Processing method by hydrolytic enzymes of plant material

【発明の詳細な説明】 植物材料の加水分解酵素による処理法 本発明は植物材料のような前駆物質から有用な製品を作るための方法に関する。 本発明はまた該製品をさらに有用な誘導体に転換する方法に関する。 大量の植物材料がパルプの形で種々の生産工程の副製品として製造されている。 例えば、ひまわりの種子のひき割りはひまわり油の製造における副製品として作られる。 ひまわりの種子のひき割りは高蛋白含有率（約４０％）を有し、 栄養的に重要なアミノ酸をかなりの量で含んでいる。 このように、このものは人の、また動物用の食品としてのポテンシャルを有する。 現在まで、そのような植物材料は資源として余り注意を惹くことはなかった。 ある種の植物性物質は動物の餌として利用されてきたが、その栄養学的価値は、内在性フェノール系化合物、主にクロロゲン酸、カフェイン酸やキニン酸のエステルの存在のために、低いものであった。 そのフェノール系化合物は蛋白質、特にリジンのような必須アミノ酸と結合して植物性材料の栄養価値を低いものとしている。 フェノール系化合物は飼料や抽出蛋白質の変色を起こすものとしても知られている。 [文献：Ｓｍ ｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｓｅｎ，Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍ． １９４８，２５，３ ３９]。 これらフェノール系物質の除去により、より利用されやすい食品物質が提供されることになる。 従来、これらのフェノール系化合物を溶媒抽出によって除去することが考えられてきたが、概してこれらは、クロロゲン酸が有機溶媒に相対的に不溶性であるために失敗していた。 また、水系抽出法ではクロロゲン酸も栄養蛋白質も、ともに植物材料から除去されてしまう傾向にあった。 （さらに情報の要る場合は、文献：Ｔｒａｎｃｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｑｕａｌ．Ｐｌａｎ ｔ Ｐｌａｎｔ Ｆｏｏｄｓ Ｈｕｍ．Ｎｕｔｒ．１９８３，３２，３０５を参照）。 有機溶媒への抽出はそのプロセスを不便なものとしている。 なぜならそれには逐次抽出が必要だからである。 （文献：Ｓｒｉｐａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ．，１９８２，４，１４５参照）。 したがって、植物材料がよりよく用いられることが望ましいことは明らかである。 本発明によれば、植物材料を、水系環境下で加水分解酵素に接触作用させ、加水分解によって生成したフェノール系化合物を溶媒抽出によって除去することを含んでなる、栄養価値を高める処理方法が提供される。 適切な溶媒のいくつかを第２表に表示した。 「植物材料」とは、ここでは植物を機械的処理して得られたひき割りやパルプのような材料を含む。 植物材料は典型的には植物材料の機械的処理によって作られた残さ、荒粉、ひき割りまたは果実油の抽出残さ、例えば、ひまわりの種、あぶらなの種、オリーブ、じゃがいも、大麦、とうもろこし、コーヒー、大豆、タバコ、ブドウの種、サトウ大根、その他を含む。 例えば実施例１の記述の如く、クロロゲン酸の加水分解によって得られたカフェイン酸のように、加水分解の生成物の除去により、残さ植物材料の栄養価値はかなり向上する。 処理した菜種果実のような植物性物質の場合、本発明の方法はシナピン、シナピン酸のエステル、コリンに起因するひどい苦みを除去するのに用いることが出来る。 このように、以下に用いる「栄養価値の向上」とは、植物材料の食味性を向上し、着色性フェノール系化合物を除去し、処理植物性材料の人または動物の食物としての適性／受容性を向上することなどを包含する。

本発明の方法は植物、および植物誘導物質の食品としての栄養価値を向上するために用いられる一方、カフェイン酸、キニン酸、シナピン酸、コリン、クマリン酸、フェルラ酸のような加水分解抽出製品もまた価値あるものである。 さらに別の観点では、本発明は植物材料を水性環境下で、ある種の加水分解酵素に接触作用させ、フェノール系化合物を分離することを含んでなるフェノール系化合物の製造方法をも提供する。 好ましくは、そのフェノール系化合物は、溶剤抽出によって分離するのがよい。 本発明の方法で使用する好ましい加水分解酵素はエステル結合に作用するもの、炭素−酸素結合を加水分解して酸およびアルコールを形成するようなものが好ましい。 これらは酵素分類推奨表、Ｅ． Ｃ． ３．１． およびそのサブグループに分類される酵素である。 加水分解酵素は実質的に処理された植物材料の蛋白質成分の栄養価値を減衰するような蛋白質分解活性を示さないものが好ましい。 その酵素としては、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）などの種から単離され、あるいは豚の肝臓から単離されたものが便利である。 適切な酵素は第１表に示されたものに包含されている。 本発明に用いられる好ましい酵素は、実施例１０に詳しく述べた選別方法によって単離される。 この方法は牛血清アルブミンに対して蛋白分解活性のない、かつクロロゲン酸加水分解活性を持つ候補酵素調剤のスクリーニング法を含む。 同様な選択法は興味あるその他のフェノール系化合物にも用いられ、その他蛋白質（複数）は適切な蛋白質分解活性選別段階で利用できることが認められた。 上記選別法も本発明の別の観点を形成するものである。 商標セルザイム（Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ）の名でデンマークのノヴォ ノルディスク社（Ｄｅｎｍａｒｋ，Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）酵素プロセス部によって市販された酵素調剤は本発明の方法において特に好ましく用いられる。 セルザイム（Ｃｅｌｌｚｙｍｅ）は眞菌フミコーラ インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌ ａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）の浸水発酵によって産出された繊維素分解酵素調剤である。 この酵素複合物は木綿あるいは木綿混合布の洗濯に用いられる。 セルザイム（Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ）は化粧品、食品に使用を認められた化学品の適性目録、例えば ＥＩＮＥＣＳ（ヨーロッパ実存化学物質目録）およびＴＳＣＡ（毒性物質管理法）に登録されている。 セルザイム（Ｃｅｌｌｕｚｙｍ ｅ）はケミカル アブストラクト サービス（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａ ｃｔ Ｓｅｒｖｉｃｅ）には”セルラーゼ（Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）”（ＣＡＳ Ｎｏ．９０１２−５４−８）として分類されている。 対応する酵素分類番号（Ｉ ｎｔｅ ｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） はＥ． Ｃ． ３．２．１．４． である。 本発明の方法に用いられるその他のノヴォ ノルディスク（Ｎｏｖｏ Ｎ ｏｒｄｉｓｋ）の酵素製品はバイオフィード プラス(Ｂｉｏ−Ｆｅｅｄ Ｐｌｕ ｓ)であり、フミコーラ インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ ）の水中発酵によって作られたカルボヒドラーゼ調剤である。 この酵素はアラバノ−キシラン類とβ−グルカン類をオリゴサッカライド類、モノ−、ジ−、トリ−サッカライドに加水分解する。 バイオフィード プラス（Ｂｉｏ−Ｆｅｅｄ Ｐｌｕｓ）はセロビアーゼ、ヘミ−セルラーゼ、セルラーゼなどのそれ以外のカルボヒドラーゼ活性をも含んでいる。 本発明の方法に用いる別の酵素調剤はウェールズのポンティプリッド（Ｐ ｏｎｔｙｐｒｉｄｄ）のバイオキャタリスト社（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｌ ｉｍｉｔｅｄ）によって商標、ペクティナーゼ（Ｐｅｃｔｉｎａｓｅ）１６２として販売されている。 ペクティナーゼ（Ｐｅｃｔｉｎａｓｅ）１６２は広い活性スペクトルを持つペクティナーゼであり、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ ｕｓ）種から誘導された。 このペクチナーゼは可溶性、不溶性ペクチンの両方に有効である。 好都合なことに、この植物材料はひまわり、西洋あぶらな、小麦、とうもろこし、米などの穀類、じゃがいも、それらの組み合わせから得られる。 しかし、トマト、オリーブ、砂糖大根、その他の入手可能な植物など、いろいろな材料が本発明の方法に用いられることは当業者には明らかであろう。 より好ましいことには、本発明の方法はさらに、処理された植物材料からの蛋白質の沈殿、および、単離法を含んでいる。 さらにまた、好ましくは、本発明の方法は処理された植物材料あるいは蛋白質の人や動物への投与の工程をも含んでいる。 第２の観点では、発明は処理された植物材料あるいは本発明の方法によって得られる蛋白質を含有してなる食品を提供する。 この食品は人の食料あるいは動物食餌の形をとる。 本発明はさらに人や動物のための食品調製方法における、処理された植物材料、蛋白質の利用に関する。 第３の観点では、本発明はシナピンの酵素的加水分解によるシナピン酸とコリンへの転換の方法を含む。 第４の観点は、本発明は第３の方法に引き続き加水分解製品を分離することによるシナピン酸とコリンの製造法を提供する。 第５の観点では、本発明はフェルラ酸の製造法を提供するもので、これは植物材料を水性環境下に加水分解酵素に接触作用させ、生産されたフェルラ酸を分離することによっておこなわれる。 フェルラ酸前駆体を含む植物材料は、植物王国に広く分布しているが、中でも小麦と米が特に好ましい。 第６の観点では、本発明は、クロロゲン酸を含む植物材料を水性環境下に加水分解酵素に接触作用して処理し、例えば溶剤抽出により、加水分解生成物を分離、分離操作によりカフェイン酸および／またはキニン酸の製法を提供する。 クロロゲン酸は通常次の式の通常入手出来る化合物である。 カフェイン酸は次式のような分子である。 この分子はそれ自体は研究用化学物質用としてしか知られていない。 それはコーヒーのような植物に見出された天然分子である。 そして、これを製造するのは極めて難しく、高価なものとなり、非常に少量しか入手出来ない。 現在、カフェイン酸の製造法は植物組織からの溶媒抽出とカラムクロマトグラフィーによるものである。 本発明はカフェイン酸およびその誘導体類の、新規にして、安価な製造方法を提供する。 本発明の方法の利便の一つは大容量の液体を必要としないことであり、植物材料の直接的酵素処理が出来るということである。 より好ましいことには、植物材料と水の比率は１：１０ないしそれ以下（例えば（

＞ １）：１０）であるそして、より好ましくは１：５ないし１；２、特に１：３が最も好ましい。 少量の液量であるほど、抽出すべき溶剤の全容量が少ないほど、加水分解の製品を分離するための溶剤が少なくて済むという利点がある。 その上、残留処理植物材料の乾燥で分離すべき水がより少ない。 このように、本発明の方法は材料の全容量が処理出来る最低量であるような最少量の水を含む植物材料の濃厚なスラリーで実施することが出来る。 処理された植物材料の蛋白質成分は植物材料溶液のｐＨをその蛋白質が可溶化するような、あるアルカリ性ｐＨに調整する事によって抽出される。 残留固体物質を例えば、濾過によって分離し、蛋白質は溶媒のｐＨを下げ、酸性ｐＨとして沈殿させる。 沈殿蛋白質は濾過などによって、これを集め、乾燥する。 適切な方法はＮｉａｚｉ，Ａ． Ｈ． Ｋ． ，ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉ． Ｉｎｔ． （Ｌａｈ ｏｒｅ），１９９４、６、２４９−２５０ および Ｔｒａｃｈｉｎｏ，Ｌ ｅ ｔ ａｌ，Ｑｕａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｐｌａｎｔ Ｆｏｏｄｓ Ｈｕｍ． Ｎｕｔｒ ． ，１９８３，３２，３０５−３３４に記されている。 生成された蛋白質は人の食料や動物の食餌などいろいろな用途に利用する事が出来る。 本発明の方法により廃棄された植物材料を商業価値のある製品に加工することができる。 本発明の好ましい実体を実施例の形で以下の例を参考として示す。

実施例 １ひまわりのひき割り中のクロロゲン酸のセルザイム（Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ） による加水分解とカフェイン酸の抽出 ペレット状にしたヒマワリのひき割り（５０ｇ）をセルザイム（Ｃｅｌｌ ｕｚｙｍｅ）（２ｇ；Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）を含む水溶液（１７５ｍｌ） に加えた。 反応は手でかき混ぜながら、水浴上（４５℃）で加熱しながらおこなった。 反応混合物のｐＨをｐＨメーターで監視しながら、苛性ソーダ水溶液（１ ．０Ｍ）を添加してｐＨ７．０に維持した。 クロロゲン酸の加水分解は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析により監視し、５時間の培養後、濃塩酸（ ０．７ｍｌ）を添加して終了させた。 反応混合物を酢酸エチル（２００ｍｌ＋１ ００ｍｌ）で抽出した後、分離、放置、硫酸ソーダ上で乾燥、さらに真空加熱乾燥した。 抽出収量 ＝ ０．５２ｇ（カフェイン酸含量 ２１％） 処理したヒマワリひき割りの収量（オーブン乾燥）＝ ４０．８４ｇ クロロゲン酸およびカフェイン酸に用いたＨＰＬＣ試験条件 試験サンプルを直接ウォーターズ社製（Ｗａｔｅｒｓ）高圧液体クロマトグラフィーのＣ

₁₈逆相クロマトグラフィーカラムに注入した。 キャリアー相はアセトニトリル：１％v／v酢酸含有水の２０：８０容量比混合物を２ｍｌ／分で溶出した。 基質と反応生成物は３２０ｎｍで紫外線検出器で監視検出した。

実施例 ２ひまわりのひき割りと水の比率のセルザイム（Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ）によるひまわりのひき割り中のクロロゲン酸の加水分解への影響 ひまわりのひき割り（ＳＦＭ）と水の比率の効果を下表に示した。 これはひき割りからカフェイン酸の総収量を水比１：１０と１：３について、事実は後者の方が抽出質量は多いのであるが、その結果を示した。 低比率は反応がひき割りの質量当たり低容量であり、カフェイン酸を分離するための抽出容量が小さいほど、ひき割りを乾燥するとき分離する水分は少ないという利点がある。

実施例 ３クロロゲン酸からカフェイン酸へのセルザイム（Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ）の活性へのｐＨおよび温度の影響 クロロゲン酸の加水分解速度はセルザイム（Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ）の最適ｐＨはｐＨ８であることを示した。 適切な温度巾は４５−５５℃であった。 ６５ ℃では酵素は不安定になることが判った。 ｐＨ７を加水分解反応に用いたが、クロロゲン酸とカフェイン酸の酸化速度はｐＨ８よりは低下した。 クロロゲン酸の加水分解速度：ｐＨ４＜５＜６＜７＜８＞９ 温度： ５５℃ ＞ ４５℃

実施例 ４小麦胚珠からフェルラ酸の酵素的製造 方法 小麦胚珠（１０ｇ）を、水ジャケット付き反応管中の水（１００ｍｌ，ｐ Ｈ７．０）に加え、マグネット撹拌子により撹拌した。 苛性ソーダの水溶液（１ ．０Ｍ）を添加してｐＨ７．０での反応を維持するためにｐＨスタットを用いた。 １時間に抽出されたフェルラ酸の量をＨＰＬＣによって求め、セルザイム（Ｃ ｅｌｌｕｚｙｍｅ）（２００ｍｇ；Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）を添加した。 ８ ０００秒後、抽出されたフェルラ酸の量を再びＨＰＬＣによって測定した。 ピーク面積 ＝ １．１１ｘ１０

⁸ （〜 ３３μｇ／ｍｌ）、滞留時間（ＲＴ）＝５ ． １３分 セルザイム（Ｃｅｌｌｚｙｍｅ）の添加のない場合の同等対照反応を行った。 ８０００秒の後、同様にしてＨＰＬＣによってフェルラ酸の量を測定した。 ピーク面積 ＝ ３．３１ｘ１０

⁷ （〜２μｇ／ｍｌ）、滞留時間（ＲＴ）＝ ５．０６分であった。 ＨＰＬＣの条件：Ｃ

₁₈逆相カラム、流量 ２ｍｌ／分、２９０ｎｍ検知吸収、アセトニトリル／水（２０：８０）＋１％酢酸移動相。 フェルラ酸滞留時間は酵素および対照反応とも標準と似たようなものであった。

実施例 ５ひまわりひき割り中のクロロゲン酸のカフェイン酸への加水分解に対するペクチナーゼ（Ｐｅｃｔｉｎａｓｅ）１６２Ｌの能力 方法 ひまわりひき割り抽出物をひまわりひき割り（１０ｇ）を水（１００ｍｌ ）とともに、４５℃、ｐＨ８．０で２０分間培養して調製した。 マグネチック撹拌子により撹拌しながら、水ジャケット付き反応器中で、この抽出物２０ｍｌ（ 濾過し、塩酸（１．０Ｍ）を用いてｐＨ７．０に調整した）にペクチナーゼ（Ｐ ｅｃｔｉｎａｓｅ）１６２Ｌ（４００μｌ；Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｌｔｄ ．）を添加した。 ｐＨスタットを用いて苛性ソーダ水溶液（１．０Ｍ）を添加し、ｐＨ７．０に反応を維持した。 クロロゲン酸のカフェイン酸への加水分解はＨ ＰＬ Ｃ分析によってｔ＝０、０．５、１および２時間ごとに監視した。

実施例 ６ひまわりひき割り中のクロロゲン酸のカフェイン酸への加水分解に対するバイオフィード プラス（Ｂｉｏｆｅｅｄ Ｐｌｕｓ）ＣＴの能力 方法 ひまわりひき割り抽出物を、ひまわりひき割り（１０ｇ）を水（１００ｍ ｌ）とともに、４５℃、ｐＨ８．０で２０分間温置した。 マグネチック撹拌子により撹拌しながら、水ジャケット付き反応器中で、この抽出物（濾過し、塩酸（ １．０Ｍ）を用いてｐＨ７．０に調整した）５ｍｌにバイオフィード プラス（ Ｂｉｏｆｅｅｄ Ｐｌｕｓ）ＣＴ（１０ｍｇ；ノヴォノルディスク社（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ））を添加した。 この溶液を４５℃で培養し、２００ｒｐｍで振トウした。 クロロゲン酸のカフェイン酸への加水分解はＨＰＬＣ分析によってｔ＝０、１および４時間に監視した。

実施例 ７ひまわりひき割り中のクロロゲン酸のカフェイン酸へのヴィスコザイム（Ｖｉ ｓｃｏｚｙｍｅ）による加水分解 方法 ひまわりひき割り（１０ｇ）を水（１００ｍｌ）とともに、４５℃、ｐＨ ８．０で６０分間培養した。 ｐＨを監視しながら、苛性ソーダ水溶液（１．０Ｍ ）を添加し、この期間中そのｐＨをｐＨ８．０に維持した。 ひまわりひき割り固体を含む溶液（２０ｍｌ）を清潔なフラスコへ中へデカンタし、ビスコザイム（ Ｖｉｓｃｏｚｙｍｅ）（１．４ｍｌ；ノボノルディスク）を加えた。 ビスコザイム（Ｖｉｃｏｚｙｍｅ）を加えない同等対照反応をも行った。 反応は、３７℃で培養し、２００rpmでしんとうした。 クロロゲン酸のカフェイン酸への加水分解はＨＰＬＣ分析によってｔ＝３時間に監視した。

実施例 ８西洋あぶらなひき割りからシナピン酸を放出するためのセルザイム（Ｃｅｌ ｌｕｚｙｍｅ）の能力 方法 西洋あぶらなのひき割り（４ｇ）を、水ジャケット付き反応管中（４５℃ ）のセルザイム（Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ）（８０ｍｇ；Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ ）を含んだ水（４０ｍｌ，ｐＨ７．０）に加え、マグネット撹拌子により撹拌した。 苛性ソーダの水溶液（１．０Ｍ）を添加してｐＨ７．０での反応を維持するためにｐＨスタットを用いた。 ２８．２５時間後に抽出されたシナピン酸の量をＨＰＬＣによって求めた。 シナピン酸の収量＝０．７５７％ ｗ／ｗ西洋あぶらなのひき割り シナピン酸の収量＝苛性ソーダ抽出可能な全シナピン酸の６９％ セルザイム（Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ）を加えなかった同等対照実験（西洋あぶらなひき割り４ｇ、水４０ｍｌ）を行った。 ２８．２５時間後、抽出されたシナピン酸の量をＨＰＬＣによって測定した。 シナピン酸の収量＝０．１８４％ ｗ／ｗ西洋あぶらなひき割り シナピン酸の収量＝苛性ソーダ抽出可能全シナピン酸の１７％ 西洋あぶらなひき割り中の全シナピン酸含量を西洋あぶらなひき割り（５ ００ｍｇ）を苛性ソーダ水溶液（１．０Ｍ，１０ｍｌ）中で１夜３０℃、２００ ｒｐｍで培養して求めた。 この反応混合物を塩酸水溶液（１．０Ｍ）で中和し、 シナピン酸の量をＨＰＬＣによって測定した。 収量＝１．１％ｗ／ｗ西洋あぶらなひき割り ＨＰＬＣの条件：Ｃ

₁₈逆相カラム、流量 ２ｍｌ／分、２９０ｎｍ検知吸収、アセトニトリル／水（２０：８０）＋１％酢酸移動相。 シナピン酸滞留時間は酵素および対照反応とも標準と似たようなものであった。

実施例 ９ひまわりひき割りの窒素分析：未処理およびセルザイム（Ｃｅｌｌｕｚｙｍ ｅ）＋抽出処理物 方法 サンプル １：未処理ひまわりひき割りを乳鉢と乳棒とで粉砕して微粉化した（サンプル量 ６０７ｍｇ） サンプル ２：ｐＨ５．０でセルザイム（Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ）で処理したひまわりひき割り 処理ひき割り（２．７２ｇ）を酢酸エチルで繰り返し抽出した（２．８ｍ ｌで１回、２．０ｍｌで６回）。 抽出荒粉を５０℃で１．５時間乾燥し、サンプル１で行ったように粉砕して粉末にし、１夜５０℃で乾燥した。 （サンプル質量 ４４１ｍｇ） サンプル ３：ｐＨ７．０でセルザイム（Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ）で処理したひまわりひき割り（抽出によって蛋白質を除去したもの）。 ひまわりひき割りをセルザイム（Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ）で処理し、実施例１に記したものと同様な方法で酢酸エチルで抽出したひまわりひき割り（抽出中に生成した蛋白質層はひき割り中に戻していない）。 この抽出ひき割りを５０℃で０．５時間乾燥、サンプル１と同様に粉砕し粉末とし、さらに５０℃で２時間乾燥した。 （サンプル量７１３ｍｇ） サンプル ４：ｐＨ７．０でセルザイム（Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ）で処理したひまわりひき割り（抽出蛋白質を除去していない） 実施例１と同様にセルザイム（Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ）で処理したひまわりひき割りを酢酸エチルで抽出したひまわりひき割り（６回抽出、全容量２１．９ｍ ｌ，抽出中に生成した蛋白質層はひき割り中に戻した）。 抽出ひき割りを１００ ℃で０．５時間乾燥、サンプル１と同様に粉砕して粉末とし、さらに５０℃で２ 時間乾燥した。 （サンプル量１７１ｍｇ） 窒素分析 サンプル １−４をファイソン（Ｆｉｓｏｎｓ）ＮＡ２０００分析計を用い窒素を分析した（１８００℃で燃やし、窒素ガスをガスクロマトグラフ分析により定量） この結果はひき割りの酢酸エチル抽出中に形成される蛋白質層の除去はひき割り中に含まれると推定される蛋白質含量を３％減少させることを示している。 （サンプル３および４）。 もし蛋白質層が抽出されたひき割りとともに残っていればその蛋白質量はほぼ同じとなる（サンプル１および４）。 ｐＨ５．０でのひきわりの抽出は、未処理ひき割りやｐＨ７での抽出ひき割りと比較して蛋白質含量は低下する。

実施例 １０酵素選択のプロトコール 酵素調剤はその酵素をクロロゲン酸の脱イオン水溶液（２ｍｇ／ｍｌ）に添加して、反応混合物を撹拌し、ｐＨ７．０および５．０でそれぞれ４５℃に加熱試験した。 反応は引き続いてｐＨスタットで０．０１Ｍの苛性ソーダ溶液添加により逆滴定し、塩基の取り込みの速さと程度を測定した。 基質の顕著な加水分解性を示した酵素は次にカフェイン酸の生成をＨＰＬ Ｃによって試験し、必要とする活性を確認した。 必要な加水分解性を示した調剤はさらに次の試験を行った。 上記のようにして第１の変換を終えた酵素調剤は、ついで実質的プロテアーゼ活性を次のようにして試験した。 牛の血清アルブミンの０．５Ｍ燐酸緩衝液中２ｍｇ／ｍｌの基準溶液でｐＨ７．５で酵素調剤を処理し、得られた混合物を４５℃で３時間撹拌した。 溶液はブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイ[Ｍ． Ｍ． Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９７４， ７２，２４８−２５４]のような標準法またはバイオラド研究所（Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から市販されている蛋白質試験キットを用いて可溶性蛋白質の試験を行った。 実質的にプロテアーゼ活性のない試験酵素は試験酵素を含んでいない対照反応より測定される蛋白質のロスが大きくないときに判定出来る。 クロロゲン酸に対するエステル加水分解活性を示すが牛の血清蛋白質に対して全く顕著な加水分解活性を示さない酵素はこの選別においてポジティブを示した。 そしてさらに植物ひきわり中のクロロゲン酸の加水分解性に関する試験、 植物ひきわり中の蛋白質の非加水分解性について試験された。 これらの活性を示す酵素（複数）は本発明の方法で好ましく使用される。

実施例 １１ひまわりひき割り反応混合物からカフェイン酸を分離するための別の方法 方法 ひまわりひき割りを実施例１で述べたようにセルザイム（Ｃｅｌｌｕｚｙ ｍｅ）で処理したが、ここでは濃塩酸での酸性化および酢酸エチルによる抽出の代わりに、次ぎのような手順を用いた。 ｉ） ひき割りと水相の分離に引き続いて酢酸エチル抽出を行った。 ひまわりひき割り（約４１２ｇ）についてクロロゲン酸をカフェイン酸へ転化するためにセルザイム（Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ）処理したサンプルをウォルカー デスモンド ヴィゴ（Ｗａｌｋｅｒ Ｄｅｓｍｏｎｄ Ｖｉｇｏ）ワインプレスを用いて圧搾し、その水相（９８０ｍｌ）と湿ったヒマワリひき割り（５１２ｇ）とを分離した。 その水相を濃塩酸でｐＨ３の酸性とし、酢酸エチル（１０００ｍｌ＋ ５００ｍｌ）で抽出し、分離した相を集め、有機相は硫酸ナトリウムで乾燥、さらに減圧で加熱乾燥した。 抽出物の収量＝１．９５ｇ（カフェイン酸含量５４％ｗ／ｗ） 処理ひまわりひき割りの収量（過乾燥）＝２８３ｇ 水相の酸性化の際に生成した沈殿は、任意に抽出の前に分離した。 （次の実施例参照） ｉｉ） ひき割りから水相を分離後、蒸発した。 セルザイム（Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ）処理ひまわりひき割りのサンプルは（ ｉ）に述べたように圧搾した。 水相は減圧下に加熱乾燥した。 抽出物の収量＝１１５ｇ（カフェイン酸含量０．９３％ｗ／ｗ） 処理ひまわりひき割りの収量（過乾燥）＝２８８ｇ

実施例 １２セルザイム（Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ）で処理したひまわりひき割りからの蛋白質の単離 方法 ひまわりひき割り（全質量４１２ｇ）を実施例１に述べたようにセルザイム（Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ）を用い、反応の終結に塩酸を添加することなく次の手順に従って処理した。 反応混合物をウォルカー デスモンド ヴィゴ（Ｗａｌｋｅ ｒ Ｄｅｓｍｏｎｄ Ｖｉｇｏ）ワインプレスを用いて圧搾し、可溶性蛋白質とカフェイン酸を含む水相を固体相から分離した。 その水相を濃塩酸ではじめｐＨ ５．０についでｐＨ３に調整した。 各ｐＨ点で形成された沈澱を遠心分離によって集め、風燥した。 乾燥沈澱中の蛋白質含量はｐＨ調整前後の水相中での残留蛋白質の差から求めた。 蛋白質濃度はバイオラド（Ｂｉｏｒａｄ）蛋白質アッセイを用い、蛋白質濃度の標準曲線と比較して求めた。 カフェイン酸は前述実施例に記述したようにその水相から有機溶媒抽出によって回収した。

実施例 １３セルザイム（Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ）で処理したひまわりひき割りからカフェイン酸の抽出 方法 ひまわりひき割り（８２５ｇ）を実施例１に述べたようにセルザイム（Ｃ ｅｌｌｕｚｙｍｅ）で処理したが、酢酸エチルの代わりにｎ−ブタン−１−オール（２５００ｍｌ＋１０００ｍｌ）を用いた。 このｎ−ブタン−１−オールを水相から分離し、硫酸ナトリウムで乾燥、減圧加熱乾燥した。 抽出物の収量＝２６．２９ｇ（カフェイン酸含量１６．６％ｗ／ｗ） 処理ひまわりひき割りの収量（過乾燥）＝５４１ｇ 処理ひまわりひき割りの収量プラス水相（過乾燥）＝６５６ｇ

実施例 １４小麦ふすまおよび脱澱粉小麦ふすまからのフェルラ酸の酵素的製造 方法 水ジャケット付き反応管（４５℃）中に入れた小麦ふすま（５００ｇ）をセルザイム（Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ）（１０ｍｇ；Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）を含む水（１０ｍｌ、ｐＨ７．０）中に加え、マグネット撹拌器を用いて撹拌した。 ｐＨスタットを用いて苛性ソーダ水溶液（０．１Ｍ）を添加し、反応をｐＨ７ ． ０に維持した。 ４時間後抽出されたフェルラ酸の量をＨＰＣＬによって測定した。 フェルラ酸の収量 ＝ ０．０５％ｗ／ｗ小麦ふすま フェルラ酸の収量 ＝ 苛性ソーダ抽出可能全フェルラ酸の７％ 小麦ふすまの代わりに脱澱粉小麦ふすまを用いて同じ反応を行った。 ４時間後抽出されたフェルラ酸をやはりＨＰＬＣによって測定した。 小麦ふすまをＫ ． Ｇ． Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ Ｅｎｚｙｍｅ． Ｍｉｃｒｏｂ． Ｔｅｃｈｎ ｏｌ． ，１９８８，１０，４０３−４０９に記された方法で脱澱粉を行った。 記されたこの脱澱粉方法は一般的にすべての植物材料に適用可能であり、本発明の好ましい実施態様に関しては部分的あるいは好ましくは完全に脱澱粉植物材料の調製に用い得る。 フェルラ酸の収量 ＝ ０．５％ｗ／ｗ小麦ふすま フェルラ酸の収量 ＝ 苛性ソーダ抽出可能全フェルラ酸の５８％ 小麦ふすまおよび脱澱粉小麦ふすま中の全フェルラ酸含量は実施例８で西洋あぶらな中のシナピン酸に用いたときに記したように定量した。 収量 ＝ ０．７１％ｗ／ｗ小麦ふすま 収量 ＝ ０．８６％ｗ／ｗ脱澱粉小麦ふすま ＨＰＬＣの条件：Ｃ

₁₈逆相カラム、流量 ２ｍｌ／分、２９０ｎｍ検知吸収、アセトニトリル／水（２０：８０）＋１％酢酸移動相。 フェルラ酸滞留時間は酵素および対照反応とも標準と似たようなものであった。

実施例 １５小麦ふすまからのフェルラ酸の酵素的製造 方法 ユニバーサルビン中で小麦ふすま（５００ｍｇ）を燐酸緩衝液（１０ｍｌ ，１００ｍＭ．，ｐＨ７．０）に加えた。 セルザイム（Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ）（ ４ｍｇ；Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）とパルプザイム（Ｐｕｌｐｚｙｍｅ）ＨＣ （１００μｌ、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）を添加し、反応を４５℃で２００ｒ ｐｍで培養した。 １時間後抽出されたフェルラ酸の量をＨＰＬＣで測定した。 収量＝０．２６％ ｗ／ｗ小麦ふすま 収量＝苛性ソーダ抽出可能全フェルラ酸の３７％ パルプザイム（Ｐｕｌｐｚｙｍｅ）ＨＣはバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ） 株の液中発酵によって作られたキシラナーゼ調剤である。 これは脱アシル化キシラン基体の加水分解を触媒する。 これはエンド−１、４−ベータ−Ｄ−キシラナーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．２．１．８）を有していて、都合の良いことにはセルラーゼ活性はない。 市販の製品は酵素の量として定められた一つのキシラナーゼ単位（ＥＸＵ） について５００ＥＸＵ／ｇの活性でノヴォノルディスク（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉ ｓｋ）から入手出来る。 そしてそれは標準条件（ｐＨ９．０、５０℃、３０分培養）では染色されたＲＢＢキシランから規定量の染料を放出する。 （分析方法の詳細（ＡＦ２９３．９／１）は要求すればノヴォ ノルディスク（Ｎｏｖｏ Ｎ ｏｒｄｉｓｋ）から入手出来る）。 パルプザイム（Ｐｕｌｐｚｙｍｅ）ＨＣはクラフトパルプの漂白強化に使用するために販売されている。 これはキシラナーゼ、ＣＡＳ Ｎｏ． ９０２５− ５７−４として分類され、またキシラナーゼはＩＵＢ（生化学国際連合）ではＥ Ｃ Ｎｏ． ３．２．１．８． に分類されている。 パルプザイム（Ｐｕｌｐｚｙｍｅ）ＨＣの添加無しの対照実験を行った。 １時間後、フェルラ酸の量をＨＰＬＣで測定した。 収量＝０．０４％ ｗ／ｗ小麦ふすま 収量＝苛性ソーダ抽出可能全フェルラ酸の５％ 小麦ふすま中の全フェルラ酸含量は実施例８で西洋あぶらなひきわり中のシナピン酸に用いたときに記したように定量した。 収量 ＝ ０．７１％ｗ／ｗ小麦ふすま ＨＰＬＣの条件：Ｃ

₁₈逆相カラム、流量 ２ｍｌ／分、２９０ｎｍ検知吸収、アセトニトリル／水（２０：８０）＋１％酢酸移動相。 フェルラ酸滞留時間は酵素および対照反応とも標準と似たようなものであった。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年６月９日【補正内容】 請求の範囲 １． 植物材料の栄養価値を高めるために、植物材料を水性環境下で、実質的に蛋白質加水分解活性を示さないフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）種から単離された加水分解酵素、または、前記酵素と同様の活性を実質的に示す酵素に接触して作用させ、製造された１以上のフェノール系化合物を分離することを含んでなる植物材料を処理する方法。 ２． 植物材料を水性環境下で、実質的に蛋白質加水分解活性を示さないフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）種から単離された加水分解酵素に接触して作用させ、フェノール系化合物を分離することを含んでなるフェノール系化合物の製造方法。 ３． 該酵素が、フミコーラ インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏ ｌｅｎｓ）から単離されたものである請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。 ４． 該酵素が、バイオフィード ベータ（Ｂｉｏｆｅｅｄ ｐｌｕｓ）、 セルザイム（Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ）、または前記酵素と同様の酵素活性を実質的に示す酵素である請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載の方法。 ５． 該酵素が、バイオフィード ベータ（Ｂｉｏｆｅｅｄ ｐｌｕｓ）またはセルザイム（Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ）である請求の範囲第４項に記載の方法。 ６． 該フェノール系化合物がカフェイン酸、フェルラ酸、シナピン酸およびクマリン酸から選ばれた請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の方法。 ７． 酵素がクロロゲン酸をカフェイン酸およびキニン酸に加水分解する請求の範囲第６項に記載の方法。 ８． 処理された植物材料中の蛋白質が沈澱されそして分離される請求の範囲第１項ないし第７項のいずれか１項に記載の方法。 ９． 請求の範囲第１項ないし第８項のいずれか１項に記載の方法によって得られる処理された植物材料あるいは蛋白質を含んでなる食物製品。 １０． ヒトまたは動物に投与される食物製品の製造における請求の範囲第９項に記載の植物材料あるいは蛋白質の使用。 １１． 処理された植物材料あるいは蛋白質をヒトまたは動物に供給する工程をさらに含む請求の範囲第１項ないし第８項のいずれか１項に記載の方法。 １２． シナピンを酵素的に加水分解することを含有してなる、シナピンのシナピン酸およびコリンへの転換方法。 １３． 請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の、水性環境下でシナピンを含む植物材料を加水分解酵素によって処理し、加水分解生成物、 シナピン酸およびコリンを分離することを含んでなる、請求の範囲第１２項に記載のシナピン酸およびコリンの製造方法。 １４． 請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の、水性環境下で植物材料を加水分解酵素により処理し、加水分解製品であるフェルラ酸を分離することを含んでなる、フェルラ酸の製造方法。 １５． 該植物材料がひまわり、米、コーヒー、西洋あぶらな、ぶどう、砂糖大根、小麦、とうもろこしのような穀類の穀粒から選ばれた１種またはそれ以上である、請求の範囲第１項ないし第１４項のいずれか１項に記載の方法。 １６． 該植物材料が穀類の穀粒である請求の範囲第１５項に記載の方法。 １７． 該穀類の穀粒が小麦である請求の範囲第１６項に記載の方法。 １８． 該植物材料が小麦胚珠である請求の範囲第１７項に記載の方法。 １９． 該植物材料が小麦ふすま穀類である請求の範囲第１７項に記載の方法。 ２０． クロロゲン酸を含む植物材料を水性環境下で加水分解酵素によって処理し、カフェイン酸、キニン酸加水分解生成物を分離することを含有してなるカフェイン酸およびキニン酸の製造方法。 ２１． 該植物材料がひまわりに由来するものである請求の範囲第２０項に記載の方法。 ２２． 該加水分解生成物を溶媒抽出によって分離される、請求の範囲第２ 項ないし第８項、第１２項、第１４項ないし第２１項のいずれか１項に記載の方法。 ２３． 植物材料と水の比率が重量／容量（ｗ／ｖ）で１：１０あるいはそれ以下に希釈された請求の範囲第１項ないし第８項、および第１１項ないし第２ ２項のいずれか１項に記載した方法。 ２４． その比率が１：５以下である請求の範囲第２３項に記載の方法。 ２５． その比率が１：２である請求の範囲第２５項に記載の方法。 ２６． 該植物材料が完全にあるいは、少なくとも部分的に脱澱粉化されたものである請求の範囲第１項ないし第２５項のいずれか１項に記載の方法。 ２７． 請求の範囲第１項あるいは第２項に請求された方法に使用する試験酵素をスクリーニングする方法において、該試験酵素をフェノール系化合物の水溶液中で培養し、そのフェノール系化合物の加水分解フェノール系化合物生成物の１種あるいはそれ以上の製造のための溶液を試験することを含んでなり、該生成物の存在は好適な加水分解活性を示唆するものであり、さらに、蛋白質溶液中で同定された加水分解性試験酵素を培養し、蛋白質の存在を試験することによる実質的な蛋白質分解活性をスクリーニングする工程を含み、実質的蛋白質分解活性は、その試験酵素を含まない対照反応と比較して蛋白質のより大きなロスがあるときに示される、試験酵素をスクリーニングする方法。 ２８． 該フェノール系化合物がクロロゲン酸であり、その加水分解生成物がカフェイン酸とキニン酸である請求の範囲第２８項あるいは第２９項に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 バニスター，ナイゲル エリック イギリス国 ＣＴ１ ２ＢＺ ケント カ ンタベリー パウンド レイン 54