지방산 생합성에 포함된 식물 유전자를 표적하는 조작된 징크 핑거 단백질 |
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申请号 | KR1020127011050 | 申请日 | 2010-10-22 | 公开(公告)号 | KR1020120123249A | 公开(公告)日 | 2012-11-08 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
申请人 | 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨; 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드; | 发明人 | 데켈버러쎌; 굽타만주; 밀러제프리씨.; 노박스티븐; 페토리노조셉에프.; | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
摘要 | 본 개시 내용은 식물에서 지방산 생합성에 포함된 유전자를 표적하는 조작된 징크 핑거 단백질에 대한 것이다. 또한, 유전자 발현, 유전자 비활성화, 및 표적된 유전자 변형을 조절하는 이런 징크 핑거 단백질을 사용하는 방법을 제공한다. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
权利要求 | 적어도 하나의 식물 유전자가 지방산 생합성에 포함되고, β-케토아실-ACP 합성효소(KAS) 유전자, 지방산 티오에스테라아제 B(FatB) 유전자, 지방산 신타아제(FAS) 유전자, 지방산 신장효소 유전자, 지방산 티오에스테라아제 A(FatA) 유전자, 색소체 G-3-P 탈수소 효소(GPDH) 유전자, 글리세로키나아제(GK) 유전자, 스테아로일-아실 운반 단백질 탈포화효소(S-ACP-DES) 유전자, 및 올레오일-ACP 가수 분해 효소 유전자로 구성되는 군으로부터 선택될 때, 적어도 하나의 내재적 식물 유전자의 발현을 조절하는 비-천연 발생 징크 핑거 단백질. 제 1항의 징크 핑거 단백질 및 기능적 도메인을 포함하는 융합 단백질. 제 2항에 있어서, 기능적 도메인은 전사적 조절 도메인 또는 절단 도메인인 것을 특징으로 하는 융합 단백질. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 유전자는 유채속 식물에 함유되는 것을 특징으로 하는 징크 핑거 단백질 또는 융합 단백질. 제 4항에 있어서, 징크 핑거 단백질은 표 2 또는 표 11에 나타난 바와 같은 표적 부위에 결합하는 것을 특징으로 하는 징크 핑거 단백질. 제 4항에 있어서, 징크 핑거 단백질은 표 1 또는 표 12에서 연속적으로 나타난 인식 헬릭스 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 징크 핑거 단백질. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 징크 핑거 단백질 또는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드. 하나 이상의 징크 핑거 단백질이 발현되고, 하나 이상의 유전자가 변경된 것과 같은 조건 하에서, 제 7항에 따른 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 발현 벡터를 식물 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 식물세포에서 지방산 생합성에 포함된 하나 이상의 유전자를 변경하는 방법. 제 8항에 있어서, 변형은 적어도 하나의 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. 제 9항에 있어서, 적어도 하나의 유전자의 발현이 활성화되는 것을 특징으로 하는 방법. 제 9항 또는 제 10항에 있어서, 적어도 하나의 유전자의 발현이 억제되는 것을 특징으로 하는 방법. 제 8항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 징크 핑거 뉴클레아제를 암호화하고, 적어도 하나의 유전자가 절단되는 것을 특징으로 하는 방법. 제 12항에 있어서, 공여자 벡터가 상동성 재조합에 의해 절단 부위로 도입되도록 공여자 핵산을 도입하는 단계를 추가로 포함하는 방법. 제 8항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 변경된 적어도 하나의 유전자를 포함하는 식물 세포. 제 14항에 있어서, 세포가 종자 내에 있고, 종자의 지방산 함량이 변경된 것을 특징으로 하는 식물 세포 제 14항 또는 제 15항에 따른 적어도 하나의 세포를 포함하는 식물. 제 16항에 따른 식물의 종자 또는 자손. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 징크 핑거 단백질 또는 제 7항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 세포를 포함하는 식물. 제 18항에 따른 식물의 종자 또는 자손. |
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说明书全文 |
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ZFP | F1 | F2 | F3 | F4 | F5 | F6 |
14025 | RSDNLSV (서열번호 5) | QKINLQV (서열번호 6) | RSDTLSE(서열번호 7) | TRSSRIN (서열번호 8) | RSDALAR(서열번호 9) | N / A |
14033 | RSDHLSA(서열번호 10) | TSSSRIN (서열번호 11) | RSDNLAR(서열번호 12) | DRSHLAR(서열번호 13) | RSDNLSE(서열번호 14) | RNAHRTT (서열번호 15) |
14035 | QSGNLAR(서열번호 16) | RSDHLSE(서열번호 17) | QKANRTK(서열번호 18) | RSDDLTR(서열번호 19) | TSANLSR (서열번호 20) | N / A |
14047 | R SDDLSK(서열번호 21) | RSANLTR(서열번호 22) | RSDDLTR(서열번호 19) | RSDHLSE(서열번호 17) | DKSNRKK(서열번호 23) | N / A |
β-케토아실-ACP 합성효소 II 징크 핑거의 표적 부위
ZFP | 표적 부위(5' 내지 3') | 서열번호에서 나타나는 ZFP 표적 / 결합 부위 |
14025 | cGTGGAGACGtCAAAAGa(서열번호 24) | 3, 4, 46 및 30 |
14033 | aAGGAAGGGCGAGAAAAGGg(서열번호 25) | 3 및 4 |
14035 | aGATGCGTAACAGGAAg(서열번호 26) | 3, 4, 46 및 30 |
14047 | cTACCGGGCGGAGTCGt(서열번호 27) | 3, 4 및 30 |
β-케토아실-ACP 합성효소 II 설계는 CCHC 구조가 있는 적어도 하나의 핑거를 갖는 단백질을 암호화하는 징크 핑거 발현 벡터로 통합되었다. 미국 특허 공개 No. 2008/0182332를 참조하라. 특히, 각각의 단백질에서 마지막 핑거는 CCHC 구조(건축)를 가졌다.
이후 징크 핑거-암호화 서열은 VP16 활성화 도메인 및 오파크-2 핵 위치화 신호를 암호화하는 서열로 융합시켰다. 융합 단백질의 발현은 애기장대 유비퀴틴 10(AtUbi10) 프로모터로부터 유래한 프로모터와 같이 상대적으로 강한 구조적 프로모터에 의해 조종되었다. 예시적인 벡터를 아래 표 3에서 보여준다.
실시예 3: 유채에서 고유한 β-케토아실-ACP 합성효소 II 유전자의 ZFP TF-매개 상향 조절
식물 세포에서 설계된 징크-핑거 단백질의 기능성을 확인하기 위하여, 살아있는 식물 세포에서 이런 단백질의 발현을 위한 방법을 사용하였다. 징크-핑거 단백질을 암호화하는 DNA를 DNA가 식물 세포 게놈으로 통합되지 않는 조건 하에서 식물 세포로 전달할 수 있다. 따라서, DNA 분자는 식물 세포에서 일시적으로 유지되고, 유전자 발현의 주형으로서 활동한다. 대안적으로, 징크-핑거 단백질을 암호화하는 DNA는 DNA가 식물 세포 게놈으로 통합되는 것을 허용하여, 징크-핑거 단백질 암호화 유전자의 형질전환을 야기하여, DNA 분자가 식물 세포에서 안정적으로 유지되고, 유전자 발현의 주형으로서 활동하는 조건 하에서 식물 세포로 전달될 수 있다. 당업자는 살아있는 식물 세포에서 이들 단백질의 기능성을 평가하기 위해 징크-핑거 단백질 암화화 DNA의 일시적이거나 형질전환된 발현 중 어느 하나를 사용할 수 있다.
3.1 컨스트럭트 설계
본 프로젝트를 위하여 설계되고 구축된 바이너리 플라스미드를 표 3에 나열하였다.
유채
KAS II를 표적하는 ZFP TF에 대한 컨스트럭트 서술
SN | ZFP | 컨스트럭트 No. | 유전자 카세트 |
1 | 14025 | pDAB4695 | Atubi10 / ZFP1-Vp16 / AtuORF23 / CsVMV / pat / AtuORF1 |
2 | 14033 | pDAB4696 | Atubi10 / ZFP2-Vp16 / AtuORF23 / CsVMV / pat / AtuORF1 |
3 | 14035 | pDAB4697 | Atubi10 / ZFP3-Vp16 / AtuORF23 / CsVMV / pat / AtuORF1 |
4 | 14047 | pDAB4698 | Atubi10 / ZFP4-Vp16 / AtuORF23 / CsVMV / pat / AtuORF1 |
AtUbi10 = 애기장대 유비퀴틴 10 프로모터, CsVMV = 카싸바 베인 모자이크 바이러스 프로모터, ZFP = 징크 핑거 단백질 유전자, pat = 포스피노트리신 아실 트랜스퍼라아제 유전자, AtuORF1 = 아그로박테리움 투멘파시엔스3' UTR 1 및 AtuORF23 = 아그로박테리움 투멘파시엔스 3' UTR 23.
pDAB4695는 14025 v3/VP 16 및 pat 유전자 발현 카세트를 함유하는 바이너리 플라스미드이다. 이 컨스트럭트는 하기 유전자 요소; RB7 MAR v3(매트릭스 부착 영역(Thompson et al., 1997, WO9727207)) :: AtUbi10 프로모터 v2(애기장대 유비퀴틴-10 프로모터(Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493)) :: 14025 v3 징크 핑거/VP16 융합 :: Atu ORF23 3'UTR v1(아그로박테리움 투멘파시엔스 전사해독틀 23, 3'비번역 영역(Gelvin et al., 1987, EP222493)) :: CsVMV 프로모터 v2(카싸바 베인 모자이크 바이러스 프로모터(Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31: 1129-1139)):: pat v5(포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라아제(Wohlleben et al., 1988, 유전자 70:25-37)):: AtuORF 1 3'UTR v4(아그로박테리움 투멘파시엔스 전사해독틀 1, 3'비번역 영역(Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822))을 포함한다. 바이너리는 NcoI-SacI 제한 부위를 통해 pDAB3916으로 4025 v3 징크 핑거 / VP16 융합을 함유하는 DNA 단편을 클로닝함으로써 구축되었다. pDAB8221로서 표지된 결과적인 컨스트럭트는 AtUbi10 프로모터 v2 :: 14025 v3 징크 핑거/ VP16 융합 :: Atu ORF23 3'UTR v1 유전자 발현 카세트를 함유한다. pDAB8221은 LR Gateway반응(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 통해 pDAB7309 바이너리로 클로닝되었다. 이 반응은 pDAB4695을 생산하였고, 제한효소 절단 반응 및 서열분석 반응을 통해 확인하였다.
pDAB4696은 14033 v3/VP 16 및 pat 유전자 발현 카세트를 함유하는 바이너리 플라스미드이다. 이 컨스트럭트는 하기 유전자 요소; RB7 MAR v3 :: AtUbi10 프로모터 v2 :: 14033 v3 징크 핑거/VP16 융합 :: Atu ORF23 3'UTR v1 :: CsVMV 프로모터 v2 :: pat v5 :: AtuORF 1 3'UTR v4를 포함한다. 바이너리는 NcoI-SacI 제한 부위를 통해 pDAB3916으로 14033 v3 징크 핑거/VP16 융합을 함유하는 DNA 단편을 클로닝함으로써 구축되었다. pDAB8222로서 표지된 결과적인 컨스트럭트는 AtUbi10 프로모터 v2 :: 14033 v3 징크 핑거/VP16 융합 :: Atu ORF23 3'UTR v1 유전자 발현 카세트를 함유한다. pDAB8222는 LR Gateway반응(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 통해 pDAB7309 바이너리로 클로닝되었다. 이 반응은 pDAB4695을 생산하였고, 제한효소 절단 반응 및 서열분석 반응을 통해 확인하였다.
pDAB4697은 14035 v3/VP 16 및 pat 유전자 발현 카세트를 함유하는 바이너리 플라스미드이다. 이 컨스트럭트는 하기 유전자 요소; RB7 MAR v3 :: AtUbi10 프로모터 v2 :: 14035 v3 징크 핑거/VP16 융합 :: Atu ORF23 3'UTR v1 :: CsVMV 프로모터 v2 :: pat v5 :: AtuORF 1 3'UTR v4를 포함한다. 바이너리는 NcoI-SacI 제한 부위를 통해 pDAB3916으로 14035 v3 징크 핑거/VP16 융합을 함유하는 DNA 단편을 클로닝함으로써 구축되었다. pDAB8222로서 표지된 결과적인 컨스트럭트는 AtUbi10 프로모터 v2 :: 14035 v3 징크 핑거/VP16 융합 :: Atu ORF23 3'UTR v1 유전자 발현 카세트를 함유한다. pDAB8223는 LR Gateway반응(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 통해 pDAB7309 바이너리로 클로닝되었다. 이 반응은 pDAB4695을 생산하였고, 제한효소 절단 반응 및 서열분석 반응을 통해 확인하였다.
pDAB4698은 14047 v3/VP 16 및 pat 유전자 발현 카세트를 함유하는 바이너리 플라스미드이다. 이 컨스트럭트는 하기 유전자 요소; RB7 MAR v3 :: AtUbi10 프로모터 v2 :: 14047 v3 징크 핑거/VP16 융합 :: Atu ORF23 3'UTR v1 :: CsVMV 프로모터 v2 :: pat v5 :: AtuORF 1 3'UTR v4를 포함한다. 바이너리는 NcoI-SacI 제한 부위를 통해 pDAB3916으로 14047 v3 징크 핑거/VP16 융합을 함유하는 DNA 단편을 클로닝함으로써 구축되었다. pDAB8224로서 표지된 결과적인 컨스트럭트는 AtUbi10 프로모터 v2 :: 14047 v3 징크 핑거/VP16 융합 :: Atu ORF23 3'UTR v1 유전자 발현 카세트를 함유한다. pDAB8224는 LR Gateway반응(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 통해 pDAB7309 바이너리로 클로닝되었다. 이 반응은 pDAB4695을 생산하였고, 제한효소 절단 반응 및 서열분석 반응을 통해 확인하였다.
3.2 아그로박테리움 형질전환
아그로박테리움 세포를 Weigel D., Glazebrook J. Arabidopsis thaliana: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002: pg123-124에서 기술된 프로토콜을 사용하여 전기천공을 위해 준비하였다. 사소한 변형을 아그로박테리움의 최적 성장을 허용하기 위해 프로토콜에 대하여 만들었다(즉 YEP 배지를 LB로 치환하였다). 독립적으로, 각각의 컨스트럭트에 대하여 1.5-3 μg의 플라스미드 DNA를 50 μl의 C58 :: Z707 아그로박테리움 투메파시엔스 세포에 첨가하였고, 부드럽게 섞었다. 혼합물을 차가운 0.2 cm 유전자 PULSERcuvettes(BioRad Hercules, CA)로 옮긴 후 얼음에 두었다. 큐벳을 차가운 유전자 PULSERrack(BioRad, Hercules, CA)에 위치시킨 후 하기 조건에서 전기천공시켰다: 정전 용량 출력 25 μFarad, 정전 용량 증량 960 μFarad, 저항 200 ohms, 및 전압 2.5 kVolts. 전기천공 바로 후에, 950 μl의 SOC 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 첨가하였고, 혼합물을 Falcon 2059 튜브(Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ) 또는 등가물로 옮겼다. 형질전환된 세포를 이후 28℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 50 μl, 100 μl, 및 200 μl의 세포를 분리된 약간의 항생제를 함유하는 YEP 배지 플레이트에 도말하였다(1리터의 물에 10 gm 효모 추출물, 10 gm 펩톤, 5 gm NaCl, 10 gm 수크로오스, 및 15 gm 아가). 플레이트를 대략 36~48시간 동안 28℃에서 거꾸로 키웠다. 단일 콜로니를 집어서 약간의 항생제를 함유하는 50 ml의 액체 YEP(1 리터의 물에 10 gm 효모 추출물, 10 gm 펩톤, 5 gm NaCl, 및 10 gm 수크로오스)에서 대략 36시간 동안 28℃에서 증식시켰다.
아그로박테리움 투메파시엔스 균주를 케토락토오스 테스트를 통해 확인하였다. 추정적으로 형질전환된 콜로니를 락토오스 아가에 획선 접종하였고, 48시간 동안 28℃에서 배양하였다. 이후 플레이트를 베네틱트 용액에 담그었다. 플레이트를 모니터링하였다: 획선 접종된 분리체가 베네딕트 용액을 파란색에서 노란색으로 바꾸면 아그로박테리움으로서 확인되었다(Bouzar, H., Jones, J., Bishop, A. Simple Cultural Tests for Identification of Agrobacterium Biovars. Methods in Molecular Biology , Volume 44. Humana Press, 1995: 9-13).
QIAGEN 저카피 미니-프렙 프로토콜(Qiagen, Valencia, CA)을 마친 다음, 정제된 플라스미드 DNA를 박테리아 배양으로부터 준비하였다. DNA 완전성을 제한 절단반응을 통해 평가하였다. 예상된 밴드 패턴을 갖는 클론을 확인하였고, 500 μl의 박테리아아 배양을 500 μl의 멸균된 글리세롤(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)에 첨가하고 혼합하기 위해 인버팅하여 글리세롤 스탁으로 준비하였다. 글리세롤 스탁은 드라이아이스에서 얼린 뒤, -80℃에서 보관하였다.
3.3 ZFP TF가 있는 유채의 형질전환
하배축 부분의 준비: 유채 유전자형, Nex 710의 종자를 10%의 시판용 표백제로 10분 동안 표면-살균하고, 멸균수로 3번 헹구었다. 종자를 멸균 종이 타월로 건조시키고, MS 기초 배지(Murashige and Skoog, Physiol Plant 15(3): 473-497, 1962), 20 g/L 수크로오스, 및 8 g/L TC 아가(PhytoTechnology Laboratories, Shawnee Mission, KS)의 절반 농도로 구성되는 '발아 배지'를 함유하는 피타-트레이에 위치시키고 23℃, 및 16시간 명/8시간 암의 명주기로 설정된 상황 하에서 유지시켰다.
5일 째에, 묘목이 불모인지 확인하고, 피타-트레이를 불모를 유지시키기 위해 EDGEGARDlaminar flow hood(The Baker Company, Sanford, ME) 안에 위치시켰다. 멸균한 핀셋 및 해부용 가위를 사용하여, 식물을 피타-트레이로부터 제거하였고, 안테나(분열조직 및 떡잎)영역 및 뿌리를 분리하고 버렸다. 하배축을 건조를 막기 위해 요구되는 멸균수를 함유하는 100 x 25mm 페트리 디쉬에 위치시켰다. 하배축을 100 x 25mm 페트리 디쉬의 뚜껑에 위치시키고 #10 외과용 메스를 사용하여 3mm 부분으로 횡단으로 잘랐다. 하배축 부분을 멸균된 필터 종이를 포함하는 7g/L TC 아가로 굳혀진, 30 g/L 수크로오스, 1 mg/L 키네틴 및 1 mg/L 2,4-D를 함유하는 MS 배지로 구성된 캘러스 유도 배지'에 위치시켰다. 플레이트를 깨끗한 STERILITEtub 내로 위치시키고, 앞서 처리한 바와 같이, 3일 동안 동일한 성장 상황 하에서 유지시켰다.
8일 째에, 부분을 이후 30 g/L 글루코오스, ½ 스트렝스 감보르그 비타민(strength Gamborg vitamin)(1968), 215.2 mg/l 키네틴 및 221.04 mg/l 2,4-D를 함유하는 Linsmaier and Skoog 기초 배지(1965)로 구성된 20 mL의 '액체 배양 배지'를 함유하는 100 x 25 멸균 페트리 디쉬로 1시간의 전처리를 위해 옮겼다. '액체 배양 배지'를 하배축 부분으로부터 제거한 후, 50 Klett에서 40mL의 아그로박테리움 부유물(Z707에 pDAB4695, pDAB4696, pDAB4697 또는 pDAB4698 중 어느 하나를 함유하는)을 약하게 와동시킨 다음 하배축 부분을 함유하는 100 x 25mm 페트리 디쉬에 30분 처리를 위해 부었다. 30분 후, 모든 아그로박테리움 부유물을 더블 스택 피펫을 사용하여 제거하였다. 처리된 하배축을 필터 종이와 함께 '캘러스 유도 배지'로 다시 옮겼고, STERILITEtub로 돌려보냈고, 어두운 뚜껑으로 덮은 뒤, 3일의 공동-경작 기간을 위해 상기와 같은 동일한 성장 상황 하의 배양 룸으로 돌려보냈다. 3일 후, 하배축을 1mg/L HERBIACE를 함유하는 '캘러스 유도 배지'로 직접 위치시켰고, 투명한 뚜껑이 있는 통으로 다시 위치시켰으며, 상기와 동일한 성장 상황을 유지하는 배양 룸으로 돌려보냈다. 1주 후, 하배축을 3 mg/L HERBIACE에서 2주간 나아간 캘러스 발달을 위해 신중히 '캘러스 유도 배지'로 직접 옮겼고, 추가적인 캘러스 발달을 위해 2-8주간 5mg/L HERBIACE에서 신중히 '캘러스 유도 배지'로 옮겼다. 일단 충분한 양의 캘러스가 사용가능하면, 분자적 분석을 위해 제출하였다.
나이든 카놀라 캘러스로부터 나온 식물의 재생: 카놀라 캘러스 조직을 5 mg/L HERBIACE에서 30 g/L 수크로오스, 3 mg/L 벤지아미노퓨린, 0.5 g/L MES[2-(N-모포리온)에탄 설폰산], 5 mg/L 실버 나이트레이트, 1mg/L 제아틴, 250 mg/L 카르베니실린, 300 mg/L 티멘틴 및 7 g/L TC 아가를 함유하는 MS 배지로 구성된'발아 재생 배지'로 신중히 위치시켰고, 플레이트를 3M 테이프로 감싸고, 23℃ 및 16시간 명/8시간 암의 명주기로 조절된 성장 상황 하에 위치하였다. 조직을 이후 5 mg/L HERBIACE에서 0.5 g/L MES, 300 mg/L 티멘틴, 20 g/L 수크로오스 및 7 g/L TC 아가를 함유하는 MS 배지로 구성된 '배아 연장 배지'로 신중히 옮겼다. 묘목을 5 mg/L HERBIACE에서 10 g/L 수크로오스, 0.5 mg/L 인돌레부티르산, 300 mg/L 티멘틴 및 8 g/L TC 아가를 함유하는 ½ MS 배지로 구성되는 '뿌리 발아 배지'로 옮겼다.
in vitro에서 묘목에서 일단 뿌리가 나오면, 그들은 Metro Mix 360을 함유하는 5 ¼ 화분에 심었다. 식물을 깨끗한 단독 컵으로 씌운 뒤, 순응을 위해 콘비론에 위치시켰다. 48-72시간 후, 공기 순환을 위해 컵을 제거하였다. 총 7일이 지난 후, 화분을 더 나아간 발달을 위해 콘비론으로부터 온실 베이로 전환하였다. 식물은 16:8 명주기, 22-24℃의 낮시간 및 밤시간 온도 하에서 자랐다. 첫 번째 꽃대가 꽃눈으로부터 올라오기 시작했을 때, 전체 식물을 이종교배를 막기 위해 셀핑 백으로 씌웠다. 자가-수분으로부터 유래한 종자를 이식 후 약 4달만에 수확하였다.
아그로박테리움의 준비: 처리하기 4일 전에 10 g/L 펩톤, 10 g/L 효모 추출물, 5 g/L NaCl, 10 g/L 수크로오스에 더하여 100 mg/L 스펙티노마이신 및 250 mg/L 스트렙토마이신으로 구성되고, 15 g/L 박토 아가로 굳혀진 '반고체 박테리아 성장 배지'로 글리세롤 스탁으로부터 아그로박테리움을 획선접종하였고, 28℃에서 2일 간 배양기(Fisher Scientific Isotemp Incubator)에서 자랐다. 2일 후, 아그로박테리움의 작은 루프를 150mL '액체 박테리아 성장 배지'(상기에서 고체화 제제만 뺌), 250mg/L의 스트렙토마이신 및 100mg/L의 스펙티노마이신을 함유하는 500mL의 멸균한 1회용 바플드 플라스크로 위치시키고, 200 rpm에서 밀봉한 교반기(New Brunswick Scientific Innova 4330 refrigerated incubator shaker), 암조건, 28℃에서 16시간 밤새 자랐다. 16시간 후 아그로박테리움 배양을 교반기에서 제거하였고, 50mL 원심기 튜브로 분주하였다(준비를 위해 35mL을 함유하는 하나, 재확인을 위해 50mL을 함유하는 두 개). 원심기 튜브를 원심기에 위치시키고, 15분 동안 6000rpm으로 원심분리하였고, 이어서 붉은 필터로 Klett 50의 최종 밀도로 '액체 배양 배지'에 재혼탁시켰다.
실시예 4: 형질전환된 캘러스 샘플의 분석
추정적으로 형질전환된 유채 캘러스 샘플을 β-케토아실-ACP 합성효소 II 내재적 유전자, 튜불린 내재적 유전자 및 ZFP TF 트랜스유전자에 대한 mRNA 발현에서의 변경에 대하여 분석하였다. 튜불린 mRNA 수준을 ZFP TF 및 β-케토아실-ACP 합성효소 II mRNA의 발현을 평준화시키기 위한 내부 대조군으로서 사용하였다. ZFP TF mRNA 발현 데이터를 형질전환된 칼리(calli)에서 적어도 하나의 기능적 ZFP TF 트랜스유전자의 존재를 확인하기 위해 사용하였다.
4.1 캘러스 샘플 준비
대략 40-50개의 8주령의 유채 캘러스 샘플을 Nex710 하배축 조직의 형질전환 후에 얻었다. 그들은 실시예 3.3에서 기술한 바와 같이 ZFP TF 컨스트럭트, pDAB4695, pDAB4696, pDAB4697, 및 pDAB4698로 개별적으로 형질전환되었다. 대조군 샘플은 pat 유전자 발현 카세트(AtUbi10 프로모터 v2 :: pat v3 :: Atu ORF1 3'UTR v3)를 함유하는 대조군 바이너리 컨스트럭트의 형질전환에 의해 얻었다. 모든 샘플은 그들을 수확할 때 까지 HERBIACE보충 세포 배양 배지에서 자랐다.
총 RNA를 QIAGEN RNEASY 96 Kit(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 신선한 캘러스 조직으로부터 준비하였다. RNA를 RNase-프리 DNase로 키트의 지침서에 EK라 임의의 게놈 DNA 오염물을 제거하기 위해 처리하였다. 첫 번째 사슬 합성은 SuperscriptIII Reverse Transcriptase 효소(Invitrogen, Carlsbad, CA) 제조사의 지침서에 따라 수행하였고, 무작위 헥사머를 사용하여 준비하였다. 합성된 cDNA 사슬을 1:10 및 1:50의 비율로 물에 희석시켰다(이것은 다중 표적을 증폭시키는 PCR을 위한 충분한 주형을 제공한다). 각각의 분주를 독립적으로 20℃에서 보관하였다.
4.2 β-케토아실-ACP 합성효소 II mRNA 발현 분석
qRT-PCR 반응 혼합을 하기와 같이 β-케토아실-ACP 합성효소 II cDNA의 증폭을 위해 수행하였다: 7.5 μL의 2X LC480 Probes Master Buffer(Roche Diagnostic, Indianapolis, IN), 10 μM 스탁으로부터 0.3 μL 유전자 특이적 정방향 프라이머(서열번호 28: 5'-TTGACTCGAGCTGCTACTGC-3'; 도 8 정렬에서 서열번호 3에 있어서 뉴클레오티드 위치 544-563), 10 μM 스탁으로부터 0.3 μL 유전자 특이적 역방향 프라이머(서열번호 29: 5'-TTTCCATATCCATCGCAACA-3'; 도 8 정렬에서 서열번호 3에 있어서 뉴클레오티드 위치 588-607), LIGHTCYCLER480 Probes Master(Roche Diagnostic, Indianapolis, IN)로부터 0.15 μL UPL 프로브 #25, 1.5 μL의 10%(w/v) 폴리비닐 피롤리돈-40(PVP-40), 및 3.9 μL 물. UPL 프로브(Roche Diagnostics, Indianapolis, USA)는 핵산을 잠그고, 그러므로 달리 계산된 것 보다 높은 Tm을 갖는다. 모든 성분을 표준 및 미지의 물질을 핸들링하기 전에 냉동고에 넣어두었다. 384-웰 마이크로플레이트를 분리하여 표지하였고, 13.5 μL의 마스터 믹스를 웰에 첨가하였다. 씰링 포일을 마이크로플레이트에 부드럽게 부착하였다. 플레이트를 1분 동안 3000 rpm에서 Qiagen microplate centrifuge에서 원심분리하였다. 1.5 μL의 녹인, 희석된 합성 cDNA 사슬을 첨가하였다. 추가적으로, 1.5 μL의 플라스미드 DNA 카피 수 표준을 가장 낮은 것에서 가장 높은 농도의 일련의 희석으로 웰을 분리하여 첨가하였고, 이들 표준은 카피 수를 정량하기 위해 β-케토아실-ACP 합성효소 II cDNA(총 mRNA로부터 합성된)과 비교하였다. β-케토아실-ACP 합성효소 II DNA 카피 수 표준 시리즈를 pCR2.1 플라스미드(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 표적 증폭산물을 클로닝하고, 카피수를 정량하기 위한 희석 시리즈를 만듦으로써 만들었다. 포일 씰을 플레이트에 단단히 붙이고 앞서 기술한대로 원심분리하였다. PCR 프로그램을 하기와 같이 수행하였다: i. 5분 동안 95℃에서 활성화시킴; ii. 10초간 95℃에서 변성 @ 4.8℃/sec; iii. 25초간 60℃에서 어닐링/연장 @ 2.5℃/sec; iv. 1초간 72℃에서 수득 @ 4.8℃/sec; ii-iv 단계 반복, 40-50번 이상; 5초 동안 38℃에서 식힘. DNA를 Real-time PCR instrumentation LC480(Roche, Indianapolis, IN) 또는 등가물에서 증폭시켰다. 증폭산물 사이즈는 64 염기쌍이었다. 본 PCR 분석에서 사용한 정방향 및 역방향 프라이머 서열은 두 개의 β-케토아실-ACP 합성효소 II 유전자 표적, 서열번호: 3 및 30(도 8)에서 존재하는 상응하는 서열과 완벽하게 매치하였다. 그러므로, 이 분석은 두 개의 β-케토아실-ACP 합성효소 II 유전자 표적의 정량적 발현을 나타낸다.
4.3 튜불린 mRNA 발현 분석
튜불린 유전자, 유채의 고유 유전자(GenBank: AF258790 및 GenBank: DU106489)를 qRT-PCR 분석에서 mRNA 발현 신호를 정확히 평준화시키기 위한 참조 표준으로 사용하였다. β-케토아실-ACP 합성효소 II qRT-PCR 분석을 위해 합성된 cDNA(실시예 4.1에서 기술됨)을 또한 아래에서 기술한 바와 같이 튜불린 qRT-PCR 분석에 사용하였다.
qRT-PCR을 DNA를 검출하고 정량하기 위하여 0.3 μL의 유전자 특이적 정방향 프라이머(서열번호 31: 5'-ACAGCGATTGCCTACAAGG-3')(10 μM 스탁) 및 0.3 μL의 유전자 특이적 역방향 프라이머(서열번호 32: 5'-AGATGGTTAAGATCACCAAAGG-3')(10 μM 스탁), 1.5 μL의 10%(w/v) PVP-40, 3.9 μL 물 및 7.5 μL 2X LIGHTCYCLER480 SYBR Green I Master Mix(Roche, Indianapolis, IN)로 수행하였다. 384-웰 마이크로 플레이트를 분리하여 표지하였고, 13.5 μL의 마스터 믹스를 웰에 첨가하였다. 씰링 포일을 마이크로플레이트에 부드럽게 부착하였다. 플레이트를 1분 동안 3000 rpm에서 Qiagen microplate centrifuge에서 원심분리하였다. 1.5 μL의 녹인, 희석된 합성 cDNA 사슬을 첨가하였다. 추가적으로, 1.5 μL의 플라스미드 DNA 카피 수 표준을 가장 낮은 것에서 가장 높은 농도의 일련의 희석으로 웰을 분리하여 첨가하였고, 이들 표준은 카피 수를 정량하기 위해 β-케토아실-ACP 합성효소 II cDNA(총 mRNA로부터 합성된)과 비교하였다. β-케토아실-ACP 합성효소 II DNA 카피 수 표준 시리즈를 pCR2.1 플라스미드(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 표적 증폭산물을 클로닝하고, 카피수를 정량하기 위한 희석 시리즈를 만듦으로써 만들었다. 포일 씰을 플레이트에 단단히 붙이고 앞서 기술한대로 원심분리하였다. PCR 프로그램을 하기와 같이 수행하였다: i. 10분 동안 95℃에서 활성화시킴; ii. 10초간 95℃에서 변성 @ 4.8℃/sec; iii. 20초간 55.5℃에서 어닐링/연장 @ 2.5℃/sec; iv. 20초간 72℃에서 수득 @ 4.8℃/sec; ii-iv 단계 반복, 39번 이상; 5초 동안 38℃에서 식힘. DNA를 Real-time PCR instrumentation LC480 또는 등가물에서 증폭시켰다. 증폭산물 사이즈는 307 염기쌍이었다. 이 역방향 프라이머는 GenBank 서열에 기초하여 78 bp만큼 인트론에 걸쳤다. 그러므로 게놈 DNA로부터 증폭된 증폭 산물은 유리하지 않을 것이고, 게놈 DNA 오염물이 더 높은 분자량을 가질 것이며, 아가로즈 겔에서 내린 증폭 산물에 의해 cDNA의 그것과 쉽게 차이날 것이다.
4.4 ZFP TF mRNA 발현 분석
발현 of ZFP TF mRNA의 발현을 β-케토아실-ACP 합성효소 II mRNA(실시예 4.1에서 기술함)를 위해 본래 합성된 cDNA 샘플로 정량하였다. TaqMan PCR 분석을 5'에서 오파크-2 NLS 서열, 3'에서 VP16 서열에 대하여 고정되는 프라이머에 의해 ZFP 카세트로부터 설계하였다. PCR 분석은 : 10 μM 스탁으로부터 0.5 μL 정방향 프라이머 OP2_NLS_F1(서열번호 33: 5'-AAGGAAGAGGAAGGAGTCTAACAG-3'), 10 μM 스탁으로부터 0.5 μL 역방향 프라이머 VP16_R1(SEQ ID 34: 5'-CTTCTGCTCTCCACCGTA-3'), 5 μM 스탁으로부터0.25 μL 프로브 VP16_MGB_185(서열번호 45: 5'-TTGATGGTGAAGATGT-3'), 1.5 μL의 10%(w/v) PVP-40, 1.5 μL 10x Hot Start PCR 버퍼, 1.0 μL 25mM MgCl 2 , 1.2 μL dNTP(2.5mM each), 0.15 L Hot Start Taq 폴리머라아제(Qiagen, Valencia, CA), 및 6.9 L 물을 사용하여 수행하였고, 칵테일을 LIGHTCYCLER480(Roche Diagnostics, USA)을 사용하여 증폭시켰다. 384-웰 마이크로 플레이트를 분리하여 표지하였고, 13.5 μL의 마스터 믹스를 웰에 첨가하였다. 씰링 포일을 마이크로플레이트에 부드럽게 부착하였다. 플레이트를 1분 동안 3000 rpm에서 Qiagen microplate centrifuge에서 원심분리하였다. 1.5 μL의 녹인, 희석된 합성 cDNA 사슬을 첨가하였다. 추가적으로, 1.5 μL의 플라스미드 DNA 카피 수 표준을 가장 낮은 것에서 가장 높은 농도의 일련의 희석으로 웰을 분리하여 첨가하였고, 이들 표준은 카피 수를 정량하기 위해 β-케토아실-ACP 합성효소 II cDNA(총 mRNA로부터 합성된)과 비교하였다. β-케토아실-ACP 합성효소 II DNA 카피 수 표준 시리즈를 pCR2.1 플라스미드(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 표적 증폭산물을 클로닝하고, 카피수를 정량하기 위한 희석 시리즈를 만듦으로써 만들었다. 포일 씰을 플레이트에 단단히 붙이고 앞서 기술한대로 원심분리하였다. PCR 프로그램을 하기와 같이 수행하였다: i. 15분 동안 95℃에서 활성화시킴; ii. 20초간 95℃에서 변성 @ 4.8℃/sec; iii. 20초간 60℃에서 어닐링/연장 @ 2.5℃/sec; iv. 55초간 72℃에서 수득 @ 4.8℃/sec; ii-iv 단계 반복, 449번 이상; 5초 동안 38℃에서 식힘. DNA를 Real-time PCR instrumentation LC480 또는 등가물에서 증폭시켰다. 증폭산물 사이즈는 775 염기쌍이었다. ZFP TF cDNA/mRNA 카피 수는 표적 증폭산물을 플라스미드로 클로닝하고, 상기 실시예에서 β-케토아실-ACP 합성효소 II 및 튜불린에 대하여 기술한 바와 같은 PC 분석을 위한 희석물을 만든 표준 시리즈를 사용하여 결정하였다.
4.5 캘러스 샘플의 발현 분석
ZFP TF mRNA 발현을 ZFP TF로 형질전환된 것으로 추정되고 HERBIACE선택 배지(실시예 3 참조)에서 자란 8주령 트랜스제닉 캘러스 샘흘에서 측정하였다. qRT-PCR 분석으로 측정한 것과 같이, ZFP TF 정량적 mRNA 발현은 컨스트럭트를 함유하는 오직 ZFP로만 형질전환된 샘플에서 검출되었지만, 대조군 컨스트럭트를 함유하는 샘플에서는 검출되지 않았다. 이 데이터는 분석이 ZFP TF 발현에 특이적이고 대조군 칼리는 XFP TF 트랜스유전자를 함유하지 않는 것을 가리킨다.
캘러스 샘플들 사이에서 발현 차이를 식별하기 위하여, β-케토아실-ACP 합성효소 II 및 튜불린 mRNA 발현의 비율을 qRT-PCR 결과에 기초하여 계산하였다. β-케토아실-ACP 합성효소 II mRNA의 가장 높은 mRNA 상향 조절은 pDAB4695 컨스트럭트로 형질전환된 카놀라 캘러스 샘플에서 관찰되었다.(표 4). 이 27% 상향 조절은 대조군 샘플의 그것 보다 통계적으로 유의하였다(p = 0.05).
다른 ZFP TF 컨스트럭트로 형질전환된 유채 캘러스 샘플에서 KASII mRNA 발현
컨스트럭트 | 분석한 칼리의 수 | KasII/튜불린 발현 평균 | KasII/튜불린 발현 표준 편차 |
4695 | 23 | 3.69 | 1.20 |
4696 | 20 | 2.81 | 0.84 |
4697 | 24 | 3.18 | 0.93 |
4698 | 24 | 3.03 | 0.68 |
대조군 | 14 | 2.90 | 1.12 |
실시예 5: 형질전환된 T0 식물 샘플의 분석
5.1 β-케토아실-ACP 합성효소 II, 튜불린, 및 ZFP TF mRNA 발현의 분석
pDAB4695 트랜스유전자 컨스트럭트를 함유하는 T0 캐놀라 식물을 6-잎 식물 단계RK지 키웠고, β-케토아실-ACP 합성효소 II 내재적 유전자, 튜불린 내재적 유전자, 및 ZFP TF 트랜스유전자의 mRNA 발현에 대하여 분석하였다. 트랜스제닉 식물을 pat 유전자 발현 카세트(AtUbi10 프로모터 v2 :: pat v3 :: Atu ORF1 3'UTR v3)를 함유하는 바이너리 컨스트럭트로 형질전환된 대조군 샘플과 비교하였다. 표준 크기 종이 펀쳐로 구멍을 뚫은 6개 잎을 각각의 식물로부터 채취하여 얼음위에 두었고 총 mRNA를 제조사의 지침서에 따라 Qiagen 96-well RNeasy RNA 추출 키트로 추출하였다(Qiagen, Carlsbad, CA). β-케토아실-ACP 합성효소 II, 튜불린, 및 ZFP TF mRNA 발현 분석을 실시예 4에서 개시한 프로토콜을 사용하여 완료하였다.
β-케토아실-ACP 합성효소 II mRNA의 발현은 독립적인 트랜스제닉 T0 식물 중 다양하였다. 3배보다 큰 mRNA 상향 소절이 분석된 16개 이벤트 중에서 관찰되었다(도 3). 모든 식물은 ZFP TF 발현에 대하여 양성이었다. 게다가, 27개 대조군 식물을 β-케토아실-ACP 합성효소 II mRNA 발현 베이스라인을 계산하기 위해 사용하였다. 베이스라인 대조군으로부터 나온 β-케토아실-ACP 합성효소 II mRNA의 평균 발현은 발현의 배수-증가를 계산하기 위하여 개별 ZFP TF 식물 이벤트로부터의 β-케토아실-ACP 합성효소 II mRNA의 발현과 비교하였다(도 3). 이들 식물은 T1 종자를 얻기 위해 성숙하도록 키웠다. 꽃이 피기 전에, 모든 식물을 식물 내의 꽃의 자가 수분을 촉진시키기 위해 셀핑 백으로 개별적으로 씌웠다. 이들 식물의 T1 종자를 온실로 그들을 옮긴지 대략 4달만에 수집하였다.
이벤트 3, 6 및 12.2(전후에서 이벤트 12에서 지칭된 것과 같이), 다른 β-케토아실-ACP 합성효소 II mRNA 발현 범위를 나타내는 것은 나아간 연구를 위해 선별하였다.
실시예 6: 형질전환된 T1 식물 샘플의 분석
6.1 T1 종자의 지방산 분석
지방산 함유량에 변경에 대한 ZFP TF의 영향을 연구하기 위하여, 단일 종자 지방산 분석을 이벤트 당 24개 각각의 T1 종자에 대하여 실시하였다(표 5). AOCS 방법 Ce2-66(97)에 근거한 지방산 메틸 에스터(FAME) 분석 방법을 사용하였으며 표 5에 모든 숫자는 카놀라 종자에 존재하는 총 지방산의 퍼센트로서 나타냈다.
FAME 분석으로 측정한 각각의 T1 종자의 지방산 프로파일
이벤트 | C16:0 | C16:1 | C18:0 | C18:1 | C18:2 | C18:3 | 총 C18 |
3 저 | 2.8 | 0.3 | 1.6 | 76.1 | 12.2 | 3.7 | 93.6 |
3 저 | 2.9 | 0.3 | 1.4 | 76.7 | 11.8 | 4.0 | 93.9 |
3 저 | 2.9 | 0.3 | 1.4 | 75.7 | 13.0 | 3.8 | 93.9 |
3 고 | 3.6 | 0.3 | 1.4 | 75.1 | 13.0 | 3.5 | 93.1 |
3 고 | 3.8 | 0.4 | 1.4 | 75.6 | 12.0 | 3.8 | 92.8 |
3 고 | 4.0 | 0.4 | 1.5 | 74.8 | 12.6 | 3.7 | 92.5 |
평균(n = 24) | 3.3 | 0.3 | 1.5 | 75.7 | 12.4 | 3.8 | 93.3 |
표준편차(n = 24) | 0.5 | 0.1 | 0.1 | 0.7 | 0.5 | 0.1 | 0.34 |
12 저 | 3.1 | 0.2 | 1.5 | 76.4 | 12.0 | 3.8 | 93.6 |
12 저 | 3.2 | 0.3 | 1.4 | 77.0 | 11.5 | 3.4 | 93.3 |
12 저 | 3.2 | 0.2 | 1.8 | 80.9 | 7.5 | 3.2 | 93.5 |
12 고 | 3.6 | 0.3 | 1.5 | 76.8 | 11.7 | 3.1 | 93.2 |
12 고 | 3.6 | 0.3 | 1.6 | 76.0 | 11.9 | 3.5 | 93.0 |
12 고 | 3.6 | 0.3 | 1.8 | 77.3 | 10.8 | 3.0 | 92.9 |
평균(n = 24) | 3.4 | 0.3 | 1.6 | 77.4 | 10.9 | 3.3 | 93.2 |
표준편차(n = 24) | 0.2 | 0.0 | 0.2 | 1.8 | 1.7 | 0.3 | 0.23 |
6 저 | 3.2 | 0.5 | 1.9 | 81.3 | 8.1 | 2.1 | 93.3 |
6 저 | 3.3 | 0.5 | 1.2 | 79.6 | 10.1 | 2.3 | 93.1 |
6 저 | 3.5 | 0.5 | 2.6 | 80.6 | 7.5 | 1.9 | 92.6 |
6 고 | 4.4 | 0.5 | 2.4 | 77.7 | 10.7 | 1.5 | 92.2 |
6 고 | 4.5 | 0.6 | 2.2 | 77.1 | 10.5 | 1.8 | 91.6 |
6 고 | 4.6 | 0.7 | 1.3 | 77.4 | 11.0 | 1.7 | 91.4 |
평균(n = 24) | 3.9 | 0.5 | 1.9 | 78.9 | 9.6 | 1.9 | 92.4 |
표준편차(n = 24) | 0.6 | 0.1 | 0.6 | 1.8 | 1.5 | 0.3 | 0.54 |
Nex710 평균(n=216) | 3.8 | 0.4 | 2.3 | 78.1 | 9.5 | 2.5 | 92.5 |
표준편차(n=216) | 0.2 | 0.0 | 0.6 | 1.8 | 1.6 | 0.7 |
샘플 준비를 위하여, 각각의 단일 종자를 하나의 1/8 강구(Small Parts, Miramar, FL)가 포함된 96-웰 추출 플레이트 상의 표지된 클러스터 튜브 내에 놓았다. 튜브를 덮고 상기 종자를 3.0분간 1300 스트로크/분으로 GenoGrinder(SPEX CertiPrep Group, Metuchen, NJ) 내 바닥에서 건조시켰다. 덮개를 제거하고 0.6 ㎖의 헵탄을 각 웰에 첨가하였다. 상기 웰을 다시 덮고 추가적인 그라인딩을 위해 2.0분간 1200 스트로크/분으로 GenoGrinder 내에 다시 놓았다. 그런 다음 상기 샘플을 제거하고 3700 rpm으로 10.0분간 6℃에서 원심분리 하였다. Beckman Coulter MC Robot를 이용하여, 상기 상층액을 유리 인서트(glass inserts)(MicroLiter, Suwanee, GA)가 있는 96 웰 플레이트에 옮겼다. 1% 메톡사이드나트륨 40 ㎕를 상기 샘플에 첨가하였다. 상기 메톡사이드나트륨은 메탄올(Fluka/Sigma Aldrich, St. Louis, MO)로 스톡 30% 용액으로부터 희석되었다. 상기 플레이트를 Teflon lined mat로 덮고 GC 분석 전에 4시간 동안 상온에서 배양되도록 하였다.
샘플을 J&W Scientific DB-23 컬럼, 15 m × 0.25 mm ID 컬럼 및 0.25 film thickness(J&W Scientific, Folsom, CA)가 장착된 Agilent 6890 GC-FID(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)에서 지방산 함유량에 대해 분석하였다. 상기 초기 오븐 온도는 200℃였고, 이러한 온도는 작동 기간 동안 유지되었다. 주입구는 분할비 1:100 및 온도 280℃로 설정되었다. 0.8 ㎖/분 헬륨의 경사진 유속은 초기 2분간 유지되었다. 그런 다음 흐름은 1.0 ㎖/분 내지 2.5 ㎖/분의 속도로 증가되었고 1.5분간 지속되었다. 검출기는 일정한 운반 가스 형성을 가지는 300℃ 및 30 ㎖/분의 컬럼 흐름, 30 ㎖/분의 연료 수소 흐름, 및 400 ㎖/분의 산화제 흐름으로 설정되었다. 2 ㎕의 주입 부피가 모든 샘플에 대해 사용되었다.
각각의 지방산 메틸 에스터 피크는 Waters Corp. Empower 소프트웨어를 사용하여 메틸 에스터 참조 표준(GLC#428, Nu-Chek-Prep, Inc., Elysian, MN)의 유지 시간과 비교함으로써 확인되었다. 각각의 퍼센트 영역은 총 통합된 크로마토그래피 피크 영역을 기초로 상기 참조 표준에서 모든 분석물에 대해 산출되었다. 헵탄 블랭크는 또한 GC 상에서 임의의 오염을 확인하기 위해 시도되었다.
세 개의 가장 낮은 C16:0 수준(아마도 ZFP TF 양성 식물임) 및 세 개의 가장 높은 C16:0 수준(아마도 ZFP TF 널 식물임)과 T1 종자의 비교는 C16:0 함유량에 변화가 상기 ZFP TF 이식유전자의 분리 때문일 수 있다는 것을 나타냈다(표 5). 총 C18(C18:0 + C18:1 + C18:2 + C18:3)에서 상응하는 변화는 또한 모든 이벤트에서 관찰되었다; 낮은 C16:0 수준을 가지는 종자는 총 C18 수준이 증가되었고, 그 반대도 또한 같았다. 이는 C18:0, C18:1, C18:2 및 C18:3 각각의 지방산 함유량에 가변성에도 불구하고 형질전환된 상기 Nex710 유전자형에서 fad2 및 fad3 돌연변이 유전자(Hu, X., et al. Theor. Appl. Genet. 2006, 113: 497-507)의 분리 때문이었다. 그러므로, 다음 단계는 유사한 유전적 배경에서 상기 지방산 프로파일에 실제 변화를 검출하기 위하여 각 이벤트의 T1 분리 개체군에 있어서 상기 ZFP TF 양성 및 널 식물 동기(sibling)를 확인하기 위해 착수되었다.
6.2 T1 식물에서 ZFP TF 존재 분석
ZFP TF 양성 및 널 식물 동기를 확인하기 위하여 모든 세 개의 트랜스제닉 이벤트 3, 6, 및 12의 100-150개의 T1 묘목을 탐색하였다(표 6). 식물들은 상기 ZFP TF 트랜스유전자의 적어도 하나의 전장 카세트의 존재에 대해 검사되었다. QIAGEN PLANT DNEASY extraction kit(Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 이러한 식물의 잎으로부터 총 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 프로토콜은 1%의 최종 농도로 Qiagen 버퍼 AP1에 PVP-40을 첨가함으로써 변형하였다. 상기 정제된 gDNA는 PICOGREENDNA Quantification protocol(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)에 의해 정량하였다. 상기 DNA 샘플을 하기 시약을 포함하는 PCR 분석에 있어서 최소, ZFP TF 트랜스유전자의 하나의 전장 카피의 존재에 대해 분석하였다: 5 ㎕ 10X EX Taq 버퍼(Takara Bio Inc., Otsu, Siga, Japan), 5 ㎕ 10% 폴리바이닐 피롤리돈-40(polyvinyl pyrrolidone-40), 10 스톡으로부터 1.0 ㎕ ubi10 정방향 프라이머(서열번호 35: 5'-GGTCAACGGATCAGGATATTCTTG-3'), 1.0 ㎕ AtuORF23 역방향 프라이머(서열번호 36: 5'-CCATGTTGGCAAAGGCAACC-3'), 10 스톡, 4 ㎕의 dNTPs(각각 2.5 mM), 0.2 ㎕ TaKaRa EX Taq™ Hot Start, 31.8 ㎕ 물 및 10 ng/㎕ 농도의 2 ㎕ DNA. PCR 사이클링 조건은 하기와 같았다: 94℃에서 2분간, 98℃에서 10초간, 60℃까지 매 사이클마다 0.5℃의 온도를 감소시키면서 65℃에서 20초로 터치다운 PCR 10 사이클에 이어서 72℃에서 3:00분간. 이어서 98℃에서 10초간, 60℃에서 20초 및 72℃에서 3:00분의 35 사이클과 72℃에서 10분간 최종 연장을 하였다. 예측되는 크기 2662 bp의 ZFP TF 밴드의 존재를 검출하기 위하여 각 반응의 5 ㎕를 1% 아가로스 겔 상에 흘렸다.
상기 pDAB4695 컨스트럭트에서 ZFP TF에 분자적으로 결합된 상기 pat 유전자에 대한 정량적 실시간 PCR 분석이 개발되었고 분자적으로 연결된 ZFP TF 카세트와 유전적 분리를 확인하기 위하여 pat 양성 및 널 식물을 식별하는데 사용되었다.
세 개의 이벤트의 T1 분리 개체군에서 ZFP TF 양성 및 널 식물 동기의 식별
이벤트 | 심은 총 T1 종자 | 식별된 T1 ZFP TF/널 식물 | T2 종자를 진출한 T1 ZFP TF/널 식물 |
3 | 150 | 115/7 | 12/7 |
6 | 100 | 66/27 | 5/5 |
12 | 150 | 126/6 | 8/6 |
pat TaqMan RT-PCR 분석을 위한 반응 혼합물은 하기로 구성되었고: 3 ㎕ Roche LIGHTCYCLERCycler 480 II Probes 2X master mix, 0.6 ㎕ 10% PVP-40, 10 스톡으로부터 0.2 ㎕의 각 pat 정방향 프라이머(서열번호 37: 5'-ACAAGAGTGGATTGATGATCTAGAGAGGT-3'), 10 스톡으로부터 0.2 ㎕ PAT 역방향 프라이머(서열번호 38: 5'-CTTTGATGCCTATGTGACACGTAAACAGT-3'), 5 스톡으로부터 0.2 ㎕ 프로브(서열번호 39: 5'-6FAM-CCAGCGTAAGCAATACCAGCCACAACACC-quencher-3'), HMG(GenBank: AF127919)의 내부 참조 표준을 위하여 하기와 같은, 시약으로 다중화 하였다: 10 스톡으로부터 0.2 ㎕의 각 HMG 정방향 프라이머(서열번호 40: 5'-CCTCTCTACCACCGTCTCACATG-3'), 10 스톡으로부터 0.2 ㎕ HMG 역방향 프라이머(서열번호 41: 5'-GATCTGGCCGGACTGTTTCA-3'), 5 스톡으로부터, 0.2 ㎕ 프로브(서열번호 42: 5'-6FAM-CGCTCCTCAGCTACCACCTCAACCA-quencher-3'), 1 ㎕ DNA 및 0.2 ㎕ 물. PCR 사이클링 조건은: 95℃에서 5분간 1 사이클, 95℃에서 10분간, 60℃에서 40초간 및 72℃에서 1초간의 40사이클이었다. 모든 샘플은 Roche LIGHTCYCLER480 PCR 기계에서 1-4 카피의 트랜스제닉 게놈 DNA 표준과 함께 384-웰 플레이트에 3개씩 증폭되었다.
각 이벤트 내에 상기 ZFP TF 양성 및 널 식물의 분리 비율에 기초하여, 이벤트 3, 6 및 12는 각각 상기 유채 게놈에서 ZFP TF 트랜스유전자의 대략 2, 1 및 2개의 삽입을 포함하였다(표 6, 컬럼 3). 이러한 데이터는 모든 세 개의 이벤트에서 pat 유전자 분리 데이터와 일치하였다.
6.3 T1 식물에서 β-케토아실-ACP 합성효소 II mRNA 상향 조절
그런 다음 표 6, 칼럼 3에 나타낸 모든 T1 ZFP TF 양성 및 널 식물 동기는 상기 내재적 β-케토아실-ACP 합성효소 II 유전자, ZFP TF 트랜스유전자, 및 내재적 튜불린 유전자에 대한 mRNA 발현 분석을 하였다. 후자는 β-케토아실-ACP 합성효소 II 및 ZFP TF 유전자 발현에 대해 표준화하기 위하여 참조 유전자로서 사용되었다. 상기 각 6-잎 식물 단계로부터 여섯 개의 잎 펀치를 얼음에 샘플링 하였고 총 RNA를 QIAGEN RNAEASYkit를 사용하여 추출하였다. cDNA 사슬 합성 및 희석은 실시예 4.1에 기술한 바와 같이 수행하였다.
상기 합성된 cDNA의 qRT-PCR 분석은 모든 세 개의 유전자에 대하여 수행하였다. 상기 β-케토아실-ACP 합성효소 II 및 튜불린 mRNA 발현 분석은 각각 실시예 4.2 및 실시예 4.3에 기술한 바와 같이 실시하였다. 상기 ZFP TF 분석은 변형되었다. 상기 PCR 반응은 하기와 같이 설정되었다: 반응 조건은 하기와 같았다: 7.5 ㎕의 2X LC480 Probes Master Buffer(Roche Diagnostic, Indianapolis, IN), 0.3 ㎕ 유전자 특이적 정방향 프라이머 #1(서열번호 43: 5 '-TCGATCTTGATATGTTGGGAGA-3')(10 스톡), 0.3 ㎕ 유전자 특이적 역방향 프라이머 #2(서열번호 44: 5'-AGGTGCAGAATCATGTGGTG-3')(10 스톡), 0.15 ㎕ UPL 프로브 #85, 1.5 ㎕의 10%(w/v) PVP-40, 및 3.9 ㎕ 물. 384-웰 마이크로 플레이트에 경계를 표시하고 상기 기술한 혼합물 13.5 ㎕를 웰 마다 첨가하였다. 밀봉 호일을 상기 플레이트에 부착하고, 상기 플레이트를 1분간 3000 rpm으로 원심분리 하였다. 필름을 제거하고 해동된 희석된 첫 번째 사슬 1.5 ㎕를 웰 마다 첨가하였다. 게다가, cDNA 표준을 분리된 대조군 웰에 첨가하였다. 상기 포일 밀봉을 상기 플레이트에 밀봉하고 상기 원심분리 단계를 반복하였다. PCR 프로그램은 하기 조건으로 진행하였다; ⅰ. 95℃에서 5분간 활성, ⅱ. 95℃에서 10초간 변성(@ 4.8℃/초), ⅲ. 60℃에서 25초간 어닐/연장(@ 2.5℃/초), ⅳ. 72℃에서 1초간 수득(@ 4.8℃/초), ⅴ. 반복 단계 ⅱ-ⅳ 39-20 회 이상, ⅵ. 38℃까지 5초간 냉각.
ZFP TF mRNA 발현은 ZFP TF 양성 샘플의 이벤트 6에서 가장 낮았고, 이벤트 3에서 가장 높았다(도 4). 상기 널 식물은 상기 ZFP TF 분석이 ZFP TF 트랜스유전자 존재에 특이적임을 보여주는 ZFP TF mRNA를 발현하지 않았다. ZFP TF에 대한 표적인, 상기 β-케토아실-ACP 합성효소 II 유전자의 mRNA 수준은, 모든 이벤트의 ZFP TF 양성 식물에서 상향-조절되었다(도 5). β-케토아실-ACP 합성효소 II mRNA 발현에서 3-4 배까지의 증가가 각 이벤트 내에서 상기 ZFP TF 양성 및 상응하는 널 식물 동기의 쌍대 비교에 의해 관찰되었다. β-케토아실-ACP 합성효소 II mRNA 수준의 상향 조절은 각 이벤트 내에서, 즉 이벤트 6에서 가장 낮고 이벤트 3에서 가장 높은, ZFP TF mRNA 발현 수준에 증가에 비례하였다(도 4).
6.4 T1 식물 잎의 지방산 분석
T1 잎 샘플의 두 번째 세트는 실시예 6.3에 기술한 mRNA 분석 샘플의 수집과 동시에 지방산 분석을 위해 수집되었다. 그러나, 상기 샘플의 오직 일부분이 표 6, 컬럼 4에 나타난 오직 성숙도가 진행되는 식물에 대해 지방산이 분석되었다. 잎 재료의 지방산 메틸 에스터(FAME) 분석은 하기와 같이 수행되었다. 10-100 mg의 잎 재료를 얼음에 수집한 다음 동결건조하고 40℃에서 20분간 무수 메탄올에서 0.25 M 메톡사이드나트륨으로 메틸기전이반응을 하였다. 상기 메틸기전이반응 후에 상기 지방산을 대리 표준으로서 헵타데카노인(heptadecanoin)을 포함하는 헵탄 용액으로 3회 추출하였다. 상기 분리된 헵탄 분획물을 말리고 공지된 부피의 헵탄에 재현탁하였다. 상기 결과로 얻어진 지방산 메틸 에스터(FAME)를 SGE 유래 BPX 70 capillary 컬럼(15m × 0.25mm × 0.25μm)을 사용하여 GC-FID를 통해 분석하였다. 각 FAME를 그들의 보유 시간에 의해 식별하였고 보정 표준으로서 Matreya LLC 유래 랩시드 오일 참조 혼합물의 주입에 의해 정량하였다. 상기 반응의 완성도는 네 번째 추출/유도에서 내재적 FAMES의 존재를 점검함으로써 증명하였다.
모든 세 개의 이벤트는 각 이벤트 내에서 ZFP TF 양성 및 상응하는 널 식물 동기의 쌍대 비교에 있어서 총 C16:0 함유량에 감소, 및 총 C18 함유량에 수반되는 증가를 나타냈다(표 7). 예를 들면, 이벤트 12 ZFP TF 양성 식물은 그것 자신의 널 식물 동기와 비교하여 C16:0 함유량에 6.3%의 감소 및 총 C18 함유량에 1.44% 증가를 나타냈다.
T1 잎 지방산 프로파일
샘플 이름 | 분석된 식물 | C16:0 | 총 C18 | ||
평균 | 표준편차 | 평균 | 표준편차 | ||
12null | 6 | 10.98 | 0.31 | 69.93 | 0.91 |
12ZFP | 8 | 10.29 | 0.39 | 70.94 | 1.02 |
3null | 7 | 10.79 | 0.56 | 69.84 | 1.18 |
3ZFP | 12 | 10.34 | 0.29 | 71.25 | 0.74 |
6null | 5 | 11.94 | 0.47 | 70.36 | 1.91 |
6ZFP | 5 | 10.44 | 0.62 | 72.16 | 2.88 |
실시예 7: ZFP TF 트랜스제닉 T2 종자의 분석
각 이벤트 내에서 가장 높은 β-케토아실-ACP 합성효소 II mRNA 발현을 나타내는 ZFP TF 양성 식물의 서브셋 및 널 식물 동기를 성숙시켜 T2 종자를 수득하였다(표 6, 컬럼 4). 더 낮은 발현 범위를 가지는 ZFP TF 양성 식물이 거의 성숙되지 않은 이벤트 3은 예외였다. 이들은 상기 pDAB4695 이식유전자의 다른 분리된 삽입을 나타낼지도 모른다. 각 T1 식물을 꼭 맞물리는 백으로 덮어 주어진 식물 내에서 자가수분을 촉진시켰다. 종자는 수확되었고, 지방산 수준들은 분석되었다.
T2 지방산 분석은 실시예 6.1에서 T1 종자 분석에 대한 설명에서 기술한 바와 같이, 식물 당 24개 종자의 풀 상에서 수행되었다. 상응하는 널 식물 동기와의 쌍대 비교된 세 이벤트 모두의 ZFP TF 양성 식물 내에서 상기 결과들은 C16:0 함유량의 감소를 나타냈다(표 8 및 9). 상기 C16:0 함유량의 감소는 이벤트 12, 3 및 6에 대하여 각각 12.6%, 11.2% 및 22.3%였다. 또한, C16:0 함유량에서 일정한 감소도 관찰되었다. 상기 C16:0 및 C16:1 함유량의 감소에 상응하여, 상기 상응하는 널 식물 동기와의 쌍대 비교에서 ZFP TF 양성 식물 내 총 C18(C18:0 + C18:1 + C18:2 + C18:3) 함유량의 수반되는 증가가 관찰되었다. JMP 통계 소프트웨어를 이용한 분석 결과(도 6, 및 B), ZFP TF 양성 및 상응하는 널 식물 동기와의 세 쌍대 비교 모두 총C16(C16:0 + C16:1) 함유량 및 총 C16/총 C18 함유량의 증가에 대하여 통계적으로 유의하였다(p = <0.001). 상기 세 이벤트들이 널 식물 동기 관찰에 근거한 그들의 C16:0 함유량에서 가변적임에도 불구하고(Tables 8A 및 8B), ZFP TF는 상기 대략 비슷한 수준; ~2.93 내지 3.05 사이까지 감소하는 C16:0 함유량에서 효과적이었다. 이벤트 3 및 12 세트 종자의 모든 ZFP TF 양성 식물이 종자를 만드는 동안, 이벤트 6의 식물을 포함하는 단 하나의 ZFP TF만이 종자를 만들었다. 이벤트 6의 상기 특정 식물은 T1 잎 지방산 데이터에 근거한 상기 C16:0 함유량이 가장 높았다. 표 8 및 9는 pDAB4695 ZFP TF 양성 및 상응하는 널 식물 동기의 세 유채 트랜스제닉 이벤트들의 T2 지방산 프로파일의 비교를 나타낸다. 상기 데이터는 FAME 분석에 의하여 얻어졌고, 항목 6.1에 기재된다. C12:0 내지 C24:1 지방산은 분석되었고, 주요한 것들은 상기 표들에 나타내었다. 모든 숫자들은 유채 종자에 존재하는 총 지방산의 퍼센트로서 나타냈다.
C16:0, C16:1, C18:0, C:18:1, C:18:2 및 C:18:3 지방산 분석
샘플 | C16:0 | C16:1 | C18:0 | C18:1 | C18:2 | C18:3 |
12Null 평균 | 3.49 | 0.26 | 1.29 | 76.59 | 11.45 | 3.73 |
Std. Dev.(n=6) | 0.06 | 0.01 | 0.05 | 0.25 | 0.21 | 0.04 |
12ZFP 평균 | 3.05 | 0.20 | 1.33 | 76.53 | 11.63 | 3.87 |
표준편차(n=8) | 0.11 | 0.02 | 0.04 | 0.39 | 0.33 | 0.06 |
3Null 평균 | 3.30 | 0.25 | 1.31 | 74.34 | 13.18 | 3.94 |
Std. Dev.(n=7) | 0.17 | 0.02 | 0.10 | 1.04 | 0.86 | 0.25 |
3ZFP 평균 | 2.93 | 0.18 | 1.30 | 74.10 | 13.62 | 4.14 |
표준편차(n=12) | 0.12 | 0.01 | 0.08 | 1.80 | 1.45 | 0.25 |
6Null 평균 | 3.77 | 0.38 | 2.02 | 73.46 | 12.42 | 3.66 |
Std. Dev.(n=4) | 0.15 | 0.08 | 0.14 | 2.80 | 2.44 | 0.66 |
6ZFP(n=1) | 2.93 | 0.17 | 1.07 | 77.89 | 10.65 | 3.24 |
C20:0, C20:1, C20:2, C22:0, C22:1, C24:0 및 C24:1 지방산 분석
샘플 | C20:0 | C20:1 | C20:2 | C22:0 | C22:1 | C24:0 | C24:1 |
12Null 평균 | 0.53 | 1.26 | 0.05 | 0.33 | 0.02 | 0.14 | 0.14 |
Std. Dev.(n=6) | 0.03 | 0.07 | 0.01 | 0.04 | 0.01 | 0.02 | 0.02 |
12ZFP 평균 | 0.55 | 1.37 | 0.06 | 0.36 | 0.02 | 0.15 | 0.16 |
표준편차(n=8) | 0.02 | 0.05 | 0.01 | 0.02 | 0.01 | 0.01 | 0.02 |
3Null 평균 | 0.59 | 1.49 | 0.06 | 0.43 | 0.02 | 0.15 | 0.21 |
Std. Dev.(n=7) | 0.07 | 0.11 | 0.01 | 0.07 | 0.01 | 0.03 | 0.04 |
3ZFP 평균 | 0.57 | 1.57 | 0.07 | 0.42 | 0.03 | 0.15 | 0.19 |
표준편차(n=12) | 0.04 | 0.21 | 0.02 | 0.07 | 0.01 | 0.04 | 0.04 |
6Null 평균 | 0.80 | 1.49 | 0.07 | 0.54 | 0.03 | 0.30 | 0.24 |
Std. Dev.(n=4) | 0.08 | 0.13 | 0.01 | 0.08 | 0.01 | 0.07 | 0.02 |
6ZFP(n=1) | 0.52 | 1.86 | 0.07 | 0.42 | 0.04 | 0.20 | 0.22 |
표 10는 표 8 및 9에 나타낸 상기 개별 지방산에 근거한 총 지방산 프로파일을 나타낸다.
샘플 | 총 C18 * | 총 LC ** | 총 Sats *** |
12Null 평균 | 93.06 | 95.52 | 5.83 |
표준편차(n=6) | 0.13 | 0.05 | 0.09 |
12ZFP 평균 | 93.36 | 96.01 | 5.48 |
표준편차(n=8) | 0.11 | 0.13 | 0.09 |
3Null 평균 | 92.78 | 95.74 | 5.82 |
표준편차(n=7) | 0.39 | 0.17 | 0.32 |
3ZFP 평균 | 93.16 | 96.14 | 5.41 |
표준편차(n=12) | 0.41 | 0.13 | 0.19 |
6Null 평균 | 91.55 | 95.01 | 7.47 |
표준편차(n=4) | 0.36 | 0.29 | 0.40 |
6ZFP( n=1) | 92.85 | 96.18 | 5.17 |
* 총 C18은 하기 탄소: C18:0, C18:1, C18:2 및 C18:3의 합을 나타낸다.
** 총 LC 또는 장쇄는 하기 탄소: 총 C18 + 총 C20(C20:0 + C20:1 + C20:2) + 총 C22(C22:0 + C22:1) + 총 C24(C24:0 + C24:1)의 합을 나타낸다.
*** 총 Sats는 표 8 및 9에 나타낸 모든 포화 지방산을 나타낸다.
모든 장쇄 지방산(총 C18, 총 C20, 총 C22 및 총 C24)을 조합하면, 널 동기들과 비교된 다른 이벤트들의 ZFP TF 양성 식물에서 0.4% 내지 1.2%의 증가가 관찰되었다. 상기 장쇄 지방산 중, 이벤트 6에 대한 ZFP TF 양성 식물에서 25% 만큼의 C20:1 증가는 주목할 만하다. 또한, 모든 이벤트들에서 ZFP TF 함유 식물에서도 총 포화 지방산 함유량의 감소가 관찰되었다. 그것은 이벤트 12 내 6% 감소에서부터 이벤트 6 내 31% 감소에까지 이르렀다.
결론적으로, T0 및 T1 식물에서 상기 β-케토아실-ACP 합성효소 II 유전자의 ZFP TF-매개 전사적 상향 조절 및 수반되는 총 C16의 감소 및 총 C18 지방산 함유량의 증가가 예로 들어졌다. 상기 데이터는 씨드 오일 프로파일 내에서 예상된 변화들을 야기하는 상기 지방산 생합성 경로 내 자손의 세대를 거쳐 유전되는 특정 유전자를 표적화 및 변형하는 신규한 ZFP TF 기술의 성공적인 적용을 나타낸다.
실시예 8-15: FatB 상향 조절/하향 조절
색소체는 고등 식물에서 지방산 신생합성을 위한 주요한 부위이다(Ohlrogge et al., 1979, Proc Natl Acad Sci USA 76:1194-8; Thelen and Ohlrogge, 2002, Metabolic Engineering 4:12-21). 상기 색소체에서 활용되지 않는 지방산은 아실-아실 운반 단백질(아실-ACP)을 가수분해하여 자유 지방산을 방출시킴으로써 아실-ACP 티오에스테라아제(FATs)의 특이적 활성을 통해 세포질로 반출된다. 식물에는 두 클래스의 FAT 효소, FATA 및 FATB가 존재한다. 상기 FATA 클래스는 인 비트로에서 18:1-ACP를 선호하는 반면, 상기 FATB 클래스는 16:0-ACP 및 18:0-ACP와 같은 포화 아실-ACP 기질을 선호할 뿐만 아니라, 서로 다른 이종적인 기질 특이성을 나타낸다(Doermann et al, 1995, Arch. Biochem. Biophys. 316:612-618; Voelker et al., 1997, Plant Physiology 114: 669-677; Salas and Ohlrogge, 2002, Archives of Biochemistry and Biophysics, 403:25-34). FATA와 유사하게, FATB도 모든 식물 조직에 존재하는 것으로 여겨지나, 발생 중인 종자에서 우세하게 발현된다(Jha et al., 2006, Plant Physiology and Biochemistry 44:645-655).
애기장대 핵 게놈은 두 FatA 유전자 및 단일의 FatB 유전자를 암호화한다. 상기 FatB 활성의 비활성화는 글리세로지질 내의 포화 지방산 함유량을 급격히 감소시킬 수 있다. 예를 들면, T-DNA의 삽입에 의하여 생성되는 FatB 돌연변이에서, 팔미테이트(palmitate)(16:0) 및 스테아레이트(stearate)(18:0) 함유량은 조직에 따라 각각 42-56% 및 30-50% 만큼 감소된다(Bonaventure et al., The Plant Cell , 2003 15:1020-1033). 야생형에 비하여 4주째에 50% 보다 낮은 생중량을 야기하는 상기 돌연변이에서 식물 성장 속도는 크게 영항을 받는다. 상기 발견은 FatB 가 식물에서 상기 포화 지방산의 운명을 지배하는 주요 인자로서 작용한다는 관점을 지지한다.
상기 주요 오일씨드 작물인 유채는 모델 종인 애기장대와 가까이 연관된 복이배체 종이나, 애기장대에 비하여 약 8 배 큰 게놈 크기를 갖는다. 따라서, FatB 유전자가 1개인 애기장대에 비하여, 상기 종들에서는 6개의 FatB 유전자가 보고되었다(WO 2009/007091). 이러한 복잡성은 그들의 조작에 있어서 개별적인 FatB 유전자의 기능을 이해하기 어렵게 한다. 반대로, 많은 수의 유전자의 존재는 지방산을 완전히 제거하는 대신 원하는 지방산 목표를 향한 다중 유전자의 발현을 조절하는 것을 쉽게 한다. 징크 핑거 전사 인자는 필수적으로 특정 DNA 서열에 결합하고, 상기 표적 유전자의 유전자 기증을 조절하는 것으로 알려져 왔다(Van Eenennaam et al., Metab. Eng. 2004 6:101-108; Sanchez et al., 2006, Plant Biotechnology Journal 4:103-114). 따라서, 이러한 수단은 유채에서 FatB 유전자의 기능을 이해하기 위한 FatB 유전자에 적용될 수 있다. 이러한 지식들은 포화 지방산이 낮은 더 "건강한" 카놀라 씨드 오일을 향한 하나 내지 다중 FatB 유전자의 발현을 조절하는 것을 도울 수 있다.
하기 실시예 8-15는 종자에서 지방산 프로파일 변화를 야기하는 유채 내 FatB 유전자의 전사적 상향 조절을 입증한다.
실시예 8: 유채 L.에서 FatB 유전자에 대한 표적 서열 식별
8.1 표적 서열 식별
변형된 게놈 워킹 프로토콜을 유채 다양성 Nex710의 FatB 유전자에 대한 프로모터 서열을 발견하고 특성화하기 위해 사용하였다. ZFP TF의 설계 및 생산을 위해 이러한 뉴클레오티드 서열을 분리하여 식별하였고, 이는 상기 FatB 유전자의 유전자 발현을 변형하기 위해 사용될 수 있다. Clontech genome Walking Kit(Palo Alto, CA)를 이용하여 9개의 게놈 워킹 라이브러리를 구조화하였다. 이러한 라이브러리는 상기 FatB 유전자에 대한 전사 개시 부위의 상류 ~1kb의 서열을 획득하는데 사용하였다. 네스티드 FatB 유전자-특이적 프라이머의 정방향 쌍을 공용 데이터베이스로부터 이용가능한 FatB EST 서열에 기초하여 설계 및 합성하였다. 네스티트 프라이머의 역방향 쌍은 어댑터 서열에 혼성화할 수 있도록 설계 및 합성하였다. 다중 PCR 단편을 상기 9개의 라이브러리로부터 증폭하였다. 상기 결과로 얻어진 PCR 단편은 TOPO 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 클로닝하여 FatB 프로모터 서열을 식별하기 위해 서열을 분석하였다. 두 개의 다른 FatB 유전자, FatB4 및 FatB5 를, 이러한 접근법에 기초하여 식별하였다. 이러한 FatB 유전자의 암호화 서열은 매우 보존되어 있음에도 불구하고, 상기 서열은 5' UTR 및 프로모터 영역에서는 갈리는 것으로 나타났다.
발생하는 유채 종자에 있어서 FatB 발현 및 정량적 RT-PCR 분석을 통한 상기 FatB4 및 FatB5 유전자의 정량화는 유전자가 유채 종자에서 높게 발현된다는 것을 제시하였다. 상기 실시예 1에서 기술한 바와 같이 총 RNA를 분리하여, 정량하였고, 상기 전사 개시 부위를 맵핑하였다. 이러한 두 개 유전자의 프로모터 서열은 전사적 발현 변형을 위하여 ZFP TF를 설계하는데 이용되었다.
실시예 9: FatB 유전자에 특이적인 ZFP DNA 결합 도메인의 설계
징크 핑거 단백질은 상기 FatB 유전자 내 다양한 표적 부위들에 대하여 설계되었다. 대표적인 ZFP 디자인을 위한 상기 표적 부위들 및 인식 헬릭스를 하기 표 11 및 12에 나타낸다.
FatB ZFP TF
에 대한 표적 결합 부위
ZFP | FatB4 표적 부위(5' to 3') | FatB 5 표적 부위(5' to 3') | FatB 특이성 |
13685 * | aaCGAAAGgAGATCGAGAGAGgagagag (서열번호 47) | 결합 부위 없음 | FatB4 |
13714 | 결합 부위 없음 | cgAAAGGGAGATCGAGAGAGgcaccgca (서열번호 48) | FatB5 |
13722 | aaGGAGAA c TTTAGGGTTTGGggagact (서열번호 49) | aaGGAGAA t TTTAGGGTTTGGggagact (서열번호 50) | FatB4 및 FatB5 |
13743 ** | ctCCGAAGAGATTGGCGTAAcacttcgt (서열번호 51) | ctCCGAAGAGATTGGCGTAAccttcatt (서열번호 52) | FatB4 및 FatB5 |
ZFP 인식 헬릭스 영역
ZFP | 1 *** | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
13685 | RSDNLSA (서열번호 75) | QSAHRKT (서열번호 76) | RSDDLSK (서열번호 21) | QSSHRKT (서열번호 77) | RSDHLSV (서열번호 78) | QNAHRIE (서열번호 79) |
13714 | RSDNLSA (서열번호 75) | QSAHRKT (서열번호 76) | RSDDLSK (서열번호 21) | QSSHRKT (서열번호 77) | RSDHLSK (서열번호 80) | QNANRIT (서열번호 81) |
13722 | RSDHLST (서열번호 82) | HSNTRKN (서열번호 83) | RSDHLSQ (서열번호 84) | NSASRKN (서열번호 85) | QSGNLAR (서열번호 16) | QSGHLSR (서열번호 86) |
13743 | NSDSLTE (서열번호 87) | RRADLSR (서열번호 88) | RSDSLSA (서열번호 89) | QNAHRKT (서열번호 90) | RSDHLSQ (서열번호 84) | RNADRIT (서열번호 91) |
* 대문자는 상기 ZFP 결합 서열을 나타내는 반면, 옆의 소문자는 ZFP TF 결합 부위에 대한 상기 옆 서열 맥락을 나타낸다. 상기 대문자들 사이의 상기 이탤릭체의 소문자는 상기 ZFP 설계에서 생략된 염기들을 나타낸다.
** ZFP 결합 서열은 FatB4 및 FatB5 사이에서 동일하나, 상기 3' 측 서열은 상기 두 유전자들 사이에서 다르다.
*** 숫자들은 징크 핑거를 나타낸다(1은 핑거 1, 2는 핑거 2, 등).
실시예 10: 유채에서 네이티브 FatB 유전자의 ZFP TF-매개 상향 조절
유채 세포 내에서 FatB 의 ZFP TF-매개 상향 조절을 예시하기 위하여, ZFP TF 유전자의 4가지의 설계를 포함하는 컨스트럭트를 만들었고(표 11 내지 13), 이러한 유전자를 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 유채 세포내로 안정적으로 운반하였다.
10.1 컨스트럭트 설계
설계되고 구조화된 ZFP TF 바이너리 플라스미드가 하기 표 13에 기재된다. 상기 ZFP TF 유전자의 발현은 카사바 베인 모자익 바이러스(Cassava Vein Mosaic Virus, CsVMV) 프로모터로부터 유래된 프로모터와 같은, 비교적 강력한 항시발현(constitutive) 프로모터에 의해 유래되었다. 상기 유채 게놈 내로 ZFP TF를 안정적으로 삽입하기 위하여 아그로박테리움-매개 식물 형질전환을 실시예 3.2에서 기술한 바와 같이 수행하였다.
유채
FatB
유전자를 표적하는 ZFP TF의 컨스트럭트 설명
SN | ZFP | 컨스트럭트 번호 | 유전자 카세트 |
1 | 13685 | pDAB4689 | RB7 MAR/CsVMV/Op-2 NLS-ZFP 13685 VP16/AtuORF23 3' UTR/AtUbi10/Pat/AtuORF1 3' UTR |
2 | 13714 | pDAB4690 | RB7 MAR/CsVMV/Op-2 NLS-ZFP 13714-VP16/AtuORF23 3' UTR/AtUbi10/Pat/AtuORF1 3' UTR |
3 | 13722 | pDAB4691 | RB7 MAR/CsVMV/Op-2 NLS-ZFP 13722-VP16/AtuORF23 3' UTR/AtUbi10/Pat/AtuORF1 3' UTR |
4 | 13743 | pDAB4692 | RB7 MAR/CsVMV/Op-2 NLS-ZFP 13743-VP16/AtuORF23 3' UTR/AtUbi10/Pat/AtuORF1 3' UTR |
pDAB4689는 opaque-2 (Op-2) 핵 위치 서열 또는 NLS /13685/ VP 16 및 pat 유전자 발현 카세트를 포함하는 바이너리 플라스미드이다. 이 컨스트럭트는 하기 유전자 요소를 포함한다; RB7 MAR v3(매트릭스 부착 영역(Thompson et al., 1997, WO9727207)) :: CsVMV 프로모터 v2(카사바 베인 모자익 바이러스 프로모터(Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31: 1129-1139)) :: opaque-2 NLS(Van Eenennaam et al., 2004, Metabolic Engineering 6:101-108; Holmes-Davis et al., 2005, Plant Molecular Biology 57:411-423)/13685 징크 핑거/VP16(Jamieson et al., Biochem. Biophy. Res. Commun. 2006, 348:873-879) 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1(아그로박테리움 투메파시언스(Agrobacterium tumefaciens) 오픈 리딩 프레임 23, 3'비번역 영역(Gelvin et al., 1987, EP222493)) :: AtUbi10 프로모터 v2(애기장대 유비퀴틴-10 프로모터(Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493)) :: pat v5(포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라아제(Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37)) :: AtuORF 1 3'UTR v4(아그로박테리움 투메파시언스 오픈 리딩 프레임 1, 3'비번역 영역(Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822)). 상기 바이너리는 NcoI-SacI 제한부위를 통해 pDAB3912 내에 상기 opaque-2 NLS/13685 징크 핑거/VP16 융합을 포함하는 DNA 단편을 클로닝함으로써 구조화하였다. 상기 결과로 얻어진 pDAB8215로서 표지된 컨스트럭트는 CsVMV 프로모터 v2 :: opaque-2 NLS/13685 징크 핑거/VP16 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 유전자 발현 카세트를 포함하였다. LR Gateway Reaction(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 통해 pDAB8215를 상기 pDAB4668 바이너리 내로 클로닝하였다. 이러한 반응은 pDAB4689를 생산하였고 제한효소 분해 및 시퀀싱 반응을 통해 확인하였다.
pDAB4690은 opaque-2 NLS/13714/VP 16 및 pat 유전자 발현 카세트를 포함하는 바이너리 플라스미드이다. 이러한 컨스트럭트는 하기 유전자 요소를 포함한다; RB7 MAR v3 :: CsVMV 프로모터 v2 :: opaque-2 NLS/13714 징크 핑거/VP16 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 :: AtUbi10 프로모터 v2 :: pat v5 :: AtuORF 1 3'UTR v4. 상긱 바이너리는 NcoI-SacI 제한부위를 통해 pDAB3912 내에 상기 opaque-2 NLS/13714 징크 핑거/VP16 융합을 포함하는 DNA 단편을 클로닝함으로써 구조화하였다. 상기 결과로 얻어진 pDAB8216로 표지된 컨스트럭트는 CsVMV 프로모터 v2 :: opaque-2 NLS/13714 징크 핑거/VP16 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 유전자 발현 카세트를 포함한다. LR Gateway Reaction(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 통해 pDAB8216을 상기 pDAB4668 바이너리 내로 클로닝하였다. 이러한 반응은 pDAB4690을 생산하였고 제한효소 분해 및 시퀀싱 반응을 통해 확인하였다.
pDAB4691은 상기 opaque-2 NLS/13722/VP 16 및 pat 유전자 발현 카세트를 포함하는 바이너리 플라스미드이다. 이러한 컨스트럭트는 하기 유전자 요소를 포함한다; RB7 MAR v3 :: CsVMV 프로모터 v2 :: opaque-2 NLS/13722 징크 핑거/VP16 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 :: AtUbi10 프로모터 v2 :: pat v5(포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라아제 :: AtuORF 1 3'UTR v4. 상기 바이너리는 NcoI-SacI 제한부위를 통해 pDAB3912 내에 상기 opaque-2 NLS/13722 징크 핑거/VP16 융합을 포함하는 DNA 단편을 클로닝함으로써 구조화하였다. 상기 결과로 얻어진 pDAB8217로 표지된 컨스트럭트는 CsVMV 프로모터 v2 :: opaque-2 NLS/13722 징크 핑거/VP16 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 유전자 발현 카세트를 포함한다. LR Gateway Reaction(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 통해 pDAB8217을 상기 pDAB4668 바이너리 내로 클로닝하였다. 이러한 반응은 pDAB4691을 생산하였고 제한효소 분해 및 시퀀싱 반응을 통해 확인하였다.
pDAB4692는 상기 opaque-2 NLS/13743/VP 16 및 pat 유전자 발현 카세트를 포함하는 바이너리 플라스미드이다. 이러한 컨스트럭트는 하기 유전자 요소를 포함한다; RB7 MAR v3(매트릭스 부착 영역 :: CsVMV 프로모터 v2 :: opaque-2 NLS/13743 징크 핑거/VP16 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 :: AtUbi10 프로모터 v2(애기장대 유비퀴틴-10 프로모터 :: pat v5 :: AtuORF 1 3'UTR v4. 상기 바이너리는 NcoI-SacI 제한부위를 통해 pDAB3912 내에 상기 opaque-2 NLS/13743 징크 핑거/VP16 융합을 포함하는 DNA 단편을 클로닝함으로써 구조화하였다. 상기 결과로 얻어진 pDAB8218로 표지된 컨스트럭트는 CsVMV 프로모터 v2 :: opaque-2 NLS/13743 징크 핑거/VP16 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 유전자 발현 카세트를 포함한다. LR Gateway Reaction(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 통해 pDAB8218을 상기 pDAB4668 바이너리 내로 클로닝하였다. 이러한 반응은 pDAB4692를 생산하였고 제한효소 분해 및 시퀀싱 반응을 통해 확인하였다.
실시예 11: 형질전환된 캘러스 샘플의 분석
실시예 3.2에서 기술한 바와 같이 아그로박테리움-매개 식물 형질전환을 통해, 트랜스제닉 유채 캘러스 라인을 4개의 ZFP TF 컨스트럭트, pDAB4689-pDAB4692, 및 대조군 컨스트럭트, pDAB8210의 형질전환에 의해 제조하였다. 상기 대조군 컨스트럭트, pDAB8210은 pat 유전자 발현 카세트(AtUbi10 프로모터 / pat / AtuORF1 3' UTR) 및 비-표적 ZFN 카세트(CsVMV 프로모터 / ZFN / AtuORF23 3' UTR)를 포함하였다. 실시예 4.1에서 기술한 바와 같이 모든 라인으로부터 총 RNA를 추출하였고, cDNA를 합성하였다. 상기 기재된 프로토콜에 대한 변형은 오직 랜덤 헥사머 대신에 상기 cDNA를 프라이밍하기 위한 올리고 dT 프라이머 및 제조사의 설명서에 따라, 상기 cDNA 반응의 상응하는 변형의 사용이었다.
11.1 FatB4 및 FatB5 mRNA 발현 분석
11.1.1 유채에 대한 FatB4 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR) 분석
PCR 혼합물은 FatB4 의 cDNA 증폭을 위하여 하기와 같이 설정하였다: 1.5 ㎕ 10X Hot Start PCR 버퍼(Qiagen, Valencia, USA), 1.2 ㎕의 10 mM dNTPs, 1 ㎕의 25 mM MgCl 2 , 0.15 ㎕ Qiagen Hot Start Taq(5U/㎕), 10 μM 스톡의 0.5 ㎕ zz143 FW 프라이머(서열번호 53: CTTTGAACGCTTATCTTCCTC)(10 μM 스톡), 10 μM 스톡의 0.5 ㎕ FATB5_R4 REV 프라이머(서열번호 54: TTCCACAACATCTCCCCAAG), 5 μM 스톡의 0.25 ㎕ TaqMan MGB 프로브(Life Technologies, Carlsbad, California) FatB4_MGB_프로브_4( 서열번호 55: FAM-CTCAGGCTCCACCC), 1.5 ㎕의 10%(w/v) PVP-40), 및 반응 당 13.5 ㎕의 H 2 O. 384-웰 마이크로 플레이트의 적절한 사분면에 경계를 표시하였고, 웰 당 13.5 ㎕의 마스터 믹스를 채웠다. 그런 다음 밀봉 호일을 상기 플레이트에 조심스럽게 부착하였다. 상기 플레이트를 Qiagen 마이크로 플레이트 원심분리기에서 1분간 3,000 rpm으로 원심분리 하였다. 그런 다음, 해동되고, 희석된 최초 사슬 cDNA 1.5 ㎕를 적절한 웰에 첨가하였고, 그리고 나서 가장 낮은 농도에서부터 높은 온도까지 1.5 ㎕ 플라스미드 cDNA 표준을 대조군 웰 내에 첨가하였다. 마지막으로, 밀봉 호일을 상기 플레이트에 단단히 부착하고 원심분리하였다. 상기 PCR 프로그램은 LIGHTCYCLER480 Real-Time PCR System(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)에서 하기 프로그램을 사용하여 수행하였다: 1) 95℃에서 15분간 활성; 2) 95℃에서 20-30초간 변성(@ 4.8℃/초); 3) 60℃에서 20-30초간 어닐(@ 2.5℃/초); 4) 72℃에서 45-60초간 수득(@ 4.8℃/초); 2)-4) 단계 반복, 39-49 회 이상; 5) 상기 반응을 멈추기 위하여 38℃에서 5초간 냉각.
상기 FatB4 증폭산물은 678 bp 크기였다. 이러한 서열은 게놈 서열을 기초로 79 bp 인트론을 포괄한다. 게다가, 상기 역방향 프라이머는 인트론을 포괄하도록 설계되었고 따라서 오직 FatB4 cDNA의 특이적 증폭에 유리하며, 이에 따라 상기 게놈 DNA의 증폭을 제거한다.
11.1.2 유채에 대한 FatB5 qRT-PCR 분석
FatB5 의 cDNA 증폭을 위해 하기와 같이 PCR 혼합물을 설정하였다: 1.5 ㎕ 10X Hot Start PCR 버퍼(Qiagen, Valencia, USA), 1.2 ㎕ of 10 mM dNTPs, 1 ㎕ 25 mM MgCl 2 , 0.15 ㎕ Qiagen Hot Start Taq(5 U/㎕), 10 μM 스톡의 0.5 ㎕ zz145 FW 프라이머(서열번호 56: CTTTGAAAGCTCATCTTCCTC), 10 μM 스톡의 0.5 ㎕ FATB5_R4 REV 프라이머(서열번호 57: TTCCACAACATCTCCCCAAG), 5 μM 스톡의 0.25 ㎕ TaqMan MGB 브로브(Life technologies, Carlsbad, California) FatB5_MGB_프로브_1(서열번호 58: FAM-AACCTTCATCCTCCCA), 1.5 ㎕의 10%(w/v) PVP-40), 반응 당 13.5 ㎕ 까지 H 2 O. 남아있는 분석 및 상기 PCR 사이클의 자세한 사항은 실시예 11.1.1에서 FatB4 qRT-PCR 분석에 대해 기술한 바와 같다.
상기 제조된 증폭산물은 678 bp 크기였다. 이러한 서열은 게놈 서열을 기초로 79 bp 인트론을 포괄한다. 게다가, 상기 역방향 프라이머는 인트론을 포괄하도록 설계되었고 따라서 FatB5 의 cDNA 증폭에 유리하며, 이에 따라 상기 게놈 DNA의 증폭을 제거한다.
11.2 튜불린 mRNA 발현 분석
이 분석은 실시예 4.3에서 기술한 바와 같이 수행하였다.
11.3 ZFP TF mRNA 발현 분석
T 0 캘러스 ZFP TF mRNA 분석은 실시예 4.4에 따라 수행하였다. 이 분석에서 증폭산물 크기는 상기 각 설계에 있어서 상기 ZFP 사이즈에 따라 1 kb 이하였다. T 0 식물 ZFP TF 발현 정량화는 하기와 같이 VP16 활성화 도메인 기반 분석으로 실시하였다. V16 qRT-PCR 혼합물은 ZFP TF의 cDNA 증폭을 위해 하기와 같이 설정되었다: 7.5 ㎕ LIGHTCYCLER480 Probes Master 2X Buffer(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA), 10 μM 스톡의 0.3 ㎕ VP16_UPL_F1 프라이머(서열번호 59: TCGATCTTGATATGTTGGGAGA), 10 μM 스톡의 0.3 ㎕ VP16_UPL_R1(서열번호 60: AGGTGCAGAATCATGTGGTG), 0.15 ㎕ UPL 프로브#85(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA), 1.5 ㎕의 10%(w/v) PVP-40), 및 13.65 ㎕ 까지 H 2 O. 384-웰 마이크로 플레이트의 적절한 사분면에 경계를 표시하였고, 웰 당 13.5 ㎕의 마스터 믹스를 채웠다. 그런 다음 밀봉 호일을 상기 플레이트에 조심스럽게 부착하였다. 상기 플레이트를 Qiagen 마이크로 플레이트 원심분리기에서 1분간 3000 rpm으로 원심분리하였다. 해동되고, 희석된 최초 사슬 cDNA 1.5 ㎕를 첨가하였고, 그리고 나서 낮은 농도에서부터 높은 온도까지 1.5 ㎕ 플라스미드 cDNA 표준을 대조군 웰 내에 첨가하였다. 밀봉 호일을 상기 플레이트에 단단히 부착하고 원심분리하였다. 상기 PCR 프로그램은 LIGHTCYCLER480 Real-Time PCR System(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)에서 하기 프로그램을 사용하여 수행하였다: 1) 95℃에서 5분간 활성; 2) 95℃에서 10초간 변성(@ 4.8℃/초); 3) 60℃에서 25초간 어닐/연장(@ 2.5℃/초); 4) 72℃에서 1초간 수득(@ 4.8℃/초); 2)-4) 단계 반복, 39-49 회 이상. 마지막으로, 상기 반응을 멈추기 위하여 38℃에서 5초간 상기 반응을 냉각하였다.
상기 VP16 증폭산물은 68 bp 크기였다. 이러한 단편 크기는 상기 PCR 증폭에 의해 제조될 것으로 예측되는 상기 VP16 단편에 상응한다.
11.4 캘러스 샘플의 발현 분석
HERBIACE 선택 상에서 생장한 트랜스제닉 캘러스 라인을 qRT-PCR에 의해 FatB4, FatB5, 튜불린 및 ZFP TF 발현 수준에 대해 분석하였다. 상기 튜불린 유전자는 FatB4 , FatB5 및 ZFP TF mRNA의 발현 수준을 표준화하기 위하여 참조 유전자로서 사용하였다. 상기 FatB4/튜불린 및 FatB5/튜불린 비율을 mRNA 발현을 표준화하기 위해 산출하였다. 그 결과 컨스트럭트 설계 pDAB4691에 대한 통계적으로 유의한 FatB4 mRNA 및 FatB5 mRNA 상향 조절이 나타났다(p = 0.005; 도 9). pDAB4692 캘러스 라인은 FatB4 및 FatB5 mRNA에서 상향조절 경향성을 나타냈으나, 상기 경향성은 통계적으로 유의하지 않았다. 또한 pDAB4689 캘러스 라인을 분리된 실험으로 분석하였고, 이는 상향조절 경향성을 나타냈으나, 통계적으로 유의하지 않았다(데이터 나타내지 않음). 상기 ZFP TF 분석이 오직 상기 ZFP TF 발현 라인에 특이적인 것을 확인하는, 대조군 세포주는 ZFP TF 특이적 증폭산물을 증폭시키지 않았다.
실시예 12: 트랜스제닉 T 0 식물 샘플의 발현 분석
12.1 qRT-PCR에 대한 내부 대조군으로서 사용하기 위한 유채 액틴에 대한 분 석
실시예 1.1에서 기술한 바와 같이 모든 라인으로부터 총 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였다. PCR 혼합물은 액틴의 cDNA 증폭을 위해 하기와 같이 설정하였다(Bo Yang et al., 2007, Plant Science 173:156-171; 액틴 유전자 Genbank accession no. AF111812): 7.5 ㎕ LIGHTCYCLER480 SYBR Green I Master 2X Buffer, 10 μM 스톡의 0.3 ㎕ BN_Actin_F 프라이머(서열번호 61: ACGAGCTACCTGACGGACAAG), 10 μM 스톡의 0.3 ㎕ BN_Actin_R(서열번호 62: GAGCGACGGCTGGAAGAGTA), 1.5 ㎕의 10%(w/v) PVP-40), 및 13.5 ㎕까지 H 2 O로 q/s. 384-웰 마이크로 플레이트의 적절한 사분면에 경계를 표시하였고, 웰 당 13.5 ㎕의 마스터 믹스를 채웠다. 그런 다음 밀봉 호일을 상기 플레이트에 조심스럽게 부착하였다. 상기 플레이트를 Qiagen 마이크로 플레이트 원심분리기에서 1분간 3000 rpm으로 원심분리 하였다. 해동되고, 희석된 최초 사슬 cDNA 1.5 ㎕를 첨가하였고, 그리고 나서 낮은 농도에서부터 높은 온도까지 1.5 ㎕ cDNA 표준을 대조군 웰 내에 첨가하였다. 밀봉 호일을 상기 플레이트에 단단히 부착하고 원심분리 하였다. 상기 PCR 프로그램은 LIGHTCYCLER480 Real-Time PCR System(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)에서 하기 조건을 사용하여 수행하였다: 1) 95℃에서 10분간 활성; 2) 95℃에서 10초간 변성(@ 4.8℃/초); 3) 60℃에서 20초간 어닐/연장(@ 2.5℃/초); 4) 72℃에서 20초간 수득(@ 4.8℃/초); 5) 2)-4) 단계 반복, 39-49 회 이상. 마지막으로, 상기 반응을 멈추기 위하여 38℃에서 5초간 상기 반응을 냉각하였다. 상기 증폭산물은 80 bp 크기였다.
12.2 FatB4 및 FatB5 mRNA 발현 분석
pDAB4689-pDAB4691로 형질전환된 유채 식물을 FatB4 및 FatB5 의 증가된 mRNA 발현에 대해 분석하였다. 게다가, 두 형태의 대조군을 사용하였다. Nex710 식물로 구성된 비-트랜스제닉 대조군을 음성 대조군으로서 사용하였다. pDAB8210으로 형질전환된 유채 Nex710 식물로 구성된 두 번째 트랜스제닉 대조군을 또한 분석하였다. 상기 pDAB8210 컨스트럭트 설계는 두 개의 유전자 발현 카세트로 구성되었다. 상기 pat 유전자 발현 카세트(AtUbi10 프로모터 :: pat 유전자 :: AtuORF1 3' UTR) 및 비-표적 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN) 유전자 발현 카세트(AtUbi10 프로모터 :: ZFN 유전자 :: AtuORF23 3' UTR). pDAB8210에서 발현되는 상기 ZFN은 유채 Nex710 식물의 게놈에 결합하거나 절단하는 것으로 예측되지 않고 이러한 식물의 표현형을 변형시키지 않을 것이다.
HERBIACE 선택 상에서 생장한 추정상의 트랜스제닉 칼리(calli)는 식물 내에서 재형성되었다(실시예 3.3). mRNA 발현 분석을 위하여 잎 샘플은 온실에서 생장한 6-잎 단계 유채 식물로부터 수집하였다. 각 식물 유래의 여섯 개의 잎 펀치가 분리되었고 RNA 추출 전에 얼음에 놓았다. 총 RNA를 QIAGEN RNEASY 키트를 사용하여 추출하였다. cDNA 합성 및 추가 희석을 실시예 11에 기술한 바와 같이 수행하였다. qRT-PCR을 통한 FatB4 및 FatB5 에 대한 발현 분석 프로토콜은 상기 기술하였다. ZFP TF 발현 분석은 상기 분석으로 플러스/마이너스였다. 상기 액틴 참조 유전자 qRT-PCR 분석은 상기 기술하였다.
FatB4 및 FatB5 유전자에 대한 T 0 잎 발현은 컨스트럭트간에 다양하였다(도 10). 가장 높은 FatB4 및 FatB5 mRNA 상향 조절은 Nex710 비-트랜스제닉 및 pDAB8210 트랜스제닉 대조군과 비교하여 mRNA 발현에서 총 2.0-2.5 배 증가한 결과를 야기한 pDAB4691 트랜스제닉 식물 이벤트에서 확인되었다. 두 유전자의 발현은 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하였다(p = 0.05 이하). 그러므로, 상기 컨스트럭트의 추가적인 특성 확인을 pDAB4691와 함께 계속하였다.
실시예 13: 트랜스제닉 T1 식물의 분석
13.1 T1 종자의 지방산 분석
이벤트 pDAB4691-003-049.1(이벤트 49)의 낮고 높은 오일 종자 사이의 C18:0 함유량에 유의적인 차이가 확인되었다(표 14). “낮은” 카테고리 종자의 C18:0 함유량은 상기 Nex710(비-트랜스제닉 대조군) 및 pDAB8210(트랜스제닉 대조군) 라인의 그것과 유사하였다. “높은” 종자에서에서 C18:0 함유량은 FatB 유전자 상향 조절의 결과를 야기하는 ZFP TF 발현과 관련되었다. 또한 C20:0, C22:0 및 C24:0에서 일부 증가가 더 장쇄 지방산 내로 C18:0의 흐름을 기초로 확인되었다. 각각의 종자에서 C16:0 함유량은 낮거나 또는 높은 카테고리 중 어느 하나 내에서 변화하지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 pDAB4691 ZFP TF 가 상기 C16:0-ACP 내지 C16:0 반응 보다는 C18:0 효소적 반응에 대하여 C18:0-ACP에 대해 특이적인 상기 FatB 유전자에 결합하고 상향-조절한다는 사실을 나타내는 것이다(실시예 1, 도 1 참조).
FAME 분석으로 측정된 각각의 T
1
종자의 지방산 프로파일
샘플* | 총 Sats | C16:0 | C16:1 | C18:0 | C20:0 | C22:0 | C24:0 |
이벤트 49 저 | 6.35 | 4.11 | 0.48 | 1.45 | 0.46 | 0.21 | 0.07 |
이벤트 49 저 | 6.35 | 3.70 | 0.35 | 1.62 | 0.58 | 0.30 | 0.12 |
이벤트 49 저 | 6.49 | 3.64 | 0.36 | 1.66 | 0.62 | 0.32 | 0.18 |
이벤트 49 고 | 7.50 | 3.55 | 0.42 | 2.59 | 0.80 | 0.34 | 0.17 |
이벤트 49 고 | 7.74 | 3.63 | 0.45 | 2.59 | 0.88 | 0.38 | 0.22 |
이벤트 49 고 | 7.93 | 3.67 | 0.47 | 2.82 | 0.86 | 0.38 | 0.17 |
이벤트 49 평균(n=24) | 6.90 | 3.70 | 0.40 | 2.03 | 0.67 | 0.31 | 0.15 |
이벤트 49 표준편차(n=24) | 0.51 | 0.14 | 0.05 | 0.37 | 0.10 | 0.04 | 0.03 |
Nex710 평균(n=24) | 6.47 | 3.70 | 0.45 | 1.79 | 0.57 | 0.26 | 0.11 |
Nex710 표준편차(n=24) | 0.35 | 0.24 | 0.06 | 0.17 | 0.06 | 0.04 | 0.03 |
8210 평균(n=150) | 6.27 | 3.51 | 0.34 | 1.63 | 0.61 | 0.33 | 0.14 |
8210 표준편차(n=150) | 0.40 | 0.24 | 0.07 | 0.25 | 0.08 | 0.05 | 0.04 |
*지방산 분석을 이벤트 49 및 Nex710의 24개 각각의 T1 종자, 및 6개의 이벤트를 포함하는 pDAB8210의 114개의 종자에 대하여 실시하였다. “낮은” 및 “높은” 카테고리는 C18:0 함유량에 기초하여 분류될 때 각각의 종자의 특이적 FA 함유량을 나타낸다.
13.2 T1 식물에서 ZFP TF 존재 분석
이벤트 49의 백 개의 T1 종자를 온실에 심었다. 97개의 식물이 묘목으로 싹텄다. ZFP TF 카피 수를 2-4 잎 단계로부터 분리된 식물 재료에 대하여 실시예 6.2에서 기술한 바와 같이 pat qRT-PCR 분석을 사용하여 측정하였다. 이벤트 49는 다중 삽입(~3 삽입) 및 0-7 pat 유전자를 포함하였고, 이에 따라 ZFP TF, 카피는 상기 T1 개체군 내로 분리되었다. 오직 하나의 널 식물이 상기 T1 개체군으로부터 식별되었다.
13.3 T1 식물에서 FatB4 및 FatB5 mRNA 상향 조절
네이티브 FatB 유전자 발현 분석을 상기 분리된 T1 개체군의 모든 97개의 식물에 대해 실시하였다. 동시에 심은 비-트랜스제닉 Nex710 식물은 대조군으로서 본 연구에 포함되었다. 식물 당 6-잎 펀치가 회수되었고 RNA 추출이 완료될 때까지 얼음에 놓았다. 총 RNA를 QIAGEN RNEASY 키트를 사용하여 추출하였다. cDNA 합성 및 추가 희석은 실시예 11에 기술한 바와 같이 수행하였다. FatB4 , FatB 5, 튜불린 및 VP16 ( ZFP TF )의 발현 분석은 상기 기술한 바와 같이 실시하였다.
튜불린 발현과 현저한 선형 경향성을 나타내는 FatB4/FatB5 및 튜불린의 비율의 통계적 분석은 FatB4/FatB5 에 증가가 상기 내재적 대조군인, 튜불린에 증가와 1:1 관계를 가지지 않는 것을 나타낸다. 이와 같이, 상기 비율을 이러한 분석에 사용하지 않았고, 튜불린을 FatB4/FatB5 의 발현 모델에 있어서 공변관계로서 포함하였다. 튜불린 및 VP16 ( ZFP TF ) 사이의 임의의 공통-직선성을 제거하기 위하여, 상기 모델 방정식에 대한 근접행렬을 직교화하였다.
하기 모델을 본 발명에서 모든 데이터세트에 적합하였다: 여기서 status i 는 y ijk 의 트랜스제닉 상태이다(트랜스제닉 또는 널/대조군);
y ijk = status i + transgenic* VP16 + e ijk
transgenic* VP16 은 트랜스제닉 라인 내에 끼워 넣은 VP16 에 대한 선형회귀이고; e ijk 는 랜덤 잔차이다. 각 샘플에 대하여 세 번의 반복된 측정이 주어졌고, 관련된 잔차 구조가 사용되었다:
여기에서 I n 은 샘플의 개수과 동일한 지위를 갖는 매트릭스를 식별한 것이고, φ는 반복된 측정의 잔차 사이의 상관관계이다.
이벤트 49에 대한 분석 결과는 매우 유의적인 양성 기울기를 나타내는 VP16 에 대한 FatB4 발현의 네스티드 회귀를 갖는 FatB4 에서 유의적인 상향 조절을 나타냈다(도 12, 표 15). FatB5 에 대하여, 네스티드 회귀는 상향 조절에 대한 양성 기울기를 나타냈고, 상기 기울기는 통계적으로 유의하였다. 상향 조절 이벤트에 대하여, 형질전환 및 대조군 식물은 동일한 라인을 형성하지 못하였고 그래서 상기 라인 및 형질전환 효과에 일부 혼란이 있을 수 있다는 것에 특히 주의해야 한다.
상향 조절 이벤트에 대한 결과
이벤트 | 유전자 | Effect A | 용액 | P-값 |
4691-3-049.001 | FatB4 | 형질전환된-대조군 | 10331.11 | <0.00001 |
형질전환된*VP16 | 0.764E-05 | <0.00001 | ||
FatB5 | 형질전환된-대조군 | 5084.09 | <0.00001 | |
형질전환된*VP16 | 0.308E-05 | <0.00001 |
A 형질전환된-대조군 = 형질전환된 라인 및 트랜스유전자를 운반하지 않는 라인 사이의 최소 제곱 평균 발현에 차이. transgenic* VP16 = 트랜스제닉 라인 내에 끼워 넣은 VP16 발현에 대한 FatB4/FatB5 발현의 회귀.
그런 다음 이벤트 49 T 1 식물을 온실에서 T 2 형성하기 위한 가장 높은 발현 식물을 검색하기 위하여 상기 FatB4/튜불린 , 및 그리고 나서 FatB5/튜불린 발현 미율에 기초하여 분류하였다. 가장 높게 발현하는 FatB4 식물 8개를 성숙을 위해 선별하였다. 이러한 식물 중 6개는 또한 FatB5 를 가장 높게 발현하였다. 전체 T1 자손에서 분리된 상기 카피 수가 0-7 카피인 반면, 이러한 가장 높게 발현하는 식물에서 ZFP TF 카피 수는 2-4 카피가 달랐다. 대조군 식물에 대하여, 이벤트 49의 하나의 널 식물 및 10개의 Nex710 대조군 식물은 또한 T 2 종자 수집을 위해 성숙되었다.
13.4 T2 종자의 지방산 분석
실시예 6.1에서 기술한 바와 같이 지방산(FA) 분석을 모든 식물의 24개의 종자 대부분에 대하여 실시하였다. 하나의 널 식물의 상기 FA 프로파일은 대조군 FA 프로파일 측정을 위하여 10개의 Nex710 대조군 식물과 결합되었다. 평균적으로, C18:0 함유량에 있어서 이벤트 49에 대해 Nex710의 것과 비교하여 12% 증가가 관찰되었다(표 16 및 17). 이러한 증가는 p = 0.05로 통계적으로 유의하였다(도 13). C20:0, C22:0 및 C24:0와 같은,장쇄 FA는, 또한 총 포화 FA 함유량에 있어서 5% 증가까지 유도하는 것으로 나타났다. FatB 효소가 C18:0 프리 FA로 C18:0 ACP의 전환을 촉매하기 때문에, FatB4 및 FatB5 전사적 상향 조절의 결과에 따라 더욱 많은 C18:0이 축적될 것이다(도 1). 상기 pDAB4691(실시예 6, 표 1 및 2)는, FatB4 및 FatB5 유전자 모두에 특이적이고, 이는 상기 FA 프로파일에 유의적인 변화의 결과를 야기한다(표 16 및 17).
이벤트 49 트랜스제닉 및 Nex710 대조군 샘플의 지방산 프로파일(C16:0, C16:1, C18:0, C18:1, C18:2 및 C18:3)
SN | 식물 ID | 총 Sats | C16:0 | C16:1 | C18:0 | C18:1 | C18:2 | C18:3 |
1 | 4691-3-049(8) | 6.42 | 3.47 | 0.24 | 1.61 | 76.32 | 11.20 | 3.52 |
2 | Nexera710(11) | 6.11 | 3.40 | 0.23 | 1.44 | 76.26 | 11.25 | 3.76 |
컬럼 2에 괄호 안의 숫자는 분석된 식물의 개수를 나타낸다.
이벤트 49 트랜스제닉 및 Nex710 대조군 샘플의 지방산(C20:0, C20:1, C20:2, C22:0, C22:1, C24:0, C24:1) 프로파일
SN | 식물 ID | 총 Sats | C20:0 | C20:1 | C20:2 | C22:0 | C22:1 | C24:0 | C24:1 |
1 | 4691-3-049(8) | 6.42 | 0.66 | 1.39 | 0.05 | 0.43 | 0.02 | 0.21 | 0.18 |
2 | Nexera710(11) | 6.11 | 0.61 | 1.43 | 0.06 | 0.41 | 0.02 | 0.20 | 0.17 |
컬럼 2에 괄호 안의 숫자는 분석된 식물의 개수를 나타낸다.
총 C16 함유량에서 유의성이 없는 변화가 네이티브 FatB4 및 FatB5 유전자 상향 조절과 함께 관찰되었다. 이는 C16:0-ACP 내지 C16:0의 촉매작용이 다른 FatB 유전자와는 일어나지만 pDAB4691 ZFP TF 설계를 사용한 상향 조절을 위한 예시적인 표적, FatB4 및 FatB5 와는 일어나지 않을 확률이 크다(도 1).
pDAB4691 ZFP TF 설계가 C16:0-ACP 내지 C16:0 반응 보다는 C18:0-ACP 내지 C18:0 효소적 반응에 대하여 더욱 특이적으로 상기 FatB 유전자에 결합한다는 사실을 나타내는(도 1), 각각의 종자 C16:0 함유량은 T1 종자 “낮은” 및“높은” 카테고리에 변화를 나타내지 않았다(표 14).
상기 네이티브 β-케토아실-ACP 합성효소 II 유전자의 상향조절이(실시예 1-6) 상기 네이티브 FatB4 및 FatB5 유전자 상향 조절과 비교하여 FA 프로파일에 다른 변화를 유발하는 ZFP TF 에 의해 유도된다는 것에 특히 주의해야한다. 예를 들면, β-케토아실-ACP 합성효소 II 유전자 상향 조절은 그들의 널 분리 개체와 비교하여 C16:0 및 C16:1 함유량에 통계적으로 유의한 감소, 및 총 C18 함량에 수반되는 증가를 야기하였다(실시예 6, 도 6, 표 5 및 8 및 9). 비교적, ZFP-TF-매개 FatB 유전자 상향 조절은 상기 C18:0 함유량에 통계적으로 유의한 증가를 야기하였지만 상기 C16:0 함유량에는 명백한 변화가 없었다(도 14). β-케토아실-ACP 합성효소 II 및 FatB 유전자의 ZFP-TF-매개 상향 조절을 통한 상기 FA 프로파일에 반복된 이러한 변화는 FA 생합성 경로에 따라 일치한다(도 1).
실시예 14: 식물 형질전환에 대한 ZFP TF 컨스트럭트 설계
유채 L에서 상기 FatB 유전자의 전사적 하향 조절을 위하여 4개의 컨스트럭트는 설계하여 만들었다(표 18). 가장 우수한 FatB 상향 조절 ZFP 설계인, 13722 및 13714를, FatB 하향 조절의 입증을 위하여 사용하였다(실시예 9-13). 이러한 ZFP 설계는 기능적 ZFP TF 를 구조화하기 위하여, KRAB1(Hanna-Rose 및 Hansen, 1996, Trends in Genetics, 12:229-234) 또는 NtERF3(Ohta et al., The Plant Cell , 2001, 13:1959-1968) 중 어느 하나로 구성된 opaque-2 핵 위치 신호 및 억제 도메인과 결합하였다. 모든 ZFP TF 는 종자-특이적 프로모터 하에서 발현되었고; 애기장대 지질 운반 단백질 2 프로모터(AtLTP170 프로모터)(Genbank ID: NC_003076) 또는 파세올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris)ß-파세올린(Phaseolin) 프로모터(PvPhas 프로모터)(미국 특허 번호 5,591,605) 중 어느 하나를 사용하였다.
FatB
유전자의 표적화된 하향 조절을 위한
ZFP TF
컨스트럭트 상세 설명
SN | ZFP 설계 | 컨스트럭트 No. | 유전자 카세트 |
1 | 13722 | pDAS5203 | AtLTP170/Op-2 * NLS-ZFP-13722-KRAB1/ORF23 3' UTR//AtUbi10/Pat/AtuORF1 3' UTR |
2 | 13714 | pDAS5204 | AtLTP170/Op-2 NLS-ZFP-13714-KRAB1/ORF23 3' UTR//AtUbi10/Pat/AtuORF1 3' UTR |
3 | 13722 | pDAS5212 | PvPhas/Op-2-NLS-ZFP13722-KRAB1/Phas 3' UTR//AtUbi10/Pat/AtuORF1 3' UTR |
4 | 13722 | pDAS5227 | AtLTP170/Op-2 NLS-ZFP-13722-NtERF3/ORF23 3' UTR//AtUbi10/Pat/AtuORF1 3' UTR |
* Op-2 = Opaque-2 핵 위치 신호(Nuclear Localization Signal)
pDAS5203은 상기 opaque-2 NLS/13722/KRAB1 및 pat 유전자 발현 카세트를 포함하는 바이너리 플라스미드이다. 이러한 컨스트럭트는 하기 유전자 요소를 포함한다: AtLTP 프로모터 170 :: opaque-2 NLS/13722 징크 핑거/KRAB1 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 :: AtUbi10 프로모터 v2 :: pat v5 :: AtuORF1 3'UTR v4. 상기 바이너리는 게이트웨이 공여자 벡터 내로 opaque-2 NLS/13722 징크 핑거/KRAB1 융합을 포함하는 DNA 단편을 클로닝함으로써 구조화하였다. 상기 결과로 얻어진 컨스트럭트는 AtLTP 프로모터 170 :: opaque-2 NLS/13722 징크 핑거/KRAB1 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 유전자 발현 카세트를 포함하였다. 이러한 컨스트럭트는 LR Gateway reaction(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 통해 바이너리 내로 클로닝되었다. 이러한 반응은 pDAS5203을 제조하였고 제한 효소 분해 및 시퀀싱 반응을 통해 확인하였다.
pDAS5204는 opaque-2 NLS/13714/KRAB1 및 pat 유전자 발현 카세트를 포함하는 바이너리 플라스미드이다. 이러한 컨스트럭트는 하기 유전자 요소를 포함한다: AtLTP 프로모터 170 :: opaque-2 NLS/13714 징크 핑거/KRAB1 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 :: AtUbi10 프로모터 v2 :: pat v5 :: AtuORF1 3'UTR v4. 상기 바이너리는 게이트웨이 공여자 벡터 내로 opaque-2 NLS/13714 징크 핑거/KRAB1 융합을 포함하는 DNA 단편을 클로닝함으로써 구조화하였다. 상기 결과로 얻어진 컨스트럭트는 AtLTP 프로모터 170 :: opaque-2 NLS/13714 징크 핑거/KRAB1 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 유전자 발현 카세트를 포함하였다. 이러한 컨스트럭트는 LR Gateway reaction(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 통해 바이너리 내로 클로닝되었다. 이러한 반응은 pDAS5204를 제조하였고 제한 효소 분해 및 시퀀싱 반응을 통해 확인하였다.
pDAS5212는 opaque-2 NLS/13722/KRAB1 및 pat 유전자 발현 카세트를 포함하는 바이너리 플라스미드이다. 이러한 컨스트럭트는 하기 유전자 요소를 포함한다: PvPhas 프로모터 :: opaque-2 NLS/13722 징크 핑거/KRAB1 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 :: AtUbi10 프로모터 v2 :: pat v5 :: AtuORF1 3'UTR v4. 상기 바이너리는 게이트웨이 공여자 벡터 내로 opaque-2 NLS/13722 징크 핑거/KRAB1 융합을 포함하는 DNA 단편을 클로닝함으로써 구조화하였다. 상기 결과로 얻어진 컨스트럭트는 PvPhas 프로모터 :: opaque-2 NLS/13722 징크 핑거/KRAB1 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 유전자 발현 카세트를 포함하였다. 이러한 컨스트럭트는 LR Gateway reaction(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 통해 바이너리 내로 클로닝되었다. 이러한 반응은 pDAS5212를 제조하였고 제한 효소 분해 및 시퀀싱 반응을 통해 확인하였다.
pDAS5227은 opaque-2 NLS/13722/NtERF3 및 pat 유전자 발현 카세트를 포함하는 바이너리 플라스미드이다. 이러한 컨스트럭트는 하기 유전자 요소를 포함한다: RB7 MAR v3 :: AtLTP 프로모터 170 :: opaque-2 NLS/13722 징크 핑거/NtERF3 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 :: AtUbi10 프로모터 v2 :: pat v5 :: AtuORF1 3'UTR v4. 상기 바이너리는 게이트웨이 공여자 벡터 내로 opaque-2 NLS/13722 징크 핑거/NtERF3 융합을 포함하는 DNA 단편을 클로닝함으로써 구조화하였다. 상기 결과로 얻어진 컨스트럭트는 AtLTP 프로모터 170 :: opaque-2 NLS/13722 징크 핑거/NtERF3 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 유전자 발현 카세트를 포함하였다. 이러한 컨스트럭트는 LR Gateway reaction(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 통해 바이너리 내로 클로닝되었다. 이러한 반응은 pDAS5227을 제조하였고 제한 효소 분해 및 시퀀싱 반응을 통해 확인하였다.
상기 컨스트럭트는 배축 외식체(hypocotyl explants)의 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 유채 다양성 Nex710 내로 안정적으로 형질전환되었다(실시예 3.2-3.3). 온실에서 생장한 T0 식물은 자가 수분되었고 T1 종자는 이식 후 4개월째 수집하였다.
실시예 15: 4개의 ZFP TF 컨스트럭트에 대한 T1 종자 트랜스제닉의 분석
T1 종자는 컨스트럭트 pDAS5203, pDAS5204, pDAS5212 및 pDAS5227의 트랜스제닉 이벤트(라인) 8, 20, 37 및 15로부터 각각 수득하였다. 5개의 Nex710 식물 종자를 대조군으로서 사용하였다. FA 프로파일을 가장 효과적으로 변형하는 ZFP TF 컨스트럭트를 먼저 식별하기 위하여, FA 분석을 실시예 6.1에 먼저 기술한 바와 같이, 각 T1 트랜스제닉 이벤트의 24개 각각의 종자에 대하여 실시하였다.
15.1 T1 종자의 지방산(FA) 분석
컨스트럭트 pDAS5203, pDAS5212 및 pDAS5227은 대조군 Nex710과 비교하여 가장 낮은 총 포화 FA 프로파일을 갖는 트랜스제닉 이벤트를 제조하였다(표 19 및 20). 각각의 상기 두 개의 컨스트럭트 이벤트 사이의 쌍대 차이는, pDAS5203 및 pDAS5212, 및 Nex710 대조군이 현저하였다(p=<0.005). 그러나 pDAS5227의 쌍대 차이가 강력한 경향성(p=0.06)을 나타냈다. pDAS5203로부터 상기 이벤트 중 하나는 상기 Nex710 대조군에서 평균 6.38%와 비교하여 5.3%의 가장 낮은 총 포화 FA 함유량(나타내지 않음)을 포함하였다. 이는 총 포화 FA에 있어서 17% 감소이다.
다중 컨스트럭트 트랜스제닉 이벤트의 T1 종자 FA 프로파일
컨스트럭트 No. | 분석의 타입 | 총 Sats | C14:0 | C16:0 | C16:1 | C18:0 | C18:1 | C18:2 | C18:3 |
pDAS5212 | 평균(n=37) * | 6.00 | 0.05 | 3.60 | 0.24 | 1.38 | 75.88 | 12.24 | 3.41 |
pDAS5212 | 표준편차(n=37) | 0.21 | 0.01 | 0.20 | 0.02 | 0.14 | 1.36 | 1.03 | 0.41 |
pDAS5212 | p값 ** | 0.01 | 0.07 | 0.89 | 0.47 | <0.0001 | 0.39 | 0.37 | 0.94 |
pDAS5204 | 평균(n=20) | 6.26 | 0.05 | 3.52 | 0.25 | 1.65 | 76.33 | 11.52 | 3.58 |
pDAS5204 | 표준편차(n=20) | 0.29 | 0.01 | 0.15 | 0.02 | 0.16 | 0.78 | 0.66 | 0.30 |
pDAS5204 | p값 | 0.43 | 0.72 | 0.52 | 0.69 | 0.32 | 0.16 | 0.04 | 0.34 |
pDAS5203 | 평균(n=8) | 5.98 | 0.05 | 3.68 | 0.26 | 1.33 | 75.32 | 12.74 | 3.55 |
pDAS5203 | 표준편차(n=8) | 0.36 | 0.01 | 0.25 | 0.05 | 0.13 | 1.76 | 1.31 | 0.47 |
pDAS5203 | p값 | 0.02 | 0.06 | 0.45 | 0.96 | 0.0001 | 0.96 | 0.98 | 0.49 |
pDAS5227 | 평균(n=15) | 6.09 | 0.03 | 3.63 | 0.32 | 1.32 | 75.43 | 12.32 | 3.73 |
pDAS5227 | 표준편차(n=15) | 0.35 | 0.00 | 0.29 | 0.09 | 0.12 | 1.69 | 1.36 | 0.37 |
pDAS5227 | p값 | 0.07 | 0.002 | 0.69 | 0.012 | <0.0001 | 0.84 | 0.48 | 0.1 |
Nex710 | 평균(n=5) | 6.38 | 0.04 | 3.59 | 0.26 | 1.73 | 75.28 | 12.76 | 3.40 |
Nex710 | 표준편차(n=5) | 0.61 | 0.01 | 0.15 | 0.03 | 0.49 | 3.00 | 2.76 | 0.43 |
* 괄호 안의 숫자는 분석에 포함된 이벤트의 개수를 나타낸다.
** 0.05와 같거나 낮은 p값은 통계적으로 유위한 것으로 간주되었고 JMP 소프트웨어로 측정되었다.
다중 컨스트럭트 트랜스제닉 이벤트의 T1 종자 FA 프로파일
컨스트럭트 No. | 분석의 타입 | 총 Sats | C20:0 | C20:1 | C20:2 | C22:0 | C24:0 | C24:1 |
pDAS5212 | 평균(n=37) * | 6.00 | 0.54 | 1.33 | 0.06 | 0.30 | 0.13 | 0.08 |
pDAS5212 | 표준편차(n=37) | 0.21 | 0.04 | 0.11 | 0.01 | 0.03 | 0.05 | 0.04 |
pDAS5212 | p값 ** | 0.01 | 0.03 | 0.003 | 0.14 | 0.76 | 0.26 | 0.23 |
pDAS5204 | 평균(n=20) | 6.26 | 0.59 | 1.20 | 0.05 | 0.32 | 0.13 | 0.11 |
pDAS5204 | 표준편차(n=20) | 0.29 | 0.06 | 0.17 | 0.01 | 0.05 | 0.05 | 0.03 |
pDAS5204 | p값 | 0.43 | 0.79 | 0.20 | 0.87 | 0.68 | 0.29 | 0.63 |
pDAS5203 | 평균(n=8) | 5.98 | 0.51 | 1.28 | 0.05 | 0.29 | 0.12 | 0.11 |
pDAS5203 | 표준편차(n=8) | 0.36 | 0.03 | 0.15 | 0.01 | 0.02 | 0.01 | 0.05 |
pDAS5203 | p값 | 0.02 | 0.006 | 0.048 | 0.42 | 0.56 | 0.55 | 0.84 |
pDAS5227 | 평균(n=15) | 6.09 | 0.56 | 1.39 | 0.06 | 0.39 | 0.15 | 0.16 |
pDAS5227 | 표준편차(n=15) | 0.35 | 0.07 | 0.23 | 0.01 | 0.10 | 0.08 | 0.05 |
pDAS5227 | p값 | 0.07 | 0.21 | 0.0005 | 0.066 | 0.008 | 0.081 | 0.004 |
Nex710 | 평균(n=5) | 6.38 | 0.60 | 1.10 | 0.05 | 0.31 | 0.11 | 0.10 |
Nex710 | 표준편차(n=5) | 0.61 | 0.13 | 0.09 | 0.01 | 0.07 | 0.05 | 0.08 |
* 괄호 안의 숫자는 분석에 포함된 이벤트의 개수를 나타낸다.
** 0.05와 같거나 낮은 p값은 통계적으로 유위한 것으로 간주되었고 JMP 소프트웨어로 측정되었다.
이벤트 pDAS5203, pDAS5212 및 pDAS5227의 특이적인 FA 프로파일은 Nex710과 비교하여 C18:0에서 21-25% 감소를 야기하였다(도 15A). 이러한 모든 차이는 p = 0.001에서 또는 그 이하에서 통계적으로 유의하였다(표 19 및 20). 다른 장쇄 FA, C20:0, C22:0 및 C24:0는 또한 농도에 감소를 나타냈다. 그러나, C16:0 함유량에는 변화가 없는 것으로 관찰되었고 이는 모든 세 가지의 컨스트럭트 트랜스제닉 이벤트에서 C16:0/C18:0 함유량에 유의적인 증가를 야기하였다(도 165B).
pDAS5227 트랜스제닉 종자의 FA 프로파일은 pDAS5203 및 pDAS5212와 비교하여 구분되는 차이를 나타냈다. C14:0에서 23% 감소(p = 0.002) 및 C16:1에서 19% 증가(p = 0.01) 함유량이 Nex710과 비교하여 pDAS5227 종자에서 관찰되었다(도 16A 및 B, 표 19 및 20). 상기 pDAS5227 ZFP TF 설계는 KRAB1 도메인 대신에 ZFP에 융합된 ERF3 하향 조절 도메인의 존재를 제외하고 pDAS5203 및 pDAS5212와 동일하다(표 18).
pDAS5204에 존재하는 다른 ZFP 설계, 13714는, 13722 설계와 비교하여 C18:0 감소에 있어서 효과적이지 않았다(표 16). FatB4 및 FatB5 유전자에 모두 결합하는 상기 13722 설계와 다르게, 상기 13714 설계는 오직 상기 FatB5 유전자에만 결합한다(실시예 9, 표 12).
15.2 mRNA 분석을 위한 식물의 식별
두 트랜스제닉 이벤트인, 5212[1]-004 및 5227[4]-012는, 각각 컨스트럭트 pDAS5212 및 pDAS5227로 형질전환됨으로써 제조되었고, FatB5 전사적 하향 조절 분석을 위해 선별되었다. 50 내지 100개의 T1 종자를 온실에 심었고 식물을 길렀다. 4개의 잎 펀치를 2-3 잎 단계에 있는 식물로부터 수집하였다. 이러한 식물 재료를 pat qRT-PCR 분석을 사용하여 ZFP TF 카피 수에 대하여 분석하였다(실시예 6.2). 그런 다음 랜덤 ZFP 널 및 ZFP 양성 식물을 T2 종자를 수집하기 위해 성숙시키기 위하여 선별하였다(표 21). FatB mRNA 분석을 위하여 상기 동일한 식물 유래의 비성숙한 꼬투리를 개화(flowering(DAF)) 후 25일에 수집하였다. 두 이벤트는 단일 카피로서 분리하였다. 이러한 이벤트는 5212-4 및 5227-12로서 표지하였다.
ZFP 양성 및 널 식물의 식별을 위한 트랜스제닉 이벤트 스크리닝
이벤트 이름 | T1 종자/식물 | 식물 No. | 카피 수 | #Plants to T2 seed |
5212-004 | 심은 종자 | 50 | 카피수 | |
발아한 종자 | 49 | |||
pat카피수에 대한 스크리닝 | 17 | 널 | 5 | |
26 | 1 카피 | 3 | ||
5 | 2 카피 | 4 | ||
1 | NT * | |||
ChiTest | 0.04 | |||
5227-12 | 심은 종자 | 100 | ||
발아한 종자 | 96 | |||
pat 카피수에 대한 스크리닝 | 19 | 널 | 4 | |
32 | 1 카피 | 3 | ||
27 | 2 카피 | 4 | ||
18 | NT * | |||
ChiTest | 0.034 |
* NT = 검사하지 않음(Not tested).
15.3 RNA 추출 및 qRT-PCR 분석 개발
RNA를 Qiagen(Valencia, CA)으로부터 입수한 식물 RNAEASYkit로 비성숙 유채 종자로부터 분리하였다. 종자를 RLT 버퍼(Qiagen) /β-머캡토에탄올(β-mercaptoethanol,BME) 및 스테인리스 강구가 포함된 클러스터 튜브에 넣었다. 샘플을 클러스터 튜브 랙 내에 놓고 1분당 500 스트로크로 5분간 비드 밀(bead mill)(Kleco, Visalia, CA)에서 균질화하였다. 상기 튜브 랙을 180도로 회전시키고 추가로 5분간 균질화하였다. 그런 다음 샘플을 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브에 옮기고 5분간 20,000 × g에서 원심분리하였고 상기 상층액을 새로운 튜브에 옮겼다. RNA는 제조사의 프로토콜(Qiagen; Valencia, CA)에 기술된 바에 따라 분리하였다. RNA를 50 ㎕의 RNase free water를 이용하여 상기 컬럼으로부터 용출하였고 상기 RNA 샘플을 Thermo Scientific(Wilmington, DE)의 NanoDrop 8000으로 정량하였다.
게놈 DNA를 제거하기 위하여 10 내지 12 ㎍의 RNA를 1.5 ㎖의 RNase/DNase 프리 튜부에서 TURBO DNA-free(catalog number AM1907; Applied Biosystems, Foster City, CA) DNase로 처리하였다. 각 RNA 샘플에 대하여, RNA, 1X DNase 버퍼, 및 2 units의 TURBO DNase를 포함하는 50 ㎕의 반응물을 준비하였다. 반응물을 37℃에서 30분간 배양하였다. 5 ㎕의 DNase 비활성화 시약을 각 튜브에 첨가하여 혼합하였다. 샘플을 상온에서 3분간 배양하였고, 다시 혼합하여, 상온에서 추가로 2분간 배양하였다. 샘플을 20,000 × g에서 5분간 원심분리하였다. 상기 DNase 비활성화 슬러리를 남겨 놓고 40 ㎕의 상층액을 제거하였다. DNase 처리된 각 샘플은 RNA의 등가물 양이 cDNA 합성을 위해 사용하기 위하여 Nanodrop으로 정량하였다.
cDNA High Capacity kit(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용함으로써 각 RNA 샘플에 대해 상보적 DNA(cDNA)를 준비하였다. 요컨대, 1.5 ㎍의 RNA를 1X 역전사 버퍼, 1X dNTPs, 1X 랜덤 올리고머, 및 125 units의 Multiscribe 역전사효소가 포함된 50 ㎕의 반응물에서 주형으로서 사용하였다. 추가적으로, Multiscribe 역전사효소 없이 상기와 같은 동일한 조건 하에서 1.5 ㎍의 DNase 처리된 RNA를 사용하여 각각에 대하여 noRT 대조군 반응을 준비하였다. 모든 샘플은 25℃에서 10분간, 37℃에서 2시간 동안, 85℃에서 5분간, 및 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.
FATB, KASII, ERF3, KRAB1, 및 튜불린에 대한 프라이머 및 프로브는 Applied Biosystems(Foster City, CA)의 Primer Express 3 소프트웨어로 설계하였다. 프라이머는 Integrated DNA Technologies(Coralville, IA)에서 합성하였다. 하기는 상기 프라이머에 대한 서열이다:
서열번호 63: FATB5 fwd-5' TCGCTGCCATAACAACCATTT 3';
서열번호 64: FATB5 rev-5' CGCCTGGGTTTCCAGTCA 3';
서열번호 65: KRAB1 fwd-5' AAGGATGTGTTCGTGGATTTCA 3';
서열번호 66: KRAB1 rev-5' CACAATCTGCTGTGCAGTATCAAG 3';
서열번호 67: ERF3 fwd-5' GCGGGCGGGAGTTGTTA 3';
서열번호 68: ERF3 rev-5' CCCCATCGGCGTTACATG 3';
서열번호 69: 튜불린 fwd-5' GAAGCTGAGAACAGCGATTGC 3';
서열번호 70: 튜불린 rev-5' GTTCCTCCTCCCAACGAATG 3'.
프로브는 Applied Biosystems(Foster City, CA)에서 합성된 6FAM/MGB이었다:
서열번호 71: FATB5 프로브 6FAM TTTCTCAGCCGCCA;
서열번호 72: KRAB1 프로브 6FAM TAGGGAAGAGTGGAAGCT;
서열번호 73: ERF3 프로브 6FAM CAGGCCTCAGCCTT; 및
서열번호 74: 튜불린 프로브 6FAM TACAAGGTTTCCAAGTTT.
FatB, ERF3, KRAB1 및 튜불린의 유전자 발현은 Applied Biosystem 7900HT(Foster City, CA)를 이용하여 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 표준 곡선은 역동적인 범위 및 분석의 효율성을 확립하기 위하여 다른 그룹 내에서 몇몇 cDNA 샘플의 부분 표본을 사용하여 준비하였다. 최초 희석의 그 후 1:5 및 1:4 연속 희석을 만들었다. 각 cDNA 샘플은 10mM Tris, pH7.5로 1:50으로 희석하였다. PCR 반응물은 1X 유전자 발현 마스터 믹스(Applied Biosystems; Foster City, CA), 0.8 μM의 정방향 및 역방향 프라이머, 0.2 μM의 유전자 특이적 6FAM/MGB 프로브 및 4 ㎕의 희석된 cDNA를 포함하는 12 ㎕의 부피로 준비하였다. 모든 반응은 SDS version 2.4 소프트웨어를 이용하여 Applied Biosystem 7900HT에서 하기 조건 하에서 수행하였다: 단계 1) 50℃에서 2분간; 단계 2)95℃에서 10분간; 단계 3)95℃에서 15초간, 및 단계 4)60℃에서 1분간. 단계 3 및 4는 39의 추가적인 사이클로 반복하였다. 튜불린 유전자 발현은 각 플레이트에 대해 측정하였지만 FatB, ERF3, 및 KRAB1은 분리되어 진행하였다. 모든 반응은 3회 반복 실시하였다.
표준 곡선은 회귀 및 기울기 및 필요에 따라 조정된 임계값에 대해 측정되었고 5 내지 7의 Ct 차이가 존재하는 것을 확인하기 위하여 상기 noRT 샘플(상기 역전사효소를 제외하고 모든 cDNA 반응과 함께 RNA를 함유하는 마이너스 역전사효소 대조군)을 상응하는 샘플과 비교하였다. 상기 데이터는 분석을 위해 엑셀로 불러왔다. FatB, ERF3, 및 KRAB1의 평균 정량값은 튜불린 및 FatB와 튜불린 발현 비율로서 보고된 정량 평균에 대하여 표준화하였다.
15.4 비성숙 종자들에서 종자-특이적 Fat5 mRNA 하향 조절의 분석
결과들은 비성숙 종자에서 25 개화일(day after flowering, DAF)의 FatB mRNA 하향-조절은 T1 식물의 접합성(zygosity) 상태에 의존적이었다. 예를 들면, 5227-12 비성숙 종자의 이형접합 식물(1 카피)에서는 명확한 FatB5 mRNA 하향 조절이 관찰되지 않았다(도 17). 그러나, 동형접합 식물(2 카피)에서 상기 ZFP TF 발현이 2-배까지 증가할 때, FatB5 mRNA 발현의 21% 감소가 관찰되었다(p = 0.025). 유사한 결과들이 다른 이벤트, 다른 컨스트럭트인 pDAS5212의 5212-4에서 얻어졌다. 상기 이벤트에서, 다시, 상기 이형접합 식물 내 명확한 Fat5 하향 조절은 관찰되지 않았다(도 18). 그러나, ZFP TF 발현이 증가될 때, 상기 동형접합 식물 내 상기 FatB5 전사체의 15% 감소가 관찰되었다.
상기 두 이벤트들의 널, 이형접합 및 동형접합 식물들을 성숙시켰고, FA 프로파일은 각 식물의 24 종자 풀에서 측정되었다. ZFP TF-함유 계통에서부터 널 계통을 분리하는 상기 과정은 상기 ZFP TF의 존재를 더욱 가깝게 반영하는 FA 프로파일 차이를 허용했다.
15.4 T2 성숙 종자에서 FA 프로파일의 분석
T 2 성숙 종자 FA 프로파일은 이벤트 5227-12(표 22 및 23)에 대한 상기 T1 부모 식물의 ZFP TF 접합성에 따라 변한다. 비록 상기 이형접합 T1 식물이 25 DAF 비성숙 종자에서 어떤 명확한 FatB mRNA 하향조절을 나타내지는 않았지만, 그들의 종자 FA 프로파일은 C18:0 함유량에서 8%의 감소를 나타내었다. C16:0 함유량의 현저한 감소는 관찰되지 않았다. 게다가, 총 포화 FA의 전반적인 5.5% 감소를 야기하면서, C18:1(올레산의(oleic)) 및 뒤이은 하류 FAs의 미세한 증가들이 관찰되었다. 5227-12 T1 식물이 ZFP TF에 대하여 동형접합이었을 때, 상기 FatB mRNA는 현저하게 하향 조절되었다. 상기 T2 종자의 FA 프로파일은 다르다. 총 포화 FA의 전반적인 2.7% 감소를 야기하면서, C16:1 함유량의 11% 증가가 관찰되었다(Tables 18A 및 18B). 그러나, 상기 이형접합 식물과 비교하여 C18:0의 추가적인 감소는 관찰되지 않았다. 상기의 변화들은 상기 T1 성숙 종자 FA 프로파일과 일치하였다(실시예 15.1).
이벤트 5227-12의 T2 성숙 종자의 표시된(indicated) FA 프로파일
식물 ID | Copy # | 총 Sats | C14:0 | C16:0 | C16:1 | C18:0 | C18:1(Oleic) | C18:1(vaccenic) | 총 C18:1 | C18:2 | C18:3 |
5227-12 평균(n=4) | 0 | 7.21 | 0.05 | 4.00 | 0.28 | 2.06 | 71.47 | 5.27 | 76.74 | 10.92 | 3.22 |
5227-12 표준편차(n=4) | 0 | 0.21 | 0.01 | 0.09 | 0.02 | 0.10 | 0.56 | 0.29 | 0.62 | 0.29 | 0.34 |
5227-12 평균(n=3) | 1 | 6.84 | 0.05 | 3.82 | 0.25 | 1.88 | 71.99 | 4.88 | 76.87 | 11.03 | 3.33 |
5227-12 표준편차(n=3) | 1 | 0.33 | 0.01 | 0.33 | 0.03 | 0.04 | 0.50 | 0.19 | 0.32 | 0.05 | 0.31 |
5227-12 평균(n=4) | 2 | 7.00 | 0.05 | 3.96 | 0.30 | 1.91 | 70.99 | 5.09 | 76.08 | 11.62 | 3.30 |
5227-12 표준편차(n=4) | 2 | 0.29 | 0.00 | 0.47 | 0.03 | 0.40 | 1.50 | 0.25 | 1.44 | 1.21 | 0.26 |
이벤트 5227-12의 T2 성숙 종자의 FA 프로파일
식물 ID | 카피 수 | 총 Sats | C20:0 | C20:1 | C20:2 | C22:0 | C24:0 | C24:1 |
5227-12 평균(n=4) | 0 | 7.21 | 0.64 | 1.01 | 0.04 | 0.27 | 0.13 | 0.09 |
5227-12 표준편차(n=4) | 0 | 0.21 | 0.03 | 0.02 | 0.01 | 0.01 | 0.03 | 0.01 |
5227-12 평균(n=3) | 1 | 6.84 | 0.62 | 1.07 | 0.04 | 0.28 | 0.12 | 0.09 |
5227-12 표준편차(n=3) | 1 | 0.33 | 0.02 | 0.11 | 0.00 | 0.03 | 0.02 | 0.01 |
5227-12 평균(n=4) | 2 | 7.00 | 0.62 | 1.06 | 0.04 | 0.27 | 0.12 | 0.08 |
5227-12 표준편차(n=4) | 2 | 0.29 | 0.09 | 0.03 | 0.01 | 0.03 | 0.03 | 0.01 |
이벤트 5212-4의 T2 성숙 종자 FA 프로파일에서도 유사한 결과들이 얻어졌다. 이형접합 식물 종자에서, 총 포화 FA의 3.2% 감소를 야기하면서, C18:0 함유량의 5.5% 감소가 관찰되었다(표 22 및 23, 도 20). C18:1의 미세한 증가도 관찰되었다; 반면 상기 잔류 FA들의 농도는 미세한 감소를 나타내었다. FatB mRNA의 현저한 하향조절에도 불구하고, 동형접합 식물은 반접합성 식물과 비교하여 C18:0 함유량에서 더 많은 감소를 나타내지 않았다.
요약하면, ZFP TF들의 종자-특이적 발현에 의한 상기 FatB5 유전자의 전사적 하향조절은 상기 실시예들에서 입증되었다. 상기 ZFP TF들은 T2 동형접합 종자에서 상기 표적 FatB5 유전자의 전사적 하향 조절을 부여하는데 효과적이었다. 그러나, T2 동형접합 종자에서 C18:0의 감소는 T2 분리 종자보다 많지 않았다. 상기 FatB 유전자는 식물 성장 및 발달에 필수적이기 때문에, 상기 결과들은 상기 동형접합 ZFP TF 카피들이 상기 FA 프로파일을 조절하기 위한 피드백 메커니즘을 야기하고 있지 않을 수 있다는 것을 암시한다(Bonaventure et al., Plant Cells, 2003 15:1020-1033). 상기 비성숙 종자에서 ZFP TF에 의해 매개되는 FatB mRNA 하향 조절이 상기 C18:0 함유량의 변화를 위한 FatB mRNA 상향 조절과 반비례 관계에 있다는 점은 주목할 만하다.
상기 실시예들은 야생형 FatB 유전자 상에 미치는 ZFP TF의 목적하는 효과가 특이적으로 FatB mRNA 양을 변화시킴으로써, 유채에서 특이적이고 유전적인 FA 프로파일 변화를 야기한다는 점을 나타낸다.
다른 접합성 수준에서 이벤트 5212-4 T2 종자의 FA 프로파일
식물 No. | 카피 수 | %총 Sats | C14:0 | C16:0 | C16:1 | C18:0 | C18:1 | C18:2 | C18:3 |
5212-4 평균(n=5) | 0 | 7.02 | 0.05 | 3.94 | 0.32 | 1.88 | 76.03 | 11.17 | 3.50 |
5212-4 표준편차(n=5) | 0 | 0.29 | 0.01 | 0.18 | 0.02 | 0.12 | 1.44 | 1.06 | 0.56 |
5212-4 평균(n=5) | 1 | 6.79 | 0.04 | 3.83 | 0.32 | 1.81 | 76.86 | 10.74 | 3.36 |
5212-4 표준편차(n=5) | 1 | 0.19 | 0.00 | 0.07 | 0.01 | 0.17 | 0.26 | 0.31 | 0.11 |
5212-4 평균(n=5) | 2 | 6.96 | 0.04 | 3.89 | 0.32 | 1.89 | 76.38 | 11.00 | 3.38 |
5212-4 표준편차(n=5) | 2 | 0.24 | 0.00 | 0.08 | 0.01 | 0.16 | 0.81 | 0.78 | 0.30 |
다른 접합성 수준에서 이벤트 5212-4 T2 종자의 FA 프로파일
식물 No. | 카피 수 | %총 Sats | C20:0 | C20:1 | C20:2 | C22:0 | C24:0 | C24:1 |
5212-4 평균(n=5) | 0 | 7.02 | 0.64 | 1.16 | 0.04 | 0.33 | 0.20 | 0.11 |
5212-4 표준편차(n=5) | 0 | 0.29 | 0.07 | 0.06 | 0.01 | 0.04 | 0.05 | 0.01 |
5212-4 평균(n=5) | 1 | 6.79 | 0.62 | 1.11 | 0.04 | 0.31 | 0.18 | 0.10 |
5212-4 표준편차(n=5) | 1 | 0.19 | 0.05 | 0.03 | 0.00 | 0.03 | 0.02 | 0.00 |
5212-4 평균(n=5) | 2 | 6.96 | 0.63 | 1.12 | 0.05 | 0.31 | 0.21 | 0.10 |
5212-4 표준편차(n=5) | 2 | 0.24 | 0.07 | 0.05 | 0.01 | 0.03 | 0.05 | 0.01 |
본원에 언급된 모든 특허, 특허원 및 공개공보는 모든 목적을 위해, 그들의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 개시내용이 이해를 명확히 할 목적으로 예시 및 그 예로써 일부 상세히 제공되긴 하였지만, 본 개시내용의 요지 또는 범위를 벗어나지 않고서도 각종 변화 및 변형을 실시할 수 있다는 것이 당업자에게는 명백할 것이다. 따라서, 전술된 설명 및 실시예는 그로써 제한되지 않아야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> DOW AGROSCIENCES LLC et al. <120> ENGINEERED ZINC FINGER PROTEINS TARGETING PLANT GENES INVOLVED IN FATTY ACID BIOSYNTHESIS <130> 8325-4006.40 <140> PCT/US2010/002817 <141> 2010-10-22 <150> 61/279,528 <151> 2009-10-22 <160> 96 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 cgcggatccg aacactgcgt ttgctggctt tgatgaaa 38 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 ctcgagctgc tactgctagt tccggtggag gagcc 35 <210> 3 <211> 736 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 3 gaattcgccc ttcgcggatc cgaacactgc gtttgctggc tttgatgaaa atcttttgac 60 gtctccacgc acgagtttac gcatcccaga cgcctcctta gagagaagag agagatcgag 120 atcgatttcc tccctcttaa acctctctct ctctcgtgaa tctcatttcc ctttgccgct 180 agattctctc ttcacccttt tctcgccctt ccttcctctc ctcattactt ttttgtcgtc 240 ttctgctctc tctctctctc agcactcttc gccatggtgg gtgctgctgc gtcttcctgt 300 tacgcatctc cgctatgcac ctggttc gtc gccgcctgca tgtccgtctc ccacggcggc 360 ggagattccc gacaagccgt cgctctcaaa tctaccgggc ggagtcgtcg aagcagacaa 420 cagctcacca aatgctctgg atccggtagc agcactactt cctttgggcc ttgcaatcac 480 tacaatgcct tgtcttctct cttcggatcg aactctgttt ctctcaatcg aaaccagagg 540 aggttgactc gagctgctac tgctagttcc ggtggaggag ccatggctgt tgcgatggat 600 atggaaaagg aagccaaggt tgacaacaaa cctcctacgg agcagcgccg ggttgttgtg 660 acaggcatgg gagttgaaac atcactaggt catgaccctg acacctttta tgagaatctc 720 ctacaagggc gaattc 736 <210> 4 <211> 732 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 4 gaattcgccc ttcgcggatc cgaacactgc gtttgctggc tttgatgaaa atgtatgtat 60 cttttgacgt ctccacgtac gagtttacgc atccagacgc ctcgttagag agaagagaga 120 gatcgagatc gagatcgaga tcgatttcct ccctctctct ctcgtgaatc tcatttcccc 180 ttaccgctag attctctctt cacccttttc tcgcccttcc ttctcctcat tatttttttg 240 tcgtcttctg ctctctcaca gcactcttct ctttagctat ggtgggtggt gctgcgtctt 300 cttcctgtta cgcatctccg ctatgcacct ggttcgtcgc tgcttgcatg tccgtctccc 360 acggcggcgg agattcccga caagccgtct ccctcaaa tc taccgggcgg agtcgtcgaa 420 gcagacgaca gctcaccaaa tgcttggctc tttctggatc cggtagcgtt caggaggctc 480 tcgtcactac ttcctttggg ccttgcaatc actacaatgc cttgtcttct ctcttcggat 540 cgaactctgt ttctctcaat cgaaaccaga ggaggttgaa tctggctgct gctagttccg 600 gtggaggagc catggctgtt gcgatggata tgcaaaagga agccaaggtt gacaacaaac 660 cccctacgga gcagcgccgt gttgtggtga caggcatggg agttgaaaca tcactaggtc 720 aagggcgaat tc 732 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Val 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Gln Lys Ile Asn Leu Gln Val 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 7 Arg Ser Asp Thr Leu Ser Glu 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 8 Thr Arg Ser Ser Arg Ile Asn 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 9 Arg Ser Asp Ala Leu Ala Arg 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 10 Arg Ser Asp His Leu Ser Ala 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 11 Thr Ser Ser Ser Arg Ile Asn 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 12 Arg Ser Asp Asn Leu Ala Arg 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 13 Asp Arg Ser His Leu Ala Arg 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 14 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Glu 1 5 <210> 15 <211 > 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Arg Asn Ala His Arg Thr Thr 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Gln Ser Gly Asn Leu Ala Arg 1 5 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Arg Ser Asp His Leu Ser Glu 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Gln Lys Ala Asn Arg Thr Lys 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Arg Ser Asp Asp Leu Thr Arg 1 5 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Thr Ser Ala 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 27 ctaccgggcg gagtcgt 17 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 28 ttgactcgag ctgctactgc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 29 tttccatatc catcgcaaca 20 <210> 30 <211> 447 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 30 actcagcact cttcgccatg gtgggtgctg ctgcgtcttc ctgttacgca tctccgctat 60 gcacctggtt cgtcgccgcc tgcatgtccg tctcccacgg cggcggagat tcccgacaag 120 ccgtcgctct caaatctacc gggcggagtc gtcgaagcag acaacagctc accaaatgct 180 ctggatccgg tagcagcact acttcctttg ggccttgcaa tcactacaat gccttgtctt 240 ctctcttcgg atcgaactct gtttctctca atcgaaacca gaggaggttg actcgagctg 300 ctactgctag ttccggtgga ggagccatgg ctgttgcgat ggatatggaa aaggaagcca 360 aggttgacaa caaacctcct acggagcagc gccgggttgt tgtgacaggc atgggagttg 420 aaacatcact aggtcaaggg cgaattc 447 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 31 acagcgattg cctacaagg 19 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 32 agatggttaa gatcaccaaa gg 22 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 33 aaggaagagg aaggagtcta acag 24 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 34 cttctgctct ccaccgta 18 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 35 ggtcaacgga tcaggatatt cttg 24 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 36 ccatgttggc aaaggcaacc 20 <210> 37 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic prime r <400> 37 acaagagtgg attgatgatc tagagaggt 29 <210> 38 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 38 ctttgatgcc tatgtgacac gtaaacagt 29 <210> 39 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 39 ccagcgtaag caataccagc cacaacacc 29 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 40 cctctctacc accgtctcac atg 23 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 41 gatctggccg gactgtttca 20 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 42 cgctcctcag ctaccacctc aacca 25 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 43 tcgatcttga tatgttggga ga 22 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 44 aggtgcagaa tcatgtggtg 20 <210> 45 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 45 ttgatggtga agatgt 16 <210> 46 <211> 718 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 46 gaattcgccc ttcgcggatc cgaacactgc gtttgctggc tttgatgaaa gcttgtatgt 60 atgtatcttt tgacgtctcc acgtacgagt ttacgcatcc agacgcctcg ttagagagaa 120 gagrgagatc gagatcgaga tcgagatcga tttcctccct ctctctctcg tgaatctcat 180 ttccccttac cgctagattc tctcttcacc cttttctcgc ccttccttct cctcattatt 240 tttttgtcgt cttctgctct ctcwcakcwc tcwkcwctct tmgcyatggt gggtgstgct 300 gcgtcttctt cctgttacgc atctccgcta tgcacctggt tcgtcgcygc ytgcatgtcc 360 gtctcccacg gcggcggaga ttcccgacaa gccgtckcyc tcaaatctac cgggcggagt 420 cgtcgaagca gacaacagct caccaaatgc tctggatccg gtagcagcac tacttccttt 480 gggccttgca atcactacaa tgccttgtct tctctcttcg gatcgaactc tgtttctctc 540 aatcgaaacc agagg aggtt gamtcgwgct gctrctgcta gttccggtgg aggagccatg 600 gctgttgcga tggatatgca aaaggaagcc aaggttgaca acaaaccccc tacggagcar 660 cgccgtgttg tggtgacagg catgggagtt gaaacatcac taggtcaagg gcgaattc 718 <210> 47 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 47 aacgaaagga gatcgagaga ggagagag 28 <210> 48 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 48 cgaaagggag atcgagagag gcaccgca 28 <210> 49 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 49 aaggagaact ttagggtttg gggagact 28 <210> 50 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 50 aaggagaatt ttagggtttg gggagact 28 <210> 51 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleot ide <400> 51 ctccgaagag attggcgtaa cacttcgt 28 <210> 52 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 52 ctccgaagag attggcgtaa ccttcatt 28 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 53 ctttgaacgc ttatcttcct c 21 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 54 ttccacaaca tctccccaag 20 <210> 55 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 55 ctcaggctcc accc 14 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 56 ctttgaaagc tcatcttcct c 21 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of 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64 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : Synthetic primer <400> 64 cgcctgggtt tccagtca 18 <210> 65 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 65 aaggatgtgt tcgtggattt ca 22 <210> 66 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 66 cacaatctgc tgtgcagtat caag 24 <210> 67 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 67 gcgggcggga gttgtta 17 <210> 68 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 68 ccccatcggc gttacatg 18 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 69 gaagctgaga acagcgattg c 21 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 70 gttcctcctc ccaacgaatg 20 <210> 71 <211> 14 <212> DN A <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 71 tttctcagcc gcca 14 <210> 72 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 72 tagggaagag tggaagct 18 <210> 73 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 73 caggcctcag cctt 14 <210> 74 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 74 tacaaggttt ccaagttt 18 <210> 75 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 75 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Ala 1 5 <210> 76 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 76 Gln Ser Ala His Arg Lys Thr 1 5 <210> 77 <211> 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