[0001] 联邦资助支持条款

[0002] 本发明是在由国立卫生研究院(National Institutes of Health)资助的HL-077439、HL-111665、HL-093039、DK-099653和U01-HL-100401下由政府支持完成的。政府对本发明享有一定的权利。

[0003] 优先权请求

[0004] 本公开内容要求2014年8月11日提交的美国临时申请序列号62/035,584的优先权的权益，其全部内容通过引用并入本文。

[0005] 背景1.技术领域

[0006] 本公开内容涉及分子生物学、医学和遗传学的领域。更具体地，本公开内容涉及使用基因组编辑来治疗迪谢纳肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)。

[0007] 2.相关技术

[0008] 迪谢纳肌营养不良(DMD)由X染色体上肌养蛋白(dystrophin)基因的突变引起并且在3,500个男孩中约有1个受到影响。肌养蛋白是肌肉细胞膜完整性所必需的大的细胞骨架结构蛋白。没有它，则肌肉退化，从而导致无力和肌病(Fairclough等，2013)。DMD患者的死亡通常发生在25岁以前，通常死于呼吸并发症和心肌病。因此，DMD的治疗需要持续地挽救骨骼肌、呼吸肌和心肌的结构以及功能。尽管近三十年前就发现了DMD的遗传原因(Worton等，1988)，并且已经开发了几种基于基因和基于细胞的疗法以向患病肌肉组织递送功能性Dmd等位基因或肌养蛋白样蛋白，但是已遇到了许多治疗挑战，并且不存在治愈的治疗(Van Deutekom和Van Ommen，2003)。

[0009] 基于II型CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列，Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)/Cas(CPISPR相关，CRISPRAssociated)系统之RNA引导的核酸酶介导的基因组编辑提供了改变基因组的新方法(Jinek等，2012；Cong等，2013和Mali等，2013a)。简言之，Cas9(一种由单引导RNA(sgRNA)引导的核酸酶)与毗邻前间区序列邻近基序(protospacer ad.iacent motif，PAM)的靶向基因组基因座结合并产生双链断裂(double-strand break，DSB)。然后通过导致插入/缺失(插失，indel)突变的非同源末端连接(non-homologous end-joining，NHEJ)或通过需要外源模板并且可在靶基因座处产生精确修饰的同源定向修复(homology-directed repair，HDR)来修复DSB(Mali等，
2013b)。与向患者细胞添加功能性或部分功能性的基因拷贝但保留原始的功能障碍的基因拷贝之其他基因治疗方法不同，该系统可以消除所述缺陷。在组织培养细胞(Schwank等，
2013)和罕见疾病的啮齿类动物模型(Yin等，2014)中已经证明了使用工程化核酸酶的遗传校正(Urnov等，2005；Ousterout等，2013；Osborn等，2013；Wu等，2013和Schwank等，2013)，但在相对常见和目前不可治愈的疾病(例如DMD)的模型中尚未证明。

[0010] 因此，根据本公开内容，提供了校正对象中肌养蛋白基因缺陷的方法，其包括使所述对象中的细胞与Cas9和DMD引导RNA接触。所述细胞可以是肌肉细胞、卫星细胞或iPSC/iCM。可通过编码Cas9和/或DMD引导RNA的一种或更多种表达载体(例如病毒载体如腺相关病毒载体)或非病毒载体的表达来向所述细胞提供Cas9和/或DMD引导RNA。可以以裸质粒DNA或化学修饰的mRNA向所述细胞提供Cas9。所述方法还可包括使所述细胞与单链DMD寡核苷酸接触以实现同源定向修复。所述方法还可包括基于参考Duchenne突变数据库(例如Duchenne Skipper数据库)设计肌养蛋白基因靶标。

[0011] 可以在一种或更多种纳米颗粒中向所述细胞提供Cas9、DMD引导RNA和/或单链DMD寡核苷酸、或编码它们的表达载体。Cas9、DMD引导RNA和/或单链DMD寡核苷酸可以被直接递送至肌肉组织，例如胫骨前肌、四头肌、比目鱼肌、膈或心脏。Cas9、DMD引导RNA和/或单链DMD寡核苷酸可以被全身递送。所述校正可以是突变外显子或多于一个外显子的永久跳读(skipping)。所述对象可表现出正常的肌养蛋白阳性肌纤维和/或包含中央核(centralized nuclei)的镶嵌的(mosaic)肌养蛋白阳性肌纤维。与接触前的血清CK水平相比，所述对象可表现出降低的血清CK水平。与接触前的血清CK水平相比，经治疗的对象可表现出改善的握力。

[0012] 构想本文所述的任何方法或组合物可相对于本文所述的任何其他方法或组合物实施。

[0013] 根据以下详细描述，本公开内容的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应理解，尽管表明了本公开内容的一些具体实施方案，但是详细描述和具体实施例仅以举例说明的方式给出，因为根据该详细描述，在本公开内容的精神和范围内的多种变化和修改对于本领域技术人员是明显的。附图说明

[0014] 以下附图构成本说明书的一部分并且包括在内以进一步证明本公开内容的某些方面。通过参考这些附图中的一个或更多个结合详细描述可以更好地理解本公开内容。

[0015] 图1A-E.mdx小鼠中CRISPR/Cas9介导的Dmd校正。(图1A)小鼠Dmd的靶向外显子的示意图和来自野生型小鼠(上)和mdx小鼠(下)的序列。具有mdx点突变(C到T)的提前终止密码子加下划线。(图1B)mdx等位基因(上)和PAM的20-nt sgRNA靶序列的示意图。箭头表示Cas9切割位点。将包含位于靶位点每侧侧翼的90bp同源序列的ssODN用作HDR模板。ssODN并入四个沉默突变(灰色)并添加TseI限制酶位点(加下划线)以用于基因分型和HDR介导的基因编辑的定量(图4B)。(图1C)通过HDR或NHEJ进行基因校正的示意图。相应的DNA和蛋白质序列示于图5A中。(图1D)通过种系基因治疗在mdx小鼠中进行基因校正的策略。(图1E)具有2至100％校正的Dmd基因镶嵌现象的mdx-C小鼠的基因分型结果。在2％琼脂糖凝胶上的未消化PCR产物(上图)、TseI消化(中间图)和T7E1消化(下图)。中间图中的上面的箭头标记了指示由TseI消化产生的HDR介导的校正的DNA条带。下面的箭头标记了未校正的mdx等位基因的DNA条带。DNA条带的相对强度(由下面的和上面的箭头所指示的)反映了基因组DNA中HDR的百分比。HDR的百分比位于中间图下方。通过ImageJ(NIH)定量条带强度。下图中的下面的箭头和上面的箭头表示未切割的条带和经T7E1切割的条带。M表示大小标记物泳道。bp表示标记物条带的碱基对长度。

[0016] 图2.来自野生型、mdx和mdx-C小鼠的肌肉的组织学分析。来自7-9周龄野生型、mdx和mdx-C小鼠(HDR-17％、HDR-41％或NHEJ-83％)的肌肉的免疫染色和组织学分析。野生型小鼠中的肌养蛋白免疫荧光存在于所有肌肉中，包括四头肌、比目鱼肌、膈和心脏，而在mdx小鼠中则不存在，骨骼肌中的单回复体纤维(single revertant fiber)除外。来自HDR-17％小鼠的骨骼肌具有在肌养蛋白阴性纤维簇附近的肌养蛋白阳性纤维簇的独特模式，而HDR-41％或NHEJ-83％mdx-C骨骼肌仅由肌养蛋白阳性肌纤维构成。白色箭头表示肌养蛋白阳性纤维的相邻簇。比例尺，100微米。

[0017] 图3A-C.来自mdx-C小鼠的卫星细胞的分析和通过CRISPR/Cas9介导的基因组校正用于挽救肌营养不良的模型。(图3A)将mdx-C腓肠肌的冷冻切片装在聚乙烯膜框架载玻片上并对卫星细胞的标志物Pax-7进行免疫组织化学染色。激光解剖(laser dissection)前(左)和激光解剖后(右)肌肉的截面示出卫星细胞的精确分离(在圆中)。比例尺，25微米。(图3B)从mdx-C小鼠的卫星细胞分离的基因组DNA产生对应于Dmd外显子23的PCR产物。对PCR产物进行测序且其示出CRISPR/Cas9介导的基因组编辑在体内校正了一组卫星细胞。第四个箭头(1-r)表示通过HDR介导的经校正的等位基因。其他箭头表示沉默突变位点。在DNA序列下方示出了相应的氨基酸残基。灰色框表示校正的位点。(图3C)通过CRISPR/Cas9介导的基因组校正挽救肌营养不良的模型。mdx-C小鼠中存在三种类型的肌纤维：1)正常的肌养蛋白阳性肌纤维(灰色膜)和源自校正的祖细胞的卫星细胞(灰色核)；2)营养不良的肌养蛋白阴性肌纤维(浅灰色膜)和源自mdx祖细胞的卫星细胞(浅灰色核)；3)通过融合经校正的祖细胞与mdx祖细胞或通过融合经校正的卫星细胞与预先存在的营养不良纤维产生的具有中央核(灰色和浅灰色核)的镶嵌肌养蛋白阳性肌纤维。mdx-C小鼠中三种类型肌纤维的免疫染色示于图11C中。

[0018] 图4A-E.野生型小鼠中HDR和NHEJ介导的Dmd的基因编辑。(图4A)Dmd和PAM(灰色)的20-nt sgRNA靶序列的示意图。箭头指示Cas9切割位点。(图4B)基于PCR的基因分型的策略。将包含位于靶位点每侧侧翼之90bp同源序列的ssODN用作HDR模板。ssODN并入了四个沉默突变(灰色)，其消除了通过sgRNA/Cas9复合体的再切割并添加TseI限制酶位点(加下划线的)以用于基因分型和HDR介导的基因编辑的定量。黑色箭头指示对应于Dmd基因编辑位点的PCR引物的位置。用TseI消化PCR产物(729bp)显示出现HDR(437bp)。(图4C)(上图)用表S1中列出的引物使用从一窝的17只小鼠幼崽(表S2)尾组织活检物分离的DNA进行基于PCR的基因分型。(中间图)将PCR产物用TseI切割以进行限制性片段长度多态性(restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP)分析从而筛选HDR。(下图)使用对由CRISPR/Cas9介导的基因组编辑产生的异源双链体DNA具有特异性的T7内切核酸酶I(T7E1)来筛选突变。将DNA产物上样到2％琼脂糖凝胶上。箭头指示TseI或T7E1的切割条带。M表示大小标记物泳道。“bp”表示标记物条带的碱基对长度。(图4D)示出了HDR的小鼠#07(上图)(来自图4C)和示出了NHEJ介导的Dmd基因的编辑的小鼠#14(下图)(来自图4C)的PCR产物的测序结果。箭头指示通过HDR引入的点突变的位置。箭头指向靶向位点附近色谱图上的混合测序峰，表示杂合NHEJ介导的基因编辑。(图4E)来自将Cas9、sgRNA和ssODN显微注射到B6C3F1小鼠合子中的四个F0小鼠(来自图4C的#07、#13、#14和#15)之Dmd等位基因的序列。将来自每只小鼠的基因组尾部DNA的PCR产物亚克隆到pCRII-TOPO载体中，挑取单个克隆并测序。用灰色字母表示点突变和沉默突变。小写字母是箭头指示的位置处的插入序列。缺失的序列由黑色破折号代替。每个基因组DNA克隆的基因型列于序列旁边，框内插入或缺失被称为IF-Ins和IF-Del。插入的核苷酸数目用(+)表示，缺失用(-)表示。具有相同序列的克隆的数目(No.)由(×)表示。

[0019] 图5A-C.在mdx小鼠中的HDR和NHEJ介导的基因校正。(图5A)举例说明通过HDR或NHEJ之CRISPR/Cas9介导的基因校正的示意图。相应的氨基酸残基示于DNA序列下方。(图5B)WT、mdx和经校正的mdx-C小鼠的直接测序结果。一个箭头表示WT等位基因(上)。一个箭头表示mdx等位基因(中间)。第四个箭头(1-r)表示通过HDR介导的经校正的等位基因。其他箭头表示沉默突变位点(下)。相应的氨基酸残基示于DNA序列下方。灰色框表示经校正的位点。(图5C)将Cas9、sgRNA和ssODN显微注射到mdx小鼠(C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J)合子中的F0mdx-C小鼠(图1E)中存在的Dmd等位基因的序列。将来自每只小鼠的基因组尾部DNA的PCR产物亚克隆到pCRII-TOPO载体中，挑取单个克隆并测序。mdx点突变(C到T)和沉默突变用灰色字母表示。具有相同序列的克隆的数目(No.)由(×)表示。以每个mdx-C小鼠HDR或NHEJ序列与mdx序列的比观察到的变异性(variability)反映了镶嵌现象的程度。

[0020] 图6A-C。靶位点(Dmd)和32个理论脱靶位点的深度测序分析。(图6A)来自四组小鼠(mdx、mdx+Cas9、WT和WT+Cas9)的DNA的深度测序在靶位点(Dmd)处之HDR(条的下部)和NHEJ(条的上部)介导的基因校正的频率。(图6B)来自四组小鼠的DNA的深度测序结果在全基因组“前十个”理论脱靶位点(OT-01至OT-10)(表S3)处之NHEJ介导的插失的频率(图例的上到下就是从左到右)。(图6C)来自四组小鼠的DNA的深度测序在外显子内二十二个理论脱靶位点处(OTE-01至OTE-22)(表S3)之NHEJ介导的插失的频率(图例的从上到下就是从左到右)。

[0021] 图7A-B.来自野生型、mdx和mdx-C小鼠的肌肉的组织学和Western印迹分析。(图7A)来自7-9周龄野生型、mdx和mdx-C小鼠(HDR-17％、HDR-41％和NHEJ-83％校正的等位基因，如图2所示)的肌肉的苏木精和伊红(H&E)以及免疫染色。免疫荧光检测肌养蛋白。通过碘化丙啶(红色)标记核。比例尺，100微米。(图7B)来自野生型、mdx和部分校正(HDR-17％)和完全校正(HDR-41％)的mdx-C小鼠的心脏和骨骼肌(四头肌)样品的Western印迹分析。红色箭头(＞250kD)表示肌养蛋白的免疫反应性条带。较小条带(＜250kD)(在mdx样品中也不存在)可能代表全长肌养蛋白蛋白质、天然变体或蛋白质合成中间体的蛋白水解分解。在来自野生型和mdx-C小鼠的样品中观察到相同的条带模式。GAPDH是上样对照。通过2％丽春红(Ponceau Red)对PVDF膜的总蛋白进行染色。M表示大小标记物泳道。kD表示标记条带的蛋白质长度。

[0022] 图8A-B.示出了通过CRISPR/Cas9介导的Dmd等位基因的基因组编辑减少纤维化和坏死之肌肉的组织学。来自(图8A)7-9周龄野生型、mdx、HDR-17％和HDR-41％和(图8B)3周龄野生型、mdx、HDR-40％-3wk的全部比目鱼肌、腓肠肌、胫骨前肌、指总伸肌、四头肌和膈之苏木精和伊红(H&E)染色的横向冷冻切片。比例尺，125微米。

[0023] 图9A-D.来自野生型、mdx和校正的mdx-C小鼠的肌肉的RFLP分析和肌纤维测量。(图9A)进行RFLP分析以对从野生型、mdx、HDR-17％和HDR-41％小鼠的尾、比目鱼肌(Sol)、膈(Dia)以及心脏(Hrt)分离的基因组DNA的镶嵌现象程度进行定量。使用引物(Dmd729F和Dmd729R)(上图)以基因组DNA进行PCR，并用TseI(下图)进行消化。将DNA产物上样到2％琼脂糖凝胶上。下方的箭头标记由TseI消化产生的DNA条带，表明HDR介导的校正。上方的箭头标记未校正的mdx等位基因的DNA条带。M表示大小标记物泳道。bp表示标记物条带的碱基对长度。(图9B)四头肌、比目鱼肌、膈和心脏中肌养蛋白阳性细胞的定量。对于WT，n＝6；对于mdx，n＝3。误差条示出基于来自多个肌肉切片的数据的标准差(图例的从上到下就是从左到右)。(图9C)来自野生型小鼠比目鱼肌的肌纤维截面积分布的测量示出均匀尺寸的纤维，其中90％的纤维为700至1499μm2。相比之下，来自mdx小鼠的肌纤维在尺寸上不均匀，为300至1899μm2。来自HDR-41％肌肉的肌纤维的尺寸分布与野生型小鼠的尺寸分布极其相似。对于WT，n＝6；对于mdx，n＝3。误差条示出基于来自多个肌肉切片的数据的标准差(图例的从上到下是从左到右)。(图9D)具有中央核的比目鱼肌肌纤维的分布。来自HDR-17％的肌肉的
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再生肌纤维的百分比为700至1099μm ，其高于来自mdx肌肉的纤维的百分比(图例的从上到下是从左到右)。

[0024] 图10A-B.在CRISPR/Cas9介导的Dmd等位基因的基因组编辑后，骨骼肌而非心脏的逐步恢复。来自3周龄和9周龄野生型、mdx和mdx-C小鼠(3周龄是HDR-40％-3wk；9周龄是HDR-41％)的(图10A)比目鱼肌或(图10B)心脏的苏木精和伊红(H&E)以及肌养蛋白免疫染色。免疫荧光检测肌养蛋白。通过碘化丙啶(红色)标记核。方框区域的放大图示出了3周龄(HDR-40％-3wk)和9周龄(HDR-41％)肌肉。在3周龄时，许多(但不是全部)的肌纤维表达显示部分恢复的肌养蛋白。白色星星表示肌养蛋白阴性肌纤维。到9周龄时，校正的肌肉中所有肌纤维都示出肌养蛋白表达。尽管在mdx-C小鼠的心脏中肌养蛋白的表达已经恢复，但是从3周龄到9周龄没有观察到随着年龄的逐步改善。比例尺，100微米。

[0025] 图11A-C.mdx-C小鼠中卫星细胞和三种类型肌纤维的分析。(图11A)来自对卫星细胞特异性标志物Pax7(左)和核(中间，碘化丙啶)免疫染色的mdx-C小鼠的腓肠肌的截面。合并的图像(右)示出了位于肌肉纤维边缘的“黄色”卫星细胞，并将其与“红色”肌纤维核区分开。白色箭头指示Pax-7阳性卫星细胞。比例尺，40微米。(图11B)在2％琼脂糖凝胶上分析对应于来自野生型、mdx-C和mdx小鼠的激光解剖卫星细胞之Dmd基因外显子23的232 bp PCR产物。M表示大小标记物泳道。bp表示标记物条带的碱基对长度。(图11C)用抗-肌养蛋白和碘化丙啶对mdx-C比目鱼肌的免疫染色，突出显示了部分校正的mdx肌肉中的三种类型肌纤维：1)源自CRISPR/Cas9介导的基因组校正的肌肉祖细胞之正常的肌养蛋白阳性肌纤维；2)源自mdx突变祖细胞的营养不良的肌养蛋白阴性肌纤维；3)由校正的卫星细胞与预先存在的营养不良肌肉融合形成的具有中央核的镶嵌的肌养蛋白阳性肌纤维。

[0026] 图12.外显子跳读的策略。示出了肌养蛋白的结构域和外显子的结构。内含子-外显子连接的形状表明在剪接后保持开放阅读框的互补性。

[0027] 图13.两种类型的Myo编辑介导的外显子跳读。示出了通过NHEJ绕过外显子23的策略。

[0028] 图14.在mdx小鼠种系中Myo编辑介导的外显子跳读的策略。(图14A)通过黑色和蓝色箭头指示引导RNA靶向外显子23的5’和3，。(图14B)将Cas9mRNA和引导RNA共注射到mdx卵子中。(图14C)在琼脂糖凝胶上分析来自幼崽的对应于Dmd外显子23的PCR产物。上方的条带表示全长PCR产物，下方的条带表示具有～200bp缺失的PCR产物(外显子23)。9个幼崽中有7个跳读外显子23。M表示大小标记物泳道。泳道2-5和9以及泳道6和7分别表示具有大插失突变和小插失突变的阳性mdx幼崽。

[0029] 图15.在Myo编辑后跳读外显子23。用指定的引物组(F和R)对来自mdx和编辑的mdx小鼠的RNA进行RT-PCR。外显子23剪接位点的破坏允许从外显子22至24(下方的带)进行剪接并恢复肌养蛋白开放阅读框。

[0030] 图16.通过跳读外显子23在mdx小鼠中挽救肌养蛋白表达。示出了来自mdx小鼠和在NHEJ介导的外显子23的跳读后mdx小鼠的肌肉的肌养蛋白染色(绿色)。通过跳读外显子23完全恢复了肌养蛋白的表达。

[0031] 图17A-C.通过AAV介导的Myo编辑在mdx小鼠中体内挽救肌营养不良的示意图。(图17A)通过上方的箭头指示引导RNA靶向外显子23的5’和3’。(图17B)来自AAV病毒载体的Cas9、引导RNA和GFP表达的策略。(图17C)不同模式的AAV9递送的示意图：腹膜内注射(IP)、肌内注射(IM)、眶后注射(RO)和心内注射(IC)。黑色箭头表示注射后组织收集的时间点。

[0032] 图18A-B.通过直接肌内注射(IM-AAV)或心内注射(IC-AAV)用AAV9-Cas9递送通过Myo编辑在mdx小鼠中挽救肌养蛋白表达。(图18A)在AAV9-Cas9+AAV9-gsRNA-GFP的IM-AAV后3周(在出生后第10天的IM-AAV；P10)示出了来自mdx小鼠胫骨前肌连续切片的天然绿色荧光蛋白(GFP)和肌养蛋白免疫染色。在IM-AAV后3周(n＝3，肌养蛋白阳性肌纤维为总肌纤维的函数)，在经处理的mdx小鼠胫骨前肌中估计有7.7％±3.1％的肌纤维的转导频率或挽救。(图18B)来自mdx小鼠心脏连续切片的天然GFP和肌养蛋白免疫染色示出了在IC-AAV后4周(28天龄的IC-AAV)之心肌细胞挽救的证据。虚线指示注射针道，框指示更高放大倍数的区域，星号表示连续切片肌纤维排列。

[0033] 图19.用IM-AAV通过Myo编辑在mdx小鼠中逐步挽救肌养蛋白表达。对于野生型小鼠(WT)、mdx小鼠和IM-AAV处理的mdx小鼠，在注射后3周和6周示出胫骨前肌的肌养蛋白免疫染色。到IM-AAV(n＝3)后六周，估计肌纤维的转导频率(挽救)提高至25.5％±2.9％。比例尺，40微米。

[0034] 图20.通过眶后注射(RO-AAV)用AAV9-Cas9全身递送通过Myo编辑在mdx小鼠中逐步挽救肌养蛋白表达。对于野生型小鼠(WT)、mdx小鼠和RO-AAV处理的mdx小鼠，在注射后4和8周(RO-AAV在P10)示出了胫骨前肌和心脏的肌养蛋白免疫染色。在RO-AAV后4周，估计处理的mdx小鼠胫骨前肌中肌纤维的转导频率(挽救)为1.9％±0.51％，而在处理的mdx小鼠心脏中心肌细胞的转导频率(挽救)为1.3％±0.05％。到RO-AAV后8周，估计胫骨前肌中肌纤维的挽救提高至6.1±3.2％，而心肌细胞挽救高达8.7％(5.0％±2.1％)(所有组中n＝3)。用白色星号突出显示了未经编辑的mdx对照小鼠胫骨前肌的肌纤维坏死，其显示细胞质填充自体荧光。箭头指示在RO-AAV后4周经处理的mddx小鼠心脏中的肌养蛋白阳性心肌细胞。比例尺，40微米。

[0035] 图21.通过腹膜内注射(IP-AAV)用AAV9-Cas9全身递送通过Myo-编辑来挽救mdx小鼠中的肌养蛋白表达。在注射后4周(IP-AAV在P1)对于野生型小鼠(WT)、mdx小鼠和IP-AAV处理的mdx小鼠，示出了胫骨前肌和心脏的肌养蛋白免疫染色。在IP-AAV后28天时，在处理的mdx小鼠胫骨前肌(n＝1)中估计肌纤维的转导频率(挽救)为3.0％，而在经处理的mdx小鼠心脏(n＝1)中心肌细胞的转导频率(挽救)为2.4％。星号和箭头分别表示在IP-AAV处理的mdx小鼠中的肌养蛋白阳性肌纤维和心肌细胞。比例尺，40微米。

[0036] 图22.一组sgRNA靶向DMD中的热点突变区。箭头指示靶位点。

[0037] 图23A-B.在人细胞中Myo编辑靶向外显子51剪接受体位点。(图23A)使用引导RNA文库，选择靶向外显子51的5’的3个引导RNA。(图23B)通过T7E1测定证明Myo编辑效率。引导RNA#3(红色)在293T细胞中显示高活性，而引导RNA#1和2没有可检测的活性。在正常人iPSC中观察到引导RNA#3的相同结果。

[0038] 图24A-B.从正常、DMD(Riken HPS0164)和经编辑的iPSC分化的心肌细胞的RT-PCR。(图24A)DMD患者中的缺失(外显子48-50)在外显子51中产生移码突变。(图24B)来自心肌细胞的RNA的RT-PCR，其中外显子51剪接受体序列被用指定的引物组(F和R)进行的Myo编辑破坏。DMD-iPSC中外显子51剪接受体的破坏使得从外显子47至52进行剪接以及恢复肌养蛋白开放阅读框(最低条带)。

[0039] 图25.DMD iPSC衍生的心肌细胞中通过CRISPR/Cas9 Myo编辑成功地挽救肌养蛋白表达。肌养蛋白表达的免疫细胞化学(绿色染色)示出DMD iPSC(Riken HPS0164)衍生的心肌细胞通常缺乏肌养蛋白，而DMD iPSC心肌细胞中成功的Myo编辑具有肌养蛋白表达。免疫荧光(红色)检测心脏标志物肌钙蛋白-I。通过Hoechst染料(蓝色)标记核。

[0040] 图26.DMD-iPSC中Myo编辑的示意图。

[0041] 图27.患者DC0160的假外显子(pseudoexon)47A的Myo编辑策略。DMD外显子表示为灰色框。带终止码的假外显子由终止符号标记。黑框表示Myo编辑介导的插失。灰色膜表示正常的肌养蛋白阳性心肌细胞。

[0042] 图28.患者DC0160的假外显子47A的引导RNA序列。DMD外显子表示为黑框，假外显子表示为浅灰框(47A)。灰色框表示插失。

[0043] 图29.从正常、DMD和经编辑的iPSC分化的人心肌细胞的RT-PCR。

[0044] 图30.通过DMD(DC0160)-iPSC衍生的人心肌细胞的Myo编辑来挽救肌养蛋白表达。肌养蛋白表达的免疫细胞化学示出了缺乏肌养蛋白表达的DMD iPSC(DC0160)心肌细胞。在成功的Myo编辑后，经编辑的DMD iPSC心肌细胞表达肌养蛋白。免疫荧光检测心脏标志物肌钙蛋白-I。通过Hoechst染料标记核。

[0045] 像许多其他遗传起源的疾病一样，迪谢纳肌营养不良存在具有挑战性的治疗情景。最近，“基因编辑”的发展已提高了校正细胞中遗传效应的能力。以下公开内容描述了使用导致插入/缺失(插失)突变的非同源末端连接(NHEJ)或通过在靶基因座产生精确修饰的同源定向修复(HDR)，CRIPSR/Cas9系统编辑在肌养蛋白基因中携带缺陷的细胞的基因组的用途。以下详细阐述本公开内容的这些和另一些方面。

[0046] I.迪谢纳肌营养不良

[0047] A.背景

[0048] 迪谢纳肌营养不良(DMD)是肌肉营养不良的隐性X-连锁形式，在3,500个男孩中约1个受到影响，其导致肌肉变性和过早死亡。该病症由位于人X染色体上编码蛋白质肌养蛋白的基因肌养蛋白中的突变引起。肌养蛋白是肌肉组织内的重要组分，为细胞膜的肌营养不良聚糖复合体(dystroglycan complex，DGC)提供结构稳定性。虽然两性均可携带突变，但是女性很少受到骨骼肌形式的疾病的影响。

[0049] B.症状

[0050] 症状通常出现在2岁至3岁的男孩中，并且在婴儿早期可见。即使症状直到婴儿早期仍不出现，实验室测试也可鉴定出生时携带活跃突变的儿童。首先观察到与肌肉重量损失相关的腿和骨盆的进行性近端肌无力。最终这种无力蔓延到手臂、颈部和其他区域。早期征兆可包括假性肥大(腓肠肌和三角肌的增大)、低耐力以及无辅助下站立的困难或无法上楼梯。随着病症发展，肌肉组织经历萎缩，并最终被脂肪和纤维化组织(纤维化)替代。到10岁时，可能需要支具来帮助行走，但是大多数患者到12岁时仍然依赖轮椅。随后的症状可能包括导致骨骼畸形(包括脊柱弯曲)的异常骨发育。由于肌肉的逐步恶化，发生运动的丧失，最终导致瘫痪。智力障碍可能存在也可能不存在，但是如果存在，不会随着儿童年龄而逐步恶化。患有DMD的男性的平均寿命期望约为25岁。

[0051] 迪谢纳肌营养不良(一种进行性神经肌肉疾病)的主要症状是与肌肉萎缩相关的肌无力，其中首先受影响的是随意肌，特别是臀部、骨盆区域、大腿、肩膀和小腿的那些。随后在手臂、颈部和其他区域也发生肌无力。腓肠经常增大。症状通常在6岁以前出现，并且可能出现在婴儿早期。另一些身体症状有：

[0052] ·不便的行走、踏步或跑步方式-(患者倾向于靠其前趾行走，原因是腓肠肌张力增加。而且，脚趾行走是对膝伸肌无力的一种补偿性适应)。

[0053] ·频繁跌倒

[0054] ·疲劳

[0055] ·运动技能(跑步、跳跃、跳高)困难

[0056] ·腰椎脊柱前凸过度(lumbar hyperlordosis)，可能导致髋-屈肌缩短。

[0057] 这对整体姿势以及步行、踏步或跑步的方式有影响。

[0058] ·跟腱和腘旁腱(hamstring)的肌肉挛缩损害功能，原因是肌纤维缩短和结缔组织中的纤维化

[0059] ·进行性行走困难

[0060] ·肌纤维畸形

[0061] ·舌和腓肠肌的假性肥大(增大)。肌肉组织最终被脂肪和结缔组织替代，因此称为假性肥大。

[0062] ·神经行为障碍(例如，ADHD)、学习障碍(诵读困难)和特定认知技能(特别是短期言语记忆)的非进行性虚弱的较高风险，这被认为是大脑缺乏肌养蛋白或肌养蛋白功能障碍的结果。

[0063] ·最终丧失行走能力(通常到12岁时)

[0064] ·骨骼畸形(包括某些情况下的脊柱侧凸)

[0065] ·由躺卧或坐姿站起来困难

[0066] 通常在临床上可从患者迈出他的第一步的那一刻起就可以观察到该病症，并且行走的能力通常在男孩9至12岁之间完全丧失。大多数受DMD影响的男性到21岁时基本上“从颈部以下瘫痪”。肌肉萎缩始于腿和骨盆，然后发展到肩膀和颈部的肌肉，随后丧失手臂肌肉和呼吸肌。腓肠肌增大(假性肥大)相当明显。心肌病特别是(扩张型心肌病)是常见的，但是充血性心力衰竭或心律失常(不规则心跳)的发生只是偶尔的。

[0067] 阳性高尔斯征(Gowers’sign)反映下肢肌肉更严重的损伤。儿童用上肢帮助自己站起来：首先靠他的胳膊和膝盖立起来，然后用手沿着他的腿“走”以直立。受影响的儿童通常比同龄儿童更容易疲倦并且总体力量更小。血流中的肌酸激酶(CPK-MM)水平极高。肌电图(EMG)示出无力是由肌肉组织的破坏而不是由神经的损伤引起的。遗传测试可以揭示Xp21基因中的遗传错误。肌肉组织活检(免疫组织化学或免疫印迹)或遗传测试(血液测试)证实缺乏肌养蛋白，虽然遗传测试的改进通常使得这不必要。

[0068] ·心肌异常(心肌病)

[0069] ·充血性心力衰竭或不规则的心律(心律失常)

[0070] ·胸部和背部的畸形(脊柱侧凸)

[0071] ·腓肠、臀部和肩膀的肌肉增大(约4或5岁)。这些肌肉最终被脂肪和结缔组织替代(假性肥大)。

[0072] ·肌肉重量损失(萎缩)

[0073] ·脚跟、腿部肌肉挛缩

[0074] ·肌肉畸形

[0075] ·呼吸系统病症，包括肺炎和吞咽食物或流体进入肺中(在疾病的晚期)[0076] C.原因

[0077] 迪谢纳肌营养不良(DMD)由位于X染色体短臂上的基因座Xp21处的肌养蛋白基因突变引起。肌养蛋白负责通过含有许多亚基的蛋白质复合体连接每个肌纤维的细胞骨架与下面的基底膜(胞外基质)。肌养蛋白的缺乏允许过量的钙穿透肌膜(细胞膜)。钙和信号转导通路的改变导致水进入线粒体中，然后破裂。

[0078] 在骨骼肌营养不良中，线粒体功能障碍引起应激诱导的胞质钙信号的放大和应激诱导的活性氧类(ROS)产生的放大。在涉及几种途径并且尚未清楚理解的复杂级联过程中，细胞内增加的氧化应激损害肌膜，并最终导致细胞死亡。肌纤维经历坏死并最终被脂肪和结缔组织替代。

[0079] DMD以X连锁隐性模式遗传。女性通常是疾病的携带者，而男性将受到影响。通常，女性携带者不知道她们携带突变，直到她们生了一个受影响的儿子。携带者母亲的儿子有50％的机会从他的母亲遗传有缺陷的基因。携带者母亲的女儿有50％的机会成为携带者，而有50％的机会具有两个正常的基因拷贝。在所有情况下，一个未受影响的父亲将一个正常的Y传给他的儿子或将正常的X传给他的女儿。X连锁隐性病症(例如DMD)的女性携带者可以根据其X失活的模式显示症状。

[0080] 迪谢纳肌营养不良在3,500名男性婴儿中发生率为1。肌养蛋白基因内的突变可以遗传或者在种系传递过程中自发发生。

[0081] D.诊断

[0082] 建议有该病家族史的人进行遗传咨询。迪谢纳肌营养不良可通过在怀孕期间进行的遗传研究以约95％的准确度检测。

[0083] DNA测试。肌养蛋白基因的肌肉特异性同工型由79个外显子构成，DNA测试和分析通常可鉴定外显子突变的特定类型或受影响的外显子。在大多数情况下DNA测试证实了诊断。

[0084] 肌肉组织活检。如果DNA测试未能发现突变，可以进行肌肉组织活检测试。提取小份肌肉组织样品(通常用手术刀而不是针)，并且使用显示肌养蛋白存在的染料。完全缺失该蛋白质表明患有该病症。

[0085] 在过去几年中，已经开发了检测更多的导致该病症之许多突变的DNA测试，并且不需要频繁地进行肌肉组织活检以确认迪谢纳肌营养不良的存在。

[0086] 产前测试。DMD由X连锁隐性基因携带。男性只有一个X染色体，所以一个拷贝的突变基因将导致DMD。父亲不能将X连锁的性状传递给他们的儿子，所以突变由母亲传递。

[0087] 如果母亲是携带者，因此她的两个X染色体之一具有DMD突变，那么女孩有50％的机会遗传该突变作为她的两个X染色体之一，并且成为携带者。男孩有50％的机会遗传该突变作为他的一个X染色体，因此患有DMD。

[0088] 产前测试可以判断他们未出生的孩子是否有最常见的突变。有许多突变导致DMD，一些还没有被鉴定出来，所以遗传测试只有当患有DMD的家庭成员具有已经被鉴定的突变时才起作用。

[0089] 在侵入性测试(invasive testing)之前，重要的是确定的胎儿性别；尽管男性有时受这种X连锁疾病的影响，但女性DMD极为罕见。这可通过在16周时的超声扫描或最近通过胎儿游离DNA测试来实现。绒毛膜采样(chorion villus sampling，CVS)可在11至14周进行，并具有1％的流产风险。羊膜腔穿刺术可在15周后进行，并具有0.5％的流产风险。胎儿血液采样可在约18周进行。在不清楚的基因测试结果的情况下，另一个选择是胎儿肌肉组织活检。

[0090] E.治疗

[0091] 目前对于DMD没有治愈方法，并且管理机构已经认识到存在持续的医疗需求。对于某些突变使用外显子跳读治疗的1-2a期试验已经阻止其下降并且在步行方面产生小的临床改善。治疗通常旨在控制症状的发作以最大限度地提高生活质量，并且包括以下：

[0092] ·皮质类固醇(例如泼尼松龙和地夫可特)提高了能量和力量，并推迟某些症状的严重程度。

[0093] ·随机对照试验(randomised control trial)已示出β-2-激动剂提高肌肉力量，但不改变疾病进展。大多数RCT对β2激动剂的随访时间仅约12个月，因此在超过该时间范围外不能外推结果。

[0094] ·鼓励轻度、不刺激的身体活动例如游泳。不活动(例如卧床休息)可使肌肉疾病恶化。

[0095] ·物理治疗有助于维持肌肉力量、灵活性和功能。

[0096] ·矫形器具(例如支具和轮椅)可改善移动性和自我护理能力。在睡眠期间将脚踝保持在适当位置的合身可移动的腿部支具可推迟挛缩的发生。

[0097] ·随着疾病的进展，适当的呼吸支持是重要的。

[0098] DMD的综合性多学科护理标准/指南已经由疾病控制和预防中心(the Centers for Disease Control and Prevention，CDC)制定，并于2010年在“The Lancet Neurology”中以两部分出版。要下载PDF格式的这两篇文章，请到TREAT-NMD网站。

[0099] 1.物理治疗

[0100] 物理治疗师关注使患者能够达到其最大身体潜能。他们的目的是：

[0101] ·通过制定适当的伸展和锻炼计划，使挛缩和畸形的发展最小化

[0102] ·通过推荐支具和耐用的医疗设备，期望并最小化物理性质的其他继发性并发症[0103] ·监测呼吸功能并对辅助呼吸训练的技术和清除分泌物的方法提供建议[0104] 2.呼吸辅助

[0105] 现代的“体积通气机/呼吸器(volume ventilator/respirator)”每次呼吸向人递送可调节体积(量)的空气，其对于治疗患有肌营养不良相关呼吸问题的人是有价值的。通气机可能需要通过其直接递送空气的侵入性气管内管或气管插管，但是对于一些人来说，通过面罩或口罩(mouthpiece)的非侵入性递送就足够了。在后一种方式中，有时使用气道正压力机(Positive airway pressure machine)，特别是双水平的压力机。呼吸设备可容易地安装在具有外部电池的电动轮椅底部或背部上的通气机托盘上以便携带。

[0106] 通气机治疗可以从当呼吸肌开始衰竭的青少年中后期开始。如果肺活量降至低于正常值的40％，则可在睡眠时间(即人最可能在低通气(“通气不足”)的时候)期间使用体积通气机/呼吸器。在睡眠期间的通气不足是由睡眠障碍的详尽病史以及血氧定量(oximetry)研究和毛细血管血气决定的(参见肺功能测试)。咳嗽辅助装置可通过用正气压的肺过度充气，然后用负压使粘液上升来帮助处理肺中的过多粘液。如果肺活量继续下降到少于正常值的30％，白天还可能需要体积通气机/呼吸器以获得更多帮助。人们将根据需要在白天逐渐增加使用通气机/呼吸器的时间量。

[0107] F.预后

[0108] 迪谢纳肌营养不良是一种进行性疾病，其最终影响所有的随意肌并涉及后期的心肌和呼吸肌。目前估计寿命期望为25岁左右，但这随患者而异。最近在医学上的进展正在延长那些受折磨的人的生命。Muscular Dystrophy Campaign是关注所有肌肉疾病的领先的英国慈善机构，其指出“随着高标准的医疗护理，迪谢纳肌营养不良的年轻人通常在他们30多岁仍生活得很好。

[0109] 在极少数情况下，如果需要，使用在轮椅和床上适当的定位、通气机支持(通过气管切开术或口罩)、呼吸道清除和心脏药物，已看到患有DMD的人能够生存到四十多岁或五十多岁出头。对于晚年护理所需支持的早期计划已经表明患有DMD的人寿命更长了。

[0110] 奇怪的是，在迪谢纳肌营养不良的mdx小鼠模型中，肌养蛋白的缺乏与提高的钙水平和骨骼肌肌坏死相关。喉内肌(intrinsic laryngeal muscle，ILM)受到保护，不会发生肌坏死。ILM具有钙调节系统谱，表明与外肌(outher muscle)相比，处理钙变化的能力更好，并且这可为其独特的病理生理学性质提供机理性启示。ILM可促进开发用于在多种临床情景下预防和治疗肌肉萎缩的新策略。

[0111] II.CRISPR/CAS系统

[0112] A.CRISPR/CAS

[0113] CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)是包含碱基序列的短重复的DNA基因座。每个重复之后是来自先前暴露于病毒的“间隔区DNA”的短区段。在约40％测序的真细菌基因组和90％测序的古细菌中发现CRISPR。CRISPR通常与编码与CRISPR相关的蛋白质的cas基因相关。CRISPR/Cas系统是原核免疫系统，其赋予对外来遗传元件(例如质粒和噬菌体)的抗性并提供获得性免疫的形式。CRISPR间隔区识别并沉默真核生物体中的这些外源遗传元件例如RNAi。

[0114] 1987年首次描述了细菌大肠杆菌(Escherichia coli)的重复序列。在2000年，在另外的细菌和古细菌中鉴定出类似的成簇重复序列，并称为短规律间隔重复序列(Short Regularly Spaced Repeats，SRSR)。SRSR在2002年被重命名为CRISPR。发现其中一些编码推定的核酸酶或解旋酶蛋白的一组基因(cas或CRISPR相关基因)与CRISPR重复序列相关。

[0115] 在2005年，三个独立的研究人员表明，CRISPR间隔区示出与几个噬菌体DNA和染色体外DNA(例如质粒)的同源性。这表明CRISPR/cas系统可在细菌的适应性免疫中起作用。Koonin和同事提出，间隔区充当RNA分子的模板，类似于使用称为RNA干扰的系统的真核细胞。

[0116] 2007年，Barrangou，Horvath(Danisco的食品工业科学家)和另一些人表明，他们可以用间隔区DNA改变嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)对噬菌体攻击的抗性。Doudna和Charpentier独立地探索CRISPR相关蛋白以了解细菌如何在其免疫防御中部署间隔区。他们共同研究了一种更简单的CRISPR系统，其依赖于一种称为Cas9的蛋白质。他们发现细菌通过将间隔区和回文DNA转录为长RNA分子而对入侵噬菌体作出应答，然后细胞使用tracrRNA和Cas9将长RNA分子切割成称作crRNA的片段。

[0117] 在2012年首次表明CRISPR在人细胞培养物中用作基因组工程/编辑工具。它已经被用于多种生物体，包括面包酵母(S.cerevisiae)、斑马鱼、线虫(C.elegans)、植物、小鼠和几种其他生物体。此外，CRISPR已被修饰从而制备使科学家们能够靶向和激活或沉默特定基因的可编程转录因子。现在可得到数以万计的引导RNA的文库。

[0118] 2014年3月展示了CRISPR可以逆转活体动物中疾病症状的第一个证据，当时MIT研究人员治愈了罕见肝脏疾病的小鼠。自2012年以来，CRISPR/Cas系统已被用于基因编辑(沉默、增强或改变特定基因)，其甚至在真核生物像小鼠和灵长类动物中起作用。通过插入含有cas基因和特异性设计的CRISPR的质粒，可以在任何期望的位置切割生物体的基因组。

[0119] CRISPR重复序列的大小为24至48个碱基对。它们通常显示一些二重对称，这意味着形成二级结构例如发夹，但不是真正的回文结构。重复序列被相似长度的间隔区分开。一些CRISPR间隔区序列与来自质粒和噬菌体的序列完全匹配，尽管一些间隔区与原核生物的基因组匹配(自靶向间隔区)。响应于噬菌体感染，可以迅速添加新的间隔区。

[0120] CRISPR相关(cas)基因通常与CRISPR重复-间隔区阵列相关。截至2013年，已描述了超过四十个不同的Cas蛋白家族。在这些蛋白家族中，Cas1似乎在不同的CRISPR/Cas系统中是普遍存在的。cas基因和重复序列结构的特定组合已用于限定8种CRISPR亚型(Ecoli、Ypest、Nmeni、Dvulg、Tneap、Hmari、Apern和Mtube)，其中一些与编码重复序列相关神秘蛋白(repeat-associated mysterious protein，RAMP)的另外的基因模块相关。在单个基因组中可存在多于一种CRISPR亚型。CRISPR/Cas亚型的不规律分布表明该系统在微生物进化过程中经历水平基因转移。

[0121] 外源DNA似乎由Cas基因编码的蛋白质加工成小元件(长度为～30个碱基对)，然后以某种方式将其插入靠近前导序列的CRISPR基因座中。来自CRISPR基因座的RNA组成型表达，并且被Cas蛋白加工成由具有侧翼重复序列的单独外源衍生序列元件构成的小RNA。RNA引导其他Cas蛋白在RNA或DNA水平上沉默外源遗传元件。证据表明CRISPR亚型之间的功能多样性。Cse(Cas亚型Ecoli)蛋白(在大肠杆菌(E.coli)中称为CasA-E)形成功能复合体Cascade，其将CRISPR RNA转录本加工成Cascade保留的间隔区-重复序列单元。在另一些原核生物中，Cas6加工CRISPR转录本。有趣的是，大肠杆菌中基于CRISPR的噬菌体灭活需要Cascade和Cas3，但不需要Cas1和Cas2。在激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)和另一些原核生物中发现的Cmr(Cas RAMP模块)蛋白与小的CRISPR RNA形成功能性复合体，其识别和切割互补靶RNA。RNA引导的CRISPR酶被分类为V型限制酶。

[0122] 还参见美国专利公开2014/0068797，其通过引用整体并入。

[0123] B.Cas9

[0124] Cas9是核酸酶(一种专用于切割DNA的酶)，具有两个活性切割位点，双螺旋的每条链各一个。该团队证明他们可使一个或这两个位点失效，同时保留Cas9之归巢定位其靶DNA的能力。Jinek等(2012)将tracrRNA和间隔区RNA合并成“单引导RNA”分子，其与Cas9混合，可找到并切割正确的DNA靶标。Jinek等(2012)提出这样的合成引导RNA可能能够用于基因编辑。

[0125] Cas9蛋白在致病和共生细菌中高度富集。CRISPR/Cas介导的基因调节可以有助于内源细菌基因的调节，特别是在与真核宿主的细菌相互作用期间。例如，新凶手弗朗西斯氏菌(Francisella novicida)的Cas蛋白Cas9使用独特的小的CRISPR/Cas相关RNA(scaRNA)来抑制编码细菌脂蛋白的内源性转录本，所述细菌脂蛋白对于新凶手弗朗西斯氏菌(F.novicida)抑制宿主应答和促进毒力是至关重要的。Wang等示出Cas9mRNA和sgRNA共注射到种系(合子)产生的具有突变的小鼠中。也构想了Cas9DNA序列的递送。

[0126] C.gRNA

[0127] 作为RNA引导的蛋白，Cas9需要短RNA以指导DNA靶标的识别(Mali等，2013a)。虽然Cas9优先地探询含有PAM序列NGG的DNA序列，但其可在没有前间区靶标的情况下在此结合。然而，Cas9-gRNA复合体需要与gRNA紧密匹配以产生双链断裂(Cho等，2013；Hsu等，2013)。
细菌中的CRISPR序列在多个RNA中表达，然后经加工以产生RNA的引导链(Bikard等，2013)。
因为真核系统缺乏处理CRISPR RNA所需的一些蛋白质，所以创建合成构建体gRNA以将用于Cas9靶向的RNA必需片段并入用RNA聚合酶III型启动子U6表达的单个RNA中(Mali等，
2013a，b)。合成的gRNA的最小长度稍微超过100bp，并且包含靶向就在PAM序列NGG之前的20个前间区核苷酸的部分；gRNA不含有PAM序列。

[0128] III.核酸递送

[0129] 如上所述，在某些实施方案中，表达盒用于表达转录因子产物，以用于随后纯化和递送至细胞/对象，或直接用于基于遗传的递送方法。表达需要在载体中提供适当的信号，并且包括多种来自病毒和哺乳动物来源二者之驱动目的基因在细胞中表达的调控元件(例如增强子/启动子)。还定义了设计用于优化宿主细胞中信使RNA稳定性和可翻译性的元件。还提供了使用多种显性药物选择标志物以建立表达产物的永久稳定细胞克隆的条件，以及将药物选择标志物的表达与多肽的表达联系起来的元件。

[0130] A.调控元件

[0131] 在整个本申请中，术语“表达盒”意在包括含有编码基因产物的核酸的任何类型遗传构建体，其中部分或全部核酸编码序列能够被转录和翻译，即，在启动子的控制下。“启动子”是指由起始基因的特异性转录所需的细胞的合成机器或引入的合成机器识别的DNA序列。短语“在转录控制下”意指启动子相对于核酸处于正确的位置和方向中以控制RNA聚合酶起始和基因的表达。“表达载体”意在包括包含在遗传构建体中能够复制的表达盒，并因此包括一个或更多个复制起点、转录终止信号、poly-A区、可选择标志物和多用途克隆位点。

[0132] 术语启动子在本文中用于指在RNA聚合酶II的起始位点周围簇集的一组转录控制模块。关于如何组织启动子的大多数想法来自几种病毒启动子的分析，包括HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期转录单位的那些。通过更新的工作加强的这些研究已经示出启动子由离散的功能模块构成，各自由约7-20bp的DNA组成，并含有一个或更多个转录激活蛋白或抑制蛋白的识别位点。

[0133] 每个启动子中至少一个模块用于定位RNA合成的起始位点。其最著名的实例是TATA盒，但是在缺少TATA盒的一些启动子(例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子)中，覆盖起始位点的离散元件本身有助于确定起始位置。

[0134] 另外的启动子元件调控转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30-110bp的区域中，但是最近已经示出许多启动子在起始位点下游也包含功能元件。启动子元件之间的间隔通常是柔性的，以使得当元件相对于彼此倒置或移动时保持启动子功能。在tk启动子中，启动子元件之间的间隔在活性开始下降之前可以增加至相距50bp。根据启动子，似乎单个元件可以协同地或独立地起作用以激活转录。

[0135] 在某些实施方案中，病毒促进例如人巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复序列、大鼠胰岛素启动子且甘油醛-3-磷酸脱氢酶可用于获得目的编码序列的高水平表达。还考虑使用本领域公知的另一些病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子来实现目的编码序列的表达，只要表达水平对于给定目的足够即可。通过使用具有公知性质的启动子，可以优化转染或转化后目的蛋白质的表达水平和模式。此外，选择响应于特定生理信号而被调节的启动子可允许基因产物的诱导型表达。

[0136] 增强子是增加来自位于相同DNA分子上的远端位置之启动子的转录的遗传元件。增强子的组织很像启动子。也就是说，它们由许多单个元件构成，其各自结合一个或更多个转录蛋白。增强子和启动子之间的基本区别是可操作性。增强子区域作为整体必须能够在一定距离处刺激转录；对于启动子区或其组成元件不需要这样。另一方面，启动子必须具有在特定位点和特定方向上指导RNA合成起始的一种或更多种元件，而增强子缺乏这些特异性。启动子和增强子通常是重叠和连续的，通常看起来具有非常相似的模块化组织。

[0137] 下面是可与表达构建体中编码目的基因的核酸组合使用的启动子/增强子和诱导型启动子/增强子的列表。另外，任何启动子/增强子组合(根据真核启动子数据库EPDB)也可用于驱动基因的表达。如果提供合适的细菌聚合酶作为递送复合体的一部分或作为另外的遗传表达构建体，则真核细胞可以支持来自某些细菌启动子的细胞质转录。

[0138]

[0139]

[0140]

[0141]

[0142]

[0143]

[0144] 特别感兴趣的是肌肉特异性启动子。这些启动子包括肌球蛋白轻链-2启动子(Franz等，1994；Kelly等，1995)、α-肌动蛋白启动子(Moss等，1996)、肌钙蛋白1启动子(Bhavsar等，1996)；Na+/Ca2+交换体启动子(Barnes等，1997)、肌养蛋白启动子(Kimura等，1997)、α7整联蛋白启动子(Ziober和Kramer，1996)、脑利尿钠肽启动子(LaPointe等，1996)和αB-晶体蛋白/小热休克蛋白启动子(Gopal-Srivastava，1995)、α-肌球蛋白重链启动子(Yamauchi-Takihara等，1989)和ANF启动子(LaPointe等，1988)。

[0145] 当使用cDNA插入片段时，通常希望包括聚腺苷酸化信号以实现基因转录本的适当聚腺苷酸化。认为聚腺苷酸化信号的性质对于本发明的成功实施并不是至关重要的，并且可采用任何这样的序列，例如人生长激素和SV40聚腺苷酸化信号。还构想作为表达盒元件的是终止子。这些元件可用于增强信息水平和最小化从盒到其他序列的读取。

[0146] B.2A肽

[0147] 发明人利用来自昆虫病毒明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna)(TaV 2A肽)的2A样自切割结构域(Chang等，2009)。已经示出这些2A样结构域在整个真核生物中起作用，并导致在2A样肽结构域内共翻译地发生氨基酸切割。因此，包含TaV 2A肽使得能够从单个mRNA转录本表达多种蛋白质。重要的是，当在真核系统中测试时，TaV的结构域示出大于
99％的切割活性(Donnelly等，2001)。

[0148] C.表达载体的递送

[0149] 存在许多将表达载体引入细胞中的方式。在本发明的某些实施方案中，表达构建体包含衍生自病毒基因组的病毒或工程构建体。某些病毒通过受体介导的胞吞作用进入细胞，整合到宿主细胞基因组中并稳定和有效地表达病毒基因的能力使得其成为将外源基因转移到哺乳动物细胞中的有吸引力的候选物(Ridgeway，1988；Nicolas和Rubenstein，1988；Baichwal和Sugden，1986；Temin，1986)。用作基因载体的第一种病毒是DNA病毒，包括乳多空病毒(猿病毒40、牛乳头瘤病毒和多瘤病毒)(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，
1986)以及腺病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986)。这些对外来DNA序列具有相对低的容纳力，并且具有受限的宿主谱。此外，它们在允许细胞中的致癌潜力和细胞病变效应引起了安全性问题。它们只能容纳达8kB的外来遗传物质，但可容易地引入多种细胞系和实验动物中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986)。

[0150] 用于体内递送的一种优选方法涉及使用腺病毒表达载体。“腺病毒表达载体”意在包括含有足以(a)支持构建体包装和(b)表达其中已克隆的反义多核苷酸的腺病毒序列的那些构建体。在本发明上下文中，表达不需要合成基因产物。

[0151] 表达载体包括基因工程形式的腺病毒。对腺病毒(36kB的线性双链DNA病毒)的遗传组织的了解允许用达7kB的外来序列取代大片段腺病毒DNA(Grunhaus和Horwitz，1992)。与逆转录病毒相反，宿主细胞的腺病毒感染不导致染色体整合，原因是腺病毒DNA可以以附加体方式复制而没有潜在的遗传毒性。此外，腺病毒在结构上是稳定的，并且在大量扩增后没有检测到基因组重排。腺病毒可感染几乎所有上皮细胞，而不论其细胞周期阶段如何。迄今为止，腺病毒感染似乎仅与轻度疾病(例如人的急性呼吸道疾病)相关。

[0152] 腺病毒特别适合用作基因转移载体，原因是其具有中等大小的基因组、易于操作、高效价、宽靶细胞范围和高感染性。病毒基因组的两端均含有100-200个碱基对的反向重复(ITR)，其是病毒DNA复制和包装所必需的顺式元件。基因组的早期(E)和晚期(L)区域包含不同的转录单位，其被病毒DNA复制的起始分开。E1区(E1A和E1B)编码负责调控病毒基因组和少数细胞基因的转录的蛋白质。E2区(E2A和E2B)的表达导致用于病毒DNA复制的蛋白质的合成。这些蛋白质参与DNA复制、晚期基因表达和宿主细胞关闭(Renan，1990)。晚期基因的产物(包括大多数病毒衣壳蛋白)仅在由主要晚期启动子(major late promoter，MLP)产生的单一初级转录本的显著加工后表达。在感染的晚期期间MLP(位于16.8m.u.)特别有效，并且从该启动子产生的所有mRNA具有5’-三联前导(TPL)序列，使其成为用于翻译的优选mRNA。

[0153] 在一个系统中，重组腺病毒由穿梭载体和原病毒载体之间的同源重组产生。由于两种原病毒载体之间可能的重组，因此可以从该过程产生野生型腺病毒。因此，从单个噬斑(plaque)分离单个病毒克隆并检查其基因组结构是至关重要的。

[0154] 产生和扩增复制缺陷型的现有腺病毒载体取决于独特辅助细胞系，称为293，其通过Ad5DNA片段从人胚肾细胞转化并组成型表达E1蛋白质(Graham等，1977)。由于E3区是腺病毒基因组所必需的(Jones和Shenk，1978)，因此现有腺病毒载体在293细胞的帮助下在E1、D3或这两个区域中携带外来DNA(Graham和Prevec，1991)。在自然界中，腺病毒可以包装大约105％的野生型基因组(Ghosh-Choudhury等，1987)，提供额外约2kb DNA的容量。加上在E1和E3区域中可替代的约5.5kb的DNA，现有腺病毒载体的最大容量为7.5kb或载体总长度的约15％。载体骨架中保留超过80％的腺病毒病毒基因组并且是载体携带的细胞毒性的来源。此外，E1缺失的病毒的复制缺陷是不完全的。

[0155] 辅助细胞系可衍生自人细胞，例如人胚胎肾细胞、肌肉细胞、造血细胞或者其他人胚胎间充质或上皮细胞。或者，辅助细胞可衍生自允许人腺病毒的其他哺乳动物物种的细胞。这样的细胞包括例如Vero细胞或其他猴胚胎间充质或上皮细胞。如上所述，优选的辅助细胞系是293。

[0156] Racher等(1995)公开了用于培养293细胞和繁殖腺病毒的改进方法。在一种方式中，通过将单独细胞接种到含有100-200ml培养基的1升硅化旋转瓶(Techne，Cambridge，UK)中来培养天然细胞聚集体。在以40rpm搅拌后，用台盼蓝估计细胞生存力。在另一种方式中，如下使用Fibra-Cel微载体(Bibby Sterlin，Stone，UK)(5g/l)。将悬浮在5ml培养基中的细胞接种物添加到250ml锥形瓶中的载体(50ml)并静置1至4小时，偶尔进行搅拌。然后用50ml新鲜培养基更换培养基并开始摇动。对于病毒产生，允许细胞生长至约80％汇合，此后更换培养基(至最终体积的25％)，并添加0.05MOI的腺病毒。将培养物静置过夜，然后将体积增加至100％，并再开始摇动72小时。

[0157] 除了要求腺病毒载体是复制缺陷型或至少条件性缺陷之外，不认为腺病毒载体的性质对成功实施本发明至关重要。腺病毒可以是已知的42种不同血清型或A-F亚组中的任一种。优选亚组C的5型腺病毒作为起始材料以获得用于本发明的条件复制缺陷型腺病毒载体。这是因为5型腺病毒是已知其大量生物化学和遗传信息的人腺病毒，并且历史上已经将其用于大多数采用腺病毒作为载体的构建。

[0158] 如上所述，根据本发明的典型载体是复制缺陷型的，并且不具有腺病毒E1区。因此，最方便的是在E1编码序列已被去除的位置处引入编码目的基因的多核苷酸。然而，构建体在腺病毒序列内的插入位置对于本发明不是关键的。如Karlsson等(1986)所述，编码目的基因的多核苷酸也可插入E3替代载体中来代替缺失的E3区，或者其中插入辅助细胞系或辅助病毒补充E4缺陷的E4区。

[0159] 腺病毒易于生长和操作并在体外和体内展示广泛的宿主范围。这组病毒可以以高效价获得，例如，每毫升109-1012噬斑形成单位，并且它们是高度感染性的。腺病毒的生命周期不需要整合到宿主细胞基因组中。由腺病毒载体递送的外来基因是附加体，因此对宿主细胞的遗传毒性低。在用野生型腺病毒疫苗接种的研究中未报道有副作用(Couch等，1963；Top等，1971)，证明了它们作为体内基因转移载体的安全性和治疗潜力。

[0160] 腺病毒载体已经用于真核基因表达(Levrero等，1991；Gomez-Foix等，1992)和疫苗开发(Grunhaus和Horwitz，1992；Graham和Prevec，1991)。动物研究表明，重组腺病毒可用于基因治疗(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991；Stratford-Perricaudet等，1990；Rich等，1993)。将重组腺病毒施用于不同组织的研究包括气管滴注(Rosenfeld等，
1991；Rosenfeld等，1992)、肌肉注射(Ragot等，1993)、外周静脉内注射(Herz和Gerard，
1993)以及脑内立体定向(stereotactic)接种(Le Gal La Salle等，1993)。

[0161] 逆转录病毒是一组单链RNA病毒，其特征在于通过逆转录过程将其RNA转化为感染细胞中双链DNA的能力(Coffin，1990)。然后所得DNA稳定整合到细胞染色体中作为前病毒并指导病毒蛋白的合成。整合导致在接受细胞及其后代中保留病毒基因序列。逆转录病毒基因组含有分别编码衣壳蛋白、聚合酶和包膜组分的三个基因gag、pol和env。在gag基因上游发现的序列含有用于将基因组包装到病毒体中的信号。病毒基因组的5’和3’端有两个长末端重复(long terminal repeat，LTR)序列。这些含有强启动子和增强子序列，并且也是整合到宿主细胞基因组中所必需的(Coffin，1990)。

[0162] 为了构建逆转录病毒载体，将编码目的基因的核酸插入病毒基因组某些病毒序列位置处以产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒体，构建了含有gag、pol和env基因但无LTR的包装细胞系和包装组分(Mann等，1983)。当将含有cDNA的重组质粒与逆转录病毒LTR和包装序列一起引入(例如通过磷酸钙沉淀)该细胞系中时，包装序列使重组质粒的RNA转录本包装成病毒颗粒，然后其分泌到培养基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等，1983)。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染多种细胞类型。然而，整合和稳定表达需要宿主细胞分裂(Paskind等，1975)。

[0163] 基于逆转录病毒的化学修饰，通过将乳糖残基化学添加至病毒包膜，最近开发了设计为使逆转录病毒载体特异性靶向的新方法。这种修饰可使得通过唾液酸糖蛋白受体特异性感染肝细胞。

[0164] 设计了重组逆转录病毒靶向的另一种方法，其中使用针对逆转录病毒包膜蛋白和针对特定细胞受体的生物素化抗体。该抗体用链霉亲和素通过生物素组分偶联(Roux等，1989)。使用针对主要组织相容性复合体I类和II类抗原的抗体，他们证明在体外用同向性病毒感染带有那些表面抗原的多种人细胞(Roux等，1989)。

[0165] 在本发明的所有方面中使用逆转录病毒载体存在某些限制。例如，逆转录病毒载体通常整合到细胞基因组中的随机位点中。这可通过中断宿主基因或通过插入可以干扰侧翼基因功能的病毒调节序列而导致插入诱变(Varmus等，1981)。使用缺陷型逆转录病毒载体的另一个问题是在包装细胞中潜在出现有复制能力的野生型病毒。这可能由其中来自重组病毒的完整序列插入整合在宿主细胞基因组中的gag、poi、env序列的上游的重组事件引起。然而，现在已有的新的包装细胞系可大大降低重组的可能性(Markowitz等，1988；Hersdorffer等，1990)。

[0166] 另一些病毒载体可用作本发明中的表达构建体。可采用衍生自以下病毒的载体：例如痘苗病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)、腺相关病毒(AAV)(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Hermonat和Muzycska，1984)和疱疹病毒。
它们为多种哺乳动物细胞提供了数个有吸引力的特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；
Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988；Horwich等，1990)。

[0167] 为了实现有义或反义基因构建体的表达，必须将表达构建体递送到细胞中。这种递送可以在体外实现，如在用于转化细胞系的实验室过程中，或者在体内或离体实现，如在某些疾病状态的治疗中。一种递送机制是通过病毒感染，其中表达构建体被包封在感染性病毒颗粒中。

[0168] 本发明也构想了用于将表达构建体转移到培养的哺乳动物细胞中的数种非病毒方法。这些包括磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等，1990)、DEAE-葡聚糖(Gopal，1985)、电穿孔(Tur-Kaspa等，1986；Potter等，1984)、直接显微注射(Harland和Weintraub，1985)、负载DNA的脂质体(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，
1979)和lipofectamine-DNA复合体、细胞超声(Fechheimer等，1987)、使用高速微粒的基因轰击(Yang等，1990)和受体介导的转染(Wu和Wu，1987；Wu和Wu，1988)。这些技术中的一些可以成功地适于体内或离体使用。

[0169] 一旦表达构建体已被递送到细胞中，编码目的基因的核酸可以在不同位点定位和表达。在某些实施方案中，编码基因的核酸可以稳定整合到细胞的基因组中。这种整合可以通过同源重组(基因置换)处于同源的位置和方向，或者其可整合到随机的非特异性位置中(基因增强)。在另一些实施方案中，核酸可以作为单独的DNA的附加体区段稳定地保持在细胞中。这样的核酸区段或“附加体”编码这样的序列，所述序列足以允许独立于宿主细胞周期或与宿主细胞周期同步地维持和复制。如何将表达构建体递送至细胞以及在细胞中核酸保留在何处取决于所使用的表达构建体的类型。

[0170] 在本发明的另一个实施方案中，表达构建体可以简单地由裸重组DNA或质粒组成。构建体的转移可以通过上述的物理或化学渗透细胞膜的任何方法进行。这尤其适用于体外转移，但也可以应用于体内使用。Dubensky等(1984)成功地将磷酸钙沉淀形式的多瘤病毒DNA注射到成年和新生小鼠的肝和脾中，证明活性病毒复制和急性感染。Benvenisty和Neshif(1986)也证明直接腹膜内注射磷酸钙沉淀的质粒导致转染的基因表达。可以设想，编码目的基因的DNA也可以以类似的方式在体内转移并表达基因产物。

[0171] 在用于将裸DNA表达构建体转移到细胞中之本发明的另一个实施方案中，可以涉及粒子轰击。这种方法取决于将DNA包被的微粒加速到高速以使其穿刺细胞膜并进入细胞而不杀伤细胞的能力(Klein等，1987)。已经开发了用于加速小颗粒的几种装置。一种这样的装置依赖于高电压放电以产生电流，其进而提供动力(Yang等，1990)。所用的微粒由生物惰性物质(例如钨或金珠)组成。

[0172] 选择的器官(包括大鼠和小鼠的肝、皮肤和肌肉组织)在体内被轰击(Yang等，1990；Zelenin等，1991)。这可能需要组织或细胞的手术暴露以消除枪和靶器官之间的任何中间组织，即离体处理。同样，编码特定基因的DNA可以通过该方法递送，并且仍通过本发明并入。

[0173] 在本发明的另一个实施方案中，表达构建体可以包载在脂质体中。脂质体是以磷脂双层膜和内部水性介质为特征的囊状结构。多层脂质体具有通过水性介质分离的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们自发形成。脂质组分在形成闭合结构之前经历自身重排，并且在脂质双层之间包载水和溶解的溶质(Ghosh和Bachhawat，1991)。还构想了lipofectamine-DNA复合体。

[0174] 脂质体介导的体外核酸递送和外来DNA的表达已经非常成功。Wong等(1980)证明在培养的鸡胚、HeLa和肝瘤细胞中脂质体介导的递送和外来DNA的表达的可行性。Nicolau等(1987)在静脉内注射后在大鼠中实现了成功的脂质体介导的基因转移。称为Lipofectamine 2000fM的试剂被广泛使用并可商购。

[0175] 在本发明的某些实施方案中，脂质体可以与血凝病毒(hemagglutinating virus，HVJ)复合。这已经示出促进与细胞膜的融合和促进脂质体包封的DNA的细胞进入(Kaneda等，1989)。在另一些实施方案中，脂质体可以与核的非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)复合或联合使用(Kato等，1991)。在另一些实施方案中，脂质体可以与HVJ和HMG-1二者复合或联合使用。由于这种表达构建体已经成功地用于体外和体内核酸的转移和表达，因此它们适用于本发明。当在DNA构建体中使用细菌启动子时，也期望在脂质体内包括合适的细菌聚合酶。

[0176] 可用于将编码特定基因的核酸递送到细胞中的另一些表达构建体是受体介导的递送载体。这些载体利用在几乎所有真核细胞中通过受体介导的胞吞作用选择性摄取大分子。由于多种受体的细胞类型特异性分布，因此递送可以是高度特异性的(Wu和Wu，1993)。

[0177] 受体介导的基因靶向载体通常由两种组分组成：细胞受体特异性配体和DNA结合剂。几种配体已经用于受体介导的基因转移。最广泛表征的配体是无唾液酸血清类粘蛋白(asialoorosomucoid，ASOR)(Wu和Wu，1987)和转铁蛋白(Wagner等，1990)。与ASOR识别相同的受体的合成拟糖蛋白已经用作基因递送载体(Ferkol等，1993；Perales等，1994)，而表皮生长因子(EGF)也已经用于递送基因至鳞状癌细胞(Myers，EP0273085)。

[0178] IV.药物组合物和递送方法

[0179] 当构想临床应用时，药物组合物将以适于预期应用的形式制备。通常，这将需要制备基本上不含热原以及可能对人或动物有害的其他杂质的组合物。

[0180] 通常期望使用合适的盐和缓冲液以使药物、蛋白质或递送载体稳定并允许被靶细胞摄取。本发明的水性组合物包含溶解或分散在可药用载体或水性介质中的有效量的药物、载体或蛋白质。短语“可药用的或药理学上可接受的”是指当向动物或人施用时不产生不利的、变应性的或其他不良反应的分子实体和组合物。如本文所用，“可药用的载体”包括用于配制药物(例如适合向人施用的药物)的可接受的溶剂、缓冲液、溶液、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这种介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。除非任何常规介质或试剂与本发明的活性成分不相容，否则构想其在治疗组合物中的用途。补充的活性成分也可并入组合物中，只要它们不使组合物的载体或细胞失活。

[0181] 本发明的活性组合物可包括经典的药物制剂。根据本发明的这些组合物的施用可通过任何常见途径，只要靶组织可通过该途径获得所述组合物即可，但通常包括全身施用。这包括经口、经鼻或口含(buccal)。或者，施用可以通过皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射，或通过直接注射到肌肉组织中进行。如上所述，这样的组合物通常作为可药用组合物施用。

[0182] 活性化合物也可经肠胃外或腹膜内施用。例如，作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液可在水中与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)适当地混合而制备。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中以及在油中制备。在普通的储存和使用条件下，这些制备物通常含有防腐剂以防止微生物的生长。

[0183] 可适于注射使用的药物形式包括例如无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。通常，这些制备物是无菌的和流动的，达到容易注射的程度。制备物在制造和储存条件下应当是稳定的，并且应当防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。合适的溶剂或分散介质可含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物，和植物油。可通过例如使用包衣(例如卵磷脂)，通过在分散体的情况下维持所需的粒径并通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。微生物作用的预防可通过多种抗菌抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。

[0184] 可通过将适量的活性化合物以及所期望的任何其他成分(例如如上所列的)一起并入溶剂中，随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将多种灭菌的活性成分并入含有基础分散介质和所需的其他成分(例如，如上面列举的)的无菌载体中制备分散体。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，其产生来自其之前无菌过滤溶液的活性成分的粉末以及任何另外的所需成分。

[0185] 本发明的组合物通常可配制成中性或盐形式。可药用盐包括例如衍生自无机酸(例如，盐酸或磷酸)，或衍生自有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)的酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)。与蛋白质的游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)或衍生自有机碱(例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。

[0186] 在配制时，优选以与剂量制剂相容的方式和以治疗有效的量施用溶液。制剂可易于以多种剂型施用，例如可注射溶液、药物释放胶囊等。对于水溶液中的肠胃外施用，例如，溶液通常进行适当地缓冲，并且首先例如用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这样的水溶液可用于例如静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。优选地，特别是根据本公开内容，使用本领域技术人员已知的无菌水性介质。例如，单剂量可溶解在1ml的等渗NaCl溶液中，并且添加至1000ml的皮下输液液体(hypodermoclysis fluid)或在所推荐的输注部位注射(参见例如“Remington’s Pharmaceutical Sciences”第15版，第1035-1038页和第1570-1580页)。根据被治疗的对象的病症，剂量将必然发生一些变化。在任何情况下，负责施用的人将确定个体对象的适当剂量。此外，对于人施用，制备物应满足FDA生物制品标准办公室(FDA Office of Biologics standards)要求的无菌性、热原性、整体安全性和纯度标准。

[0187] V.实施例

[0188] 包括以下实施例以证明本公开内容的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术代表由本发明人发现的用于实施本公开内容的运行良好的技术，因此被认为是实施本发明的一些优选方式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应理解，在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，可以在所公开的具体实施方案中进行许多改变，并且仍然获得相同或相似的结果。

[0189] 实施例1-材料和方法

[0190] 质粒。含有人密码子优化的Cas9基因的hCas9质粒(Addgene质粒41815)和含有sgRNA骨架的gRNA克隆载体质粒(Addgene质粒41824)均购自Addgene。根据Church Lab CRISPR质粒说明(万维网网址addgene.org/crispr/church/)进行sgRNA的克隆。

[0191] Cas9mRNA和sgRNA的体外转录。通过PCR将T3启动子序列添加到hCas9编码区。根据制造商的说明书，将T3-hCas9 PCR产物凝胶纯化并亚克隆到pCRII-TOPO载体(Invitrogen)中。线性化的T3-hCas9质粒用作用于使用mMESSAGE mMACHINE T3转录试剂盒(Life Technologies)进行体外转录的模板。通过PCR将T7启动子序列添加到sgRNA模板。使用凝胶纯化的PCR产物作为使用MEGAshortscript T7试剂盒(Life Technologies)进行体外转录的模板。通过MEGAclear试剂盒(Life Technologies)纯化hCas9RNA和sgRNA，并用无核酸酶的水(Ambion)洗脱。通过NanoDrop仪器(Thermo Scientific)测量RNA的浓度。

[0192] 单链寡脱氧核苷酸(ssODN)。使用ssODN作为HDR模板并且以Ultramer DNA寡核苷酸购自Integrated DNA Technologies。将ssODN与Cas9mRNA和sgRNA直接混合而不进行纯化。ssODN的序列列于表S1中。

[0193] 通过单细胞胚胎注射之CRISPR/Cas9介导的基因组编辑。所有动物程序都得到德克萨斯大学西南医学中心(University 0f Texas Southwestern Medical Center)的实验动物照管及使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准。B6C3F1(C57BL/6NCr雌性X C3H/HeN MTV雄性)、C57BL/6NCr和C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J是用作卵母细胞供体的三个小鼠品系。将超数排卵(Superovulate)的雌性B6C3F1小鼠(6周龄)与B6C3F1配种饲养的雄性交配。将超数排卵的雌性C57BL/6NCr雌性(12-18克)与C57BL/6NCr雄性交配，并将超数排卵的雌性纯合子C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J(12-18克)与半合子C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J配种饲养的雄性交配。收获合子并在37℃下在M16培养基(用于卵子培养的Brinster培养基，其中有100U/ml青霉素和50mg/ml链霉素)中保持1小时。将合子转移到M2培养基(M16培养基和20mM HEPES)并注射hCas9mRNA、sgRNA和ssODN。将Cas9/sgRNA仅注射到原核(称为Nuc)或原核和细胞质(称为Nuc+Cyt)中。通过Nuc或Nuc+Cyt将不同剂量的Cas9mRNA、sgRNA和ssODN注射入合子(如表S2中详述)。将注射的合子在37℃下在M16培养基中培养1小时，然后转移到假孕ICR雌性小鼠的输卵管中。

[0194] 基因组DNA的分离。将尾组织活检物添加到100μl的25mM NaOH/0.2mM EDTA溶液，并在95℃下放置15分钟，然后冷却至室温。在添加100μl的40mM Tris-HCl(pH 5.5)后，将试管在15,000×g下离心5分钟。将DNA样品保存在4℃下数周或在-20℃下长期储存。根据制造商的说明书，使用TRIzol(Life Technologies)从肌肉中分离基因组DNA。

[0195] 通过PCR扩增靶基因组区。PCR测定含有2μl的GoTaq(Promega)、20μl的5X Green GoTaq反应缓冲液、8μl的25mM MgCl2、2μl的10μM引物(DMD729F和DMD729R)(表S1)、2μl的10mM dNTP、4μl的基因组DNA以及ddH2O至100μl。PCR条件为：94℃2分钟；32X(94℃15秒，59℃30秒，72℃1分钟)；72℃7分钟；然后是4℃。通过2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，并使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)从凝胶中纯化以用于直接测序。根据制造商的说明书，将这些PCR产物亚克隆到pCRII-TOPO载体(Invitrogen)中。挑取个体克隆并对DNA进行测序。

[0196] PCR产物的RFLP分析。将由20μl的基因组PCR产物、3μl的10X NEB缓冲液CS和1μl的TseI(New England BioLabs)组成的消化反应物在65℃下孵育1小时，并通过2％琼脂糖凝胶电泳分析。来自野生型DNA的消化PCR产物为581bp，而来自F0小鼠的HDR介导的基因组编辑DNA示出约437bp的额外产物。

[0197] PCR产物的T7E1分析。通过使用以下条件使25μl的基因组PCR样品变性/复性来获得错配的双链体DNA：

[0198] 95℃10分钟，95℃至85℃(-2.0℃/秒)，85℃1分钟，85℃至75℃(-0.3℃/秒)，75℃1分钟，75℃至65℃(-0.3℃/秒)，65℃1分钟，65℃至55℃(-0.3℃/秒)，55℃1分钟，55℃至
45℃(-0.3℃/秒)，45℃1分钟，45℃至35℃(-0.3℃/秒)，35℃1分钟，35℃至25℃(-0.3℃/秒)，25℃1分钟，保持在4℃。

[0199] 在变性/复性后，向样品添加以下物质：3μl的10X NEB缓冲液2、0.3μl的T7E1(New England BioLabs)和ddH2O至30μl。将消化反应物在37℃下孵育1小时。通过2％琼脂糖凝胶电泳分析未消化的PCR样品和T7E1消化的PCR产物。未消化的PCR产物是729bp，而来自具有错配DNA的F0小鼠的基因组DNA示出在约440bp和290bp处的两个额外的消化产物。

[0200] 握力测试。通过由德克萨斯大学西南医学中心(UT Southwestern Medical Center)的Neuro-Models Core Facility进行的握力行为工作来评估肌肉力量。将小鼠从笼中取出，称重并从尾部提起，从而使前肢抓住与握力强度计(Columbus Instruments)连接的拉杆组件。沿着远离传感器的直线拉小鼠，直到握力下降，并记录以克计的力的峰值量。重复5次。

[0201] 血清肌酸激酶(CK)测量。从颌下静脉收集血液，通过VITROS化学产品CK载玻片测量血清CK水平以使用VITROS 250化学系统定量测量CK活性。

[0202] 肌肉的组织学分析。分别解剖来自野生型、mdx和校正的mdx-C小鼠的骨骼肌，并在黄蓍胶粉末(Sigma-Aldrich)与组织冷冻培养基(TissueFreezing Medium，TFM)(Triangle Bioscience)的1∶2体积混合物中冷冻包埋(cryoembed)。心脏在TFM中冷冻包埋。将所有包埋物在异戊烷热提取剂中快速冷冻过度冷却至-155℃。在切片前将所得团块(block)在-80℃下储存过夜。在Leica CM3050低温恒温器上制备骨骼肌的八微米横切片和心脏的前切片(frontal section)，并在染色同一天前风干。根据已建立的染色方案进行H&E染色，并且使用MANDYS8单克隆抗血清(Sigma-Aldrich)进行肌养蛋白免疫组织化学，其中对制造商的说明进行了修改。简言之，将恒冷切片解冻并在1％triton/磷酸盐缓冲盐水，pH7.4(PBS)中再水化/脱脂。在脱脂后，洗涤切片除去Triton，用小鼠IgG封闭试剂(M.O.M.试剂盒，Vector Laboratories)孵育、洗涤并用MOM蛋白浓缩物/PBS和在MOM蛋白浓缩物/PBS中1∶1800稀释的MANDYS8依次平衡。在4℃下孵育一抗过夜后，洗涤切片，与MOM生物素化的抗小鼠IgG一起孵育、洗涤并通过孵育Vector荧光素-抗生物素蛋白DCS完成检测。在用Vectashield覆片之前，用碘化丙啶(Molecular Probes)对核进行复染色。

[0203] 成像和分析。用配有落射荧光照明(epifluiorescence illumination)、CRI色轮和Zeiss Axiocam单色CCD照相机的Zeiss Axioplan 2iE直立照相显微镜观察试样。使用OpenLab 4.0采集和控制软件(Perkin-Elmer)捕获4x、10x和20x物镜放大视野，并进一步用于应用指示的伪彩色和合并图像叠加。将图像用Adobe Photoshop CS2调整峰值水平并保存用于图像分析。使用ImageJ 1.47来应用立体形态测量随机化网格叠加并使用软件的计数函数对每个肌肉组的约500个聚集肌纤维(来自最少三个间隔切片)的肌养蛋白阳性和阴性免疫染色进行标记和评分。还用ImageJ 1.47分析每种基因型的比目鱼肌H&E染色切片的尺寸和特征。简言之，对115+个立体随机化的肌纤维的肌膜边界进行手动勾画，计算其截面积，并记录中央核表型。

[0204] Western印迹分析。解剖肌肉并在液氮中快速冷冻。按照(Nicholson等，1989和Kodippili等，2014)所述(进行了修改)来进行蛋白质提取和Western印迹分析。将样品用匀化器(POLYTRON System PT 1200E)在含有10％SDS、62.5mM Tris、1mM EDTA和蛋白酶抑制剂(Roche)的400μL样品缓冲液中匀化2X20秒。使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce)测量蛋白质浓度。将每个肌肉样品的50微克蛋白质上样到梯度SDS-PAGE(Bio-Rad)上。将凝胶在100V下运行2.5小时。将分离的蛋白质在冷藏室(4℃)中在35V下转移到PVDF膜过夜。使用
2％丽春红对PVDF膜的总蛋白进行染色，然后在25℃下在温和摇动下用5％w/v脱脂奶粉、1X TBS、0.1％Tween-20(TBST)封闭1小时。将封闭的膜与小鼠抗肌养蛋白单克隆抗体(MANDYS8，Sigma-Aldrich，在5％奶/TBST中1∶1000稀释)在4℃下孵育过夜，然后在TBST中洗涤。然后将印迹与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG二抗(Bio-Rad，1∶10,000稀释)在25℃下孵育1小时。用TBST洗涤后，将印迹暴露于Western Blotting Luminol试剂(Santa Cruz Biotech)1分钟以检测信号。通过抗GAPDH抗体(Millipore，1∶10,000稀释)监测蛋白质上样。

[0205] 脱靶位点的深度测序。使用表S1中列出的针对(A)mdx(B)mdx+Cas9(C)WT和(D)WT+Cas9的引物通过PCR扩增脱靶基因座。PCR产物通过MinElute PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化，调节至相同浓度(10ng/μL)，并且对于每组合并等体积(5μL)。根据制造商的说明书(KAPA Library Preparation Kits with standard PCR library amplification module，Kapa Biosystems)进行文库制备。在来自Illumina的Hiseq 2500上进行测序并使用Rapid Mode 150PE化学运行。使用BWA(bio-bwa.sourceforge.net/)对测序读数制图。保留了制图质量大于30的读数以用于变体发现。所有区域和所有样品的平均读数深度为2570倍。使用SAMtools(samtools.sourceforge.net/)和自定义脚本对这些变体命名。在每个区域中，在以Cas9潜在切割位点为中心的50-bp窗口中对3个碱基对或更长的插入和缺失进行计数。

[0206] 卫星细胞的激光显微解剖。来自腓肠肌冷冻包埋物的冷冻切片被装在聚乙烯膜框架载玻片(Leica Microsystems PET-Foil 11505151)上进行同日设置(same-day set-up)的Pax-7免疫组织化学。按照(Murphy等2011)所述(进行了修改)使用单克隆Pax-7抗体(Developmental Studies Hybridoma Bank)对PET箔膜框架载玻片进行抗原修复(Gjerdrum等，2001)。简言之，将腓肠肌冷冻切片风干，用4％的多聚甲醛固定、Triton-X100脱脂并在抗原修复缓冲液(柠檬酸钠缓冲液pH 6.0)中在65℃下孵育20小时。在抗原修复后，用0.6％的过氧化氢淬灭切片，除去内源性过氧化物酶，并与小鼠IgG封闭试剂(M.O.M试剂盒，Vector Laboratories)一起孵育，用PBS洗涤，与MOM蛋白浓缩物/PBS一起孵育，然后与Pax-7抗体(2μg/ml)在MOM蛋白浓缩物/PBS中在4℃下过夜孵育。用PBS洗涤切片并与MOM生物素化的抗小鼠IgG、链霉亲和素-过氧化物酶(Vector Laboratories)孵育，并用二氨基联苯胺发色团(DAB，Dako)显色。用无核酸酶的Mayer苏木精对核进行复染。使用Leica AS-LMD显微鉴定Pax-7阳性卫星细胞，并通过激光显微解剖在63x物镜放大下分离。对于每种基因型，分离60至70个Pax-7阳性卫星细胞，并合并到10μl的捕获缓冲液中(DirectPCR Lysis Reagent，Viagen Biotech Inc.)并储存在-20℃。如上所述，使用引物DMD232_f和DMD232_r(表S1)通过PCR扩增靶基因组区。

[0207] 实施例2-结果

[0208] 本研究的目的是通过体内CRISPR/Cas9介导的基因组编辑来校正mdx小鼠Dmd基因中的遗传缺陷。mdx小鼠(C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J)在Dmd基因的外显子23中含有无义突变(14，15)(图1A)。本发明人将Cas9、sgRNA和HDR模板注射到小鼠合子中以校正种系中的致病基因突变(16，17)，这种策略具有校正身体所有细胞(包括肌源性祖细胞)中突变的潜力。还评估了基于CRISPR/Cas9的基因治疗的安全性和效力。

[0209] 最初，本发明人测试了在野生型小鼠(C57BL6/C3H和C57BL/6)中CRISPR/Cas9介导的Dmd基因编辑的可行性并优化了条件。本发明人设计了靶向Dmd外显子23的sgRNA(图4A)和作为用于HDR介导的基因修复之模板的单链寡脱氧核苷酸(ssODN)(图4B和表S1)。将野生型合子与Cas9mRNA、sgRNA-DMD和ssODN共注射，然后植入假孕雌性小鼠中。对来自后代小鼠的对应于Dmd外显子23的聚合酶链式反应产物进行测序(图4C-E)。CRISPR/Cas9介导的Dmd基因编辑的效率在表S2中示出。

[0210] 本发明人接下来将优化的CRISPR/Cas9介导的基因组编辑方法应用于mdx小鼠(图1B)。CRISPR/Cas9介导的基因组编辑系统将在胚胎发育期间通过HDR或NHEJ校正mdx小鼠中的点突变(图1C-D和图5A)。通过RFLP分析和错配特异性T7内切核酸酶I(T7E1)测定(图1E，表S2)来鉴定“校正的”mdx后代(称为mdx-C)。本发明人分析了总共11只不同的mdx-C小鼠。
对来自用HDR介导的基因校正的七只mdx-C小鼠(称为mdx-C1至C7)和含有NHEJ介导的终止密码子之框内缺失的四只mdx-C小鼠(称为mdx-N1至N4)的Dmd外显子23的PCR产物进行测序。测序结果揭示，CRISPR/Cas9介导的种系编辑产生表现出Dmd基因2％至100％校正的遗传性镶嵌mdx-C小鼠(图1E和图5B-C)。如果在合子阶段后发生CRISPR/Cas9介导的修复，则发生大范围的镶嵌现象，从而导致一组胚胎细胞中的基因组编辑(Yen等，2014)。所有小鼠后代发育成成体，没有肿瘤生长的迹象或其他异常表型。

[0211] 本发明人测试了四个不同的小鼠组之CRISPR/Cas9介导的基因组编辑的可能的脱靶效应：(a)未处理的mdx小鼠(称为mdx)，(b)CRISPR/Cas9编辑的mdx小鼠(称为mdx+Cas9)，(c)未处理的野生型对照小鼠(C57BL6/C3H)(称为WT)和(d)CRISPR/Cas9编辑的野生型小鼠(称为WT+Cas9)(图6A)。通过CRISPR设计工具(crispr.mit，edu/)预测小鼠基因组中靶位点(Dmd外显子23)的序列和总共32个潜在脱靶(OT)位点，并列于表S3中。称为OT-01至OT-10的32个位点中的10个代表全基因组的十大命中(top-ten hits)。称为OTE-01至OTE-22的32个位点中的22个位于外显子内。

[0212] 对应于Dmd外显子23的PCR产物的深度测序揭示了在B组和D组中高比率的HDR和NHEJ介导的遗传修饰，但在对照组A和C中则没有(图6A和表S4)。在不同组之间的32个潜在脱靶区域中的插失突变的频率没有差异(图6B-C，表S5)。这些结果也与最近的全基因组研究一致，表明通过Cas9的DNA切割不是混杂的(Wu等，2014；Kuscu等，2014；Duan等，2014)。因此，脱靶效应在体内比以前在体外可能是较小的问题(Pattanayak等，2013和Fu等，2013)。

[0213] 为了分析CRISPR/Cas9介导的基因组编辑对肌营养不良的发生的影响，本发明人对在7-9周龄时具有不同百分比的Dmd基因校正的来自野生型小鼠、mdx小鼠和三个选择的mdx-C小鼠的四种不同肌肉类型(四头肌、比目鱼肌(后肢肌肉)、膈(呼吸肌)和心肌)进行了组织学分析。mdx肌肉显示肌营养不良的组织病理学标志，包括纤维直径、中央核、变性纤维、坏死纤维和矿化纤维以及间质纤维化的变化(图2、图7A和8A)。免疫组织化学示出在mdx小鼠的骨骼肌或心脏中没有肌养蛋白表达，而野生型小鼠在纤维和心脏的肌膜下区域中示出肌养蛋白表达(图2)。尽管mdx小鼠携带Dmd基因的终止突变，但本发明人观察到0.2-0.6％的回复纤维(revertant fiber)，与以前的报道(24)一致。通过HDR校正的具有41％mdx等位基因的mdx-C小鼠(称为HDR-41％)或通过框内NHEJ的具有83％校正的mdx-C小鼠(称为NHEJ-83％)示出完全缺乏营养不良肌肉表型和在所有肌纤维的肌膜下区域中恢复肌养蛋白表达(图2)。引人注目的是，仅17％的突变Dmd等位基因的校正(称为HDR-17％)就足以使大多数肌纤维中的肌养蛋白表达与野生型小鼠的强度水平相当，并且与mdx肌肉相比，肌肉展示较少的肌营养不良的组织病理学标志(图7A)。与仅17％的基因校正相关的显著更高百分比(47-60％)的肌养蛋白阳性纤维(图9A-B)表明校正的骨骼肌细胞的选择性优势。
Western印迹分析示出在mdx-C小鼠的骨骼肌(四头肌)和心脏中恢复的肌养蛋白达到与肌养蛋白阳性纤维的百分比一致的水平(图7B和图9B)。

[0214] 为了比较随着时间的挽救效率，本发明人选择具有约40％挽救的可比镶嵌现象的mdx-C小鼠。如图10A所示，具有约40％HDR-介导的基因校正的3周mdx-C小鼠(称为HDR-40％-3wks)在大多数肌养蛋白阳性纤维中示出偶尔的肌养蛋白阴性肌纤维。相反，在9周龄时在具有可比基因校正的小鼠中未观察到肌养蛋白阴性纤维，表明在骨骼肌中随年龄的进行性挽救。在具有可比镶嵌现象的mdx-C小鼠中，本发明人没有观察到3至9周龄之间心脏中肌养蛋白表达的显著差异(图10B)，表明年龄依赖性改善可能限于骨骼肌。

[0215] 骨骼肌中肌养蛋白表达的广泛和进行性挽救可能反映肌纤维的多核结构，以使得具有经校正的Dmd基因的一组核可补偿具有Dmd突变的核。校正的卫星细胞(骨骼肌的干细胞群)与营养不良纤维的融合也可能进行性促进营养不良肌肉的再生(Yin等，2013)。为了研究这种可能性，本发明人通过用Pax-7(一种用于卫星细胞的特异性标志物)进行免疫染色，鉴定了mdx-C小鼠的肌肉切片中的卫星细胞(图11A)。本发明人使用激光显微解剖来解剖Pax-7阳性卫星细胞和分离的基因组DNA以用于PCR分析(图3A和图11B)。来自这些分离的卫星细胞之对应于Dmd外显子23的PCR产物的测序结果示出经校正的Dmd基因(图3B)。这些结果表明，CRISPR/Cas9基因组编辑校正卫星细胞中的突变，从而使得这些肌肉干细胞挽救营养不良肌肉(图3C和图11C)。

[0216] 在野生型、mdx和mdx-C小鼠中测量了血清肌酸激酶(CK)，其是一种反映肌肉渗漏(muscle leakage)的肌营养不良的诊断标志物。与组织学结果一致，与mdx小鼠相比，mdx-C小鼠的血清CK水平显著降低，并且与基因组校正的百分比成反比(表1)。还对野生型、mdx和mdx-C小鼠进行握力测试以测量肌肉性能，并且与mdx小鼠相比，mdx-C小鼠示出增强的肌肉性能(表1)。

[0217] 通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑(Myo编辑)的永久外显子跳读。对出生后组织中基因组编辑的挑战是在有丝分裂后的细胞(例如肌纤维和心肌细胞)中不发生HDR。然而，NHEJ确实发生并且可用于破坏突变而不需要诱变的精确性。外显子跳读是一种其中基因的部分被“跳读”的策略，从而使得产生部分功能性肌养蛋白(Aartsma-Rus，2012)。然而，传统的反义寡核苷酸(AON)介导的瞬时外显子跳读具有寡核苷酸组织摄取的效率低、寡核苷酸终身递送的需求和不完全外显子跳读的问题。为了克服这种挑战，本发明人使用CRISPR/Cas9系统破坏DMD突变之前的外显子剪接位点或者删除突变体或框外外显子，从而使得周围外显子之间剪接以重建缺少突变的框内肌养蛋白。通过永久校正引起DMD的遗传损伤，基因组编辑仅需要将编辑组分一次递送至心脏或骨骼肌。此外，肌肉功能随时间的逐步改善使得在基因组编辑后长时间中发生肌肉功能的持续恢复。

[0218] 肌养蛋白的示意图如图12所示。这种3685个氨基酸的大蛋白含有数个表征充分的结构域，包括在N-末端的肌动蛋白结合结构域、具有一系列血影蛋白样重复和肌动蛋白结合重复的中心杆结构域以及在C末端介导与肌养蛋白聚糖、小肌营养蛋白(dystrobrevin)和互养蛋白(syntrophin)结合的富含WW和半胱氨酸的结构域。重要的是，蛋白质的许多区域对达到外显子跳读策略的治疗效力的功能是不必要的。因此，肌养蛋白的C-末端对于以下功能是必需的：恢复C-末端的外显子跳读策略可将DMD转化为贝克肌营养不良(Becker Muscular Dystrophy，BMD)(一种不引起过早死亡或严重移动性丧失的相对温和形式的疾病)，从而使得功能显著改善。

[0219] 考虑到在人中已经鉴定出数千个单独的DMD突变，一个明显的问题是如何通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑容易地校正这样大量的突变。为了克服该挑战，本发明人提出使用CRISPR/Cas9破坏DMD突变前的剪接受体/供体位点或缺失突变外显子，从而使得周围外显子之间剪接以重建缺乏突变的框内肌养蛋白。该方法的示意图在图13中示出，其中NHEJ可产生内部基因组缺失以校正开放阅读框或可破坏剪接受体位点。该实施例示出了如何可以应用该方法来绕过造成mdx小鼠营养不良表型的外显子23突变，但是原则上可应用于基因内的多种类型的突变。据估计，多达80％的DMD患者可能潜在受益于外显子跳读策略以部分恢复肌养蛋白表达。

[0220] 在mdx小鼠种系上CRISPR/Cas9介导的永久Dmd外显子跳读。为了开始测试mdx小鼠中外显子23突变的Myo编辑，本发明人首先产生了靶向外显子23的5’端和3’端的sgRNA(sgRNA-L和R)的库(图14A)。NHEJ介导的插失可废除保守的RNA剪接位点或缺失外显子23。将这些引导RNA克隆到质粒spCas9-2A-GFP(Addgene#48138)中。最初，本发明人评估了小鼠
10T1/2细胞中引导RNA的效率。通过如前所述的T7E1测定检测Myo编辑效率。外显子23的sgRNA-R3靶标3’端示出高活性。然后，在没有HDR模板的情况下，他们将Cas9和引导RNA mdx以及R3共注射到mdx合子中(图14B)。引人注目的是，9个后代小鼠中的7个在3’供体位点含有插失或缺失整个外显子23(图14C)。在以前的工作中，仅有～8％的mdx幼崽含有HDR介导的校正。使用新方法将效率显著提高十倍。对来自外显子23的靶位点的PCR产物进行克隆和测序。结果表明，Myo编辑可有效地产生NHEJ介导的插失突变从而挽救肌养蛋白基因的开放阅读框。

[0221] 一组NHEJ基因编辑的mdx小鼠具有废除外显子23中剪接位点的遗传缺失。本发明人通过使用外显子22和24中的引物对产生的RT-PCR产物进行测序来分析这些小鼠可能的外显子跳读。测序结果示出外显子22直接剪接至外显子24，不包括外显子23(图15)。跳读外显子23的结果维持肌养蛋白的开放阅读框并恢复蛋白质表达(图16)。外显子23“跳读(skipper)”小鼠(也称为mdx-AE23小鼠)的RT-PCR产物的测序证实了对应于缺乏外显子23序列和肌养蛋白71个氨基酸的框内缺失的213个核苷酸缺失。这些研究结果建立了使用NHEJ介导的基因组编辑以绕过Dmd基因中的许多不同突变之计划的研究的重要概念证据。

[0222] 通过AAV介导的Myo编辑在小鼠中体内挽救肌营养不良。AAV是用于安全递送Cas9蛋白和引导RNA以对人骨骼肌和心脏进行精确Myo编辑的最有前景和合适的载体之一。重要的是要强调这样的问题：通过AAV递送CRISPR/Cas9精确Myo编辑疗法与优化病毒递送和基因组工程过程二者的效率紧密相关。本发明人集中于开发用于将CRISPR/Cas9基因组编辑机器体内递送至肌肉细胞的最高效价的AAV9制备物。这是一个有大量国际研究的领域(Senis等，2014；Schmidt&Grimm，2015)。

[0223] 本发明人使用经验证的引导RNA-mdx/R3来产生AAV9-引导RNA(图17A)。他们获得了独特的AAV9CRISPR/Cas9载体(微小CMV-Cas9-短PolyA质粒)(图17B)。这种病毒构建体使用尽可能最短的“微小”-CMV启动子/增强子序列来驱动Cas9蛋白的表达。本发明人在mdx小鼠模型中体内评估了这些重组病毒。他们系统地测试AAV9递送的不同模式以及表达时间的变化以确定实现最大Dmd编辑的最佳方法。他们在不同年龄施用四种类型的注射途径：(i)在P1时腹膜内(IP)，(ii)在P10时肌内(IM)，(iii)在P14时框后(RO)以及(iv)在P28时心内(IC)。在图17C中示出的时间点收获心脏和骨骼肌。

[0224] 在概念验证实验中，本发明人通过P10小鼠的IM注射或P28的IC注射来注射重组AAV。在注射后3周，通过免疫染色分析肌肉组织的肌养蛋白表达，如图18A所示。天然绿色荧光蛋白(GFP)指示在肌纤维中AAV介导的基因表达。经注射小鼠的骨骼肌具有邻近肌养蛋白阴性纤维簇的肌养蛋白阳性纤维簇的独特模式。在IM-AAV后3周，在经处理的mdx小鼠的胫骨前肌中估计肌纤维的转导频率或挽救为7.7％±3.1％。(图18B)来自mdx小鼠心脏的连续切片的天然GFP和肌养蛋白免疫染色示出在心肌细胞中的肌养蛋白表达(在IC-AAV后4周)。在IM-AAV后6周，估计肌纤维的转导频率(挽救)提高到25.5％±2.9％(图19)。在IM-AAV后3周至6周，观察到随着年龄的逐步改善，这与来自种系编辑的结果一致(图10A)。

[0225] 在注射后4周和8周，通过免疫组织化学检查在P14时通过眶后注射注射有重组AAV(RO-AAV)的小鼠的肌肉组织(图20)。将肌养蛋白阳性纤维或肌细胞的百分比计算为总估计纤维的函数。在mdx小鼠中RO注射后4周，1.9％±0.51％的肌纤维是肌养蛋白阳性，而1.3％±0.05％的心肌细胞是肌养蛋白阳性。在RO-AAV后4周至8周观察到随着年龄的逐步改善。到RO-AAV后8周时，估计胫骨前肌中肌纤维的挽救提高至6.1±3.2％，而心肌细胞挽救提高至5.0％±2.1％。

[0226] 在P1mdx幼崽进行IP注射后4周，通过免疫组织化学检查骨骼肌和心脏(图21)。在经处理的mdx小鼠中，估计在胫骨前肌中的肌纤维的转导频率(挽救)为3.0％，而心肌细胞中为2.4％。本发明人期望随着时间逐步进行更高百分比的肌肉校正。事实上，在本发明人先前的种系研究中，体内编辑随着时间逐步改善(Long等，2014)。已报道在心脏中肌养蛋白甚至低水平的表达(4-15％)可部分改善mdx小鼠的心肌病(van Putten等，2014)。

[0227] 在以20×物镜放大率扫描的胫骨前肌和心脏的全标本逐层切片(whole step-section)的重复片上进行肌养蛋白阳性和总肌纤维和心肌细胞的形态测量分析。使用Nikon Imaging Solution Elements v4.20.00软件的注释和测量功能(NIS/AM)以大小为7889×7570像素至27518×18466像素解析扫描的图像。分别对肌养蛋白阳性肌纤维和心肌细胞的数目进行计数并使用NIS/AM记录，同时从由8个20×物镜图像的平均值得到的每个视野的细胞计数来估计总肌纤维和心肌细胞的数目，并外推至整个扫描截面区域。

[0228] 结果表明AAV介导的Myo编辑可以有效地在体内挽救mdx小鼠中肌养蛋白的阅读框。不同的AAV递送方法对组织具有不同的影响。在注射的骨骼肌(TA)中IM具有最高的挽救百分比肌纤维，而RO在心脏中示出最佳性能。

[0229] 通过Myo编辑挽救DMD心肌细胞功能。长期目标是使Myo编辑适用于出生后心脏和骨骼肌细胞并利用该方法来校正人中的DMD突变。本发明人现在通过改造DMD患者来源的iPSC的基因组中突变外显子的跳读，将小鼠的Myo编辑扩展到人DMD患者的细胞。患者中的DMD突变簇集在基因的特定区域(“热点”突变)(图22)。他们已经使用sgRNA库来靶向最高的12个热点突变外显子，优化了“热点”DMD突变的Myo编辑，这可能适用于80％的DMD患者。他们选择三到六个PAM序列以靶向每个外显子的5’或3’端(表2)。Myo编辑介导的插失废除了保守的RNA剪接受体/供体位点并挽救框外的外显子。基于已知的DMD突变，本发明人正建立用于选择Myo编辑的最佳靶标DMD序列的在线资源(Duchenne Skipper Database)，其将挽救大多数DMD患者中的肌养蛋白功能。

[0230] 例如，本发明人设计了靶向外显子51的5’的三个引导RNA(图23A)。将这些引导RNA克隆到质粒spCas9-2A-GFP(Addgene#48138)中。最初，本发明人通过转染和核转染来评估人293T细胞和正常人iPSC中引导RNA的效率。通过GFP报道子分选经转染的293T细胞和核转染的iPSC。按照以上所述通过T7E1测定来检测Myo编辑效率(图23B)。在GFP+分选的293T细胞中，引导RNA#3示出高活性，而引导RNA#1和2没有可检测的活性。结果突显了靶序列优化的重要性。然后，本发明人在人iPSC中应用引导RNA#3并观察到相同的结果。将来自外显子51的靶位点的PCR产物克隆并测序。结果示出Myo编辑可以有效地废除剪接受体位点(Aag)或产生插失以挽救阅读框。

[0231] 接着，本发明人对来自具有缺失(外显子48-50)的DMD患者的iPSC系(也称为Riken HPS0164)进行Myo编辑，这产生如图24A中可见的移码突变。原则上，外显子51中剪接受体的破坏允许外显子47至外显子52的剪接，从而重构开放阅读框。本发明人使用引导RNA(外显子51-sgRNA#3)(图23B)成功地破坏了来自该患者iPSC中外显子51中的剪接受体，通过NHEJ突变恢复了开放阅读框(图24B)。利用Myo编辑的DMD-iPSC库，本发明人使用标准化条件将其分化成心肌细胞(iCM)，并且在一组这些细胞中通过免疫细胞化学证实肌养蛋白表达的挽救(图25)。

[0232] 为了进一步扩展Myo编辑概念，UTSW处的Myo编辑核心产生另外的DMD iPSC细胞系，其用于测试永久外显子跳读策略(图26)。本发明人由患者的血液样品而不是皮肤细胞制备DMD-iPSC，因为血液细胞更易获得，对患者的风险最小。将从全血获得的PBMC(外周血单核细胞)进行培养，然后使用表达重编程因子的重组仙台病毒载体(Cytotune 2.0，Life Technologies)将其重编程为iPSC。通过免疫细胞化学、支原体测试和畸胎瘤形成来验证iPSC集落。

[0233] 22岁的男性患者在内含子47中具有自发突变(c.6913-4037T＞G)，其产生新的RNA剪接受体位点(YnNYAG)，并产生外显子47A的假外显子(图27)。该假外显子编码提前终止信号。本发明人设计了精确靶向突变位点的两个引导RNA(图28)。Myo编辑可废除新的剪接受体位点并且永久地跳读假外显子。值得指出的是，引导RNA#2将仅靶向突变等位基因，因为野生型DMD不含有PAM序列(AGG)，这对于具有突变和野生型等位基因二者的女性DMD携带者中潜在的Myo编辑是重要的。此外，Myo编辑介导的插失突变在内含子区域的中间，其不会影响所编码的肌养蛋白的正常功能。理论上，通过跳读假基因，所得的肌养蛋白基因可产生全长mRNA和肌养蛋白。按照所述将特异性引导RNA克隆并核转染到iPSC中。本发明人通过RT-PCR在这些DMD-iCM中测试了外显子跳读的效力(图29)。通过免疫细胞化学测定衍生自校正的iPSC之肌肉细胞的肌养蛋白表达，其在myo编辑的DMD心肌细胞中示出肌养蛋白表达(图30)。

[0234] 总之，精确的Myo编辑使我们不仅靶向DMD“热点”(例如，Riken HPS0164DMD-iPSC)，而且容易地校正任何其他罕见突变(例如DC0160DMD)。Myo编辑代表永久地消除DMD的遗传原因的新的和强大的方法。考虑到在有丝分裂后成体组织中的持久和进行性治疗响应的可能性，本发明人认为这是应用Myo编辑来永久性校正与DMD相关的肌肉异常的适宜时机。

[0235] 实施例3-讨论

[0236] 这些结果示出CRISPR/Cas9介导的基因组编辑能够校正引起肌肉营养不良(DMD)的原发性遗传病变，并防止mdx小鼠中该疾病的特征性特点的发展。由于种系中基因组编辑产生具有宽范围镶嵌现象(2至100％)的遗传校正的动物，因此本发明人能够将基因组校正百分比与正常肌肉结构和功能的挽救程度进行比较。本发明人观察到，在体内仅一组校正细胞就足以完成表型挽救。如图3C所示意，部分校正的mdx小鼠的组织学分析揭示了三种类型的肌纤维：1)正常肌养蛋白阳性肌纤维；2)营养不良的肌养蛋白阴性肌纤维；和3)指示肌肉再生的含有中央核的镶嵌肌养蛋白阳性肌纤维。本发明人提出，后一类型的肌纤维来源于将校正的卫星细胞募集到损伤的肌纤维中，从而形成具有中央核的镶嵌肌纤维。培养物中这些细胞的增殖潜能和再生能力的丧失已经阻碍了将卫星细胞作为细胞来源离体扩增以用于体内植入的努力(Montarras等，2005)。因此，通过CRISPR/Cas9系统在体内直接编辑卫星细胞代表了促进DMD中肌肉修复之潜在的有前景的替代方法。

[0237] 如果可以克服某些技术挑战，则原则上可设想在出生后细胞中在体内进行基因组编辑。例如，需要能够在体内将CRISPR/Cas9系统的组分引导至营养不良肌肉或卫星细胞的合适的体细胞递送系统。在这方面，已证明非病原性腺相关病毒(AAV)递送系统是安全和有效的，并已在用于基因治疗的临床试验中得到发展(Nathwani等，2011和Peng等，2005)。此外，已经示出AAV9血清型在DMD患者的骨骼肌、心脏和脑、受影响的主要组织中提供稳健的表达。也可考虑另一些非病毒基因递送方法，包括注射裸质粒DNA(Peng等，2005)、化学修饰的mRNA(Kormann等，2011和L.Zangi等，2013)以及含有核酸的纳米颗粒(Harris等，2010)。关于CRISPR/Cas9系统临床应用的可行性的另一个挑战是啮齿类动物与人之间身体尺寸的增加，需要大规模扩大。CRISPR/Cas9系统进入临床使用的发展还需要在出生后体细胞组织中更有效的基因组编辑。尽管CRISPR/Cas9可在体细胞中有效产生NHEJ介导的插失突变，但是HDR介导的校正在有丝分裂后的细胞(例如肌纤维和心肌细胞)中相对无效，原因是这些细胞缺乏同源重组所必需的蛋白质(Hsu等，2014)。HDR途径的组分与CRISPR/Cas9系统的共表达可增强HDR介导的基因修复。最后，CRISPR/Cas9系统的安全性问题，特别是长期使用时，需要在大型动物疾病模型的临床前研究中进行评估。尽管有上面列出的挑战，但是随着基因递送系统的快速技术进步和CRISPR/Cas9编辑系统的改进(Hsu等，2014)，本发明人描述的方法在可预见的未来最终可以为DMD和另一些人遗传疾病提供治疗益处。

[0238] 总之，本文的方法使用CRISPR/Cas9系统来缺失含有肌养蛋白基因突变的外显子上游的外显子剪接受体。该方法在基因组上仅产生微小的改变(几个核苷酸)，这将避免破坏内含子中的其他功能元件(增强子、可变启动子和微RNA等)。这种基因校正机制不同于其他人报道的机制。主要剪接体剪接在5’剪接位点含有GU以及在3’剪接位点含有AG的内含子。由单链引导RNA(sgRNA)引导的Cas9与毗邻前间区序列邻近基序(PAM)的靶向基因组基因座结合并产生双链断裂(DSB)。经典Cas9(来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes))的PAM序列是NAG或NGG，这意味着原则上其可以靶向具有突变的任何外显子并通过外显子跳读来挽救基因表达。另外，本文的方法是通过使用AAV9(和其他递送方法)递送CRISPR/Cas9系统来指导体内卫星细胞或肌纤维的基因组编辑。迄今为止尚未报道人中的直接的基因组编辑。这种直接的方法代表一种促进DMD肌肉修复的潜在有前景的替代方法。

[0239] 表1.野生型、mdx和mdx-C小鼠的血清肌酸激酶(CK)水平和前肢握力

[0240]

[0241] 表2.DMD基因12个外显子的引导RNA的序列

[0242]

[0243] 注：粗体表示用于Myo编辑的最佳引导

[0244] 表S1.寡核苷酸和引物序列

[0245]

[0246]

[0247] 表S2.通过细胞质和原核注射之CRISPR/Cas9介导的基因组编辑的效率[0248]

[0249] 表S3.小鼠基因组中靶位点(Dmd外显子23)和32个潜在脱靶(OT)位点的序列[0250]

[0251] 表S4.来自Dmd靶位点的PCR产物的深度测序结果

[0252]

[0253] 表S5.来自32个潜在脱靶区的PCR产物的深度测序结果

[0254]

[0255]

[0256] ＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊

[0257] 根据本公开内容，可以制备和实施本文公开和要求保护的所有组合物和/或方法而无需过度实验。虽然已经根据一些优选实施方案描述了本公开内容的组合物和方法，但是对于本领域技术人员明显的是，在不脱离本公开内容的概念、精神和范围的情况下可以对本文描述的组合物和/或方法以及方法的步骤或步骤顺序进行变化。更具体地，明显的是，化学和生理学二者相关的某些试剂可代替本文所述的试剂，同时将获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员明显的是所有这些类似的替代和修改均被认为在由所附权利要求限定的本公开内容的精神、范围和概念内。

[0258] VI.参考文献

[0259] 以下参考文献，在其对本文所阐述的内容提供补充性的示例性方法或其他细节的程度上，通过引用明确并入本文。

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