째 컬럼: 형질도입 화합물 번호; 두 번째 컬럼: 형질도입 화합물의 화학 구조; 세 번째 컬럼: 상대적인 β-락타마제 단백질 형질도입 활성; 네 번째 컬럼: β-락타마제 형질도입 후 24시간째의 상대적인 BrdU 통합. MEF는 30 mM의 글리세롤 및 15 mM의 글리신 및 25 mM의 지시된 형질도입 화합물을 함유하는 형질도입 완충제 중의 700 mOsm/㎏의 NaCl 조절된 오스몰랄 농도에서 1 μM β-락타마제 단백질로 3시간 동안 형질도입되었다. 기준 화합물(NDSB201, #01)의 β-락타마제 통합을 100%로 정하였다. 빈 원은 상기 형질도입된 세포에 의한 상대적인 BrdU 통합을 가리킨다. 형질도입되지 않은 세포의 BrdU 통합을 100%로 정하고 미토마이신 C-처리된 세포의 BrdU 통합을 0%로 정하였다. 도 7: mES 세포에서 Cre 단백질 형질도입. (A) Cre 리콤비나제 리포터의 도식적 표현. CMV-Lox-Stop-Lox-eGFP 리포터가 쥐 ESC의 ColA1 유전자좌에 표적화되었다 ² . 세포내 CRE-리콤비나제는 상기 Stop 카세트를 절제하고 이에 의해 eGFP 발현을 유도한다. (B) 상이한 농도에서 수회 라운드의 형질도입에 의해 CRE로 형질도입된 상부 mES 세포에 대해 나타내는 FACS 밀도 플롯. 하부 패널은 상이한 농도의 융합유도 펩타이드와 함께 5 uM의 CRE 단백질로 형질도입된 mES 세포를 나타낸다. CFP 채널로부터의 신호가 자발형광에 대한 대조용으로서 사용되었다. (C) (B)에 개시된 바와 같은 2회 라운드의 CRE 형질도입된 샘플의 현미경 상. 점선은 각 콜로니의 경계를 가리킨다. (D) (C)에 나타낸 샘플의 세포 증식 곡선. 상부 & 기부 그래프. 2일 후에, 형질도입된(백색 원) 또는 형질도입되지 않은(회색 막대) 세포를 매일 카운트하여 세포 증식 곡선을 작성하였다. (E) (C)에 나타낸 샘플의 형질도입되지 않은 및 형질도입된 mES 세포의 다능성 유전자 발현의 qRT-PCR 분석. GAPDH가 로딩 대조용으로서 사용되었다. (F) 형질도입된 mESC의 다능성을 시험하기 위해서 7B의 실험으로부터 이중-형질도입된 GFP+ESC를 숙주 배반포 배아에 주사하고 거짓임신 양육 마우스에 이식하였다. 도 7F에 도시된 바와 같이, 이중-형질도입된 mESC는, Tat-HA2 융합 펩타이드의 부재(7F, 상부 패널) 및 존재(도 7F, 하부 패널)하에서의 형질도입 모두에서 키메라 형성에 효율적으로 기여하였다. 도 8: 인간 유도된 다능성 줄기세포(iPSC)에서의 CRE 단백질 형질도입. (A) CRE 리콤비나제 리포터의 도식적 묘사. EF1a-Lox-dsRED-Stop-Lox-EGFP/ires-PuroR 구조물이 렌티바이러스 감염 및 후속의 퓨로마이신 선택을 통해 인간 iPSC에 도입되었다. 수득된 세포는 렌티바이러스 리포터 구조물의 다수의 사본을 함유한다. 형질도입되지 않은 세포는 적색 형광 단백질을 발현한다. LoxP-인접된 dsRED-STOP 카세트의 CRE-매개된 절제는 dsRed 발현을 방해하고 EGFP 리포터 단백질의 발현을 유도한다. (B) 상부 패널. Cre 형질도입된 인간 iPSC의 FACS 밀도 플롯. x-축은 GFP 신호를 도시하고 y-축은 dsRED 신호를 도시한다. 인간 iPSC는 나타낸 바와 같이 CRE 단백질 또는 CRE 단백질 + 융합유도 펩타이드로 형질도입되었다. 우측 패널은 수회 라운드의 형질도입을 도시한다. 대조용은 CRE 단백질 부재하에서 형질도입 배지와 배양된 세포였다. 기부 패널. 상부 밀도 플롯 패널의 막대그래프를 도시한다. 또한, 전체 세포 집단에 대한 GFP 양성 세포의 정량분석을 도시한다. (C) (B)에서와 같이 형질도입된 인간 iPSC의 전형적인 형광 및 위상차 상. 상부 열 및 중간 열은 각각 적색 및 녹색 형광 채널을 가리킨다. 하부 열은 위상차 채널을 도시한다. 도 9: 상이한 신경세포 유형에서 Cre 단백질 형질도입 (A) CRE 리콤비나제 리포터의 도식적 묘사. EF1a-Lox-dsRED-Stop-Lox-EGFP/ires-PuroR 구조물이 렌티바이러스 감염 및 후속의 퓨로마이신 선택을 통해 나타낸 바와 같이 신경 선조세포 및 인간 iPSC 및 이들의 유도된 신경 유도체에 도입되었다. 수득된 세포는 렌티바이러스 리포터 구조물의 다수 사본을 함유한다. 형질도입되지 않은 세포는 적색 형광 단백질을 발현한다. LoxP-인접된 dsRED-STOP 카세트의 CRE-매개된 절제는 dsRed 발현을 방해하고 EGFP 리포터 단백질의 발현을 유도한다. (B) CRE 단백질로 형질도입되거나 또는 형질도입되지 않은 채로 있는 상이한 세포 유형들의 전형적인 형광 상. 도 10: 형질도입 시간 및 배지 긴장성을 최적화하기 위한 다중-웰 셋업의 도식적인 표현 도 11: 형질도입 완충제는 mES 세포에서 DNA-지질 형질감염을 증대시킨다. 쥐 배아 줄기세포내로의 플라스미드 DNA 발현 벡터의 통합에 대한 유식 세포측정 분석. 적색 형광 단백질(RFP)이 성공적인 통합 후 상기 발현 벡터로부터 발현된다. 몇몇 쥐 배아 줄기세포주는 양이온성 지질에 의한 표준 플라스미드 형질감염에 탄력적이다. 좌측 패널: 제조사의 프로토콜에 따라 리포펙타민 LTX(라이프 테크놀로지스)를 사용하여 RFP 발현 플라스미드로 형질감염시킨 mESC. 세포는 유식 세포측정을 사용하여 RFP 발현에 대해 분석되었다. 우측 패널: 상기 플라스미드 DNA/리포펙타민 LTX 형질감염 혼합물에 형질도입 완충제의 첨가는 상기 쥐 ESC 내로의 리포터 DNA의 효율적인 형질감염을 생성시킨다. y축은 적색 채널 형광을 나타내고 x축은 녹색 채널 형광을 나타낸다. 도 12: 형질도입 완충제를 사용하는 DNA 및 단백질의 이중 통합. 쥐 배아 줄기세포내로의 플라스미드 DNA 발현 벡터의 통합에 대한 유식 세포측정 분석. 적색 형광 단백질(RFP)이 성공적인 통합 후 상기 발현 벡터로부터 발현된다. 또한 Lox-Stop-Lox-GFP 리포터 쥐 ES 세포내로의 Cre 리콤비나제 단백질의 형질도입은 상기 GFP 리포터 유전자의 활성화를 생성시킨다. 좌측에서부터 우측으로(FACS 패널 상에 나타낸 바와 같이): Cre 리콤비나제 단백질 또는 RFP 리포터 플라스미드 DNA 없이 12시간 동안 배양된 형질도입 완충제 하에서의 대조용 mES Lox-Stop-Lox-GFP 세포; 5 uM Cre 리콤비나제 단백질; 적색 형광 단백질(RFP) 리포터 유전자를 함유하는 플라스미드 DNA; 및 RFP-DNA/지질 복합체와 함께 5 uM CRE 단백질. y축은 적색 채널 형광을 나타내고 x축은 녹색 채널 형광을 나타낸다. 도 13: 형질도입 완충제는 인간 iPS 세포에서 바이러스 통합을 증대시킨다. 인간 iPS 세포가 적색 형광 단백질(RFP)을 발현하는 렌티바이러스 입자로 형질도입되었다. FACS 패널은 처리되지 않은(대조용) 인간 iPS 세포(좌측 패널); 적색 형광 단백질(RFP)을 발현하는 렌티바이러스 입자로 12시간 동안 형질도입된 세포(가운데 패널); 및 1x 형질도입 완충제의 존재하에서 RFP를 발현하는 렌티바이러스 입자로 12시간 동안 형질도입된 세포(완충제 12/500, 우측 패널)를 나타낸다. y축은 적색 채널 형광을 나타내고 x축은 녹색 채널 형광을 나타낸다. 도 14: 인간 iPS 세포에서 TALEN 단백질에 의해 매개된 HPRT 유전자 붕괴 남성 인간 iPS 세포가 X 염색체상의 HPRT 유전자를 표적화하는 TALEN 단백질 쌍으로 형질도입되었다. 야생형(WT) 서열을 밑줄 친 표적 TALEN 절반-부위와 함께 상부에 나타낸다. TALEN 형질도입시, 6TG-내성 iPSC 클론을 단리하고 상기 TALEN 표적 부위에서 결실에 대해 분석하였다. 결실은 청색 대시선으로 나타낸다. 결실(D)의 크기는 각 돌연변이된 부위의 좌측에 나타낸다. 돌연변이 빈도는 식별된 돌연변이수를 분석된 서열의 총수로 나누어 계산된다. 도 15: 폴리사카라이드 덱스트란 및 단백질의 동시-형질도입 A: 형질도입 완충제가 단백질 및 대세포의 동시적인 형질도입을 허용하는지의 여부를 평가하기 위해서, 우리는 GFP-발현 쥐 배아섬유아세포(MEF)에 의한 TMR-덱스트란(적색) 및 형광 표지된 BSA 단백질(청록색)의 대음세포작용 매개된 흡수를 분석하였다. B: 대음세포작용 억제제, EIPA(에틸아이소프로필아밀로라이드)는 TMR-덱스트란 또는 BSA 단백질의 흡수를 억제한다. 핵은 훽스트(Hoescht)33342(청색)로 염색되었다. 도 16: NDSB-201 및 GABA 분자는 마크로피노솜 소낭 누출을 유도한다. (A) 좌측 패널. GAL3-GFP 리포터 분석의 도식적인 표현. 형질도입의 개시시, 세포외 적용된 단백질을 마크로피노솜(회색 소낭)에 용해시킨다. 상기 마크로피노솜 막의 세포내 붕괴는 상기 마크로피노솜 내용물을 세포질로 방출시킨다. 동시에, 상기 손상된 마크로피노솜막은 이제 시토솔 GAL3-GFP 단백질의 진입을 허용하며, 상기 단백질은 상기 마크로피노솜내 탄수화물에 결합하고 축적되어 밝은 형광 신호(백색 소낭)를 생성시킨다. 우측 패널. GAL3-GFP 세포는 대음세포작용 억제제 EIPA의 존재 또는 부재하에 700 mOsmol/㎏에서 형질도입 배지와 함께 배양되었다. 처리되지 않은 세포는 음성 대조용으로서 포함되었다. 형질도입 조건(중간 패널)하에서, GAL3-GFP는 상기 손상된 마크로피노솜 중에 축적됨이 주목된다. (B) 단백질 형질도입 활성, 대음세포작용 및 NDSB-201의 마크로피노솜 소낭 방출의 측정 및 유도체 화합물의 예. 세포는 나타낸 바와 같이 상이한 형질도입 화합물들과 함께 700 mOsmol/㎏에서 형질도입 완충제와 배양되거나 처리되지 않은 채로 있다. 좌측 패널. MEF 세포에서 상대적인 β-락타마제 단백질 통합. 처리되지 않은 세포로부터의 신호를 1로 정하였다. 중간 패널. 대음세포작용 수준이 이전과 같이 처리된 세포에서 TMR덱스트란 통합에 의해 측정되었다. 대음세포작용 수준이 세포당 덱스트란 양성 소낭의 전체 면적을 측정함으로써 측정되었다. 우측 패널. Gal3-GFP MEF 세포가 이전과 같이 처리되었다. 소낭 누출 수준이 세포당 Gal3-GFP 양성 소낭의 전체 면적을 측정함으로써 측정되었다. 도 17: 인간 세포에서 siRNA 형질도입에 의해 유도된 내인성 유전자 녹다운. KBM7 및 MCF7 세포가 25 uM의 GAPDH 및 스크램블드 siRNA에 의해 형질도입되거나 처리되지 않은 채로 있었다. 3일의 형질도입 후에 GAPDH 단백질 수준이 웨스턴 블럿에 의해 측정되었다. 튜불린 단백질 수준을 로딩 대조용으로서 나타낸다. 도 18: 재조합 Cas9 단백질 및 짧은 안내 RNA(sgRNA)의 동시적인 형질도입을 사용하는 유전자 편집. (A) 상이한 농도의 NaCl 및 NDSB-201(화합물 #01) 또는 GABA(화합물 #20)에서 재조합 Cas9 단백질의 용해도 시험. 단백질 응집을 반-정량적인 비탁 분석에 의해 측정하였다. 수정같이 맑은 용액(cas9 단백질 응집이 없음)을 백색 사각형으로 나타낸다. Cas9 응집체에 의해 유발된 탁한 용액은 회색 사각형으로 묘사된다. (B) BrdU 통합률이 상이한 시점에서 NDSB-201 또는 GABA를 갖는 오스모사이토시스(osmocytosis) 완충제와 함께 배양된 KBM7 세포에서 측정되었다. 처리되지 않은 세포는 100%의 BrdU 통합으로서 간주되었다. (C) 상부 패널. CRE 리콤비나제 리포터의 도식적 묘사. EF1a-Lox-dsRED-Stop-Lox-EGFP/ires-PuroR 구조물이 렌티바이러스 감염 및 후속의 퓨로마이신 선택을 통해 KBM7 세포에 도입되었다. 수득된 세포는 렌티바이러스 리포터 구조물 다수 사본을 함유한다. 형질도입되지 않은 세포는 적색 형광 단백질을 발현한다. 상기 LoxP-인접된 dsRED-STOP 카세트의 CRE-매개된 절제는 dsRed 발현을 방해하고 EGFP 리포터 단백질의 발현을 유도한다. 기부 패널. 60분 동안 250 mM GABA(화합물 #20)와 함께 1250 mOsmol/㎏에서 오스모사이토시스 배지와 CRE 단백질로 형질도입된 KBM7 세포. 상부 패널은 녹색 및 적색 채널의 형광 사진을 나타낸다. 기부 패널은 x축에서 녹색 형광 및 y축에서 적색 형광 또는 사건의 빈도를 도시하는 FACS 플롯을 나타낸다. 사건의 백분율이 상응하는 면적으로 묘사된다. (D) 상부 패널. 20 nt의 안내 서열 및 80 nt의 스캐폴드 서열을 함유하는 시험관내 전사된 작은 안내 RNA의 도식적 표현. 기부 패널. 재조합 정제된 CAS9 단백질의 단백질 젤. (E) CRISPR-CAS9 리포터 시스템의 도식적 표현. KBM7 세포가 CRISPR-CAS 표적 서열에 이어서 dTomato 유전자의 프레임밖 서열을 함유하는 렌티바이러스 벡터로 형질되입되었다. 표적 서열의 CRISPR-CAS9 유도된 DNA 이중가닥 절단에 이은 비-상동-단부-결합(NHEJ) 수복은 DNA 결실 및/또는 삽입을 유도하며, 이는 상기 dTomato 판독 프레임을 복구하고 세포 형광을 유도한다. (F) CRISPR-CAS9 리포터 KBM7 세포가 CAS9 단백질 및 표적-상 sgRNA로 형질도입되거나 처리되지 않은 채로 있었다. 세포를 CAS9 단백질 및 표적-밖 sgRNA로 형질도입시킴으로써 특이성 조절이 수행되었다. dTomato-양성 세포의 백분율이 유식-세포측정 분석에 의해 측정되었다. 기부 패널은 지시된 조건에 대한 위상차 및 형광 상을 도시한다. 도 19: CRISPR-CAS9 형질도입에 의해 유도된 내인성 유전자 붕괴. (A) WDR85 유전자 및 5개의 상이한 sgRNA의 결합 부위의 도식. (B) CAS9-sgRNA 형질도입 및 디프테리아 독소 선택의 도식적 묘사. KBM7 세포가 CAS9-sgRNA로 2회 형질도입되었다. 7일의 최종 라운드의 형질도입 후에 세포가 디프테리아 독소 단백질 성분들(PA; 보호 항원 및 LFn-DTA; 디프테리아 독소에 융합된 치사 인자 n-말단 도메인)과 함께 배양되었다. 막대 그래프는 2일의 디프테리아 독소 선택 후 생육 가능한 세포수를 도시한다. (C) KBM7 세포 중의 내인성 WDR85 유전자에서의 CRISPR-CAS9-유도된 돌연변이의 DNA 서열. 야생형(WT) 서열이 상부에 도시된다. 개시 코돈은 밑줄 친 ATG로 나타낸다. 결실은 대시선에 의해 삽입은 밑줄에 의해 나타낸다. 삽입(+) 또는 결실(D)의 크기는 각각의 돌연변이된 부위의 우측에 나타낸다. 각각의 돌연변이체가 단리된 횟수를 괄호안에 나타낸다. 다수의 표적 서열에 대해서, 우리는 또한 CRISPR/CAS9 표적 부위의 서열 이상으로 연장되는 보다 큰 결실 및/또는 삽입을 식별하였음에 주목한다. (D) 상부 패널. CAS9-sgRNA 형질도입에 의한 이중대립유전자 녹아웃을 정량분석하는 도식적 표현. KBM7 세포가 CAS-sgRNA로 2회 형질도입되었다. 3일 후에 세포가 유식 세포계를 사용하여 384-웰내로 단세포 침착에 의해 단리되었다. 7일 후에 성장하는 클론이 카운트되고 디프테리아 독소로 처리되었다. 2일 후에 디프테리아 독소 생존 클론이 카운트되었다. WDR85 녹아웃 효율이 최초로 수득된 전체 단세포 클론에 대한 디프테리아 독소 생존 클론의 백분율로서 계산되었다. 기부 패널. 디프테리아 독소 생존 클론의 DNA 서열. A1 = 대립유전자 1 및 A2 = 대립유전자 2. 삽입(+) 또는 결실(D)의 크기는 각각의 돌연변이된 부위의 우측에 나타낸다. 각각의 돌연변이체가 단리된 횟수를 괄호안에 나타낸다. 다수의 표적 서열에 대해서, 우리는 또한 CRISPR/CAS9 표적 부위의 서열 이상으로 연장되는 보다 큰 결실 및/또는 삽입을 식별하였음에 주목한다. 형질도입은 외부 환경으로부터 세포내로의 분자의 내면화이다. 소수의 단백질 및 펩타이드는 세포막을 침투할 수 있는 본래의 성질을 갖는다. 다른 단백질들은, 상기 세포의 환경 조건을 변경시키거나 관심 단백질을 형질도입을 위해 변형시킴으로써 상기 단백질들에 부여되는 형질도입 성질을 가질 수 있다. 본 발명은 세포내로의 분자의 형질도입을 위한 개선된 방법 및 완충제를 제공한다. 특히 본 발명은 분자를 변형시킬 필요 없이, 세포 생육력을 최소로 상실시키면서, 세포에 분자를 효율적으로 형질도입시키는 신규의 완충제 조성물을 제공한다. 구체적으로, 발명자들은 염, 형질도입 화합물 및 바람직하게는 삼투억제제를 포함하는 형질도입 완충제가 놀랍게도 단백질 및 다른 분자의 세포내로의 효율적인 흡수를 허용함을 발견하였다. 발명자들은 iPS 세포를 생성시킬 목적으로, 세포 투과성 펩타이드(CPP)로 태그된 OCT4의 줄기세포 내로의 수송 효율을 개선시키고자 하였다. 이들은 뜻밖에도 상기 CPP 태그가 제거될 수 있고 효율적인 형질도입이 여전히 발생할 수 있는 만큼 많이, 단백질 안정제와 함께 염을 함유하는 형질도입 완충제로 놀랍게 양호한 효율을 성취할 수 있음을 발견하였다. 발명자들은 형질도입 수준을 또한 삼투억제제의 첨가에 의해 개선시킬 수 있음을 발견하였는데, 상기억제제는 형질도입 효율을 증가시키며 또한 형질도입된 세포의 생육력 및 계속되는 증식을 증가시킨다. 이들은 상기 방법이 일련의 크기, 전하 및 기능을 갖는 다른 분자들, 예를 들어 소분자, 핵산 및 단백질에 대해서도 실행됨을 입증하였다. 이들은 또한 상기 방법이 시험된 모든 세포 유형들, 예를 들어 다양한 1차 세포, 줄기 세포주 및 이들의 유도체내로의 형질도입에도 실행됨을 설명하였다. 더욱 또한, 이들은 상기 형질도입 완충제를 생체내에서, 특히 점도 증가제가 상기 형질도입 완충제에 첨가되는 경우 사용할 수 있음을 고려한다. 따라서 상기 완충제는 시험관내 및 생체내 모두에서 일련의 세포내로 일련의 분자를 형질도입시키기 위한 다수의 용도를 갖는다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 발명자들은 염 및 형질도입 화합물(하기에 정의되는 바와 같은)의 조합을 포함하는 형질도입 완충제가 대음세포작용 경로를 활성화시킴을 가정한다. 이러한 가정은 대체 수송 경로(실시예 참조)의 억제를 수반하는 발명자들의 다수의 실험들에 의해 지지된다. 예를 들어, 상기 가정은 실시예 14에 의해 지지되는데, 상기 실시예는 갈렉틴3-GFP 수송체 시스템의 용도를 개시하고 단백질 형질도입 중 마크로피노솜 소낭 누출을 설명한다. 따라서 실시예 14는 본 발명에 개시된 형질도입 완충제가, 형질도입된 관심 분자를 시토솔내로 방출시키는 대음세포작용 및 마크로피노솜 소낭 누출의 유도에 의해 단백질 및 다른 분자의 흡수를 촉진함을 암시한다. 대음세포작용은 클라트린의 독립성 및 0.2 내지 1 ㎛ 범위 직경의 비교적 큰 크기의 소낭의 형성을 특징으로 하는 유동상 세포이물흡수의 한 유형이다. 소수의 특정 마커들에 의해 일반적으로 불충분하게 특성화되었음에도 불구하고, 대음세포작용은 수지상 세포에서 면역 감시에 중요한 것으로 입증되었다. 다른 유형의 세포에서, 대음세포작용은 낮은 자발적 비율로 발생하지만 성장 인자에 반응하여 빠르게 유도된다. 면역계 밖의 세포에서 대음세포작용의 기능은 여전히 알기 어렵다. 발명자들은 그들의 형질도입 완충제가 대음세포작용 경로를 활성화하고 상기 경로에 의한 분자의 세포내로의 흡수를 촉진함을 가정한다. 상기 완충제는 또한 분자의 엔도솜으로부터 세포 시토솔내로의 방출을 촉진한다. 상기 염은 2가지 역할을 수행하는 것으로 가정된다, 즉 첫째로 상기 염은 고오스몰랄 농도를 발생시키고 둘째로 대음세포작용에 관련된 핵심 막 수송 단백질에 결합하여 이를 활성화시킨다. 상기 형질도입 화합물은 관심 단백질 또는 다른 분자의 소낭내로의 흡수를 촉진하는 것으로 생각된다. 상기 화합물은 또한 상기 관심 분자의 고유 구조 및 안정성을 유지시키고 추정상 상기 대음세포작용성 소낭으로부터의 세포내 방출을 돕는 것으로 생각된다. 상기 염과 상기 형질도입 화합물과의 조합은 효율적인 형질도입에 중요한 것으로 보인다. 우리가 아는 한, 상기 조합은 단백질 또는 다른 분자의 세포내로의 형질도입을 자극하기 위해 앞서 사용된 적이 없다. 형질도입 방법 본 발명은 관심 분자의 세포내로의 형질도입 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 세포를 상기 관심 분자와 접촉시키고 상기 세포를 염 및 형질도입 화합물을 포함하는 형질도입 완충제와 접촉시키는 단계들을 포함한다. 상기 관심 분자 및 형질도입 완충제를 상기 세포와 함께, 동시에, 연속적으로, 또는 별도로 임의의 순서로 접촉시킨다. 바람직한 실시태양에서, 이들을 동시에(예를 들어 상기 조합을 함유하는 용기로부터) 투여한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 상기 관심 분자를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 형질도입 완충제와 상기 관심 분자를 혼합시키는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 형질도입에 앞서 상기 세포를 수득하고/하거나 배양 배지에서 유지시키는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포를 형질도입에 앞서, 특정 세포에 적합한 배양 배지에서 도말한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 또한 상기 세포를 형질도입 중에 배양 배지와 접촉시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 형질도입 완충제를 배양 배지와 혼합시키는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 형질도입에 앞서 상기 세포를 수득하고 상기 세포를 배양 배지에서 유지시키고, 형질도입 중에 상기 세포를 배양 배지와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 세포를 상기 형질도입 완충제와 접촉시키기 전에 상기 형질도입 완충제를 배양 배지와 혼합시키는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 형질도입 후에, 상기 형질도입 완충제를 흡출하고/하거나 세포를, 예를 들어 1회 또는 2회 세척한다. 전형적으로, 특정한 세포 유형에 적합한 정규 배양 배지를 상기 단계에서 세포에 가할 것이다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 형질도입 후에 세포를 수득하고/하거나 상기 세포를 배양 배지에서 유지시키는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 최종 형질도입 완충제의 오스몰랄 농도를 염의 첨가에 의해 목적하는 오스몰랄 농도로 조절한다. 바람직한 실시태양에서, 관심 분자 및/또는 배양 배지를 포함하는 최종 형질도입 완충제는 세포 시토솔에 관하여 고장성이다. 상기 형질도입 방법을 생체내에서 또는 시험관내에서 수행할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 방법은 예를 들어 바이러스 플라스미드, 나노입자, 리포솜 및 다른 지질 소낭(미셀 포함) 중에서 선택된 막관통 담체를 포함하지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 방법은 비-바이러스성인데, 이는 상기 방법이 바이러스 형질감염 시스템에 의존하지 않고/않거나 예를 들어 막관통 담체로서 바이러스 플라스미드를 포함하지 않음을 의미한다. 일부 실시태양에서 상기 형질도입 방법은 예를 들어 막관통 담체로서 양이온성 지질을 포함하지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 방법은 예를 들어 막관통 담체로서 리포솜을 수반하지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 방법은 예를 들어 막관통 담체로서 나노입자를 수반하지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 방법은 예를 들어 막관통 담체로서 외막 소낭(OMV)을 수반하지 않는다. 일부 실시태양에서 상기 방법은 세포 투과성 펩타이드를 수반하지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 대음세포작용을 활성화 또는 촉진시키고/시키거나 엔도솜 용해를 촉진하여, 분자, 특히 관심 분자의 세포내로의 흡수를 촉진함을 포함한다. 본 출원과 관련하여, 대음세포작용에 관련되고 세포막의 내부 함입이며 지질들의 복합 혼합물을 포함하는 "엔도솜"은, 보다 적은 유형의 지질 분자 및 OMV(막관통 담체로서 적합하도록 변형시킬 수 있는 세균 소낭이다)로부터 전형적으로 형성되는 합성 지질 소낭인 "리포솜" 또는 "미셀"과 상이함을 알아야 한다. 하나의 실시태양에서("제1 프로토콜" 또는 "프로토콜 12/500), 형질도입을 약 500 mOsm/㎏의 오스몰랄 농도에서 약 12시간 동안 수행한다. 예를 들어, 형질도입 전날(약 12 내지 24시간 전), 세포를 항생제가 없는 적합한 배양 배지에 도말한다. 다음날(형질도입 당일), 1x "형질도입 완충제 500"(500 mOsm/㎏의 오스몰랄 농도를 갖는 형질도입 완충제)을 관심 분자와 함께 제조한다. 5x 형질도입 완충제 및 관심 분자를 세포 배양 배지와 혼합하여 500 mOsm/㎏의 오스몰랄 농도의 1x 형질도입 완충제를 수득한다. 상기 배지/형질도입 완충제/관심 분자의 혼합물을 상기 세포에 가한다. 상기 세포를 상기 형질도입 완충제 중에서 약 12시간 동안 상기 관심 분자와 함께 배양하고, 그 시간 후에, 상기 형질도입 배지를 제거하고 정규 배양 배지로 교환한다. 또 다른 실시태양에서("제2 프로토콜" 또는 "프로토콜 3/700"), 형질도입을 약 700 mOsm/㎏의 오스몰랄 농도에서 약 3시간 동안 수행한다. 예를 들어, 형질도입 전날(약 12 내지 24시간 전), 세포를 항생제가 없는 적합한 배양 배지에 도말한다. 다음날, 1x "형질도입 완충제 500"을 관심 분자와 함께 제조한다. NaCl 또는 RbCl 또는 또 다른 염(하기 참조)을 가하여 최종 오스몰랄 농도를 700 mOsm/㎏으로 조절한다. 예를 들어 2 ㎕의 5M NaCl을 98 ㎕의 1x "형질도입 완충제 500"에 가하여 700 mOsm/㎏의 최종 오스몰랄 농도를 획득한다. 상기 세포를 상기 형질도입 완충제 중에서 약 3시간 동안 상기 관심 분자와 함께 배양하고, 그 시간 후에, 상기 형질도입 배지를 제거하고 정규 배양 배지로 교환한다. 또 다른 실시태양에서("제3 프로토콜" 또는 "프로토콜 2/1000), 형질도입을 약 1000 mOsm/㎏의 오스몰랄 농도에서 약 2시간 동안 수행한다. 예를 들어, 형질도입 전날(약 12 내지 24시간 전), 세포를 항생제가 없는 적합한 배양 배지에 도말한다. 다음날, 4부피의 1x "형질도입 완충제 1000"을 1부피의 관심 분자 함유 5x "형질도입 완충제 500"과 혼합한다. 상기 세포를 상기 형질도입 완충제 중에서 약 2시간 동안 상기 관심 분자와 함께 배양하고, 그 시간 후에, 상기 형질도입 배지를 제거하고 정규 배양 배지로 교환한다. 또 다른 실시태양에서("제4 프로토콜" 또는 "Cas9-적응된 형질도입 프로토콜"), 형질도입을 약 1250 mOsm/㎏의 오스몰랄 농도에서 약 60 내지 90분 동안 수행한다. 상기 형질도입 화합물을 바람직하게는 약 250 mM의 농도로 사용한다. 상기 프로토콜은 낮은 용해도를 갖는 분자, 예를 들어 CAS/CRISPR 유전자 편집 시스템의 부분인 Cas9 뉴클레아제 단백질의 형질도입에 특히 유용하다. 예를 들어, 형질도입 전날(약 12 내지 24시간 전), 세포를 바람직하게는 항생제가 없는 적합한 배양 배지에 도말한다. 다음날, 상기 관심 분자를 상기 형질도입 완충제에 가한다. 상기 세포를 상기 형질도입 완충제 중에서 약 60 내지 90분 동안 상기 관심 분자와 함께 배양하고, 그 시간 후에, 상기 형질도입 배지를 제거하고 정규 배양 배지로 교환한다. 또 다른 실시태양에서, 형질도입을 병행 오스몰 농도에서 수행한다. 예를 들어, 약 2시간 동안 약 1000 mOsm/㎏의 오스몰 농도에 이어서 약 10시간 동안 약 500 mOsm/㎏의 오스몰 농도. 예를 들어, 형질도입 전날(약 12 내지 24시간 전), 세포를 항생제가 없는 적합한 배양 배지에 도말한다. 다음날, 4부피의 1x "형질도입 완충제 1000"을 1부피의 관심 분자 함유 5x "형질도입 완충제 500"과 혼합한다. 상기 세포를 상기 형질도입 완충제 중에서 약 2시간 동안 상기 관심 분자와 함께 배양하고, 그 시간 후에, 상기 형질도입 배지를 제거하고 상기 관심 분자의 존재 또는 부재하의 1x "형질도입 완충제 500"(500 mOsm/㎏의 오스몰랄 농도를 갖는 형질도입 완충제)으로 교환한다. 상기 세포를 상기 1x "형질도입 완충제 500" 중에서 약 10 내지 12시간 동안 상기 관심 분자와 함께 배양하고, 그 시간 후에, 상기 형질도입 배지를 제거하고 정규 배양 배지로 교환한다. 어떠한 의심도 피하기 위해서, 상기 방법들 및 프로토콜들은 하기에 상세히 개시되는 형질도입 화합물, 염, 삼투억제제, 및 형질도입 완충제의 다른 추가적인 성분들과 상용성이며 병용될 수 있다. 이들 프로토콜 및 방법을 하기에 상세히 개시하는 바와 같이, 관심 분자들의 조합을 포함한 다양한 관심 분자들을 세포내로 형질도입시키는데 사용할 수 있다. 형질도입을 위한 형질도입 화합물 상기 형질도입 완충제 중에 형질도입 화합물을 포함시키는 것은 효율적인 형질도입을 위해 요구된다. 따라서 본 발명은 본 발명에 개시되는 바와 같은 적어도 하나의 형질도입 화합물을 포함하는 완충제를 제공한다. 발명자들은 다양한 화합물들이 본 발명의 형질도입 완충제와 관련하여 사용될 때 관심 분자의 세포내로의 효율적인 형질도입을 허용함을 발견하였다. 따라서 본 발명에 사용되는 바와 같은 "형질도입 화합물"은 본 발명의 형질도입 완충제와 관련하여 사용될 때 관심 분자의 세포내로의 형질도입을 촉진하는 임의의 화합물이다. 실시예들에 개시된 바와 같은 베타-락타마제 분석을 사용하여 어느 한 화합물이 형질도입 화합물인지 아닌지를 측정할 수 있다. 형질도입 화합물의 효능을 시험하기 위해서, 특히 상기 대음세포작용 기전의 연루를 입증하기 위해서 추가의 분석이 필요한 경우, 실시예 14에 개시된 Gal3-GFP 분석을 사용할 수 있다. 따라서, 하나의 태양에서 갈렉틴-3-GFP(GAL3-GFP) 융합 단백질을 발현하도록 변형시킨 세포를 본 발명에 개시된 형질도입 완충제 또는 프로토콜(예를 들어 상술한 제1 프로토콜, 제2 프로토콜, 제3 프로토콜 또는 제4 프로토콜)을 사용하여 후보 형질도입 화합물과 접촉시키고; 녹색 형광 방출에 의해 GAL3-GFP의 국소화를 관찰함 을 포함하는 형질도입 화합물의 식별 방법을 제공하며, 여기에서 GAL3-GFP의 세포내 소낭으로의 국소화는 유효한 형질도입 화합물을 가리킨다. 일부 실시태양에서, 형질도입 화합물의 식별 방법은 유효한 형질도입 화합물을 단리하고, 임의로 상기 형질도입 화합물을 본 발명에 개시된 형질도입 완충제내에 통합시키거나 또는 본 발명에 개시된 형질도입 방법에 상기 형질도입 화합물을 사용함을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 후보 형질도입 화합물은 본 발명에 개시된 형질도입 완충제 또는 프로토콜에서 공지된 형질도입 화합물을 대체한다. 다른 실시태양에서, 상기 후보 형질도입 화합물은 본 발명에 개시된 형질도입 완충제 또는 프로토콜에서 공지된 형질도입 화합물에 부가적이다. 바람직한 실시태양에서, 상기 녹색 형광 방출을, 상기 후보 형질도입 화합물을 함유하지 않음을 제외하고 동일한 방식으로 처리된 대조용 세포와 비교한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 상기 방법에 의해 식별가능한 임의의 형질도입 화합물이다. 발명자들이 발견한 첫 번째 형질도입 화합물은 비-세정성 설포베타인(NDSB; 예를 들어 NDSB-201)이었다. 발명자들은 상기 화합물의 유도체(예를 들어 비-세정성 카보베타인[NDCB])를 시험하였으며 또한 형질도입 화합물들인 다수의 다른 관련 화합물들을 발견하였다. 작용하는 다양한 화합물 구조가 존재하지만, 하기에 보다 상세히 개시되는 바와 같이, 상기 다양한 상이한 화합물들로부터 유도될 수 있는 다수의 공통적인 특징이 존재한다. 발명자들은 형질도입 화합물이 일반적으로 적어도 하나의 친수성 작용기를 포함함을 발견하였다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 단지 하나의 친수성 작용기만을 가지며; 상기와 같은 화합물의 예는 펜탄산(표 1의 실시예 화합물 #23) 및 n-부틸아민(표 1의 실시예 화합물 #24)을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 하나 초과, 예를 들어 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 친수성 작용기를 갖는다. 상기 형질도입 화합물은 그의 말단에서 실질적인 자유를 허용하지만, 탄소쇄의 어느 한 단부에 친수성기가 바람직한 것으로 보인다. 따라서, 바람직한 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은, 각각이 짧은 소수성기, 예를 들어 C1-5 알킬렌에 의해 분리된 적어도 2개의 친수성기를 갖는 화합물이다. 상기 쇄 중의 탄소수 6 이상의 알킬렌은 세포에 독성인 듯하다. 상기 친수성기들은 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 베타인이다. 본 발명에 사용되는 바와 같이, "베타인"이란 용어는 수소 원자를 갖지 않는 양이온성 작용기, 및 음이온성 작용기를 갖는 임의의 중성 화학 화합물을 지칭한다. 양이온성 작용기의 비제한적인 예는 4급 암모늄 양이온을 포함한다. 음이온성 작용기의 비제한적인 예는 카복실레이트, 설포네이트 및 포스페이트 음이온을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 세제가 아니다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 비-세정성 베타인이다. "비-세정성 베타인"(NDB)이란 용어는 용액 중에서 미셀을 형성하지 않는 베타인을 지칭한다. 따라서 세제가 아닌 형질도입 화합물은 용액 중에서 리포솜 또는 미셀을 형성하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 비-세정성 설포베타인(NDSB)이다. NDSB는 짧은 소수성기, 예를 들어 C1-5 알킬렌에 의해 4급 질소기로부터 분리된 설포네이트기를 갖는 베타인이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 소분자 화합물이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 탄소수 50 초과, 탄소수 30 초과, 탄소수 25 초과 또는 탄소수 20 초과이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 1000 g/mol 미만, 500 g/mol 미만, 400 g/mol 미만, 360 g/mol 미만, 300 g/mol 미만, 200 g/mol 미만의 질량을 갖는다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 발명자들은 이들 화합물이 서로에 대해 폴딩되어 상기 분자의 소수성 및 친수성면을 생성시켜 상기 화합물을, 예를 들어 하기에 도시된 바와 같이 형질도입 화합물로서 특히 잘 작용하게 한다고 가정한다. 일부 실시태양에서, 상기 4급 질소 원자는 지방족 또는 방향족 고리 구조의 부분이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 다이메틸에틸-(3-설포프로필)-암모늄염(NDSB-195, Vuillard et al (1994) FEBS Letters, 353, 294-296; Goldberg et al (1995/1996) Folding & Design, 1, 21-27), 3-(1-피리디노)-1-프로판설포네이트(NDSB-201), 다이메틸벤질암모늄 프로판설포네이트(NDSB-256), 다이메틸-t-부틸-(3-설포프로필)암모늄염(NDSB-222t), 3-(1-메틸피페리딘)-1-프로판설포네이트(NDSB221), 다이메틸-(2-하이드록시에틸)-(설포프로필)-암모늄염(NDSB-211; Vuillard et al (1995) Anal Biochem, 230, 290-294) 중에서 선택된 NDSB이다. 바람직한 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 NDSB-201이다. 비-세정성 카복시베타인(NDCB)이 형질도입 화합물로서 기능하는 것으로 또한 밝혀졌다. 따라서 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 NDCB이다. NDCB는 짧은 소수성기, 예를 들어 C1-5 알킬렌에 의해, 4급 질소기로부터 분리된 카복실레이트기를 갖는 베타인이다. NDCB는 NDSB에 대해 상술한 바와 같이 용액 중에서 폴딩되어 그의 형질도입 촉진 능력을 증대시킬 수 있다. 발명자들은 카복실레이트기에 대한 NDSB의 설포네이트기의 치환으로 NDCB를 형성시키는 것은 형질도입 효율에 부정적으로 영향을 미치지 않음을 발견하였다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 다수의 NDCB가 NDSB보다 더 큰 효율 및 세포 생육력 및/또는 세포 증식에 대한 감소된 영향으로 작용한다. 광범위한 pH에 걸쳐 용액 중에서 쯔비터이온성인 비-베타인 화합물이 또한 형질도입 화합물로서 기능한다. 예를 들어, 일부 아미노산, 예를 들어 GABA(감마-아미노부티르산)(용액 중에서 쯔비터이온성이다)가 또한 형질도입 화합물로서 기능한다. 쯔비터이온성 화합물은 종종 적어도 하나의 산성 및 적어도 하나의 염기성 작용기를 포함하며, 이들은 용액 중에서 이온화될 수 있다. 산성기는 카복실산, 설폰산 및 포스폰산 작용기를 포함한다. 염기성기는 아미노기를 포함한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 바람직하게는 적어도 하나의 산성 작용기 및 적어도 하나의 염기성 작용기를 포함하는 쯔비터이온, 예를 들어 비-세정성 쯔비터이온이다. 몇몇 바람직한 실시태양에서 상기 산성 작용기는 짧은 소수성기, 예를 들어 C1-5 알킬렌에 의해 적어도 하나의 염기성기로부터 분리된다. 또한 놀랍게도 비-쯔비터이온성 화합물이 형질도입 화합물로서 작용하는 것으로 밝혀졌다. 음으로 하전된 작용기(예를 들어 상술한 바와 같은 카복실레이트 또는 설포네이트)를 갖는 대신에 생물등배전자기(bioisosteric group), 예를 들어 아미드 또는 테트라졸을 포함하는 화합물이 또한 형질도입 화합물로서 기능한다. 따라서, 일부 실시태양에서 상기 형질도입 화합물은 아미드 또는 테트라졸 작용기를 포함한다. 몇몇 바람직한 실시태양에서 형질도입 촉진제(형질도입 화합물)는 짧은 소수성기, 예를 들어 C1-5 알킬렌에 의해 또 다른 친수성기, 바람직하게는 아미노 또는 암모늄으로부터 분리된 아미드 또는 테트라졸 작용기를 포함한다. 따라서 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 음으로 하전된 작용기에 대해 생물등배전자성인 기를 갖는 쯔비터이온 또는 비-쯔비터이온성 화합물이다. 이들 비-쯔비터이온성 화합물은 상기 생물등배전자기로 인해, 양으로 하전된 작용기와 함께 약간의 "쯔비터이온성 성질"을 가져서, 예를 들어 상술한 폴딩 기전을 허용하는 것으로 생각된다. 음으로 하전된 작용기에 대해 생물등배전자성인 기는 비제한적으로 아미드 및 테트라졸 작용기를 포함한다(예를 들어 화합물 #43, #15, #29, #34, #30, #31 및 #45를 참조하시오). 도 6은 형질도입 화합물들의 구조-기능 관계를 검토하는 연구들의 결과를 도시한다. 상기에 따라서, 상기 형질도입 화합물은 하기 화학식 I의 화합물 및 그의 토오토머, 용매화물, 쯔비터이온 및 염일 수 있다: [화학식 I] 상기 식에서, X는 NR ¹ R ² , NR ¹ R ² R ³ +, OH 및 COOR ⁴ 이고; Y는 SO ₃ H, SO ₃ ^- , COO ^- , CONH ₂ , COOR ¹² , CONR ⁵ R ⁶ , 테트라졸, OH, NR ¹⁰ R ¹¹ , 및 H 중에서 선택되고; n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고; R ¹ , R ² 및 R ³ 은 각각 독립적으로 H, C1-6 알킬, C5-10 아릴, C6-15 아르알킬, COR ⁹ 중에서 선택되고; C1-6 알킬, C5-10 아릴, C6-15 아르알킬은 R ^Y , OH 또는 COOH로 임의로 치환될 수 있거나; 또는 R ¹ 및 R ² 는 이들이 결합된 질소와 함께 헤테로사이클릴을 형성할 수도 있거나; 또는 X가 NR ¹ R ² R ³ +일 때, R ³ 은 존재하지 않을 수도 있고 R ¹ 및 R ² 는 이들이 결합된 질소와 함께 헤테로아릴을 형성할 수도 있으며; R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , R ⁹ , R ¹⁰ , R ¹¹ , R ¹² 는 독립적으로 H 및 C1-6 알킬 중에서 선택되고; R ⁷ 및 R ⁸ 은 독립적으로 H, C1-6 알킬 및 OH 중에서 선택되거나; 또는 R ⁷ 은 R ¹ 과 함께 헤테로사이클릴을 형성할 수도 있고; 헤테로사이클릴은 가능한 경우 N, NR ¹³ , NR ¹³ R ¹⁴ + 및 O 중에서 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 고리원, 및 탄소수 2 내지 5를 함유하는, 포화되거나 부분적으로 불포화된 모노사이클릭 고리이고; 헤테로사이클릴은 C1-C6 알킬, C1-C6 카복실산 또는 R ^Y 로 치환된 C1-C6 알킬로 임의로 치환될 수 있고; 헤테로아릴은 가능한 경우 N, NR ¹³ , NR ¹³ R ¹⁴ + 및 O 중에서 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 고리원을 함유하는 5 또는 6원 방향족 고리이고; 헤테로아릴은 C1-C6 알킬, C1-C6 카복실산 또는 R ^Y 로 치환된 C1-C6 알킬로 임의로 치환될 수 있고; R ¹³ 및 R ¹⁴ 는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C1-C6 카복실산 및 R ^Y 로 치환된 C1-C6 알킬 중에서 선택되고; 알킬은 선형 또는 분지된 포화된 탄화수소이고; R ^Y 는 SO ₃ H, SO ₃ ^- , COO ^- , CONH ₂ , COOR ¹² , CONR ⁵ R ⁶ , 테트라졸, OH, 및 NR ¹⁰ R ¹¹ 중에서 선택되고; C1-6 카복실산은 -COOH 또는 COOH로 치환된 C1-5 알킬쇄를 의미한다. 형질도입 화합물은 일부 실시태양에서 4급 또는 염기성 질소기를 포함할 수 있다. 따라서 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 X가 NR ¹ R ² R ³ + 또는 NR ¹ R ² 인 화학식 I의 화합물이다. 일부 실시태양에서 R ¹ , R ² 및 R ³ 은 각각 독립적으로 H, 및 R ^Y , OH 또는 COOH로 임의로 치환될 수 있는 C1-6 알킬 중에서 선택되거나; 또는 R ¹ 및 R ² 는 이들이 결합된 질소와 함께 임의로 치환될 수도 있는 헤테로사이클릴, 바람직하게는 피페리딘, 피페라진 또는 모르폴린을 형성할 수도 있거나; 또는 R ³ 은 존재하지 않을 수도 있고, R ¹ 및 R ² 는 이들이 결합된 질소와 함께 임의로 치환될 수도 있는 헤테로아릴, 바람직하게는 피리딜을 형성할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 Y가 SO ₃ H, SO ₃ ^- , COO ^- , COOR ¹² , CONR ⁵ R ⁶ , 및 테트라졸 중에서 선택되며, 바람직하게는 SO ₃ H, SO ₃ ^- , COO ^- , COOR ¹² , 및 CONR ⁵ R ⁶ 중에서 선택되고; 보다 바람직하게는 COO ^- , COOH 및 CONR ⁵ R ⁶ 중에서 선택되는 화학식 I의 화합물이다. 일부 실시태양에서, R ^Y 는 SO ₃ H, SO ₃ ^- , COO ^- , COOR ¹² , CONR ⁵ R ⁶ , 및 테트라졸 중에서 선택되고, 바람직하게는 R ^Y 는 SO ₃ H, SO ₃ ^- , COO ^- , COOR ¹² , 및 CONR ⁵ R ⁶ 중에서 선택되고; 보다 바람직하게는 R ^Y 는 COO ^- , COOH 및 CONR ⁵ R ⁶ 중에서 선택된다. X와 Y를 분리시키는 탄소쇄가 3 탄소원자 길이인 경우 형질도입이 더 효율적으로 촉진되는 것으로 밝혀졌다. 따라서 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 n이 3인 화학식 I의 화합물이다. 다른 실시태양에서, n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상이다. 일부 실시태양에서, n은 5 이하, 4 이하, 3 이하 또는 2 이하이다. 일부 바람직한 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 하기 화학식 II에 따른, 화학식 I의 부분집합에 속하는 화합물이다: [화학식 II] 상기 식에서, X는 NR ¹ R ² , 및 NR ¹ R ² R ³ + 중에서 선택되고; Y는 SO ₃ H, SO ₃ ^- , COO ^- , CONH ₂ , COOR ¹² , 및 CONR ⁵ R ⁶ 중에서 선택되고; R ¹ , R ² 및 R ³ 은 각각 독립적으로 H, 및 OH 또는 COOH로 임의로 치환될 수도 있는 C1-6 알킬이거나; 또는 R ¹ 및 R ² 는 이들이 결합된 질소와 함께, 임의로 치환될 수도 있는 헤테로사이클릴, 바람직하게는 피페리딘, 피페라진 또는 모르폴린을 형성할 수도 있고; 또는 X가 NR ¹ R ² R ³ +일 때, R ³ 은 존재하지 않을 수도 있고 R ¹ 및 R ² 는 이들이 결합된 질소와 함께, 임의로 치환될 수도 있는 헤테로아릴, 바람직하게는 피리딜을 형성할 수도 있고; 모든 다른 기는 상기 화학식 I에 정의된 바와 같다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 4급 질소기를 함유한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 X가 NR ¹ R ² R ³ +인 화학식 I 또는 II의 화합물이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 X가 NH ₃ +인 화학식 I 또는 II의 화합물이다. 일부 실시태양에서, 상기 4급 질소는 지방족 또는 방향족 고리 구조의 부분일 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 X가 하기 화학식 a인 화학식 I 또는 II의 화합물이다: [화학식 a] ; 상기 식에서, Z는 C(R ¹⁵ ) ₂ , NR ¹³ , NR ¹³ R ¹⁴ + 및 O 중에서 선택되고; 각각의 R ¹⁵ 는 독립적으로 H, C1-6 알킬, C1-C6 카복실산 및 R ^Y 로 치환된 C1-C6 알킬 중에서 선택되고; R ³ 은 H, C1-6 알킬, C5-10 아릴, C6-15 아르알킬, COR ⁹ 중에서 선택되고; C1-6 알킬, C5-10 아릴 및 C6-15 아르알킬은 R ^Y , OH 또는 COOH로 임의로 치환될 수도 있다. 바람직하게는 R ₃ 은 -CH ₃ 이고; R ¹³ 및 R ¹⁴ 는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C1-C6 카복실산 및 R ^Y 로 치환된 C1-C6 알킬 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서 상기 형질도입 화합물은 X가 a이고, Z가 NR ¹³ 또는 NR ¹³ R ¹⁴ +이고, R ¹³ 이 -CH ₂ CH ₂ CH ₂ R ^Y 인 화학식 I 또는 II의 화합물이다. 한편으로, 다른 실시태양에서 상기 형질도입 화합물은 X가 a이고, Z가 CH ₂ 이고, R ³ 이 -CH ₃ 인 화학식 I 또는 II의 화합물이다. 다른 실시태양에서 상기 형질도입 화합물은 X가 하기 화학식 b인 화학식 I 또는 II의 화합물이다: [화학식 b] ; Z는 CR ¹⁵ 및 NR ¹³ + 중에서 선택되고; R ¹⁵ 는 H, C1-C6 알킬 및 C1-C6 카복실산 및 R ^Y 로 치환된 C1-C6 알킬 중에서 선택되고; R ¹³ 은 H, C1-C6 알킬, C1-C6 카복실산 및 R ^Y 로 치환된 C1-C6 알킬 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서 상기 형질도입 화합물은 X가 b이고, Z가 NR ¹³ 이고, R ¹³ 이 -CH ₂ CH ₂ CH ₂ R ^Y 인 화학식 I 또는 II의 화합물이다. 한편으로, 다른 실시태양에서 상기 형질도입 화합물은 X가 b이고, Z가 CH인 화학식 I 또는 II의 화합물이다. 일부 실시태양에서 상기 형질도입 화합물은 표 1의 화합물들 중에서 선택된 화합물이다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "화합물 #"은 왼쪽 컬럼의 화합물 번호(#)를 사용하는 표 1의 화합물들을 지칭한다. 일부 실시태양에서 상기 형질도입 화합물은 화합물 #10, #11, #16, #42, #34, #41, #40, #39, #33, #15, #11, #29, #46 및 #36 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서 상기 형질도입 화합물은 화합물 #32가 아니다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 화합물 #27, #07, #18, #09 및 #32 중에서 선택된 화합물 중 어느 것도 아니다. 이들 화합물은 모두 대조용 화합물 #1에 비해 30% 미만의 형질도입을 나타낸다. 진술이 "표 1의 화합물"을 지칭하는 경우, 일부 실시태양에서 이는 화합물 #32를 제외한 표 1의 모든 화합물, 또는 화합물 #27, #07, #18, #09 및 #32를 제외한 표의 모든 화합물을 지칭한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 하나의 형질도입 화합물을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 2개 이상(예를 들어 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상)의 형질도입 화합물, 예를 들어 임의의 가능한 조합으로, 인용된 형질도입 화합물들 중 2개 이상을 포함한다. 형질도입 화합물의 조합의 예는 도 6F에 제공된다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 화합물 #1 및 화합물 #18을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 화합물 #1 및 화합물 #34를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 화합물 #1 및 화합물 #20을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 500 mM, 약 1 mM 내지 약 400 mM, 약 1 mM 내지 약 300 mM, 약 1 mM 내지 약 200 mM, 약 1 mM 내지 약 100 mM, 약 2 mM 내지 약 200 mM, 약 2 mM and 100 mM, 약 2 mM 내지 약 80 mM, 약 3 mM 내지 약 75 mM, 약 4 mM 내지 약 70 mM, 약 5 mM 내지 약 60 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 25 mM 내지 40 mM, 또는 약 30 mM이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물의 농도는 약 25 mM이고, 예를 들어 상기 형질도입 화합물의 농도는 일부 실시태양에서 약 10 내지 약 25 mM, 또는 약 25 mM이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물의 농도는 적어도 1 mM, 적어도 2 mM, 적어도 3 mM, 적어도 4 mM, 적어도 5 mM, 적어도 10 mM, 적어도 20 mM, 적어도 30 mM, 적어도 40 mM, 적어도 50 mM, 적어도 60 mM, 적어도 70 mM 또는 적어도 80 mM, 적어도 90 mM, 적어도 100 mM, 적어도 150 mM, 적어도 200 mM, 적어도 300 mM, 적어도 400 mM 또는 500 mM이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물의 농도는 약 100 mM 내지 약 500 mM, 약 200 mM 내지 약 400 mM, 200 mM 내지 약 300 mM, 또는 약 250 mM이다. 이러한 보다 높은 농도 범위가, 예를 들어 낮은 용해도의 단백질, 예를 들어 Cas9를 도입시키는 경우 특히 유용하다. 형질도입 화합물의 최적 농도는 또한 상기 화합물 및 그의 효율에 따라 변할 것이나, 이를 예를 들어 실시예에 개시된 실험 및 분석을 사용하여 당해 분야의 숙련가들에 의해 쉽게 측정할 수 있는 것으로 생각된다. 본 발명은 화합물 #10을 제공한다. 본 발명은 또한 화합물 #11을 제공한다. 본 발명은 또한 화합물 #16을 제공한다. 본 발명은 또한 화합물 #42를 제공한다. 본 발명은 또한 화합물 #34를 제공한다. 본 발명은 또한 화합물 #41을 제공한다. 본 발명은 또한 화합물 #40을 제공한다. 본 발명은 또한 화합물 #39를 제공한다. 본 발명은 또한 화합물 #33을 제공한다. 본 발명은 또한 화합물 #15를 제공한다. 본 발명은 또한 화합물 #11을 제공한다. 본 발명은 또한 화합물 #29를 제공한다. 본 발명은 또한 화합물 #36을 제공한다. 본 발명은 또한 화합물 #46을 제공한다. 이들 화합물은 신규의 것으로 보인다. 본 발명은 또한 치료법에 의해 인간 또는 동물체를 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 어딘가에 개시된 바와 같은 형질도입 화합물을 제공한다. 특히, 치료법에 의해 인간 또는 동물체를 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한 화합물 #10, 화합물 #11 또는 화합물 #16을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 화합물 #15(BU-2026-05)이다. 상기 화합물은 고농도로 사용되는 경우에조차, 양호한 세포 생육력을 유지시키면서 고 효율의 형질도입을 생성시키기 때문에 유리하다(표 1 참조). 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 화합물 #10이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 화합물 #11이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 화합물 #16이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 화합물 #42이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 화합물 #34이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 화합물 #41이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 화합물 #11이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 화합물 #40이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 화합물 #39이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 화합물 #33이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 화합물 #29이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 화합물 #15이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 화합물 #36이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 화합물 #46이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 화합물 #20이다. 화합물 #20은 다른 형질도입 화합물들에 비해 특히 양호한 세포 생존률을 생성시키는 것으로 나타났다(예를 들어 도 18B를 참조하시오). 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 실시예 1에 개시된 방법에 의해 측정된 바와 같이, 표 1의 기준 화합물 #1(NDSB-201)에 비해 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 110% 이상, 120% 이상, 150% 이상, 200% 이상, 300% 이상, 400% 이상, 500% 이상, 600% 이상, 700% 이상, 800% 이상, 1000% 이상의 형질도입 효율을 갖는 임의의 화합물이다. 유사하게, 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 방법(전체로서)은 대조용으로서 표에 나타낸 바와 같은 화합물 #1을 포함하는 방법을 사용하여(즉 100% 형질도입 효율로서), 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 110% 이상, 120% 이상, 150% 이상, 200% 이상, 300% 이상, 400% 이상, 500% 이상, 600% 이상, 700% 이상, 800% 이상, 1000% 이상의 형질도입 효율을 갖는다. 표 1의 기준 화합물 #1에 비해 100% 초과의 형질도입 효율을 갖는 형질도입 화합물의 비제한적인 예는 기준 화합물 #30, #17, #15, #38, #35, #11, #10, #28 및 #37을 포함한다. 이들 화합물은 특히 유효한 형질도입 화합물들이다. 따라서 일부 실시태양에서 상기 형질도입 화합물은 화합물 #30, #17, #15, #38, #35, #11, #10, #28 및 #37 중에서 선택된다. 다른 바람직한 형질도입 화합물은 #42, #1, #45, #43, #44, #15, #10, #11, #28, #37 및 #46을 포함한다. 따라서 일부 실시태양에서 상기 형질도입 화합물은 #42, #1, #45, #43, #44, #15, #10, #11, #28, #37 및 #46 중에서 선택된다. 이들은 대조용 화합물 #1에 비해 50% 이상의 형질도입 효율 및/또는 대조용 화합물 #1에 비해 75% 이상의 생육력을 갖거나 갖는 것으로 예상되는 화합물들이다. 일부 상황에서 세포 증식 또는 생육력의 감소를 야기하는 완충제 중에 형질도입 화합물을 사용하는 것이 유리할 수도 있다. 예를 들어 백신 개발의 경우에, 약간의 독성이 유리할 수도 있다. 세포내에 형질도입된 항원은 면역계에 표시된다. 상기 표시 세포가 병들거나 죽으면, 면역 반응이 증대될 수 있다. 상기와 같은 목적에 적합한 형질도입 화합물은 #40, #41, #25, #35 및 #38을 포함한다. 따라서 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 화합물 #40, #41, #25, #35 및 #38 중에서 선택된다. 다른 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 화합물 #10, #11, #16, #42, #34, #41, #40, #39, #33, #15, #11, #29, #36 및 #46 중에서 선택된다. 이들은 신규의 화합물인 것으로 여겨지는 형질도입 화합물들이다. 본 발명에 개시된 형질도입 화합물은 단량체, 이량체 또는 다량체로서 존재할 수 있다. 예를 들어, 화합물 #42는 이량체로서 활성이다. 따라서 일부 실시태양에서 상기 형질도입 화합물은 그의 단량체, 이량체 또는 다량체 형태로 사용된다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 화합물 #42의 이량체 형태이다. 본 발명은 또한 세포에 하나 이상의 분자를 형질도입시키기 위한 상술한 바와 같은 형질도입 화합물의 용도를 제공한다. GABA 작용물질 상기에 언급한 바와 같이, 형질도입 화합물인 것으로 밝혀진 화합물들 중 하나는 뇌의 중요한 신경전달물질인 감마-아미노부티르산(GABA, 화합물 #20)이었다. GABA는 GABA-수용체의 활성화를 자극함으로써 작용하며, 상기 수용체 중 3개의 부류, 즉 GABA-A, GABA-B 및 GABA-C가 확인되었다. GABA 수용체는 에탄올 및 GABA 자신과 같이 간단한 구조에서부터 겉보기에 관련없는 벤조다이아제핀, 뮤시몰, 바클로펜에 이르는 현저하게 광범위한 화학 구조물들에 의해 자극된다. 유효한 단백질 형질도입 화합물의 화학 구조가 또한 자유도를 나타내기 때문에, 발명자들은 GABA 신호전달이 상기 형질도입 효과에 적극적인 역할을 할 수도 있다고 가정한다. 실제로, 발명자들은 염 및 형질도입 화합물(예를 들어 NDSB-201)을 포함하는 형질도입 완충제에 GABA 작용물질의 첨가는 마우스 배아섬유아세포(MEF)내로의 β-락타마제의 증가된 형질도입을 생성시킴을 발견하였다. 따라서 GABA 작용물질을 상기 형질도입 완충제에 포함시켜 형질도입 효율을 추가로 증대시킬 수 있다. GABA 작용물질의 식별 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 형질도입 완충제에 사용하기에 적합한 GABA 작용물질을, 뇌 조각상에서 패치 클램프 기술을 사용하여 막 전위 변화를 측정함으로써 주어진 화합물에 의한 GABA 수용체의 활성화를 측정하는 분석에 의해 식별할 수 있다(Patch Clamp Techniques, Springer Protocols Handbooks, 2012, pp 71-83). 또한 GABA-B 작용물질을 식별하는데 이용될 수 있는 상업적인 분석(예를 들어 밀리포어(Millipore)에 의한 "레디-투-어세이(Ready-to-assay)")이 존재한다. 본 발명에 개시된 형질도입 완충제에 사용하기에 적합한 GABA 작용물질을 상기와 같은 분석을 사용하여 식별할 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 GABA 작용물질을 추가로 포함한다. GABA 작용물질은 GABA 신호전달 경로를 활성화시키는 임의의 화합물, 예를 들어 상기 참고된 패치 클램프 분석 또는 밀리포어 분석을 사용하여 식별된 바와 같은, GABA 수용체(예를 들어 GABA-A, GABA-B 및/또는 GABA-C 수용체)에 결합하고/하거나 상기 수용체를 활성화시키는 임의의 화합물을 포함한다. GABA 작용물질의 예는 비제한적으로 SKF-97541, 아캄프로세이트, 바르비튜레이트, 벤조다이아제핀, 에탄올, 메타쿠알론, 뮤시몰, 비벤조다이아제핀(잘레플론, 졸피뎀, 조피클론), 피카밀론, 프로가바이드, 티아가빈, 바클로펜, 1,4-부탄다이올, GBL(γ-부티로락톤), GHB(γ-하이드록시부티르산), GHV(γ-하이드록시발레르산), GVL(γ-발레로락톤), 레소가베란, 페니부트, (Z)-4-아미노-2-부텐산, (+)-시스-2-아미노메틸사이클로프로판 카복실산, N4-클로로아세틸시토신 아라비노사이드, GABOB(γ-아미노-베타-하이드록시부티르산), 및 프로가바이드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 염 및 형질도입 화합물을 포함하고, 뮤시몰 및/또는 SKF-97541을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 GABA 작용물질을 상기 형질도입 완충제에 마이크로- 또는 나노몰 범위의 농도로 포함시킨다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 GABA 작용물질은 약 0.1 μM 내지 약 100 μM, 약 1 μM 내지 약 90 μM, 약, 2 μM 내지 약 80 μM, 약 3 μM 내지 약 75 μM, 약 4 μM 내지 약 70 μM, 약 5 μM 내지 약 60 μM, 약 10 μM 내지 약 50 μM, 약 25 μM 내지 40 μM, 또는 약 30 μM의 농도를 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 GABA 작용물질은 약 10 μM, 약 25 μM 또는 약 50 μM의 농도를 갖는다. 다른 실시태양에서, 상기 GABA 작용물질은 약 0.1 nM 내지 약 100 nM, 약 1 nM 내지 약 90 nM, 약 2 nM 내지 약 80 nM, 약 3 nM 내지 약 75 nM, 약 4 nM 내지 약 70 nM, 약 5 nM 내지 약 60 nM, 약 10 nM 내지 약 50 nM, 약 25 nM 내지 40 nM, 또는 약 30 nM의 농도를 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 GABA 작용물질은 약 10 nM, 25 nM 또는 약 50 nM의 농도를 갖는다. 다른 신경전달물질들이 유사하게 형질도입을 증대시킬 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 염, 형질도입 화합물을 포함하고, 신경전달물질을 추가로 포함한다. 형질도입 완충제에 사용하기 위한 염 본 발명의 형질도입 완충제에 사용하기 위한 염은 본 발명의 방법과 관련하여 작용하는 임의의 염, 즉 형질도입 화합물과 병용시 세포내 형질도입을 허용하는 임의의 염이다. 도 5A에 도시된 바와 같이, LiCl, KCl, CsCl, RbCl을 포함하여 시험된 모든 Na-관련염(주기율표에 따라)은 단백질 형질도입 활성을 가졌으며, 이때 Na 및 Rb가 최고의 활성을 나타낸다. 또한, 다른 Na-염들이 단백질 흡수를 유도할 수 있는지를 시험하였다. 도 5A에 도시된 바와 같이, 나트륨 글루코네이트는 β-락타마제 형질도입을 NaCl 및 RbCl과 유사한 효율로 유효하게 매개하였다. 최종적으로, 관련없는 화합물들을 사용하는 긴장성 증가가 또한 단백질 형질도입을 촉발하는 지를 시험하였다. 도 5A에 도시된 바와 같이, 슈크로스, 락툴로스, 솔비톨 및 만니톨이 모두 700 mOsm/㎏에서 단백질 형질도입에 실패하였는데, 이는 단백질 형질도입이 나트륨 또는 나트륨-관련 염에 의해서 유도되는 고장성에 특이적으로 의존함을 암시한다. 본 발명의 형질도입 완충제에 사용하기에 적합한 고장성-유발염의 식별을 위한 분석을 실시예(실시예 6 참조)에 제공한다. 따라서 바람직하게는, 상기 염은 세포막을 가로질러 긴장성을 증가시킬 수 있다, 즉 상기 염은 "고장성"염이다. 긴장성은 하기에 보다 상세히 개시된다. 따라서 일부 실시태양에서, 상기 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 세슘 또는 루비듐염, 바람직하게는 나트륨 또는 루비듐염이다. 일부 실시태양에서, 상기 염은 클로라이드, 글루코네이트, 카보네이트, 설포네이트, 설페이트, 설파이드, 브로마이드, 요오다이드 또는 플루오라이드, 바람직하게는 클로라이드 또는 글루코네이트이다. 비제한적인 예는 염화 나트륨, 나트륨 글루코네이트, 염화 리튬, 리튬 글루코네이트, 염화 칼륨, 칼륨 글루코네이트, 염화 세슘, 세슘 글루코네이트, 염화 루비듐 및 루비듐 글루코네이트를 포함한다. 일부 실시태양에서, 하나의 염을 상기 형질도입 완충제에 포함시킨다. 일부 실시태양에서, 하나 초과의 염, 예를 들어 2, 3, 4, 또는 5개의 염을 상기 형질도입 완충제에 포함시킨다. 흥미롭게도, 단백질 형질도입은 Na+/H+ 교환의 특정한 억제제, 예를 들어 나트륨-수소 역수송체(Nhe) 단백질 과의 특정한 억제제들인 EIPA 또는 DMA에 의해 강하게 억제되었다(도 5B). 이러한 데이터는 상기 형질도입 과정이 대음세포작용을 통해 외부적으로 적용된 화합물의 능동 세포 흡수를 수반함을 암시한다. 이는 Nhe1 녹아웃 배아로부터의 마우스 배아섬유아세포(MEF)의 형질도입을 Nhe1 이종접합성 및 야생형 MEF와 비교함으로써 추가로 확인되었다. 도 5C에 도시된 바와 같이, 단백질 형질도입은 Nhe1 눌 섬유아세포에서 거의 완벽하게 방해되었다. Nhe1+/- 이종접합성 배아로부터의 섬유아세포는 야생형 한배새끼에 비해 감소된 단백질 형질도입 활성을 나타내었다(도 5C). 이러한 결과는, Nhe1이 단백질 형질도입의 중요한 매개체이나 잔류 단백질 형질도입 활성이 Nhe1 발현의 부재하에서 남아있음을 설명한다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 발명자들은 상기와 같은 Nhe 수송체의 활성이 상기 대음세포작용 경로의 활성화를 이끌며, 이는 상기 형질도입 과정의 첫 번째 단계이다. 따라서, 바람직한 실시태양에서, 상기 염은 나트륨/수소(Na+/H+) 수송체, 예를 들어 Nhe 수송체, 예를 들어 Nhe1 수송체에 결합하고/하거나 상기 수송체를 활성화시킬 수 있는 임의의 염이다. Nhe1은 척추동물 세포의 부피- 및 pH-조절에 관련된 편재하는 막-결합된 효소이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 상기 염에 대한 대체물로서, 또는 상기 염에 더하여, Nhe1 수송체와 같은 나트륨/수소 수송체의 활성제 및/또는 촉진제를 포함한다. 예를 들어, 다수의 성장 인자들이 Nhe1을 활성화시키고 Na+/H+ 교환을 촉진함으로써 대음세포작용을 유도하는 것으로 나타났다. 상응하게, 일부 실시태양에서, 나트륨/수소 수송체의 활성제 또는 촉진제는 사이토카인 또는 성장 인자이다. 일부 실시태양에서, 나트륨/수소 수송체의 활성제 또는 촉진제는 상피 성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 혈소판-유래된 성장 인자(PDGF), 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF)이다. 사이토카인 또는 성장 인자 신호전달의 소분자 작용물질이 또한 Nhe1 활성을 유도할 수 있다. NHE1의 활성제의 다른 예는 비제한적으로 사이토카인 또는 성장 인자 신호전달의 소분자 작용물질, 안지오텐신 II, 글루코코르티코이드 및 호르몬을 포함한다(Alexander RT, J Exp Biol 212, 1630-1637, 2009). 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 나트륨/수소 수송체의 하나 초과, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개의 활성제 및/또는 촉진제를 포함한다. 상기 활성제 및/또는 촉진제의 임의의 조합이 하기 개시되는 바와 같이, 염과 함께 또는 염 없이 고려된다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 나트륨/수소 수송체, 예를 들어 Nhe 수송체의 활성제 및/또는 촉진제 및 형질도입 화합물을 포함하는 형질도입 완충제를 제공한다. 대음세포작용 또는 엔도솜 용해의 다른 활성제 및/또는 촉진제가 또한 본 발명과 관련하여 유용할 수 있다. 예를 들어, 앞서 단백질의 마크로피노솜 탈출을 촉진하는 것으로 입증된 짧은 dTAT-HA2 융합 펩타이드가 본 발명자들에 의해 단백질 형질도입을 촉진하는 것으로 설명되었으며, 상기는 마우스 배아줄기세포(mESC)에 특히 유효하였다. 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 대음세포작용의 활성제 및/또는 촉진제 또는 마크로피노솜 탈출의 촉진제를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 dTAT-HA2 융합 펩타이드를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 용원성 펩타이드를 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 엔도솜 용해의 활성제 및/또는 촉진제를 추가로 포함한다. 바람직하게는 본 발명에 개시된 형질도입 완충제의 부분으로서, 세포에 관심 분자의 형질도입을 증대시키기 위한 용원성 펩타이드의 용도를 제공한다. 형질도입의 억제 발명자들은 본 발명에 개시된 방법에 의한 형질도입이 대음세포작용을 통해 일어나며 액틴 리모델링이 필요함을 입증하였다. 따라서, 상기 과정의 특정한 억제제들은 형질도입을 방지할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 방법을 사이토칼라신 D 또는 라트런컬린 A, 또는 액틴 중합 및 소낭 수송의 다른 특정한 억제제들에 의해 억제시킬 수 있다. 유사하게, 상기 형질도입 방법을 Nhe 수송체에 의한 Na+/H+ 교환의 특정한 억제제들, 예를 들어 EIPA 또는 DMA에 의해 억제시킬 수 있다. 오스몰랄 농도 범위 상기 정의된 바와 같은 염을 상기 형질도입 완충제에 목적하는 오스몰랄 농도를 성취하기 위해서 적합한 양으로 첨가한다. 상기 형질도입 완충제의 오스몰랄 농도를 삼투압계를 사용하여 당해 분야에 공지된 방법에 의해 측정하거나, 또는 예를 들어 상기 완충제의 나머지 부피를 구성하는 배지의 삼투압을 알고 있는 경우에는 계산할 수 있다. 따라서, 상기 염을 가하여 상기 완충제의 오스몰랄 농도를 목적하는 수준으로 조절할 수 있다(예를 들어 실시예 6 참조). 오스몰랄은 용매의 킬로그램당 용질의 오스몰에 의한 용액의 농도이다. 이는 용매의 부피당 용질의 오스몰의 농도인 오스몰 농도와 다르다. 오스몰 농도는 물이 온도에 따라 그의 범위가 변하기 때문에 온도 의존성이다. 따라서, 오스몰랄 농도는 온도 의존성이 아니므로 바람직한 척도이다. 용질의 농도가 매우 낮은 경우, 오스몰 농도 및 오스몰랄 농도는 동등한 것으로 간주한다. 대조적으로, 긴장성은 세포막을 가로지르지 않는 모든 용질의 농도, 즉 세포막을 가로질러 삼투압을 생성시키는 용질의 농도에 의해 한정된다. 상기 형질도입 완충제와 관련하여, 고오스몰랄 농도는 고장성염, 예를 들어 상술한 염을 사용하여 성취된다. 상기 형질도입 방법을 실행하기 위해서, 세포막을 가로질러 삼투압이 존재하는 것이 중요하다. 따라서, 상기 형질도입 완충제는 오스몰랄 농도에 의해 한정될 수 있지만(세포의 단리에서), 형질도입 방법은 상기 형질도입 완충제가 세포 시토솔에 대해 고장성일 것을 요한다. 고장성 용액, 예를 들어 본 발명에 개시된 형질도입 완충제 중에 놓인 세포는 삼투에 의해 물을 상실할 것이다. 이는 세포가 수축되게 하며 집단 중 세포들간의 공간을 증가시키는 경향이 있다. 세포 부피 중의 상기 상실을 보상하기 위해서, 상기 세포는 대음세포작용, 즉 세포외 환경으로부터 거대분자의 유입을 활성화시킨다. 상기 형질도입 완충제의 최적의 오스몰랄 농도는 세포-유형 특이적이며, 부분적으로는 형질도입 전에 상기 세포를 유지하는데 사용되는 배양 배지의 오스몰랄 농도 및/또는 상기 세포 시토솔의 오스몰랄 농도에 의해 한정된다. 따라서 일부 실시태양에서, 세포에 관심 분자를 형질도입시키는 방법은 상기 세포 밖의 삼투압을 증가시키는 단계를 수반한다. 일부 실시태양에서, 세포막을 가로질러 삼투압이 존재한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 상기 세포가 형질도입 전에 유지된 배양 배지 및/또는 세포 시토솔에 대해 고장성이다. 즉, 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제의 오스몰랄 농도는 상기 세포가 형질도입 전에 유지된 배양 배지의 오스몰랄 농도보다 크고/크거나 세포 시토솔보다 크다. 인간 혈청의 노말 오스몰랄 농도는 약 275 내지 295 mOsm/㎏이다. 혈청 오스몰랄 농도의 일시적인 상승을 사용하여 뇌졸중 환자의 뇌 부종을 감소시켰지만, 인간에서 연장된 상승된 전체적인 오스몰랄 농도는 합병증을 유도할 수 있으며 심한 경우 치명적일 수 있다. 이러한 이유 때문에, 약학 조성물은 전형적으로 등장성(혈청과 대략 동일한 오스몰랄 농도를 갖는다)이다. 그러나, 개별적인 세포는 훨씬 더 높은 오스몰랄 농도(예를 들어 약 1000 mOsm/㎏ 이하)에서 생존할 수 있다. 따라서, 살아있는 유기체는 수일 동안 오스몰랄 농도의 보통의 상승을 허용할 수 있고 국소적으로 일시적으로 높은 오스몰랄 농도를 허용할 수 있다. 고오스몰랄 농도는 용액, 특히 체액 또는 배양 배지의 오스몰랄 농도의 이상 증가를 지칭한다. 인간 세포가 유지되는 오스몰랄 농도는 전형적으로 약 275 내지 295 mOsm/㎏이나, 예를 들어 착상전 배아는 약 250 내지 260 mOsm/㎏의 오스몰랄 농도에서 성장한다. 따라서, 전형적인 인간 세포의 상황에서, 고오스몰랄 농도는 약 250 mOsm/㎏ 초과의 오스몰랄 농도를 지칭한다. 따라서 약 295 mOsm/㎏ 초과의 오스몰랄 농도를 갖는 형질도입 완충제는 전형적인 인간 세포에 대해 고장성인 듯한 반면, 약 260 mOsm/㎏ 초과의 오스몰랄 농도를 갖는 형질도입 완충제는 초기 배아에 대해 고장성인 듯하다. 저-오스몰랄 농도는 용액, 특히 체액의 오스몰랄 농도의 이상 감소를 지칭한다. 따라서, 전형적인 인간 세포의 상황에서 저-오스몰랄 농도는 약 295 mOsm/㎏ 미만의 오스몰랄 농도를 지칭한다. 따라서 약 295 mOsm/㎏ 미만의 긴장성 염-매개된 오스몰랄 농도를 갖는 형질도입 완충제는 전형적인 인간 세포에 대해 저장성인 듯하다. 전형적인 배아의 상황에서, 저-오스몰랄 농도는 약 260 mOsm/㎏ 미만의 오스몰랄 농도를 지칭한다. 따라서 약 260 mOsm/㎏ 미만의 긴장성 염-매개된 오스몰랄 농도를 갖는 형질도입 완충제는 전형적인 초기 배아에 대해 저장성인 듯하다. 삼투 쇼크는 세포 주변 용질 농도의 갑작스러운 변화로, 상기 세포막을 가로질러 수 이동의 빠른 변화를 야기한다. 바람직한 실시태양에서, 형질도입 방법은 어떠한 단계에서도 세포의 저-삼투 쇼크 또는 고-삼투 환경을 필요로 하거나 수반하지 않는다. 일부 실시태양에서, 세포의 형질도입 방법은 고삼투 쇼크를 수반한다. 그러나, 어떠한 삼투 쇼크 또는 스트레스도 최소로 유지되는 것이 바람직하다(하기 삼투억제제 섹션 참조). 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 세포가 형질도입 전에 유지된 배양 배지에 대해 및/또는 세포 시토솔에 대해 등장성이 아니고/아니거나 등-삼투성이 아니다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 세포가 형질도입 전에 유지된 배양 배지에 대해 및/또는 세포 시토솔에 대해 저장성이 아니다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 세포가 형질도입 전에 유지된 배양 배지에 대해 및/또는 세포 시토솔에 대해 고장성 및/또는 고삼투성이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 250 mOsm/㎏ 초과, 예를 들어 300 mOsm/㎏ 초과의 오스몰랄 농도를 갖는다. 예를 들어, 상기 형질도입 완충제는 350 mOsm/㎏ 초과, 400 mOsm/㎏ 초과, 450 mOsm/㎏ 초과, 500 mOsm/㎏ 초과, 550 mOsm/㎏ 초과, 600 mOsm/㎏ 초과, 650 mOsm/㎏ 초과, 700 mOsm/㎏ 초과, 750 mOsm/㎏ 초과, 800 mOsm/㎏ 초과, 850 mOsm/㎏ 초과, 900 mOsm/㎏ 초과, 950 mOsm/㎏ 초과, 1000 mOsm/㎏ 초과, 1100 mOsm/㎏ 초과, 1200 mOsm/㎏ 초과, 1300 mOsm/㎏ 초과, 1400 mOsm/㎏ 또는 1500 mOsm/㎏ 초과, 1600 mOsm/㎏ 초과, 1700 mOsm/㎏ 초과, 1800 mOsm/㎏, 또는 1900 mOsm/㎏ 초과, 2000 mOsm/㎏ 초과, 2100 mOsm/㎏ 초과, 2200 mOsm/㎏ 초과, 2300 mOsm/㎏ 초과, 2400 mOsm/㎏ 초과, 2500 mOsm/㎏ 초과, 2500 mOsm/㎏ 초과, 2600 mOsm/㎏ 초과, 2700 mOsm/㎏ 초과, 2800 mOsm/㎏ 초과, 2900 mOsm/㎏ 초과, 또는 약 3000 mOsm/㎏의 오스몰랄 농도를 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 3000 mOsm/㎏ 미만, 예를 들어 2500 mOsm/㎏ 미만의 오스몰랄 농도를 갖는다. 예를 들어, 상기 형질도입 완충제는 2000 mOsm/㎏ 미만, 1900 mOsm/㎏ 미만, 1800 mOsm/㎏ 미만, 1700 mOsm/㎏ 미만, 1600 mOsm/㎏ 미만, 1500 mOsm/㎏ 미만, 1400 mOsm/㎏ 미만, 1300 mOsm/㎏ 미만, 1200 mOsm/㎏ 미만, 1000 mOsm/㎏ 미만, 900 mOsm/㎏ 미만, 800 mOsm/㎏ 또는 700 mOsm/㎏ 미만, 600 mOsm/㎏ 미만, 500 mOsm/㎏ 미만, 400 mOsm/㎏ 미만, 또는 약 400 mOsm/㎏의 오스몰랄 농도를 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 적어도 250 mOsm/㎏, 300 mOsm/㎏의 오스몰랄 농도를 갖는다. 예를 들어, 상기 형질도입 완충제는 적어도 350 mOsm/㎏, 적어도 400 mOsm/㎏, 적어도 450 mOsm/㎏, 적어도 500 mOsm/㎏, 적어도 550 mOsm/㎏, 적어도 600 mOsm/㎏, 적어도 650 mOsm/㎏, 적어도 700 mOsm/㎏, 적어도 750 mOsm/㎏, 적어도 800 mOsm/㎏, 적어도 850 mOsm/㎏, 적어도 900 mOsm/㎏, 적어도 950 mOsm/㎏,적어도 1000 mOsm/㎏, 적어도 1100 mOsm/㎏, 적어도 1200 mOsm/㎏, 적어도 1300 mOsm/㎏, 적어도 1400 mOsm/㎏ 적어도 1500 mOsm/㎏, 적어도 1600 mOsm/㎏, 적어도 1700 mOsm/㎏, 적어도 1800 mOsm/㎏, 적어도 1900 mOsm/㎏, 적어도 2000 mOsm/㎏, 적어도 2100 mOsm/㎏, 적어도 2200 mOsm/㎏, 적어도 2300 mOsm/㎏, 적어도 2400 mOsm/㎏, 적어도 2500 mOsm/㎏, 적어도 2600 mOsm/㎏, 적어도 2700 mOsm/㎏, 적어도 2800 mOsm/㎏, 적어도 2900 mOsm/㎏, 적어도 3000 mOsm/㎏, 또는 약 3000 mOsm/㎏의 오스몰랄 농도를 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 적어도 1250 mOsm/㎏의 오스몰랄 농도를 갖는다. 일부 실시태양에서 상기 오스몰랄 농도는 약 250 mOsm/㎏ 내지 약 1500 mOsm/㎏, 약 300 mOsm/㎏ 내지 약 1500 mOsm/㎏, 약 400 mOsm/㎏ 내지 약 1500 mOsm/㎏, 약 500 mOsm/㎏ 내지 약 1500 mOsm/㎏, 약 600 mOsm/㎏ 내지 약 1500 mOsm/㎏, 약 700 mOsm/㎏ 내지 약 1500 mOsm/㎏, 약 800 mOsm/㎏ 내지 약 1500 mOsm/㎏ , 약 900 mOsm/㎏ 내지 약 1500 mOsm/㎏, 약 1000 mOsm/㎏ 내지 약 1500 mOsm/㎏, 약 1100 mOsm/㎏ 내지 약 1500 mOsm/㎏, 약 1200 mOsm/㎏ 내지 약 1500 mOsm/㎏, 약 1300 mOsm/㎏ 내지 약 1500 mOsm/㎏ 또는 약 1400 mOsm/㎏ 내지 약 1500 mOsm/㎏, 약 300 mOsm/㎏ 내지 약 1000 mOsm/㎏, 약 300 mOsm/㎏ 내지 약 800 mOsm/㎏, 약 300 mOsm/㎏ 내지 약 600 mOsm/㎏, 약 400 mOsm/㎏ 내지 약 600 mOsm/㎏, 약 450 mOsm/㎏ 내지 약 550 mOsm/㎏, 약 400 mOsm/㎏ 내지 약 800 mOsm/㎏, 약 500 mOsm/㎏ 내지 약 800 mOsm/㎏, 약 600 mOsm/㎏ 내지 약 800 mOsm/㎏, 또는 약 700 mOsm/㎏ 내지 약 800 mOsm/㎏, 약 750mOsm/㎏ 내지 약 850 mOsm/㎏의 범위이다. 일부 실시태양에서, 상기 오스몰랄 농도는 약 800 mOsm/㎏ 내지 약 900 mOsm/㎏, 약 850 mOsm/㎏ 내지 약 950 mOsm/㎏, 약 900 mOsm/㎏ 내지 약 1000 mOsm/㎏, 약 950 mOsm/㎏ 내지 약 1050 mOsm/㎏, 약 1000 mOsm/㎏ 내지 약 1100 mOsm/㎏, 약 1050 mOsm/㎏ 내지 약 1150 mOsm/㎏, 약 1100 mOsm/㎏ 내지 약 1200 mOsm/㎏, 약 1150 mOsm/㎏ 내지 약 1250 mOsm/㎏, 약 1200 mOsm/㎏ 내지 약 1300 mOsm/㎏, 약 1250 mOsm/㎏ 내지 약 1350 mOsm/㎏, 약 1300 mOsm/㎏ 내지 약 1400 mOsm/㎏, 약 1350 mOsm/㎏ 내지 약 1450 mOsm/㎏, 약 1400 mOsm/㎏ 내지 약 1500 mOsm/㎏, 약 1600 mOsm/㎏ 내지 약 1800 mOsm/㎏, or 약 1700 mOsm/㎏ 내지 약 1800 mOsm/㎏, 약 1750 mOsm/㎏ 내지 약 1850 mOsm/㎏, 약 1800 mOsm/㎏ 내지 약 1900 mOsm/㎏, 약 1850 mOsm/㎏ 내지 약 1950 mOsm/㎏, 약 1900 mOsm/㎏ 내지 약 2000 mOsm/㎏, 약 1950 mOsm/㎏ 내지 약 2050 mOsm/㎏, 약 2000 mOsm/㎏ 내지 약 2100 mOsm/㎏, 약 2050 mOsm/㎏ 내지 약 2150 mOsm/㎏, 약 2100 mOsm/㎏ 내지 약 2200 mOsm/㎏, 약 2150 mOsm/㎏ 내지 약 2250 mOsm/㎏, 약 2200 mOsm/㎏ 내지 약 2300 mOsm/㎏, 약 2250 mOsm/㎏ 내지 약 2350 mOsm/㎏, 약 2300 mOsm/㎏ 내지 약 2400 mOsm/㎏, 약 2350 mOsm/㎏ 내지 약 2450 mOsm/㎏, 약 2400 mOsm/㎏ 내지 약 2500 mOsm/㎏, 약 2600 mOsm/㎏ 내지 약 2800 mOsm/㎏, 또는 약 2700 mOsm/㎏ 내지 약 2800 mOsm/㎏, 약 2750 mOsm/㎏ 내지 약 2850 mOsm/㎏, 약 2800 mOsm/㎏ 내지 약 2900 mOsm/㎏, 약 2850 mOsm/㎏ 내지 약 2950 mOsm/㎏, 약 2900 mOsm/㎏ 내지 약 3000 mOsm/㎏의 범위이다. 일부 실시태양에서, 상기 오스몰랄 농도는 약 250 mOsm/㎏ 내지 약 3000 mOsm/㎏, 약 300 mOsm/㎏ 내지 약 3000 mOsm/㎏, 약 350 mOsm/㎏ 내지 약 3000 mOsm/㎏, 약 400 mOsm/㎏ 내지 약 3000 mOsm/㎏, 약 450 mOsm/㎏ 내지 약 3000 mOsm/㎏, 약 500 mOsm/㎏ 내지 약 3000 mOsm/㎏의 범위이다. 하나의 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제의 오스몰랄 농도는 약 800 mOsm/㎏이다. 상기 오스몰랄 농도는 마우스 배아섬유아세포(MEF)에 적합한 것으로 입증되었다. 또 다른 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제의 오스몰랄 농도는 약 500 mOsm/㎏이다. 상기 오스몰랄 농도는 마우스 배아 줄기세포(mESC), 인간 유도된 다능성 줄기세포(hIPSC) 및 쥐 및 인간 신경줄기세포에 적합한 것으로 입증되었다. 그러나, 상기에 설명된 바와 같이, 숙련가는 표적 세포 유형, 형질도입된 분자의 성질 및 형질도입 전 세포 환경의 오스몰랄 농도에 따라 상기 형질도입 완충제의 바람직한 오스몰랄 농도가 변함을 알 것이다. 보다 높은 오스몰랄 농도는 관심 분자가 불충분하게 용해성인 단백질인 경우에 또한 바람직할 수 있다. 예를 들어, 불충분하게 용해성인 단백질에 약 1000 mOsm/㎏의 오스몰랄 농도가 바람직하다. 일부 실시태양에서, 예를 들어 CRISPR-Cas9 유전자 편집의 상황에서, 예를 들어 불충분하게 용해성인 단백질, 예를 들어 Cas9 뉴클레아제 단백질의 형질도입에 약 1250 mOsm/㎏의 오스몰랄 농도가 바람직하다. 일반적으로, 상기 형질도입 완충제의 오스몰랄 농도가 클수록, 상기 완충제가 더 효율적이다, 즉 형질도입에 필요한 시간이 적다. 그러나, 높은 오스몰랄 농도는 삼투압을 야기하고 세포 증식 및/또는 생육력을 감소시킬 수 있기 때문에(하기 참조) 또한 상충이 존재한다. 발명자들은 형질도입 시간("배양 시간" 또는 "형질도입 시간" - 하기 참조) 및 완충제의 오스몰랄 농도를 최적화하기 위한 분석을 개발하였다(도 10 및 실시예 6 참조). 따라서, 숙련가는 상기 분석을 사용하여 상기 형질도입 시간 및/또는 상기 완충제의 오스몰랄 농도를 최적화할 수 있었다. 형질도입을 위한 삼투억제제 상기 형질도입 완충제 중의 염은 형질도입 방법 동안 상기 형질도입 완충제가 세포에 대해 고장성이도록 상기 형질도입 완충제의 오스몰 농도를 증가시킨다. 이는 세포에 대한 삼투 스트레스를 야기할 수 있으며 몇몇 상황에서 이는 세포 증식 또는 생육력을 감소시킬 수 있다(예를 들어 BrdU 통합에 의해 측정된 바와 같이; 실시예 섹션 참조). 발명자들은 삼투억제제가 상기 효과를 방지할 수 있음을 발견하였다. 삼투억제제는 삼투물질로서 작용하고 세포 및 유기체를 삼투 스트레스로부터 보호하는데 일조하는 소분자이다. 화학적으로, 삼투억제제는 3가지 유형, 즉 베타인 및 관련 화합물, 폴리올 및 당(예를 들어 글리세롤, 만니톨 및 트레할로스) 및 아미노산으로 분류될 수 있다. 베타인은 질소 원자가 완전히 메틸화된 글리신의 메틸 유도체이다, 즉 상기는 4급 암모늄 화합물이다. 본 발명과 관련하여 유용한 글리신의 다른 메틸 유도체는 비제한적으로 사르코신 및 다이메틸글리신을 포함한다. 따라서 본 발명에 개시된 형질도입 화합물들 중 일부가 삼투억제제로서 작용할 수 있음은 숙련가에게 명백할 것이다. 삼투억제제로서 또한 기능하는 형질도입 화합물의 비제한적인 예는 GABA이다. 그러나, 모든 삼투억제제가 형질도입을 증대시키는 것은 아니다. 유사하게, 모든 형질도입 화합물이 삼투억제제로서 작용하는 것은 아니다. 따라서, 일부 실시태양에서 삼투억제제를 상기 형질도입 화합물(이와 관련하여 삼투억제제로서 기능할 수도, 기능하지 않을 수도 있다) 외에 상기 형질도입 완충제에 가한다. 발명자들은 다수의 상이한 유형의 삼투억제제 및 삼투억제제들의 다수의 상이한 조합이 형질도입 방법에 사용될 때 세포 생육력을 증가시킬 수 있음을 발견하였다(예를 들어 도 4 참조). 일부 실시태양에서, 상기 삼투억제제는 베타인 또는 관련 화합물, 폴리올 또는 당, 및/또는 예를 들어 글르신, 히스티딘, 알라닌, 아이소류신, 아르기닌, 아스파라진, 류신, 아스파트산, 리신, 글루탐산, 시스테인, 메티오닌, 페닐알라닌, 글루타민, 쓰레오닌, 트립토판, 프롤린, 발린, 오르니틴, 셀레노시스테인, 세린, 타이로신 및 프롤린 중에서 선택된 아미노산이다. 일부 실시태양에서 상기 삼투억제제는 글리신 또는 그의 유도체이다. 일부 실시태양에서, 상기 삼투억제제는 글리신의 메틸 유도체, 예를 들어 사르코신, 다이메틸글리신 또는 베타인이다. 다른 실시태양에서, 상기 삼투억제제는 글리신, 글리세롤, 타우린, 글리신베타인, 미오-이노시톨, 글루타민, 글루타메이트, 아르기닌, 만니톨 및 트레할로스 중에서 선택된다. 바람직한 실시태양에서, 상기 삼투억제제는 글리신 또는 글리세롤이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 한 가지 유형보다 많은 삼투억제제, 예를 들어 글리신 및 글리세롤을 포함한다. 글리신 및 글리세롤은 쥐 배아섬유아세포(도 4B에 도시된 바와 같은), 배아 줄기세포 및 인간 iPS 세포에서 최상의 보호를 제공하기 때문에 바람직한 조합이다. 그러나, 삼투억제제의 임의의 조합이 본 발명의 형질도입 완충제에 사용하기에 적합할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 개시된 삼투억제제들의 임의의 조합, 예를 들어 글리신, 글리세롤, 타우린, 글리신베타인, 미오이노시톨, 글루타민, 글루타메이트, 아르기닌, 만니톨 및 트레할로스 중 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 전부의 임의의 조합. 본 발명에 사용하기 위해 선택된 삼투억제제의 유형(또는 유형들의 조합)은 형질도입되는 세포의 유형에 따라 변할 수 있다. 삼투억제제의 적합성을 실시예 6에 개시된 분석(IV)에 의해 숙련가에 의해 쉽게 측정할 수 있다. 본 발명에 사용하기 위해 선택된 삼투억제제의 농도는 도입되는 세포의 유형에 따라 변할 수 있지만, 당해 분야에 충분히 공지된 방법들에 의해 숙련가에 의해 쉽게 측정될 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 삼투억제제의 농도는 약 5 내지 약 500 mM, 약 1 내지 약 500 mM, 약 1 내지 약 400 mM, 약 1 내지 약 300 mM, 약 1 내지 약 200 mM, 약 1 내지 약 100 mM, 약 10 내지 약 50 mM, 약 15 내지 약 50 mM, 약 20 내지 약 40 mM이다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 삼투억제제는 약 15 mM 또는 약 20 mM 또는 약 30 mM의 농도로 사용된다. 일부 실시태양에서, 상기 삼투억제제는 적어도 15 mM, 적어도 20 mM, 적어도 30 mM, 적어도 40 mM, 적어도 50 mM 적어도 60 mM, 적어도 70 mM, 적어도 80 mM, 적어도 90 mM, 적어도 100 mM, 적어도 200 mM, 적어도 300 mM, 적어도 400 mM 또는 약 500 mM의 농도로 사용된다. 일부 실시태양에서, 상기 삼투억제제는 500 mM 이하, 400 mM 이하, 300 mM 이하, 200 mM 이하, 100 mM 이하, 50 mM 이하, 40 mM 이하, 30 MM 이하 또는 20 mM 이하의 농도로 사용된다. 예를 들어, 바람직한 실시태양에서, 글리신 및/또는 타우린은 약 15 mM의 농도로 사용되고/되거나 글리세롤은 약 30 mM의 농도로 사용된다. 본 발명은 또한 세포에 분자를 형질도입시키기 위한, 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 이상)의 삼투억제제, 예를 들어 본 발명에 개시된 임의의 삼투억제제 또는 삼투억제제들의 조합의 용도를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 세포에 분자를 형질도입시키기 위한 삼투억제제로서 글리신 및/또는 글리세롤의 용도를 제공한다. 형질도입 완충제의 다른 성분들 본 발명에 개시된 형질도입 완충제의 추가적인 성분들 중 임의의 성분은 상기 형질도입 완충제의 부분일 수 있는 것으로 생각된다. 한편으로, 상기 성분들을 형질도입 방법의 한 단계로서 임의의 조합으로 세포에 동시에 또는 연속적으로 첨가할 수 있다. 상기 형질도입 완충제는 상기 완충제를 살아있는 세포 또는 살아있는 세포 배양물 또는 생체내 용도에 사용하기에 특히 적합하게 하는 성분들을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 상기 형질도입 완충제는 생물학적 pH 완충제, 점도 증가제, 및/또는 하나 이상의 성장 인자(들), 염, 아미노산, 비타민 및 영양분 중 하나 이상(예를 들어 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개)을 포함한다. 본 발명의 형질도입 완충제는 통상적으로 탈이온수, 증류수 중에서 제형화될 것이지만, 적합한 대체물, 예를 들어 비제한적으로 세포 배양 배지 또는 치료학적 용액을 사용할 수도 있다. 상기를 전형적으로는 사용전에, 예를 들어 자외선, 가열, 조사 또는 여과에 의해 멸균시켜 오염을 방지할 것이다. 상기를 보관 또는 수송을 위해 동결시킬 수도 있다(예를 들어 -20 ℃ 내지 -80 ℃, 예를 들어 -20 ℃ 또는 -80 ℃). 상기 형질도입 완충제는 오염을 방지하기 위해서 하나 이상의 항생제, 예를 들어 독시사이클린 또는 테트라사이클린을 함유할 수 있다. 그러나, 일부 항생제, 특히 비 세포-투과성 항생제(예를 들어 페니실린 및/또는 스트렙토마이신)는 세포에 형질도입될 때 상기 세포에 독성일 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 항생제를 포함하지 않는다, 예를 들어 상기 형질도입 완충제는 비 세포-투과성 항생제를 포함하지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 페니실린을 포함하지 않는다. 상기 형질도입 완충제를 약 6 내지 약 8의 pH, 예를 들어 약 7.2 내지 약 7.6의 pH 또는 약 7.4의 pH에서 생물학적 pH 완충제에 의해 완충시킬 수 있다. 상기 범위 밖(즉 8 초과 또는 6 미만)의 pH가, 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 측정될 수 있는 바와 같이, 특정 조직에의 투여에 적합할 수도 있다. 예를 들어, 위 pH는 1 또는 2 정도로 낮게 떨어질 수 있다. 따라서, 상기 위에 투여하기 위한 형질도입 완충제는 7 미만, 6 미만, 5 미만, 4 미만, 3 미만, 2 미만의 pH, 예를 들어 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1의 pH를 가질 수 있다. 생물학적 pH 완충제는 살아있는 세포에 사용하기에 적합한, 즉 세포 생육력에 대해 부정적인 영향을 최소로 미치는 pH 완충제이다. 상기 생물학적 pH 완충제는 카보네이트계 완충제 또는 임의의 다른 적합한 완충제일 수 있다. 다수의 생물학적 pH 완충제들이 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어 문헌[Plant Microtechnique and Microscopy, Oxford University Press, Steven E. Ruzin, ISBN: 0-19-508956-1]; 및 www.sigmaaldrich.com/life-science/core-bioreagents/biological-buffers/biological-buffer-products.html에 제공된 생물학적 완충제들을 참조하시오). 생물학적 pH 완충제의 예는 비제한적으로 PBS, TES, TRIS, PIPES, MOPS, MES, 굿(Good)의 완충제, 트리즈마(Trizma) 또는 HEPES를 포함한다. 따라서 일부 실시태양에서 상기 형질도입 완충제는 PBS, TES, TRIS, PIPES, MOPS, MES, 굿의 완충제, 트리즈마 또는 HEPES를 추가로 포함한다. 상기 형질도입 화합물 중 일부는 또한 상기 생물학적 완충제 대신에 완충제로서 또는 상기 완충제에 더하여 작용할 수 있으므로, 탁월한 완충 화합물이다. 상기 형질도입 완충제에 정제된, 천연, 재조합, 반-합성 및/또는 합성 성장 인자(예를 들어 실시예 4 참조)를 보충할 수 있다. 임의의 적합한 성장 인자 또는 성장 인자들의 조합을 사용할 수 있다. 적합한 성장 인자의 비제한적인 예는 EGF, FGF, HGF, PDGF, BDNF, VEGF 또는 IGF를 포함한다. 적합한 성장 인자들의 임의의 조합을 사용할 수 있다. 성장 인자 조합의 비제한적인 예는 EGF, FGF, HGF, PDGF, BDNF, VEGF 및 IGF로 이루어지는 목록 중 성장 인자들의 임의의 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)을 포함한다. 상기 첨가되는 성장 인자들은 일부 상황에서 형질도입되는 세포에 따라 변할 수 있으며, 특정 세포에 적합한 성장 인자를 선택하는 것은 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 성장 인자 또는 성장 인자들을 바람직하게는 약 1 내지 약 500 ng/㎖ 또는 5 이상 500 ng/㎖ 이하의 농도로 첨가한다. 바람직한 농도는 1, 2, 5, 10, 20, 25, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 ng/㎖ 이상 600, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 또는 100 ng/㎖ 이하이다. 보다 바람직한 농도는 10 ng/㎖ 이상 500 ng/㎖ 이하이다. 훨씬 더 바람직한 농도는 약 50 ng/㎖이거나 50 ng/㎖이다. 숙련가는 성장 인자의 최적 농도가 상기 성장 인자 및 형질도입되는 세포 둘 다에 따라 변함을 알 것이다. 상기 최적 농도는 당해 분야에 공지된 방법 및 본 발명의 실시예에 개시된 방법에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제에 사이토카인을 보충한다. 유사하게, 성장 인자에 대해, 상이한 사이토카인이 상이한 세포 유형의 배양에 적합하며, 적합한 사이토카인은 당해 분야에 공지되어 있다. 당해 분야에 공지된 다른 세포 유형의 특정한 인자들, 예를 들어 비제한적으로 수지상 세포의 경우 LIF(배아줄기세포의 줄기세포 상태를 유지시키기 위해) 및 GM-CSF를 또한 상기 형질도입 완충제에 가할 수 있다. 본 발명은 또한, 바람직하게는 본 발명에 개시된 바와 같은 형질도입 완충제 중에 또는 상기 완충제와 함께 사용될 때, 세포내로의 관심 분자의 형질도입을 증대시키기 위한 성장 인자, 사이토카인 및/또는 상기 신호전달 경로의 신경전달물질 및/또는 소분자 작용물질의 용도를 제공한다. 일부 실시태양에서 상기 형질도입 완충제는 점도 증가제를 추가로 포함한다. 상기는 상기 형질도입 완충제를 생체내에서 사용하기 위한 경우 상기 형질도입 완충제의 불필요한 분산을 방지하기 때문에 특히 바람직하다. 따라서, 상기는 상기 완충제를 상기 형질도입되는 세포와 접촉된 채로 유지시키는데 일조한다. 일부 실시태양에서, 상기 점도 증가제는 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리비닐 알콜, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스(NaCMC), 프로필렌 글리콜 알기네이트(PGA) 또는 나트륨 알기네이트(SA)이다. 바람직한 점도 증가제는 무독성이며 살아있는 세포 및/또는 생체내에서 사용하기에 적합하다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 산화방지제, 예를 들어 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA), 나트륨 바이설파이트, 나트륨 메타바이설파이트, 아스코르브산 또는 티오유레아를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 기본 배양 배지를 추가로 포함한다. 적합한 배양 배지는 상업적으로 입수할 수 있으며, 비제한적으로 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM), 최소 필수 배지(MEM), 녹아웃-DMEM(KO-DMEM), 글래스고우(Glasgow) 최소 필수 배지(G-MEM), 기본 배지 이글(BME), DMEM/햄스(Ham's) F12, 어드밴스드(Advanced) DEME/햄스 F12, 아이스코베(Iscove)의 변형된 둘베코의 배지 및 최소 필수 배지(MEM), 햄스 F-10, 햄스 F-12, 배지 199 및 RPMI 1640 배지를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 혈청을 추가로 포함한다. 그러나, 바람직한 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 불명확한 성분, 예를 들어 소 태아 혈청 또는 송아지 태아 혈청을 포함하지 않는다. 다양한 상이한 혈청 대체 제형들을 상업적으로 입수할 수 있으며 이들은 숙련가에게 공지되어 있다. 혈청 대체물이 사용되는 경우, 상기를 예를 들어 통상적인 기법에 따라 상기 배지 부피의 약 0.1% 내지 약 50%로 사용할 수 있다. 형질도입을 전형적으로는 특정 세포 유형의 정규적인 유지에 적합한 배양 배지에서 수행한다. 본 발명에 개시된 인자들 중 임의의 인자에 대해서, 상기 배양 배지는 상기 형질도입 완충제의 부분이거나 또는 상기 배지를 형질도입 방법에서 상기 세포에 별도로 가할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 형질도입 중 사용되는 배양 배지 중에 혈청이 존재하지 않거나 감소된 농도로 존재한다. 상기 완충제의 모든 성분들에 대해 제공되는 농도 범위는 상기 완충제가 형질도입에 사용 중인 때의 최종 농도이다(예를 들어 상기 완충제를 탈이온수, 증류수, 세포 배양 배지 또는 치료학적 조성물 중에서 제형화하는 때의 농도). 형질도입을 위한 단백질을 전형적으로는 5X 또는 10X 농축물로 제공하며, 상기는 세포 배양 배지에 첨가될 때 본 발명에 개시된 농도를 제공한다. 형질도입을 위한 관심 분자 바람직한 실시태양에서, 하나 초과의 관심 분자(즉 관심 분자의 다중 사본)를 세포에 형질도입시킨다. 예를 들어 적어도 2, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 2000, 적어도 5000, 적어도 10,000개의 관심 분자, 적어도 10 ⁴ , 적어도 10 ⁵ , 적어도 10 ⁶ , 적어도 10 ⁷ , 또는 10 ⁷ 초과의 관심 분자를 상기 세포에 형질도입시킨다. 본 발명의 형질도입 완충제 및 방법을 사용하여 다수의 상이한 유형의 생물학적 및 합성 분자를 세포에 형질도입시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 관심 분자는 단백질(펩타이드 및 폴리펩타이드 포함), 핵산, 폴리사카라이드(예를 들어 덱스트란), 소낭(예를 들어 엑소솜), 나노입자, 소분자, 바이러스 또는 다른 유기체일 수 있다. 일부 실시태양에서 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상)의 상이한 유형의 관심 분자를 세포에 형질도입시킨다. 일부 실시태양에서, 다수의 관심 분자들을 세포에, 예를 들어 복합 혼합물의 형태로 형질도입시킨다. 복합 혼합물의 비제한적인 예는 세포 및/또는 조직 추출물을 포함한다. 예를 들어, 쥐 배아줄기세포로부터의 추출물이 형질전환된 293T 세포주(세포막에 큰 구멍을 생성시키는 스트렙토리신의 사용으로 투과성으로 되었다)의 부분적인 리프로그래밍을 개시시키는 것으로 나타났다. 상기 방법은 세포에 의해 명백히 잘 허용되지는 않지만, 세포내로의 분자의 확산을 허용한다. 발명자들은 쥐 배아줄기세포 또는 인간 다능성 줄기세포의 세포- 또는 핵 추출물의 체세포, 예를 들어 피부 섬유아세포내로의 효율적인 형질도입이 상기 세포의 다능성 줄기세포내로의 효율적이고 완전한 리프로그래밍을 허용하는 것으로 가정한다. 유사하게, 다른 세포 유형 또는 조직의 추출물이 상기 형질도입된 세포유형 상에 상기 세포 또는 조직의 정체 또는 기능적 성질을 부여할 수 있다. 상응하게, 본 발명은 세포, 예를 들어 체세포를 다능성 세포(즉 iPS 세포)로 리프로그래밍하는 방법을 제공한다. 이는 또한 세포 운명 또는 기능을 매개하는 새로운 경로 또는 전사 인자를 식별하기 위한 중요한 도구이다. 따라서 일부 실시태양에서 세포 운명 또는 기능을 매개하는 새로운 경로 또는 전사 인자를 식별하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 본 발명에 개시된 형질도입 방법을 사용하여 세포 및/또는 조직 추출물을 세포에 형질도입시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자는 거대분자이다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자는 단백질이다. 단백질의 비제한적인 예는 단클론 항체, 사이토카인, 조직 성장 인자 및 치료학적 단백질을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자는 생물학적 약물(또한 생물학으로서 공지된)이다. 일부 실시태양에서, 상기 단백질은 효소이다. 예를 들어, 상기 효소는 핵산을 표적화하고 변형시키는 효소, 예를 들어 제한 효소, 엔도뉴클레아제, Cre-리콤비나제 또는 플립파제일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 엔도뉴클레아제는 변형된 엔도뉴클레아제, 예를 들어 TAL 효과기 뉴클레아제(TALEN)이다(Boch, J "TALEs of genome targeting". Nature Biotechnology 29 (2): 135-6, 2011). 상기와 같은 엔도뉴클레아제를 사용하여 세포 중 핵산을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 상기를 유전자 침묵 또는 활성화를 위한 돌연변이 또는 결실을 도입시키기 위해(예를 들어 엑손 스키핑에 의해) 특이적인 DNA 서열을 표적화하도록 설계할 수 있다. 발명자들은 TALEN을 세포에 형질도입시킬 수 있으며 상기는 삽입 및 결실을 포함하여 유전자 돌연변이를 도입시킬 수 있음을 입증하였다. 또한, TALE-DNA 결합 도메인을 다른 효과기 도메인, 예를 들어 DNA 메틸트랜스퍼라제 도메인(특정 부위에서 DNA 중의 시토신 잔기를 메틸화할 것이다), 히스톤 변형 도메인, 예를 들어 메틸트랜스퍼라제- 또는 아실트랜스퍼라제 도메인(상기 TALE 표적 부위 주변의 히스톤을 변형시킨다), 또는 다른 단백질 효과기 도메인에 커플링시킬 수 있다. 베타-락타마제는 본 발명에 개시된 완충제 및 방법에 의해 형질도입시킬 수 있는 효소의 또 다른 예이다. 따라서 일부 실시태양에서 상기 관심 분자는 베타-락타마제이다. 일부 실시태양에서, 상기 단백질은 전사 인자이다. 전사 인자의 세포내로의 형질도입을 사용하여 유전자 발현을 구동시키고 세포 운명, 표현형 또는 정체의 회로를 바꿀 수 있다. 예를 들어 OCT2, OCT3, OCT4, SOX2, KLF4, C-MYC, N-MYC, NANOG, ESRRB 및 LIN28이 모두 유도된 다능성 줄기(iPS) 세포의 생성에 사용되어 왔다. 전형적으로, 이들을 바이러스 벡터에 의해 세포에 도입시킨다. 그러나, 본 발명의 형질도입 방법으로 상기 방법을 대체할 수 있었다. 따라서, 일부 실시태양에서, 형질도입을 위한 관심 분자는 세포 주기의 조절, 한정 또는 변화 및/또는 세포 정체에 관련된 전사 인자이다. 다른 실시태양에서, 상기 전사 인자는 줄기세포의 유지 또는 분화에 관련된 전사 인자이다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 전사 인자는 OCT2, OCT3, OCT4, SOX2, KLF4, C-MYC, N-MYC, NANOG, ESRRB 및 LIN28 중에서 선택된다. 다수의 전사 인자들이 또한 몇몇 질병 및 질환들과 관련된다(표 A 참조). [표 A] 형질도입에 의한 잘못된 전사 인자의 교체는 치료 또는 연구 목적에 유용할 수 있었다. 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 전사 인자는 질병 또는 질환과 관련된 전사 인자이다. 일부 실시태양에서 상기 질병 또는 질환은 암, 대사성 질병, 심혈관 질병, 신경퇴행성 질병, 자가면역 질병 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서, 상기 질병 또는 질환은 유전병이다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 전사 인자는 MECP2, HNFs, IPF1/Pdx1, FOXP2, FOXP3, p53, STAT 및 HOX 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서, 2개 이상(예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상)의 전사 인자, 예를 들어 MECP2, HNFs, IPF1/Pdx1, FOXP2, FOXP3, p53, STAT 및 HOX로 이루어지는 목록 중의 전사 인자 중 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 전부가 본 발명의 형질도입 완충제 또는 방법에 포함된다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 유전자가 단백질인 경우, 상기는 핵산을 변형시킬 수 있는 단백질, 예를 들어 유전자 편집 시스템의 부분이다. 핵산을 변형시킬 수 있는 단백질은 전형적으로 뉴클레아제 효소 활성, 예를 들어 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제 활성을 갖는다. 따라서 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자는 뉴클레아제 효소 활성을 갖거나 또는 뉴클레아제이다. 상기 뉴클레아제 활성은 상기 단백질의 야생형 버전 중에 존재하거나, 또는 예를 들어 재조합 방법에 의해 부가되어 융합 단백질을 생성시킬 수 있다. 따라서 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자는 융합 단백질, 예를 들어 뉴클레아제 활성을 갖는 융합 단백질, 예를 들어 뉴클레아제 활성을 갖는 도메인에 융합된 전사 인자이다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자는 유전자 편집 시스템이거나 또는 유전자 편집 시스템의 부분이다. 일부 실시태양에서, 유전자 편집 시스템은 상기 논의된 바와 같이 핵산을 변형시킬 수 있는 단백질을 포함하고 임의로 추가의 분자, 예를 들어 안내 분자를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 유전자 편집 시스템은 특정한 서열, 예를 들어 아연 집게 뉴클레아제(ZFN) 또는 TALEN을 표적화하는 단백질들을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 상기 유전자 편집 시스템은 (별도의) 안내 분자에 의해 그의 표적 서열로 안내되는 단백질을 포함한다. 표적 서열로 안내되는 상기와 같은 단백질의 예는 비제한적으로 Cas9 뉴클레아제, 캐스케이드 시스템으로부터의 단백질, TtAgo 및 다른 아고너트 단백질, 및 다른 FOKI-뉴클레아제 관련 단백질을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 안내 분자는 안내 핵산, 예를 들어 sgRNA 또는 gDNA이다. 안내 핵산, 예를 들어 sgRNA 또는 gDNA를 표적 핵산 중의 특정한 서열을 표적화하기 위해 당해 분야에 공지된 방법에 의해 설계할 수 있다(예를 들어 sgRNA에 대해서 문헌[Mali, P., et al., RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science, 2013. 339(6121): p. 823-6]; 및 gDNA에 대해서 문헌[Swarts, D. et al, DNA-guided DNA interference by a prokaryotic Argonaute. Nature, 2014. 507, 258-261]을 참조하시오). 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자는 안내 핵산, 예를 들어 sgRNA 또는 gDNA(하기에 핵산과 관련된 추가의 설명을 참조하시오)이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 작은 안내 RNA의 예는 도 19에 도시된 바와 같은 sgRNA #1, sgRNA #2, sgRNA #3, sgRNA #4, sgRNA #5, sgRNA #6 또는 sgRNA #7을 포함한다. 하기의 작은 안내 RNA들이 특히 효율적인 유전자 편집을 생성시키는 것으로 나타났다: sgRNA #2, sgRNA #3, sgRNA #5, sgRNA #6 및 sgRNA #7(도 19B 참조). 일부 실시태양에서, 상기 단백질은 신호전달 분자이다. 일부 실시태양에서, 상기 단백질은 특정한 신호전달 경로 또는 신호전달 경로망을 활성화하거나 억제한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 단백질은 성장 인자-유도된 신호전달 경로, 사이토카인 신호전달 경로 또는 호르몬-유도된 신호전달 경로를 활성화하거나 억제한다. 일부 실시태양에서, 상기 단백질은 Wnt, 헤지호그(Hedgehog), BMP, SMAD, 히포(Hippo), 노취(Notch), JAK/STAT, NF-kB, cAMP, PLC 또는 당해 분야에 공지된 다른 신호전달 경로(예를 들어 문헌[Cell Signalling Biology, Michael J. Berridge, Module 2, Cell Signalling Pathways, Portland Press Limited 2012]을 참조하시오) 중에서 선택된 신호전달 경로를 활성화하거나 억제한다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자는 항체이다. 전형적으로 항체는 세포외 분자이다. 따라서, 세포내 표적과 관련된 것으로 밝혀진 경우, 상기 항체는 상기가 결합된 임의의 표적 분자와 함께 파괴에 대해서 표적화된다. 따라서, 발명자들은 항체를 세포내 표적에 표적화하고 이들을 본 발명의 형질도입 완충제 및 방법을 사용하여 세포내로 형질도입시킴으로써, 상기 세포내 표적을 파괴에 대해 특이적으로 표적화할 수 있었다. 세포내 표적을 표적화하는 항체를 때때로 "인트라바디(intrabody)"라 칭한다. 암-전투 항체의 내면화는 종양-특이적 단백질-단백질 상호작용의 차단에 의해 암 치료법을 지지할 수 있다(Bitler, BG and Schroeder, JA Recent Patents on Anti-Cancer Drug Discovery, 5 :99-108, 2010). 일부 실시태양에서, 상기 관심 단백질은 10 미만, 20 미만, 40 미만, 70 미만, 100 미만, 150 미만, 200 미만, 300 미만, 750 미만, 1000 미만, 1500 미만, 2000 미만, 5000 미만, 10,000 미만 아미노산의 길이이다. 다른 실시태양에서, 상기 관심 단백질은 5 이상, 10 이상, 20 이상, 40 이상, 70 이상, 100 이상, 150 이상, 200 이상, 300 이상, 750 이상, 1000 이상, 2000 이상, 5000 이상 아미노산의 길이이다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 단백질은 상기 값들 중 임의의 값 중에서 선택된 임의의 범위의 길이일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 단백질은 10-5000, 12-1800, 30-1200, 35-800, 40-500, 5-200, 5-50, 5-30, 5-20, 5-12, 2-50, 2-30, 2-20, 또는 2-12 아미노산의 길이이다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물, 완충제 또는 방법은 세포내로의 단백질의 형질도입에 적합하다. 추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물, 완충제 또는 방법은 세포내로의 단백질 및 핵산의 동시적인, 연속적인 또는 별도의 형질도입에 적합하다. 상기 관심 분자가 핵산인 실시태양에서, 상기 핵산은 DNA, cDNA, RNA, miRNA, siRNA 또는 이들의 임의의 변형된 버전이다. 일부 실시태양에서, 상기 핵산은 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 실시태양에서, 상기 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 일부 실시태양에서, 상기 핵산은 2-차원 또는 3-차원 핵산 구조, 예를 들어 DNA 케이지(예를 들어 약물 전달용)이다. 상기 DNA는 상기가 도입되는 세포에 대해 합성적, 재조합성, 외래 또는 고유일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 DNA는 플라스미드 DNA이다. 플라스미드 DNA는 대개 세포이물흡수에 의해 흡수된다. 그러나, 발명자들은 놀랍게도 상기 형질도입 완충제를 사용하여, 핵산 흡수 기전을 주로 세포이물흡수에 의한 것으로부터 주로 대음세포작용에 의한 것으로 이동시킬 수 있음을 입증하였다. 이는 핵산, 및 재조합 및 변형을 위해 핵산을 표적화하는 효소를 유전자 변형 및 유전자 요법을 위해 동시에 세포내로 형질도입시킬 수 있음을 의미한다. 일부 실시태양에서, 상기 핵산은 상기 세포와 관심 서열에 대해 상동 영역을 가져서, 예를 들어 상동 재조합을 허용한다. 일부 실시태양에서, 상기 핵산은 예를 들어 CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템 또는 다른 유전자 편집 시스템에 사용하기 위한 작은 안내 RNA(sgRNA), 또는 예를 들어 TtAgo 유전자 편집 시스템 또는 다른 유전자 편집 시스템에 사용하기 위한 작은 안내 DNA(gDNA)이다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자는 핵산이 아니다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 핵산은 10 미만, 20 미만, 40 미만, 70 미만, 100 미만, 150 미만, 200 미만, 300 미만, 750 미만, 1000 미만, 1500 미만, 2000 미만, 5000 미만, 10,000 미만의 뉴클레오타이드, 15,000 미만의 뉴클레오타이드, 20,000 미만의 뉴클레오타이드, 50,000 미만의 뉴클레오타이드, 100,000 미만의 뉴클레오타이드, 200,000 미만의 뉴클레오타이드, 250,000 미만의 뉴클레오타이드(또는 등가 염기) 길이이다. 다른 실시태양에서, 상기 관심 핵산은 1 이상, 5 이상, 10 이상, 20 이상, 40 이상, 70 이상, 100 이상, 150 이상, 200 이상, 300 이상, 750 이상, 1000 이상, 2000 이상, 5000 이상, 10,000 이상, 20,000 이상, 50,000 이상, 100,000 이상, 200,000 이상, 250,000 이상 뉴클레오타이드(또는 등가 염기)의 길이이다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 핵산은 상기 값들 중 임의의 값 중에서 선택된 임의의 범위의 길이일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 핵산은 10-10,000, 10-5000, 12-1800, 30-1200, 35-800, 40-500, 2-50, 5-30, 5-20, 또는 5-12 뉴클레오타이드(또는 그의 등가) 길이이다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 핵산은 염색체 전체 또는 그의 일부이다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자는 약 30 kDa 내지 약 500 kDa, 예를 들어 약 30 kDa 내지 약 200 kDa이다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자는 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 또는 약 200 kDa이다. 발명자들은 약 30 kDa(예를 들어 Oct-4) 내지 약 140 kDa(예를 들어 TALEN 단백질) 범위의 분자들을 본 발명의 완충제 및 방법을 사용하여 세포내로 형질도입시킬 수 있음을 입증하였다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자는 30 초과, 40 초과, 50 초과, 60 초과, 70 초과, 80 초과, 90 초과, 100 초과, 110 초과, 120 초과, 130 초과, 140 초과, 150 초과, 160 초과, 170 초과, 180 초과, 190 초과 또는 200 kDa 초과이다. 이러한 크기는 상기 관심 분자가 단백질 또는 펩타이드인 경우 특히 적용될 수 있다. 상기 관심 분자가 핵산 분자, 예를 들어 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드인 경우, 상기 크기는 전형적으로 뉴클레오타이드의 수에 의해 한정된다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자는 소분자이다. 소분자는 전형적으로 생물학적 과정의 효소 기질 또는 조절제로서 작용할 수 있는 저 분자량(<800 달톤)의 유기 화합물이다. 소분자의 형질도입은 약물 전달에 유용하다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자는 거대분자이다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자는 순 양전하를 갖는다. 또 다른 실시태양에서, 상기 관심 분자는 순음전하를 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자는 쯔비터이온성이다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자는 극성이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 관심 분자는 비-극성이다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자는 우세하게 소수성이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 관심 분자는 친수성이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 관심 분자는 중성이다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자는 약 pH 7에서 용해성이다. 용해도를 상기 형질도입 완충제에 의해 개선시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 형질도입을 위한 관심 분자를 포함한다. 다른 실시태양에서 상기 형질도입 완충제는 하나 초과의 형질도입을 위한 관심 분자, 예를 들어 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 관심 분자를 포함한다. 본 발명에 개시된 분자들의 임의의 조합을 상기 형질도입 완충제에 포함시키거나 또는 본 발명에 개시된 형질도입 방법에 사용할 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는, 예를 들어 형질도입을 위한 관심 분자로서 핵산 및 단백질, 예를 들어 엔도뉴클레아제 또는 Cre-리콤비나제(예를 들어 상기 핵산의 유전자 변형을 위해)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 형질도입을 위한 관심 분자로서 단백질 및 폴리사카라이드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 형질도입을 위한 관심 분자로서 핵산 및 지질을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 형질도입을 위한 관심 분자로서 핵산, 단백질 및 지질을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 방법은 하기의 관심 분자들의 조합의 비제한적인 예를 포함한다: 2개 이상의 상이한 단백질(예를 들어 TALEN 쌍), 2개 이상의 핵산 분자, 핵산 및 단백질(예를 들어 DNA 및 단백질), 폴리사카라이드(예를 들어 덱스트란) 및 단백질, 핵산 및 지질, 단백질 및 지질, 핵산, 및 단백질 및 지질. 핵산 및 단백질 쌍의 구체적인 예는 안내 핵산 및 뉴클레아제 활성을 갖는 단백질, 예를 들어 sgDNA 및 Cas9, 또는 gDNA 및 TtAgo를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 핵산 및 단백질은 핵산-단백질 복합체로서 존재한다. 같은 원리를 본 발명의 방법에 적용한다, 즉 세포를 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 관심 분자와 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, TALEN 단백질 및 핵산 및 임의로 지질을 세포에 동시에 형질도입시킬 수 있다. 형질도입을 위한 관심 분자의 농도는 상기 관심 분자, 세포 및 형질도입 목적에 따라 변한다. 숙련가는 적합한 농도를 결정할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입을 위한 관심 분자를 밀리몰, 마이크로몰 또는 나노몰 농도로 가한다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자를 상기 형질도입 완충제에 약 1 nM 내지 약 1 mM, 약 10 nM 내지 약 500 μM, 약 10 nM 내지 약 100 μM, 약 10 nM 내지 약 50 μM, 약 10 nM 내지 약 10 μM, 약 10 nM 내지 약 1 μM, 약 10 nM 내지 약 500 nM, 약 10 nM 내지 약 100 nM, 약 50 nM and 100 nM, 약 100 nM 내지 약 500 nM, 약 100 nM 내지 약 1 μM, 약 100 nM 내지 약 5 μM, 약 100 nM 내지 약 10 μM, 약 100 nM 내지 약 50 μM, 또는 약 100 nM 내지 약 100 μM의 농도로 가한다. 상기 관심 분자가 단백질인 경우, 상기 농도는 약 10 nM 내지 약 1 mM, 예를 들어 10 nM 내지 100 μM, 또는 약 100 nM 내지 약 1 μM일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자의 농도는 약 1 μM 내지 약 5 μM, 예를 들어 약 1 μM 또는 약 5 μM이다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자는 변형되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자는 담체 분자와 결합되지 않고/않거나 태그를 포함하지 않으며, 여기에서 상기 태그는 세포내로의 형질도입을 촉진한다. 예를 들어, 하나의 실시태양에서 상기 관심 단백질은 세포 투과성 펩타이드 또는 TAT 단백질로 태그되지 않는다. 추가의 예에서, 하나의 실시태양에서 핵산은 네이키드 핵산이다. 놀랍게도 본 발명의 방법을 사용하여 임의의 관심 분자를 변형 없이 세포에 형질도입시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자는 형질도입 화합물과의 복합체가 아니다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자는 미셀 또는 리포솜 중에 있거나 이들과 결합되지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자는 상기 형질도입 화합물과의 복합체가 아니다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자는 바이러스 벡터 중에 있거나 상기와 결합되지 않는다. 발명자들은 본 발명에 개시된 방법 및 완충제를 사용하여 바이러스를 세포내에 형질도입시킬 수 있음을 입증하였다(예를 들어 실시예 9 참조). 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 세포 또는 세포 집단에 바이러스를 형질도입시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 세포 또는 세포 집단을 형질도입 완충제와 접촉시키고 상기 세포 또는 세포 집단을 바이러스와 접촉시킴을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 바이러스를 세포 또는 세포 집단에 형질도입시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 세포 또는 세포 집단을 본 발명에 따른 형질도입 완충제와 접촉시키고 상기 세포를 바이러스와 접촉시킴을 포함한다. 상기 형질도입 완충제를 상기 세포에 투여 전에 상기 바이러스와 혼합하거나 또는 상기 바이러스와 동시에, 연속적으로 또는 별도로 투여할 수도 있다. 또한, 발명자들은 형질도입 완충제의 존재하에서 세포 집단이 상기 세포들 사이의 생성 공간을 수축시키고 상기 세포들에 보다 더 접근할 수 있게 함을 또한 관찰하였다. 이는 세포내로의 바이러스의 형질도입을 더욱 증대시킨다. 따라서, 일부 실시태양에서, 세포내로 관심 분자를 형질도입시키는 방법은 상기 세포의 크기 감소 및/또는 세포 사이의 공간의 증가를 수반한다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 발명자들은 상기 수축이 상기 형질도입 완충제 중의 염에 의해 유발된 고오스몰랄 농도의 결과인 것으로 가정한다. 그럼에도 불구하고, 상기에 이미 개시된 대음세포작용 기전이 여전히 세포내로의 바이러스의 형질도입의 증대에 중요한 역할을 하는 듯하다. 형질도입을 위한 세포 상기 형질도입 방법을 사용하여 관심 분자를 임의의 세포, 예를 들어 1차 세포 또는 줄기 세포(그의 유도체, 예를 들어 선조 세포 포함), 정상의 건강한 세포 또는 병든 세포에 형질도입시킬 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기 형질도입 방법에 관련된 세포는 포유동물 세포이다. 이는 상기 형질도입 완충제 및 방법이 포유동물 대음세포작용 시스템(보다 상세한 내용에 대해서 하기 참조)에 특히 매우 적합한 것으로 생각되기 때문이다. 그러나, 일부 실시태양에서, 상기 방법은 분자를 다른 동물 세포, 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 세균 세포에 형질도입시키기에 유용할 수도 있음이 또한 예상된다. 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 세포는 동물 세포, 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 세균 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 세균 세포가 아니다. 바람직한 실시태양에서, 상기 포유동물 세포는 인간, 영장류, 설치류(예를 들어 마우스 또는 래트), 토끼, 개, 고양이, 말, 소 또는 돼지 세포이다. 이들 포유동물은 연구 목적에 유용하고/하거나 본 발명의 형질도입 완충제 및 방법을 포함한 치료 또는 진단으로부터 이로울 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 비-인간 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 생체내, 임의로 원위치에 있다. 예를 들어, 의학적 상태의 치료 또는 진단시, 상기 관심 분자를 상기가 필요한 유기체 또는 조직에 상기 형질도입 완충제와 함께 직접 및 국소적으로 투여할 수 있었다. 또 다른 실시태양에서, 상기 세포는 시험관내에 있다. 예를 들어, 상기 세포는 배양 배지 중에 있을 수 있으며, 여기에서 상기 배양 배지는 상기 세포의 유지, 분화 및/또는 확대를 임의로 지지한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 확립된 세포주, 예를 들어 확립된 인간 세포주로부터 유래한다. 일부 실시태양에서, 상기 확립된 세포주는 불멸화된 세포주이다. 다른 실시태양에서, 상기 세포주는 1차 세포주이다. 다수의 종래 기술의 형질도입 방법들은 1차 세포에서 실행되지 않는다(배경 섹션 참조). 따라서, 본 발명의 형질도입 완충제 및 방법을 사용하여 분자를 1차 세포내에 형질도입시킬 수 있음은 놀라운 것이다. 본 발명과 관련하여 사용하기에 적합한 확립된 인간 세포주의 예는 비제한적으로 HeLa, ESTDAB 데이터베이스, DU145(전립선암), Lncap(전립선암), MCF-7(유방암), MDA-MB-438(유방암), PC3(전립선암), T47D(유방암), THP-1(급성 골수성 백혈병), COS7(신장 조직으로부터의 불멸화된 CV-1 세포), U87(교모세포종), 골수종으로부터 클로닝된 SHSY5Y 인간 신경모세포종 세포, Saos-2 세포(골암)를 포함한다. 상기 ESTDAB 데이터베이스(www.ebi.ac.uk/ipd/estdab/directory.html) 및 국립 암 연구소(NCI-60)는 본 발명에 사용하기에 적합한 암세포주의 추가적인 예들을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 확립된 세포주는 영장류 세포주, 예를 들어 Vero(1962년 개시된 아프리카 녹색 원숭이 클로로세부스 신장 상피 세포주)이다. 일부 실시태양에서, 상기 확립된 세포주는 설치류 세포주, 예를 들어 GH3(뇌하수체 종양), PC12(갈색세포종) 또는 MC3T3(태아 두개관)이다. 본 발명에 개시된 형질도입 완충제 및 방법에 사용하기에 적합한 다른 포유동물 세포주는 Madin-Darby 개 신장(MDCK) 상피 세포주, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주 및 Caco-2 세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 KBM7 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 1차 세포이다. 1차 세포 또는 세포주는 살아있는 유기체로부터 직접 취한 세포로부터 유래하며, 불멸화되지 않았다. 즉, 1차 세포 또는 세포주는 유전적으로 및 표현형적으로 안정하다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 줄기세포 또는 줄기세포의 분화에 의해 유래된 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 줄기세포는 다능성 줄기세포, 예를 들어 배아줄기세포, 임의로 인간 배아줄기세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 인간 배아 줄기세포가 아니다. 일부 실시태양에서, 상기 줄기세포는 상업적인 또는 산업적인 목적의 인간 배아의 사용을 수반하는 방법들에 의해 수득되지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 줄기세포는 인간 배아의 파괴를 필수적으로 수반하는 방법에 의해 수득되지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 줄기세포는 쥐 배아 줄기세포이다. 다른 실시태양에서, 상기 줄기세포는 성체 줄기세포, 예를 들어 신경, 지방 또는 조혈 줄기세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 쥐 또는 인간 신경 줄기세포, 뉴런 세포 또는 신경교 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 줄기세포는 유도된 다능성 줄기세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 체세포 또는 생식 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 면역계에 속하는 세포, 예를 들어 T 세포, B 세포 또는 백혈구, 예를 들어 비제한적으로 식세포(대식세포, 호중구 또는 수지상 세포), 비만세포, 호산구, 호염기구, 및 천연 살해 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 수지상 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입을 위한 세포를 약 4% 내지 약 10% CO ₂ , 약 5% 내지 약 9% CO ₂ , 약 6% 내지 약 8% CO ₂ , 바람직하게는 약 5% CO ₂ 를 포함하는 분위기에서 배양한다. 모든 실시태양에서, 명세서가 "세포"를 지칭하는 경우, 이는 단세포를 지칭하며 이를 또한 "세포 집단", 예를 들어 2개 이상, 10개 이상, 100개 이상, 1000개 이상, 10 ⁴ 개 이상, 10 ⁵ 개 이상, 10 ⁶ 개 이상, 10 ⁷ 개 이상, 10 ⁸ 개 이상의 세포에 적용한다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 개시된 형질도입 완충제 및/또는 방법을 사용하여 수득되거나 또는 수득될 수 있는 형질도입된 세포 또는 세포 집단을 제공한다. 본 발명은 관심 분자를 포함하는 세포 또는 세포 집단을 제공하며, 여기에서 상기 관심 분자는 본 발명에 개시된 형질도입 완충제 및/또는 방법을 사용하여 세포내에 형질도입되었다. 세포 생육력 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 형질도입 완충제 및 방법은 세포의 생육력에 최소의 영향을 미친다. 세포 생육력은 상기 형질도입된 세포의 다수의 용도들, 예를 들어 비제한적으로 형질도입된 세포의 이식; 연구 모델용으로 유전자 변형된 배아를 생성시키기 위한 형질도입된 세포의 용도; 및 연구 등에서의 형질도입된 세포의 용도에 중요하다("본 발명의 용도" 섹션 참조). 세포 생육력의 하나의 척도는 세포 증식이다(예를 들어 실시예 5에 개시된 바와 같은, BrdU 통합 분석). 계속되는 세포 증식은 정상 세포주기가 여전히 기능 중임을 설명한다. 증식, 생육력 및 세포독성을 측정하는 분석들은 당해 분야에 공지되어 있으며 이들을 상업적으로 입수할 수 있다(예를 들어 시그마 알드리치로부터). 상기와 같은 분석을 사용하여, 다양한 자극에 의한 처리 후의 배양물에서의 세포의 반응 및 건강을 모니터할 수 있다. 분석 방법의 적합한 선택은 사용되는 세포의 수 및 유형뿐만 아니라 예상되는 결과에 따라 변한다. 세포 증식에 대한 분석은 시간에 따른 세포수, 세포 분열수, 대사 활성 또는 DNA 합성을 모니터할 수 있다. 생육성 염료, 예를 들어 트립판 블루 또는 칼세인-AM을 사용하는 세포 카운팅은 생육 가능한 세포의 백분율뿐만 아니라 증식률을 모두 제공할 수 있다. 5(6)-카복시플루오레세인 다이아세테이트 N-숙신이미딜 에스테르(CFSE)는 집단이 겪은 세포분열수를 측정하기 위한 인기있는 선택이다. 세포에 진입시, CFSE는 세포내 에스테라제에 의해 절단되어 형광 화합물을 형성하고 숙신이미딜 에스테르기는 세포내 단백질상의 1차 아민과 공유적으로 반응한다. 분열시, 각 딸세포의 형광 강도는 이등분되며 이는 유식 세포측정에 의한 세포 분열수의 간단한 검출을 허용한다. 대사 활성을 측정하는 분석은 증식, 생육력 및 세포독성의 분석에 적합하다. 테트라졸륨 염, 예를 들어 MTT 및 XTT의 착색된 포르마잔 화합물로의 환원 또는 레사주린의 생물환원은 오직 대사적으로 활성인 세포에서만 발생한다. 활발하게 증식하는 세포는 그의 대사 활성을 증가시키는 반면 독소에 노출된 세포는 감소된 활성을 가질 것이다. 증식을 측정하는 분석의 일례는 BrdU 통합 분석이며, 상기 분석은 세포 증식 중 세포 DNA에의 BrdU 통합을 측정한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 형질도입 방법이 가해지는 세포에 상기 BrdU 통합 분석을 수행하는 경우, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 99% 초과 또는 모든 세포가 상기 세포들의 세포 DNA내에 BrdU의 통합을 나타낸다. 세포의 생육력을 또한 세포사멸 마커(예를 들어 애넥신 V, 카스파제 활성제 등)의 염색에 의해서 또는 세포사의 표시로서 프로피디움 요오다이드 흡수를 평가함으로써 평가할 수 있다. 상기와 같은 세포사멸 마커(예를 들어 애넥신 V, 카스파제 활성화)에 대해 양성 염색되지 않거나 또는 프로피디움 요오다이드를 흡수하지 않는 세포는 생육 가능한 세포이다. 바람직한 실시태양에서, 애넥신 V 염색을 사용하여 평가시, 1, 2, 3, 4 또는 5 라운드의 형질도입 후에 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 99% 초과 또는 모든 세포가 생육 가능하다. 몇몇 분자의 형질도입은 세포 중의 세포사 경로를 촉발할 수 있다. 예를 들어, 세포내에 도입된 외래 DNA/RNA는 인터페론 반응 경로를 촉발하여 세포사를 발생시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 방법 및/또는 형질도입 완충제는 세포사의 하나 이상의 억제제를 사용/포함한다. 세포사의 억제제, 예를 들어 인터페론 반응 경로의 억제제는 세포사멸 반응을 방지하는데 일조하고 따라서 세포 생존을 개선시킬 수 있다. 상기와 같은 억제제는 상기 인터페론 반응 경로의 다수의수준에서 작용할 수 있다, 예를 들어 상기 억제제는 인터페론의 그의 수용체에의 세포외 결합의 억제제, 세포내 인터페론 신호전달의 억제제, 인터페론 반응의 하류 효과기의 억제제(예를 들어 RNaseL, PKR, Jak/STAT 신호전달, Mx 억제제)일 수 있다. 사용될 수 있는 다른 유형의 억제제는 세포에서 외래 RNA/DNA의 검출을 개선시킬 수 있는 단백질 또는 소분자 화합물, 예를 들어 인플루엔자 A NS1 단백질을 포함한다. 억제제들의 조합을 또한 사용할 수 있다. 상기와 같은 억제제들의 예는 당해 분야에 공지되어 있다. 발명자들은 예를 들어 인터페론 억제제 단백질 B18R을 사용하였다(Nat Protoc. 2013 Mar;8(3):568-82. doi: 10.1038/nprot.2013.019. Epub 2013 Feb 21. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Mandal PK1, Rossi DJ; 및 Cell. 1995 May 19;81(4):551-60. Vaccinia virus encodes a soluble type I interferon receptor of novel structure and broad species specificity. Symons JA1, Alcami A, Smith GL.). 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 세포사의 하나 이상의 억제제, 바람직하게는 상기 인터페론 반응 경로의 억제제를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서 상기 억제제를 형질도입 전, 도중 및/또는 후에 가한다. 일부 실시태양에서 상기 억제제를 약 10 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖, 약 100 ng/㎖ 내지 약 500 ng/㎖, 약 200 ng/㎖ 내지 약 400 ng/㎖, 약 200 ng/㎖ 내지 약 300 ng/㎖, 또는 약 250 ng/㎖의 농도로 사용한다. 일부 실시태양에서, 상기 억제제는 B18R이며, 상기는 바람직하게는 형질도입 전(예를 들어 3시간 전), 형질도입 도중 및 형질도입 후(예를 들어 48시간 후) 약 250 ng/㎖로 사용된다. 상기와 같은 억제제는 핵산 분자를 세포내로 형질도입시킬 때(예를 들어 유전자 편집 시스템과 관련하여 작은 억제성 RNA(siRNA) 또는 작은 안내 핵산 분자, 예를 들어 sgRNA 또는 gDNA를 뉴클레아제, 예를 들어 Cas9에 의해 세포내에 형질도입시킬 때) 특히 유용하지만, 모든 유형의 관심 분자, 특히 세포사 경로를, 특히 상기 인터페론 반응 경로를 통해 활성화시킬 수도 있는 것들에 유용할 수 있다. 이들은 본 발명에 개시된 모든 형질도입 완충제 및 프로토콜에 적합하다. 형질도입을 위한 효율/시간 관심 분자를 세포에 형질도입시키기 위해서, 상기 관심 분자 및 세포를, 상기 분자가 상기 세포에 형질도입되기에 충분한 시간 동안 접촉시킨다. 일반적으로, 상기 세포내로의 흡수량은 상기 세포가 상기 형질도입 완충제 및 관심 분자와 접촉하는 시간의 양과 상관있다. 이는 본 발명에서 "배양 시간" 또는 "형질도입 시간"으로서 공지된다. 바람직한 실시태양에서, 상기 배양 시간은 약 1 내지 약 24시간, 예를 들어 약 2 내지 약 12시간 또는 약 2 내지 약 5시간이다. 일부 실시태양에서 상기 배양시간은 적어도 30분, 적어도 1 시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 적어도 4시간, 적어도 5시간, 적어도 6시간, 적어도 7시간, 적어도 8시간, 적어도 9시간, 적어도 10시간, 적어도 11시간, 적어도 12시간, 적어도 13시간 또는 13시간 초과이다. 일부 실시태양에서, 상기 배양 시간은 48시간 미만, 24시간 미만, 20시간 미만, 15시간 미만, 13시간 미만, 12시간 미만, 11시간 미만, 10시간 미만, 9시간 미만, 8시간 미만, 7시간 미만, 6시간 미만, 5시간 미만, 4시간 미만, 3시간 미만, 2시간 미만 또는 1시간 미만이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 시간은 3시간이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 시간은 12시간이다. 일부 실시태양에서, 상기 배양 시간은 약 30분 내지 약 1시간이다. 일부 실시태양에서, 상기 배양 시간은 약 1분 내지 약 30분, 약 30분 내지 약 60분, 약 30분 내지 약 90분, 약 60분 내지 약 90분, 또는 약 90분 미만, 또는 약 60분 미만이다. 상기 형질도입율은 세포 유형(및 형질도입 기전의 효율) 및 형질도입되는 관심 분자(그의 크기, 전하, 소수성 등)에 따라 변할 것이다. 발명자들은 또한 상기 형질도입 완충제의 오스몰랄 농도가 높을수록, 상기 형질도입율이 커짐을 입증하였다. 따라서, 보다 높은 오스몰랄 농도에서, 상기 형질도입율은 전형적으로 보다 높으며 보다 짧은 배양 시간이 요구된다. 환언하면, 보다 낮은 오스몰랄 농도에서는 상기 형질도입율이 더 낮고 동등한 형질도입 수준을 성취하기 위해서는 더 긴 배양 시간이 요구된다. 그러나, 본 명세서의 어딘가에 언급된 바와 같이, 고오스몰랄 농도는 세포 생육력에 부정적인 영향을 미칠 수 있으며 따라서, 상기 배양 시간이 오스몰랄 농도 및 세포 생육력과 균형을 이루게 해야 한다. 삼투억제제를 가함으로써 상기 세포 생육력을 보호하고 따라서 보다 높은 오스몰랄 농도 및 보다 짧은 배양 시간을 사용할 수 있다. 최적의 오스몰랄 농도, 배양 시간 및 삼투억제제 농도는 시행착오 및 최적화 시험을 사용하여 숙련가에 의해 측정될 수 있다(예를 들어 도 3 참조). 예를 들어 MEF 세포에서, 650 내지 800 mOsm/㎏의 오스몰랄 농도를 사용하고 상기 형질도입 완충제에 글리세롤 및 글리신을 포함시키는 일부 실시태양에서, 베타-락타마제의 형질도입을 위한 배양 시간은 3시간일 수 있다. MEF 세포에서, 단지 450 내지 650 mOsm/㎏의 오스몰랄 농도(즉 보다 낮은 오스몰랄 농도)를 사용하고 글리세롤 및 글리신을 포함하시키는 또 다른 실시태양에서, 최적 형질도입에 요구되는 배양 시간은 더 길수 있다, 예를 들어 12시간에 가까울 수 있다. 유사하게 mES 세포에서 450 내지 600 mOsm/㎏의 오스몰랄 농도를 사용하고 형질도입 완충제에 글리세롤 및 글리신을 포함시키는 일부 실시태양에서, 베타-락타마제의 최적의 형질도입을 위한 배양 시간은 약 12시간일 수 있다. 형질도입을 당해 분야에 공지되고 상업적으로 입수할 수 있는 리포터 구조물, 예를 들어 루시페라제 또는 GFP 리포터 구조물을 사용하여 정성적으로 또는 정량적으로 검출할 수 있으며, 여기에서 형광의 수준은 발현 수준에 상응한다(보다 상세한 내용에 대해서 실시예 섹션 참조). 일부 실시태양에서, 상기 방법은 1 라운드의 형질도입을 포함한다. 그러나, 다른 실시태양에서, 수회 라운드의 형질도입이 바람직할 수도 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상 라운드의 형질도입을 같은 세포상에서 수행한다. 각 라운드의 형질도입은 동일한 또는 상이한 관심 분자의 형질도입을 수반할 수 있다. 각 형질도입 라운드 사이에, 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11 또는 적어도 12 시간의 "회수 기간"이 있을 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 회수 기간은 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40 또는 적어도 50 분이다. 일부 실시태양에서, 회수 기간이 존재하지 않거나, 또는 24시간 미만, 12시간 미만, 6시간 미만, 3시간 미만, 1시간 미만, 30분 미만 또는 10분 미만의 회수 기간이 존재한다. 상기 회수 기간 동안, 상기 형질도입 완충제를 상기 세포로부터 제거하고 상기 세포를 전형적으로는 특정 세포 유형에 적합한 세포 배양 배지에서 배양한다. 예시적인 형질도입 완충제 및 방법 형질도입 완충제 및 방법의 비제한적인 예를 하기에 제공한다. 본 발명에 개시된 적합한 실시태양들의 임의의 조합을 형질도입 완충제 또는 형질도입 완충제를 포함하는 형질도입 방법에 사용할 수 있음을 알아야 한다. 조합가능한 실시태양들 중 일부 예를 하기에 제공한다. 일부 실시태양에서, 관심 분자를 세포에 형질도입시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 세포를 관심 분자와 접촉시키고 상기 세포를, 나트륨/수소 수송체 단백질에 결합하고/하거나 상기 단백질을 활성화시키는 염, 형질도입 화합물 및 임의로 삼투억제제로서 글리신 및/또는 글리세롤을 포함하는 형질도입 완충제와 접촉시킴을 포함하며, 여기에서 상기 형질도입 화합물은 소분자 화합물이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 소분자 화합물이고 세제가 아니다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 소분자 화합물이고, 세제가 아니며, 음으로 하전된 작용기에 생물등배전자성인 기를 갖는 쯔비터이온 또는 비-쯔비터이온 화합물이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 소분자 화합물이고, 세제가 아니며, 쯔비터이온이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 소분자 화합물이고, 음으로 하전된 작용기에 생물등배전자성인 기를 갖는 쯔비터이온 또는 비-쯔비터이온 화합물이다. 일부 실시태양에서, 세포에 관심 분자를 형질도입시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 세포를 관심 분자와 접촉시키고 상기 세포를, 나트륨/수소 수송체 단백질에 결합하고/하거나 상기 단백질을 활성화시키는 염, 표 1 중에서 선택된 형질도입 화합물 및 임의로 삼투억제제로서 글리신 및/또는 글리세롤을 포함하는 형질도입 완충제와 접촉시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 세포에 관심 분자를 형질도입시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 세포를 관심 분자와 접촉시키고 상기 세포를, 염(상기 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 세슘 또는 루비듐 클로라이드 또는 글루코네이트이다), 표 1 중에서 선택된 형질도입 화합물 및 임의로 삼투억제제로서 글리신 및/또는 글리세롤을 포함하는 형질도입 완충제와 접촉시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 세포에 관심 분자를 형질도입시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 세포를 관심 분자와 접촉시키고 상기 세포를, 염화 나트륨, 표 1 중에서 선택된 형질도입 화합물 및 임의로 삼투억제제로서 글리신 및/또는 글리세롤을 포함하는 형질도입 완충제와 접촉시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 세포에 관심 분자를 형질도입시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 세포를 관심 분자와 접촉시키고 상기 세포를, 염화 루비듐, 표 1 중에서 선택된 형질도입 화합물 및 임의로 삼투억제제로서 글리신 및/또는 글리세롤을 포함하는 형질도입 완충제와 접촉시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 세포에 관심 분자를 형질도입시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 세포를 관심 분자와 접촉시키고 상기 세포를, 나트륨/수소 수송체 단백질에 결합하고/하거나 상기 단백질을 활성화시키는 염, 화학식 I 또는 화학식 II에 따른 형질도입 화합물 및 임의로 삼투억제제로서 글리신 및/또는 글리세롤을 포함하는 형질도입 완충제와 접촉시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 세포에 관심 분자를 형질도입시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 세포를 관심 분자와 접촉시키고 상기 세포를, 염(상기 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 세슘 또는 루비듐 클로라이드 또는 글루코네이트이다), 화학식 I 또는 화학식 II에 따른 형질도입 화합물 및 임의로 삼투억제제로서 글리신 및/또는 글리세롤을 포함하는 형질도입 완충제와 접촉시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 세포에 관심 분자를 형질도입시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 세포를 관심 분자와 접촉시키고 상기 세포를, 염화 나트륨, 화학식 I 또는 화학식 II에 따른 형질도입 화합물 및 임의로 삼투억제제로서 글리신 및/또는 글리세롤을 포함하는 형질도입 완충제와 접촉시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 세포에 관심 분자를 형질도입시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 세포를 관심 분자와 접촉시키고 상기 세포를, 나트륨/수소 수송체 단백질에 결합하고/하거나 상기 단백질을 활성화시키는 염, 형질도입 화합물로서 GABA 및 임의로 삼투억제제로서 글리신 및/또는 글리세롤을 포함하는 형질도입 완충제와 접촉시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 세포에 관심 분자를 형질도입시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 세포를 관심 분자와 접촉시키고 상기 세포를, 염(상기 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 세슘 또는 루비듐 클로라이드 또는 글루코네이트이다), 형질도입 화합물로서 GABA 및 임의로 삼투억제제로서 글리신 및/또는 글리세롤을 포함하는 형질도입 완충제와 접촉시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 세포에 관심 분자를 형질도입시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 세포를 관심 분자와 접촉시키고 상기 세포를, 염화 나트륨, 형질도입 화합물로서 GABA 및 임의로 삼투억제제로서 글리신 및/또는 글리세롤을 포함하는 형질도입 완충제와 접촉시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 적어도 250 mOsm/㎏, 적어도 300 mOsm/㎏, 또는 적어도 700 mOsm/㎏의 오스몰랄 농도를 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 적어도 400 mOsm/㎏의 오스몰랄 농도를 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 적어도 1000 mOsm/㎏의 오스몰랄 농도를 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 방법은 세포막을 가로질러 삼투압을 유도하는 단계를 수반한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 세포가 형질도입 전에 유지된 배양 배지에 대해서 및/또는 세포 시토솔에 대해서 고장성이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 방법은 대음세포작용의 활성화 및/또는 엔도솜 용해의 활성화를 수반한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 방법(전체로서)은 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 110% 이상, 120% 이상, 150% 이상, 200% 이상, 300% 이상, 400% 이상, 500% 이상, 600% 이상, 700% 이상 또는 800% 이상의 형질도입 효율을 가지며, 여기에서 상기 방법은 대조용(즉 100% 형질도입 효율을 나타낸다)으로서 표 1에 나타낸 바와 같은 화합물 #1을 수반한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 세포의 75% 초과가 애넥신 V 염색을 사용하여 평가시 형질도입후 생육 가능하다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 GABA 작용물질, 성장 인자, Tat-HA2 융합 펩타이드 및 나트륨/수소 수송체 촉진제 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 세포를 형질도입 전에 수득하고/하거나 배양 배지에서 유지시키는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 세포를 형질도입 중에, 바람직하게는 항생제의 부재하에서 배양 배지와 접촉시킴을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 세포-투과성 항생제, 예를 들어 독시사이클린 또는 테트라사이클린을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 점도 증가제, 성장 인자, 사이토카인, 신경전달물질, 및 이들의 작용물질, 예를 들어 GABA 작용물질 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5)을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 세포를 상기 형질도입 완충제와 적어도 30분의 기간 동안, 바람직하게는 약 12시간 동안 접촉시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 적어도 2 라운드의 형질도입을 수반한다, 즉 상기 세포를 상기 형질도입 완충제 및 관심 분자에 의해 적어도 30분의 적어도 2개의 연속적인 기간 동안 접촉시키고 그 사이에 회수 기간을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 1차 세포이다. 하나의 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 염화 나트륨, 표 1에서 선택된 형질도입 화합물, 및 글리신 및/또는 글리세롤을 포함한다. 표 1에서 선택된 화합물은 약 5 내지 약 50 mM의 농도이다. 상기 글리신은 약 15 mM의 농도이다. 상기 글리세롤은 약 30 mM의 농도이다. 상기 염화 나트륨을 오스몰랄 농도를 대략 700 mOsm/㎏으로 조절하기 위해 가할 수 있다. 최종 부피는 물 또는 배양 배지, 예를 들어 DMEM 배지로 구성될 수 있다. 상기 형질도입을 위한 관심 분자를 상기 분자의 유형에 따라 적합한 농도로 가한다. 하나의 비제한적인 예에서, 상기 관심 분자의 농도는 약 10 nM 내지 약 100 μM일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 Tat-HA2 융합 펩타이드(상기는 약 5 μM의 농도로 존재할 수 있다)를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 완충제는 GABA 작용물질을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 하나 이상의 성장 인자 및/또는 사이토카인 및/또는 상기 신호전달 경로의 신경전달물질 및/또는 소분자 작용물질을 추가로 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 염화 나트륨, 표 1에서 선택된 형질도입 화합물, 및 글리신 및/또는 글리세롤을 포함한다. 상기 표 1에서 선택된 화합물은 약 50 내지 약 500 mM의 농도이다. 상기 글리신은 약 300 mM의 농도이다. 상기 글리세롤은 약 150 mM의 농도이다. 상기 염화 나트륨을 오스몰랄 농도를 대략 1000 mOsm/㎏으로 조절하기 위해 가할 수 있다. 최종 부피는 물 또는 배양 배지, 예를 들어 DMEM 배지로 구성될 수 있다. 상기 형질도입을 위한 관심 분자를 상기 분자의 유형에 따라 적합한 농도로 가한다. 하나의 비제한적인 예에서, 상기 관심 분자의 농도는 약 10 nM 내지 약 100 μM일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 Tat-HA2 융합 펩타이드(상기는 약 5 μM의 농도로 존재할 수 있다)를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 완충제는 GABA 작용물질을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 하나 이상의 성장 인자 및/또는 사이토카인 및/또는 상기 신호전달 경로의 신경전달물질 및/또는 소분자 작용물질을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물은 NDCB 또는 NDSB, 예를 들어 NDSB-201 또는 표 1에 나타낸 화합물 #42, #1, #45, #43, #44, #15, #10, #11, #28, #37 및 #46 중에서 선택된 화합물이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 방법은 mESC, iPSC, 인간 iPSC-유래된 신경교 세포 또는 뉴런을 관심 분자와 접촉시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자는 약 1 nM 내지 약 100 μM, 예를 들어 약 1 μM 또는 약 5 μM 농도의 단백질이다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 단백질은 CRE이다. 상기 형질도입 완충제는 염 및 형질도입 화합물을 포함하고, 임의로 5 μM Tat-HA2 융합 펩타이드 및 임의로 삼투억제제를 추가로 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 방법은 2회의 연속적인 라운드의 형질도입을 수반하며, 여기에서 상기 세포를 관심 단백질, 예를 들어 CRE와, 각 형질도입 라운드에서 12시간 동안 접촉시키고, 각 형질도입 라운드 사이에 12-시간 회수 기간을 갖는다. 마우스 배아 줄기(mES)세포를 하기의 프로토콜(실시예에서 "형질도입 프로토콜")을 사용하여 형질도입시킬 수 있다: 웰당 75,000 mES 세포를 mES 배지를 사용하여 젤라틴-코팅된 플레이트상에 시딩하고; 다음날, 5x 형질도입 완충제 중의 관심 분자(예를 들어 단백질, 예를 들어 Cre 단백질)를 mES 배지로 희석하고(예를 들어 1:5까지); 이어서 상기 완성 혼합물을 상기 세포에 가하고; 약 12시간 후에, 상기 형질도입 배지를 mES 배지로 교체한다. 마우스 신경 줄기세포를 하기의 프로토콜(실시예에서 "형질도입 프로토콜")을 사용하여 형질도입시킬 수 있다: 신경구를 신경 줄기세포 배지와 함께 도말하고; 이어서 5x 형질도입 완충제 중의 관심 분자(예를 들어 20 ㎕의 단백질, 예를 들어 CRE)를 상기 세포에 가하고 조심스럽게 혼합하고; 약 12시간 후에, 상기 형질도입 배지를 신선한 신경 줄기세포 배지로 교체한다. 인간 iPS 세포를 하기의 프로토콜(실시예에서 "형질도입 프로토콜 12/500")을 사용하여 형질도입시킬 수 있다. 세포를 예를 들어 mTeSR1 또는 TeSR-E8 제조사의 설명서에 따라 기계적 용해에 의해 작은 덩어리로 계대배양하고 매트리젤 코팅된 플레이트상에 시딩하여 약 50% 세포밀집도에 도달한다. 다음날, 5x 형질도입 완충제 중의 관심 분자(예를 들어 단백질, 예를 들어 CRE 단백질)를 mTeSR1 또는 TeSR-E8 배지로 희석한다(예를 들어 1:5). 이어서 상기 완성 혼합물을 상기 세포에 가한다. 12시간의 형질도입 후에, 배지를 신선한 mTeSR1 또는 TeSR-E8 배지로 교체하고, 세포를 24 내지 48시간 동안 배양할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제를 사용하여 DNA 및 지질을 세포에 형질도입시킨다(예를 들어 실시예 7 및 도 11 참조). 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 플라스미드 DNA 및 지질을 포함한다. 예를 들어, 상기 형질도입 완충제는 100 ng 플라스미드 DNA, 0.8 ㎕ 리포펙타민 LTX 지질 시약, 0.1 ㎕ 플러스 시약(라이프 테크놀로지스(Life Technologies)) 및 20 ㎕의 5x 형질도입 완충제를 포함한다. 최종 형질도입 완충제는 100 ㎕ mESC 배지 및 백혈병 억제 인자(LIF)를 포함한다. LIF를 ES 세포와 관련하여 사용하여 상기 줄기세포 상태를 유지시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제를 사용하여 DNA 및 단백질을 세포에 형질도입시킨다(예를 들어 실시예 8 및 도 12 참조). 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 100 ng 플라스미드 DNA, 0.8 ㎕ 리포펙타민 LTX 지질, 0.1 ㎕ 플러스 시약(라이프 테크놀로지스) 및 20 ㎕의 5x 형질도입 완충제 중의 CRE 단백질을 포함한다. 최종 형질도입 완충제는 100 ㎕ mESC 배지 및 LIF를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 세포, 예를 들어 인간 iPS 세포에의 바이러스 통합을 증대시킨다(예를 들어 실시예 9 및 도 13 참조). 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 농축된 바이러스 쇼크, 폴리브렌, 및 인간 iPS 배양 배지를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 방법은 낮은 용해도를 갖는 단백질의 형질도입에 적합하다(실시예 10 참조). 일부 실시태양에서, 낮은 용해도를 갖는 단백질의 형질도입에 적합한 형질도입 완충제는 약 100 mOsm/㎏의 오스몰랄 농도를 가지며, 약 250 mM의 농도로 형질도입 화합물을 포함하고, 약 150 내지 300 mM의 농도로 삼투억제제를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 D-MEM N2/B27 중의 500 mM NaCl, 250 mM NDSB-201, 300 mM 글리신, 150 mM 글리세롤 및 LIF를 포함한다. 이는 "2/1000" 형질도입 완충제이다. 상기는 낮은 용해도를 갖는 단백질의 형질도입에 적합하다. 하나의 실시태양에서 mES 세포의 형질도입 방법을 제공한다. 상기 mES 세포의 형질도입 방법은 80 ㎕의 2/1000 형질도입 완충제를 20 ㎕의 5x 형질도입 완충제 12/500 중의 CRE 단백질(또는 다른 관심 분자)에 첨가함을 포함한다. 상기 세포를 2시간 동안 배양한다. 배양에 이어서, 상기 형질도입 완충제를 mESC 배지로 교체한다. 일부 실시태양에서, 인간 iPS 세포를 TALEN 단백질로 형질도입시킬 수 있다(예를 들어 실시예 11 참조). 일부 실시태양에서, 인간 iPS 세포를 약 2 μM TALEN 단백질과 약 12시간 동안 배양한다. 예를 들어 약 20 ㎕의 5x 형질도입 완충제 중의 TALEN 단백질을 약 80 ㎕의 인간 iPS 세포 배지와 혼합한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제를 단백질 및 대분자의 세포내로의 동시 형질도입에 사용할 수 있다(예를 들어 실시예 12 참조). 예를 들어 하나의 실시태양에서 덱스트란 및 BSA를 MEF에 형질도입시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 세포를 1x 형질도입 배지(프로토콜 3/700) 중에서 5 ㎍/㎖의 덱스트란 및 1 ㎍의 BSA와 30분 동안 배양시킴을 포함한다. 후속으로 세포를 1x 형질도입 완충제로 2회 세척한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제 및 방법을, 핵산을 변형시킬 수 있는 단백질 또는 유전자 편집 시스템의 세포내로의 형질도입에 사용할 수 있다. 일부 실시태양에서, 핵산을 변형시킬 수 있는 단백질 또는 유전자 편집 시스템, 예를 들어 Cas9 뉴클레아제 및 sgRNA를 세포에 형질도입시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 세포를 약 1250 mOsmol/㎏의 오스몰랄 농도에서 약 250 mM의 형질도입 화합물(예를 들어 화합물 #20)과 약 60분 동안 배양함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 2회 연속 라운드의 형질도입을 사용할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 세포를 형질도입 전(예를 들어 약 3시간 전), 및/또는 형질도입 중 및/또는 형질도입 후(예를 들어 약 48시간 후) 약 250 ng/㎖의 B18R 단백질과 함께 배양한다. 일부 실시태양에서, 글리신(예를 들어 15 mM) 및/또는 글리세롤(예를 들어 30 mM)을 삼투억제제로서 포함시킨다. 숙련가는 본 발명의 범위 내에 있는 다른 적합한 프로토콜들을 대안으로 사용할 수 있음을 알 것이다. 본 발명은 또한 세포 중의 핵산, 예를 들어 유전자 서열을 변형시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 세포를 핵산을 변형시킬 수 있는 단백질 및 형질도입 완충제와 접촉시킴을 포함하며, 여기에서 상기 형질도입 완충제는 (i) 형질도입 화합물, (ii) 나트륨-수소 수송체의 염 또는 활성제/촉진제, 및 바람직하게는 (iii) 삼투억제제를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 핵산을 변형시킬 수 있는 단백질을 특정한 표적 서열에 표적화하며, 예를 들어 상기 단백질은 아연 집게 뉴클레아제 또는 TALEN, Cas9, Cas9 유사체, DNA-표적화된 FokI-뉴클레아제-관련 단백질, 캐스케이드 복합체, TtAgo 단백질 또는 다른 아고너트 단백질 또는 이들의 유도체이다. 일부 실시태양에서, 상기 세포를 상기 단백질이 표적 유전자 서열로 향하게 하기 위해서 안내 분자와 추가로 접촉시킨다. 일부 실시태양에서, 오스몰랄 농도를 약 1000 mOsm/㎏ 내지 약 1500 mOsm/㎏, 바람직하게는 약 125 mOsm/㎏으로 조절한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물을 약 200 nM 내지 약 400 nM, 바람직하게는 약 250 mM의 농도로 사용한다. 일부 실시태양에서, 형질도입을 약 1시간 내지 약 24시간 동안, 또는 약 1시간 내지 약 12시간 동안 수행한다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 완충제는 인터페론 반응 경로의 억제제, 예를 들어 B18R을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 줄기세포, 예를 들어 iPS 세포 또는 줄기세포주, 예를 들어 인간 줄기세포주이다. 일부 실시태양에서, 상기 삼투억제제는 글리신, 글리세롤, 타우린, 글리신베타인, 미오-이노시톨, 글루타민, 글루타메이트, 아르기닌, 만니톨 및 트레할로스 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서, 세포에서 핵산, 예를 들어 유전자 서열의 변형 방법에서, 상기 핵산을 변형시킬 수 있는 단백질은 상기 세포 중에 10일 미만, 5일 미만, 4일 미만, 3일 미만, 2일 미만, 1일 미만, 12시간 미만, 6시간 미만 또는 1시간 미만 동안 존재한다. 상기 핵산을 변경시킬 수 있는 단백질이 상기 세포 중에 너무 오래 존재하는 경우, 해로운 표적-외 효과를 갖기 시작할 수 있다(즉 비-표적 서열이 변형될 수 있다). 이는 종종 수일에 걸쳐 발현 플라스미드로부터의 단백질의 발현을 수반하는 전통적인 형태의 형질감염이 갖는 문제점이다. 일부 실시태양에서, 세포에서 핵산, 예를 들어 유전자 서열의 변형 방법은 상기 변형된 세포를 단리 또는 사용함을 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 의해 수득될 수 있거나 수득되는 변형된 세포를 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 변형된 세포는 형질도입된 유전자 편집 시스템을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 변형된 세포는 바이러스 벡터를 포함하지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 변형된 세포는 나노입자 담체를 포함하지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 세포 투과성 펩타이드를 포함하지 않는다. 약학 조성물 일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 형질도입 완충제 및 형질도입을 위한 관심 분자를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 상기 형질도입 완충제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 분자 및 형질도입 완충제 성분을 동시에 또는 연속적으로 투여한다. 상기 약학 조성물은 상기 형질도입 완충제 및 관심 분자 외에 추가의 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 약학 조성물은 대개 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 것이며, 상기 담체는 그 자체가 상기 조성물을 수용하는 환자에게 유해한 항체의 생산을 유도하지 않으며 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 적합한 약학적으로 허용 가능한 담체는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 예를 들어 액체, 예를 들어 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 포함할 수 있다. 보조 물질, 예를 들어 습윤 또는 유화제, pH 완충 물질 등이 또한 약학 조성물 중에 존재할 수 있다(문헌[Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472]을 참조하시오). 일부 실시태양에서, 형질도입 화합물 또는 형질도입 화합물 및 핵산을 변형시킬 수 있는 단백질, 예를 들어 유전자 편집 시스템을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물은 무균 및/또는 무-발열원일 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 약학 조성물로 사전-충전된 용기(예를 들어 바이알) 또는 전달 장치(예를 들어 주사기)를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 조성물을 상기와 같은 용기 또는 장치에 도입시킴을 포함하는, 상기 용기 또는 장치의 제공 과정을 제공한다. 적합한 용량은 치료되는 개인의 건강 및 신체 상태, 연령, 치료되는 개인(예를 들어 인간, 비-인간 영장류, 영장류 등)의 분류학적 그룹, 목적하는 형질유도의 정도, 약학 조성물의 제형, 치료중인 의사의 의학적 상황의 평가 및 다른 관련 인자들에 따라 변할 수 있다. 상기 용량은 통상적인 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 있을 수 있다. 본 발명의 조성물을 다양한 액체 형태로 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물을 주사가능물질, 용액 또는 현탁액으로서 제조할 수 있다. 국소적인 피하 또는 근육내 투여용 주사가능물질이 전형적이다. 주사는 바늘(예를 들어 피하 주사바늘)을 통해 이루어질 수 있지만, 한편으로 무바늘 주사가 사용될 수도 있다. 조성물은 항균제를 포함할 수 있다. 항균제, 예를 들어 티오메르살 및 2-페녹시에탄올이 약학 조성물 중에서 통상적으로 발견되지만, 무-수은 보존제를 사용하거나 보존제를 사용하지 않는 것이 바람직하다. 조성물은 세제, 예를 들어 트윈(폴리솔베이트), 예를 들어 트윈 80을 포함할 수 있다. 세제는 일반적으로 낮은 수준, 예를 들어 <0.01%로 존재한다. 일부 실시태양에서, 상기 완충제는 세제를 포함하지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 방법은 형질도입 중에 세제의 사용을 수반하지 않는다. 유효 투여량 부피는 상기 조성물의 목적에 따라 통상적으로 확립될 수 있다. 상기 조성물의 전형적인 인간 용량은 예를 들어 근육내 주사(예를 들어 관심 근육 또는 조직내로의 국소 주사)의 경우 약 0.5 ㎖일 수 있다. 유사한 용량이 다른 전달 경로에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 형질도입 완충제 또는 본 발명의 약학 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 세포 및/또는 형질도입을 위한 관심 분자를 추가로 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 사용 설명서를 포함할 수도 있다. 상기 키트는 하나 이상의 별도의 용기, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상의 별도의 용기 중에 상기 형질도입 완충제의 다양한 성분들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 염 용액을 포함하는 용기, 형질도입 화합물을 포함하는 용기, 관심 분자를 포함하는 용기, 삼투억제제를 포함하는 용기 및/또는 희석제 또는 배지를 포함하는 용기를 포함할 수 있다. 또한 상기 키트는 본 발명에 개시된 바와 같은 추가적인 다른 성분들 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있으며, 여기에서 상기는 상기 형질도입 완충제와 동시, 연속 또는 별도 투여에 적합하다. 발명의 용도 본 발명은 관심 분자를 세포에 형질도입시키기 위한 형질도입 완충제의 용도를 제공한다. 세포내로의 분자의 형질도입은 연구 및 치료 둘 다의 이유 때문에 유용할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 형질도입 완충제 및 방법을 유전자 변형에 사용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 세포내로의 몇몇 효소의 형질도입은 상기 세포의 게놈의 변형 또는 외래 핵산 서열의 변형을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 형질도입된 분자(예를 들어 효소)는 하나 이상(예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 10 ⁴ , 10 ^5, 10 ⁶ , 10 ⁷ 이상의 서열)의 핵산의 삽입, 결실, 치환, 전좌, 역위 또는 변형을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, Cre-Lox 재조합은 세포의 DNA에서 결실, 삽입, 전좌 및 역위를 수행하기 위해 광범위하게 사용되는 부위-특이적인 리콤비나제 기술이다(Turan, S.; Galla, M.; Ernst, E.; Qiao, J.; Voelkel, C.; Schiedlmeier, B.; Zehe, C.; Bode, J. (2011). "Recombinase-mediated cassette exchange (RMCE): traditional concepts and current challenges". J. Mol . Biol . 407 (2): 193-221). 상기는 특정한 세포 유형에 표적화되거나 또는 특정한 외부 자극에 의해 촉발되는 DNA 변형을 허용한다. 이는 진핵생물 및 원핵생물 시스템 모두에서 실행된다. 상기 시스템은 Lox 서열이라 지칭되는 한 쌍의 짧은 표적 서열을 재조합하는 단일 효소, Cre 리콤비나제로 이루어진다. 상기 시스템은 임의의 여분의 지지 단백질 또는 서열을 삽입시키지 않고 실행될 수 있다. 상기 Cre 효소 및 LoxP 서열이라 지칭되는 원래의 Lox 부위는 박테리오파지 P1으로부터 유래된다. Lox 서열을 적합하게 놓는 것은 유전자가 활성화되거나, 억제되거나, 또는 다른 유전자와 교환되게 할 것이다. DNA 수준에서 많은 유형의 조작들이 수행될 수 있다. 상기 Cre 효소의 활성은 상기 효소가 특정한 세포 유형에서 발현되거나 외부 자극, 예를 들어 화학 신호 또는 열 쇼크에 의해 촉발되도록 조절될 수 있다. 상기 표적화된 DNA 변화는 세포 계통 추적에 유용하며 전체적으로 발현되는 경우 돌연변이체는 치사적이다. 상기 Cre-Lox 시스템은 작용 및 용도가 FLP-FRT 재조합 시스템(상기는 사카로마이세스 세레비지아에의 2 ㎛ 플라스미드로부터 유래된 리콤비나제(Flp)에 의한 짧은 플립파제 인식 표적(FRT) 부위들간의 서열의 재조합을 수반한다)과 매우 유사하다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 세포에 Cre 리콤비나제 또는 플립파제의 형질도입을 위한 Cre-Lox 또는 FLP-FRT 재조합 시스템에서 상기 형질도입 완충제의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 세포에 관심 분자의 형질도입 방법을 제공하며, 여기에서 상기 관심 분자는 Cre 리콤비나제 또는 플립파제이다. 일부 실시태양에서, 상기 형질도입 화합물, 완충제 또는 방법을 특정한 유전자 서열의 유전자 변형(또한 본 발명에서 "유전자 편집"이라 칭한다)에 사용할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 또한 세포 중의 유전자 서열의 변형 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 본 발명의 형질도입 방법을 포함하고, 상기 관심 분자는 핵산, 바람직하게는 특정한 유전자 서열을 변형시킬 수 있는 단백질이며, 임의로 유전자 편집 시스템의 부분이다. 최근 수년간, 특정한 게놈 표적 서열을 찾는 방식이 상이한 2개의 필수적으로 상이한 유전자 편집 시스템이 개발되었다. 아연-집게 뉴클레아제(ZFN) 및 TALEN에 의해 대표되는 한 가지 유형은 게놈 중 특정한 표적 DNA 서열을 인식하기 위해서 뉴클레아제 단백질 자체 내에 맞춤가능한 도메인을 사용한다. 다른 유형은 Cas9/CRISPR, 캐스케이드 및 TtAgo 및 다른 아고너트 단백질 시스템[때때로 융합 단백질로서 뉴클레아제 도메인, 예를 들어 FokI 뉴클레아제 도메인에 커플링되며, 관련된 뉴클레오타이드 서열(예를 들어 sgRNA 또는 gDNA)에 의해 특정한 표적에 표적화되는 게놈 표적 부위와 관계 없이 동일한 공통 단백질(복합체)을 사용한다]에 의해 대표된다. 전통적으로, 이들 유전자 편집 시스템은 단백질/RNA 기구를 암호화하는 핵산으로서 세포내로 형질감염되었으며; 이어서 상기 형질감염된 핵산은 상기 세포내에서 발현된다. 핵산 형질감염에 대한 전통적인 방법은 바이러스 벡터, 일렉트로포레이션 또는 담체 나노입자 또는 리포솜을 수반한다. 이들 방법은 임상 적용을 방해하며 어딘가에 설명된 바와 같이 몇몇 세포 유형에 비효율적이다. 발명자들은 대조적으로 본 발명에 개시된 형질도입 화합물, 완충제 및 방법이 단백질 및/또는 핵산을 세포에 직접 전달하여(예를 들어 유전자 편집 시스템의 부분으로서) 빠르고, 비-바이러스성이며 매우 효율적인 유전자 편집을 허용함을 입증하였다. 구체적으로, 발명자들은 상기에 언급된 유전자 편집 기구의 2가지 "유형" 모두를 본 발명의 형질도입 화합물, 완충제 및 방법을 사용하여 형질도입시킬 수 있음을 입증하였다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 형질도입 방법을 유전자 변형에 사용하며, 여기에서 상기 형질도입은 바이러스 벡터의 사용을 필요로하거나 포함하지 않고(특히, 세포내부에서 단백질을 발현하기 위한 바이러스 벡터의 사용을 포함하지 않고), 일렉트로포레이션의 사용을 필요로하거나 포함하지 않고, 담체 나노입자의 사용을 필요로하거나 포함하지 않고, 및/또는 리포솜의 사용을 필요로하거나 포함하지 않는다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 형질도입 방법에 의해 수득될 수 있거나 또는 수득되는 세포를 제공하며, 예를 들어 여기에서 상기 세포는 바이러스 벡터를 포함하지 않거나(예를 들어, 유전자를 변형시킬 수 있는 단백질을 암호화하는 바이러스 벡터를 포함하지 않거나), 또는 예를 들어 상기 세포는 담체 나노입자, 미셀 또는 리포솜을 포함하지 않는다. 일부 실시태양에서, 세포에 형질도입되는 분자는 엔도뉴클레아제이다. 엔도뉴클레아제는 특정한 서열에서 DNA 가닥을 절단하는 효소이다. 전사 활성제-유사 효과기(TALE)는 특정의 목적하는 DNA 서열에 결합하도록 설계된 조작된 전사 조절제이다(Moscou, J & Bogdanove, AJ Science 326 (5959): 1501, 2009). 상기와 같은 조작된 TALE를 엔도뉴클레아제 도메인(DNA 가닥을 절단한다)과 병용함으로써, 임의의 목적하는 DNA 서열에 특이적인 엔도뉴클레아제를 조작할 수 있다. 상기 제한 효소를 세포에 도입시킬 때, 상기 효소는 조작된 뉴클레아제에 의한 게놈 편집으로서 공지된 기법인 원위치 게놈 편집에 사용될 수 있다. 전사 활성제-유사 엔도뉴클레아제(TALEN)를 사용하여 수복 기전으로 세포가 응답하는 이중-가닥 절단(DSB)을 유도함으로써 게놈을 편집할 수 있다(Zhang, F et.al. Nature Biotechnology 29 (2): 149-53, 2011). 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 제한 효소-기반 또는 엔도뉴클레아제-기반(예를 들어 TALEN-기반) 유전자 공학에서 상기 형질도입 완충제의 용도를 제공한다. 상응하게, 일부 실시태양에서 세포에 형질도입되는 관심 분자는 TALEN이다. 외래 핵산 서열을 또한 본 발명의 방법에 의해 또는 대안의 전사 방법에 의해 세포에 도입시킬 수 있다. DNA를 외인성 이중-가닥 DNA 단편의 존재하에서 비-상동 엑손 결합을 통해 게놈에 임의로 도입시킬 수 있다. 상동성 지향된 수복이 또한, 형질감염된 이중-가닥 서열을 수복 효소에 대한 주형으로서 사용하기 때문에, 외래 DNA를 이중-가닥 절단에 도입시킬 수 있다. 따라서, TALEN은 안정하게 변형된 인간 배아줄기세포 및 유도된 다능성 줄기세포(iPS 세포) 클론을 생성시키고, 녹아웃 씨 엘레간스, 녹아웃 래트, 및 녹아웃 제브라피시를 생성시키는데 사용되었다. 따라서, 일부 실시태양에서, TALEN 또는 다른 형질도입된 분자에 의한 유전자 변형을 사용하여, 유전자-변형된 동물의 생성을 위한(예를 들어 특정한 특성을 나타내거나 또는 특정한 유전자 질병 또는 질환을 갖는 모델 유기체의 생성을 위한) 착상-전 배아 또는 배반포의 변형에 현재 사용되는 주사 기법을 대체할 수 있었다(Voncken JW. Methods Mol Biol. 2011;693:11-36). 다른 도메인을 상기 TALE 주쇄상에 커플링시킴으로써, DNA를 다른 방식으로 변형 또는 조절할 수 있다. 예를 들어, 상기 엔도뉴클레아제 도메인 대신에 전사촉진 도메인의 첨가는 TALE를 전사 활성제로 바꾼다. 억제제 도메인의 첨가는 유전자 전사를 차단하는 TALE를 생성시킨다. 메틸화 도메인의 첨가는 특정한 부위에서의 DNA 메틸화를 허용한다. 유사하게, 히스톤 변형 도메인(예를 들어 히스톤 아세틸라제)의 첨가는 특정한 부위에서의 히스톤 변형을 허용한다. 이들은 모두 본 발명에 사용하기 위한 분자로서 예상된다. 일부 실시태양에서, 단백질 뉴클레아제 및 안내 핵산(예를 들어 sgRNA 또는 gDNA)을 본 발명의 형질도입 화합물, 완충제 및/또는 방법을 사용하여 동시에 또는 연속적으로 세포에 형질도입시킨다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 Cas9 뉴클레아제 및 sgRNA를 세포에 동시에 또는 연속적으로 형질도입시킨다. 작은 안내 RNA 및 안내 DNA를 특정한 DNA 서열을 표적화하도록 설계할 수 있으며 따라서 상기 조합을 특정한 유전자 편집에 사용할 수 있다. 상기에 언급한 바와 같이, 상기 조합은 CRISPR/Cas9 시스템으로서 공지되어 있다. 다른 유사한 시스템 및 Cas9 뉴클레아제에 대한 대체물은 캐스케이드 시스템, TtAgo 및 다른 아고너트 단백질, 및 다른 FOKI-뉴클레아제 관련 단백질로부터의 단백질을 포함한다. 따라서 일부 실시태양에서, 본 발명은 유전자 편집 시스템, 예를 들어 TALEN 시스템, CRISPR/Cas9 시스템(바람직하게는 상이한 종들로부터의 Cas 유사체를 수반하는 시스템 포함), FokI 뉴클레아제 시스템, 캐스케이드 시스템, TtAgo 시스템 또는 다른 아고너트 단백질 시스템을 세포에 형질도입시키는 방법을 제공한다. 본 발명에 개시된 형질도입 화합물 및 완충제를 상기와 같은 방법에 사용할 수 있으며 이들은 바이러스 형질감염(상기 설명 참조)의 필요 없이, 세포에서의 유전자 편집을 허용할 수 있다. 일부 실시태양에서 상기 유전자 편집 시스템에 의해 표적화된 핵산은 내인성 핵산, 예를 들어 게놈 DNA이다. 다른 실시태양에서, 상기 유전자 편집 시스템에 의해 표적화된 핵산은 외인성 핵산이며, 이를 예를 들어 상기 형질도입 방법의 부분으로서 상기 유전자 편집 시스템에 의해 상기 세포에 형질도입시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기와 같은 유전자 편집 시스템을 사용하여 표적화된 유전자 돌연변이, 예를 들어 비제한적으로 단일대립유전자 또는 이중대립유전자 녹아웃을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 실시예 14에서 발명자들은 이중대립유전자 WDR85 유전자 붕괴를 설명하였다. 본 발명의 방법을 사용하여 세포에 형질도입될 때(예를 들어 종래 기술의 바이러스 형질감염 방법을 사용하는 대신에), 상기 유전자 편집 시스템은 매우 효율적인 단일대립유전자 또는 이중대립유전자 녹아웃을 생성시킨다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 방법은 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 또는 적어도 70%의 단일대립유전자 또는 이중대립유전자 변형(또는 녹아웃)을 생성시킨다. 유전자 편집을 또한 동물에서 유전자 기능을 연구하고 인간을 포함한 동물에서 유전자 요법을 연구하는데 사용할 수 있다. 상기는 또한 합성 생물학 분야에서 세포 및 유기체가 새로운 기능을 수행하도록 조작하는데 유용하다. 또한, 유전자 기능을 변형된 세포주, 예를 들어 줄기세포주에서 연구할 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 형질도입 화합물, 방법 또는 완충제는 특히 상기 유전자 편집 실시태양과 함께 사용될 때, 유전자 요법 또는 합성 생물학에 대해 유전자 기능을 연구하는데 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기와 같은 방법에서, 상술한 바와 같은 효소를 동물에게 착상전에 배아 또는 배반포 세포에 형질도입시켜 상기 세포를 유전자 변형시킨다. 따라서 일부 실시태양에서 본 발명의 형질도입 완충제 및 방법을 모델 유기체, 예를 들어 녹아웃 유기체의 생성에 사용할 수 있었다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 형질도입 완충제 및 방법을 인간에서, 예를 들어 인간 배아 또는 배반포 단계(예를 들어 착상-전 유전학)에서 유전병을 유전학적으로 치료하는데 사용할 수 있었다. 따라서 본 발명은 세포에 관심 분자를 형질도입시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 관심 분자는 핵산 및/또는 핵산을 변형시키는 효소이며 임의로 상기 세포는 배아 또는 배반포 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 유전자 변형은 외래 DNA의 숙주 게놈내로의 삽입을 수반하며, 여기에서 상기 외래 DNA는 본 발명의 방법에 의해 세포에 도입되는 관심 분자이다. 그러나, 이상 삽입 및 게놈 붕괴를 피하기 위해서, 일부 실시태양에서, 상기 유전자 변형은 비-삽입성 접근법을 수반한다, 즉 상기 변형된 핵산을 상기 게놈에 삽입하지 않는다. 본 발명의 형질도입 완충제 및 방법을 또한, 세포를 다능성 줄기세포 유지에 관련된 몇몇 전사 인자들을 발현하도록 유전학적으로 변형시키거나 또는 상기 세포에 전사 인자를 직접 형질도입시킴으로써 iPS 세포를 생성시키는데 사용할 수 있었다. 다능성의 유도에 관련된 전사 인자의 예는 비제한적으로 OCT2/3/4, SOX2, KLF4, C-MYC, N-MYC, NANOG, ESRRB 및 LIN28을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 치료, 예방 또는 진단에 사용하기 위한 형질도입 완충제 또는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 세포에 관심 분자를 형질도입시킴을 포함하는 치료 또는 진단 방법을 제공한다. 상기 세포는 생체내 세포일 수 있으며, 이 경우에 치료는 직접 치료이다. 한편으로, 상기 세포는 시험관내에서, 예를 들어 시험관내 진단을 위해서 형질도입될 수 있다. 한편으로, 상기 세포를 상기 세포의 환자에의 이식 전에 시험관내에서 형질도입시킬 수도 있다. 상기 이식은 자가조직이거나 동종이계일 수 있다, 즉 상기 형질도입된 세포를 상기 세포를 취한 동일 환자내에 다시 이식하거나(자가조직) 또는 상이한 사람(동종이계)에게 이식할 수있다. 바람직한 실시태양에서 상기 이식은 자가조직이다. 단클론 항체, 사이토카인, 조직 성장 인자 및 치료 단백질을 포함한 생물학적 약물(또한 생물학적 약물로서 공지됨)은 치료법에 사용하기 위한 화학적 소분자에 대한 대체물로 점점 더 중요해지고 있다. 그러나, 생물학적 약물과 관련된, 특히 관심 표적으로의 상기 약물의 전달과 관련된 다수의 어려움들이 존재한다. 본 발명의 형질도입 완충제 및 방법을 사용하여 세포로의 생물학적 약물의 전달을 개선시킬 수 있었다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 본 발명의 방법에서 관심 분자는 예를 들어 단클론 항체, 사이토카인, 조직 성장 인자 및 치료 단백질 중에서 선택된 생물학적 약물이다. 상기 관심 세포를 시험관내에서 형질도입시키고 환자에게 다시 이식하거나, 또는 상기 세포를 생체내에서 형질도입시킬 수 있다. 일부 실시태양에서 치료법에 사용하기 위한, 핵산을 변형시키는 단백질, 예를 들어 유전자 편집 시스템(예를 들어 ZNF, TALEN, CRISPR/Cas9, 캐스케이드 시스템, TtAgo 및 다른 아고너트 시스템 및 다른 FOKI-뉴클레아제 관련 단백질)을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 치료법은 본 발명에 따라 세포에 분자를 형질도입시키는 방법을 포함한다. 다수의 질병 및 상태가, 핵산을 변형시키는 단백질, 예를 들어 유전자 편집 시스템의 형질도입에 의해 치료될 수 있으며, 질병 또는 질환이 치료될 수 있음은 숙련가에게 명백할 것이다. 핵산을 변형시키는 단백질, 예를 들어 유전자 편집 시스템의 형질도입에 의해 치료될 수 있는 상태 및 질병은 비제한적으로 유전자 질병, 예를 들어 낫세포 질병, 레베르 선천성 흑내장, X-결합된 SCID, ADA-SCID, 부신백질 이영양증, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 다발성 골수종, 혈우병 및 파킨슨병을 포함한다. 상기 치료법은 체세포 또는 생식세포 유전자 요법일 수 있다, 즉 일부 실시태양에서 상기 형질전환 방법에서의 세포는 체세포 또는 생식세포이다. 본 발명의 형질도입 완충제 및 방법을 사용하여 항원을 면역계에 제공하기 위해서 항원-제공 세포에 로딩할 수 있다. 이는 유리하게는 신규의 백신 제조 방법을 생성시킨다. 예를 들어, 항원을 시험관내에서 수지상세포에 로딩하고 이어서 다시 몸에 이식하였다. 그러나, 지금까지 사용되어 온 상기 방법은, 예를 들어 세포이물흡수와 같은 기전을 사용하여 세포에 단백질을 강제로 집어넣었기 때문에 상기 수지상 세포를 손상시켰다. 수지상 세포는 매우 활발한 대음세포작용 경로를 이미 갖고 있다. 따라서, 본 발명의 방법을 사용함으로써 상기 수지상 세포에, 상기 세포에 대해 무시할만한 손상으로, 대음세포작용 기전을 통해 항원을 로딩할 수 있었다. 상기 방법을 환자에게 상기 세포를 이식하기 전에 시험관내에서 수행하거나 또는 항원을 예를 들어 피하 주사에 의해 생체내에서 수지상 세포(또는 다른 항원 제공 세포)에 형질도입시킬 수 있었다. 상응하게, 항원을 항원 제공 세포에 형질도입시키기 위한 형질도입 완충제의 용도를 제공한다. 또한 항원을 항원 제공 세포에 형질도입시키기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 백신을 제조하기 위한 본 발명의 형질도입 완충제의 용도 및/또는 방법을 제공하며, 예를 들어 이때 상기 백신은 본 발명의 방법에 의해 형질도입된 항원-제공 세포를 포함한다, 즉 관심 항원이 상기 세포에 형질도입되었다. 유사하게, 본 발명은 환자에게 세포를 투여함을 포함하는 상기 환자의 백신접종, 치료 또는 예방 방법을 제공하며, 여기에서 상기 세포는 본 발명의 방법에 의해 형질도입되었다. 마찬가지로 본 발명은 환자에게 세포를 투여함을 포함하는 상기 환자의 백신접종, 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 세포를 제공하며, 여기에서 상기 세포는 본 발명의 방법에 의해 형질도입되었다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 양이온성 지질-매개된 DNA 형질감염 방법에서 본 발명에 개시된 형질도입 완충제의 용도를 제공한다. 본 발명은 지질 및 DNA를 세포에 형질도입시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 본 발명에 개시된 바와 같다. 일반적인 내용 상기 "포함하는"이란 용어는 "포함하는"뿐만 아니라 "이루어지는"을 포함한다, 예를 들어 X를 "포함하는" 조성물은 X만으로 이루어지거나 또는 추가적인 어떤 것을 포함할 수 있다, 예를 들어 X+Y. 상기 "실질적으로"란 용어는 "완전히"를 제외하지 않는다, 예를 들어 Y가 "실질적으로" 없는 조성물은 Y가 완전히 없을 수도 있다. 필요한 경우, "실질적으로"란 단어는 본 발명의 정의로부터 생략될 수도 있다. 수치 x와 관련하여 "약"이란 용어는 예를 들어 x±10%를 의미한다. 상기는 또한 구체적으로 정확한 값, 예를 들어 상기 예에서 정확하게 10%를 지칭한다. 필요한 경우, "약"이란 단어는 본 발명의 정의로부터 생략될 수도 있다. "하나의"란 용어는 달리 구체적으로 명시되지 않는 한, "하나 이상"을 의미한다. 예를 들어, 상기는 "단지 하나"를 의미하거나 또는 "하나 초과", 예를 들어 "2, 3, 4, 5 또는 그 이상"을 의미할 수 있다. 달리 구체적으로 명시되지 않는 한, 2개 이상의 성분을 혼합하는 단계를 포함하는 방법은 임의의 구체적인 혼합 순서를 필요로 하지 않는다. 따라서 성분들을 임의의 순서로 혼합할 수 있다. 3개의 성분이 존재하는 경우, 2개의 성분을 배합하고, 이어서 상기 조합을 세 번째 성분 등과 배합할 수 있다. 본 발명을 단지 예로서 개시할 것이나 변형을 본 발명의 범위 및 진의 내에 서 수행할 수 있음을 알 것이다. 실시예 1 세포에 소분자 또는 거대분자를 도입시키는 능력은 연구 및 의학에서 중요한 용도를 갖는다. 불행하게도, 세포막은 많은 생물 활성 분자들의 도입에 큰 장애를 제공한다. 뉴클레오타이드(DNA, RNA, siRNA) 및/또는 치료학적 분자의 세포내 도입에 상당한 노력이 투자되었으며, 1차 세포는 여전히 도전이지만, 막관통 담체로서 양이온성 지질, 나노입자 또는 바이러스 벡터를 사용한 진보가 이루어졌다. 대조적으로, 단백질의 세포내 전달을 위한 신기술의 개발은 실제로 정체상태이다. 그럼에도 불구하고, 세포에 단백질을 도입시키는 능력은 백신 개발, 게놈 편집, 후성적 리프로그래밍, (줄기)세포 분화 및 세포내 과정의 조작에 많은 용도를 가질 것이다. 따라서, 특히 1차 세포에서, 단백질 및 다른 거대분자의 효율적인 세포내 전달을 위한 보다 양호한 기술의 개발이 대단히 필요하다. 여기에서 우리는 염-유발된 고장성, 소분자 화합물 및 삼투억제제의 조합이 세포 생육력에 영향을 미치지 않으면서, 소분자 및 거대분자의 1차 세포내로의 확고하고 효율적인 도입을 구동함을 개시한다. 우리는 단백질, 뉴클레오타이드, 나노구 및 거대분자가 어떻게 광범위하게 다양한 1차 세포, 줄기 세포주 및 이들의 유도체에 도입될 수 있는지에 대한 예를 제공한다. 단백질을 세포에 도입시키는 능력은 연구 및 의학에서 다수의 용도를 갖지만, 그렇게 하기에 신뢰할만한 무독성의 효율적인 방법은 여전히 없다. 1982년에, 오카다와 레흐슈타이너는 0.5M 슈크로스 및 10% PEG1000에 의해 유도된 고장성 처리에 이은 간단한 저장성 처리가 거대분자 및 단백질의 불멸화된 세포주내로의 세포내 흡수를 유도함을 설명하였다 ¹ . 불행하게도, 상기 기법은 불멸화된 세포주로 제한됨이 입증되었으며, 1차 세포에서 불량한 단백질 형질도입 효율을 생성시킨다. 우리는 상기 오카다 방법을 사용하여 CRE 리콤비나제 단백질의 쥐 배아줄기세포(mESC)내로의 형질도입을 시험하였다. 우리는 CRE-리콤비나제 유도성 리포터가 ColA1 유전자좌에 안정하게 삽입된 트랜스제닉 mESC 주를 사용하였다 ² . 상기 리포터는 CMV 프로모터에 이어서 LoxP-인접된 Stop-카세트 및 eGFP 리포터 유전자를 포함한다(도 1A). eGFP 발현은 상기 Stop 카세트의 성공적인 CRE-리콤비나제 매개된 절제시에 유도된다(도 1A). 유식 세포측정에 의해 입증되는 바와 같이, 5 μM CRE-리콤비나제 단백질에 의한 mESC의 형질도입은 6% GFP-양성 mESC를 생성시켰으며, 이는 상기 오카다와 동료들에 의해 개시된 복합 고장성/저장성 형질도입 방법이 1차(줄기) 세포의 형질도입에 비효율적임을 암시한다(도 1B). 몇 년 후에, 그린 ³ 과 프랭켈 ⁴ ^,5 로부터의 독립적인 발견은 HIV TAT 단백질이 자신을 세포막을 가리질러 형질도입시킬 수 있음을 최초로 설명하였다. 이러한 자기-형질도입을 매개하는 펩타이드 서열은 후속적으로 식별되었으며 상기 서열은 이종 단백질에 화학적으로 융합시 세포 형질도입을 구동하는 것으로 나타났다 ⁶ . 최종적으로, 나가하라와 동료들은 TAT-펩타이드 매개된 단백질 형질도입이 또한 상기 TAT 펩타이드를 인-프레임 융합으로서 관심 '수송' 단백질에 클로닝시킬 때 실행됨을 설명하였다 ⁷ . TAT-펩타이드 매개된 단백질 형질도입의 분명한 이점은 상기 방법이 1차 세포를 포함한 모든 세포 유형들에 대해 실행되는 것으로 보이며, 일반적으로 무독성이라는 것이다. 그러나, 상기 TAT 펩타이드의 강한 양전하는 이 콜라이에서 고유의 재조합 TAT-융합 단백질의 생산을 방해하며, 이때 상기 재조합 단백질 중 다수는 봉입체로 끝난다. 또한, 후속의 연구는 자기-형질도입 단백질에 대한 일부 선행의 보고서들이 실제로는 세포의 고정 중에 도입된 실험 인공물의 결과임을 설명하였다 ⁸ . 또한, 상기 기술은 상기 TAT 펩타이드를 재조합 단백질에 융합시킬 것을 요하며 따라서 형질도입될 수 있는 단백질의 유형 및 수를 제한한다. 상기 TAT 펩타이드 자체가 상기 재조합 단백질의 기능 또는 국소화를 붕괴시켜 뜻밖의 또는 불필요한 결과를 도출할 수 있다. 최종적으로, 및 추정상 가장 중요하게는, 상기 TAT-융합 단백질의 형질도입 효율은 매우 가변적이며 상기 단백질 수송물의 성질 및 물성에 의존한다. 단백질 형질도입 시약 우리는 단백질 형질도입을 위한 보다 신뢰성 있고 효율적인 방법을 개발하고자 하였다. 세균 독소는 종종 매우 높은 효율로 형질도입되는 단백질이므로, 우리는 상기와 같은 독소 시스템(의 부분)이 재조합 단백질의 전달을 위한 수송 시스템으로서 작용할 수 있음을 가정하였다. 이러한 생각을 시험하기 위해서, 우리는 전사 조절제 OCT4(POU5F1)가 안트락스 치사 인자(LFn)의 N-말단 도메인에 융합될 때 세포에 형질도입될 수 있는 지의 여부를 분석하였다. 이를 위해서 우리는 His-정제 태그, LFn-형질도입 도메인, SUMO 절단 부위, 인간 OCT4 및 VP16 전사촉진 도메인으로 이루어지는 재조합 융합 단백질을 생성시켰다(도 2A). 후자를 상기 재조합 인자의 전사 활성을 더욱 증강시키기 위해 가하였다. 또한, 우리는 상기 LFn 형질도입 도메인 또는 LFn 형질도입 도메인 및 SUMO-절단 도메인이 없는 대조용 구조물을 생성시켰다(도 2A). COS7 리포터 세포를, COS7 세포를 oct4 표적 서열의 6개 반복부에 이어서 최소 TK 프로모터 및 개똥벌레 루시페라제 유전자를 함유하는 리포터 구조물로 형질감염시킴으로써 생성시켰다(도 2B). 대조용으로서, 우리는 상기 Oct4 결합 부위가 없는 루시페라제 리포터 벡터로 COS7 세포를 형질도입시켰다(도 2B). 형질감염 효율의 변화를 조절하기 위해서, 우리는 상기 COS7 세포를 편재 발현된 레닐라-루시페라제 벡터로 동시형질감염시켰다(도 2B). 상기 형질도입의 타임라인을 도 2C에 도시한다. 재조합 LFn-OCT4-SUMO1-VP16 단백질에 의한 CO7 세포의 형질도입은 상기 루시페라제 리포터 활성을 활성화시켰다(도 2D). 그러나, 불행하게도, 상기 LFn 형질도입 도메인이 없는 대조용 단백질의 대조용 형질도입은 유사하거나, 그렇지 않다면 약간 더 양호한 형질도입 효율을 나타내었다(도 2D). 또한, 상기 LFn 형질도입 도메인 및 SUMO 절단 도메인이 없는 대조용 단백질은 COS7 세포내로의 효율적인 형질도입을 나타내었으며, 이는 Oct4를 발현하는 렌티바이러스 벡터에 의한 상기 세포의 대조용 감염에 필적한다(도 2D). 상기에 언급한 바와 같이, 짧은 펩타이드 서열은 세포막을 가로질러 재조합 단백질의 형질도입을 매개할 수 있다. 우리는 6x 히스티딘(6xHis) 태그를 상기 재조합 Oct4 단백질에 가하여 단백질 정제를 촉진하였기 때문에, Oct4 단백질 형질도입이 상기 펩타이드 태그에 의해 매개되는지를 평가하였다. 이를 위해서, 우리는 His-정제 태그(H6) 및 R11 형질도입 펩타이드 ⁹ , 또는 His-태그만을 함유하거나, 또는 펩타이드 태그 없는, 도 2E에 나타낸 다수의 재조합 단백질들을 제조하였다(도 2E). 우리는 상기 Oct4-리포터를 활성화하는 이들 재조합 단백질의 능력을 시험하였다. 도 2F에 도시된 바와 같이, H6-Oct4-VP16-R11, H6-Oct4-VP16 및 Oct4-VP16은 유사한 리포터 활성화를 나타내었으며, 이는 상기 6xHis 정제 태그가 단백질 형질도입에 필요하지도, 상기를 증대시키거나 억제하지도 않음을 설명한다(도 2F, 청색 및 적색 막대). 음성 대조용으로서 우리는 상기 리포터 세포를 대조용 렌티바이러스 발현 벡터로 감염시켰다(도 2F, 백색 막대). 양성 대조용으로서 우리는 상기 리포터 세포를 렌티바이러스 Oct4 발현 벡터로 감염시켰다(도 2F, 흑색 막대). 상기 결과는 상기 재조합 Oct4 단백질이 형질도입 펩타이드 서열의 부재하에서 형질도입시킴을 암시하였으며 우리로 하여금 배양 시스템에 첨가된 하나 이상의 성분이 관찰된 단백질 형질도입에 원인일 수 있는지를 시험하게 촉구하였다. 상기 재조합 단백질을 함유하는 완충제의 개별적인 성분들(도 2G의 범례에 나타낸)을 생략시킴으로써, 우리는 단백질 형질도입 과정의 중요한 인자들로서 NaCl 고오스몰 농도 및 비-세정성 설포베타인 201(NDSB 201)을 확인하였다(도 2G 및 2H). 어느 한 인자의 생략은 재조합 Oct4-VP16 단백질에 의한 Oct4-리포터 활성화를 방해하였다. 시간, 오스몰랄 농도, 형질도입 화합물 농도, 단백질 농도의 효과. 상기 단백질 형질도입 과정을 추가로 특성화하기 위해서 우리는 상기 형질도입 과정에 대한 시간, 오스몰랄 농도, 형질도입 화합물 농도 및 단백질 농도의 효과를 분석하였다. 이를 위해서, 우리는 β-락타마제 단백질 형질도입 분석을 셋업하고, 상기 효소에 의해 절단시 방출 파장을 변화시키는 세포내 형광 β-락타마제 기질인 CCF2-AM을 사용하여 세포내 β-락타마제 활성을 측정하였다(도 3A). 따라서, 상기 방출 형광의 변화는 세포내 β-락타마제 활성의 정량적인 척도이다. 우리는 초기 연구에서 불멸화된 COS7 세포주를 사용하였지만, 상기 화합물-매개된 단백질 형질도입이 또한 1차 세포내로 상기 단백질의 형질도입을 허용하는지를 알고 싶었다. 따라서 우리는 쥐 배아섬유아세포(MEF)를 NaCl-조절된 고장성 배지(700 mOsm/㎏) 및 25 mM NDSB201을 사용하여 β-락타마제(1 μM 최종 농도)로 형질도입시켰다. β-락타마제 활성을 상기 실험의 출발시 1로 정하였고 상대적인 세포내 β-락타마제 활성을 시간의 함수로서 측정하였다(도 3B, 막대). 대조용으로서, β-락타마제 형질도입을 25 mM NSDB201의 존재하에서 등장성 배지에서 측정하였다(도 3B, 빈 원). 도 3B에 도시된 바와 같이, 상기 조건하에서, 세포내 β-락타마제 활성을 단백질 형질도입의 개시후 2.5시간째에 관찰할 수 있었다. 보다 긴 형질도입 시간은 세포내 β-락타마제 활성을 증가시켰다(도 3B). 상기 관찰된 β-락타마제 활성이 형질도입된 단백질의 결과임을 확실히 하기 위해서, 우리는 형질도입 배지(25 mM NDSB201 및 700 mOsm/㎏) 또는 25 mM NDSB201이 첨가된 등장성 배지에서 용량-반응 시험을 수행하고 β-락타마제 농도의 함수로서 β-락타마제 활성을 측정하였다. MEF를 β-락타마제 단백질로 3시간 동안 형질도입시키고 세포내 β-락타마제 활성을 개시된 바와 같이 측정하였다. 도 3C에 도시된 바와 같이, 형질도입 배지에서 β-락타마제 단백질을 농도-의존적인 방식으로 효율적으로 형질도입시켰다. 대조적으로, β-락타마제 단백질을 등장성 배지에 첨가했을 때 세포내 β-락타마제 활성은 관찰되지 않았다. 상기 결과는 상기 β-락타마제 분석의 정확성을 설명하며 β-락타마제 단백질이 단백질 농도-의존적인 방식으로 세포내에 형질도입됨을 설명한다. 이어서 우리는 상기 형질도입 과정에 대한 배지 긴장성의 효과를 측정하였다. 상기와 같이, MEF를, 25 mM NDSB201을 함유하고 NaCl로 조절된 증가하는 배지 긴상성의 MEF 배지 중에서 1 μM β-락타마제로 3시간 동안 형질도입시켰다. 대조용으로서, 우리는 형질도입된 β-락타마제 단백질의 부재하에서 배지 오스몰랄 농도의 함수로서 기질 절단을 측정하여(도 3D, 빈 원) 상기 배지 긴장성 자체가 β-락타마제에는 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 도시된 바와 같이, 증가된 NaCl 농도는 대략 700 내지 800 mOsm/㎏에서 최대 형질도입을 갖는, 증가된 β-락타마제 형질도입을 생성시켰다. 850 mOsm/㎏ 이상의 오스몰랄 농도에서 우리는, 추정상 높은 배지 긴장성의 독성에 기인한 세포 상실을 관찰하였다. 최종적으로 우리는 β-락타마제 형질도입에 대한 형질도입 화합물, NDSB201의 농도의 효과를 탐구하였다. 다시, MEF를, NaCl에 의해 700 mOsm/㎏으로 조절된 다양한 NDSB201 농도의 고장성 MEF 배지에서 3시간 동안 β-락타마제(1 μM 최종 농도)로 형질도입시켰다. 대조용으로서, β-락타마제 형질도입을 등장성 배지 중의 다양한 NDSB201 농도의 함수로서 측정하였다(도 3E, 빈 원). 증가된 NSDB201 농도는 10 내지 25 mM NSDB201에서 최대인 β-락타마제 형질도입의 일시적인 증가를 생성시켰다(도 3E). 고삼투성 조건하에서, 보다 높은 NSDB201 농도는 세포 상실을 생성시켰다. 상기 결과는 단백질 형질도입이 단백질 농도, 형질도입 시간, NDSB201 농도 및 NaCl 조절된 배지 긴장성에 의존함을 설명한다. 삼투억제제의 첨가는 고장성 스트레스를 개선시킨다 우리는 NaCl-유도된 고오스몰농도 및 NDSB201의 조합이 단백질의 효율적인 형질도입을 허용하지만, 상기가 또한 세포 증식 및 세포 생존에 영향을 미치는 것으로 보이며, 높은 배지 긴장성 및/또는 높은 NSDB201 농도는 상기 세포에 유해한 영향을 미치는 것으로 보임을 인지하였다. 고삼투 스트레스는 포유동물 세포에서 세포주기 정지 및 세포사멸을 유도하는 것으로 나타났다 ¹⁰ ^- ¹³ . 형질도입 중 고삼투성 조건이 세포 증식에 영향을 미치는지를 탐구하기 위해서, 우리는 700 mOsm/㎏에서 3시간 또는 500 mOsm/㎏에서 12시간 동안 단백질 형질도입시의 MEF 중의 BrdU 통합을 측정하였다(도 4A). BrdU 통합을 단백질 형질도입 개시후 24시간째에 측정하였다. 등장성 조건에서 유지된 MEF의 BrdU 통합을 100%로 정하였으며 이는 단백질 형질도입 완충제 단독, 또는 단백질 형질도입 완충제 + β-락타마제의 첨가시 40% 이하로 떨어졌다(도 4A). 상기 결과는, 의심한 바와 같이, 상기 형질도입 조건이 상기 형질도입된 단백질과 무관하게, 세포 증식에 부정적인 영향을 미쳤음을 설명한다. 삼투억제제는 시토솔 중 축적에 의해 세포가 삼투 스트레스에 대항하게 해주고, 이에 의해 세포내외 환경간의 삼투 차이의 균형을 맞추는 화합물이다. 우리는 상기 배지에 삼투억제제(도 4B에 나타낸)의 첨가가 단백질 형질도입 동안 세포주기 정지를 방지할 것인지를 시험하였다. 이전과 같이, 우리는 상기 형질도입 개시후 24시간째에 BrdU 통합을 측정하였다. β-락타마제 단백질을, NaCl로 700 mOsm/㎏으로 조절된 MEF 배지에서 삼투억제제를 단독으로 또는 도 4B에 나타낸 바와 같은 조합으로 첨가하여 25 mM NDSB201로 3시간 동안 형질도입시켰다. 도시된 바와 같이, 단백질 형질도입 중 삼투억제제의 첨가는 상기 형질도입 배지에 의해 유도된 세포주기 정지를 개선시켰다. 글리세롤 및 글리신의 조합은 MEF에서 세포 증식 차단의 개선에 가장 유효한 것으로 나타났으며 700 mOsm/㎏에서 3시간 형질도입 중 뿐만 아니라 500 mOsm/㎏에서 12시간 형질도입 중 유효하였다(도 4C). 이어서 우리는 삼투억제제가 다른 세포 유형의 형질도입 중의 세포주기 차단을 또한 방지할 수 있는지를 시험하였다. 이런 취지로, 우리는 쥐 ESC를 700 mOsm/㎏에서 3시간 또는 500 mOsm/㎏에서 12시간 동안 형질도입시켰다. 글리세롤 및 글리신의 삼투억제제 조합은 700 mOsm/㎏에서 mESC에서 세포 증식 감소를 방지하는데 효과가 없었지만, 500 mOsm/㎏에서 12시간 형질도입 중에는 세포 증식이 계속될 수 있었다(도 4D). 최종적으로 우리는 삼투억제제의 첨가가 수회의 연속 라운드의 단백질 형질도입을, 세포 주기 정지를 방지하면서 허용할 수 있는지를 시험하였다. 우리는 500 mOsm/㎏에서 12시간 동안 중간의 12시간 회수 기간과 함께 수회 라운드의 mESC의 형질도입을 수행하였다. 도 4E에 도시된 바와 같이, 삼투억제제의 존재하에서, 수회 라운드의 형질도입이 세포 증식에 대한 현저한 부정적인 영향 없이 mESC에 의해 충분히 허용되었다. 단백질 형질도입은 대음세포작용을 통해 능동적인 세포 흡수를 필요로 한다 배지 고긴장성이 단백질 형질도입을 유도하는 기전을 추가로 분석하기 위해서, 우리는 상기 효과가 배지 오스몰 농도의 증가에 사용되는 NaCl에 특이적인 지를 탐구하였다. MEF를 NDSB201(25 mM) 및 삼투억제제의 존재하에서 3시간 동안 β-락타마제로 형질도입시키고 배지 긴장성을 NaCl, 또는 원소주기율표에 따른 관련 염, 예를 들어 LiCl, KCl, CsCl 및 RbCl을 사용하여 700 mOsm/㎏로 조절하였다. 도 5A에 도시된 바와 같이, 모든 Na-관련염은 단백질 형질도입 활성을 가졌으며, 이때 Na 및 Rb가 가장 높은 활성을 나타내었다. 또한, 우리는 다른 Na-염이 단백질 흡수를 유도할 수 있는지를 시험하였다. 도 5A에 도시된 바와 같이, 나트륨 글루코네이트는 NaCl 및 RbCl과 유사한 효율로 β-락타마제 형질도입을 매개하였다. 최종적으로, 우리는 관련없는 화합물을 사용하여 증가하는 배지 긴장성이 또한 단백질 형질도입을 촉발하는지를 시험하였다. 도 5A에 도시된 바와 같이, 슈크로스, 락툴로스, 솔비톨 및 만니톨이 모두 700 mOsm/㎏에서 단백질 형질도입을 유도하지 못했으며, 이는 단백질 형질도입이 나트륨 또는 나트륨-관련염에 의해 유발된 고장성에 특이적으로 의존함을 암시한다. 단백질 형질도입을 촉발하는 조건들은 고장성이 Na+ 및 관련 이온에 의해 특이적으로 유발되는 것을 요하기 때문에, 상기 형질도입이 단순히 원형질막의 증대된 투과성을 통해 발생하는 것처럼 보이지는 않았다. 우리는 단백질 형질도입이 식작용성 수송의 능동 방식을 수반하고 세포이물흡수의 상이한 유형의 특정한 억제제들을 사용하여 우리의 단백질 형질도입 완충제에 의해 활용된 진입 기전을 탐구할 것을 가정하였다. 예상한 바와 같이, 액틴 중합 및 소낭 수송의 특정한 억제제인 사이토칼라신 D 또는 라트런컬린 A에 의한 세포의 처리는 단백질 형질도입을 완벽하게 차단하였으며(도 5B), 이는 단백질 형질도입이 액틴 리모델링을 필요로 함을 입증한다. 그러나, 핏스탑2 및 클로르프로마진(클라트린-매개된 세포이물흡수의 억제제), 및 니나소어 및 니스타틴(카베올린-매개된 세포이물흡수의 억제제)을 포함한 세포이물흡수의 특정한 억제제들은 모두 단백질 형질도입의 억제에 효과가 없었다(도 5B). 이러한 데이터는 단백질 형질도입이 고전적인 클라트린-매개되거나 카베올린-매개된 세포이물흡수 경로를 통해 발생하지 않음을 암시한다. 다른 유형의 세포이물흡수와 대조적으로, 대음세포작용은 Na+/H+ 교환의 억제제에 독특하게 민감하다. 흥미롭게도 단백질 형질도입은 Na+/H+ 교환의 특정한 억제제들, 예를 들어 EIPA 또는 DMA, 나트륨-수소 역수송체(Nhe) 단백질 과의 특정한 억제제들에 의해 강하게 억제되었다(도 5B). 상기 데이터는 상기 단백질 형질도입 과정이 대음세포작용을 통해 외부적으로 적용된 능동 세포 흡수를 수반함을 암시한다. 상기 나트륨-수소 역수송체-1(Nhe1)는 척추동물 세포에서 세포 부피 및 세포내 pH를 조절하는 기능을 하는 독특하게 발현되는 Na+/H+ 교환 인자이다. 상기는 삼투 스트레스에 반응하여 활성화되어, 세포외 Na+에 대한 교환에서 세포내 H+ 이온의 추방을 유도한다. 상기 교환 자체는 삼투적으로 중성이나, 추방된 H+는 세포내 완충제로부터 대체되어 세포내 오스몰 농도의 순증가 및 삼투에 의한 세포부피의 증가를 생성시킨다. 또한, Nhe1 활성화는 세포외 공간으로부터 대음세포작용-매개된 능동 유체 흡수를 유도한다. Nhe1 활성화와 대음세포작용간의 정확한 분자 연계는 여전히 불명확하지만, 실험적 증거는 원형질막 부근에서 Nhe1에 의한 세포내 pH의 국소 조절이 액틴 중합 및 마크로피노솜 형성에 요구됨을 암시한다 ¹⁴ . 삼투 스트레스에 대한 대항 및 대음세포작용의 조절에서 Nhe1의 역할, Na+ 및 관련 이온의 수송에서 그의 특이적인 역할, 및 단백질 형질도입이 Na+/H+ 교환의 억제제에 의해 억제된다는 사실은 상기 수송체를 NaCl-유도된 단백질 형질도입의 매개체로서 흥미로운 후보로 만들었다. EIPA 및 DMA의 효과가 Nhe1의 억제에 기인한 것인지를 추가로 확인하기 위해서, 우리는 Nhe1 녹아웃 배아로부터의 MEF의 형질도입을 Nhe1 이종접합성 및 야생형 MEF와 비교하였다. 도 5C에 도시된 바와 같이, 단백질 형질도입은 Nhe1 눌 섬유아세포에서 거의 완벽하게 방해되었다. Nhe1+/- 이종접합성 배아로부터의 섬유아세포는 야생형 한배 새끼에 비해 감소된 단백질 형질도입 활성을 나타내었다(도 5C). 상기 결과는 Nhe1이 단백질 형질도입의 중요한 매개체이나, Nhe1 발현의 부재하에서 잔여 단백질 형질도입 활성이 여전히 남아있음을 설명한다. Nhe1은 역수송체의 용질 담체 과의 한 구성원이며, 잔여 역수송체는 잔여 단백질 형질도입 활성에 원인인 듯하다. 이는 NHE 역수송체의 특정한 억제제인 EIPA가 단백질 형질도입을 완벽하게 억제한다는 우리의 발견에 의해 추가로 지지된다. Nhe1의 활성제는 단백질 형질도입을 증대시킨다 Nhe1이 단백질 형질도입의 중요한 매개체라는 우리의 발견은 우리로 하여금 Nhe1의 활성제가 상기 단백질 형질도입 과정을 증대시킬 수 있는지의 여부를 탐구하게 촉구하였다. 제공된 다수의 성장 인자들은 Nhe1을 활성화시킴으로써 대음세포작용을 유도하고 Na+/H+ 교환을 증대시키는 것으로 나타났다 ¹⁵ ^- ¹⁶ . 우리는 상피 성장인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 혈소판-유래된 성장인자(PDGF), 인슐린, 인슐린-유사 성장인자(IGF) 및 이들 인자의 조합의, 단백질 형질도입에 대한 효과를 탐구하였다. 도 5D에 도시된 바와 같이, 인슐린 및 IGF는 MEF의 단백질 형질도입에 대해 작지만 현저한 자극 효과를 가졌다. 또한, EGF, FGF 및 PDGF는 β-락타마제 흡수를 배가시켰다. 최종적으로, 이들 인자의 조합은 β-락타마제 형질도입에 대해 부가적인 효과를 나타내었다(도 5D). EIPA에 의한 Nhe 활성의 억제는 FEF 및 PDGF의 존재하에서조차 단백질 형질도입을 완벽하게 차단하였으며, 이는 상기 성장인자들에 의해 유도된 증대된 단백질 형질도입이 대안의 식작용 기전에 의해 매개되지 않음을 입증한다. 짧은 dTAT-HA2 펩타이드는 단백질의 마크로피노솜 탈출을 증대시키는 것으로 나타났다 ²⁰ . 우리는 상기 dTAT-HA2 펩타이드의 부가가 MEF내로의 β-락타마제 단백질의 단백질 형질도입을 추가로 증대시킬 수 있는지를 시험하였다. 이를 위해서, 우리는 상이한 농도의 dTAT-HA2 펩타이드를 형질도입 완충제에 적정하였다. 도 5D에 도시된 바와 같이, 상기 dTAT-HA2 펩타이드의 부가는 단백질 형질도입에 대해 작은 증대 효과를 가졌다. 최종적으로, 우리는 성장인자 자극 또는 dTAT-HA2 펩타이드의 부가가 또한 다른 세포의 단백질 형질도입을 증대시킬 수 있는지를 시험하였다. 우리는 쥐 ESC를 지시된 성장 인자 또는 dTAT-HA2 융합 펩타이드의 존재하에서 12시간 동안 500 mOsm/㎏에서 1 μM β-락타마제 단백질로 형질도입시켰다. 도 5E에 도시된 바와 같이, 성장 인자의 부가는 mESC 단백질 형질도입에 작은 효과를 미쳤지만, dTAT-HA2 융합 펩타이드의 부가는 mESC 내로의 β-락타마제 통합을 현저하게 증가시켰다. 단백질 형질도입 화합물의 화학적 성질 NDSB201과 함께 염-유발된 고장성이 효율적인 단백질 형질도입을 촉발한다는 우리의 발견은 우리로 하여금 다른 비-세정성 설포베타인이 또한 단백질 형질도입을 촉발시킬 수 있는지를 탐구하게 촉구하였다. 우리는 6개의 상업적으로 입수할 수 있는 NDSB(도 6A에 나타낸 화학 구조들)의 단백질 형질도입 활성을 시험하였다. 도 6A는 모두 25 mM의 최종 농도에서 MEF내로의 NDSB201(#01)뿐만 아니라 5개의 추가적인 NDSB 화합물(#02-06)에 의한 β-락타마제의 형질도입(700 mOSm/㎏에서 3시간)을 도시한다. 빈 원은 상기 단백질 형질도입 개시후 24시간째에 측정된 BrdU 통합을 가리킨다. 상기 결과는 모든 NDSB 화합물이 단백질 형질도입을 촉진한 반면, 형질도입 효율 및 세포 증식에 대한 이들의 효과가 다양함을 설명하였다. NDSB201(#01) 및 NDSB221(#03)이 β-락타마제 형질도입에서 가장 효율적인 것으로 나타났으며 따라서 우리는 상기 두 화합물에 대한 추가적인 변형들을 탐구하였다. NDSB는 한쪽에 설폰산 말단 및 다른 쪽에 4가 질소 원자를 분리시키는 2-6 탄소 주쇄로 이루어지는 다소 이종성인 화합물 기로 이루어진다. 우리는 먼저 상기 설폰산기를 카복실산(화합물 #10 및 #11을 제공함, 도 6B) 또는 아미드(화합물 #43 및 #15, 도 6B)에 대해서 #01 및 #03 중의 설폰산을 치환시킴으로써 다른 단부-기로 치환시킬 수 있는 지를 조사하였다. 도 6B의 막대 그래프에 도시된 바와 같이, 설폰산의 치환은 형질도입 효율에 부정적인 영향을 미치지 않았다. 그러나, 상기 치환은 증대된 BrdU 흡수에 의해 나타난 바와 같이 세포 주기에 대한 형질도입 완충제의 부정적인 효과를 추가로 감소시켰다(도 6B, 빈 원). 또한, 상기 형질도입 화합물(각각 화합물 #01 및 #03) 중의 피리딘 또는 피페리딘 고리 구조를 또한 형질도입 활성의 현저한 변화 없이 3가의 4가 아민(화합물 #20 및 #29, 도 6B)으로 치환시킬 수 있었다. 이어서 우리는 하나 또는 2개의 양성자를 CH3로 치환시킴으로써(화합물 #30, #31 및 #34 제공) 양성자를 제공하는 상기 아미드(화합물 #29 및 #15)의 능력이 형질도입 활성에 필요한지의 여부를 검사하였다. 도시된 바와 같이, 상기 메틸 치환은 상기 화합물들의 형질도입 활성을 증대시켰다(도 6B). 최종적으로 우리는 상기 설폰산(화합물 #45)의 생물등배전자체 또는 상기 형질도입 화합물(화합물 #42)의 이량체화가 형질도입 활성에 영향을 미치는지를 검사하였다. 도 6B에 도시된 바와 같이, 화합물 #45 및 #42는 동등하거나 보다 양호한 세포 증식을 갖는 원래의 NDSB201(#01)에 비해 높은 형질도입 효율을 나타내었다(도 6B). 따라서, 원래의 형질도입 화합물 NDSB201(#01)에 대한 변형은, 상술한 구조들에 의해 치환될 수 있는 피리딘 고리 및 설폰산의 치환에 관하여 실질적인 화학적 자유가 존재함을 입증한다. 상기 질소의 4가 및/또는 고리 구조에서의 그의 통합도, 상기 설폰산의 양성자-공여 성질도 상기 형질도입 활성에 중요하지 않은 것으로 보였다. 그러나, 시험된 모든 활성 치환체는 소수성 탄소쇄에 의해 분리된 친수성 단부를 가졌다. 따라서, 우리는 이어서 소수성 CH3기에 의한 상기 친수성 단부기의 치환이 형질도입 활성에 영향을 미치지는지를 조사하였다. 우리는 NDSB195(#06) 및 질소(#07) 또는 설폰산(#08)기가 각각 C 또는 CH3에 의해 치환된 2개 유도체의 활성을 비교하였다(도 6C). 또한, 우리는 3가 질소 및 카복실산 말단을 갖는 형질도입 화합물에 대한 상기 치환의 효과를 탐구하였다(도 6C, #20 및 유도된 #23 및 #24). 도 6C의 그래프에 도시된 바와 같이, 어느 한 기의 탄소 치환은 상기 화합물의 형질도입 활성을 크게 감소시켰다. 더욱이, 치환된 화합물(#07, #08, #23 및 #24)이 심한 세포주기 억제를 나타내었다(도 6C, 빈 원). 따라서, 상기 형질도입 화합물은 그의 말단에서 실질적인 자유를 허용하는 반면, 상기 탄소쇄의 어느 한 단부에 친수성기가 바람직한 것으로 보인다. 상기 친수성 말단은 3-탄소쇄에 의해 분리된다. 우리는 이어서 상기 탄소쇄의 길이가 형질도입 활성에 중요한 지의 여부를 시험하였다. 우리는 쇄 중에 1(#18), 2(#13 및 #19), 3(기준 화합물 #11 및 #20), 4(#12 및 #21) 및 5(#22)개 탄소를 갖는 화합물들을 시험하였다. 도 6D에 도시된 바와 같이, 형질도입 활성은 상기 기준 화합물(3-탄소쇄)에서 최고였다. 상기 5-탄소쇄를 갖는 화합물(도 6D, #22)은 유사한 형질도입 활성을 나타내었지만, 감소된 세포주기 진행을 나타내었다. 우리의 결과로부터 2 내지 5의 탄소쇄 길이를 갖는 화합물은 형질도입 활성을 나타내지만 3-탄소쇄가 바람직한 것으로 보인다. 상기에 입증된 바와 같이, 뜻밖에도 넓은 범위의 화합물들이 형질도입 활성을 나타낸다. 유효 단백질 형질도입 화합물의 화학적 성질을 추가로 분석하기 위해서, 우리는 광범위하게 다양한 비-세정성 설포베타인-관련 화합물의 단백질 형질도입 활성을 탐구하였다. 시험 화합물의 전체 목록뿐만 아니라 단백질 형질도입 활성 및 세포 증식에 대한 그의 효과를 나타내는 그래프를 표 1의 동반되는 범례와 함께 도 6E에 도시한다. 상기 기준 화합물 NDSB201(#01)을 청색으로 나타낸다. 도시된 바와 같이, 형질도입 화합물은 광범위한 형질도입 활성 및 세포 증식을 나타낸다. 이는 우리로 하여금 형질도입 화합물들의 조합이 형질도입 활성 및/또는 세포 증식에 대해 부가적인 또는 심지어 상승작용 효과를 갖는지의 여부를 시험하게 촉구하였다. 도 6F는 형질도입 화합물들의 다양한 조합의 결과를 나타낸다. 상기 기준 화합물 NDSB201(#01)의 형질도입 효율을 100%로 정하였다(도 6F, 청색 막대). 단일 탄소쇄를 갖는 글리신(#18)은 불량한 형질도입 활성(기준 화합물의 9%, 도 6F)을 나타낸다. 동몰 농도(각각 12.5 mM)의 기준 형질도입 화합물과 병용시, 형질도입 활성은 대략 15%였으며, 이는 병용된 화합물들이 부가적인 효과를 갖지 않고, 오히려 가장 낮은 형질도입 활성을 갖는 화합물이 전체 활성을 좌우함을 암시한다. 이는 우리의 기준 화합물을 화합물 #34(단독으로 180%의 형질도입 효율을 나타내었다)와 병용시 추가로 예시된다. 그러나, 상기 기준 화합물과 병용시, 형질도입 활성은 120%까지 떨어졌다. 필적하는 형질도입 활성을 갖는 화합물들을 병용하는 경우(기준 화합물 #01 및 화합물 #20), 형질도입 활성은 크게 변하지 않은 채로 있는다(도 6F). 우리가 시험한 상기 NDSB201 유도체들 중 하나는 뇌의 중요한 신경전달물질인 감마-아미노부티르산(GABA, 화합물 #20)이었다. GABA는 GABA-수용체의 활성화를 자극함으로써 작용하며, 상기 수용체들 중 3개의 부류, GABA-A, GABA-B 및 GABA-C가 확인되었다. 흥미롭게도, GABA 수용체는 에탄올 및 GABA 자체와 같은 간단한 구조에서부터 겉보기에 관련없는 벤조다이아제핀, 뮤시몰, 바클로펜 및 긴 목록의 다른 화합물들에 이르는 현저하게 광범위한 화학 구조에 의해 자극된다. 유효한 단백질 형질도입 화합물의 화학 구조가 또한 큰 자유도를 나타내기 때문에, 우리는 GABA 신호전달이 단백질 형질도입 효과에서 능동적인 역할을 하는지를 탐구하였다. 우리는 β-락타마제 형질도입에 대한 특정한 GABA 작용물질의 효과를 시험하였다. MEF를 GABA 작용물질 뮤시몰 및 SKF-97541의 존재 또는 부재하에서 700 mOsm/㎏에서 3시간 동안 1 μM β-락타마제 및 25 mM NDSB201로 형질도입시켰다. 도 6G에 도시된 바와 같이, GABA 작용물질의 부가는 단백질 형질도입을 대략 300% 증대시켰다(도 6G). 쥐 배아 줄기세포의 단백질 형질도입 쥐 배아 줄기세포의 단백질 형질도입을 보다 상세히 탐구하기 위해서, 우리는 CRE-리콤비나제 유도성 리포터가 ColA1 유전자좌에 안정하게 삽입된 트랜스제닉 mESC 주를 사용하였다 ² . 상기 리포터는 CMV 프로모터에 이어서 LoxP-인접된 Stop-카세트 및 eGFP 리포터 유전자를 포함한다(도 7A). eGFP 발현은 상기 Stop 카세트의 성공적인 CRE-리콤비나제 매개된 절제시에 유도된다. 실제로, 증가하는 농도의 재조합 CRE 단백질의 쥐 ESC내로의 형질도입은 GFP+ ESC에서 용량-의존적인 증가를 생성시킨다(도 7B, 상부 패널, 글리세롤 및 글리신 존재하에 500 mOsm/㎏에서 12시간 형질도입). 5 μM CRE에 의한 2회 연속 라운드의 형질도입(상기와 같이 각각 12시간, 사이에 12시간 회수 기간이 있다)은 79% GFP+ ESC를 생성시켰다(도 7B, 상부 패널). 더욱 또한, 대음세포작용성 소낭의 엔도솜 용해를 촉진하는 것으로 공지된, 5 μM Tat-HA2 융합 펩타이드의 부가 ²⁰ 는 GFP+ 세포의 백분율을 단일 형질도입후 81% 및 2회 라운드의 단백질 형질도입후 97% 형질도입된 세포로 추가로 증가시켰다(도 7B, 하부 패널). B에서 상기 세포의 형광 현미경상을 도 7C에 나타낸다. 이어서 우리는 단백질 형질도입이 ESC 증식에 영향을 미치는지를 시험하였다. 2회 라운드의 CRE-단백질 형질도입 후에, 7B에서 이중으로 형질도입된 세포를 트립신 처리하고, MEF 공급기상에 시딩하고, 세포 증식을 세포 카운팅에 의해 모니터하였다. 형질도입되지 않은 세포를 대조용으로서 사용하였다. 도 7D에 도시된 바와 같이, 2회 라운드의 CRE 단백질 형질도입은 ESC 증식에, Tat-HA2 융합 펩타이드의 부재(도 7D, 상부 패널)하에서도 존재(도 7D, 기부 패널)하에서도 영향을 미치지 않았다. 이어서 우리는 qRTPCR에 의해 상기 이중 형질도입된 mESC에서 핵심 다능성 인자의 발현을 탐구하였다. 도 7E는 Oct4, Nanog, Sox2, Rex1 및 FBox15의 발현이 형질도입되지 않은 대조용 ESC에 비해, Tat-HA2 융합 펩타이드의 부재(도 7E, 상부 패널)하에서 또는 존재(도 7E, 기부 패널)하에서 이중-형질도입된 mESC에서 변하지 않음을 입증하였다. 쥐 ESC는 다능성이며, 이는 상기가 3 배엽층의 유도체로 분화하는 능력을 가짐을 의미한다. mESC 다능성에 대한 엄격한 시험은 키메라를 형성하는 그의 능력이다. 상기 형질도입된 mESC의 다능성을 시험하기 위해서, 7B의 실험으로부터 이중-형질도입된 GFP+ ESC를 숙주 배반포 배아에 주사하고 거짓임신 양육 마우스에 이식하였다. 도 7F에 도시된 바와 같이, 이중-형질도입된 mESC는, Tat-HA2 융합 펩타이드의 부재(7F, 상부 패널) 및 존재(도 7F, 하부 패널)하에서의 형질도입 모두에서 키메라 형성에 효율적으로 기여하였다. 인간 유도된 다능성 줄기세포(iPSC)의 CRE 단백질 형질도입 우리의 형질도입 완충제가 또한 인간 유도된 다능성 줄기세포(iPSC)의 형질도입을 허용하는지의 여부를 탐구하기 위해서, 우리는 쥐 ESC에 대해 사용된 유사한 전략(도 7)을 약간 개조하여 사용하였다. 우리는 인간 iPSC를 렌티바이러스 리포터(CRD-리콤비나제의 단백질 형질도입시, 발현된 dsRed 형광 리포터 유전자의 제거 및 eGFP 리포터 유전자의 후속 활성화를 생성시킨다)로 형질도입시켰다(도 8A). 따라서, 성공적으로 형질도입된 hiPSC의 형광 신호는 적색에서 녹색으로 이동할 것이다. 쥐 ESC에 대해서, 5 μM CRE 단백질에 의한 인간 iPSC의 형질도입은 dsRed 리포터의 효율적인 제거 및 유식 세포측정에 의해 분석된 바와 같이 상기 세포의 64%에서 eGFP 발현으로의 이동을 생성시켰다(도 8B, 좌측 2개 패널, 500 mOsm/㎏에서 12시간 형질도입). 일부 세포는 GFP 및 dsRed에 대해 이중 양성으로 남아있음이 주목된다. 이는 상기 렌티바이러스 리포터 구조물의 다수의 사본이 상기 iPSC에 존재하며, 모든 사본이 록스-아웃(loxed-out)은 아니라는 사실에 기인한다. 상기 Tat-HA2 융합 펩타이드의 부가는 형질도입 효율을 77%까지 더욱 증가시켰다(도 8B, 중간 패널). 이중 CRE 단백질 형질도입은 부가된 tat-HA2 융합 펩타이드 없이 78% eGFP 세포를 생성시켰고 5 μM Tat-HA2 융합 펩타이드 부가시 84% GFP+ hiPSC를 생성시켰다. 도 8C는 (8B) 세포의 형광 현미경상을 도시한다. 쥐 및 인간 신경 줄기세포, 뉴런 및 신경교의 단백질 형질도입. 상술한 바와 같은 CRE-리콤비나제 매개된 적색에서 녹색으로의 리포터 이동의 유사한 전략을 사용하여 쥐 및 인간 뉴런, 신경교 및 신경 줄기세포의 형질도입을 평가하였다. 도 9A는 상기 분석의 도식적 표현을 묘사한다. 쥐 신경구의 CRE 단백질 형질도입은 eGFP 리포터의 효율적인 활성화를 생성시켰다(도 9B, 좌측 패널). 유사하게, 인간 iPSC-유래된 신경교 세포 및 뉴런을 5 μM CRE로 형질도입시켜, 상기 eGFP 리포터의 효율적인 활성화를 생성시켰다. 상기 형광 리포터 구조물을 렌티바이러스 감염을 사용하여 상기 iPSC-유래된 신경교 세포 및 뉴런에 도입시켰기 때문에, 세포는 상기 리포터의 다수 사본을 통합하는 듯했다. 따라서, CRE 단백질 형질도입은 상기 eGFP 리포터의 효율적인 활성화를 생성시키는 동시에, 세포는 계속해서 상기 리포터의 추가의 사본들로부터 dsRed를 발현하였다. 참고문헌: 1. 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V & Dowdy, SF Transducible TAT-HA fusogenic peptide enhances escape of TAT-fusion proteins after lipid raft macropinocytosis. Nature Medicine 10, 310-315 (2004). 물질 및 방법 4.5 g/l 글루코스 함유 DMEM (라이프 테크놀로지스, cat. 31966-021). 4.5 g/l 글루코스 함유 DMEM 페놀-레드 프리 (라이프 테크놀로지스, cat. 21063-029). 칼슘 및 마그네슘이 없는 DPBS (라이프 테크놀로지스, cat. 14190-094). L-글루타민, 100x (라이프 테크놀로지스, cat. 25030-123). NEAA; 불필수 아미노산 용액, 100x (NEAA; 라이프 테크놀로지스, cat. 11140-035). 2-머캅토에탄올 용액, 14.3M (시그마, cat. M3148-25ml). 페니실린/스트렙토마이신 용액, 100x (라이프 테크놀로지스, cat. 15140-130). 0.05% 트립신-EDTA (라이프 테크놀로지스, cat. 25300-054). 젤라틴 (시그마, cat. no. G1890) (시약 셋업 참조). 퓨로마이신 (라이프 테크놀로지스, Cat A11138-03). mTeSR1(상표) (스템셀 테크놀로지스(StemCell technologies), cat. 5850). TeSR(상표)-E8(상표) (스템셀 테크놀로지스, cat. 05840). 환원된 매트리젤-성장 인자 (BD, Cat. 354230). 디스파제 (스템셀 테크놀로지스, cat. 7923). 쥐 배아섬유아세포 (MEF) 혈청 (시그마, Cat. F7524). 쥐 배아줄기세포 (mES) 혈청 (그레이너 바이오 원(Greiner Bio-One), Cat. 758073). 5x 형질도입 완충제 (시약 셋업 참조). MEF 배지 (시약 셋업 참조). mES 배지 (시약 셋업 참조). mES 형질도입 배지 (시약 셋업 참조). 신경 줄기세포 배지 (시약 셋업 참조). N2 보충제, 100x (라이프 테크놀로지스, cat. 17502-048). B27 보충제, 50x (라이프 테크놀로지스, cat. 12587-010). 라이소자임 (시그마, Cat. L6876-1G). 벤조나제 엔도뉴클레아제 (시그마, Cat. E1014-25KU). 이미다졸 (시그마, Cat. I5513-5G). NDSB-201 (시그마, Cat. 82804-50G). NDCB-165 (신콤(SYNCOM) BV, 네덜란드 소재). 글리세롤 (시그마, Cat. G2025). 글리신 (시그마, Cat. 50046). NaCl - 염화 나트륨 (시그마, Cat. S5886). NaH ₂ PO4 - 일염기성 인산 나트륨 (시그마 Cat, S5011). MgCl ₂ - 염화 마그네슘 (시그마, Cat. M4880). 세포 증식 ELISA, BrdU (롯슈(Roche), Cat. 11669915001). 카스파제-Glo 3/7 분석 (프로메가(Promega), Cat, G8090). EGF (라이프 테크놀로지스, Cat. PHG0311). FGF2 (라이프 테크놀로지스, Cat. 13256-029). PDGF (라이프 테크놀로지스, Cat. PMG0044). 인슐린 (시그마, Cat. I9278-5ML). IGF (R&D 시스템스, Cat. 791-MG-050). TAT-HA2 융합 펩타이드 (유로젠텍 네덜란드(Eurogentec Nederland) bv, Cat. AS-64876). INF7-TAT 융합 펩타이드 (유로젠텍 네덜란드 bv, Cat. AS-64908). 샤프론 플라스미드 세트 (TAKARA, cat. 3340). 암피실린 (시그마, Cat. A9518). 클로란페니콜 (시그마, Cat. C0378). hLIF (인간 백혈병 억제인자, 모액 1000x; R&D 시스템스, Cat. 7734-LF-025). 쿠마씨 염료 (바이오래드(Biorad), Cat. 161-0786). CCF2-AM 로딩 키트 (라이프 테크놀로지스, Cat. K1032). 폴리-D-리신 하이드로브로마이드 (시그마, Cat. P6407). 장비 Ni-NTA 초유동 컬럼 (퀴아겐(Qiagen), Cat. 30622). 아미콘 울트라-15 원심분리 필터 유닛 (밀리포어(Millipore), Cat. UFC903008). 제바(Zeba) 회전 탈염 컬럼 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific), Cat. 87772). 96 웰 편평 투명 바닥 흑색 폴리스타이렌 TC (코닝(Corning), Cat. 3603). 100-mm 조직 배양 디쉬 (그레이너 바이오 원, Cat. 664160). 6-웰 조직 배양 플레이트 (그레이너 바이오 원, cat. 657160). 24-웰 조직 배양 플레이트 (그레이너 바이오 원, cat. 662160). 96-웰 조직 배양 플레이트 (그레이너 바이오 원, cat. 655180). 2-㎖ 플라스틱 일회용 피펫 (그레이너 바이오 원, cat. 710180). 5-㎖ 플라스틱 일회용 피펫 (그레이너 바이오 원, cat. 606188). 10-㎖ 플라스틱 일회용 피펫 (그레이너 바이오 원, cat. no. 607188). 50-㎖ 플라스틱 일회용 피펫 (그레이너 바이오 원, cat. 768180). 0.22-mm 기공 크기 필터 (밀렉스(Millex) GP; 밀리포어, cat. SLGP033RS). 0.45-mm 기공 크기 셀룰로스 아세테이트 필터 (FP30/0.45 CA-S, 슐라이허 & 슈엘(Schleicher & Schuell)). 10-㎖ 일회용 주사기 (테루모(Terumo), cat. SS-10ESZ). 해부용 겸자! 주의 오토클레이브에 의해 살균 해부용 가위! 주의 오토클레이브에 의해 살균 광도계 (베르톨드 테크놀로지스(Berthold Technologies), 센트로(Centro) XS ³ LB 960). 형광계 (몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices), 스펙트라맥스(SpectraMax) M5e). 형광 현미경 (니콘(Nikon), 이클립스(Eclipse) TS100). 유식 세포측정계 (BD 바이오사이언시즈(Biosciences), FACS-ARIAII). 사용된 용어: 형질도입: 표적 분자(소분자, 중합체, 펩타이드, 단백질, RNA, DNA, siRNA 또는 나노구조)의 세포내 전달 형질도입 표적: 형질도입에 의해 도입되는 분자(소분자, 중합체, 펩타이드, 단백질, RNA, DNA, siRNA 또는 나노구조) 형질도입 고장성: 형질도입을 유도하는 배지 고장성 시약 셋업 5X 형질도입 완충제. 25 mM NaH ₂ PO ₄ , 500 mM NaCl, 75 mM 글리신, 150 mM 글리세롤, 250 mM NDB, 1.25 mM MgCl ₂ , 1 mM 2-머캅토에탄올. 500 ㎖의 5x 형질도입 완충제를 제조하기 위해서, 1.5 g의 NaH ₂ PO ₄ 및 14.6 g의 NACL을 혼합하고 이어서 400 ㎖ 까지 밀리QH ₂ O를 가하고, pH를 10 M NaOH를 사용하여 8.0의 최종 pH에 도달하도록 조절한다. 이어서, 혼합하면서 2.8 g의 글리신, 25 g의 NDSB-201, 60 ㎎의 MgCl ₂ , 5.5 ㎖의 글리세롤, 7 ㎕의 2-머캅토에탄올을 가한다. 최종적으로 밀리QH ₂ O로 500 ㎖까지 충전시킨다. 필터를 0.2 um 필터를 사용하여 살균한다. 실온에서 보관한다. 1x 형질도입 완충제 500 1x 형질도입 완충제 500을 제조하기 위해서, 관심 단백질을 갖는 1 부피의 5x 형질도입 완충제를 4부피의 등장성 세포 배양 배지와 합하여 500 mOsm/㎏의 최종 긴장성에 도달시킨다. 1x 형질도입 완충제 700 1x 형질도입 완충제 700을 제조하기 위해서, 관심 단백질을 갖는 1 부피의 5x 형질도입 완충제를 4부피의 등장성 세포 배양 배지와 합한다. 최종적으로 적합한 양의 NaCl 또는 RbCl 염을 가하여 700 mOsm/㎏의 최종 긴장성에 도달시킨다. MEF 배지 50 U/㎖ 페니실린 및 50 ㎎/㎖ 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM. 500 ㎖의 MEF 배지를 제조하기 위해서, 50 ㎖의 MEF 혈청 및 2.5 ㎖의 페니실린/스트렙토마이신을 혼합하고, 이어서 DMEM으로 500 ㎖까지 충전한다. 4 ℃에서 보관한다. 신경 줄기세포 배지 50 U 페니실린 및 50 ㎎/㎖ 스트렙토마이신과 함께 10 ng/㎖의 EGF 및 1xB27을 함유하는 DMEM/F12. 500 ㎖의 신경 줄기세포 배지를 제조하기 위해서, 10 ㎖의 B27 및 2.5 ㎖의 페니실린/스트렙토마이신을 혼합하고, 이어서 DMEM/F12로 500 ㎖까지 충전한다. 4 ℃에서 보관한다. mES 배지 15% FBS(vol/vol), 2 mM L-글루타민, 10 mM NEAA, 1x10 ^-4 M 2-머캅토에탄올, 20 ng/㎖ hLIF, 500 U 페니실린 및 50 ㎎/㎖ 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM. 500 ㎖의 배지를 제조하기 위해서, 75 ㎖의 mES 혈청, 5 ㎖의 L-글루타민, 5 ㎖의 불필수 아미노산, 3.5 ㎕의 2-머캅토에탄올, 2.5 ㎖의 페니실린/스트렙토마이신 및 500 ㎕의 hLIF를 혼합하고 이어서 DMEM으로 500 ㎖까지 충전한다. 4 ℃에서 보관한다. mES 형질도입 배지(mES 세포에 사용됨) 1xN2 및 1xB27(vol/vol), 2 mM L-글루타민, 10 mM NEAA, 1x10 ^-4 M 2-머캅토에탄올, 및 20 ng/㎖의 hLIF를 함유하는 DMEM 페놀-레드 프리. 500 ㎖의 배지를 제조하기 위해서, 5 ㎖의 N2, 10 ㎖의 B27, 5 ㎖의 L-글루타민, 5 ㎖의 NEAA, 500 ul의 hLIF 및 3.5 ㎕의 2-머캅토에탄올을 혼합하고 이어서 DMEM 페놀-레드 프리로 500 ㎖까지 충전한다. 4 ℃에서 보관한다. 배양 용기의 젤라틴 코팅 1 g의 젤라틴 분말을 100 ㎖의 증류수에 용해시키고, 오토클레이브처리하고, 10x 젤라틴 모액으로서 4 ℃에서 보관한다. 0.1%(1x) 젤라틴 용액을 제조하기 위해서 상기 10x 젤라틴 모액을 전자레인지 및/또는 오토클레이브에서 해동시키고, 이어서 50 ㎖의 상기 10x 용액을 450 ㎖의 증류수에 가한다. 상기 용액을 0.22 ㎛ 필터 유닛으로 여과하고 4 ℃에서 보관한다. 배양 디쉬를 코팅하기 위해서, 적합한 부피의 0.1%(1x) 젤라틴 용액을 상기 디쉬 바닥 전면을 덮도록 가한다. 예를 들어, 1, 3 또는 5 ㎖의 젤라틴 용액을 각각 35-, 60- 또는 100-㎜ 디쉬에 사용한다. 상기 디쉬를 무균 환경에서 37 ℃에서 적어도 30분 동안 배양한다. 사용전에, 과잉의 젤라틴 용액을 흡출한다. 젤라틴 모액을 10x 농축물(1% w/v) 모액으로서 제조한다. 방법: 세포 배양 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 13.5-일 임신 마우스의 배아를 단리하여 수득하였다. 먼저, 상기 배아를 포스페이트-완충된 염수(PBS)로 세척하고 머리와 내장 조직을 제거하였다. 남은 조직을 저온 PBS 중에서 세척하고, 한쌍의 가위를 사용하여 다지고, 0.1 mM 트립신/1 mM EDTA 용액(3 ㎖/배아) 중에서 37 ℃에서 20분 배양하였다. 상기 배양 후에, 배아당 추가로 3 ㎖의 0.1 mM 트립신/1 mM EDTA 용액을 가하고, 상기 혼합물을 37 ℃에서 20분 동안 다시 배양하였다. 트립신 처리 후에, 배아당 6 ㎖의 MEF 배지를 가하고 수회 위아래로 피펫팅하여 조직 분리를 도왔다. 실온에서 5분 동안 상기 조직/배지 혼합물을 배양한 후에, 상등액을 새로운 튜브로 옮겼다. 세포를 원심분리(4 ℃에서 5분간 200 xg)에 의해 수집하고 MEF 배지에 재현탁시켰다. 1 x 10 ⁶ 세포(1번 계대배양)를 MEF 배지 중에서 5% CO2와 함께 37 ℃에서 100 ㎜ 디쉬상에서 배양하였다. Lox-RFP/STOP-Lox-eGFP MEFS 세포를, IRES-퓨로마이신 내성 유전자에 커플링된 Lox-RFP/STOP-Lox-eGFP 카세트의 발현을 구동하는 EF1-α 벡터를 함유하는 렌티바이러스 입자로 형질도입시켜 제조하였다. 48시간의 형질도입 후에, 세포를 1주일 동안 1 ㎍/㎖의 퓨로마이신이 있는 MEF 배지에서 배양하였다. 7일의 선택 후에, 거의 모든 세포가 상기 RFP 마커를 발현하였다. 세포를 1 ug/㎖의 퓨로마이신이 있는 MEF 배지에서 유지시켰다. 세포를 추가의 실험을 위해 3번 계대배양에서 동결시켰다. IB10 mES 세포를 한스 클레버스(Hans Clevers)(후브레흐트(Hubrecht) 연구소, 네덜란드 소재) 박사의 실험실로부터 수득하였다. V6.5 ES 세포는 루돌프 야에니치(Rudolf Jaenisch) 박사 실험실의 선물이었다. Lox-Stop-Lox-GFP mES 세포는 콘라드 호헤들링거(Konrad Hochedlinger) 박사의 선물이었다. 모든 mES 세포를 mES 배지 중에서 조사된 MEF 세포의 층상에 유지시켰다. 마우스 배아 신경 줄기세포를 앞서 개시된 바와 같이(REF1) 14-일 임신 마우스의 태아 머리로부터 수득하였다. 세포를 10 ng/㎖의 EGF를 함유하는 배지 중의 신경 줄기세포 배지에서 유지시켰다. 2주 후에, 신경구의 형성을 관찰할 수 있다. 상기 세포를 IRES-퓨로마이신 내성 유전자에 커플링된 Lox-RFP/STOP-Lox-eGFP 카세트를 발현하는 렌티바이러스 입자로 형질도입시킴으로써 Lox-RFP/STOP-Lox-eGFP 트랜스제닉 신경 줄기세포를 생성시켰다. 신경 줄기세포의 렌티바이러스 형질도입 후 2일째에, 퓨로마이신을 0.75 ㎍/㎖의 농도로 배지에 가하였다. 10일의 선택 후에 세포의 95% 초과가 RFP를 발현한다. 세포를 0.75 ㎍/㎖의 퓨로마이신이 있는 신경 줄기세포 배지에서 유지시켰다. 인간 배아 줄기세포를 37 ℃에서 mTeSR1 또는 mTeSR-E8 배지에서 매트리젤상에서 배양하였다. 배양 배지를 매일 교체하였다. 상기 세포를 IRES-퓨로마이신 내성 유전자에 커플링된 Lox-RFP/STOP-Lox-eGFP 카세트를 발현하는 렌티바이러스 입자로 형질도입시킴으로써 Lox-RFE/STOP-Lox-eGFP 트랜스제닉 H1 세포를 생성시켰다. 인간 ES 세포의 렌티바이러스 형질도입 후 2일째에, 퓨로마이신을 0.75 ㎍/㎖의 농도로 mTeSR1 배지에 가하였다. 10일의 선택 후에 세포의 95% 초과가 RFP를 발현한다. 세포를 0.75 ㎍/㎖의 퓨로마이신이 있는 mTeSR1 또는 TeSR-E8 배지에서 유지시켰다. 형질도입 완충제에서 단백질 발현, 정제 및 완충제 교환 단백질을 과발현시키고 관심 유전자를 갖는 발현 플라스미드 pET15와 함께 샤프론이 있는 이 콜라이 균주 BL21(DE3)로부터 정제하였다. 여러 세트의 샤프론을 타카라(Takara)로부터 입수할 수 있으며, 각각의 단백질에 대해 최적인 샤프론 세트를 상기 샤프론 플라스미드-세트와 함께 제공된 제조사의 프로토콜에 따라 결정할 수 있다. 밤새 배양물을 50 ug/㎖ 암피실린 및 20 ug/㎖ 클로람페니콜을 함유하는 LB 배지에 1:100으로 가하고 37 ℃ 진탕 배양기에 넣었다. 배양물을 0.75의 OD600에 도달할 때까지 증식시키고 이 시점에서 상기 배양물을 16 ℃에서 진탕시키면서 배양하였다. 1시간 후에, IPTG를 1 mM로 가하고 배양물을 16시간 동안 16 ℃에서 진탕하면서 배양하였다. 세포를 원심분리에 의해 수확하고 4 ℃에서 1시간 동안 라이소자임(1 ㎎/㎖) 및 벤조나제(1U/㎖)에 의한 처리로 용해시켰다. 용해물을 원심분리에 의해 등명화하고 상등액을 Ni-NTA 컬럼상에 로딩하였다. 상기 단백질을 5x 형질도입 완충제 중에서 이미다졸 구배에 의해 용리시켰다. 모든 용리 분획의 SDS-젤 전기영동 및 쿠마씨 염색 후에, 고순도 단백질 분획들을 모으고 아미콘 필터를 사용하여 농축시켰다. 이미다졸을 제거하기 위해서, 제바 회전 탈염 컬럼을 제조사의 설명서에 따라 사용하고, 상기 단백질을 5x 형질도입 완충제 중에서 용리시켰다. 이 시점에서, 단백질을 추가로 정제하거나 분액하고 액체 질소에서 급속-동결시킬 수 있다. 작은 분획의 단백질 용액을 사용하여 브래드포드 분석 및 쿠마씨 염색과 커플링된 SDS-젤 전기영동에 의한 단백질 정량분석을 수행하여 각각 단백질 농도 및 순도를 측정하였다. 우리의 생각대로, 최소의 활성 손실로 5x 형질도입 완충제 중에서 다수의 단백질을 수회 동결 및 해동시킬 수 있었다. 형질도입 최적의 형질도입 조건을 확립시키기 위해서, 다수의 매개변수들을 각각의 특정한 세포 유형에 대해서 최적화시킬 필요가 있다. 구체적으로, 여기에는 긴장성 및 긴장성 유발-염의 유형, 형질도입 시간, 삼투억제제의 유형 및 농도, 형질도입 화합물의 유형 및 농도가 있다. 이들 매개변수 각각의 최적화를 위한 구체적인 과정들을 하기에 나열한다. 우리는 지금까지 시험된 모든 1차 세포 및 세포주들에 대해 주로 2개의 상이한 형질도입 프로토콜을 사용한다. 우리는 상기 형질도입을 위해 항생제 없는 배양 배지를 사용한다. 형질도입은 혈청의 존재하에서 실행되지만, 우리는 무혈청 조건이 가장 효율적임을 발견하였다. 최적화에 대한 출발점으로서, 우리는 2개의 형질도입 프로토콜 중에서 특정한 표적 세포 유형 및 오스모사이토시스 표적에 가장 잘 실행되는 것이 어떤 것인지 결정한다. 이로부터, 형질도입 효율, 세포 생존, 세포 증식 및 세포 기능에 대해 최상의 결과를 제공하는 형질도입 완충제를 하기에 개략된 바와 같이 더욱 최적화할 수 있다. 첫 번째 프로토콜에서 형질도입을 500 mOsm/㎏의 긴장성에서 12시간 동안 수행한다(프로토콜 12/500). 간단히, 단백질 형질도입 전날, 세포를 항생제 없는 적합한 배양 배지에 도말하였다. 다음 날, 상기 오스모사이토시스 표적을 갖는 1x 형질도입 완충제 500을 제조한다. 간단히, 5x 형질도입 완충제 및 오스모사이토시스 표적을 세포 배양 배지와 함께 혼합하여 500 mOsm/㎏의 긴장성에서 1x 형질도입 완충제를 수득한다. 상기 배지/형질도입 완충제/오스모사이토시스 표적의 혼합물을 상기 세포에 가한다. 세포를 형질도입 완충제 중에서 12시간 동안 단백질과 배양하고, 그 후에 형질도입 배지를 제거하고 정규 배양 배지로 교환한다. 두 번째 프로토콜에서 단백질 형질도입을 700 mOsm/㎏ 긴장성에서 3시간 동안 수행한다(프로토콜 3/700). 간단히, 형질도입 하루 전날 세포를 항생제가 없는 적합한 배양 배지에 도말하였다. 다음날, 상술한 바와 같이 오스모사이토시스 표적이 있는 1x 형질도입 완충제 500을 제조한다. 최종적으로, NaCl 또는 RbCl 또는 또 다른 형질도입 고장성-유발염(하기 참조)을 가하여 최종 긴장성을 700 mOsm/㎏으로 조절한다. 예를 들어 2 ul의 5M NaCl을 98 ul의 1x 형질도입 완충제 500에 가하여 700 mOsm/㎏의 최종 긴장성을 획득한다. 하기의 실시예에서, 우리는 하기에 개략된 바와 같이 베타-락타마제 또는 Cre 단백질을 형질도입시킴으로써 상기 12/500 및 3/700 프로토콜의 효율을 시험한다. 그러나, 상기 형질도입 완충제에 대한 효율 및 표적 세포 반응을 다른 리포터 분자들, 예를 들어 비제한적으로 리포터 DNA, RNA, siRNA, circRNA, 소분자 및/또는 형광 탐침을 사용하여 측정할 수 있다. 상기 배지/형질도입 완충제/ 및 표적 오스모사이토시스 분자의 혼합물을 세포에 가하였다. 세포를 3시간 동안 형질도입 완충제 중에서 단백질과 배양하였다. 그 후에, 상기 형질도입 배지를 제거하고 정규 배양 배지로 교환하였다. 후속 라운드의 형질도입을 전형적으로는 12 내지 24시간의 회수 시간 간격으로 수행할 수 있다. β-락타마제 형질도입 측정. β-락타마제 형질도입을 쥐 배아섬유아세포(MEF) 중에서 상기 3/700 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 흑색의 투명-바닥 96 웰-플레이트를 실온에서 1시간 동안 0.15 ㎎/㎖의 폴리-D-리신으로 코팅하였다. 12,000 MEF 세포를 항생제 없이 MEF 배지에서 웰당 시딩하였다. 다음날, 세포를 상술한 바와 같이 형질도입 프로토콜 3/700을 사용하여 형질도입시켰다. 5x 형질도입 완충제 중의 β-락타마제 단백질을 항생제가 없는 DMEM 페놀-레드 프리 배지에서 1/5 희석하였다. Na- 또는 Rb-염을 가하여 최종 긴장성을 700 mOsm/㎏으로 조절하였다. 이어서 완성 혼합물을 세포에 가하였다. 3시간 후에, 상기 형질도입 배지를 신선한 MEF 배지에 의해 30분 동안 교체하였다. 후속으로, 세포를 페놀-레드-프리 DMEM으로 1회 세척하였다. β-락타마제 활성을 제조사의 설명에 따라 CCF2-AM 키트를 사용하여 측정하였다. 간단히, 웰당 120 ㎕의 CCF2-AM 로딩 배지를 웰당 가하고 세포를 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 세포를 DMEM 페놀-레드 프리로 2회 세척하고 추가로 30 내지 60분 동안 배양하였다. 형광 방출을 제조사의 설명서에 따라 409 ㎚ 및 510 ㎚에서 측정하였다. 모든 시험을 3회 중복 수행하였다. mES 세포에서 β-락타마제 형질도입을 상기 12/500 프로토콜(상기)을 사용하여 유사한 방식으로 수행하였다. mES 세포를 mES 배양 배지 중에서 젤라틴-코팅된 96-웰 플레이트에서 웰당 75,000 세포로 도말하였다. 다음날, 세포를 상술한 바와 같이 형질도입 프로토콜 12/500을 사용하여 형질도입시켰다. 이어서 5x 형질도입 완충제 중의 β-락타마제 단백질을 mES 형질도입 배지에서 1/5 희석하였다. 이어서 완성 혼합물을 세포에 가하였다. 12시간의 형질도입 후에, 세포를 페놀-레드-프리 DMEM으로 2회 세척하였다. β-락타마제 활성을 제조사의 설명서에 따라 CCF2-AM 키트를 사용하여 측정하였다. 간단히, 120 ul의 CCF2-AM 로딩 배지를 각 웰에 가하고 세포를 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 세포를 DMEM 페놀-레드 프리 배지로 2회 세척하고 추가로 30 내지 60분 동안 배양하였다. 형광 방출을 제조사의 설명서에 따라 409 ㎚ 및 510 ㎚에서 판독하고 분석하였다. 모든 시험을 3회 중복 수행하였다. 실시예 2: CRE 형질도입 및 CRE 통합의 정량분석 MEF를 96 웰 포맷에서 상기 프로토콜 3/700에 따라 CRE로 형질도입시켰다. 간단히, 웰당 12,000 Lox-RFP/STOP-Lox-eGFP MEF 세포를 MEF 배지를 사용하여 젤라틴 코팅된 플레이트에 시딩하였다. 다음날, 5x 형질도입 완충제 중의 CRE 단백질을 항생제가 없는 DMEM 페놀-레드 프리로 1/5 희석하였다. 이어서 완성 혼합물을 세포에 가하였다. 3시간의 형질도입 후에, 배지를 신선한 mES 배지로 교체하고 24 내지 48시간 동안 배양하였다. 이어서 세포를 형광 현미경에서 또는 유식 세포계에서 녹색 및 적색 신호의 측정에 의해 분석하였다. mES 세포를 96 웰 포맷에서 상기 프로토콜 12/500에 따라 CRE로 형질도입시켰다. 간단히, 웰당 75,000 Lox-STOP-Lox-GFP mES 세포를 mES 배지를 사용하여 젤라틴 코팅된 플레이트에 시딩하였다. 다음날, 5x 형질도입 완충제 중의 Cre 단백질을 mES 형질도입 배지로 1/5 희석하였다. 이어서 완성 혼합물을 세포에 가하였다. 12시간 후에, 형질도입 배지를 mES 배지로 교체하고 24 내지 48시간 동안 배양하였다. 이어서 세포를 형광 현미경에서 또는 유식 세포계에서 녹색 및 적색 신호의 측정에 의해 분석하였다. 마우스 신경줄기 Lox-RED/STOP-Lox-eGFP 세포를 상기 형질도입 프로토콜 12/500에 따라 CRE 단백질로 형질도입시켰다. 신경구를 80 ul의 신경 줄기세포 배지가 있는 96 웰 플레이트로 옮겼다. 직후에, 5x 형질도입 완충제 중의 20 ul의 CRE를 세포에 가하고 조심스럽게 혼합하였다. 12시간 후에, 형질도입 배지를 신선한 신경 줄기세포 배지로 교체하고 세포를 24 내지 48시간 동안 배양하였다. 이어서 세포를 형광 현미경에서 또는 유식 세포계에서 녹색 및 적색 신호의 측정에 의해 분석하였다. 인간 ES Lox-RED/STOP-Lox-eGFP 세포를 96 웰 포맷에서 상기 프로토콜 12/500에 따라 CRE로 형질도입시켰다. 세포를 mTeSR1 또는 TeSR-E8 제조사의 설명서에 따라 작은 덩어리로 기계적 분해에 의해 계대배양하고 매트리젤 코팅된 플레이트상에 50% 세포밀집도에 도달하도록 시딩하였다. 다음날, 5x 형질도입 완충제 중의 CRE 단백질을 mTeSR1 또는 TeSR-E8로 1/5 희석하였다. 이어서 완성 혼합물을 세포에 가하였다. 12시간 형질도입 후에, 배지를 신선한 mTeSR1 또는 TeSR-E8 배지로 교체하고 세포를 24 내지 48시간 동안 배양하였다. 이어서 세포를 형광 현미경에서 또는 유식 세포계에서 녹색 및 적색 신호의 측정에 의해 분석하였다. 실시예 3: TALEN 형질도입 TALEN 단백질을 상술한 바와 같이 고유 조건하에서 발현시키고 정제하였다. 재조합 TALEN 단백질을 5x 형질도입 완충제 중에서 정제하였다. 인간 ES 세포를 상기 형질도입 프로토콜 12/500을 사용하여 TALEN 단백질로 형질도입시켰다. HPRT 유전자 붕괴를 위해서, 상기 HPRT 유전자를 표적화하는 한 쌍의 TALEN 단백질을 사용하였다. 상기 형질도입 후 4일째에, 2.5 μM 6-TG를 HPRT 녹아웃 세포의 선택을 위해 가하였다. 2주 후에, 생존한 클론을 골라내고 게놈 DNA 정제 및 HPRT 유전자 서열분석을 위해 확대시켰다. 남성 인간 iPS 세포를 12시간 동안 2 uM TALEN 단백질로 형질도입시켰다. 간단히, 5x 형질도입 완충제 중의 20 ul HPRT talen 단백질을 80 ul의 인간 iPS 세포 배지와 혼합하였다. 최종 혼합물을 세포에 12시간 동안 가하였다. 그 후에, 배지를 150 ul의 인간 iPS 세포 배양 배지로 교체하였다. 5일 후에 3 uM 6-TG를 배양 배지에 가하여 HPRT 결함 세포를 선택하였다. 10일 후에, 개별적인 클론을 골라내고 이들을 별도로 배양하였다. 게놈 DNA를 각각의 클론으로부터 정제하고 HPRT 유전자 서열을 수행하였다. Blast 정렬을 실행하여 TALEN 단백질에 의해 야기된 HPRT 유전자에서의 삽입 및 결실율을 측정하였다(도 14 참조). 실시예 4: 형질도입 촉진제 EGF, FGF 및 PDGF를 단백질 형질도입 촉진제로서 사용하였다. 성장 인자들을 그들의 최종 활성 농도(나열된 성장 인자들의 경우에 각각 약 10 ng/㎖)로 형질도입 완충제에 가하였다. 융합 펩타이드를 형질도입 완충제 중에 1 내지 10 uM 범위의 농도로 사용하였다. 실시예 5: BrdU 및 카스파제 측정 세포 증식을 제조사의 설명서(롯슈)에 따라 세포 증식 Elisa 키트(롯슈)를 사용하여 측정하였다. 카스파제-3 및 카스파제-7의 정량분석을 제조사의 설명서(프로메가)에 따라 카스파제-글로 3/7 분석 키트(프로메가)를 사용하여 측정하였다. 실시예 6: 형질도입 과정 및 형질도입 완충제의 최적화를 위한 분석 긴장성은 세포막을 가로지르지 않는 모든 용질의 농도에 의해 한정됨을 아는 것은 중요하다. 우리의 실시예에서, 우리는 NaCl 또는 RbCl을 전형적으로 500 내지 700 mOs/㎏으로 사용하지만 완충제 긴장성뿐만 아니라 형질도입 시간을 하기에 개략되는 바와 같이(I) 특정한 용도(형질도입 표적 및 표적 세포 유형)에 최적화해야 한다. 또한, 우리의 실시예에서 우리는 형질도입 화합물로서 NDSB201을 사용하지만, 형질도입의 유도 또는 촉진에서 다른 화합물의 능력 및 효율은 하기에 개략하는 바와 같이 측정될 수 있고, 하기에 개략되는 바와 같이(II) 특정한 용도(형질도입 표적 및 표적 세포 유형)에 최적화해야 한다. 상술한 바와 같이, 우리의 실시예에서 우리는 형질도입 긴장성의 유도에 Nacl 또는 RbCl을 사용하지만, 다른 염 또는 화합물들을 사용할 수 있다. 우리는 분자 또는 화합물이 형질도입 긴장성을 유효하게 유도할 수 있는지를 시험하기 위한 분석을 하기에 개략하였다(III). 형질도입을 유도하는 것으로 밝혀진 염, 분자 또는 화합물을 (I)에 개략되는 바와 같이 시간 및 완충제 긴장성에 대해 추가로 최적화해야 한다. 우리의 실시예에서, 우리의 형질도입 완충제에 사용되는 삼투억제제는 글리신 및 글리세롤이나, 삼투억제제로서 다른 화합물들의 유효성을 하기에 개략된 바와 같이 측정할 수 있으며, 하기에 개략되는 바와 같이(IV) 특정한 용도 및 세포 유형에 대해 최적화해야 한다. 상기 매개변수들의 최적화는 다른 성분들의 반복되는 조절을 요할 것이다. 예를 들어, 신규의 형질도입 화합물의 측정 및 최적화 후에, 상기 형질도입 긴장성 및 시간은 재조정이 필요할 수 있다. (I) 형질도입 긴장성 및 형질도입 시간을 최적화하기 위한 분석 특정한 용도(형질도입 표적 및 표적 세포 유형)에 대한 형질도입 과정을 최적화하기 위해서 이전에 개시한 프로토콜 12/500 및 3/700을 출발점으로서 간주한다. 여기에서 우리는 상기 형질도입 프로토콜을 세포내 흡수의 효율, 세포 생존, 및 적용 가능한 경우, 세포 증식에 관하여 최적화하는 방법을 개시한다. 우리의 실시예에서, 우리는 형질도입을 최적화하기 위해 β-락타마제 단백질을 사용하지만, 다른 단백질, DNA, RNA, siRNA, (소)분자 또는 나노구조를, 이들이 상기 형질도입 표적의 세포내 전달을 측정하는데 사용될 수 있는 분석이 존재하는 한 사용할 수 있다. 형질도입 배지 긴장성 및 형질도입 시간을 최적화하기 위해서, 적정 기질을 도 10에 도시된 바와 같이 96-웰 포맷으로 셋업한다. 5x 형질도입 완충제 중의 적어도 80 내지 100 마이크로M의 베타-락타마제 용액을 제조한다. 상기 β-락타마제 단백질 용액을 100x 농도로 사용하여 0.8 내지 1 uM의 최종 β-락타마제 농도를 획득한다. 완충제 긴장성 및 형질도입 시간을 최적화하기 위해서, 표적 세포를 3개의 상이한 다중-웰 플레이트(플레이트 "A", 세포내 β-락타마제 활성을 측정하기 위한, 플레이트 "B" 세포 증식을 측정하기 위한, 및 플레이트 "C" 세포사멸 분석을 위한)에서 항생제가 없는 적합한 페놀-레드 프리 배양 배지에 도말한다. 50 mM NDSB201, 15 mM 글리신 및 30 mM 글리세롤을 항생제가 없는 페놀 레드 프리 배양 배지에 가하고 NaCl, RbCl 또는 다른 형질도입 고장성-유발염(형질도입 고장성 유발염의 최적화를 위한, 하기 (III) 참조)을 사용하여 긴장성을 조절함으로써 300 내지 1000 mOsm/㎏ 범위의 상이한 긴장성을 갖는 일련의 배양 배지를 제조한다. 세포를 2 내지 24시간 동안 상이한 긴장성으로 배양하고(도 10 참조) 진행시켜 상술한 바와 같은 플레이트 A에서 β-락타마제 활성을 측정하고 플레이트 B 및 C에서 배지를 표준 배양 배지로 교체한다. 6 내지 8시간 후에, 정규 배양 배지 중에 플레이트 B에서 BrdU를 가하고 플레이트 C에서 카스파제 3/7 활성을 측정한다. 플레이트 B를 증식 표적 세포(제조 프로토콜 참조)에의 BrDU 통합에 필요한 추가적인 시간 동안 BrdU와 함께 배양하고 진행시켜 BrdU 통합을 측정한다(제조사 설명; 세포 증식 ELISA, BrdU, 롯슈, Cat. 11669915001). 최적의 조건은 최고의 β-락타마제 단백질 통합, 및 세포 생존, 세포 증식(적용 가능한 경우) 및 세포 기능에 대한 최소의 효과를 갖는 것들일 것이다. (II) 형질도입 화합물의 유형 및 농도의 최적화를 위한 분석 우리의 실시예에서 우리는 형질도입 화합물 NDSB201을 사용하였으나, 상이한 형질도입 화합물들을 용도 및 형질도입 표적에 따라 사용할 수 있다. 여기에서 우리는 잠재적인 형질도입 화합물의 수행성능을 시험하고 상기 형질도입 화합물의 최종 농도를 최적화하는 방법을 개시한다. 본 실시예에서 우리는 형질도입 프로토콜 3/700을 사용하여 β-락타마제 단백질을 쥐 배아 섬유아세포(MEF)에 전달하지만, 표적 세포 유형에 따라 상기 형질도입 프로토콜을 (I)에 개시된 바와 같이 조절해야 한다. (I)에 개시된 바와 같이 100x β-락타마제 모액을 제조한다. 형질도입 화합물을 최적화하기 위해서, 상기 모 β-락타마제 용액을 상기 시험하고자 하는 관심 형질도입 화합물로 제조하거나 또는 250 mM의 관심 형질도입 화합물을 갖는 5x 형질도입 완충제에 대해 투석시킬 필요가 있을 것이다. (I)에서 측정된 최적화된 긴장성으로 배양 배지를 제조한다. 상기 배지에, 상기 시험하고자 하는 형질도입 화합물을 5 내지 150 mM의 농도 범위로 가한다. (I)에 개시된 바와 같이, 표적 세포가 있는 다중-웰 플레이트를 제조하여 형질도입 표적의 세포내 전달, 세포 사멸 및 적용가능한 경우, 세포 증식을 시험한다. 형질도입 표적(우리의 실시예에서 β-락타마제) 및 상이한 농도의 상기 시험된 형질도입 화합물을 갖는 형질도입 배지를 가한다. 세포를 (I)에서 측정된 시간으로 배양하고 (I)에 개시된 바와 같이 β-락타마제 형질도입, 세포사멸 및 BrdU 통합을 측정한다. (III) 고장성-유발염 유형의 최적화를 위한 분석 다수의 염이 형질도입 고장성을 유발시킬 수 있지만, 우리의 실시예에서 입증된 바와 같이, 모든 고장성-유발 분자가 형질도입을 유도하는 것은 아니다. 여기에서 우리는 특정한 염이 형질도입을 유도할 수 있는지를 측정하는 방법 및 특정한 용도에 대해 형질도입 염의 유형을 최적화하는 방법을 개시한다. (I)에 개시된 바와 같이 100x β-락타마제 모액을 제조한다. 형질도입 염을 최적화하기 위해서, 상기 모 β-락타마제 용액을 상기 시험하고자 하는 관심 형질도입 화합물로 제조하거나 또는 250 mM의 관심 형질도입 염이 있는 5x 형질도입 완충제에 대해 투석시킬 필요가 있을 것이다. 이상적으로, 하기의 단계들에서, 무-나트륨 배지를 상기 형질도입 배지의 제조에 사용하는데, 그 이유는 표준 배양 배지 중에 존재하는 나트륨이 결과를 혼동시킬 수 있기 때문이다. 대조용 형질도입 염(실시예 참조) 또는 300 내지 1000 mOsm/㎏ 범위의 긴장성의 시험하고자 하는 염(들)을 사용하여 배양 배지를 제조하고 형질도입 표적(본 실시예에서 β-락타마제)과 합한다. (한편으로, 초기 시험을 형질도입 프로토콜 12/500 또는 3/700에서 시험하고자 하는 염을 사용하여 수행하여 특정한 염 또는 분자의 형질도입 활성을 측정할 수 있으며, 후속으로 상기 염 또는 분자를 (I)에 개시된 바와 같이 추가로 최적화할 수 있다). (I)에 개시된 바와 같이 표적 세포가 있는 다중-웰 플레이트를 제조하여 형질도입 표적의 세포내 전달, 세포 사멸 및 적용가능한 경우, 세포 증식을 시험한다. 상이한 농도의 상기 시험된 형질도입 염을 갖는 형질도입 배지를 가한다. 세포를 (I)에서 측정된 최적의 형질도입 시간으로 배양하고 (I)에 개시된 바와 같이 β-락타마제 형질도입, 세포사멸 및 BrdU 통합을 측정한다. (IV) 삼투억제제의 유형 및 농도를 최적화하기 위한 분석 우리의 실시예에서 우리는 삼투억제제로서 글리세롤 및 글리신의 조합을 사용하지만, 용도 및 형질도입 표적에 따라 상이한 삼투억제제를 사용할 수 있다. 여기에서 우리는 잠재적인 삼투억제제의 수행성능을 시험하고 상기 삼투억제제의 최종 농도를 최적화하는 방법을 개시한다. (I)에 개시된 바와 같이 100x β-락타마제 모액을 제조한다. 대조용 삼투억제제(들)(실시예 참조) 또는 1 내지 250 mM 범위 농도의 시험하고자 하는 삼투억제제(들)를 사용하여 형질도입 배양 배지를 제조하고 형질도입 표적(본 실시예에서 β-락타마제)과 합한다. (I)에 개시된 바와 같이, 표적 세포가 있는 다중-웰 플레이트를 제조하여 형질도입 표적의 세포내 전달, 세포 사멸 및 적용가능한 경우, 세포 증식을 시험한다. 상이한 농도의 상기 시험된 삼투억제제(들)를 갖는 형질도입 배지를 가한다. 세포를 (I)에서 측정된 최적의 형질도입 시간으로 배양하고 (I)에 개시된 바와 같이 β-락타마제 형질도입, 세포사멸 및 BrdU 통합을 측정한다. 실시예 7: 형질도입 완충제는 1차 세포상에서 DNA-지질 형질감염을 증대시킨다 형질도입 하루 전날, 96-웰 플레이트에 웰당 75,000 마우스 ES 세포를 도말하였다. 다음날, 세포를 100 ㎕의 형질감염 배지로 형질감염시켰다. 간단히, 형질감염 배지는 100 ng 플라스미드 DNA, 0.8 ㎕ LTX 지질, 0.1 ㎕ 플러스 시약(라이프 테크놀로지스) 및 20 ㎕의 5x 형질도입 완충제를 함유한다. 전체 부피는 100 ㎕ mESC 배지 + LIF를 포함하였다. 대조용 세포를 유사하게 형질감염시키고; 형질도입 완충제를 mESC 배지 + LIF로 대체하였다. 결과를 도 11에 나타낸다. 형질도입 완충제를 상기 플라스미드 DNA/리포펙타민 LTX 형질감염 혼합물에 가하여 리포터 DNA의 쥐 ESC내로의 효율적인 형질감염을 생성시킨다. 실시예 8: 형질감염 완충제를 사용하는 DNA 및 단백질의 이중 세포내 통합 형질도입 하루 전, 96-웰 플레이트의 웰당 75,000 마우스 ES 세포를 도말하였다. 다음날, 세포를 100 ㎕의 형질도입 배지와 함께 배양하였다. Cre 형질도입 배지를 5x 형질도입 완충제 중의 20 ㎕ CRE 단백질 + 추가적인 80 ㎕의 mESC 배지 + LIF를 합하여 제조하였다. RFP/DNA-지질 형질감염 배지는 100 ng 플라스미드 DNA, 0.8 ㎕ LTX 지질, 0.1 ㎕ 플러스 시약(라이프 테크놀로지스) 및 20 ㎕의 5x 형질도입 완충제를 함유하였다. 전체 부피는 100 ㎕ mESC 배지 + LIF를 포함하였다. CRE 및 DNA/지질 형질감염 배지는 5x 형질도입 완충제 중의 100 ng 플라스미드 DNA, 0.8 ul LTX 지질, 0.1 ㎕ 플러스 시약(라이프 테크놀로지스) 및 20 ㎕ CRE 단백질을 함유한다. 전체 부피는 100 ㎕ mESC 배지 + LIF를 포함하였다. 세포를 12시간 동안 배양하고 배지를 mESC 배지로 교체하였다. 세포를 FACS 분석에 의해 형질도입 후 32시간째에 분석하였다. 결과를 도 12에 나타낸다. 형질도입 완충제의 첨가는 RFP-DNA/지질 복합체와 함께 Cre 리콤비나제 단백질; 플라스미드 RFP-DNA; 및 CRE 단백질의 쥐 ESC내로의 효율적인 형질감염을 생성시킨다. 실시예 9: 형질도입 완충제는 인간 iPS 세포에서 바이러스 통합을 증대시킨다 96-웰 포맷에서 75% 세포밀집도의 세포 밀도로 인간 iPS 세포상에서의 렌티바이러스 형질도입. 바이러스 형질도입은 1 ㎕ 농축된 바이러스 모액, 4 ㎍/㎖ 폴리브렌, + 100 ul의 최종 부피에 대한 인간 iPS 배양 배지로 이루어졌다. 형질도입 완충제 조건하에서 바이러스 형질도입을, 1 ul 농축된 바이러스 모액, 4 ㎍/㎖ 폴리브렌, 20 ㎕의 5x 형질도입 완충제, + 100 ㎕의 최종 부피에 대한 인간 iPSC 배양 배지를 합하여 수행하였다. 세포를 12시간 동안 배양하고 배지를 정규 인간 iPSC 배지로 교환하였다. 세포를 형질도입 후 36시간째에 분석하였다. 다음날, 세포를 100 ㎕ 형질감염 배지로 형질감염시켰다. 간단히, 형질감염 배지는 100 ng 플라스미드 DNA, 0.8 ㎕ LTX 지질, 0.1 ㎕ 플러스 시약(라이프 테크놀로지스) 및 20 ㎕의 5x 형질도입 완충제로 이루어졌다. 전체 부피는 100 ul mESC 배지 + LIF를 포함하였다. 대조용 세포를 유사하게 형질감염시켰으며; 형질도입 완충제는 mESC 배지 + LIF로 교체되었다. 결과를 도 13에 나타낸다. 형절도입 완충제의 첨가는 인간 iPS 세포내로의 렌티바이러스 입자의 효율적인 형질감염을 생성시킨다. 실시예 10: 낮은 용해도를 갖는 단백질에 대한 형질도입 완충제 2/1000 형질도입 완충제 - 최종 조성물. D-MEM N2/B27 + LIF 중의 500 mM NaCl, 250 mM NDSB-201, 300 mM 글리신, 150 mM 글리세롤. 2/1000 형질도입 완충제 프로토콜. 간단히, mES 세포를, 5x 형질도입 완충제 500/12 중의 80 ㎕ 의 2/1000 형질도입 완충제 + 20 ㎕ CRE 단백질을 첨가함으로써 형질도입시켰다. 세포를 2시간 동안 배양하였다. 배양에 이어서, 배지를 mESC 배지로 교체하였다. 세포를 형질도입 후 36시간째에 FACS에 의해 분석하였다. 실시예 11: TALEN의 인간 iPS 세포내로의 형질도입 남성 인간 iPS 세포를 2 μM TALEN 단백질로 12시간 동안 형질도입시켰다. 간단히, 5x 형질도입 완충제 중의 20 ㎕ HPRT TALEN 단백질을 80 ㎕의 인간 iPS 세포 배지와 혼합하였다. 최종 혼합물을 12시간 동안 세포에 가하였다. 그 후에, 배지를 150 ㎕의 인간 iPS 세포 배양 배지로 교체하였다. 5일 후에 3 μM 6-TG를 배양 배지에 가하여 HPRT 결함 배지를 선택하였다. 10일 후에, 개별적인 클론들을 골라내고 이들을 별도로 배양하였다. 게놈 DNA를 각각의 클론으로부터 정제하고 HPRT 유전자 서열을 수행하였다. Blast 정렬을 실행하여 TALEN 단백질에 의해 야기된 HPRT 유전자에서의 삽입 및 결실율을 측정하였다. 결과를 도 14에 나타낸다. 상기 결과는 상기 TALEN 표적 부위에서 세포 내부의 유전 물질 중에 삽입 및 결실이 발생하였기 때문에 기능성 TALEN이 상기 iPS 세포내로 형질도입되었음을 나타낸다. 실시예 12: 단백질 및 대분자의 동시적인 형질도입 상기 형질도입 완충제가 단백질 및 대분자의 동시적인 형질도입을 허용하는지를 평가하기 위해서, 우리는 TMR-덱스트란(적색) 및 형광 표지된 BSA 단백질(청록색)의 대음세포작용 매개된 흡수를 GFP-발현 쥐 배아 섬유아세포(MEF)에 의해 분석하였다. 간단히, eGFP 단백질(녹색)을 발현하는 MEF를 1x 형질도입 배지(프로토콜 700/3) 중의 5 ㎍/㎖의 고분자량 TMR-덱스트란(적색) 및 1 ㎍의 BSA-알렉사-647(근-적색)과 함께 30분 동안 배양하였다. 후속으로, 세포를 1x 형질도입 완충제로 2회 세척하였다. 최종적으로, 세포를 1x 형질도입 완충제 중에서 유지시키고 공초점 현미경검사에 의해 즉시 분석하였다. 덱스트란 및 BSA 흡수는, 세포를 형질도입 과정 전 30분째 및 상기 과정 중에 100 μM 에틸아이소프로필아밀로라이드(EIPA)와 배양함으로써 억제되었다. 결과를 도 15에 나타낸다. 덱스트란(폴리사카라이드) 및 BSA 단백질의 동시 형질도입은 형질도입 완충제의 존재하에서 관찰되었다. 형질도입은 대음세포작용 억제제 EIPA에 의해 억제되었다. 실시예 13: 형질도입에 의한 유전자 편집 단백질 오스모사이토시스의 높은 효율은 유전자 편집에 매력적인 용도를 갖는다. 상술한 TALEN 유전자 편집 외에, 최근에 발견된 CRISPR-Cas9 시스템은 추가적인 유전자 편집 시스템을 제공한다. CAS/CRISPR은 스트렙토코커스 파이로제네스 Cas9 뉴클레아제 단백질로 이루어지며, 상기 단백질은 작은 안내 RNA(sgRNA)에 의해 특이적인 게놈 유전자좌로 안내된다(1,2). 상기 CAS/CRISPR 시스템의 매력은 그의 디자인 단순성이다. 뉴클레아제 단백질 자체를 디자인하고 각각의 특이적인 표적 부위에 대해 변형시킬 필요가 있는 TALEN 및 아연-집게 시스템과 대조적으로, 상기 CAS/CRISPR 시스템은 단일 뉴클레아제 단백질(Cas9)을 요하고 표적 선택을 위한 관련된 짧은 안내 RNA가 다양하다. 표적 결합시, 상기 Cas9 뉴클레아제는 표적 유전자좌에 이중가닥 절단(DSB)을 생성시키며, 이는 세포 DSB-수복 시스템에 의해 수복시 프레임이동 결실을 빈번히 생성시켜 유전자를 붕괴시킨다. 상기 Cas/CRISPR 시스템은 전형적으로는 바이러스 벡터를 사용하여 표적 세포에 도입되는데, 이는 임상 적용을 방해하며, 감염된 세포의 추가적인 약물-선택 없이 일부 표적 세포 유형에 비효율적이다. 인간 줄기세포를 포함하여 다수의 감염시키기 어려운 세포주에서 우리의 오스모사이토시스 시스템의 효율이 제공될 때, 우리는 상기 시스템이 또한 단백질-매개된 유전자 편집을 허용할 것인지를 탐구하였다. 이를 위해서, 우리는 먼저 오스모사이토시스가 세포내로의 RNA의 효율적인 형질도입을 허용하는지를 시험하였다. 이를 시험하기 위해서, 우리는 700/3 프로토콜을 사용하여 KBM7 세포내로의 siRNA(작은 간섭 RNA) 형질도입을 수행하였다. 우리는 siRNA 표적화 GAPDH(인비트로젠)를 형질도입시키고 웨스턴 블럿에 의해 GAPDH 녹다운을 측정하였다. 도 17에 도시된 바와 같이, siRNA의 형질도입은 GAPDH 단백질 발현 수준의 효율적인 녹다운을 생성시켰다. 상기 데이터는 우리의 오스모사이토시스 시스템이 작은 RNA, 예를 들어 siRNA의 표적 세포내로의 효율적인 형질도입을 허용함을 입증한다. 이어서 우리는 재조합 Cas9의 형질도입을 허용하도록 상기 형질도입 배지를 최적화하였다. 상기 700/3 및 500/12 배지를 사용하여 Cas9 단백질을 형질도입시키고자 하는 우리의 최초의 시도로, 우리는 Cas9 단백질이 상기 두 형질도입 조건 모두에 불용성임을 알았다. 그러나, Cas9 단백질은 보다 높은 농도의 NaCl 및 NDSB-201(#01) 또는 GABA(#20)를 모두 사용하는 경우 용해성인 채로 있었다(도 18A). 이 때문에 우리는 1250 mOsmol/㎏의 최종 오스몰랄 농도 및 250 mM 농도의 NDSB-201(형질도입 화합물 #01) 또는 표 1에서 선택된 다른 형질도입 화합물을 갖는 "Cas9-적응된 형질도입 프로토콜"("네 번째 프로토콜")을 개발하였다. 우리는 보다 높은 오스몰랄 농도 및 NDSB가 보다 빠른 단백질 형질도입을 유도할 것이나 또한 가능하게는 세포 독성을 증가시킬 수 있음을 예상하였다. 이러한 새로운 형질도입 조건을 특성화하기 위해서 우리는 KBM7 세포에서 상이한 짧은 시점들에서 높은 오스몰 농도(1250 mOsm/㎏) 형질도입시의 BrdU 통합을 측정하였다. 우리는 상기 상이한 형질도입 화합물들이 KBM7에서 NDBS-201에 비해 다양한 생존율을 나타내며, 예를 들어 화합물 #20은 NDSB-201보다 훨씬 더 양호한 생존을 제공함을 관찰하였다(도 18B). 변형된 형질도입 완충제에 의한 형질도입의 지속기간을 추가로 시험하기 위해서, 우리는 상이한 시점들에서 1250 mOsmol/㎏ 및 250 mM GABA에서 Cre 재조합 단백질 형질도입을 수행하였고 성공적인 cre-매개된 리포터 활성화를 갖는 세포의 백분율뿐만 아니라 세포 증식 및 생존의 척도로서 BrdU 통합을 측정하였다. 이러한 조건하에서, 세포 생존 및 Cre 형질도입 기반 최적 형질도입 시간은 대략 60분이었다. 상기 시점들에서, 1 라운드의 Cre 단백질 형질도입은 80%의 GFP 양성 KBM7 세포를 제공하였다. 또 2개의 후속 라운드의 Cre 단백질 형질도입은 94% 양성 KBM7을 제공하였다(도 18C). 2 번째 라운드의 단백질 형질도입은 세포 생존율에 영향을 미치지 않았다. 따라서, 상기 데이터는 상기 오스모사이토시스 방법의 융통성을 보이며, 형질도입되는 단백질의 성질을 근거로, 최적 단백질 통합 효율 및 세포 생존에 대한 형질도입 조건(상기 형질도입 화합물의 유형 및 농도 및/또는 완충제 오스몰랄 농도)을 조절할 수 있다. 상기 Cas9-적응된 형질도입 배지를 사용하여, 우리는 상응하는 sgRNA를 갖는 Cas9 단백질을 KMB7 세포에 동시에 형질도입시키려고 하였다. sgRNA는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 생성되었다. 상기 sgRNA는 표적 특이성을 부여하는 20nt 안내 서열, 및 80 nt 스캐폴드 서열을 함유한다(도 18D, 상부 패널). 재조합 Cas9 단백질을 이 콜라이에서 발현시켰다(도 18D, 기부 패널). CAS9-sgRNA의 세포내로의 도입을 모니터하기 위해서, 우리는 프레임 밖 침묵 tdtomato 유전자에 커플링된 20 nt의 AAVS1 표적 서열을 갖는 안정한 삽입된 렌티바이러스 구조물을 갖는 리포터 세포주를 개발하였다(도 18E). 상기 tdTomato 유전자 상류의 프레임이동 결실의 성공적인 Cas9-sgRNA 매개된 도입은 상기 tdTomato 리포터의 판독 프레임을 복원하고 표적화 효율의 분석을 허용할 것이다(도 18F). KBM7 리포터 세포를 상응하는 표적-상 AAVS1 sgRNA와 함께 Cas9 단백질로 형질도입시켰다. 상기 첫 번째 라운드의 Cas9-sgRNA 형질도입 후에, 상기 리포터 KBM7 세포의 30%는 tdtomato 단백질 발현을 재확립시켰다(도 18F, 상부 패널). 두 번째 라운드의 Cas9-sgRNA 형질도입 후에, 상기 KBM7 세포의 56%가 상기 tdtomato 리포터를 발현하였다. 특이성 대조용으로서, KMB7 리포터 세포를 Cas9 단백질, 및 상기 AAVS1-표적 서열에 비해 2개의 뉴클레오타이드 치환을 갖는 표적-밖 sgRNA로 형질도입시켰다(도 18F, 상부 패널). 도 18F에 도시된 바와 같이, 표적-밖 sgRNA는 상기 tdtomato 리포터를 활성화시키지 않았다. 동시에, 우리의 데이터는 우리의 오스모사이토시스 완충제가 단백질 및 RNA의 효율적인 나란한 형질도입을 허용하며, 상기 Cas9/CRISPR 시스템을 사용하여 매우 효율적이고 특이적인 유전자 편집을 허용함을 입증한다. 최근에, 상기 Cas9/CRISPR 시스템에 대한 다수의 변화들, 예를 들어 이종 FokI 뉴클레아제의 도입에 의해 증대된 특이성(3,4), 상이한 종들로부터의 대체 Cas 유사체(5), 또는 다른 세균 면역 복합체, 예를 들어 캐스케이드 시스템에 기반한 대체 표적화 시스템(6) 또는 세균 아고너트 단백질((7)에 재고찰됨)이 보고되었다. 우리는 우리의 오스모사이토시스 시스템이 작은 안내 RNA와 함께 우리의 재조합 TALEN 단백질 및 재조합 Cas9 단백질의 성공적인 형질도입에 의해 예시되는 바와 같이, 유전자 편집 단백질 또는 단백질-뉴클레오타이드 복합체의 포유동물(줄기) 세포내로의 효율적인 도입을 허용함을 입증하였다. 우리의 형질도입 시스템은 다른 유전자 편집 단백질 또는 단백질-복합체(예를 들어 상기 언급한 것들)의 효율적인 도입도 또한 허용할 것으로 예상된다. 우리는 CAS9/sgRNA 형질도입을 측정하기 위해 렌티바이러스 리포터 시스템을 사용하였기 때문에, 각각의 세포는 상기 리포터의 다수의 사본을 함유한 듯하며, 이는 인식된 형질도입 효율을 왜곡할 수도 있다. CRISPR-Cas9 오스모사이토시스 매개된 표적화 효율의 정확한 평가를 획득하고 상기 시스템을 사용하여 내인성 유전자를 또한 조절할 수 있음을 입증하기 위해서, 우리는 내인성 유전자 WDR85(DPH7)를 변형시키는 우리의 유전자-편집 단백질 형질도입 시스템의 능력을 시험하였다. WDR85 녹아웃 세포는 디프테리아 독소-유도된 세포사에 내성이며, 따라서 성공적인 이중대립유전자 녹아웃을 측정하기 위한 간단하고 신뢰성 있는 분석을 제공한다. 이배체 KBM7 세포를 WDR85 유전자에 대해 6개의 상이한 sgRNA 및 Cas9 단백질로 2회 형질도입시켰다(도 19A). 두 번째 Cas9 단백질/sgRNA 형질도입 후 7일째에(유전자 녹아웃이 단백질 수준에서 유효하게 되도록), 세포를 디프테리아 독소로 48시간 동안 처리하였다. 세포 생존은 오직 Cas9 단백질 및 WDR85 sgRNA로 형질도입된 세포에서만 관찰된 반면, 디프테리아 독소 처리된 야생형 KBM7 세포에서 또는 표적-외 sgRNA를 갖는 Cas9 단백질로 형질도입된 세포에서 생육가능한 세포는 검출되지 않았다(도 19B). 상이한 sgRNA는 WDR85의 녹아웃에서 상이한 효율을 나타내었다. 6개의 sgRNA 중 4개는 특별히 높은 세포 생존율을 제공하였다(도 19B, 막대 그래프). 본 실험에 사용된 KBM7 세포는 이배체였기 때문에, 상기는 생존 세포에서 내인성 WDR85가 상기 두 대립유전자 모두에서 결실되었음을 의미한다. DNA 서열 분석을 상이한 WDR85 sgRNA 및 CAS9 단백질로 형질도입된 디프테리아 독소 내성 세포의 풀에서 수행하였다. 우리는 모든 WDR85 sgRNA에 대해서 100%의 유전자 붕괴를 관찰하였으며(도 19C), 이는 디프테리아 독소 내성 세포가 WDR85 유전자 녹아웃임을 입증한다. 상기 녹아웃 빈도를 정확하게 평가하기 위해서, 우리는 KMB7 세포를 CAS9 단백질 및 상이한 WDR85 sgRNA로 형질도입시켰다. 4일 후에, 우리는 384 웰 플레이트에서 단일 세포 분류를 수행하였으며 1주일 후에 우리는 상기 단세포 분류 과정에 생존한 클론을 식별하였다. 이어서 상기 클론을 디프테리아 독소로 48시간 동안 처리하였다. 생존하는 클론을 카운트하여 우리는 디프테리아 독소 내성 클론의 백분율을 측정할 수 있게 되었고, 여기에서 WDR85의 2개의 대립유전자는 모두 녹아웃되었으며, 따라서 WDR85 녹아웃 세포를 만드는 효율을 평가하였다. 이전과 같이, 상기 상이한 sgRNA는 WDR85 녹아웃을 생성시킴에 있어서 상이한 효율을 나타내었으며, 이는 이중 대립유전자 녹아웃의 10 내지 70% 범위에 이른다(도 19D). 우리는 디프테리아 독소 생존 클론이 실제로 이중대립유전자 WDR85 유전자 붕괴를 함유하는지를 확인하는데 매우 효율적인 4개의 sgRNA에 대해서 3개의 단세포 클론 중의 CAS/CRIPSR 표적 부위를 서열분석하였다. 도 19D에 도시된 바와 같이, 디프테리아-내성 클론은 실제로 이중대립유전자 WDR85 유전자 붕괴를 나타내었다. 재조합 Cas9 단백질 및 sgRNA의 오스모사이토시스에 의해 이중대립유전자 녹아웃을 생성시키는 효율은 앞서 보고된 경우(2)보다 훨씬 더 크며, 이는 상기 방법이 인간 세포에서 표적화된 유전자 돌연변이의 매우 효율적인, 비-바이러스성 생성을 허용함을 입증한다. 상기 방법들 모두에서 15 mM 글리신 및 30 mM 글리세롤을 삼투억제제로서 상기 형질도입 완충제 중에 포함시켰다. 우리는 RNA 또는 DNA를 세포에 형질도입시키는 경우 인터페론 억제제 단백질 "B18R"을 사용하여 현저한 세포 생존 효과를 관찰하였다(Nat Protoc. 2013 Mar;8(3):568-82. doi: 10.1038/nprot.2013.019. Epub 2013 Feb 21. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Mandal PK1, Rossi DJ). 간단히, 세포를 형질도입 3시간 전, 형질도입 도중, 및 형질도입 후 48시간째에 250 ng/㎖의 B18R 단백질과 함께 배양하였다. 최근 수년간, 특이적인 게놈 표적 서열을 찾는 방식이 상이한 2개의 필수적으로 상이한 유전자 편집 시스템이 개발되었다. 아연-집게 뉴클레아제 및 TALEN에 의해 대표되는 한 가지 유형은 게놈 중 특정한 표적 DNA 서열을 인식하기 위해서 뉴클레아제 단백질 자체 내에 맞춤가능한 도메인을 사용한다. 다른 유형은 Cas9/CRISPR, 캐스케이드 및 TtAgo 및 다른 아고너트 단백질 시스템(관련된 뉴클레오타이드 서열에 의해 특정한 표적에 표적화되는 게놈 표적 부위와 관계없이 동일한 공통 단백질(복합체)을 사용한다)에 의해 대표된다. 우리의 데이터는 본 발명에 개시된 형질도입 시스템이 상기 두 유형의 유전자 편집 시스템을 포유동물 세포에 직접 전달할 수 있고 이렇게 함으로써 빠르고, 비-바이러스성이며 매우 효율적인 유전자 편집을 허용함을 입증한다. 실시예 14: 형질도입의 대음세포작용 기전에 대한 증거 및 형질도입 화합물 후보의 효능을 평가하기 위한 간단한 분석 형질도입을 발생시키기 위해서, 대음세포작용에 의해 취한 단백질을 시토솔내로 방출시켜야 한다. 우리는 이것이 대음세포작용성 소낭의 투과에 의해 발생함을 가정하였다. 잠재적인 형질도입 화합물 후보의 효능을 시험하기 위해서, 우리는 마크로피노솜 소낭 침투를 모니터하기 위한 분석을 셋업하였다. 우리는 약물 또는 병원체에 의해 유발된 소낭 누출을 모니터하기 위해서 앞서 개시된 갈렉틴3-GFP 리포터 시스템을 사용하였다(8,9). 갈렉틴-3은 베타-갈락토사이드 당 함유 탄수화물에 결합할 수 있는 작은 용해성 시토솔 단백질이다. 상기는 통상적으로 오직 원형질막의 외부 및 세포내 식작용성 소낭의 내부에 존재한다. 대음세포작용성 소낭 막의 세포내 투과시, 세포질 갈렉틴-3은 상기 소낭을 투과하여 혈관내 탄수화물에 결합할 수 있다. 따라서 갈렉틴-3 재국소화는 감염 도중 세포질에 들어가기 위해 소낭 파열에 의존하는 세균 및 바이러스의 연구에서 소낭의 파열을 식별하는 도구로서 사용되었다(8,9). 우리는 갈렉틴-3 단백질이 GFP에 융합된 리포터 시스템(GAL3-GFP)을 셋업하였다. 시토솔 GAL3-GFP 단백질은 투과된 마크로피노솜의 내부에 재국소화되고, 이때 다량체 복합체가 강한 녹색 형광 방출과 함께 형성된다. GAL3-GFP 단백질을 발현하는 MEF 세포를 700/3 조건을 사용하여 형질도입시켰다. 예상된 바와 같이, 우리는 형질도입 배지하에 세포에서 밝은 소낭 형성을 관찰하였으며, 이는 단백질 형질도입 조건하에서의 마크로피노솜 누출을 입증한다(도 16). Gal3-GFP는 세포를 대음세포작용 억제제 EIPA(단백질 형질도입을 효능 있게 억제한다)와 사전-배양시 또는 세포를 처리하지 않은 채로 두었을 때 소낭으로 재국소화되지 않았다(도 16). 더욱 또한, 상기 형질도입 화합물(NDSB-201)을 형질도입 활성이 거의 없거나 전혀 없는 화합물(화합물 09 및 18)로 교체했을 때, Gal3-GFP는 대음세포작용성 소낭내로 국소화되지 않았다(도 16). 이러한 결과는 상기 형질도입 배지가 대음세포작용을 통해 세포외 공간으로부터의 단백질 흡수를 촉진하고 마크로피노솜 소낭 누출을 유도하여 단백질을 시토솔내로 방출시킴을 암시한다. 상기 Gal3-GFP 분석은 후보 형질도입 화합물을 단백질 형질 도입 효능에 대해 시험하기 위한 간단하고 유효한 수단이다. 실시예 13 및 14에 대한 참고문헌 1. Jinek, M., et al., A programmable dual - RNA - guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity . Science, 2012. 337 (6096): p. 816-21. 2. Mali, P., et al., RNA - guided human genome engineering via Cas9 . Science, 2013. 339 (6121): p. 823-6. 3. Tsai, SQ, et al., Dimeric CRISPR RNA - guided FokI nucleases for highly specific genome editing . Nat Biotechnol, 2014. 32 (6): p. 569-76. 4. 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형질도입 완충제

형질도입 완충제{TRANSDUCTION BUFFER}

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