표적화된 단일가닥 분할 및 표적화된 통합을 위한 방법 및 조성물

표적화된 단일가닥 분할 및 표적화된 통합을 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETED SINGLE-STRANDED CLEAVAGE AND TARGETED INTEGRATION}

본 발명은 게놈 조작 (engineering), 유전자 표적화, 표적화된 염색체 통합 및 단백질 발현의 분야에 관한 것이다.

특히 다수의 게놈의 완전한 뉴클레오타이드 서열의 결정에 비추어서 게놈 생물학에서 주된 관심 도메인은 게놈 서열의 표적화된 변화이다.

디자인된 DNA 결합 단백질 (예를 들어, FokI 로부터 유래하는 것과 같은 뉴클레아제 분할 도메인에 연결된 아연-핑거 (finger) 단백질 (ZFP))에 뉴클레아제의 분할 (cleavage) 도메인을 연결하는 인공 뉴클레아제가 진핵성 세포 내에서 표적화된 분할을 위해서 사용되었다. 예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제 매개된 게놈 편집은 (1) 생존 세포의 게놈 내의 원하는 변형을 위한 표적 부위에서 특이적으로 이중가닥 파손 (double-strand break; DSB)의 발생에 의해서, 및 (2) DNA 수복의 자연적 기전이 이러한 파괴를 "치유"하도록 함으로써 특이적 위치에서 인간 게놈의 서열을 변형시키는 것으로 나타났다.

특이성을 증가시키기 위해서, 분할 현상은 DNA를 결합시키면 다이머화하여 촉매적으로 활성인 뉴클레아제 복합체를 형성하는, 맞춤 디자인된 (custom-designed) 아연 핑거 뉴클레아제의 하나 또는 그 이상의 쌍을 사용하여 유도된다. 또한, 특이성은 단지 헤테로다이머 (heterodimer)의 형성에 의해서만 이중가닥 DNA를 분할하는 조작된 분할 반 (half)-도메인을 포함하는 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFNs)의 하나 또는 그 이상의 쌍을 사용함으로써 더 증가된다 [예를 들어, 본 발명에 온전히 참고로 포함된 미국 특허공보 제20080131962호 참조].

인공 뉴클레아제에 의해서 발생된 이중가닥 파손 (DSB)는 예를 들어, 표적화된 돌연변이유발을 유도하고, 세포 DNA 서열의 표적화된 결실을 유도하며, 예정된 염색체 유전자좌 (chromosomal locus)에서 표적화된 재조합을 촉진시키기 위해서 사용되어 왔다 [예를 들어, 기술내용이 모든 목적으로 본 발명에 온전히 참고로 포함된 미국 특허공보 제20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; 20070218528; 20070134796; 20080015164호 및 국제공보 제WO 07/014275 및 WO 2007/139982호 참조]. 따라서, 표적 게놈 위치에서 DSB를 생성시키는 능력은 어떤 게놈의 게놈 편집을 가능하게 한다.

DSB를 수복하는 두 가지의 주된 별개의 경로가 있으며, 즉 동종성 재조합 및 비-동종성 말단-접합 (NHEJ)이다. 동종성 재조합은 세포 수복과정을 인도하기 위한 주형 (예를 들어, "공여체")으로서 동종성 서열의 존재를 필요로 하며, 수복의 결과는 오류가 없고 예측할 수 있다. 동종성 재조합을 위한 주형 (또는 "공여체") 서열의 부재 하에서, 세포는 전형적으로 비-동종성 말단-접합 (NHEJ)의 예측할 수 없으며 오류-경향이 있는 과정을 통해서 DSB의 수복을 시도한다.

DNA 닉 (nicks)을 포함하는 단일가닥 파손 (SSBs)은 내인성인 반응 산소종에 의해서, 및 DNA 수복 및 복제와 같은 DNA 대사 중에 생산된 가장 빈번한 손상 중의 하나이다 [참조: McKinnon et al . (2007) Annu Rev Genomics Hum Genet 8:37-55; Okano et al . (2003) Mol Cell Biol 23:3974-3981]. 비-세포소멸성 세포의 염색체는 전체 게놈 전체에 걸쳐 약 50 kb 간격으로 위치하는 단일가닥 불연속성 (SSBs/닉)을 함유한다 [참조: 예를 들어, Szekvolgyi et al . (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104:14964-14969]. 대부분의 SSB/닉은 폴리 (ADP-리보즈) 폴리머라제-1 (PARP-1)에 의한 SSB 검출, 다양한 효소에 의한 DNA 말단 처리, DNA 폴리머라제에 의한 DNA 갭 충진, 및 DNA 리가제에 의한 DNA 결찰 (ligation)인 4개의 기본적 단계로 구분될 수 있는 빠른 포괄적 SSB 수복 과정에 의해서 수복된다 [참조: Caldecott, KW (2008) Nat Rev Genet 9, 619-31]. 문헌 [Lee et al . (2004) Cell 117:171-184]에는 돌연변이된 RAG 단백질에 의해서 유도된 닉이 포유동물에서 상동성-지시된 수복 (homology-directed repair; HDR)을 개시한다는 것을 시사하는 데이터를 제공하였다.

그러나, ZFNs가 SSBs/닉을 유도하도록 조작될 수 있다거나, 또는 이들 SSBs/닉이 동종성 재조합에 의해서 수복될 수 있다거나, 또는 이들을 사용하여 동종성 재조합을 통해서 이식유전자의 표적화된 통합을 촉진시킬 수 있다는 것은 이전에 밝혀지지 않았다. 따라서, 이중가닥 DNA 내에 단일가닥 파손 (닉)을 생성시키고, 포유동물/인간 세포 내에서 오류-경향의 NHEJ 수복을 동시에 발생시키지 않으면서 닉 부위에서 동종성 재조합에 의해 표적화된 통합을 촉진시키는 방법 및 조성물에 대한 필요성이 있다.

발명의 요약

본 발명에는 관심이 있는 이중가닥 표적 서열 내에서 표적화된 단일가닥 파손을 유도하는 방법 및 조성물이 기술된다. 또한, 표적의 단일가닥 분할 후에 동종성 재조합 및 표적화된 통합을 촉진시키는 방법이 기술된다. 따라서, 게놈의 표적화된 변조가 기술된다.

하나의 관점에서는, 원하는 이중가닥 표적 서열 내에서 단일가닥 절단을 생성시키는 인공 (천연적으로 존재하지 않는) 뉴클레아제가 제공된다. 본 발명에 기술된 뉴클레아제는 DNA 결합 도메인 (예를 들어, 조작된 아연 핑거 단백질) 및 적어도 하나의 분할 도메인 또는 적어도 하나의 분할 반-도메인을 포함한다. 특정의 구체예에서, 뉴클레아제는 어떤 선택된 서열 (예를 들어, 유전자)을 결합시키도록 조작된 아연 핑거 도메인을 포함하는 아연 핑거 뉴클레아제이다. 본 발명에 기술된 아연 핑거 단백질 중의 어떤 것이라도 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상의 아연 핑거를 포함할 수 있으며, 각각의 아연 핑거는 선택된 서열(들) (예를 들어, 유전자(들)) 내의 표적 서브사이트 (subsite)에 결합하는 인식 나선 (recognition helix)을 갖는다. 분할 도메인은 어떤 뉴클레아제로부터라도 유도될 수 있으며, 예를 들어, 분할 반-도메인은 FokI 과 같은 타입 IIS 뉴클레아제로부터 유도된다. 특정의 구체예에서, 분할 반-도메인은 또 다른 분할 반-도메인 (예를 들어, 다이머화 도메인 내의 조작되거나 야생인 형태)과의 헤테로다이머를 형성하는 조작된 FokI 분할-반 도메인을 포함한다. 추가의 구체예에서, 분할 도메인 (예를 들어, 조작된 FokI 분할 반-도메인)은 뉴클레아제 도메인의 촉매적 도메인 (효소적 활성)을 불활성화하는 돌연변이를 포함한다.

또 다른 관점에서, 본 발명에서는 각각의 뉴클레아제가 아연 핑거 도메인 및 FokI 분할 반-도메인을 포함하는 아연 핑거 뉴클레아제의 쌍을 포함하는 복합체 및/또는 조성물이 제공되며, 여기에서 분할 반-도메인은 다이머 (호모다이머 또는 헤테로다이머)를 형성한다. 특정의 구체예에서, 쌍 중의 하나의 아연 핑거 뉴클레아제는 제1 촉매적 활성 조작된 분할-반 도메인을 포함하고, 다른 아연 핑거 뉴클레아제는 제2 촉매적 불활성 조작된 분할 반-도메인을 포함하며, 여기에서 제 1 및 2 조작된 분할 반-도메인은 편성 (obligate) 헤테로다이머를 형성한다.

또 다른 관점에서, 본 발명에 기술된 뉴클레아제 중의 어떤 것을 코드화한 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.

또 다른 관점에서는 또한, 본 발명에 기술된 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드 중의 어떤 것을 포함하는 분리된 세포가 제공된다. 특정의 구체예에서는, 외인성 서열이 표적화된 변화를 통해서 도입된 세포주가 제공된다. 특정의 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 선택된 유전자(들)는 이들 세포주 내에서 불활성화된다 (부분적으로 또는 완전히). 다른 구체예에서, 세포 또는 세포주는 세포 내로 안정적으로 또는 일시적으로 도입된 하나 또는 그 이상의 전사되고/되거나 해독된 외인성 서열을 포함한다. 이러한 세포주는 세포주 내에서 본 발명에 기술된 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드 중의 어떤 것을 포함하는 세포를 배양하여 선택된 유전자(들)의 불활성화를 야기함으로써 생성된다.

또한, 세포 내로 안정적으로 또는 일시적으로 도입된 하나 또는 그 이상의 전사되고/되거나 해독된 외인성 서열을 포함하는 이식유전자 유기체가 제공된다. 추가로, 본 발명에 제공된 방법에 의해서 선택적으로 불활성화된 유전자(들)를 함유하는 이식유전자 유기체, 또는 내인성 서열의 발현을 변화시킬 수 있는 외인성 서열을 함유하는 유기체가 제공된다. 본 발명에 기술된 것으로서 이식유전자 유기체는 식물 (예를 들어, 농작물 또는 담배 스트레인 (strain)) 또는 동물 (예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 어류 등)일 수 있다. 특정의 구체예에서는, 이식유전자 유기체를 사용하여 본 발명에 기술된 바와 같은 뉴클레아제를 코드화한 하나 또는 그 이상의 서열 및/또는 하나 또는 그 이상의 외인성 서열 (예를 들어, 본 발명에 기술된 바와 같은 뉴클레아제를 사용한 표적화된 통합을 통해서 게놈 내로 삽입된 서열)을 갖는 유기체의 라인을 생성시킨다. 예를 들어, 본 발명에는 유도성 프로모터의 조절 하에 본 발명에 기술된 바와 같은 뉴클레아제를 포함하는 이식유전자 식물 및 식물 라인이 기술된다. 따라서, 뉴클레아제를 코드화한 에피좀 또는 통합된 서열을 포함하는 이식유전자 식물 및 식물 라인은 식물에서 원하는 시간에 및/또는 식물의 원하는 조직에서 발현될 수 있다.

또한, 세포 내에서 표적 이중가닥 서열 내에 특이적 단일가닥 파손을 생성시키는 방법이 제공된다. 특정의 구체예에서, 이 방법은 뉴클레아제의 하나 또는 그 이상의 쌍 (뉴클레아제를 코드화한 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드(들))을 세포 내로 도입시키는 것을 수반한다. 각각의 뉴클레아제 쌍은 제1 DNA 결합 도메인 및 제1 촉매적 활성 분할-반 도메인을 갖는 제1 뉴클레아제 및 제2 DNA 결합 도메인 및 제2 촉매적 활성 분할-반 도메인을 갖는 제2 뉴클레아제를 포함한다. 뉴클레아제의 하나 또는 그 이상의 쌍은 각각의 쌍의 제1 및 2 분할 반-도메인이 다이머를 형성하고, 표적 서열 내에 단일가닥 파손을 생성시키도록 하는 조건 하에서 세포 내로 도입된다.

특정의 구체예에서, 제1 및/또는 2 DNA 결합 도메인은 아연 핑거 단백질 (예를 들어, 조작된 아연 핑거 단백질)을 포함한다. 더구나, 본 발명에 기술된 방법 중의 어떤 것에서나 제1 및 2 분할 반-도메인은 FokI 분할 반-도메인, 예를 들어, 편성 헤테로다이머를 형성하도록 조작된 FokI 분할 반-도메인을 포함할 수 있다. 표적 서열은 어떤 이중가닥 서열이라도 될 수 있으며, 예를 들어, 게놈 서열 또는 그의 일부분과 같은 세포성 크로마틴 내의 서열일 수 있다. 또한, 표적 서열은 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 내의 염색체외 이중가닥 DNA 서열일 수 있다. 유사하게, 표적 서열은 진균 세포, 식물 세포, 동물 세포, 포유동물 세포, 영장류 세포 및 인간 세포와 같은 원핵성 및 진핵성 세포를 포함하는 모든 세포 타입 내의 것일 수 있다.

단일가닥 파손의 부위는 촉매적으로 활성인 뉴클레아제가 결합하거나 이것이 인접할 수 있는 (예를 들어, 결합 부위의 근접 가장자리로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드만큼 떨어져 있는) 서열과 일치할 수 있다. 융합 단백질은 예를 들어, 융합 단백질을 세포에 전달하고/하거나 하나 또는 그 이상의 뉴클레아제를 코드화한 폴리뉴클레오타이드를 세포에 전달함으로써 세포 내에서 발현될 수 있으며, 여기에서 폴리뉴클레오타이드는 DNA인 경우에 mRNA로 전사된 다음에 융합 단백질로 해독된다. 대신으로, RNA 분자는 세포에 전달된 다음에 해독되어 융합 단백질을 생성시킬 수 있다. 세포에 대한 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 전달 방법은 본 발명의 다른 곳에서 제시된다.

표적화된 재조합을 위한 방법 (예를 들어, 염색체 내에서 또는 세포성 크로마틴 내의 관심이 있는 부분에서 서열의 변화 또는 치환)이 또한 제공된다. 예를 들어, 돌연변이체 게놈 서열은 예를 들어, 유전자 질환 또는 유전적 장애의 치료를 위해서 야생형 서열에 의해서 치환될 수 있다. 또한, 야생형 게놈 서열은 예를 들어, 종양유전자 생성물 또는 부적절한 염증성 반응에 수반되는 유전자의 생성물의 기능을 방지하기 위해서 돌연변이체 서열에 의해서 치환될 수 있다. 더구나, 유전자의 하나 또는 그 이상의 대립인자는 하나 또는 그 이상의 상이한 대립인자에 의해서 치환될 수 있다 (예를 들어, 이대립인자 (biallelic) 표적화된 통합).

본 발명의 방법에서, 본 발명에 기술된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 표적화된 뉴클레아제는 예정된 부위에서 표적 서열 (예를 들어, 세포성 크로마틴) 내에 단일가닥 파손을 발생시키며, 파손의 부분에서의 뉴클레오타이드 서열에 대한 상동성을 갖는 "공여체" 폴리뉴클레오타이드는 세포 내로 도입될 수 있다. 단일가닥 파손의 존재는 공여체 서열의 통합을 촉진시키는 것으로 본 발명에서 나타났다. 공여체 서열은 물리적으로 통합될 수 있거나, 대신으로 공여체 폴리뉴클레오타이드는 동종성 재조합을 통한 파손의 수복을 위한 주형으로 사용되어 공여체에서와 같이 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부의 세포성 크로마틴 내로의 도입을 제공한다. 따라서, 세포성 크로마틴 내의 제1 서열은 변화될 수 있으며, 특정의 구체예에서는 공여체 폴리뉴클레오타이드 내에 존재하는 서열로 전환될 수 있다. 따라서, 용어 "치환시키다" 또는 "치환"의 사용은 하나의 뉴클레오타이드의 또 다른 것에 의한 치환 (즉, 정보적 의미에서 서열의 치환)을 나타내는 것으로 이해될 수 있으며, 하나의 폴리뉴클레오타이드의 또 다른 것에 의한 물리적 또는 화학적 치환을 반드시 필요로 하지는 않는다.

또한, 세포성 크로마틴 내의 관심이 있는 부분 (예를 들어, 게놈 서열)을 제1 뉴클레오타이드 서열로 치환시키는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 제1 아연 핑거 결합 도메인을 관심이 있는 부분 내의 제2 서열에 결합하도록 조작하고; (b) 제2 아연 핑거 결합 도메인을 제공하여 관심이 있는 부분 내의 제3 서열에 결합시키고; (c) 제1 아연 핑거 결합 도메인 및 제1 촉매적 활성 분할 반-도메인을 포함하는 제1 융합 단백질을 세포 내에서 발현시키고; (d) 제2 아연 핑거 결합 도메인 및 제2 촉매적 활성 분할 반-도메인을 포함하는 제2 융합 단백질을 세포 내에서 발현시키고; (e) 세포를 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 접촉시킴으로써 (여기에서, 제1 융합 단백질은 제2 서열에 결합하고, 제2 융합 단백질은 제3 서열에 결합한다) 단일가닥 파손이 관심이 있는 부분에서 세포성 크로마틴 내에 만들어지고, 관심이 있는 부분 내의 뉴클레오타이드 서열은 제1 뉴클레오타이드 서열에 의해서 치환되도록 분할 반-도메인을 위치시키는 것을 포함한다. 특정의 구체예에서, 세포성 크로마틴 내의 단일가닥 파손은 제2 및 3 서열 사이의 부위에서 관심이 있는 부분에 만들어진다. 아연 핑거 뉴클레아제는 단백질로서 및/또는 상기 아연 핑거 뉴클레아제(들)를 코드화한 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오타이드로서 세포에 제공될 수 있다. 예를 들어, 각각이 2 개의 융합 단백질 중의 하나를 코드화한 서열을 포함하는 2 개의 폴리뉴클레오타이드가 세포 내에 도입될 수 있다. 대신으로, 2 개의 융합 단백질 모두를 코드화한 서열을 포함하는 단일 폴리뉴클레오타이드가 세포 내로 도입될 수 있다.

본 발명에 기술된 방법 중의 어떤 것에서라도, 아연 핑거 단백질의 추가의 쌍이 세포 내의 추가의 표적 부위의 추가의 이중가닥 및/또는 단일가닥 분할을 위해서 사용될 수 있다.

따라서, 하나의 구체예에서 세포성 크로마틴 내의 관심이 있는 부분 (예를 들어, 게놈 서열)을 제1 뉴클레오타이드 서열로 치환시키는 방법은 (a) 제1 아연 핑거 결합 도메인을 관심이 있는 부분 내의 제2 서열에 결합하도록 조작하고; (b) 제2 아연 핑거 결합 도메인을 제공하여 제3 서열에 결합시키고; (c) 세포를 (i) 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드; (ii) 제1 아연 핑거 결합 도메인 및 제1 촉매적 활성 분할 반-도메인을 포함하는 제1 융합 단백질을 코드화한 제2 폴리뉴클레오타이드; 및 (iii) 제2 아연 핑거 결합 도메인 및 제2 촉매적 활성 분할 반-도메인을 포함하는 제2 융합 단백질을 코드화한 제3 폴리뉴클레오타이드와 접촉시킴으로써 (여기에서, 제1 및 2 융합 단백질은 발현되고, 제1 융합 단백질은 제2 서열에 결합하며, 제2 융합 단백질은 제3 서열에 결합한다) 단일가닥 파손이 관심이 있는 부분에서 세포성 크로마틴 내에 만들어지고, 관심이 있는 부분은 제1 뉴클레오타이드 서열에 의해서 치환되도록 분할 반-도메인을 위치시키는 것을 포함한다

세포성 크로마틴 내의 관심이 있는 부분에서 서열의 표적화된 재조합 및/또는 치환 및/또는 변화를 위한 방법의 바람직한 구체예에서, 염색체 서열은 외인성 "공여체" 뉴클레오타이드 서열과의 동종성 재조합에 의해서 변화된다. 이러한 동종성 재조합은 파손의 부분에 대해서 동종성인 서열이 존재한다면 세포성 크로마틴 내의 단일가닥 파손의 존재에 의해서 자극된다. 특히, 세포성 크로마틴 내의 단일가닥 파손은 비-동종성 말단 접합의 세포성 기전을 자극하지 않는다.

본 발명에 기술된 방법 중의 어느 것에서나, 제1 뉴클레오타이드 서열 ("공여체 서열")은 관심이 있는 부분 내의 게놈 서열에 대해서 동종성이지만 동일하지 않은 서열을 함유함으로써 관심이 있는 부분에 비-동일 서열을 삽입하는 동종성 재조합을 자극할 수 있다. 따라서, 특정의 구체예에서 관심이 있는 부분 내의 서열에 대해 동종성인 공여체 서열의 부분은 치환된 게놈 서열에 대해 약 80 내지 99% (또는 이들 사이의 어떤 정수) 서열 동일성을 나타낸다. 다른 구체예에서, 예를 들어, 100개의 인접한 염기쌍을 초과하는 공여체 및 게놈 서열 사이에서 단지 1 개의 뉴클레오타이드가 다르다면, 공여체와 게놈 서열 사이의 상동성은 99%보다 크다. 특정의 경우에, 공여체 서열의 비-동종성 부분은 관심이 있는 부분에 존재하지 않는 서열을 함유할 수 있어서, 새로운 서열이 관심이 있는 부분에 도입된다. 이들 경우에, 비-동종성 서열은 일반적으로, 50-1,000 염기쌍 (또는 이들 사이의 어떤 정수 값) 또는 1,000개보다 많은 어떤 수의 염기쌍의 서열, 예를 들어, 관심이 있는 부분 내의 서열과 동종성이거나 동일한 인공 염색체 내에 존재하는 것과 같은 서열이 측면에 배치된다. 다른 구체예에서, 공여체 서열은 제1 서열에 대해서 비-동종성이며, 비-동종성 재조합 기전에 의해서 게놈 내로 삽입된다.

본 발명에 기술된 방법 중의 어떤 것이라도 관심이 있는 유전자(들)의 발현을 붕괴시키는 공여체 서열의 표적화된 통합에 의한 세포 내의 하나 또는 그 이상의 표적 서열의 부분적이거나 완전한 불활성화를 위해서 사용될 수 있다. 부분적이거나 완전히 불활성화된 유전자를 갖는 세포주가 또한 제공된다. 또한 추가로, 부분적이거나 완전히 불활성화된 유전자를 갖는 식물 세포 라인을 사용하여 이식유전자 식물을 생성시킬 수 있다. 본 발명에 기술된 바와 같은 뉴클레아제를 포함하는 식물 세포 라인 (여기에서, 뉴클레아제의 발현은 유도성 프로모터에 의해서 구동된다)이 또한 제공된다. 마찬가지로, 부분적이거나 완전히 불활성화된 유전자를 갖는 난모세포와 같은 포유동물 생식세포를 사용하여 이식유전자 동물을 생성시킬 수 있다.

더구나, 본 발명에 기술된 바와 같은 표적화된 통합의 방법을 또한 사용하여 하나 또는 그 이상의 외인성 서열을 통합시킬 수 있다. 외인성 핵산 서열은 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 유전자 또는 cDNA 분자, 또는 코드화 또는 비코드화 서열의 모든 타입뿐만 아니라 하나 또는 그 이상의 조절 요소 (예를 들어, 프로모터)를 포함할 수 있다. 또한, 외인성 핵산 서열은 하나 또는 그 이상의 RNA 분자 (예를 들어, 작은 헤어핀 RNA (shRNA), 억제성 RNA (RNAi), 마이크로RNA (miRNA) 등)를 생산할 수 있다.

본 발명에 기술된 세포, 세포 라인 및 방법 중의 어떤 것에서나, 세포 또는 세포 라인은 COS, CHO (예를 들어, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (예를 들어, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), PerC.6® (Crucell); EBx™ (Sigma-Aldrich Group), 스포도프테라 푸지페르다 ( Spodoptera fugiperda (Sf))와 같은 곤충 세포, 또는 사카로마이세스 ( Saccharomyces ) , 피치아 ( Pichia ) 및 스키조사카로마이세스 ( Schizosaccharo - myces )와 같은 진균 세포일 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 본 발명에 기술된 바와 같은 방법을 수행하기 위한 본 발명에 기술된 하나 또는 그 이상의 뉴클레아제 (또는 이들 뉴클레아제를 코드화한 폴리뉴클레오타이드)를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 임의로 시약, 완충제, 세포, 적합한 용기, 및 설명서를 포함할 수 있다.

이들 및 그 밖의 다른 관점은 전체로서의 기술내용에 비추어 숙련된 전문가에게 쉽게 명백할 것이다.

도 1 은 불활성화된 분할 도메인을 포함하는 예시적인 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 구조를 도시한 개략도이다. ZFN 쌍은 단지 하나의 DNA 스트랜드를 분할하여 또한 닉으로도 불리는 단일가닥 파손 (SSBs)을 형성한다.
도 2, 패널 A 내지 C 는 아연 핑거 뉴클레아제의 쌍을 사용한 이중가닥 표적의 단일가닥 분할을 도시한 것이며, 여기에서 하나의 뉴클레아제는 뉴클레아제 도메인의 분할 활성을 불활성화시키도록 돌연변이된 분할 도메인을 포함한다.
도 2a는 표시된 ZFN 쌍에 의한 표적 기질의 분할에 의해서 수득된 이중가닥 분할 생성물의 분석을 도시한 것이다. 왼쪽에서 오른쪽으로, 레인은 분자량 래더 (ladder), 대조군, 본 출원에서 야생형 8196zKK8267EL (WT)로 불리는, 8196zKK:8267EL로 명시된 CCR5-표적화된 ZFN 쌍 (여기에서, KK 및 EL은 편성 헤테로다이머를 형성하여 이중가닥 파손을 생성시키는 조작된 분할 도메인을 나타낸다) (참조: 미국 특허공보 제2008/0131962호); 8196zKK:8267EL로 명시된 CCR5-표적화된 ZFN 쌍 (여기에서, 8267EL 단백질은 또한 ZFN 쌍의 하나의 분할 반-도메인을 불활성화하는, 하나의 분할 반-도메인의 촉매적 도메인의 위치 450 (D450N)에서 돌연변이를 함유한다); 8196zKK:8267EL로 명시된 CCR5-표적화된 ZFN 쌍 (여기에서, 8267EL 단백질은 또한 ZFN 쌍의 하나의 분할 반-도메인을 불활성화하는, 촉매적 도메인 내의 위치 467 (D467A)에서 돌연변이를 함유한다); 제2 분자량 래더, 제2 대조군; 본 출원에서 야생형 8267RD:8196zDR (WT)로 불리는, 8267RD:8196zDR로 명시된 CCR5-표적화된 ZFN 쌍 (여기에서, RD 및 DR은 편성 헤테로다이머를 형성하는 조작된 분할 도메인을 나타낸다) (참조: 미국 특허공보 제2008/0131962호); 8267RD:8196zDR로 명시된 CCR5-표적화된 ZFN 쌍 (여기에서, 8196zDR 단백질은 또한 ZFN 쌍의 하나의 분할 반-도메인을 불활성화하는, 하나의 분할 반-도메인의 촉매적 도메인의 위치 450 (D450N)에서 돌연변이를 함유한다); 8267RD:8196zDR로 명시된 CCR5-표적화된 ZFN 쌍 (여기에서, 8196zDR 단백질은 또한 ZFN 쌍의 하나의 분할 반-도메인을 불활성화하는, 촉매적 도메인의 위치 467 (D467A)에서 돌연변이를 함유한다)을 나타낸다.
도 2b는 표시된 ZFN 쌍에 의한 표적 기질의 분할에 의해서 수득된 단일가닥 분할 생성물의 분석을 도시한 것이다. 도 2a에 관하여 상술한 바와 같이 왼쪽으로부터 오른쪽으로 레인은 분자량 래더, 대조군, 8196zKK:8267EL (WT)로 명시된 CCR5-표적화된 ZFN 쌍; 8196zKK:8267EL (D450N)로 명시된 CCR5-표적화된 ZFN 쌍; 8196zKK:8267EL (D467A)로 명시된 CCR5-표적화된 ZFN 쌍; 제2 분자량 래더, 제2 대조군; 8267RD:8196zDR (WT)로 명시된 CCR5-표적화된 ZFN 쌍; 8267RD:8196zDR (D450N)로 명시된 CCR5-표적화된 ZFN 쌍; 및 8267RD:8196zDR (D467A)로 명시된 CCR5-표적화된 ZFN 쌍을 나타낸다.
도 2c는 어떤 밴드가 다양한 DNA 절편 상의 방사성라벨 (radiolabel)의 위치에 기인한 자가방사기록 분석에서 검출될 것인지를 보여주는 것으로서, 본 발명에 기술된 바와 같은 돌연변이체 분할 도메인을 사용하는 가능한 분할 패턴을 도시한 개략도이다.
도 3, 패널 A 내지 E 는 HDR-의존성 단일가닥 어니일링 (annealing) (SSA) 경로에 의한 K562 세포 내의 ZFN 유도된 SSB/닉의 수복을 도시한 것이다. K562 세포는 미처리되거나 (미처리, 도 3a), 도 2a에 상술한 바와 같은 ZFN 발현 플라스미드의 부재 (무 ZFN, 도 3b) 또는 존재 하에서 SSA-GFP 리포터 DNA 플라스미드로 형질감염되었다: 8196zKK:8267EL로 명시된 CCR5-표적화된 ZFN 쌍 (WT, 도 3c); 8196zKK:8267EL로 명시된 CCR5-표적화된 ZFN 쌍 (D450N, 도 3d); 8196zKK:8267EL로 명시된 CCR5-표적화된 ZFN 쌍 (D467A, 도 3e). 세포는 형질감염-후 3일에 수집하고, 프로피듐 아이오다이드 (PI)와 5 분 배양하여 비-생존 세포 (PI ⁺ )를 염색한 후에 유동 세포계수 분석에 적용하였다. GFP 공여체 서열은 닉 부위의 측면에 있는 부분에 대해서 동종성인 CCR5 서열이 측면에 있기 때문에, CCR5 유전자에서 파손 내로 GFP 공여체 서열을 통합시키는 것은 HDR-의존성 경로를 통해서 일어난다. 따라서, 관찰된 GFP 형광 시그날의 증가는 공여체 서열의 표적화된 통합이 일어났음을 나타내었다. 각각의 4분부 (quadrant)에서 세포의 백분율은 4분부의 코너 (corner)에 표시된다. 데이터는 D450N 및 D467A 돌연변이체를 함유하는 ZNF 쌍이 GFP 서열을 통합시킬 수 있음을 입증한다.
도 4, 패널 A 내지 D 는 표적 유전자 내에 이중가닥 또는 단일가닥 파손을 도입시킨 후의 외인성 서열 (패치 (patch) 공여체)의 비-동종성 말단 접합 (NHEJ) 및 표적화된 통합 (TI)의 분석을 도시한 것이다. 도 4a는 각각의 레인 상부에 나타낸 ZFN 쌍을 포함하는 K562 세포에서 NHEJ에 의한 단일가닥가 아닌 이중가닥 파손의 수복을 도시한다. 레인 번호는 표 1에서의 샘플 번호에 상응한다. 도 4b는 표 1에 나타낸 ZFN 쌍에 의한 CCR-5 유전자의 단일- 또는 이중가닥 분할 후의 46 bp CCR-5 패치 공여체 분자의 표적화된 통합을 도시한다. 레인 라인 번호는 샘플 번호에 상응한다. 도 4c 및 4d는 단일 아연 핑거 뉴클레아제 또는 2 개의 아연 핑거 뉴클레아제 (각각의 레인 상부에 나타냄)의 조합으로 처리된 세포에서의 동종성 재조합 현상을 도시한다.
도 5, 패널 A 및 B 는 46bp CCR5-패치 공여체의 존재 하에서, 표시된 ZFN 조합에 의해 형질감염된 K562 세포에서 표적화된 통합 및 NHEJ의 분석을 도시한 것이다. 도 5a는 표적화된 통합 분석을 나타내고, 도 5b는 NHEJ 분석을 나타낸다. 각각의 레인 하부의 숫자는 표적화된 통합 또는 NHEJ의 빈도 (%)를 나타낸다.
도 6, 패널 A 및 B 는 CCR5-tNGFR-outGFP 공여체의 존재 하에서, 표시된 ZFN 조합에 의해 형질감염된 K562 세포에서 표적화된 통합 및 NHEJ의 분석을 도시한 것이다. 도 6a는 NHEJ 분석을 나타내고, 도 6b는 사우던 블럿 (Southern blot)에 의한 표적화된 통합 분석을 나타낸다. 각각의 레인 하부의 숫자는 표적화된 통합 또는 NHEJ의 빈도 (%)를 나타낸다.
도 7 은 표시된 ZFN 구조물에 의해서 형질감염된 K562 세포에서 표시된 시점에서의 53BP1+ foci (DSB를 나타냄)를 도시한 그래프이다. 오픈 서클 (open circles)은 ZFNs이 없는 대조군 세포를 나타내며; 음영이 있는 서클은 야생형 ZFNs으로 형질감염된 세포를 나타내고; 오픈 스퀘어 (open squares)는 하나의 야생형 ZFN 및 하나의 불활성화된 ZFN (D450N)으로 형질감염된 세포를 나타내며; 음영이 있는 스퀘어는 하나의 야생형 ZFN 및 하나의 불활성화된 ZFN (D467A)으로 형질감염된 세포를 나타낸다.
도 8 은 K562 세포 내의 CXCR4 유전자좌에서의 표적화된 통합의 분석을 도시한다. K562 세포는 CXCR4 D450N ZFNs인 CXCR4-ZFN-L-EL-D450N + CXCR4-ZFN-R-KK의 부재 (무 ZFN) 또는 존재 하에서 CXCR4-패치 공여체 DNA에 의해 뉴클레오펙션되었다 (nucleofected). 세포는 4-7일 동안 회수한 다음에, 다시 동일한 DNAs로 뉴클레오펙션되었다. 과정을 총 4 뉴클레오펙션 (nucleofection) 동안 반복하였다. 그후, 세포는 최종 뉴클레오펙션의 3일후에 gDNA 제조 및 RFLP 분석을 위해서 수집하였다. TI에 의해서 변형된 CXCR4의 예상된 위치는 화살표로 나타내었다. 각각의 레인의 하부의 숫자는 TI의 빈도 (%)를 나타낸다.

본 발명에는 세포성 크로마틴의 표적화된 단일가닥 분할 및, 예를 들어, 표적화된 단일가닥 분할에 이은 외인성 폴리뉴클레오타이드 (세포성 뉴클레오타이드 서열과의 상동성인 하나 또는 그 이상의 부분을 포함)와 게놈 서열 사이의 동종성 재조합에 의한 세포성 뉴클레오타이드 서열의 표적화된 변화에 유용한 조성물 및 방법이 기술된다. 게놈 서열은 염색체, 에피좀, 세포기관 게놈 (예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체), 인공 염색체, 및 예를 들어, 증폭된 서열, 이중 미소 염색체 및 내인성 또는 감염성 박테리아 및 바이러스의 게놈과 같은 세포 내에 존재하는 어떤 다른 타입의 핵산 내의 존재하는 것을 포함한다. 게놈 서열은 정상적 (즉, 야생형)이거나 돌연변이체일 수 있으며; 돌연변이체 서열은 예를 들어, 삽입, 결실, 전좌, 재배열 및/또는 점돌연변이를 포함할 수 있다. 게놈 서열은 또한 하나 또는 다수의 상이한 대립인자를 포함할 수 있다. 조성물 및 방법은 또한 염색체외 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 플라스미드의 표적화된 변화를 위해서 사용될 수 있다.

표적화된 단일가닥 분할 및 재조합에 유용한 조성물은 분할 반-도메인 및 아연 핑거 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질, 이들 단백질을 코드화한 폴리뉴클레오타이드, 및 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드-코드화 폴리뉴클레오타이드의 조합물을 포함한다. 아연 핑거 결합 도메인은 하나 또는 그 이상의 아연 핑거 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 아연 핑거)를 포함할 수 있으며, 어떤 게놈 또는 에피좀 서열에라도 결합하도록 조작될 수 있다. 따라서, 분할 또는 재조합을 원하는 관심이 있는 표적 게놈 또는 에피좀 부분을 확인함으로써 본 발명에 기술된 방법에 따라 촉매적 활성 및 촉매적 불활성 분할 반-도메인 및 상기 게놈 또는 에피좀 부분에서 표적 서열을 인식하도록 조작된 아연 핑거 도메인 둘 다를 포함하는 하나 또는 그 이상의 융합 단백질을 구성할 수 있다. 세포 내에 이러한 융합 단백질 (또는 단백질들)의 존재는 그의 (그들의) 결합 부위(들)에 대한 융합 단백질(들)의 결합 및 상기 게놈 또는 에피좀 부분 내에서 또는 그에 인접한 단일가닥 분할을 야기할 수 있다. 특히, 본 발명에서 나타낸 바와 같이, 게놈 또는 에피좀 부분에 대해서 동종성인 부분을 갖는 외인성 폴리뉴클레오타이드가 또한 이러한 세포 내에 존재한다면, 동종성 재조합은 게놈 또는 에피좀 부분과 외인성 폴리뉴클레오타이드 사이에서 높은 비율로 나타난다.

일반론

방법의 실시뿐만 아니라 본 발명에 기술된 조성물의 제조 및 사용은 다른 식으로 표시되지 않는 한은 분자 생물학, 생화학, 크로마틴 구조 및 분석, 컴퓨터 화학, 세포 배양, 재조합 DNA, 및 기술의 범위 내에 있는 관련된 분야에서의 통상적인 기술을 이용한다. 이들 기술은 문헌에 상세히 설명되어 있다 [참조: 예를 들어, Sambrook et al . MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel et al . , CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates; the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (PM Wassarman and AP Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; 및 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (PB Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999].

정의

용어 "핵산", "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 상호교환적으로 사용되며, 선형 또는 원형 입체배좌 (conformation), 및 단일- 또는 이중-가닥 형태인 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 폴리머를 나타낸다. 본 발명의 목적을 위해서, 이들 용어는 폴리머의 길이에 관해서 제한적인 것으로 해석되지는 않는다. 이들 용어는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체뿐만 아니라 염기, 당 및/또는 포스페이트 부분 (예를 들어, 포스포로티오에이트 골격)에서 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일반적으로, 특정한 뉴클레오타이드의 유사체는 동일한 염기-쌍 특이성을 가지며, 즉 A의 유사체는 T와 염기-쌍을 이룰 것이다.

용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질은 아미노산 잔기의 폴리머를 나타내기 위해서 상호교환적으로 사용된다. 이 용어는 또한, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 상응하는 천연적으로 존재하는 아미노산의 화학적 유사체 또는 변형된 유도체인 아미노산 폴리머에 적용한다.

"결합"은 거대분자 사이의 (예를 들어, 단백질과 핵산 사이의) 서열-특이적인 비-공유적 상호작용을 나타낸다. 전체로서의 상호작용이 서열-특이적인 한은 결합 상호작용의 모든 성분이 서열-특이적일 필요는 없다 (예를 들어, DNA 골격 내의 포스페이트 잔기와 접촉한다). 이러한 상호작용은 일반적으로 10 ^-6 M ^-1 또는 그 이하의 해리상수 (K _d )를 특징으로 한다. "친화성"은 결합의 강도를 나타낸다: 결합 친화성의 증가는 더 낮은 K _d 와 상관관계가 있다.

"결합 단백질"은 또 다른 분자에 비-공유적으로 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은 예를 들어, DNA 분자 (DNA 결합 단백질), RNA 분자 (RNA 결합 단백질) 및/또는 단백질 분자 (단백질 결합 단백질)에 결합할 수 있다. 단백질 결합 단백질의 경우에, 이것은 그 자체에 결합할 수 있고 (호모다이머, 호모트리머 등을 형성)/있거나, 이것은 다른 단백질 또는 단백질들의 하나 또는 그 이상의 분자에 결합할 수 있다. 결합 단백질은 하나 이상의 타입의 결합 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 아연 핑거 단백질은 DNA 결합, RNA 결합 및 단백질 결합 활성을 갖는다.

"아연 핑거 DNA 결합 단백질" (또는 결합 도메인)은 그의 구조가 아연 이온의 배위를 통해서 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 부분인 하나 또는 그 이상의 아연 핑거를 통해서 서열-특이적 방식으로 DNA를 결합시키는 단백질 또는 더 큰 단백질 내의 도메인이다. 용어 아연 핑거 DNA 결합 단백질은 종종 아연 핑거 단백질 또는 ZFP로 약칭된다.

아연 핑거 결합 도메인은 예를 들어, 천연적으로 존재하는 아연 핑거 단백질의 인식 나선 부분의 조작 (하나 또는 그 이상의 아미노산을 변화시킴)을 통해서 예정된 뉴클레오타이드 서열에 결합하도록 "조작"될 수 있다. 따라서, 조작된 아연 핑거 단백질은 천연적으로 존재하지 않는 단백질이다. 아연 핑거 단백질을 조작하는 방법의 비-제한적인 예는 디자인 및 선택이다. 디자인된 아연 핑거 단백질은 그의 디자인/조성이 합리적 기준으로부터 유래하는, 천연에 존재하지 않는 단백질이다. 디자인을 위한 합리적 기준은 기존의 ZFP 디자인 및 결합 데이터의 데이터베이스 저장 정보에서 정보를 처리하기 위한 컴퓨터화된 알고리즘 및 치환 규칙의 적용을 포함한다 [참조: 예를 들어, 미국 특허 제6,140,081; 6,453,242; 및 6,534,261호; 또한 WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496 참조].

"선택된" 아연 핑거 단백질은 그의 생산이 파지 디스플레이 (phage display), 상호작용 트랩 (trap) 또는 하이브리드 선택과 같은 실험적 방법으로부터 유래하는, 자연에서 발견되지 않는 단백질이다 [참조: 예를 들어, US 5,789,538; US 5,925,523; US 6,007,988; US 6,013,453; US 6,200,759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197 및 WO 02/099084].

용어 "서열"은 DNA 또는 RNA일 수 있으며; 선형, 원형 또는 분지될 수 있고, 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있는 모든 길이의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 용어 "공여체 서열"은 게놈 내로 삽입된 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 공여체 서열은 어떤 길이의 것이라도 될 수 있으며, 예를 들어, 2 내지 10,000 뉴클레오타이드 길이 (또는 이들 사이 또는 이들 이상의 어떤 정수 값), 바람직하게는 약 100 내지 1,000 뉴클레오타이드 길이 (또는 이들 사이의 어떤 정수), 더욱 바람직하게는 약 200 내지 500 뉴클레오타이드 길이의 것일 수 있다. 대신으로, 공여체 서열은 박테리아 인공 염색체 (BAC) 또는 효모 인공 염색체 (YAC)와 같은 인공 염색체 서열일 수 있다.

"동종성, 비-동일성 서열"은 제2 서열과의 서열 동일성의 정도를 공유하지만, 그의 서열이 제2 서열의 것과 동일하지 않은 제1 서열을 나타낸다. 예를 들어, 돌연변이체 유전자의 야생형 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 돌연변이체 유전자의 서열과 동종성이며, 비-동일성이다. 특정의 구체예에서, 2개의 서열 사이의 상동성의 정도는 정상적인 세포 기전을 이용하여 이들 사이의 동종성 재조합을 허용하기에 충분하다. 2 개의 동종성 비-동일성 서열은 어떤 길이의 것이라도 될 수 있으며, 이들의 비-상동성의 정도는 단일 뉴클레오타이드로 작을 수 있거나 (예를 들어, 표적화된 동종성 재조합에 의한 게놈 점돌연변이의 교정의 경우), 10 또는 그 이상의 킬로염기 (kilobases) 만큼 클 수 있다 (예를 들어, 염색체 내의 예정된 편위 부위에서 유전자의 삽입의 경우). 동종성 비-동일성 서열을 포함하는 2개의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 길이일 필요는 없다. 예를 들어, 20 내지 10,000 뉴클레오타이드의 외인성 폴리뉴클레오타이드 (즉, 공여체 폴리뉴클레오타이드), 인공 염색체 또는 뉴클레오타이드 쌍이 사용될 수 있다.

핵산 및 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 기술은 본 기술분야에서 공지되어 있다. 전형적으로, 이러한 기술은 유전자에 대한 mRNA의 뉴클레오타이드 서열을 결정하고/하거나 그에 의해서 코드화된 아미노산 서열을 결정하고, 이들 서열을 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 비교하는 것을 포함한다. 게놈 서열도 또한 이러한 방식으로 결정 및 비교될 수 있다. 일반적으로, 동일성은 2 개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열 각각의 정확한 뉴클레오타이드-대-뉴클레오타이드 또는 아미노산-대-아미노산 일치를 나타낸다. 2개 또는 그 이상의 서열 (폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산)은 이들의 동일성 퍼센트를 결정함으로써 비교될 수 있다. 핵산 서열이든 아미노산 서열이든 2개의 서열의 동일성 퍼센트는 2 개의 정렬된 서열 사이에서 정확하게 매치된 것을 더 짧은 서열의 길이로 나누고 100을 곱한 수이다. 본 발명에 기술된 서열에 관해서, 서열 동일성의 바람직한 정도의 범위는 약 80% 내지 100% 및 이들 사이의 어떤 정수 값이다. 전형적으로, 서열 사이의 동일성 퍼센트는 적어도 70-75%, 바람직하게는 80-82%, 더욱 바람직하게는 85-90%, 더 더욱 바람직하게는 92%, 더욱 더 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98% 서열 동일성이다.

대신으로, 폴리뉴클레오타이드 사이의 서열 유사성의 정도는 동종성 부분 사이에서 안정한 듀플렉스 (duplexes)의 형성을 허용하는 조건 하에서의 폴리뉴클레오타이드의 하이브리드화에 이어서 단일가닥-특이적 뉴클레아제(들)에 의한 분해 및 분해된 단편의 크기의 결정에 의해서 결정될 수 있다. 서열이 상기의 방법을 사용하여 결정된 것으로서, 분자의 정의된 길이에 걸쳐서 적어도 약 70%-75%, 바람직하게는 80%-82%, 더욱 바람직하게는 85%-90%, 더 더욱 바람직하게는 92%, 더욱 더 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98% 서열 동일성을 나타내는 경우에, 2개의 핵산 또는 2개의 폴리펩타이드 서열은 실질적으로 서로에 대해서 동종성이다. 본 발명에서 사용된 것으로서, 실질적으로 동종성이라는 것은 또한 명시된 DNA 또는 폴리펩타이드 서열에 대해 완전한 동일성을 나타내는 서열을 나타낸다. 실질적으로 동종성인 DNA 서열은 예를 들어, 특정한 시스템에 대해서 정의된 바와 같은 엄격한 조건 하에서의 사우던 (Southern) 하이브리드화 실험에서 확인될 수 있다. 적절한 하이브리드화 조건을 정의하는 것은 본 기술분야에서의 기술의 범위 내에 있다 [참조: 예를 들어, Sambrook et al., supra ; Nucleic Acid Hybridization : A Practical Approach , editors BD Hames and SJ Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press].

2개의 핵산 단편의 선택적 하이브리드화는 다음과 같이 결정될 수 있다. 2개의 핵산 분자 사이의 서열 동일성의 정도는 이러한 분자들 사이의 하이브리드화 현상의 효율성 및 강도에 영향을 미친다. 부분적으로 동일한 핵산 서열은 표적 분자에 대한 완전히 동일한 서열의 하이브리드화를 적어도 부분적으로 억제할 것이다. 완전히 동일한 서열의 하이브리드화의 억제는 본 기술분야에서 잘 알려진 하이브리드화 시험 (예를 들어, 사우던 (DNA) 블럿, 노던 (RNA) 블럿, 용액 하이브리드화 등; 참조: Sambrook, et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual , Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, NY)을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 시험은 다양한 정도의 선택성을 사용하여, 예를 들어, 낮은 엄밀성 (stringency)으로부터 높은 엄밀성으로 변화하는 조건을 사용하여 수행할 수 있다. 낮은 엄밀성의 조건이 사용된다면, 비-특이적 결합의 부재는, 비-특이성 결합 현상의 부재 하에서 제2 프로브 (probe)가 표적에 대해서 하이브리드화할 수 없도록, 부분적인 정도의 서열 동일성조차도 결여하는 제2 프로브 (예를 들어, 표적 분자와 약 30% 미만의 서열 동일성을 갖는 프로브)를 사용하여 평가될 수 있다.

하이브리드화를 위한 조건은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려져 있다 [참조: 예를 들어, Nucleic Acid Hybridization : A Practical Approach , editors BD Hames and SJ Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press]. 하이브리드화 엄밀성은 하이브리드화 조건이 미스매치된 (mismatched) 뉴클레오타이드를 함유하는 하이브리드의 형성을 꺼려하는 정도를 나타내며, 높은 엄밀성은 미스매치된 하이브리드에 대한 더 낮은 관용성과 상관관계가 있다. 하이브리드화의 엄밀성에 영향을 미치는 인자들은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려져 있으며, 온도, pH, 이온 강도, 및 예를 들어, 포름아미드 및 디메틸설폭사이드와 같은 유기 용매의 농도를 포함하나 이들로 제한되지는 않는다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 바와 같이, 하이브리드화 엄밀성은 더 고온, 더 낮은 이온 강도 및 더 낮은 용매 농도에 의해서 증가된다.

하이브리드화를 위한 엄밀성 조건에 관해서, 다수의 동등한 조건을 사용하여 예를 들어, 다음의 인자들을 변화시킴으로써 특별한 엄밀성을 확립할 수 있다는 것은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다: 서열의 길이 및 성질, 다양한 서열의 염기 조성, 염 및 다른 하이브리드화 용액 성분의 농도, 하이브리드화 용액 내에 차단의 존재 또는 부재 (예를 들어, 덱스트란 설페이트 및 폴리에틸렌 글리콜), 하이브리드화 반응 온도 및 시간 파라메터뿐만 아니라 다양한 세척 조건. 하이브리드화 조건의 특별한 세트의 선택은 본 기술분야에서의 표준 방법에 따라 선택된다 [참조: 예를 들어, Sambrook, et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual , Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, NY].

"재조합"은 2개의 폴리뉴클레오타이드 사이에서 유전자 정보의 교환의 방법을 나타낸다. 본 기술내용의 목적에 따르면, "동종성 재조합 (HR)"은 예를 들어, 세포 내에서 이중가닥 파손의 수복 중에 일어나는 이러한 교환의 전문화된 형태를 나타낸다. 이 방법은 뉴클레오타이드 서열 상동성을 필요로 하고, "표적" 분자의 주형 수복에 대해 "공여체" 분자 (즉, 이중가닥 파손을 경험한 것)를 사용하며, 이것은 공여체로부터 표적으로의 유전자 정보의 전이를 유도하기 때문에 "비-크로스오버 (non-crossover) 유전자 전환" 또는 "짧은 트랙트 (short tract) 유전자 전환"으로 다양하게 알려져 있다. 어떤 특별한 이론에 의해서 구속되기를 바라지는 않지만, 이러한 전이는 파손된 표적 및 공여체 사이에서 형성하는 헤테로듀플렉스 DNA의 미스매치 교정, 및/또는 공여체를 사용하여 표적의 일부분이 될 수 있는 유전자 정보를 재합성하는 "합성-의존적 스트랜드 어니일링", 및/또는 관련된 방법을 수반한다. 이러한 전문화된 HR은 종종, 공여체 폴리뉴클레오타이드의 서열의 일부분 또는 전부가 표적 폴리뉴클레오타이드 내로 혼입되도록 표적 분자의 서열의 변화를 야기한다.

"분할 (cleavage)"은 DNA 분자의 공유적 골격의 파손을 나타낸다. 분할은 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 다양한 방법에 의해서 개시된다. 단일가닥 분할은 이중가닥 DNA/RNA의 하나의 스트랜드의 분할을 나타내고, 이중가닥 분할은 두 개의 스트랜드 모두의 분할 (예를 들어, 두 개의 별개의 단일가닥 분할 현상을 통해서)을 나타낸다. 특정의 구체예에서, 융합 폴리펩타이드는 표적화된 단일가닥 DNA 분할을 위해서 사용된다.

"분할 반-도메인 (half-domain)"은 제2 폴리펩타이드 (동일하거나 상이함)와 함께 분할 활성 (바람직하게는 이중가닥 분할 활성)을 갖는 복합체를 형성하는 폴리펩타이드 서열이다. 용어 "제1 및 2 분할 반-도메인", "+ 및 - 분할 반-도메인" 및 "우측 및 좌측 분할 반-도메인"은 다이머화하는 분할 반-도메인의 쌍을 나타내기 위해서 상호교환하여 사용된다.

"조작된 분할 반-도메인"은 또 다른 분할 반-도메인 (예를 들어, 또 다른 조작된 분할 반-도메인)과 편성 헤테로다이머를 형성하도록 변형된 분할 반-도메인이다 [참조: 또한, 미국 특허공보 제2005/0064474; 2007/0218528; 2008/0131962호 및 미국 특허출원 제12/217,185호; 이들은 본 발명에 온전히 참고로 포함된다].

"크로마틴"은 세포성 게놈을 포함하는 핵단백질 구조이다. 세포성 크로마틴은 핵산, 주로 DNA, 및 히스톤 및 비-히스톤 염색체 단백질을 포함한 단백질을 포함한다. 대부분의 진핵 세포성 크로마틴은 뉴클레오솜 (nucleosomes)의 형태로 존재하며, 여기에서 뉴클레오솜 핵은 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4 각각 2개를 포함하는 옥타머와 결합된 DNA의 약 150 염기쌍을 포함하며; 링커 DNA (유기체에 따라 가변적인 길이임)는 뉴클레오솜 핵 사이에 걸쳐진다. 히스톤 H1의 분자는 일반적으로 링커 DNA와 결합한다. 본 발명의 기술의 목적을 위해서, 용어 "크로마틴"은 원핵성 및 진핵성 둘 다인 세포성 핵단백질의 모든 타입을 포함하는 것을 의미한다. 세포성 크로마틴은 염색체 및 에피좀 크로마틴 둘 다를 포함한다.

"염색체"는 세포의 게놈의 전부 또는 일부분을 포함하는 크로마틴 복합체가다. 세포의 게놈은 종종, 세포의 게놈을 포함하는 모든 염색체의 수집물인 그의 핵형 (karyotype)을 특징으로 한다. 세포의 게놈은 하나 또는 그 이상의 염색체를 포함할 수 있다.

"에피좀"은 복제성 핵산, 핵단백질 복합체, 또는 세포의 염색체 핵형의 일부분이 아닌 핵산을 포함하는 다른 구조이다. 에피좀의 예로는 플라스미드 및 특정의 바이러스 게놈이 포함된다.

"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합을 위해서 충분한 조건이 존재한다면 결합 분자가 결합할 수 있는 핵산의 일부분을 정의하는 핵산 서열이다. 예를 들어, 서열 5'-GAATTC-3'는 Eco RI 제한 엔도뉴클레아제에 대한 표적 부위이다.

"외인성 분자"는 세포 내에 정상적으로 존재하지 않지만 하나 또는 그 이상의 유전적, 생화학적 또는 다른 방법에 의해서 세포 내에 도입될 수 있는 분자이다. "세포 내에 정상적으로 존재"는 세포의 특별한 발생 단계 및 환경 조건에 관해서 결정된다. 따라서, 예를 들어, 근육의 배아 발생 중에만 존재하는 분자는 성숙 근육 세포에 관해서는 외인성 분자이다. 마찬가지로, 열 충격에 의해서 유도된 분자는 비-열-충격 세포에 관해서는 외인성 분자이다. 외인성 분자는 예를 들어, 기능부전성 내인성 분자의 기능성 버전 (functioning version) 또는 정상적-기능성 내인성 분자의 기능부전성 버전 (malfunctioning version)을 포함할 수 있다.

외인성 분자는 다른 것들 중에서 특히, 조합 화학방법에 의해서 생성된 것과 같은 소분자, 또는 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지단백질, 폴리사카라이드, 상기 분자의 모든 변형된 유도체, 또는 상기 분자 중의 하나 또는 그 이상을 포함하는 모든 복합체와 같은 거대분자일 수 있다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함하며, 단일- 또는 이중가닥일 수 있고; 선형이거나 분지되거나 원형일 수 있으며; 어떤 길이의 것이라도 될 수 있다. 핵산은 듀플렉스를 형성할 수 있는 것뿐만 아니라 트리플렉스 (triplex)-형성 핵산을 포함한다 [참조: 예를 들어, 미국 특허 제5,176,996 및 5,422,251호]. 단백질은 DNA 결합 단백질, 전사 인자, 크로마틴 리모델링 인자, 메틸화된 DNA 결합 단백질, 폴리머라제, 메틸라제, 데메틸라제, 아세틸라제, 데아세틸라제, 키나제, 포스파타제, 인테그라제, 리콤비나제, 리가제, 토포이소머라제, 기라제 및 헬리카제를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.

외인성 분자는 내인성 분자와 동일한 타입의 분자, 예를 들어, 외인성 단백질 또는 핵산일 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산은 감염성 바이러스 게놈, 세포 내로 도입된 플라스미드 또는 에피좀, 또는 세포에 정상적으로는 존재하지 않는 염색체를 포함할 수 있다. 세포 내로 외인성 분자를 도입시키는 방법은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지되어 있으며, 지질 매개된 전이 (즉, 중성 및 양이온성 지질을 포함하는 리포좀), 전기천공, 직접 주입, 세포 융합, 입자 충돌 (particle bombardment), 인산칼슘 공-침전, DEAE-덱스트란 매개된 전이 및 바이러스 벡터 매개된 전이를 포함하나 이들로 제한되지는 않는다. 외인성 분자는 또한 내인성 분자와 동일한 타입의 분자일 수도 있지만, 세포가 유도된 것과는 상이한 종으로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 인간 핵산 서열은 원래 마우스 또는 햄스터로부터 유도된 세포주 내로 도입될 수 있다.

대조적으로, "내인성" 분자는 특정한 환경적 조건 하의 특정한 발생 단계에서 특정한 세포 내에 정상적으로 존재하는 것이다. 예를 들어, 내인성 핵산은 염색체, 미토콘드리아, 엽록체 또는 다른 세포 기관의 게놈, 또는 천연적으로-존재하는 에피좀 핵산을 포함할 수 있다. 추가의 내인성 분자는 단백질, 예를 들어, 전사 인자 및 효소를 포함할 수 있다.

"융합" 분자는 2개 또는 그 이상의 서브유니트 분자가 바람직하게는 공유적으로 결합된 분자이다. 서브유니트 분자는 분자의 동일한 화학적 타입일 수 있거나, 분자의 상이한 화학적 타입일 수 있다. 융합 분자의 제1 타입의 예로는 융합 단백질 (예를 들어, ZFP DNA 결합 도메인과 하나 또는 그 이상의 분할 도메인 사이의 융합) 및 융합 핵산 (예를 들어, 상술한 융합 단백질을 코드화한 핵산)이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 융합 분자의 제2 타입의 예로는 트리플렉스-형성 핵산과 폴리펩타이드 사이의 융합, 및 마이너 그루브 (minor groove) 결합제와 핵산 사이의 융합이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.

세포 내에서 융합 단백질의 발현은 융합 단백질의 세포에 대한 전달로부터, 또는 융합 단백질을 코드화한 폴리뉴클레오타이드의 세포에 대한 전달에 의해서 제공될 수 있으며, 여기에서 폴리뉴클레오타이드는 전사되고, 전사물은 해독되어 융합 단백질을 생성시킨다. 트랜스-스플리싱 (trans-splicing) 폴리펩타이드 분할 및 폴리펩타이드 결찰이 또한 세포 내에서의 단백질의 발현에 수반될 수 있다. 세포에 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드를 전달하는 방법은 본 발명의 다른 곳에서 제시된다.

본 발명의 목적에 따라 "유전자"는 유전자 생성물을 코드화한 DNA 부분 (이하 참조)뿐만 아니라, 조절 서열이 코드화 및/또는 전사 서열에 인접하든지 아니든지, 유전자 생성물의 생산을 조절하는 모든 DNA 부분을 포함한다. 따라서, 유전자는 프로모터 서열, 종결인자 (terminators), 리보좀 결합 부위 및 내부 리보좀 유입 부위와 같은 해독 조절 서열, 인핸서 (enhancers), 사일런서 (silencers), 인슐레이터 (insulators), 경계 요소 (boundary elements), 복제 기원, 매트릭스 부착 부위 및 유전자좌 조절 부분을 포함하지만, 반드시 이들로 제한되지는 않는다.

"유전자 발현"은 유전자에 함유된 정보를 유전자 생성물로 전환시키는 것을 나타낸다. 유전자 생성물은 유전자의 직접 전사 생성물 (예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조적 RNA 또는 어떤 다른 타입의 RNA) 또는 mRNA의 해독에 의해서 생산된 단백질일 수 있다. 유전자 생성물은 또한 캡핑 (capping), 폴리아데닐화, 메틸화 및 편집과 같은 방법에 의해서 변형된 RNA, 및 예를 들어, 메틸화, 아세틸화, 포스포릴화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화 및 글리코실화에 의해서 변형된 단백질을 포함한다.

유전자 발현의 "변조 (modulation)"는 유전자의 활성의 변화를 나타낸다. 발현의 변조는 유전자 활성화 및 유전자 억제를 포함할 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다. 유전자 불활성화는 본 발명에 기술된 바와 같은 ZFP를 포함하지 않는 세포에 비해서 유전자 발현의 감소를 나타낸다. 따라서, 유전자 불활성화는 완전하거나 (녹-아웃) 부분적일 수 있다 (예를 들어, 유전자가 정상적인 발현 레벨 미만을 나타내는 정상하위 대립인자 (hypomorph) 또는 이것이 영향을 미치는 활성에 있어서의 부분적인 감소를 나타내는 돌연변이체 유전자의 생성물).

"진핵성" 세포는 진균 세포 (예를 들어, 효모), 식물 세포, 동물 세포, 포유동물 세포 및 인간 세포 (예를 들어, T-세포)를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.

"세포주 (cell line)"는 일차 배양으로부터 조직 배양물 내에서 확립된 세포의 집단을 나타낸다. 따라서, 아연 핑거 뉴클레아제(들)를 사용하여 생성된 세포주는 하나 또는 그 이상의 표적 유전자가 하나 또는 그 이상의 아연 핑거 뉴클레아제에 의해서 부분적으로 또는 완전히 불활성화되고, 세포 (또는 세포주)의 자손이 배양 중에서 다수의 계대를 거친 후에 부분적이거나 완전환 불활성화 표현형을 유지하는 세포 (또는 세포주)로부터 발생한다. 더구나, 유전자(들)의 발현이 감소되거나 (녹-다운) 또는 제거되는 (녹-아웃) 경우에, 세포 또는 세포주는 하나 또는 그 이상의 표시된 유전자의 발현이 "결핍"된다.

"이식유전자 (transgenic)"는 세포 내로 도입되어 동물 또는 식물의 게놈의 일부분이 된 핵산 서열을 포함하는 모든 동물 또는 식물을 의미한다. 이 용어는 유전자 조작된 동물 또는 식물뿐만 아니라 유전자 조작된 동물의 자손을 나타낸다. 비-인간 이식유전자 동물에는 설치류, 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 코끼리, 조류, 어류, 곤충, 파충류 등과 같은 척추동물이 포함된다. 이 용어는 또한 도입된 핵산 서열이 발견되거나 핵산 서열 유전자가 동물 또는 식물의 세포의 전부가 아닌 일부에서 발현된 동물 또는 식물을 포함한다.

"관심이 있는 부분"은 외인성 분자를 결합시키는데 바람직한 것으로, 예를 들어, 유전자, 또는 유전자 내의 또는 그에 인접한 비-코드화 서열과 같은 세포성 크로마틴의 어떤 부분이다. 결합은 표적화된 DNA 분할 및/또는 표적화된 재조합을 목적으로 하는 것일 수 있다. 관심이 있는 부분은 예를 들어, 염색체, 에피좀, 세포 기관 게놈 (예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체), 또는 감염성 바이러스 게놈 내에 존재할 수 있다. 관심이 있는 부분은 유전자의 코드화 부분 내에, 예를 들어, 리더 서열, 트레일러 (trailer) 서열 또는 인트론과 같은 전사된 비-코드화 부분 내에, 또는 코드화 부분의 상류 또는 하류인 비-전사된 부분 내에 있을 수 있다. 관심이 있는 부분은 단일 뉴클레오타이드 쌍만큼 작을 수 있거나, 길이가 2,000 뉴클레오타이드 쌍까지 또는 어떤 정수 값의 뉴클레오타이드 쌍일 수 있다.

용어 "작동적 결합" 및 "작동적으로 결합된" (또는 "작동가능하게 결합된")은 2개 또는 그 이상의 성분 (예를 들어, 서열 성분)의 병렬 배치에 관하여 상호교환적으로 사용되며, 여기에서 성분들은 두 개의 성분이 정상적으로 기능을 나타내고, 성분 중의 적어도 하나가 다른 성분 중의 적어도 하나에 대해서 발휘되는 기능을 매개할 수 있도록 배열된다. 예를 들어, 전사 조절 서열이 하나 또는 그 이상의 전사 조절 인자 A의 존재 또는 부재에 대한 응답으로 코드화 서열의 전사의 레벨을 조절한다면, 프로모터와 같은 전사 조절 서열은 코드화 서열에 작동적으로 결합된다. 전사 조절 서열은 일반적으로 코드화 서열과 시스 (cis) 배열로 작동적으로 결합되지만, 이것에 바로 인접할 필요는 없다. 예를 들어, 인핸서는 비록 이들이 인접하지 않더라도, 코드화 서열에 작동적으로 결합된 전사 조절 서열이다.

융합 폴리펩타이드에 관해서, 용어 "작동적으로 결합된"은 각각의 성분이 이렇게 결합되지 않을 수 있기 때문에, 이들이 다른 성분에 대한 결합에 있어서 동일한 기능을 수행한다는 사실을 나타낼 수 있다. 예를 들어, ZFP DNA 결합 도메인이 분할 도메인에 융합된 융합 폴리펩타이드에 관해서는, 융합 폴리펩타이드에서 ZFP DNA 결합 도메인 부분이 그의 표적 부위 및/또는 그의 결합 부위에 결합할 수 있는 한편 분할 도메인이 표적 부위의 부근에서 DNA를 분할시킬 수 있다면 ZFP DNA 결합 도메인과 분할 도메인은 작동적으로 결합된 것이다.

단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산의 "기능적 단편"은 그의 서열이 전체-길이 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일하지 않지만, 전체-길이 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일한 기능을 보유하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산이다. 기능적 단편은 상응하는 천연 분자보다 많거나, 적거나, 그와 동일한 수의 잔기를 가질 수 있고/있거나, 하나 또는 그 이상의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 치환을 함유할 수 있다. 핵산의 기능 (예를 들어, 코드화 기능, 또 다른 핵산에 대해 하이브리드화하는 능력)을 결정하는 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 마찬가지로, 단백질 기능을 결정하는 방법은 잘 알려져 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 DNA 결합 기능은 예를 들어, 필터 결합, 전기영동상 이동-변화 (electrophoretic mobility-shift), 또는 면역침강 시험에 의해서 결정될 수 있다. DNA 분할은 겔 전기영동에 의해서 시험할 수 있다 [참조: Ausubel et al ., supra ]. 단백질이 또 다른 단백질과 상호작용하는 능력은 예를 들어, 공-면역침강, 2-하이브리드 시험, 또는 유전적 및 생화학적 둘 다의 상보성에 의해서 결정될 수 있다 [참조: 예를 들어, Fields et al . (1989) Nature 340: 245-246; 미국 특허 제5,585,245호 및 PCT WO 98/44350].

본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "항체"는 폴리클로날 및 모노클로날 제제 둘 다뿐만 아니라 다음으로부터 수득된 항체를 포함한다: 하이브리드 (키메릭) 항체 분자 [참조: 예를 들어, Winter et al., Nature (1991) 349:293-299; 및 미국 특허 제4,816,567호]; F(ab')2 및 F(ab) 단편; Fv 분자 (비-공유적 헤테로다이머; 참조: 예를 들어, Inbar et al., Proc Natl Acad Sci USA (1972) 69:2659-2662; 및 Ehrlich et al., Biochem (1980) 19:4091-4096]; 단일-쇄 Fv 분자 (sFv) [참조: 예를 들어, Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA (1988) 85:5879-5883]; 다이머 및 트라이머 항체 단편 구조물; 미니바디 (minibodies) [참조: 예를 들어, Pack et al., Biochem (1992) 31:1579-1584; Cumber et al., J Immunology (1992) 149B: 120-126]; 인간화된 항체 분자 [참조: 예를 들어, Riechmann et al., Nature (1988) 332:323-327; Verhoeyan et al., Science (1988) 239:1534-1536; 및 영국 특허공보 제GB 2,276,169호 (1994년 9월 21일에 공개됨)]; 및 이러한 분자로부터 수득된 모든 기능적 단편 (여기에서, 이러한 단편은 모 항체 분자의 면역학적 결합 특성을 보유한다).

본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "모노클로날 항체"는 동종성 항체 집단을 갖는 항체 조성물을 나타낸다. 이 용어는 항체의 종 또는 공급원에 관해서 제한되지 않으며, 이것이 만들어지는 방식에 의해서도 제한되지 않는다. 이 용어는 전체 면역글로불린뿐만 아니라 Fab, F(ab')2, Fv, 및 그 밖의 다른 단편과 같은 단편, 및 모 모노클로날 항체 분자의 면역학적 결합 특성을 나타내는 키메릭 및 인간화된 동종성 항체 집단을 포함한다.

뉴클레아제

본 발명에는 이중가닥 DNA에서 단일가닥 파손 (SSBs, 또는 닉으로도 칭함)을 만들기 위해서 사용될 수 있는 인공 뉴클레아제가 기술되어 있다. 또한, 본 발명에는 SSB를 게놈 내에 도입시킴으로써 동종성 재조합 (예를 들어, 표적화된 통합)을 촉진시키는 방법이 기술된다.

A. 분할 도메인

본 발명에 기술된 뉴클레아제는 뉴클레아제 (분할 도메인, 분할 반-도메인)를 포함한다. 본 발명에 기술된 융합 단백질의 분할 도메인 부분은 어떤 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터라도 수득될 수 있다. 분할 도메인이 유도될 수 있는 엔도뉴클레아제의 예로는 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소 (homing) 엔도뉴클레아제가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다 [참조: 예를 들어, 2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; 및 Belfort et al . (1997) Nucleic Acids Res . 25: 3379-3388]. DNA를 분할하는 추가의 효소는 공지되어 있다 (예를 들어, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 마이크로코칼 (micrococcal) 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제 [또한, Linn et al . (eds.) Nucleases , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993을 참조]. 이들 효소 (또는 그의 기능적 단편) 중의 하나 또는 그 이상이 분할 도메인 및 분할 반-도메인의 공급원으로 사용될 수 있다. 예를 들어, SceI와 같은 메가뉴클레아제의 분할 도메인은 DSB가 아닌 SSBs를 유도하도록 부분적으로 불활성이 되게 할 수 있다.

마찬가지로, 분할 반-도메인은 분할 활성을 위해서 다이머화를 필요로 하는 상술한 바와 같은 어떤 뉴클레아제 또는 그의 일부분으로부터라도 유도될 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질이 분할 반-도메인을 포함한다면 분할을 위해서 2개의 융합 단백질이 필요하다. 대신으로, 2개의 분할 반-도메인을 포함하는 단일 단백질이 사용될 수 있다. 2개의 분할 반-도메인은 동일한 엔도뉴클레아제 (또는 그의 기능적 단편)로부터 유도될 수 있거나, 각각의 분할 반-도메인은 상이한 엔도뉴클레아제 (또는 그의 기능적 단편)로부터 유도될 수 있다.

또한, 2개의 융합 단백질에 대한 표적 부위는 바람직하게는 서로에 대해서, 그들의 각각의 표적 부위에 대한 2개의 융합 단백질의 결합이 분할 반-도메인을 분할 반-도메인이, 예를 들어, 다이머화에 의해서 기능적 분할 도메인을 형성하도록 하는 공간적 배향으로 서로에 대해서 위치하도록 배치된다. 따라서, 특정의 구체예에서, 표적 부위의 근접 가장자리는 5-8 뉴클레오타이드에 의해서, 또는 15-18 뉴클레오타이드에 의해서 분리된다. 그러나, 어떤 정수값의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쌍이라도 2개의 표적 부위 사이에 개입될 수 있다 (예를 들어, 2 내지 50개의 뉴클레오타이드 쌍 또는 그 이상). 일반적으로, 분할의 부위의 표적 부위 사이에 놓인다.

제한 엔도뉴클레아제 (제한효소)는 다수의 종에 존재하며, DNA에 대한 서열-특이적 결합이 가능하며 (인식 부위에서), 결합의 부위에서 또는 그에 근접하여 DNA를 분할시킬 수 있다. 특정의 제한효소 (예를 들어, 타입 IIS)는 인식 부위로부터 떨어진 위치에서 DNA를 분할하며, 분리가능한 결합 및 분할 도메인을 갖는다. 예를 들어, 타입 IIS 효소 Fok I은 하나의 스트랜드 상의 그의 인식 부위로부터 9 뉴클레오타이드 및 다른 스트랜드 상의 그의 인식 부위로부터 13 뉴클레오타이드에서 DNA의 이중가닥 분할을 촉진시킨다 [참조: 예를 들어, 미국 특허 제5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994호; 및 Li et al . (1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89: 4275-4279; Li et al . (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 2764-2768; Kim et al . (1994a) Proc. Nat'l . Acad . Sci . USA 91: 883-887; Kim et al . (1994b) J. Biol . Chem . 269: 31,978-31, 982]. 따라서, 하나의 구체예에서 융합 단백질은 적어도 하나의 타입 IIS 제한효소로부터의 분할 도메인 (또는 분할 반-도메인), 및 조작될 수 있거나 없는 하나 또는 그 이상의 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다.

그의 분할 도메인이 결합 도메인으로부터 분리가능한 타입 IIS 제한효소의 예는 Fok I이다. 이 특정한 효소는 다이머로서 활성이 있다 [Bitinaite et al . (1998) Proc. Natl . Acad . Sci . USA 95: 10,570-10,575]. 따라서, 본 발명의 목적에 따르면, 기술된 융합 단백질에서 사용된 FokI 효소의 부분이 분할 반-도메인으로 간주된다. 따라서, 아연 핑거- Fok I 융합을 사용한 세포성 서열의 표적화된 이중가닥 분할 및/또는 표적화된 치환을 위해서는 각각이 Fok I 분할 반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질을 사용하여 촉매적으로 활성인 분할 도메인을 재구성할 수 있다. 대신으로, 아연 핑거 결합 도메인 및 2개의 Fok I 분할 반-도메인을 함유하는 단일 폴리펩타이드 분자가 사용될 수도 있다. 아연 핑거- Fok I 융합을 사용하는 표적화된 분할 및 표적화된 서열 변화를 위한 파라메터는 본 발명의 다른 곳에 제시된다.

분할 도메인 또는 분할 반-도메인은 분할 활성을 보유하거나, 멀티머화하여 (예를 들어, 다이머화하여) 기능적 분할 도메인을 형성하는 능력을 보유하는 단백질의 어떤 부분이라도 될 수 있다.

예시적인 타입 IIS 제한효소는 본 발명에 온전히 포함된 국제 공보 제WO 07/014275에 기술되어 있다. 추가의 제한효소는 또한 분리가능한 결합 및 분할 도메인을 함유하며, 이들은 본 발명에 의해서 고려된다 [참조: 예를 들어, Roberts et al . (2003) Nucleic Acids Res . 31: 418-420].

특정의 구체예에서, 분할 도메인은 예를 들어, 이들 모두의 기술내용이 본 발명에 온전히 참고로 포함된 미국 특허공보 제20050064474; 20060188987; 및 20080131962호에 기술된 바와 같이 호모다이머화를 최소화하거나 방지하는 하나 또는 그 이상의 조작된 분할 반-도메인 (또한, 다이머화 도메인 돌연변이체로 칭함)을 포함한다. Fok I의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 및 538에서의 아미노산 잔기는 모두 Fok I 분할 반-도메인의 다이머화에 영향을 미치는 표적이다.

편성 헤테로다이머를 형성하는 Fok I의 조작된 분할 반-도메인의 예로는 제1 분할 반-도메인이 Fok I의 위치 490 및 538에 있는 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함하고, 제2 분할 반-도메인이 아미노산 잔기 486 및 499에서 돌연변이를 포함하는 쌍이 포함된다.

예를 들어, 특정의 구체예에서는 분할 도메인이 490에서 Glu (E)를 Lys (K)로 치환시키는 돌연변이; 538에서 Iso (I)를 Lys (K)로 치환시키는 돌연변이; 486에서 Gln (Q)을 Glu (E)로 치환시키는 돌연변이; 및 위치 499에서 Iso (I)를 Lys (K)로 치환시키는 돌연변이를 갖는 뉴클레아제 조합이 사용된다. 구체적으로, 본 발명에 기술된 조작된 분할 반-도메인은 하나의 분할 반-도메인에서 위치 490 (E→K) 및 538 (I→K)을 돌연변이시켜 "E490K:I538K" 또는 "KK"로 명시되는 조작된 분할 반-도메인을 생성시키고, 또 다른 분할 반-도메인에서 위치 486 (Q→E) 및 499 (I→L)를 돌연변이시켜 "Q486E:I499L" 또는 "EL"로 명시되는 조작된 분할 반-도메인을 생성시킴으로써 제조되었다.

편성 헤테로다이머 (여기에서 비정상적인 분할은 최소화되거나 폐지된다)를 형성하는 조작된 분할 반-도메인의 쌍의 또 다른 예는 하나의 분할 반-도메인이 위치 487에서 돌연변이되고 (R→D, 또한 "RD"로도 칭함), 다른 분할 반-도메인은 위치 483에서 돌연변이된 (D→R, 또한 "DR"로도 칭함) 것이다.

본 발명에 기술된 조작된 분할 반-도메인은 어떤 적합한 방법을 사용하여서라도, 예를 들어, 미국 특허공보 제20050064474호 (참조: 예를 들어, 실시예 5); 및 WO 07/139898에 기술된 바와 같이, 야생형 분할 반-도메인 ( Fok I)의 부위-지시된 돌연변이유발에 의해서 제조될 수 있다.

본 발명의 분할 반-도메인은 또한, 분할 반-도메인을 불활성으로 만드는 뉴클레아제의 촉매적 도메인의 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함할 수도 있다. FokI 의 촉매적 도메인에서 돌연변이될 수 있는 아미노산의 비-제한적인 예는 아미노산 잔기 450, 467 및/또는 469를 포함한다 (야생형에 대비하여 결정됨). 특정의 구체예에서는, 분할 반-도메인의 촉매적 활성을 불활성화시키기 위해서 하나 또는 그 이상의 점 돌연변이가 편성 헤테로다이머의 하나의 구성원의 촉매적 도메인 내에 만들어진다. 예를 들어, 위치 450은 D로부터 N으로 돌연변이될 수 있고, 위치 467은 D로부터 A로 돌연변이될 수 있으며; 위치 469는 K로부터 A로 돌연변이될 수 있다. 다른 아미노산은 이들 또는 다른 위치에서 치환될 수 있다.

B. DNA 결합 도메인

본 발명에 기술된 뉴클레아제는 또한, 적어도 하나의 DNA 결합 도메인을 포함한다. 어떤 DNA 결합 도메인이라도 본 발명에 기술된 조성물 및 방법에서 사용될 수 있다. 특정의 구체예에서, DNA 결합 도메인은 아연 핑거 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 아연 핑거 단백질은 선택된 표적 부위에 결합하도록 조작된다는 점에서 비-천연적으로 존재하는 것이다 [참조: 예를 들어, Beerli et al . (2002) Nature Biotechnol. 20: 135-141; Pabo et al . (2001) Ann . Rev . Biochem . 70: 313-340; Isalan et al . (2001) Nature Biotechnol . 19: 656-660; Segal et al . (2001) Curr . Opin. Biotechnol . 12: 632-637; Choo et al . (2000) Curr . Opin . Struct . Biol . 10: 411-416]. 조작된 아연 핑거 결합 도메인은 천연적으로-존재하는 아연 핑거 단백질에 비해서 새로운 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작방법은 합리적 디자인 및 다양한 타입의 선택을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 합리적 디자인은 예를 들어, 삼중 (또는 사중) 뉴클레오타이드 서열 및 개개의 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용하는 것을 포함하며, 여기에서 각각의 삼중 또는 사중 뉴클레오타이드 서열은 특정의 삼중 또는 사중 서열을 결합시키는 아연 핑거의 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열과 결합한다 [참조: 예를 들어, 본 발명에 온전히 참고로 포함된 것으로, 공동-소유된 미국 특허 제6,453,242 및 6,534,261호].

파지 디스플레이 및 2-하이브리드 시스템을 포함하는 예시적 선택방법의 예는 미국 특허 제5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; 및 6,242,568호; 및 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 및 GB 2,338,237에 기술되어 있다. 또한, 아연 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 증진은 예를 들어, 공동-소유된 WO 02/077227에 기술되어 있다.

융합 단백질 (및 이것을 코드화한 폴리뉴클레오타이드)의 디자인 및 구성을 위한 표적 부위; ZFP 및 방법의 선택은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지되어 있으며, 본 발명에 온전히 참고로 포함된 미국 특허출원공개 제20050064474 및 20060188987호에 상세히 기술되어 있다.

또한, 이들 및 다른 참고문헌에 기술된 바와 같이, 아연 핑거 도메인 및/또는 다중-핑거화된 (multi-fingered) 아연 핑거 단백질은 예를 들어, 길이가 5 또는 그 이상의 아미노산인 링커를 포함한 어떤 적합한 링커 서열을 사용하여서라도 함께 결합될 수 있다 [또한, 길이가 6 또는 그 이상의 아미노산인 예시적인 링커 서열에 관해서는 미국 특허 제6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949호를 참고로 한다]. 본 발명에 기술된 단백질은 단백질의 개개 아연 핑거 사이에서 적합한 링커의 어떤 조합이라도 포함할 수 있다.

대신으로, DNA 결합 도메인은 뉴클레아제로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, I- Sce I, I- Ceu I, PI- Psp I, PI- Sce , I- Sce IV, I- Csm I, I- Pan I, I- Sce II, I- Ppo I, I- Sce III, I- Cre I, I- Tev I, I- Tev II 및 I- Tev III와 같은 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 인식 서열은 공지되어 있다 [또한, 미국 특허 제5,420,032호; 미국 특허 제6,833,252호; Belfort et al . (1997) Nucleic Acids Res . 25: 3379-3388; Dujon et al . (1989) Gene 82: 115-118; Perler et al . (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet . 12: 224-228; Gimble et al . (1996) J. Mol. Biol . 263: 163-180; Argast et al . (1998) J. Mol . Biol . 280: 345-353 및 New England Biolabs 카탈로그를 참조한다]. 또한, 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA 결합 특이성은 비-천연 표적 부위를 결합시키도록 조작될 수 있다 [참조: 예를 들어, Chevalier et al . (2002) Molec . Cell 10: 895-905; Epinat et al . (2003) Nucleic Acids Res . 31: 2952-2962; Ashworth et al . (2006) Nature 441: 656-659; Paques et al . (2007) Current Gene Therapy 7: 49-66; 미국 특허공보 제20070117128호].

특정의 구체예에서, 본 발명에 기술된 바와 같은 뉴클레아제는 하나의 DNA 결합 도메인 및 하나의 분할 도메인, 예를 들어, 아연 핑거 단백질 및 FokI 분할 반-도메인을 포함한다. 다른 구체예에서, 뉴클레아제는 하나의 DNA 결합 도메인 및 2개 또는 그 이상의 분할 도메인, 예를 들어, 하나의 촉매적 활성 FokI 분할 반-도메인 및 하나의 촉매적 불활성 FokI 분할 반-도메인을 포함하는 아연 핑거 단백질을 포함한다. DNA 결합 도메인이 그의 표적 부위에 결합하고, 표적 부위에 근접한 단일가닥 절단을 생산하는 경우에, 분할 반-도메인은 다이머화할 수 있다.

전달

본 발명에 기술된 뉴클레아제 (예를 들어, ZFNs)는 어떤 적합한 수단에 의해서 표적 세포에 전달될 수 있다. 적합한 세포에는 진핵 (동물 및/또는 식물) 및 원핵 세포 및/또는 세포주가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 세포 또는 이러한 세포로부터 생성된 세포주의 비-제한적 예로는 COS, CHO (예를 들어, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (예를 들어, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), 및 perC6 세포, 및 스포도프테라 푸지페르다 ( Spodoptera fugiperda (Sf))와 같은 곤충 세포, 또는 사카로마이세스 ( Saccharomyces ) , 피치아 (Pichia ) 및 스키조사카로마이세스 ( Schizosaccharo - myces )와 같은 진균 세포가 포함된다. 특정의 구체예에서, 세포주는 CHO-K1, MDCK 또는 HEK293 세포주이다. 또한, 이중가닥 파손에 대해서 민감할 수 있는 일차 세포가 사용될 수 있다. 이들에는 CD34+ 인간 줄기세포, 배아 줄기세포, 마우스 배아 줄기세포, 및 유도된 다능성 세포가 포함될 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다. 마우스 배아 줄기세포 및 난모세포와 같은 이식유전자 유기체의 발생에 사용되는 것으로 알려진 세포가 사용될 수도 있다.

본 발명에 기술된 바와 같은 아연 핑거 단백질을 포함하는 뉴클레아제를 전달하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 제6,453,242; 6,503,717; 6,534,261; 6,599,692; 6,607,882; 6,689,558; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; 및 7,163,824호에 기술되어 있으며, 이들 문헌 모두의 기술 내용은 본 발명에 온전히 참고로 포함된다.

본 발명에 기술된 바와 같은 뉴클레아제는 또한, 하나 또는 그 이상의 뉴클레아제(들) (예를 들어, ZFNs)를 코드화한 서열을 함유하는 벡터를 사용하여 전달될 수 있다. 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터 및 아데노 연관된 바이러스 벡터 등을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 어떤 벡터 시스템이라도 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 온전히 참고로 포함되고, 뉴클레아제(들)를 코드화한 서열에 작동적으로 결합되어 이들 뉴클레아제의 발현을 유도할 수 있는 구성적 또는 유도성 프로모터를 상세히 기술하고 있는 미국 특허 제6,534,261; 6,607,882; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; 및 7,163,824호를 또한 참고로 한다. 더구나, 이들 벡터 중의 어떤 것이라도 하나 또는 그 이상의 뉴클레아제 코드화 서열을 포함할 수 있다는 것은 명백할 것이다. 따라서, ZFNs의 하나 또는 그 이상의 쌍이 세포 내에 도입되는 경우에, ZFNs은 동일한 벡터 상에서 또는 상이한 벡터 상에서 운반될 수 있다. 다수의 벡터가 사용되는 경우에, 각각의 벡터는 하나 또는 다수의 ZFNs을 코드화한 서열을 포함할 수 있다.

통상적인 바이러스 및 비-바이러스 기본 유전자 전이방법을 사용하여 세포 (예를 들어, 포유동물 세포) 및 표적 조직 내에 조작된 ZFP을 코드화한 핵산을 도입시킬 수 있다. 또한, 이러한 방법을 사용하여 시험관내에서 ZFP을 코드화한 핵산을 세포에 투여할 수 있다. 특정의 구체예에서, ZFP을 코드화한 핵산은 생체내 또는 생체외 유전자 요법으로 사용하기 위해서 투여된다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, 무모 (naked) 핵산, 및 리포좀 또는 폴록사머와 같은 전달 비히클과 복합체화된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 세포에 전달한 후에 에피좀성 또는 통합 게놈을 갖는 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다. 유전자 요법 절차의 검토를 위해서는 문헌 [Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al ., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Boehm (eds.) (1995); 및 Yu et al ., Gene Therapy 1:13-26 (1994)]을 참고로 한다.

핵산의 비-바이러스 전달의 방법에는 전기천공 (electroporation), 리포펙션 (lipofection), 미량주사 (microinjection), 바이오리스틱스 (biolistics), 비로좀 (virosomes), 리포좀, 면역리포좀, 다양이온 (polycation) 또는 지질:핵산 컨쥬게이트, 무모 DNA, 인공 비리온 (virions), 및 DNA의 약제-증진된 흡수가 포함된다. 예를 들어, 소니트론 (Sonitron) 2000 시스템 (Rich-Mar)을 사용하는 소노포레이션 (sonoporation)이 핵산의 전달을 위해서 또한 사용될 수 있다.

추가의 예시적인 핵산 전달 시스템에는 Amaxa Biosystems (Cologne, Germany), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) 및 Copernicus Therapeutics Inc.에 의해서 제공된 것이 포함된다 [참조: 예를 들어, US6008336]. 리포펙션은 예를 들어, US 5,049,386, US 4,946,787; 및 US 4,897,355에 기술되어 있으며, 리포펙션 시약은 상업적으로 판매되고 있다 (예를 들어, Transfectam™ 및 Lipofectin™). 폴리뉴클레오타이드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 Felgner, WO 91/17424, WO 91/16024에 제시된 것을 포함한다. 전달은 세포 (생체외 투여) 또는 표적 조직 (생체내 투여)에 대한 것일 수 있다.

면역지질 복합체와 같은 표적화된 리포좀을 포함하는 지질:핵산 복합체의 제조는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려져 있다 [참조: 예를 들어, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al ., Cancer Gene Ther . 2:291-297 (1995); Behr et al ., Bioconjugate Chem . 5:382-389 (1994); Remy et al ., Bioconjugate Chem . 5:647-654 (1994); Gao et al ., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al ., Cancer Res . 52:4817-4820 (1992); 미국 특허 제4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, 및 4,946,787호].

조작된 ZFP를 코드화한 핵산의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기본 시스템의 사용은 바이러스를 신체 내의 특이적 세포에 대해 표적화시키고, 핵에 대한 바이러스 페이로드 (payload)를 유통시키는 (trafficking) 고도로 진화된 방법을 이용한다. 바이러스 벡터는 환자에게 직접 투여될 수 있거나 (생체내), 이들을 사용하여 시험관내에서 세포를 치료하고, 변형된 세포를 환자에게 투여할 수 있다 (생체외). ZFP의 전달을 위한 통상적인 바이러스 기본 시스템에는 유전자 전이를 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관, 백시니아 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 숙주 게놈 내의 통합은 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 아데노 연관된 바이러스 유전자 전이 방법에 의해서 이루어질 수 있으며, 종종 삽입된 이식유전자의 장기간 발현을 제공한다. 추가로, 높은 형질도입 효율은 다수의 상이한 세포 타입 및 표적 조직에서 관찰되었다.

레트로바이러스의 지향성 (tropism)은 외래 외피 단백질을 혼입시키고, 표적 세포의 잠재적 표적 집단을 확장시킴으로써 변화될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 형질도입시키거나 감염시킬 수 있고, 전형적으로 높은 바이러스 역가를 생산하는 레트로바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 유전자 전이 시스템의 선택은 표적 조직에 따라 좌우된다. 레트로바이러스 벡터는 외래 서열의 6-10 kb까지에 대한 패키징 수용력 (packaging capacity)을 갖는 시스-작용성 긴 말단 반복체로 이루어진다. 최소 시스-작용성 LTRs는 벡터의 복제 및 패키징에 충분하며, 그 후 이것을 사용하여 치료학적 유전자를 표적 세포 내로 통합시켜 영구적 이식유전자 발현을 제공한다. 광범하게 사용된 레트로바이러스 벡터에는 쥐 백혈병 바이러스 (MuLV), 지본 원숭이 (gibbon ape) 백혈병 바이러스 (GaLV), 유인원 (Simian) 면역결핍 바이러스 (SIV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 및 이들의 조합물을 기본으로 하는 것이 포함된다 [참조: 예를 들어, Buchscher et al . , J. Virol . 66:2731-2739 (1992); Johann et al ., J. Virol . 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al . , Virol . 176:58-59 (1990); Wilson et al ., J. Virol . 63:2374-2378 (1989); Miller et al ., J. Virol . 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700].

일시적 발현이 바람직한 적용예에서는 아데노바이러스 기본 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스 기본 벡터는 다수의 세포 타입에서 매우 높은 형질도입 효율이 가능하며, 세포 분열을 필요로 하지 않는다. 이러한 벡터를 사용하여 발현의 높은 역가 및 높은 레벨이 수득되었다. 이 벡터는 비교적 간단한 시스템에서 대량으로 생산될 수 있다. 아데노 연관된 바이러스 ("AAV") 벡터를 또한, 예를 들어, 핵산 및 펩타이드의 시험관내 생산 시에, 및 생체내 및 생체외 유전자 요법 절차를 위해서 세포를 표적 핵산에 의해서 형질도입시키기 위해서 사용된다 [참조: 예를 들어, West et al . , Virology 160:38-47 (1987); 미국 특허 제4,797,368호; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin . Invest . 94:1351 (1994)]. 재조합 AAV 벡터의 구성은 미국 특허 제5,173,414호; 및 문헌 [Tratschin et al . , Mol . Cell . Biol . 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al . , Mol. Cell . Biol . 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); 및 Samulski et al . , J. Virol . 63:03822-3828 (1989)]을 포함하는 다수의 공개자료에 기술되어 있다.

적어도 6개의 바이러스 벡터 접근방법이 현재 임상실험에서 유전자 전이에 이용될 수 있으며, 이들은 형질도입제를 생성시키기 위해서 헬퍼 세포주 내로 삽입된 유전자에 의한 결함 유전자의 보충을 수반한다.

pLASN 및 MFG-S는 임상실험에서 사용된 레트로바이러스 벡터의 예이다 [Dunbar et al., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al ., Nat . Med . 1:1017-102 (1995); Malech et al ., PNAS 94:22 12133-12138 (1997)]. PA317/pLASN는 유전자 요법 실험에서 사용된 최초의 치료학적 벡터였다 [Blaese et al ., Science 270:475-480 (1995)]. 50% 또는 그 이상의 형질도입 효율이 MFG-S 패키지된 벡터에 대해서 관찰되었다 [Ellem et al ., Immunol Immunother . 44(1):10-20 (1997); Dranoff et al ., Hum. Gene Ther . 1:111-2 (1997)].

재조합체 아데노 연관된 바이러스 벡터 (rAAV)는 결함성 및 비병원성 피르보바이러스 아데노 연관된 타입 2 바이러스를 기초로 하는 유망한 대체 유전자 전달 시스템이다. 모든 벡터는 단지 이식유전자 발현 카세트의 측면에 위치하는 AAV 145 bp 전도된 (inverted) 말단 반복체만을 보유하는 플라스미드로부터 유도된다. 형질도입된 세포의 게놈 내로의 통합에 기인한 효율적인 유전자 전이 및 안정한 이식유전자 전달이 이 벡터 시스템에 대한 주된 특징이다 [Wagner et al ., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al ., Gene Ther . 9:748-55 (1996))].

복제 결핍 재조합체 아데노바이러스 벡터 (Ad)는 높은 역가로 생산될 수 있고, 다수의 상이한 세포 타입을 쉽게 감염시킬 수 있다. 대부분의 아데노바이러스 벡터는 이식유전자가 Ad E1a, E1b, 및/또는 E3 유전자를 대신하도록 조작되며; 이어서 복제 결함 벡터는 결실된 유전자 기능을 트랜스 (trans)로 공급하는 인간 293 세포 내에서 증식된다. Ad 벡터는 생체내에서, 간, 신장 및 근육에 존재하는 것과 같은 비-분열성의 분화된 세포를 포함하는 다수의 타입의 조직을 형질도입시킬 수 있다. 통상적인 Ad 벡터는 큰 운반 수용력을 갖는다. 임상실험에서 Ad 벡터의 사용에 대한 예는 근육내 주사에 의한 항종양 면역화를 위한 폴리뉴클레오타이드 치료법을 수반한다 [Sterman et al ., Hum . Gene Ther . 7:1083-9 (1998)]. 임상실험에서 유전자 전이를 위한 아데노바이러스 벡터의 사용에 대한 추가의 예는 문헌 [Rosenecker et al ., Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman et al ., Hum . Gene Ther . 9:7 1083-1089 (1998); Welsh et al ., Hum . Gene Ther . 2:205-18 (1995); Alvarez et al., Hum . Gene Ther . 5:597-613 (1997); Topf et al ., Gene Ther . 5:507-513 (1998); Sterman et al ., Hum . Gene Ther . 7:1083-1089 (1998)]에 포함되어 있다.

패키징 세포를 사용하여 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성시킨다. 이러한 세포는 아데노바이러스를 패키징하는 293 세포, 및 레트로바이러스를 패키징하는 Ψ2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 요법에 사용된 바이러스 벡터는 통상적으로 핵산 벡터를 바이러스 입자 내로 패키징하는 생산자 (producer) 세포주에 의해서 생성된다. 벡터는 전형적으로, (적용가능하다면) 숙주 내로 패키징하고 후속 통합시키는데 필요한 최소의 바이러스 서열을 함유하며, 다른 바이러스 서열은 발현될 단백질을 코드화한 발현 카세트에 의해서 치환된다. 누락된 바이러스 기능은 패키징 세포주에 의해서 트랜스로 공급된다. 예를 들어, 유전자 요법에서 사용된 AAV 벡터는 전형적으로 단지, 숙주 게놈 내로의 패키징 및 통합을 위해서 필요한, AAV 게놈으로부터의 전도된 말단 반복 (ITR) 서열을 갖는다. 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉 rep 및 cap 을 코드화하지만 ITR 서열을 결여하는 헬퍼 플라스미드를 함유하는 세포주 내에 패키징된다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스에 의해서 감염된다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 유전자의 발현을 촉진시킨다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결여로 인하여 상당한 양으로 패키징되지 않는다. 아데노바이러스에 의한 오염은 예를 들어, AAV보다 아데노바이러스가 더 민감한 열처리에 의해서 감소될 수 있다.

다수의 유전자 요법 적용예에서, 유전자 요법 벡터는 특정의 조직 타입에 대해서 고도의 특이성으로 전달되는 것이 바람직하다. 따라서, 바이러스 벡터는 바이러스의 외부 표면상에서 바이러스 피막 단백질 (coat protein)과의 융합 단백질로서 리간드를 발현시킴으로써 소정의 세포 타입에 대한 특이성을 갖도록 변형될 수 있다. 리간드는 관심이 있는 세포 타입 상에 존재하는 것으로 알려진 수용체에 대해서 친화성을 갖도록 선택된다. 예를 들어, 문헌 [Han et al . , Proc . Natl . Acad . Sci . USA 92:9747-9751 (1995)]은 몰로니 (Moloney) 쥐 백혈병 바이러스가 gp70에 융합된 인간 히레귤린을 발현하도록 변형될 수 있고, 재조합체 바이러스는 인간 표피 성장인자 수용체를 발현하는 특정의 인간 유방암 세포를 감염시키는 것을 보고하였다. 이 원리는 표적 세포가 수용체를 발현하고, 바이러스는 세포-표면 수용체에 대한 리간드를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 다른 바이러스-표적 세포 쌍에 대해서 확대될 수 있다. 예를 들어, 섬유상 파지는 실질적으로 모든 선택된 세포성 수용체에 대한 특이적 결합 친화성을 갖는 항체 단편 (예를 들어, FAB 또는 Fv)을 표시하도록 조작될 수 있다. 비록 상기의 설명은 주로 바이러스 벡터에 적용되지만, 동일한 원리는 비-바이러스 벡터에 적용될 수 있다. 이러한 벡터는 특이적 표적 세포에 의한 흡수 (uptake)에 알맞은 특이적 흡수 서열을 함유하도록 조작될 수 있다.

유전자 요법 벡터는 전형적으로 이하에 기술되는 바와 같이 전신적 투여 (예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 또는 두개내 주입) 또는 국소 적용에 의해서 개개 환자에게 투여함으로써 생체내 전달될 수 있다. 대신으로, 벡터는 개개 환자로부터 이식된 세포 (예를 들어, 림프구, 골수 흡인액, 조직 생검) 또는 보편적 공여체 조혈 줄기세포와 같은 세포와 같은 세포에 생체외 전달하고, 이어서 통상적으로는 벡터를 혼입시킨 세포에 대해서 선택한 후에 세포를 환자에게 재이식할 수 있다.

진단, 탐색 또는 유전자 요법을 위한 생체외 세포 형질감염 (예를 들어, 형질감염된 세포의 숙주 유기체 내로의 재-주입에 의함)은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려져 있다. 바람직한 구체예에서는, 세포를 대상 유기체로부터 분리하고, ZFP 핵산 (유전자 또는 cDNA)으로 형질감염시키고, 대상 유기체 (예를 들어, 환자)에게 다시 재-주입한다. 생체외 형질감염에 적합한 다양한 세포 타입은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려져 있으며 [참조: 예를 들어, Freshney et al ., Culture of Animal Cells , A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994), 및 환자로부터의 세포를 어떻게 분리 및 배양하는지에 대해 거론한 여기에 인용된 문헌].

하나의 구체예에서, 줄기세포는 세포 형질감염 및 유전자 요법을 위한 생체외 절차에서 사용된다. 줄기 세포를 사용하는 것의 이점은 이들이 시험관내에서 다른 세포 타입으로 분화될 수 있거나, 포유동물 (예를 들어, 세포의 공여체) 내로 도입되어, 여기에서 골수 내로 생착될 수 있다는 점이다. GM-CSF, IFN-γ 및 TNF-α와 같은 사이토킨을 사용하여 시험관내에서 CD34+ 세포를 임상적으로 중요한 면역세포 타입으로 분화시키는 방법은 공지되어 있다 [참조: Inaba et al ., J. Exp . Med . 176:1693-1702 (1992)].

줄기세포는 공지된 방법을 사용하여 형질도입 및 분화를 위해서 분리된다. 예를 들어, 줄기세포는 골수 세포를 CD4+ 및 CD8+ (T 세포), CD45+ (panB 세포), GR-1 (과립구), 및 Iad (분화된 항원 표시 세포)와 같은 원치 않는 세포를 결합시키는 항체와 함께 팬닝 (panning)함으로써 골수 세포로부터 분리된다 [참조: Inaba et al ., J. Exp . Med . 176:1693-1702 (1992)].

치료학적 ZFP 핵산을 함유하는 벡터 (예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 리포좀 등)는 또한, 생체내에서 세포의 형질도입을 위하여 유기체에 직접 투여될 수 있다. 대신으로, 무모 DNA가 투여될 수 있다. 투여는 주사, 주입, 국소 적용 및 전기천공을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 것으로, 분자를 혈액 또는 조직 세포와의 궁극적으로 접촉하도록 도입시키기 위해서 통상적으로 사용되는 경로 중의 어떤 것에 의해서라도 이루어진다. 이러한 핵산을 투여하는 적합한 방법은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려져 있으며, 비록 하나 이상의 경로를 사용하여 특정의 조성물을 투여할 수 있지만, 특정의 경로는 종종 또 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다.

조혈 줄기세포 내로 DNA를 도입시키는 방법은 예를 들어, 미국 특허 제 5,928,638호에 기술되어 있다. 조혈 줄기세포, 예를 들어, CD34 ⁺ 세포 내로 이식유전자를 도입시키는데 유용한 벡터는 아데노바이러스 타입 35를 포함한다.

이식유전자를 면역세포 (예를 들어, T-세포) 내로 도입시키는데 적합한 벡터는 비-통합성 렌티바이러스 벡터를 포함한다 [참조: 예를 들어, Ory et al . (1996) Proc . Natl. Acad . Sci . USA 93: 11382-11388; Dull et al . (1998) J. Virol . 72: 8463-8471; Zuffery et al . (1998) J. Virol . 72: 9873-9880; Follenzi et al . (2000) Nature Genetics 25: 217-222].

약제학적으로 허용되는 담체는 부분적으로 투여되는 특정한 조성물에 의해서뿐만 아니라 조성물을 투여하기 위해서 사용된 특정한 방법에 의해서 결정된다. 따라서, 이하에 기술된 바와 같이 이용할 수 있는 광범하게 다양한 약제학적 조성물의 적합한 제제가 있다 [참조: 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences , 17th ed., 1989].

상기 언급한 바와 같이, 기술된 방법 및 조성물은 원핵 세포, 진균 세포, 아르키알 (Archaeal) 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 동물 세포, 척추동물 세포, 포유동물 세포 및 인간 세포를 포함한 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 세포의 어떤 타입에서라도 사용될 수 있다. 단백질 발현에 적합한 세포주는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지되어 있으며, COS, CHO (예를 들어, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (예를 들어, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), perC6, 스포도프테라 푸지페르다 ( Spodoptera fugiperda ) (Sf)와 같은 곤충 세포, 및 사카로마이세스 ( Saccharomyces ), 피치아 ( Pischia ) 및 스키조사카로마이세스 ( Schizosaccharomyces )와 같은 진균 세포를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 이들 세포주의 자손, 변이체 및 유도체가 또한 사용될 수도 있다. 또한, 이중가닥 파손에 민감할 수 있는 일차 세포가 사용될 수 있다. 이들에는 CD34+ 인간 줄기세포, 배아 줄기세포, 마우스 배아 줄기세포, 및 유도된 다능성 세포가 포함될 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다. 마우스 배아 줄기세포 및 난모세포와 같이 이식유전자 유기체의 발생에 사용되는 것으로 공지된 세포가 또한 사용될 수 있다.

적용

기술된 조성물 및 방법은 선택된 위치에서의 단일가닥 파손의 도입이 바람직한 어떤 적용예를 위해서나 사용될 수 있다. 더구나, 본 발명에서 입증된 바와 같이, 단일가닥 분할은 비-동종성 말단-접합 (NHEJ) 현상을 유도함이 없이 단일가닥 파손의 부위 내로의 표적화된 통합을 촉진시킨다 (동종성 재조합에 의해서).

따라서, 본 발명에 기술된 조성물 및 방법은 특이적으로 표적화된 단일가닥 분할이 바람직한 어떤 뉴클레아제 적용예를 위해서 및/또는 어떤 게놈서열을 외인성 서열 (예를 들어, 동종성의 비-동일 서열)로 치환시키기 위해서 사용될 수 있다.

표적화된 통합을 위해서, 하나 또는 그 이상의 아연 핑거 결합 도메인은 예정된 분할 부위에서 또는 그에 근접하여 표적 부위를 결합시키도록 조작되며, 조작된 아연 핑거 결합 도메인(들) 및 적어도 제1 및 2 분할 반-도메인 (다이머를 형성한다)을 포함하는 융합 단백질은 세포 내에서 발현된다. 제1 분할 도메인은 촉매적으로 불활성화되며, 융합 단백질의 아연 핑거 부분의 표적 부위에 대한 결합 및 분할 반-도메인의 다이머화에 의해 DNA 내에서 표적 부위에 근접하여 단일가닥 절단이 만들어진다.

단일가닥 파손의 존재는 동종성 재조합을 통한 외인성 서열의 통합을 촉진시킨다. 따라서, 게놈 내로 삽입될 적어도 하나의 외인성 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 전형적으로 동종성 재조합을 촉진시키기 위해서 표적 유전자와 상동성인 하나 또는 그 이상의 부분을 포함할 것이다.

관심이 있는 어떤 서열이라도 (외인성 서열) 본 발명에 기술된 바와 같이 도입될 수 있다. 예시적인 외인성 서열은 모든 폴리펩타이드 코드화 서열 (예를 들어, cDNAs), 프로모터, 인핸서 및 그 밖의 다른 조절 서열, shRNA 발현 카세트, 에피토프 태그 (tags), 마커 유전자, 분할 효소 인식 부위 및 다양한 타입의 발현구조물을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 또한, 외인성 핵산 서열은 하나 또는 그 이상의 RNA 분자 (예를 들어, 작은 헤어핀 RNA (shRNA), 억제성RNA (RNAi), 마이크로RNA (miRNA) 등)을 생산할 수 있다. 이러한 서열은 표준 분자 생물학적 기술 (클로닝, 합성 등)을 사용하여 쉽게 수득될 수 있고/있거나 상업적으로 입수할 수 있다. 예를 들어, MISSION™ TRC shRNA 라이브러리는 Sigma Aldrich로부터 상업적으로 입수할 수 있다.

마커 유전자는 항체 저항성 (예를 들어, 앰피실린 저항성, 네오마이신 저항성, G418 저항성, 퓨로마이신 저항성)을 매개하는 단백질을 코드화한 서열, 착색되거나 형광성이거나 발광성인 단백질 (예를 들어, 녹색 형광성 단백질, 증진된 녹색 형광성 단백질, 적색 형광성 단백질, 루시퍼라제)을 코드화한 서열, 세포 표면 항원 (예를 들어, ΔNGFR) 및 증진된 세포 성장 및/또는 유전자 증폭을 매개하는 단백질 (예를 들어, 디하이드로폴레이트 환원효소)을 포함하나 이들로 제한되지는 않는다. 에피토프 태그는 예를 들어, FLAG, His, myc, Tap, HA 또는 어떤 검출가능한 아미노산 서열의 하나 또는 그 이상의 카피 (copies)를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 외인성 서열은 항체, 항원, 효소, 수용체 (세포 표면 또는 핵), 호르몬, 림포킨, 사이토킨, 리포터 폴리펩타이드, 성장 인자 및 상기한 것 중의 어떤 것의 기능적 단편을 포함하는 것으로 (단, 이들로 제한되지는 않는다), 세포 내에서의 그의 발현이 바람직한 모든 폴리펩타이드를 코드화한 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 코드화 서열은 예를 들어, cDNAs일 수 있다. 외인성 서열은 또한 전사 조절 인자를 코드화할 수 있다.

예를 들어, 외인성 서열은 다음의 유전적 질환 중의 어떤 것을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 유전적 질환을 갖는 대상체에게서 결여되거나 비-기능적인 폴리펩타이드를 코드화한 서열을 포함한다: 연골발육부전, 색맹, 산 말타제 결핍, 아데노신 데아미나제 결핍 (OMIM No.102700), 부신백질이영양증, 에카르디 증후군 (aicardi syndrome), 알파-1 안티트립신 결핍, 알파-탈라세미아 (alpha-thalassemia), 안드로겐 불감 증후군, 아페르 (apert) 증후군, 부정맥 유발성 우심실 이형성증, 모세혈관확장성 운동실조, 바스 (barth) 증후군, 베타-탈라세미아, 청색 고무 포말 모반 증후군 (blue rubber bleb nevus syndrome), 카나반병 (canavan disease), 만성 육아종성 질환 (CGD), 묘성 증후군, 낭포성 섬유증, 더컴병 (dercum's disease), 외배엽 이형성증, 판코니 빈혈 (fanconi anemia), 진행성 골화 성 섬유이형성증, 취약 (fragile) X 증후군, 갈락토즈혈증, 고셔병 (Gaucher's disease), 전신성 강글리오사이드증 (예를 들어, GM1), 혈색소증, 베타-글로빈의 6번째 코돈에서의 헤모글로빈 C 돌연변이 (HbC), 혈우병, 헌팅톤병 (Huntington's disease), 후를러 (Hurler) 증후군, 저포스파테이스증 (hypophosphatasia), 클라인펠터 (Klinefelter) 증후군, 크라베병 (Krabbes Disease), 랑거-기디온 (Langer-Giedion) 증후군, 백혈구 부착 결핍 (LAD, OMIM No. 116920), 백질이영양증, QT 간격 연장 증후군 (long QT syndrome), 마르팡 (Marfan) 증후군, 뫼비우스 (Moebius) 증후군, 점액다당질증 (mucopolysaccharidosis; MPS), 조슬개 증후군 (nail patella syndrome), 신성 요붕증, 신경섬유종증, 네이만-픽병 (Neimann-Pick disease), 골형성부전증, 포르피린증, 프라더-윌리 (Prader-Willi) 증후군, 조로증, 프로테우스 (Proteus) 증후군, 망막아세포증, � ��트 (Rett) 증후군, 루빈스타인-테이비 (Rubinstein-Taybi) 증후군, 산필립포 (Sanfilippo) 증후군, 중증 복합 면역결핍증 (SCID), 슈와크만 (Shwachman) 증후군, 겸상 적혈구병 (겸상 적혈구 빈혈), 스미스-마게니스 (Smith-Magenis) 증후군, 스티클러 (Stickler) 증후군, 테이-삭스병 (Tay-Sachs disease), 혈소판감소-요골 결손 (Thrombocytopenia Absent Radius; TAR) 증후군, 트리처 콜린스 (Treacher Collins) 증후군, 삼염색체성 (trisomy), 결절성 경화증, 터너 (Turner's) 증후군, 우레아 회로 장애, 폰 히펠-란다우병 (von Hippel-Landau disease), 바르덴부르그 (Waardenburg) 증후군, 윌리암스 (Williams) 증후군, 윌슨병 (Wilson's disease), 비스코트-앨드리치 (Wiskott-Aldrich) 증후군, X 연관 림프세포증식성 증후군 (XLP, OMIM No. 308240).

단일가닥 분할에 이은 표적화된 통합에 의해서 치료될 수 있는 추가의 예시적인 질환에는 후천성 면역결핍증, 라이소좀 저장병 (예를 들어, 고셔병, GM1, 파브리병 (Fabry disease) 및 테이-삭스병), 점액다당질증 (예를 들어, 헌터병 (Hunter's disease), 후를러병), 혈색소병증 (예를 들어, 겸상 적혈구병, HbC, α-탈라세미아, β-탈라세미아) 및 혈우병이 포함된다.

특정의 구체예에서, 외인성 서열은 표적화된 통합을 수행한 세포의 선택을 허용하는 마커 유전자 (상술함), 및 추가의 작용성을 코드화한 결합된 서열을 포함할 수 있다.

더구나, 비록 발현에 필요한 것은 아니지만, 외인성 서열은 또한 전사 또는 해독 조절 서열, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인슐레이터, 내부 리보좀 유입 부위, 2A 펩타이드를 코드화한 서열 및/또는 폴리아데닐화 시그날일 수도 있다.

본 발명에 기술된 바와 같은 뉴클레아제는 또한, 하나 또는 그 이상의 게놈 서열의 불활성화 (부분적이거나 완전함)를 위해서 사용될 수 있다. 불활성화는 예를 들어, 미스센스 또는 논센스 코돈의 코드화 부분 내로의 표적화된 재조합에 의해서, 유전자 또는 조절 부분을 붕괴시키기 위한 부적절한 서열 (즉, "스터퍼 (stuffer)" 서열)의 유전자 또는 그의 조절 부분 내로의 표적화된 재조합에 의해서, 또는 스플라이스 수용기 (splice acceptor) 서열의 인트론 내로의 재조합을 표적화하여 전사물의 미스-스플리싱을 야기함으로써 달성될 수 있다.

내인성 유전자의 ZFN 매개된 불활성화 (예를 들어, 녹다운 또는 녹아웃)를 사용하여, 예를 들어, 세포소멸 또는 단백질 생산에 수반된 유전자를 결여하는 세포주를 생성시킬 수 있다 (예를 들어, 푸코실화와 같은 해독-후 변형). ZFN 매개된 불활성화는 또한 이식유전자 유기체 (예를 들어, 식물 또는 이식유전자 동물)를 생성시키기 위해서 사용될 수 있다.

감염성 또는 통합된 바이러스 게놈의 표적화된 분할을 사용하여 숙주 내에서 바이러스 감염을 치료할 수 있다. 추가로, 바이러스에 대한 수용체를 코드화한 유전자의 표적화된 분할을 사용하여 이러한 수용체의 발현을 차단함으로써 숙주 유기체 내에서 바이러스 감염 및/또는 바이러스 확산을 방지할 수 있다. 바이러스 수용체 (예를 들어, HIV에 대한 CCR5 및 CXCR4 수용체)를 코드화한 유전자의 표적화된 돌연변이유발을 사용하여 수용체가 바이러스에 결합할 수 없도록 함으로써 새로운 감염을 방지하고, 기존의 감염의 확산을 차단할 수 있다 [참조: 국제 특허공개 제WO 2007/139982호]. 표적화될 수 있는 바이러스 또는 바이러스 수용체의 비제한적 예로는 HSV-1 및 HSV-2와 같은 헤르페스 심플렉스 (herpes simplex) 바이러스 (HSV), 바리셀라 주스터 (varicella zoster) 바이러스 (VZV), 엡스타인-바르 (Epstein-Barr) 바이러스 (EBV) 및 사이토메갈로바이러스 (CMV), HHV6 및 HHV7이 포함된다. 바이러스의 간염 집단에는 A형 간염 바이러스 (HAV), B형 간염 바이러스 (HBV), C형 간염 바이러스 (HCV), 델타 간염 바이러스 (HDV), E형 간염 바이러스 (HEV) 및 G형 간염 바이러스 (HGV)가 포함된다. 피코르나비리다에 (Picornaviridae) (예를 들어, 폴리오바이러스 (polioviruses) 등); 칼리시비리다에 (Caliciviridae); 토가비리다에 (Togaviridae) (예를 들어, 루벨라 (rubella) 바이러스, 뎅기열 (dengue) 바이러스 등); 플라비비리다에 (Flaviviridae); 코로나비리다에 (Corona-viridae); 레오비리다에 (Reoviridae); 비르나비리다에 (Birnaviridae); 라브도비리다에 (Rhabodoviridae) (예를 들어, 광견병 바이러스 등); 필로비리다에 (Filoviridae); 파라믹소비리다에 (Paramyxoviridae) (예를 들어, 볼거리 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스 등); 오르토믹소비리다에 (Orthomyxoviridae) (예를 들어, 인플루엔자 바이러스 타입 A, B 및 C 등); 분야비리다에 (Bunyaviridae); 아레나비리다에 (Arenaviridae); 레트로비리다에 (Retroviradae); 렌티바이러스 (lentiviruses) (예를 들어, HTLV-I; HTLV-II; HIV-1 (또한, HTLV-III, LAV, ARV, hTLR 등으로 공지됨), HIV-II); 시미안 면역결핍 바이러스 (SIV), 인간 파필로마바이러스 (papillomavirus) (HPV), 인플루엔자 바이러스 및 진드기-매개 뇌염 바이러스를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 그 밖의 다른 바이러스 또는 이들의 수용체가 표적화될 수 있다. 이들 및 다른 바이러스에 대한 설명에 관해서는 예를 들어, 문헌 [ Virology , 3rd Edition (WK Joklik ed. 1988); Fundamental Virology , 2nd Edition (BN Fields and DM Knipe, eds. 1991)]을 참고로 한다. HIV에 대한 수용체는 예를 들어, CD4, CCR-5 및 CXCR-4를 포함한다.

본 발명에 기술된 방법 및 조성물은 또한, 시험관내 정황에서, 예를 들어, 분리된 DNA 주형에서 부위-특이적 닉의 도입을 위한 도구로서, 핵산 증폭을 위해서 (예를 들어, 클로닝, 라이브러리 생산을 위해서), 어떤 샘플에서 핵산 검출을 위해서 (예를 들어, 유전적 조건 및/또는 감염성 성분의 존재의 진단제로서), 게놈 워킹 (genome walking)을 위해서, DNA 메틸화 분석 등을 위해서 사용될 수 있다 [참조: 예를 들어, 미국 특허 제7,314,714; 7,112,423; 7,090,804; 6,884,586; 및 6,395,523호]. 예를 들어, 본 발명에 기술된 바와 같은 닉킹 (nicking) 뉴클레아제는 긴 비-상보적 오버행 (overhangs)뿐만 아니라 다른 구조물을 생성시키기 위해서 단독으로, 또는 다른 효소와 함께 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 기술된 바와 같은 조성물은 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)의 검출에 대한 빠른 (15분 정도로 짧음) 대체방법을 제공하는 등온성 DNA 증폭방법, SDA (stand displacement amplification)를 위한 닉 (또는 갭) 이중가닥 DNA의 생성을 위해서 사용될 수 있다 [참조: 예를 들어, 미국 특허 제5,523,204호; Walker et al . (1992) Nucleic Acids Res . 20(7): 1691-1696]. 현재까지 SDA의 사용은, 변형된 스트랜드 상에서 효소 분할에 대해서 저항성일 수 있는 헤미-포스포르티오에이트 DNA 듀플렉스를 생산함으로써 분해 대신에 효소적 닉킹을 야기하여 변위반응 (displacement reaction)을 구동시키기 위해서 변형된 포스포르티오에이트 뉴클레오타이드에 대해, 또는 이중가닥 DNA를 절단하지 않는 조작된 "니카제 (nickase)" 효소에 대해 의존적이었다. 따라서, 본 발명에 기술된 뉴클레아제는 SDA가 현재 적용되는 어떤 적용예에 대해서 쉽게 순응될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 핵산 서열의 검출에, 및 따라서, 유전적 질환 및/또는 어떤 샘플 (예를 들어, 혈액, 뇨, 혈장, 조직 샘플, 분리된 세포, 고정된 세포 등)로부터 HPV, 간염 바이러스 (HCV, HBV, HAV), HIV, 마리코박테리움 튜버큘로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 및 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis)와 같은 감염성 성분의 존재를 진단하는데 사용될 수 있다.

추가의 시험관내 적용예에는 엑소뉴클레오라이틱 분해 (exonucleolytic degradations)의 생성이 포함된다. 예를 들어, 본 발명에 기술된 바와 같은 닉킹 뉴클레아제는 소결실 (nested deletion)의 발생을 위해서 S1과 함께 사용될 수 있다 [참조: 예를 들어, 미국 특허 제7,244,560; 6,867,028; 및 6,828,098호].

실시예

실시예 1: 돌연변이체 분할 도메인을 갖는 ZFNs 의 디자인 및 구성

국제 특허공개 제WO 2007/139982호에 기술된 바와 같은 CCR5에 대해서 표적화된 아연 핑거 단백질을 본질적으로 미국 특허공보 제20050064474호 및 국제 특허공개 제WO2005/014791호에 기술된 바와 같이, 미국 특허공보 제2008/0131962호에 기술된 바와 같은 조작된 분할 도메인에 작동적으로 결합시켰다.

구체적으로, 8196z로 명시된 CCR5 결합 아연 핑거 단백질을 (1) "8196zKK"로 명시된 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 형성시키기 위한 E490K 및 I538K 돌연변이 또는 (2) "8196zDR"로 명시된 ZFN을 생성시키기 위한 D483R 돌연변이를 갖는 분할 도메인을 형성하는 편성 헤테로다이머에 융합시켰다. 마찬가지로, 8267로 명시된 CCR5 결합 아연 핑거 단백질을 (1) "8267EL"로 명시된 ZFN을 형성시키기 위한 Q486E 및 I599L 돌연변이 또는 (2) "8267RD"로 명시된 ZFN을 형성시키기 위한 R487D 돌연변이를 갖는 분할 도메인을 형성하는 편성 헤테로다이머에 융합시켰다. 4 가지 ZFNs 모두의 촉매적으로 불활성인 형태는 또한 아미노산 잔기 450 (D를 N으로, D450N으로 명시됨); 467 (D를 A로, D467A로 명시됨); 또는 469 (K를 A으로, K469A로 명시됨)의 부위-지시된 돌연변이유발에 의해서 제조하였다.

실시예 2: 분할 도메인과 하나의 촉매적 불활성 분할 도메인의 다이머는 단일가닥 파손을 유도한다

실시예 1에 기술된 ZFNs를 평가된 다양한 쌍별 조합 및 분할 현상에서 사용하였다. 특히, 실시예 1에 기술된 ZFN 변이체는 TNT T7 Quick™ 커플링된 전사/해독 시스템 (Promega)을 사용하여 합성하였다.

ZFNs 표적 부위를 함유하는 적절한 기질은 CCR5 ZFN 결합 부분을 측면에 둔 CCR5 서열을 PCR 증폭시켜 292 염기쌍 기질을 생성시킴으로써 생성되었다. 기질을 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제를 사용하여 ³² P 말단-표지하고, 다음의 ZFN쌍과 배양하였다: 8196zKK 및 8267EL (WT); 8196zKK 및 8267EL (여기에서, 8267 EL은 촉매적 불활성화 점돌연변이 D450N을 포함한다 (D450N)); 8196zKK 및 8267EL (여기에서, 8267 EL은 촉매적 불활성화 점돌연변이 D467A를 포함한다 (D467A)); 8267RD 및 8196zDR (WT); 8267RD 및 8196zDR (여기에서, 8196zDR은 촉매적 불활성화 점돌연변이 D450N을 포함한다 (D450N)); 및 8267RD 및 8196zDR (여기에서, 8196zDR은 촉매적 불활성화 점돌연변이 D467A를 포함한다 (D467A)). 방사성-표지된 기질 DNA 및 ZFN 단백질의 혼합물을 후술하는 바와 같은 변형을 갖는 문헌 [Miller et al (2007) Nat . Biotech . 25:778-785]에 기술된 바와 같이 37℃에서 2 시간 동안 배양하였다.

분할된 DNA를 페놀/클로로포름에 의해서 추출하고, 미처리하거나 (이중가닥 분할 생성물) DNA 변성 용액 (1.0 M 글리옥살, 10 mM NaH ₂ PO ₄ /Na ₂ HPO ₄ , pH 7.0, 50% DMSO)으로 처리하여 단일가닥 DNA를 생성시킨 후에 10% Ready™ 겔 TBE 겔 (Invitrogen) 상에서 분리시켰다.

도 2a에 나타낸 바와 같이, 이중가닥 분할 생성물은 단지 ZFN 쌍 8196zKK + 8267EL (WT) 또는 8267RD + 8196zDR (WT)에 의해서만 효율적으로 생성되었으며, 여기에서 좌측 및 우측 ZFNs의 FokI 분할 반-도메인은 촉매적으로 활성이다. 어버이 비절단 DNA (292bp)는 모든 ZFN 쌍에 의해서 존재한다. 두 개의 ZFNs 모두가 촉매적으로 활성인 경우에는 (8196zKK + 8267EL (WT) 또는 8267RD + 8196zDR (WT) 쌍), 2개의 단편 (~168 bp 및 ~124 bp)이 나타났다. ZFNs 중의 하나가 지시된 점돌연변이에 의해서 촉매적으로 불활성화된 모든 ZFN 쌍 조합의 경우에, CCR5 표적 DNA에서 이중가닥 파손은 생성되지 않았다.

그러나, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 하나의 촉매적 불활성 ZFN을 갖는 ZFN 쌍은 단일가닥 파손을 유도하였다. 특히, 이중가닥 분할 생성물에서 FokI 분할 반-도메인 둘 다가 촉매적으로 활성인 경우에 나타난 ~168 bp 단편 (도 2a, 왼쪽으로부터 레인 3 및 8)은 ZFN 쌍 8196zKK + 8267EL D450N 및 8196zKK + 8267EL D467A (하나의 촉매적 불활성 분할 도메인을 함유)에 의해서 처리된 단일가닥 분할 생성물에서도 나타났다 (참조: 도 2b, 왼쪽으로부터 레인 4 및 5). 각각의 DNA 스트랜드의 5' 말단만이 말단-표지되었기 때문에, 더 작은 ~124 bp 단편은 보이지 않는다 (참조: 도 2c).

마찬가지로, 이중가닥 분할 생성물에서 FokI 분할 반-도메인 둘 다가 촉매적으로 활성인 경우에 나타나는 ~124 bp 단편 (도 2a, 왼쪽으로부터 레인 3 및 8)은 또한 8267RD + 8196zDR D450N 또는 8267RD + 8196zDR D467A (각각 촉매적 불활성 분할 반-도메인을 함유)에 의해서 처리된 단일가닥 분할 생성물에서도 나타났다 (참조: 도 2b, 왼쪽으로부터 레인 9 및 10). 각각의 DNA 스트랜드의 5' 말단만이 말단-표지되었기 때문에, 역시 더 큰 ~168 bp 단편은 이들 샘플에서 보이지 않는다 (참조: 도 2c).

이들 결과는 하나의 분할 반-도메인이 촉매적으로 불활성화된 분할 반-도메인의 다이머의 사용이 이중가닥 DNA에서 SSBs/닉을 생성시키는 것을 입증한다.

실시예 3: 세포에서 단일가닥 어니일링에 의한 SSB / 닉의 수복

A. 효모 세포

SSB/닉이 표적화된 유전자좌에서 재조합-기본 게놈 편집을 유도하기 위한 대체방법으로 사용될 수 있는지 여부를 평가하기 위해서, 본 발명자들은 우선 본질적으로 문헌 [Doyon et al . (2008) Nat Biotechnol 26:702-8 및 미국 특허공보 제20090111119호]에 기술된 바와 같이 효모 내에서 시스템을 시험하였다.

CCR5 ZFN-표적화 부위가 MEL1 유전자의 2개의 중첩성 비기능적 단편 사이에 도입된 SSA-MEL1 리포터 효모 스트레인을 다음의 ZFN 발현 플라스미드로 형질전환시켰다: ZFN-L-EL-D450N + ZFN-R-KK (D450N), ZFN-L-EL-D467A + ZFN-R-KK (D467A) 또는 대조 벡터 (대조군). ZFN 발현은 세포를 2% 갈락토즈 내에서 2 내지 6 시간 동안 배양함으로써 유도되었으며, 그 후에 글루코즈 배지 내에서 밤새 배양하고, 갈락토시다제 활성에 대해서 시험하였다.

상당히 증가된 갈락토시다제 활성은 대조 벡터에 의해서 처리된 배양물 (2.7-4.1 mU)에 비해서 D450N/WT (40.0-75.5 mU) 또는 D467A/WT (51.7-96.0 mU) ZFNs로 처리된 배양물에서 갈락토즈에 의해 2-6 시간 동안 ZFN 발현을 유도함에 따라 관찰되었으며, 이것은 본 발명에 기술된 바와 같은 ZFNs에 의해서 유도된 SSB/닉은 재조합원성 (recombinogenic)일 수 있으며, 효모 내에서 단일가닥 어니일링에 의해서 수복될 수 있음을 입증한다.

ZFNs가 DSB가 아닌 SSB/닉의 SSA 수복을 통해서 MEL1 발현을 유도하였음을 보장하기 위해서, DSB 형성을 유도하는 ZFNs의 능력을 또한 평가하였다. 동종성 주형 서열의 부재 하에서, DSB 유도는 콜로니에서 효모 세포의 99.8%에 대해서 치명적이다. HO 유전자좌 내로 통합된 CCR5 ZFN 표적 부위를 갖는 효모 세포를 ZFN 발현 플라스미드로 형질전환시키고, 10-배 계열 희석도에서 글루코즈 또는 갈락토즈를 함유하는 최소 배지 내에서 배양하였다. 단지 ZFNs가 DSB를 유도하지 않는 세포만이 ZFN 발현의 유도를 존속시키는 것으로 예상될 수 있다.

세포는 이들 세포에 도입된 ZFN 발현 플라스미드와는 무관하게 글루코즈의 존재 하에서 잘 성장하였다 (ZFN 발현의 유도 없음). 갈락토즈의 존재 하에서, 본 발명자들은 대조 벡터로 처리된 배양물과 비교하여 WT/WT ZFNs로 처리된 경우의 배양물에서 생존한 효모 세포의 수에 있어서 2-3 로그 감소를 관찰하였다. 대조적으로, WT/WT ZFNs 중의 하나가 ZFNs 변이체 (D450N 또는 D467A) 중의 하나로 치환시킨 발현 구조물로 형질전환된 효모는 대조 벡터로 처리된 이들 배양물과 구분할 수 없었다. 이들 배양물로부터 취한 추출물의 웨스턴 블럿 분석은 ZFN 단백질의 발현 레벨이 유사하였음을 뒷받침하였다.

관찰된 치사율은 통합된 CCR5 표적 부위의 존재에 대해 완전히 의존적이기 때문에, 이것은 야생형 ZFN에 의한 랜덤 DSB의 생성에 기인하지 않는다. 따라서, 이들 결과는 생존 세포의 환경에서 ZFNs 생성 SSB가 SSB/닉 형성을 통해서 SSA 매개된 수복을 유도하고, DSB를 촉진시키지 않음을 뒷받침하였다.

B. 포유동물 세포

SSB/닉이 포유동물 세포에서 HDR-의존적 SSA 경로에 의해서 수복될 수 있는지 여부를 평가하기 위해서, K562 세포를 ZFN 발현 플라스미드 및 SSA-GFP 리포터 플라스미드 (여기에서, 반복된 동종성 서열을 갖는 eGFP 개방 판독 프레임은 CCR5 ZFN 표적 부위 (HDR 의존성에 필요함)를 코드화한 DNA의 스트레치 (stretch) 측면에 배치된다)로 공동-형질감염시켰으며, 그 후에 SSA 매개된 수복을 겪고 GFP를 발현하는 세포의 수를 유동 세포측정 분석에 의해서 모니터링하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, SSA-GFP 리포터 단독으로 처리된 샘플 (0.67%)보다 상당히 더 많은 GFP ⁺ 세포가 D450N/WT (ZFN-L-EL-D450N + ZFN-R-KK + SSA-GFP 리포터, 3.55%) 또는 D467A/WT (ZFN-L-EL-D467A + ZFN-R-KK + CCR5-SSA-GFP 리포터, 3.40%)로 처리된 샘플에서 관찰되었지만, 이것은 WT/WT ZFNs (ZFN-L-EL + ZFN-R-KK + SSA-GFP 리포터, 8.58%)으로 처리된 샘플에 비해서 2-3 배 더 적다.

이들 데이터는 SSBs를 생성하는 ZFNs에 의해서 생성된 SSB/닉이 또한 포유동물 세포 내에서 SSA 경로에 의해 수복될 수 있음을 나타낸다.

실시예 4: 단일가닥 파손은 동종성 재조합에 의한 표적 통합을 촉진시킨다

SSB/닉을 유도하여 동종성 재조합 및/또는 NHEJ를 촉진시키는 ZFNs의 능력이 또한 측정되었다.

간략하면, K562 세포를 표 1에 제시된 ZFN 조합 단독으로, 또는 표 1에 제시된 ZFN 조합과 CCR5 패치 공여체 서열로 처리하였다. 게놈 DNAs를 3일 후에 처리된 세포로부터 수거한 다음에, Surveyor™ 뉴클레아제 시험 및 TaqMan™ qPCR 시험에 의해서 NHEJ 현상에 대해서 시험하였다. 또한, RFLP 시험을 사용하여 동종성 재조합에 의한 표적화된 통합을 시험하였다.

A. 비-동종성 말단 접합

상기 언급한 바와 같이, NHEJ 현상의 백분율은 Surveyor™ 뉴클레아제 시험 및 TaqMan™ qPCR 시험에 의해서 평가하였다. 간략하면, Surveyor™ 뉴클레아제 시험은 문헌 [Miller et al (2007) Nat . Biotech . 25:778-785]에 기술된 바와 같이 수행되었다. Taqman™ qPCR 시험은 제조자의 설명에 따라 수행하여 CCR5 ZFNs로 이중가닥 분할시킨 후에 세포의 약 10 내지 30%에서 나타나는 것으로 공지된 5 bp 삽입의 존재를 측정하였다. 따라서, 특정의 프라이머는 이러한 펜타머 (pentamer) 삽입 현상을 기초로 하여 디자인하고, 시험하여 최적화하였다. 이 시험은 펜타머 삽입 서열을 함유하는 플라스미드 DNA의 1 카피를 검출할 수 있다. 이 시험은 또한, 게놈 DNA 샘플에서 0.01% (1e-4) NHEJ 현상을 쉽게 검출할 수 있다.

비절단 어버이 DNA (292bp) 이외에도, 분할된 큰 단편 (~168bp) 및 작은 단편 (~124bp)의 존재는 시험 과정 중에 DNA 서열의 NHEJ 유도된 변형 및 DNA 헤테로듀플렉스 (heteroduplex)의 후속 형성에 기인하는 Surveyor™ 뉴클레아제에 의한 분할을 나타낸다.

표 1 및 도 4a에서 나타낸 바와 같은 결과는 야생형 (WT) ZFNs, 8196zKK + 8267EL 또는 8267RD + 8196zDR (1 및 9로 표지된 레인)의 조합이 DSB를 유도하였고, 이들 중의 54.3% 및 36.7%가 각각 NHEJ에 의해서 수복되었음을 입증한다. 또한, 단지 야생형 ZFs에 의한 NHEJ를 나타내는 도 5b를 참고로 한다.

이와는 대조적으로, 방사성 Surveyor™ 뉴클레아제 시험 및 고도로 민감한 Taqman™ qPCR 시험에 의해서 검출된 바와 같이 NHEJ에 의한 수복의 부재를 기초로 하여, 2개의 ZFNs 중의 하나가 FokI 도메인 내에 촉매적으로 불활성화된 점돌연변이를 함유하는 다른 ZFN 조합 중의 어떤 것도 이중가닥 파손을 유도하지 않았다 (참조: 도 5b).

따라서, 하나의 ZFN이 본 발명에 기술된 바와 같이 촉매적으로 불활성화된 ZFN 쌍에 의해서 유도된 DNA SSBs/닉은 NHEJ를 유도할 수 없다.

B. 표적화된 통합

다양한 공여체의 표적화된 통합이 또한 평가되었다. 시험한 공여체에는 Bgl I 제한효소 부위, 및 2 개의 CCR5 ZFN 결합 부위 사이에 총 46bp 삽입을 갖는 더 작은 46 pb CCR5-패치 공여체 (R5-패치 공여체); eGFP 발현 카세트가 CCR5에 대해서 동종성인 서열의 측면에 있는 1.6kb CCR5-GFP 공여체 (R5-GFP 공여체); 및 CCR5-GFP 공여체의 동종성 CCR5 서열 사이의 eGFP 마커를 절단된 NGFR 리포터 유전자로 치환시키고, 공여체 주형 플라스미드 상의 동종성 CCR5 서열의 바깥쪽에 eGFP 마커 카세트를 배치한 추가의 공여체 (CCR5-NGFR-outGFP 공여체)가 포함된다. 이하에 구체적으로 나타내지 않는 한, 이하의 ZFNs가 사용되었다: 8267-EL (또는 ZFN-L-EL), 8267-EL-D450N (또는 ZFN-L-EL-D450N), 8267-EL-D467A (ZFN-L-EL-D467A), 및 8196zKK (ZFN-R-KK).

더 작은 46 bp CCR5-패치 공여체의 존재 하에서, 표적화된 통합은 제한 단편 길이 다형현상 (RFLP) 시험에 의해서 평가되었으며, 여기에서 BglI 분해된 야생형 PCR 생성물은 2433bp이며, 패치-함유 변형된 CCR5 PCR 생성물의 BglI 분해된 단편은 각각 1554bp 및 925bp이다.

도 4b 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 야생형 (WT) ZFNs, 8196zKK + 8267EL 또는 8267RD + 8196zDR의 조합은 DSB를 유도하였으며, 이들 중의 29.4% 및 28.4%가 각각 동종성 재조합에 의해서 수복되었다. 촉매적 활성 FokI 도메인을 갖는 하나의 야생형 ZFN를 함유하는 조합의 대부분은 DNA 수복 현상의 0.5-2.5%에서 동종성 재조합을 유도한 반면에, 촉매적으로 불활성화된 FokI 도메인을 갖는 2개의 ZFNs를 함유하는 조합은 어떤 것도 동종성 재조합을 유도할 수 없었다. 더구나, 야생형 촉매적 활성 또는 촉매적으로 불활성화된 돌연변이체를 갖는 모든 단일 ZFNs는 이들 단독으로는 동종성 재조합을 유도하지 못하였다 (도 4c 및 4D).

또한, 별개의 실험에서 도 5a에 나타낸 바와 같이, WT/WT ZFNs (DSB-유도성)으로 처리된 K562 세포는 내인성 CCR5 대립인자의 30.6%에서 CCR5-패치 공여체의 표적화된 통합 (TI)을 나타내었다. D450N/WT 또는 D467A/WT ZFNs로 처리된 세포는 또한, CCR5 유전자좌에서 ~4-배 감소된 레벨의 효율로 TI를 나타내었다 (각각 7.3 and 8.0%). TI은 단일 ZFN (WT, D450N, 또는 D467A)으로 처리된 샘플 중의 어떤 것에서도 검출될 수 없었다.

CCR5-패치 공여체를 사용한 실험에서 분류되지 않은 풀 (pools)로부터 유래하는 단일 세포 클론의 유전자형 결정 (genotyping)이 또한 수행되었다. K562 세포를 표 2에 제시된 공여체 DNA 및 다음의 ZFN 발현 플라스미드의 조합으로 공동-형질감염시켰다: ZFN-L-EL + ZFN-R-KK (WT), ZFN-L-EL-D450N + ZFN-R-KK (D450N), 또는 ZFN-L-EL-D467A + ZFN-R-KK (D467A). 분류되지 않거나 분류된 풀을 제한된 희석에 의한 단일 세포 클로닝에 적용하였다. 단일 세포 유도된 클론을 현미경 하에서 선택하고, 후속 유전자형 결정 분석에 의해서 시험하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 확장된 클론의 25% 이상은 CCR5 유전자좌 내로의 표적화된 통합에 대해서 이형접합성이었으며, 이것은 K562 세포에서 SSB/닉의 유도를 통한 높은 빈도의 HDR 유도된 게놈 변형을 뒷받침한다.

마찬가지로, 상술한 더 큰 1.6 kb CCR5-GFP 공여체를 WT/WT CCR5 ZFN 및 니카제 돌연변이체 ZFN 쌍과 함께 K562 세포 내로 도입시켜 CCR5 유전자좌 내로의 GFP 발현 카세트의 표적화된 통합을 평가하였다. 간략하면, GFP ⁺ 세포를 문헌 [Moehle et al . (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104: 3055-3060]에 기술된 바와 같이 캘리포니아 대학 (University of California, Berkeley, CA)의 시설에서 형광 활성화된 세포 분류에 의해서 분류하고, 분류된 집단을 사용하여 단일 세포 유도된 클론을 생성시켰다.

WT/WT ZFN (ZFN-L-EL + ZFN-R-KK + CCR5-GFP)으로 처리된 샘플로부터 유도된 75 GFP+ 클론 중에서 70개의 클론 (93.3%)은 TI 현상을 가졌으며, 58개의 클론 (77.3%)은 NHEJ 현상을 가졌다. 반대로, D450N/WT ZFNs (ZFN-L-EL-D450N + ZFN-R-KK + CCR5-GFP)으로 처리하여 변형된 클론은 NHEJ-기본 변형을 나타내지 않는 반면에 총 93개의 클론 중의 61개 (65.6%)는 TI 현상을 나타내었다. D467A/WT ZFNs (ZFN-L-EL-D467A + ZFN-R-KK + CCR5-GFP)로 처리된 세포로부터 유도된 95개의 클론 중의 한 개 (1.1%)는 CCR5에서 NHEJ-유사 돌연변이를 나타낸 반면에 67개의 클론 (70.5%)은 TI 현상을 나타내었다 (참조: 표 2).

CCR5-tNGFR-outGFP 공여체를 사용한 실험의 경우에, 공여체 상에서 코드화된 서열의 HDR 유도된 TI을 겪는 세포는 단지 NGFR 마커를 발현하여야 하며, GFP는 발현하지 않아야 한다 (NGFR+GFP-). eGFP의 발현 (GFP+)은 미지의 부위에서의 공여체 플라스미드의 에피좀 DNA 또는 랜덤 통합의 존재를 나타낼 수 있다.

표면 NGFR 발현이 있는 세포를 풍부하게 하기 위해서, 세포는 우선 안티-NGFR mAb (BD Pharmingen)와 함께 배양하고, 세척한 다음에 CELLection Pan 마우스 IgG 키트 (Invitrogen)에서 제공된 다이날 비드 (Dynal beads)와 컨쥬게이트된 염소 안티-마우스 IgG와 배양하고 이어서 자기장을 통해서 통과시켰다. 그 후, 비드는 제조자의 설명 (Invitrogen)에 따르는 DNase I 분해에 의해서 풍부하게 된 세포로부터 제거하였다. 대신으로, 세포는 염색하지 않거나 PE와 컨쥬게이트된 안티-NGFR mAb (BD Pharmingen)와 함께 배양한 다음에 유동 세포측정 세포 분류기를 사용하여 GFP 및/또는 NGFR 발현을 기초로 하여 분류하였다.

Surveyor™ 뉴클레아제 시험에 의해서 측정되는 바와 같이, WT/WT ZFNs (ZFN-L-EL + ZFN-R-KK + CCR5-tNGFR-outGFP)로 처리된 세포로부터 유도된, 분류된 NGFR+GFP- 세포 풀은 높은 레벨 (63.2%)의 NHEJ-기본 변형을 함유하는 반면에 다음의 ZFNs로 처리된 세포에는 NHEJ 변형이 검출되지 않았다: D450N/WT (ZFN-L-EL-D450N + ZFN-R-KK + CCR5-tNGFR-outGFP) 또는 D467A/WT (ZFN-L-EL-D467A + ZFN-R-KK + CCR5-tNGFR-outGFP) (도 6a). NHEJ에 의한 변형의 레벨에 있어서의 이러한 차이는 또한 분류된 NGFR+GFP+ 세포 집단 및 비분류된 풀 둘 다에서 관찰되었다.

CCR5-tNGFR-outGFP 공여체 및 닉-유도성 ZFNs (D450N/WT 또는 D467A/WT)로 처리된 세포는 Surveyor™ 뉴클레아제 시험을 사용하여 NHEJ을 나타내지 않은 반면에, 본 발명자들은 이들 세포로부터 유도된 분류된 NGFR+GFP- 세포에서 CCR5 대립인자의 >18%는 사우던 블럿에 의해서 검출되는 바와 같이 표적화된 삽입 현상을 가졌다 (도 6b). 더구나, D450N/WT 및 D467A/WT ZFNs로 처리된 샘플로부터 생성된 단일 세포 유도된 클론은 각각 91 클론 중의 71개 (78%) 및 96 클론 중의 74개 (77.1%)가 그들의 게놈 내에 TI을 갖는 것을 뒷받침하였다 (표 2). 이와는 달리, ZFN-처리된 샘플로부터 유도된 것으로 공여체 플라스미드의 랜덤 통합을 겪은 세포에 대해서 풍부할 수 있는, 분류된 NGFR+GFP+ 세포에서 TI 현상은 나타나지 않았다. WT/WT ZFN (ZFN-L-EL + ZFN-R-KK + CCR5-tNFR-outGFP)-처리된 샘플로부터 유도된 분류된 NGFR+GFP+ 세포에서는 예상된 TI 밴드 이외에도, 아마도 CCR5에서 다양한 종류의 NHEJ 변형의 존재, 공여체 DNA 주형의 랜덤 통합, 또는 에피좀 DNA로서 공여체 플라스미드의 안정적인 지속성에 의해서 야기되는 다수의 사우던 블럿 밴드가 나타났다.

표 2에 나타낸 바와 같이, 확장된 클론의 25% 이상은 CCR5 유전자좌 내로의 표적화된 통합에 대해서 이형접합성이었으며, 이것은 SSB/닉의 유도를 통한 높은 빈도의 HDR 유도된 게놈 변형을 뒷받침한다.

따라서, DNA 내의 단일가닥 파손 (닉)은 포유동물 (예를 들어, 인간) 세포에서 동종성 재조합을 유도할 수 있으며, ZFN 분할 부위에서 정확하거나 빗겨난 표적 NHEJ 돌연변이를 감소 또는 제거하여 어떤 DNA 서열의 표적화된 통합을 위해서라도 사용될 수 있다.

실시예 5: Solexa ® 심층 서열결정 ( deep sequencing )

SSB/닉이 NHEJ 경로에 의해서 수복되는 여부를 더 평가하기 위해서, 본 발명자들은 WT/WT, D450/WT ZFNs, 또는 대조 처리된 K562 세포로부터의 CCR5 표적 유전자좌의 Solexa® 심층 서열결정을 수행하였다. 간략하면, 게놈 DNAs는 공여체 분자의 CCR5 동종성 부분 바깥에 위치하는 CCR5 프라이머의 쌍을 사용하여 증폭시켰다. 증폭된 2.5kb CCR5 단편을 겔 정제하고, BpmI 및 XhoI 제한효소 부위를 함유하는 프라이머를 사용하는 내부 PCR 반응을 위한 주형으로 사용하였다.

그 후, 앰플리콘을 BpmI 및 XhoI로 분해하여 PCR 생성물의 16bp의 5'-말단을 제거하여 서열결정이 추정적인 ZFN 분할 부위에 근접해서 시작하도록 하였다. 분해된 생성물을 겔 정제하고, BpmI- 또는 XhoI-분해된 DNA-유사 말단을 가지며 태그 또는 각각의 실험에 대해 독특한 3-뉴클레오타이드 '바-코드 (bar-code)'를 함유하지 않는 어댑터 (adaptors)에 결찰시켰다. 그 후, 어댑터-결찰된 PCR 생성물을 겔 정제하고, 일루미나 게놈 DNA 프라이머 (Illumina Genomic DNA Primers; Illumina)를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 생성된 PCR 생성물을 캘리포니아 대학 (University of California, Berkeley, CA)의 California Institute for Quantitative Biosciences에 위치한 Solexa® 심층 서열결정에 적용하였다. 관례대로 씌어진 컴퓨터 스크립트를 사용하여 WT이거나 NHEJ 매개된 결실 또는 삽입과 일치하는 모든 서열을 추출하였다.

485,000보다 큰 퀄리티 (quality) 서열 판독물 (각각의 염기에 대해서 > 99% 신뢰도)을 시험한 샘플의 각각으로부터 분석하였다. WT/WT ZFN 샘플 (ZFN-L-EL + ZFN-R-KK + CCR5-patch)로부터 유도된 서열은 713,186개의 서열 중에서 260,509개 (36.5%)가 NHEJ에 의해서 변형되는 것으로 나타났음을 보여주었다 [참조: 표 3].

명백히 대조적으로, D450/WT ZFNs (ZFN-L-EL-D450N + ZFN-R-KK + CCR5-패치)으로부터 분석된 서열은 944,605개의 서열 중의 단지 43개 (0.0046%)가 NHEJ에서 >7,900 배 감소를 가지고 NHEJ와 일치하는 돌연변이를 나타낸 것으로 밝혀졌다. D450/WT ZFN 처리된 세포에서 돌연변이율은 공여체 DNA 단독으로 또는 공여체와 단일 ZFN으로 처리된 샘플로부터의 데이터를 기초로 하여, 아마도 PCR 증폭 및 서열결정 단계 중에서 생성된 오차에 의해서 야기되는 시험의 배경 잡음 (0-0.0058%) 이내에 있다. 이것은 또한 대조군 및 ZFN 샘플에서 확인된 소수의 독특한 서열 변이체에 의해서 뒷받침된다. 이들 변형이 NHEJ에 기인하는 것이었다면, WT/WT ZFN-처리된 샘플에서 나타나는 것과 같이, 관찰된 서열 변형의 타입에 있어서의 더 큰 다양성이 예상될 수 있다.

CCR5-패치 공여체의 존재 하에서 D450N/WT ZFNs으로 처리된 세포는 7.3% 표적화된 통합 현상을 가졌으며, 이것은 ZFNs를 사용하여 NHEJ에 비해 HDR에 대해서 >1,500 배의 선호도가 있음을 의미한다. 단일 ZFN의 첨가는 NHEJ에 의한 유전자좌의 변형을 야기하지 않음을 주목하여야 하며, 이것은 DSB 형성에는 DNA 상에서 적절한 배향으로 2 ZFNs의 결합이 필요하다는 추가의 증거를 제공한다.

이들 데이터는 SSB-유도성 ZFN-처리된 샘플에서 NHEJ 현상이 없거나 매우 낮은 레벨로 있음을 시시하였다. 이들 데이터는 SSB/닉이 HDR에 의해서 선택적으로 수복되지만 NHEJ에 의해서는 그렇지 않음을 더 뒷받침한다.

실시예 6: 촉매적으로 불활성화된 ZFN 을 갖는 ZFN 쌍에 의해서 유도된 DSB 형성의 게놈- 와이드 ( wide ) 평가

SSB/닉은 온전한 반대 스트랜드를 주형으로 사용하여 DNA 폴리머라제 및 리가제에 의해서 정확하게 수복될 수 있는 것으로, 내인성 반응성 산소 종에 의해서, 또는 DNA 수복 및 복제와 같은 DNA 대사 중에 생산된 DNA 손상의 가장 빈번한 타입 중의 하나이다 [참조: Caldecott (2008) Nat Rev Genet 9:619-31]. γH ₂ AX 및 53BP1은 DNA 손상에 대한 자연적 반응으로 DSB의 부위로 동원되기 때문에, 의도된 표적 부위가 아닌 게놈 부위에서 낮은 레벨의 DSB를 유도하는 SSB-생성 ZFNs의 가능성을 더 평가하기 위해서 본 발명자들은 γH ₂ AX 및 53BP1 발현을 검출함으로써 DSB 형성의 게놈-와이드 평가를 수행하였다.

간략하면, γH2AX의 세포내 염색을 위해서 뉴클레오펙션-후의 다양한 시점 (예를 들어, 1, 2, 3 및 7일)에서 수집된 세포를 투과/세척 완충액 (perm/wash buffer) (PBS 중의 0.05% 사포닌, 2.5% FBS, 및 0.02% NaN3)으로 투과하한 다음에 안티-γH2AX 모노클로날 항체 (Upstate)와 함께 배양하고, 이어서 Alexa Fluor488-컨쥬게이트된 염소 안티-마우스 면역글로불린 (Ig, Invitrogen)과 함께 배양하였다. 그 후, 세포를 Guava Easycyte® 단일 세포 분석 시스템 (Guava® Technologies)을 사용하여 분석하였다.

53BP1 면역세포화학을 위해서, 세포를 수집하여 사이톱신 (cytospin) (Thermo Scientific)에 의해 슬라이드를 제조하고, 안티-53BP1 토끼 폴리클로날 항체 (Bethyl Laboratories)로 염색하고, 이어서 이전에 문헌 [Perez et al. (2008) Nat Biotechnol 26:808-16]에 상세히 기술된 바와 같이 면역형광 현미경 (Nikon)에 연결된 CCD 카메라로 사진을 찍었다.

세포를 ZFNs 및 공여체로 형질감염시키기 위해서 사용된 실험 조건 하에서, 상당한 양의 γH ₂ AX 발현이 형질감염-후 2일에 WT/WT ZFNs로 처리된 세포 (ZFN-L-EL + ZFN-R-KK + CCR5-패치, 14.70% γH ₂ AX ⁺ )에서 관찰되었지만, D450N/WT로 처리된 세포 (ZFN-L-EL-D450N + ZFN-R-KK + CCR5-패치, 0.33% γH ₂ AX ⁺ )에서는 관찰되지 않았다. 그러나, 약간 더 큰 γH ₂ AX 발현은 D467A/WT로 처리된 세포 (ZFN-L-EL-D467A + ZFN-R-KK + CCR5-패치, 4.34% γH ₂ AX ⁺ )에서 관찰되었으며, 이것은 D467A/WT 쌍이 소량의 DSB 활성을 보유할 수 있다는 이전의 관찰결과와 일치한다. 예상된 바와 같이, 본질적으로 배경의 레벨인 D450N/WT 쌍으로 처리된 세포 (ZFN-L-EL-D450N + ZFN-R-KK + CCR5-패치, 0.84±0.17 포커스/세포)에서 보다 WT/WT ZFNs로 처리된 세포 (ZFN-L-EL + ZFN-R-KK + CCR5-패치, 6.09±1.07 포커스/세포, Ave±SD)에서 더 많은 53BP1 ⁺ 포커스가 또한 관찰되었다. CCR5-패치 공여체 단독으로 형질감염된 대조 세포 (0.82±0.22 포커스/세포)와 비교하여, 53BP1 ⁺ 포커스의 수에 있어서의 온화한 증가가 D467A/WT (ZFN-L-EL-D467A + ZFN-R-KK + CCR5-패치, 1.77±0.33 포커스/세포)로 처리된 세포에서 관찰되었다. γH ₂ AX 및 53BP1의 발현은 형질감염 후 1주일 이내에 배경 레벨로 복귀하였다 (도 7).

이들 실험 조건 하에서 상향조절된 γH ₂ AX 및 53BP1 발현의 부재는 본 발명에 기술된 바와 같은 ZFNs가 배경에 비해서 형성된 DSB의 수를 증가시키지 않는다는 것을 더 뒷받침하며, SSB-유도성 ZFN-처리된 세포에서 관찰된 표적화된 통합이 DSB 유도된 HDR이 아닌 닉 유도된 HDR을 통해서 일어나고, NHEJ를 통해서 표적 상에서의 및 표적을 빗겨난 돌연변이 둘 다의 가능성을 감소시키면서 인간 세포의 게놈을 편집하는 대체 방법을 제공한다는 추가의 뒷받침을 제공한다.

실시예 7: 비- CCR5 내인성 유전자좌에서 SSB - ZFN -개시된 표적화된 통합

SSB를 유도하는 ZFNs가 CCR5 유전자좌 이외의 유전자좌에서 게놈 편집을 위해서 사용될 수 있는지 여부를 더 평가하기 위해서, 본 발명자들은 CXCR4 유전자좌에서의 D450N ZFNs-개시된 표적화된 통합을 시험하였다. CXCR4에 대해서 표적화된 아연 핑거 도메인을 포함하는 WT 및 D450N ZFNs는 미국 특허출원 제61/210,636호에 기술된 바와 같이 제조되었다. 이어서, K562 세포를 CXCR4 D450N ZFNs의 부재 (ZFN 없음) 또는 존재 하에서 CXCR4-패치 공여체 DNA로 뉴클레오펙션하였다: CXCR4-ZFN-L-EL-D450N + CXCR4-ZFN-R-KK. 세포를 4-7일 동안 회수한 다음에 다시 동일한 DNAs로 뉴클레오펙션하였다. 이 과정을 총 4 뉴클레오펙션 동안 반복하였다. 그 후, 세포를 마지막 뉴클레오펙션한 지 3일 후에 gDNA 제조 및 RFLP 시험을 위해서 수집하였다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 인간 게놈 내의 염색체 2 상에 위치하는 내인성 CXCR4를 특이적으로 표적화한 D450N/WT ZFN 쌍은 또한 CXCR4 유전자좌에서 상당량의 TI을 매개할 수 있다.

이들 데이터는, HDR 유도된 게놈 편집을 매개하기 위하여 표적화된 SSB-유도성 ZFNs를 사용하는 전략이 광범하게 적용될 수 있으며, 다양한 표적 유전자좌에 걸쳐서 범용적으로 적용될 수 있음을 시사한다.

실시예 8: 핵산 서열의 검출

감염성 성분을 함유하는 것으로 의심되거나, 유전적 질환을 갖는 것으로 의심되는 개체로부터의 혈액 또는 세포 샘플을 표준 기술에 따라 수집한다. 적절한 프라이머는 유전적 질환 또는 감염성 성분의 특징인 표적 뉴클레오타이드 서열에 관해서 제조된다. 본 발명에 기술된 바와 같은 뉴클레아제는 표적 서열 및/또는 증폭 프라이머 내에서 부위-특이적 단일가닥 닉을 유도하도록 구성된다.

샘플은, 유전적 질환 또는 감염성 성분의 특징적인 서열이 존재하는 경우에 이들이 증폭되도록 적절한 프라이머, 뉴클레오타이드 (증폭을 위한 dNTPs) 및 효소 혼합물 (적절한 닉킹 뉴클레아제 및 DNA 폴리머라제 함유)과 함께 배양한다. 하나 또는 그 이상의 성분이 검출의 용이성을 위해서 검출가능하게 표지될 수 있다.

그 후, 증폭된 서열이 있다면 이것을 표준 기술을 사용하여, 예를 들어, 겔 전기영동, 유동 세포측정, 방사성표지 등의 기술을 사용하여 검출한다. 증폭된 서열의 존재는 유전적 질환 또는 감염성 성분의 존재를 나타낸다.

실시예 9: 핵산 서열의 검출

감염성 성분을 함유하는 것으로 의심되거나, 유전적 질환을 갖는 것으로 의심되는 개체로부터의 혈액 또는 세포 샘플을 표준 기술에 따라 수집한다.

본 발명에 언급된 모든 특허, 특허출원 및 문헌들은 이에 의해서 본 발명에 온전히 참고로 포함된다.

설명은 이해를 명료하게 할 목적으로 실례로서 및 예를 들어 약간 상세하게 제공되어 있지만, 다양한 변화 및 변형이 본 발명의 기술의 정신 또는 범위를 벗어나지 않으면서 실시될 수 있다는 것은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 명백할 것이다. 따라서, 전술한 설명 및 예는 제한적인 것으로 이해되지 않아야 한다.