C1-C2有机酸处理木质纤维素生物质以制造酰化纤维素纸浆、半纤维素、木质素以及糖和糖的发酵 |
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| 申请号 | CN201280048383.9 | 申请日 | 2012-09-21 | 公开(公告)号 | CN103958689A | 公开(公告)日 | 2014-07-30 |
| 申请人 | 阿彻丹尼尔斯米德兰德公司; 诺瓦塞梅斯公司; | 发明人 | T·P·宾德; 查尔斯·阿巴斯; 武-立·包; 卢卡斯·洛夫莱斯; | ||||
| 摘要 | 本 发明 描述了一种用于由木质 纤维 素 生物 质 产生富集C5和C6糖的糖浆和由其产生 发酵 产物的方法。将一种 木质 纤维素 生物质 用一种C1-C2酸（例如乙酸）处理，其中该C1-C2酸的洗涤用一种C1-C2酸可混溶的 有机 溶剂 （例如乙酸乙酯）进行。与一个富集纤维素纸浆的部分分离地获得了一个可溶的富集半纤维素和木质素的部分，并且将木质素从该可溶半纤维素部分移除。这些部分包含酰化（例如乙酰化）纤维素和半纤维素，它们通过用一种 碱 和/或用一种乙酰酯酶处理来脱酰化。然后将这些经过脱酰化的部分用适合的纤维素分解和/或半纤维素分解酶优选在非离子清洁剂存在下消化，以便产生这些富集C5和C6的糖浆。还描述了通过分别 水 解 和发酵（SHF）或同时水解和发酵（SSF）方法使这些糖浆进行发酵以制造达到至少7%w/vol 乙醇 的方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种用于加工木质纤维素生物质以形成酰化纤维素纸浆的方法，该方法包括： |
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| 说明书全文 | C1-C2有机酸处理木质纤维素生物质以制造酰化纤维素纸浆、半纤维素、木质素以及糖和糖的发酵 相关申请的交叉引用 [0001] 本申请要求2011年9月23日提交的名称为纤维素分解酶组合物和其用途（Cellulolytic Enzyme Compositions and Uses Thereof）的美国临时申请号61/538,211和2012年4月26日提交的美国临时申请号61/638,544的优先权，各美国临时申请通过引用以其全文结合在此。 联邦赞助研究声明 发明背景[0003] 纤维素和半纤维素向单体糖的水解是商业转化如以下的木质纤维素原料的一种关键前提：玉米秆、玉米纤维壳、大豆壳、小麦秸、甘蔗渣、甜糖用甜菜浆、以及衍生自由多年生禾草（如柳枝稷或芒草）、竹子以及软和/或硬木组成的能源作物的其他植物生物质形式、以及纸浆和废纸残余物。然而，木质纤维素生物质向单体糖的转化给这些单体糖尤其作为用于通过使这些糖发酵来制造如乙醇的产物的原料的经济用途造成许多技术挑战。 [0004] 这些技术问题之一是水解过程本身。常规地，使用无机酸、与高热量结合的苛刻酸性条件是将一个充足量的纤维素和半纤维素聚合物水解为其有用的单体糖残余物所要求的。不幸的是，此类苛刻条件导致产生对用于发酵的微生物具有毒性的众多副产物，如糠醛、羟甲基糠醛、复合酯、腐黑物以及焦油。此外，这些副产物降低了否则可以获得的单体糖的产率。这些副产物可以通过不同的纯化技术与所释放的单体糖分离，但这些技术增加了成本并且导致有用糖的更低的产率。具有纤维素分解和半纤维素分解活性的酶的不同混合物可以代替酸处理或结合酸处理使用，然而，这些不同的可用酶混合物对于典型木质纤维素生物质中存在的大部分的纤维素和半纤维素来说仍然不提供有成本效益的水解活性。又另一个技术问题是，来自木质纤维素生物质的单体糖制剂包含相对大量的C5糖，如木糖；和一个较少量的衍生自半纤维素的阿拉伯糖、以及C6糖甘露糖和半乳糖。否则可以能够将此类糖用于细胞生长的生物体典型地在以足够经济的量将这些糖转化为所希望的发酵产物方面是低效的。即使基因工程化以利用木糖的酵母菌株也不能够在一个典型发酵过程中积聚乙醇达到多于5%v/v，该产率太低以致不能将乙醇从发酵液中蒸馏出来作为一项经济提议。 [0005] 因此，在本领域中仍然存在一种需求，即开发一种用于制备具有高品质的木质纤维素生物质的综合方法，该木质纤维素生物质可以在减少毒性副产物的情况下高产率地转化为C5和C6糖原料；以及在发酵方案中利用所提供的C5和C6糖流以获得至少8%v/v的一个组合乙醇产率的方法。发明概述 [0006] 如在此所述的方法和由此制造的物质克服了许多前述技术挑战。这些方法包括在初始回合的水解中使用一种温和C1-C2有机酸结合一种适合C1-C2酸可混溶的有机溶剂，以将酸可溶半纤维素和木质素与一种纤维素纸浆分离。使用该C1-C2有机酸导致半纤维素和纤维素酯化，这通过在用一种纤维素分解和半纤维素分解酶的适当混合物使这些部分进一步水解之前或结合该进一步水解进行酶促和/或化学去酯化来克服。在优选实施例中，包括一种酯酶。在该酶促水解中使用一种非离子清洁剂实质上增加了催化转化为适合富集C5和C6糖的糖浆的速率。此外，在分阶段发酵过程中使用其以在发酵液中达到大于8%乙醇产生。 [0007] 所获得的结果出人意料之处在于，与来自现有技术的公开的理解相反，纤维素向葡萄糖的水解可以在纤维素酶活性无明显抑制的情况下进行，并且超过5%的乙醇浓度在通过在此所述的方法制造的物质中对酶活性并非是不利的。另外，这些方法提供了一种由单子叶植物物种、特别是小麦和玉米秆制造一种可用纤维素纸浆的方式，该单子叶植物物种尚未被涵盖作为可用于代替衍生自木质性更大的物种的纸浆的纤维素纸浆的来源。 [0008] 一个通用实施例是加工木质纤维素生物质以形成酰化纤维素纸浆的方法，该方法包括使一种木质纤维素生物质与一个第一量的一种选自下组的C1-C2酸接触，该组由以下各项组成：乙酸、甲酸以及其混合物。将该经过接触的木质纤维素生物质加热到一个温度并且持续一段时间，足以水解释放一个第一部分的半纤维素和木质素，从而形成一种水解产物液体和一种酰化木质纤维素滤饼。将该酰化木质纤维素滤饼与该第一水解产物液体分离，并且使其与一个第二量的该C1-C2酸接触，以将半纤维素和木质素从该酰化木质纤维素滤饼洗掉。将该包括可溶半纤维素和木质素的酸洗涤液体与该经过酸洗涤的滤饼分离，并且使该滤饼与一个第一量的一种C1-C2酸可混溶的有机溶剂接触，以将该C1-C2酸、半纤维素以及木质素从该经过酸洗涤的酰化滤饼进一步洗掉，留下一种酰化纤维素纸浆，将其与该C1-C2酸可混溶的溶剂洗涤液体分离。 [0009] 在另一个实施例中，这些方法进一步包括将该溶剂洗涤液体与该水解产物和该酸洗涤液体中的至少一者合并，形成一种酸性有机溶剂提取物。将该酸性有机溶剂提取物浓缩，形成一种富集有半纤维素和木质素的酸性有机溶剂糖浆。向那个糖浆中添加一个第二量的该C1-C2酸可混溶的有机溶剂，该第二量足以形成一种包含半纤维素和木质素的沉淀物。将该半纤维素和木质素沉淀物与该酸性有机溶剂糖浆分离。将该沉淀物与一种水性溶剂混合，以形成一种溶解的半纤维素的溶液和不溶的木质素，并且将该不溶的木质素与该溶解的半纤维素分离。 [0010] 在任选的实施例中，在该浓缩之前，将该水解产物与该酸洗涤液体混合，形成一种酸可溶物质的混合物。在某些实施例中，该浓缩通过蒸发形成一种包含该C1-C2酸和该C1-C2酸可混溶的有机溶剂的蒸气混合物来进行。在此类实施例的一个优选惯例中，将该蒸气混合物回收，并且通过蒸馏将该C1-C2酸和该C1-C2酸可混溶的有机物分离和回收。 [0011] 在某些实施例中，在将该半纤维素和木质素沉淀物与该酸性有机溶剂糖浆分离之后，添加一个新的量的C1-C2酸可混溶的有机溶剂到该酸性有机溶剂糖浆中，并且形成一种第二包含半纤维素和木质素的沉淀物，并且也将其与酸性有机溶剂糖浆分离。 [0012] 在其他实施例中，以上方法中的任一者可以进一步包括使该经过溶剂洗涤的酰化纤维素纸浆和该溶解的半纤维素中的至少一者与一种碱接触，形成一种脱酰化纤维素纸浆和一种脱酰化半纤维素部分中的至少一者。在一个优选替代方案中，该脱酰化包括使该经过溶剂洗涤的酰化纤维素纸浆和该溶解的半纤维素部分中的至少一者与一种酯酶接触，形成该脱酰化纤维素纸浆和一种脱酰化半纤维素部分中的至少一者。 [0013] 再另外的实施例包括使该脱酰化纤维素纸浆和该脱酰化半纤维素部分中的至少一者与一种包含至少一种半纤维素酶和一种纤维素酶的酶混合物接触足以形成至少一种富集C5或C6糖的糖浆的一段时间。在某些实施例中，使该经过溶剂洗涤的酰化纤维素纸浆与一种酯酶接触在与该包含至少一种半纤维素酶和一种纤维素酶的酶混合物接触同时进行，并且其中该酯酶活性是对该半纤维素酶和纤维素酶混合物中存在的内源酯酶活性的补充。在特别有利的实施例中，在该酯酶、该半纤维素酶或该纤维素酶存在下接触该经过洗涤的酰化纤维素纸浆包括在作为所存在物质的总重量百分比测量在0.05%v/wt与5%v/wt之间的一种非离子清洁剂存在下接触。 [0014] 在以上方法的优选惯例中，该木质纤维素生物质是来自一种单子叶植物物种。在具体惯例中，该单子叶植物物种选自下组，该组由以下各项中的至少一者组成：禾草、竹子、小麦秸、玉米秆、大麦秸、粟秸、高粱秸以及稻秸。在再更具体惯例中，该单子叶植物物种是小麦秸、玉米秆或竹子。 [0015] 在示例性实施例中，该C1-C2酸主要是乙酸，该酰化纤维素纸浆包含乙酰化纤维素，并且该酰化半纤维素包含乙酰化半纤维素。另外，在示例性实施例中，该C1-C2酸可混溶的有机溶剂主要是乙酸乙酯。 [0016] 在一个独特实施例中，该C1-C2酸可混溶的有机溶剂不是卤化有机溶剂。 [0017] 在大部分令人希望的惯例中，该木质纤维素生物质具有不大于40%wt/wt、20%wt/wt或10%wt/wt中的至少一者的一个水含量。 [0018] 在另一个方面，提供了一种酰化或脱酰化纤维素纸浆或一种酰化或脱酰化半纤维素，由一种单子叶植物物种制成。在此实施例的具体方面，该纤维素纸浆衍生自一种单子叶植物物种。在再更具体方面，该单子叶植物物种选自下组，该组由以下各项中的至少一者组成：禾草、竹子、小麦秸、玉米秆、大麦秸、粟秸、高粱秸以及稻秸。在示例性方面，该纤维素纸浆衍生自小麦秸、玉米秆或竹子。一种衍生自小麦秸或玉米秆的纤维素纸浆提供了一种特别新的纤维素纸浆来源，该来源来自谷物生产的一种丰富的低价值副产物，该纤维素纸浆可用作衍生自木质性更大的树木物种的纤维素纸浆的一种代替或补充。 [0019] 在又另一个方面，提供了一种发酵以制造所希望的发酵产物的方法，该方法包括获得一种酰化纤维素纸浆和酰化半纤维素部分中的至少一者；使该酰化纤维素纸浆和/或该酰化半纤维素部分脱酰化；使该经过脱酰化的酰化纤维素纸浆和/或酰化半纤维素部分与一种酶混合物接触足以形成一种主要包含C5或C6糖的糖浆的一段时间，该酶混合物包含至少两种选自下组的酶的一种混合物，该组由以下各项组成：一种纤维素酶和一种半纤维素酶；并且使一种微生物在这些糖上生长，以产生该所希望的发酵产物。 [0020] 在一个整合惯例中，获得该酰化纤维素纸浆和/或酰化半纤维素部分根据上文所述的方法来进行。在某些惯例中，这些方法包括，其中使该酰化纤维素纸浆脱酰化包括使该获得的酰化纤维素纸浆与一种碱接触。在某些优选惯例中，这些方法包括，其中使该酰化纤维素纸浆脱酰化包括使该获得的酰化纤维素纸浆与一种酯酶接触。在一些特别优选的惯例中，这些方法包括，其中使该酰化纤维素纸浆与一种酯酶接触包括同时与该包含至少一种半纤维素酶和一种纤维素酶的酶混合物接触，其中该酯酶是对该酶混合物中包含的内源酯酶的补充。在某些优选惯例中，这些方法包括，其中在该酯酶、该半纤维素酶或该纤维素酶存在下接触该酰化纤维素纸浆或酰化半纤维素包括在作为所存在物质的总重量百分比测量在0.05%v/wt与5%v/wt之间的一种非离子清洁剂存在下接触。 [0021] 这些发酵方法包括实施例，其中使该微生物生长在对使该微生物繁殖最佳的条件下进行。在其他实施例中，使该微生物生长在对通过该微生物产生该所希望的产物最佳的条件下进行。 [0022] 在优选发酵方法中，该所希望的产物是乙醇，并且该微生物选自下组，该组由以下各项组成：运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）和一种酵母。该酵母优选是酿酒酵母（S.cerevisiae）。 [0023] 当该生物体是一种酵母时，并且特别是当这些糖主要是C5糖时，该生长可以在被选择以使该酵母繁殖的好氧条件下进行。在其他惯例中，在该生物体是一种被基因工程化以使C5糖发酵以形成乙醇的酵母时，该生长在被选择以产生乙醇的厌氧条件下进行。 [0024] 虽然这些发酵方法示例的是乙醇作为该所希望的产物，但这些方法同样适用于其他发酵产物。这些发酵产物包括，其中这些发酵产物选自下组，该组由以下各项组成：一种氨基酸和一种有机酸。当该发酵产物是一种氨基酸时，一种典型的氨基酸选自下组，该组由以下各项组成：赖氨酸和苏氨酸，并且该微生物选自下组，该组由以下各项组成：大肠杆菌（Escherichia coli）和谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutanicum）。当这些优选的发酵产物是有机酸时，该有机酸可以选自下组，该组由以下各项组成：乳酸、葡萄糖酸、柠檬酸、苹果酸、富马酸以及琥珀酸，在该情况下，该微生物是一种选自下组的真菌，该组由以下各项组成：根霉属（Rhizopus）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）、毛霉菌属（Mucor）以及曲霉属（Aspergillus）。附图简要说明 [0025] 图1是一种生物炼制的一个总体实施例的一个图解，该生物炼制用于加工木质纤维素生物质以形成一种纤维素纸浆、一种半纤维素部分以及一种木质素部分，并且随后通过发酵形成C5和C6糖用于制造乙醇或其他产物。 [0026] 图2展示了一种将一种C1-C2酸和C1-C2酸可混溶的有机溶剂结合用于由木质纤维素生物质制备一种纤维素纸浆、一种半纤维素部分以及一种木质素部分的方法的一个实施例。发明详细说明 [0027] “木质纤维素生物质”意指一种植物物质，其中大部分碳水化合物呈与淀粉和糖不同的纤维素和半纤维素形式。为了使本发明最大程度地可工作，木质纤维素生物质应该具有少于40%的一个水分含量，并且在典型实施例中，水分含量应该是少于30%、优选少于20%并且最优选少于10%。还优选的是使用具有相对低蛋白质含量的生物质，这是因为较高量的蛋白质干扰加工步骤并且污染最终回收的半纤维素和木质素部分。蛋白质含量应该是少于生物质的10%wt/wt。在大部分实施例中，少于5%是优选的。适合的实例包括木材、禾草、竹子、谷类的茎秆（如小麦（秸）、玉米（秆）、大麦、粟、高粱以及稻）、以及来自收获双子叶作物的残余植物废料（包括豆类和谷物的一些皮壳）。具有太多蛋白质的不适合的木质纤维素生物质包括例如玉米皮壳（也称为来自一种湿磨机玉米加工操作的“玉米纤维”流）。 [0028] 一种“C1-C2酸”意指甲酸、乙酸或其混合物，它们可以包括至多30%水。 [0029] 一种“C1-C2酸可混溶的有机溶剂”是与一种C1-C2酸可混溶并且能够由一种包含半纤维素和木质素的C1-C2酸性溶液形成一种其沉淀物的一种非酸性有机溶剂，其条件仅是该C1-C2酸可混溶的有机溶剂不是一种卤化溶剂。适合的实例包括低分子量醇、酮以及酯，如C1-C3醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸甲酯以及甲基乙基酮。 [0030] “酰化”和“酰化的”意指在一种多糖的一个糖或糖残基与一种有机酸之间形成一个酯键。 [0031] C1-C2酸水解。图2展示了本发明的一个方面，关于利用一种C1-C2酸和C1-C2酸可混溶的有机溶剂来将一种纤维素纸浆、半纤维素以及木质素由一种木质纤维素生物质10分离和回收。展示该方法，其中乙酸作为该C1-C2酸并且乙酸乙酯作为该C1-C2酸可混溶的有机溶剂为一种优选方法，然而，还可以将甲酸或甲酸与乙酸的混合物用作乙酸的替代物，并且可以将其他C1-C2酸可混溶的有机溶剂与乙酸乙酯组合或作为其替代物使用，其条件是卤化有机溶剂被明确地排除在某些实施例外。 [0032] 在步骤200，将一种由玉米秆展示和示例的木质纤维素生物质10与该C1-C2酸（乙酸）混合。该C1-C2酸与该木质纤维素生物质的最终比率以wt:wt计应该优选在3:1到5:1酸:干燥固体范围内，其排除了该C1-C2酸和木质纤维素生物质的水含量。更低和更高的C1-C2酸与干燥固体比率将起作用，但不经济。待使用的该C1-C2酸的浓度取决于该木质纤维素生物质10的水分含量而可变，只要达到以上提及的C1-C2酸与干燥固体比率即可。在被干燥到约8%的一个水分含量的一种玉米秆木质纤维素生物质10的情况下，4.5升70%乙酸/千克生物质是充足的。当使用甲酸时，水含量应该更低以实现木质素的有效溶解。80%-90%的甲酸浓度较好起作用，而更高水含量则不。因为乙酸是更疏水的，所以它包容更多水以使相同量的木质素溶解。在步骤205，将该经过酸化的木质纤维素生物质10加热到一个温度并且持续一段时间，足以将一个第一部分的半纤维素和木质素由该生物质10水解溶解，从而形成一种第一水解混合物206。优选地，该加热205在搅拌下或在物理翻滚剂下进行，以在该加热和水解过程200/205期间向该木质纤维素生物质10施加机械力。任选地，在某些实施例中，该初始水解200/205中所用的该C1-C2酸可以补充有不超过0.25%到 1%w/v的一种无机酸，如HCl或硫酸。包括少量无机酸导致半纤维素的水解和溶解提高，然而，还导致溶解的C5糖中的一些降解并且导致尤其将获得的半纤维素部分的无机（灰分）含量增加。此外，如果希望用硫酸补充该C1-C2酸，那么另外必需中和该硫酸并且将其以一种硫酸盐形式回收。如下文和名称为纤维素分解酶组合物和其用途的共同未决的临时申请号 61/538,211中所述，残余硫与可以用于化学转化在某些生物炼制操作中可以是令人希望的糖的某些催化剂不相容，并且还可能会导致形成可能会干扰使用纤维素分解酶、半纤维素分解酶以及酯酶的后续酶促步骤的硫酸酯。因此，在某些实施例中，硫酸确切地说被排除在酸水解步骤205和215外。 [0033] 用于水解释放半纤维素和木质素的温度和时间条件是关键的。如果温度太低或时间太短，那么半纤维素和木质素的水解释放将是不充足的。意外地，发现过度水解对于可用物质的回收是不利的。如果温度太高或时间太长，那么可能会发生纤维素和半纤维素向单糖的不希望的水解，并且将形成干扰后续半纤维素和木质素沈淀的其他反应产物，当反应温度和/或时间过度时，导致形成一种胶质沉淀物。温度应该在120℃-280℃范围内，并且时间应该在5-40分钟范围内。在一个具有70%乙酸的实验室实施例中，将温度在10分钟内升高到165℃，随后经3分钟快速降低到150℃的一个温度，此后经一个30分钟时间段逐渐冷却到100℃。在一个工厂实施例中，使用165℃的一个温度持续一个1-10分钟的时间段。 [0034] 第一水解步骤200/205形成该包含一种富集有半纤维素和木质素的可溶第一水解产物207和一种不溶性木质纤维素残余物部分的第一水解混合物206。在步骤210，将这些物质通过一种适合技术（如过滤或离心）分离。将固体物质以一种第一木质纤维素滤饼208形式回收，该第一木质纤维素滤饼至少部分地耗乏半纤维素和木质素并且含有至少部分酰化的纤维素（例如对于乙酸和甲酸来说，对应地是乙酰纤维素酯或甲酰纤维素酯）。在步骤215，将该第一回收的木质纤维素滤饼208用该C1-C2酸充分洗涤，以进一步释放结合的半纤维素和木质素。优选地，将用于该洗涤的该C1-C2酸升温到约40℃-50℃的一个温度。任选地但未必，该第一木质纤维素滤饼208的该酸洗涤可以包括使用与前文提及的在步骤200/205的第一回合中所用相同的酸和热条件的一个第二回合的热处理。该酸洗涤 215是否应该在高温下进行取决于该木质纤维素生物质10中的半纤维素和木质素含量和结构。当该木质纤维素生物质10如在木质来源的情况下具有一个高木质素或半纤维素含量时，那么一个第二回合的加热220是优选的。该C1-C2酸的浓度优选地在此洗涤步骤215比在水解步骤200更高，这是由于由水解释放的水和由来自用在步骤200所用的该C1-C2酸的初始处理的该木质纤维素滤饼208释放的水的稀释。在玉米秆作为该木质纤维素生物质 10的情况下，在该酸洗涤步骤215中使用90%乙酸。该酸洗涤产生一种酸洗涤混合物209，在步骤225通过离心或过滤将该酸洗涤混合物回收，得到一种与该经过酸洗涤的木质纤维素滤饼214分离开的包含另外的半纤维素和木质素的液体酸洗涤部分212，该经过酸洗涤的木质纤维素滤饼已经耗乏大部分半纤维素和木质素并且包含另外的酰化的纤维素。 [0035] 在一种优选方法中，在步骤230，将该第一水解产物部分207与该酸洗涤部分212混合，以形成合并的乙酸可溶物溶液219。然后在步骤250，优选地将此合并的乙酸可溶物溶液219蒸发，以达到一个至少30%wt/vol的溶解固体含量，形成一种浓缩的可溶水解产物221。 [0036] 分别地，在步骤240，将该第二木质纤维素滤饼214用乙酸乙酯或其他C1-C2酸可混溶的有机溶剂洗涤，以将该C1-C2酸和剩余半纤维素和木质素从该第二木质纤维素滤饼214移除。用于洗涤240该第二木质纤维素滤饼214的该C1-C2可混溶的有机溶剂的总量优选地是约与该第二水解步骤220中所用的C1-C2酸215的第二量相同的量。该洗涤可以用总体积分批地进行，或优选地总体积以不连续增量应用以将该C1-C2酸的移除最大化并且保留半纤维素和木质素。用于该洗涤的乙酸可混溶的有机溶剂的量应该足以将该乙酸由乙酰化纤维素纸浆充分洗涤。一种至少3体积（升）乙酸可混溶的有机溶剂/重量（千克）纸浆的总洗涤是适合的。该总洗涤优选地在三个或更多个不连续的相继阶段中递送以便递送整个洗涤量。 [0037] 该洗涤产生一种液体有机溶剂/C1-C2酸洗涤部分216，在步骤245通过过滤将该洗涤部分与该第二木质纤维素滤饼214分离。在步骤245所用的该过滤介质应该具有孔隙，足够大以允许不溶性半纤维素和木质素与该有机洗液通过；又足够小以将较高分子量纤维素纤维的固体块保留在该经过酸洗涤的滤饼214中，该经过酸洗涤的滤饼在过滤之后以经过有机溶剂洗涤的酰基纤维素纸浆218形式保留。一种用于此过滤步骤245的适合过滤介质是孔径对应于一个60目筛网（250微米的标称筛直径）的过滤介质；或常规滤纸。 [0038] 在步骤255，将该有机溶剂/C1-C2酸洗涤部分216与该浓缩的水解产物221大致等体积地合并，形成一种C1-C2酸/有机溶剂混合物257，将该混合物搅拌一段充足时间，以将所获得的任何不溶性半纤维素和木质素溶解于该有机溶剂洗液216中。然后在步骤265，将该C1-C2酸/有机溶剂混合物257蒸发，达到一个40%wt/vol的溶解固体含量，以形成一种浓缩的半纤维素和木质素糖浆268。将一个第二量的该C1-C2可混溶的有机溶剂添加到该浓缩的半纤维素和木质素糖浆268中，该量足以使该半纤维素和木质素沉淀。在一个40%的溶解固体含量下在一种乙酸和乙酸乙酯混合物作为用于该糖浆268的溶剂系统的情况下，1份糖浆268比3到4份乙酸乙酯的一个比率足以产生一种可过滤沉淀物。在步骤275，将此半纤维素和木质素沉淀物277与该糖浆滤液278分离。任选地，可以将该半纤维素和木质素沉淀物277用另外量的该C1-C2酸可混溶的有机溶剂洗涤，以移除残余C1-C2酸。 [0039] 据发现，该半纤维素和木质素沉淀物277在不经过进一步处理时可能具有呈乙酸盐（X-乙酸盐）形式的残余乙酸酯。如果希望减小所回收的半纤维素和木质素沉淀物277的乙酸酯含量，那么可以在沉淀之前，将该浓缩的半纤维素和木质素糖浆268用一种无机酸（如硫酸）滴定，以将pH调节到低于乙酸的pKa：优选地达到约3.8的一个pH。此将乙酸盐的X与无机酸的共轭碱交换，形成乙酸，当用乙酸乙酯使半纤维素和木质素沉淀时，乙酸与共轭盐和碱（例如X-硫酸盐）一起保持在溶液中。 [0040] 然后在步骤280，将该半纤维素和木质素沉淀物与温水混合以使该半纤维素溶解，形成一种可溶半纤维素水性部分289和一种不溶性木质素部分287，在步骤285通过过滤或离心将这些部分分离。任选地，可以将该不溶性木质素部分287用一个第二回合的温水洗涤，以将更多半纤维素由该沉淀物提取。出人意料地，据发现，用于使该半纤维素溶解和将该木质素由该沉淀物分离的水的温度和冷却是至关重要的。用水将该半纤维素和木质素沉淀物加热到95℃、然后冷却到60℃使得该木质素聚结成较大颗粒，这些较大颗粒对于过滤和洗液来说要容易得多。相比之下，加热到120℃事实上使该木质素形成一种固体块，该固体块给半纤维素的处理和回收造成问题。 [0041] 在图2中描绘的总体实施例中，将该C1-C2酸（乙酸）和该C1-C2酸可混溶的有机溶剂（乙酸乙酯）由该方法回收并且再循环用于持续使用。因此，举例来说，在步骤290，将所回收的乙酸乙酯滤液278蒸发，以回收该乙酸乙酯，留下一种暗色残余物291。在步骤295，将在步骤290通过蒸发回收的该乙酸乙酯和乙酸与该乙酸/乙酸乙酯滤液261和在步骤250由蒸发该水解产物回收的该乙酸合并。然后在步骤298，通过蒸馏将这些合并的物质分离，以将该乙酸由该乙酸乙酯回收。 [0042] 图2中描绘的该方法中所用的几乎所有该C1-C2有机酸都以流的形式使用，可以容易通过简单蒸馏将这些流与该C1-C2酸可混溶的有机溶剂而非水分离。乙酸和乙酸乙酯的组合是特别有效的。该方法中所用的这些C1-C2酸可混溶的溶剂针对其使木质素和寡糖以及一些单糖由该C1-C2酸沉淀的能力进行选择。还容易通过简单蒸馏将其与该有机酸分离。将乙酸或甲酸与水组合使用以由纤维素纸浆分离半纤维素和木质素的现有技术的方法存在产生水酸共沸物混合物的缺点，这些共沸物混合物更难以回收和再循环用于持续使用。本发明的方法主要依赖于该C1-C2酸与一种可混溶的有机溶剂的组合。 [0043] 在此所述的使用该C1-C2有机酸的方法是有利的，它们使得纸浆和糖部分能够由木质纤维素物质的优选来源制备，这些优选来源是来自单子叶植物物种、特别是谷类的茎秆和竹子的来源。这是因为单子叶植物物种具有比双子叶植物木材显著更高的二氧化硅含量，这些双子叶植物木材是常规加工中的主要纤维素纸浆来源。单子叶植物物种不用于常规制浆以获得一种纤维素纸浆，部分是因为常规制浆依赖于对木材进行亚硫酸盐处理。亚硫酸盐处理在加工流中形成一种不希望的溶解的硅酸盐残余物，该残余物必须被移除。然而，使用该C1-C2有机酸防止硅酸盐残余物溶解，因为硅酸盐基本上保持与该经过洗涤的乙酰纤维素纸浆218一起。因此，该方法提供了一种在不依赖于亚硫酸盐处理的情况下制造纤维素纸浆218的机会。 [0044] 可溶半纤维素部分的组成分析。使一种通过前述方法获得的该可溶半纤维素部分289的样品经历关于单体糖、酸可水解糖、木质素和乙酸含量以及其他元素取代基的详细化学分析（参看表21，实例1）。在呈酸可水解寡聚物和单体糖形式的全部碳水化合物中，约 19%是单体C5和C6糖，并且约81%呈可水解寡聚物（半纤维素寡聚物）形式。这些一起占该样品的总质量的约68%。木质素含量仅是质量的0.28%。少量乙酸在该方法之后得以保留，占质量的约1.2%。用以产生乙醇的发酵中所用的大多数生物体可以包容高达1%w/v乙酸，但优选在约6的pH下远低于0.5%w/v的浓度。如果希望的话，乙酸含量可以通过在步骤280溶解于水中之前用乙酸乙酯或其他乙酸可混溶的有机溶剂洗涤该半纤维素/木质素沉淀物277来减小。在此情况下，优选的是使用一种极性较小的乙酸可混溶的溶剂，如甲基乙基酮、丙醇等，以避免由该可溶半纤维素部分289移除单体糖。 [0045] 根据前文的一个示例性惯例，质量分布如下：由1.5kg固体含量是92%的切短的玉米秆（1380g起始固体物质），在该经过乙酸乙酯洗涤的纸浆218中回收约810克，其中约80%呈纤维素形式并且它还包含约10%戊糖。该浓缩的包含乙酸乙酯的糖浆268是约50%溶解固体，并且包含约10%糖和60%木质素。由其，在该半纤维素木质素沉淀物部分277中回收约525g该起始固体物质，其中约45%呈半纤维素289形式并且剩余物呈木质素287形式。 [0046] 纤维素纸浆的组成分析通过ANKOMTM纤维分析方法（沃格尔（Vogel）等人，1999）和由国家可再生能源实验室（NREL）规定的标准方法木质纤维素原料的组成分析（Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks）（斯勒伊特（Sluiter）等人， 2010）分析该纤维素纸浆218的纤维素和木质素含量。由如上文所述加工玉米秆生物质10TM 秆获得的该纤维素纸浆218的若干湿润和干燥部分的分析提供在表1和2中。通过ANKOM方法进行的分析（表1）表明，纤维素代表总干物质的85.5%到88.4%，半纤维素以0.7%-3.5%的范围存在，并且木质素以1.0%-2.3%的范围存在。在用一种乙酸和硫酸组合处理的样品中，在增加的硫酸下获得一个更高浓度的纤维素，而半纤维素减少，与半纤维素的更大水解一致。比较起来，用NREL方法分析的样品（表2）指示一个在62.2%-77.3%范围内的更低纤维素浓度的存在，而通过此方法半纤维素和木质素更高（3.2%-15.8%和1.0%-5.8%）。当用一种乙酸和硫酸组合处理样品时，还观测到纤维素含量增加与平行半纤维素减少。虽然TM 当与NREL方法相比时，通过ANKOM 方法进行的分析指示纸浆有一定变化性并且总体纤维素组成的含量更低，但物质平衡测量指示通过两种方法大部分固体有一致组成（范围是 94.1%-108.8%，平均值是99.1%）。 表1 TM 通过ANKOM 纤维分析方法对纤维素纸浆218进行的组成分析 表2 通过NREL方法对纤维素纸浆218进行的组成分析 [0047] 进一步检查该纤维素纸浆218，以针对其中存在的纤维素纤维作为一种用于由典型纸张制浆操作（依赖于对木质纤维素木材进行亚硫酸盐处理）制造的纤维素纤维的替代物或补充物的效用对其进行表征。一种酰化纤维素纸浆218由玉米秆、小麦秸以及两种类型的竹子（毛竹和淡竹（Moso,and Henon））制成。下表2B概述了所获得的纸浆纤维的相关特征中的一些。表2B 乙酰化纤维素纸浆的纤维特征 (X.X)=均质纸浆的细粒 以上数据表明，根据在此提供的方法由单子叶植物物种制成的乙酰化纤维素纸浆纤维适合作为由常规木材制浆制成的纤维的替代物和/或改善物。 [0048] 处理可溶半纤维素289或纤维素纸浆218以制造一种富集C6或C5的糖浆。该纤维素纸浆218主要是纤维素（以重量计62.2%到88.4%，取决于分析方法和所分析的样品），它当通过一种适合纤维素分解酶混合物消化时将产生一种富集有C6糖（主要是葡萄糖）的糖浆。该富集溶解的半纤维素的部分289是一种几乎不含木质素的半纤维素流，并且由一种木糖单体和寡聚物混合物与痕量的阿拉伯糖、葡萄糖以及其他己糖组成。当由一种适合半纤维素分解酶混合物充分消化时，该富集可溶半纤维素的部分289将产生一种主要富集有C5糖的糖浆。术语“纤维素分解酶”和“半纤维素分解酶”以及其混合物意指一种或多种（例如“若干”）对应地使一种包含纤维素或半纤维素的物质水解的酶。此类酶的实例提供在名称为纤维素分解酶组合物和其用途的共同未决的美国临时申请号61/538,211中。然而，本发明的申请人发现，可用于使纤维素和半纤维素消化的常规纤维素分解和半纤维素分解酶混合物在通过对玉米秆（作为木质纤维素生物质）进行乙酸处理制备的纤维素纸浆和可溶半纤维素部分的情况下并不有效地操作。初始结果显示，溶解的C5糖浆和C6纸浆的酶促水解即使在高酶负载下也缓慢地进行，并且所释放的单糖的量少于预测。 [0049] 初始半纤维素289水解。对该可溶半纤维素部分289进行酶水解，以将可溶半纤维素寡聚物转化为单体以供发酵。通过苯酚-硫酸方法对此部分进行的总碳水化合物分析指示65%w/w干质量基的一个总碳水化合物浓度。初始酶水解使用以一个4:1比率共混的以商品名称CellicCTec（一种或多种纤维素酶）和Viscozyme L（一种或多种果胶酶）获自诺维信A/S（Novozymes A/S）（丹麦巴格斯瓦德（Bagsvaard,Denmark））的商业酶的混合物，在2%w/w干基可溶半纤维素289固体的一个酶用量率下使用，这些固体用50mM柠檬酸°盐缓冲液（pH5.0）稀释到10%wt/vol。将样品在50 C下孵育五天。结果提供在下表3中。 这些结果指示在酶水解之后总碳水化合物的单体的82.7%的一个产率。仅约80%的总碳水化合物呈酸可水解半纤维素寡聚物形式，因此被转化为单体糖的半纤维素寡聚物的百分比仅是约65%。 表3 来自玉米秆的半纤维素的酶水解的结果 C5部分 右旋糖 木糖 阿拉伯糖 %，db %，db %，db 经过酶水解的 13 37.4 3.4 对照物 6.3 18.2 3.5 [0050] 初始纤维素纸浆218水解还对如上文所述制备的该纤维素纸浆218进行酶促水解。将两种来自诺维信的商业酶（Cellic CTec2（一种或多种纤维素酶）、Cellic HTec2（一种或多种木聚糖酶））的一种混合物用于该纤维素纸浆部分的酶水解。还测试其他商业和非商业酶共混物。通过ANKOMTM纤维分析方法分析的该纤维素纸浆218对于六个纤维素纸浆218样品来说，w/w干基纤维素、半纤维素以及木质素对应地平均是86.7%、1.8%以及1.7%。 在低固体（10%）和高固体负载（20%）下进行实验室规模酶水解。低固体酶水解产生该纤维素纸浆218向葡萄糖和木糖的87.8%转化，而具有20%干燥固体负载的高固体酶水解实验得到向葡萄糖和木糖的超过82.6%转化（表4）。两个实验中的酶水解都在50℃下进行五天。 用于低固体酶水解的酶用量是12mg酶蛋白质/g纸浆干燥固体。对于高固体酶水解来说，用量是33mg酶蛋白质/g纸浆干燥固体。 表4 由玉米秆获得的纤维素纸浆218在10%-20%干燥固体下的酶水解 [0051] 前述结果显示，该可溶半纤维素部分289和该纤维素纸浆部分218向单体糖的转化少于使后续发酵经济实用所需的转化。这些物质通过使生物质在高浓度的乙酸（>70%）存在下暴露于热量来制造。据推测，游离和结合糖中的一些可能已经变得被乙酰基取代，并且此乙酰化可能至少部分地抑制酶促活性。为测试此，将该纤维素纸浆218的样品用一种碱处理，以催化乙酸酯基团的去酯化。结果通过傅里叶变换红外光谱法（FTIR）来评估。图3展示了玉米秆纤维素纸浆（顶部迹线）和经过氢氧化铵处理的玉米秆纸浆（下部迹线）的 1 -1 FTIR光谱的差异。图4示出了在1150cm- 与2000cm 之间的FTIR光谱，其中三个重要酯键-1 -1 由以下各项表示：在1725cm 下的C=O酯拉伸；在1366cm 下的-O(C=O)-CH3基团中的C-H-1 -1 拉伸；以及在1242cm 下的乙酰基的-CO-拉伸。一个代表着一个羧基的吸收的在1700cm下的峰的不存在证实了，经过碱处理的样品不含酯化乙酸。 [0052] 此结果表明，根据图2对木质纤维素生物质10进行乙酸水解产生一种乙酰化的纤维素纸浆218。更一般来说，由一种C1-C2酸处理一种木质纤维素生物质10产生一个显著部分的该纤维素纸浆218以及该可溶半纤维素部分289，通过该C1-C2酸水解210和洗涤步骤220酰化（即碳水化合物部分将包含甲酰酯或乙酰酯）。因此，通过酶消化产生用于发酵的适合原料C5和C6糖糖浆需要在用适当酶混合物使纤维素聚合物或半纤维素寡聚物消化之前或结合该消化使这些酯脱酰化。 [0053] 当该C1-C2酸是甲酸时制造的甲酰化碳水化合物酯是热不稳定的。因此，可以通过将该物质在一种水溶液中在50℃到95℃的一个温度下孵育0.5到4小时来使一种甲酰化纤维素纸浆218或可溶半纤维素部分289去甲酰化，该条件如例如科伯利（Chempolis）美国专利号6,252,109所述足以使碳水化合物去甲酰化。然而，乙酰化碳水化合物比甲酰化酯更稳定。乙酰酯可以通过用一种碱（alkali）（碱（base））处理来去乙酰化。适合的碱包括氨（氢氧化铵）和苛性碱（氢氧化钠）。因此，在酶促消化之前，将纤维素纸浆218和可溶半纤维素部分通过与碱性碱接触来处理。将经过乙酸处理的玉米秆纸浆样品制剂218用水稀释，以形成一种8%固体混合物。添加NaOH以将pH调节到13。将混合物加热到沸腾，并且保持沸腾10分钟。在反应混合物达到室温之后，将磷酸用于将pH值调节到5.0。将一种对照纤维素纸浆218类似地同时并且在相同固体含量下在无氢氧化钠处理或pH调节的情况下加热。将经过碱处理的样品调节为一种5%溶解固体混合物，并且针对乙酸进行分析，结果示出在表5中。表5 纤维素纸浆218通过碱的去乙酰化 乙酸（mg/g） 经过NaOH处理的 1.68 对照物 0.75 [0054] 结果表明，与未经处理的对照物相比，碱性处理释放更多乙酸。由加热碱性处理释放的乙酸提供了另外的证实，乙酰基通过在乙酸处理步骤期间形成的酯键共价键联到碳水化合物纸浆纤维分子。通过在此所述的方法制造的不同纤维素纸浆218部分的酯化程度在从0.05到0.2取代程度（即5%-20%的糖残基被乙酰化）的范围内，这对应于纤维素纸浆部分的质量的1.4%到6.6%w/w乙酰基含量。 [0055] 为了证实去酯化是否将提高酶可消化性，使以上制备的经过处理的纤维素纸浆218样品在5%固体含量下在柠檬酸盐缓冲液和一种来自诺维信的商业纤维素酶共混物（Cellic Ctec）下经历酶水解。将酶处理在一个轮转热烤孵育箱（rotisserie incubator）（Daigger FinePCR Combi D24）中在50℃下进行96小时。通过HPLC将经过酶处理的样品针对糖进行分析。表6提供了分析结果的一个概述。 表6 碱处理对葡萄糖由玉米秆纤维素纸浆218的酶促释放的影响 含量mg/g 葡萄糖 木糖 经过NaOH处理的 12.8 4.0 对照物 6.1 3.0 [0056] 结果表明，对碱性去酯化的纤维素纸浆218进行酶处理产生葡萄糖和木糖的一个实质上更高释放。结果进一步支持以下发现：在使用不同纤维素分解和半纤维素分解酶混合物的以上提及的酶促消化中，乙酸酯阻碍酶达到纤维素。推测起来通过移除乙酸酯，酶可以更佳地达到并且结合底物，并且因此，使更多纤维素纸浆218和半纤维素289纤维聚合物水解，导致更多葡萄糖和其他单体糖释放。结果还指示，在一个高压釜中在121℃下在氨的浓度是0.1%到1%的情况下加热10到30分钟；或在50℃的较低温度下在氨是0.5到5%的情况下加热1到10小时足以使大多数乙酰基由纸浆释放。 [0057] 清洁剂进一步发现，非离子清洁剂可以实质上增加半纤维素分解和纤维素分解酶制剂的活性。将纤维素纸浆样品218用碱性NaOH处理，随后用一种商业酶纤维素酶共混物处理。测试许多清洁剂化学品以测定其对于纸浆的酶水解的功能，这些清洁剂化学品包括Tween-20（聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯）、Tween-40（聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕榈酸酯）、Tween-60（聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯）以及triton X-100（4-辛基酚聚乙氧基化物）。酶反应包含5%纸浆固体wt/wt的一种50mM柠檬酸盐缓冲液、商业纤维素酶共混物Cellic Ctec II，具有或不具有清洁剂（例如0.2%w/w含量的Tween-40）。在6天之后，将所得混合物通过HPLC针对葡萄糖进行分析。表7 Tween40对葡萄糖由纤维素纸浆218的释放的影响 添加剂 葡萄糖（mg/ml） Tween-40补充 38 无添加的对照物 20 [0058] 在另一个测试中，将来自经过乙酸处理的玉米秆的如在此所述制备但不通过碱处理来去乙酰化的纤维素纸浆218干燥，并且在高和低酶用量下、具有或不具有Tween40下用诺维信的纤维素酶共混物Cellic CTec2、诺维信果胶酶Viscozyme L或木聚糖酶Htec2半纤维素酶共混物进行处理。表8中提供的结果表明，Viscozyme一贯比HTec2释放更多糖，并且重要的是，当该纤维素纸浆218不被去乙酰化时，在处理步骤中包括Tween40导致糖事件的一个更高释放。结果还表明，高酶用量可以至少部分地克服在预处理期间因纤维素纸浆的乙酰化而对纤维素酶的抑制。此进一步表明，所测试的纤维素酶共混物具有一个低水平的存在的酯酶活性，并且在共混物中包括更多酯酶活性可以适用于减少纤维素酶负载。表8 纤维素酶/Tween40提高葡萄糖由纤维素纸浆的释放 [0059] 表7和8中概述的结果表明，与经过对照物处理、不添加Tween40的情况下的样品相比，添加清洁剂到多种纤维素分解和半纤维素分解酶反应中导致葡萄糖有一个实质上更大释放。也可以适用于增强纤维素分解和半纤维素分解酶制剂的酶促活性的其他非离子清洁剂包括但不限于Tween-20、Tween-60、Tween-80以及Triton X-100。待使用的清洁剂的量应该在反应混合物的0.01%与5%v/wt范围内。 [0060] 在另一个测试中，将在乙酸乙酯洗涤之后获得的该乙酰化纤维素纸浆218在过滤以移除任何游离乙酸之后，用水充分洗涤。向经过洗涤的样品中添加NH4OH，达到0.5%（v/w）的一个最终浓度。在121℃下处理样品30分钟，以使样品去乙酰化。添加磷酸、缓冲液以及商业酶（以DS的3%投加）以及Tween-40（以0.5%w/v添加）到经过碱处理的样品中，以制造一种15%固体反应混合物。将样品放置在一个50℃孵育箱中，并且在20rpm下旋转。在2天的孵育之后，纤维素纸浆215开始液化。在第三天，测量葡萄糖含量。随后每天移出另外的样品，以针对葡萄糖进行检查。通过酶反应释放的葡萄糖图示在图5中。在50℃下孵育7天之后，释放据估计存在于纤维素纸浆218中的大多数葡萄糖。在9天之后，水解产物的组成是（以w/w溶解物质计）葡萄糖12.56%（84%DM）、木糖1.73%（11.5%DM）、灰分2.0%（13.3%DM）以及乙酸0.56%（3.7%DM）。 [0061] 在30℃下在以150rpm旋转的被塞住的振荡器烧瓶中通过不同酵母菌株使经过9天酶处理的水解产物的等分试样发酵。以2.5亿个细胞/毫升的一个接种率接种培养物。在发酵期间24小时和48小时获得样品。将这些样品针对糖、有机酸以及乙醇进行分析。结果表明，被工程化以将木糖用于发酵的所测试酵母菌株之一（即酿酒酵母424a，获自普渡研究基金会（Purdue Research Foundation），拉斐特（Lafayette），印第安纳州（IN））在24小时内产生5.6%乙醇（v/v）并且在48小时内使用50%木糖。 [0062] 结合补充酯酶尽管如上文所述，酰化纤维素纸浆218和半纤维素部分289的碱催化的去酯化提高了酶可消化性，但它需要额外物质并且产生一种碱性反应混合物，该碱性反应混合物必须在纤维素纸浆218和可溶半纤维素289部分的酶促消化之前经过pH调节。然而，出人意料地发现，这些部分也可以通过用一种酯酶共同处理来有效地去乙酰化。此发现部分基于对当用一种来自诺维信的商业半纤维素酶和纤维素酶混合物（Cellic CTec2和HTec2）处理一种纤维素纸浆218时所释放的乙酸的分析。此类酶制剂不被高度纯化以获得一种具有一种具体类型的酶促活性的蛋白质，而实际上是具有不同的部分纯化的酶活性的混合物，这些混合物包含在制备方法中共同纯化的其他酶的残余活性。在高酶负载下，观测到该纤维素纸浆218的一定去乙酰化与酶共混物中存在的低水平的酯酶类型活性一致。此形成了力图通过添加另外的酯酶活性制剂到纤维素分解和半纤维素分解酶制剂混合物中来结合更多酯酶活性的基础。 [0063] 一种用于制造由对如在此所述制造的纤维素纸浆和半纤维素部分进行C1-C2酸处理制成的C6和C5糖浆的适合酯酶应该呈现至少一种催化乙酰基由以下中的至少一者水解的活性：一种聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酰化纤维素以及乙酰化阿拉伯糖。名称为纤维素分解酶组合物和其用途的共同未决的美国专利申请号61/538,211描述了此种酯酶的至少一个实例，表示为乙酰木聚糖酯酶（AXE），它可以用于实现如在此所述制造的纤维素纸浆218和可溶半纤维素部分289的得到提高的消化以提供提高的C6和C5糖浆。 AXE是一种催化乙酰基由聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯以及乙酸对硝基苯酯水解的羧酸酯酶（EC.3.1.1.72）。其活性通过使乙酸对硝基苯酯在pH5.0下乙酸盐缓冲液中去乙酰化（提供了比色产物对硝基苯酚盐）来测量。将一个单位的AXE定义为在25℃下每分钟释放1微摩尔的对硝基苯酚盐的酶的量。名称为纤维素分解酶组合物和其用途的共同未决的美国专利申请号61/538,211提供了另外的数据，展现结合此种酯酶活性用于使在此所述的纸浆218和可溶半纤维素部分289消化提高了该物质向C6和C5糖浆的转化。 [0064] 一种适合酯酶的又另一个实例以一种由阿拉卢夫O（Alalouf O），巴拉日Y（Balazs Y），沃尔肯施泰因M（Volkinshtein M），格瑞姆派尔Y（Grimpel Y），肖哈姆G（Shoham G）以及肖哈姆Y（Shoham Y）.（《生物化学杂志》（J Biol Chem）.2011,286(49):41993-2000）所述的来自嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）的GDSL水解酶/乙酰木聚糖酯酶为代表，该酯酶被分类为CE17家族的一种碳水化合物酯酶（CE）。 [0065] 再其他适合实例包括被分组到CE1-7家族中的多种碳水化合物酯酶，如由皮特别雷（Peter Biely）在使植物多糖去乙酰化的微生物碳水化合物酯酶（Microbial Carbohydrate Esterases Deacetylating Plant polysaccharides），《生物技术进展》（Biotechnology Advances），2012在线出版中所概述，该文献通过引用结合在此。这些实例包括乙酰木聚糖酯酶（AcXE）、乙酰酯酶（AcE）、甲壳素去乙酰酶、肽聚糖去乙酰酶、阿魏酸酯酶、果胶乙酰酯酶、果胶甲基酯酶、葡糖醛酸酯酶以及催化低分子质量氨基糖衍生物的N-去乙酰化的酶。CE1家族是具有活性位点氨基酸的SHD三合结构的丝氨酸酯酶，它们还对于乙酰半乳葡甘露聚糖和乙酰化碳水化合物（包括己糖苷）以及对于乙酸纤维素是AcXE活性的。CE2家族是具有活性位点氨基酸的SH二合结构的丝氨酸酯酶，它们是多糖和寡糖的己吡喃糖基残基的6-O-去乙酰酶；对于乙酰木聚糖和木糖苷具有低的比活性；但催化专有地向己糖和己糖基残基的6位的转酯化。CE3家族是具有活性位点氨基酸的SHD三合结构的丝氨酸酯酶，它们是具有宽底物特异性的AcE，并且形成和通常是双官能酶的一种组分。CE4家族是在活性位点具有天冬氨酸的金属酶，它们是特异性AcXE，对于乙酰半乳葡甘露聚糖和乙酰化甘露化合物不具有活性，但对于甲壳素上和在肽聚糖N-去乙酰化方面是活性的。CE5家族是具有活性位点氨基酸的SHD三合结构的丝氨酸酯酶，它们是AcXE，使乙酰木聚糖和木寡糖以及糖苷中的木吡喃糖基残基的2位去乙酰化；并且使甘露糖苷和乙酸纤维素去乙酰化。CE5家族是具有活性位点氨基酸的SHD三合结构的丝氨酸酯酶，它们是AcXE，使乙酰木聚糖去乙酰化，但具有较宽底物特异性。CE7家族是具有活性位点氨基酸的SHD三合结构的丝氨酸酯酶，它们在使被输送到细胞中的寡糖去乙酰化方面是活性的，并且也被称为头孢菌素C去乙酰酶。CE16家族的活性位点氨基酸并不已知，但这些酶是胞外作用的木寡糖去乙酰酶，它们仅使非还原末端糖残基去乙酰化，对于聚合底物呈现为非活性，并且催化向糖苷和非还原糖的3位的转酯化。 [0066] 来自这些家族的适合乙酰酯酶的一些更具体但非限制性实例（以其缩写酶名称和CE家族形式）包括：裂褶菌（Schizophyllum commune）ScCE1（AcXE）；产紫青霉（Penicillium purpurogenum）PpCE1（AcXEI）；产紫青霉PpCE5（AcXEII）；日本纤维弧菌（Celvibrio japonicus）CjCE2（AcF）；变铅青链霉菌（Streptomyces lividans）SlCE4（AcXE）；热纤维梭菌（Clostridium thermocellum）CtCE4（AcXE）；里氏木霉（Trichoderma reesei）TrCE5（AcXEI）；根囊鞭菌种（Orpinomyces sp）OxCE6（AcXE）；海栖热孢菌（Thermotoga maritime）TmCE7（AcE）；以及短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）BpCE7（AcE）。 [0067] 发酵将根据在此所述的方法制造的可溶半纤维素289以及耗乏半纤维素和木质素的纤维素纸浆218物质制剂用于制造适合作为用于被用以通过发酵制造多种产物的微生物的原料的C5和C6糖。多种用于利用此类物质的方案是可能的，取决于所用的生物体和被制造的发酵产物。大多数微生物可以利用通过使这些物质消化制造的C5和C6糖（作为用于细胞生长（生物质积聚）的一种碳源）的模板（palette）。然而，生物质积聚仅是一种与最终发酵产物的产生的经济情况相关的因素。举例来说，虽然多种酵母可以在好氧生长条件下将C5糖用于生物质积聚，但大多数酵母通过在此类条件下发酵并不产生乙醇。相反地，在酵母由葡萄糖和其他C6糖产生乙醇的厌氧条件下，酵母属酵母不具有将C5糖D-木糖和L-阿拉伯糖转移到乙醇产生中所必需的代谢路径，除非它们已经用外源酶活性基因工程化以将C5糖转移到糖分解路径中。相比之下，细菌运动发酵单胞菌的经过基因工程化的菌株具有通过在厌氧条件下对C5或C6糖发酵来产生乙醇的能力。再发酵单孢菌属（Zymomonas），如酵母和大多数其他微生物显示出在摄取其他C6或C5糖之前优选首先摄取葡萄糖。 [0068] 关于由通过在此提供的方法制造的半纤维素289和纤维素纸浆218产生的C5和C6糖的消化和发酵的若干变化是可能的。在一个实施例中，首先将半纤维素289和纤维素纸浆218用酶分别地消化，以形成分别的C5和C6糖。随后，将这些原料馈入到微生物中，以产生发酵产物。当将酶促消化与后续发酵分别地进行以形成一种糖浆时，此被称为分别水解和发酵，缩写是SHF。 [0069] 在一种SHF方法中，在至多70℃的温度和4.0-6.0的pH下在连续混合下将通过本发明的方法制造的半纤维素部分289用包含纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、酯酶以及任选地蛋白酶活性的适当酶混合物消化，以产生一种富集C5糖的糖浆。在该优选实施例中，半纤维素部分289的酶消化在50℃-65℃下在5.0的一个pH下进行1到7天。为了产生最大量的糖，酶消化反应混合物还包含一种如上文论述的非离子清洁剂，如Tween40。使用该清洁剂使得纤维素纸浆218或可溶半纤维素部分的固体含量在10%-25%w/w的范围内。然后将由消化产生的C5糖的糖浆直接用作发酵介质中的一种原料以积聚生物质，或积聚生物质并且产生所希望的发酵产物。 [0070] 类似地，可以使如在此所述制造的纤维素纸浆218在悬浮于一种水性缓冲溶液（在4.5-5.5的pH下在10%-25%干燥固体下）中之后，在50℃的一个温度下使用包括一种酯酶的酶的一种纤维素酶共混物经历酶消化5天，以产生一种包含富集C6糖的糖浆的发酵原料。同样，在消化混合物中包括一种非离子清洁剂，如Tween40，该非离子清洁剂允许使用10%-25%纤维素纸浆的高固体含量以使C6糖的产生最大化。 [0071] 如果所希望的发酵产物是乙醇并且发酵微生物是酿酒酵母的一种基因工程化的菌株，那么使酵母在厌氧条件下单独在C5糖的糖浆上生长持续足以在一个第一阶段中积聚生物质和第一部分的乙醇的一段时间。在一个第二阶段中，将发酵液用一种C6糖来源、优选地是葡萄糖或蔗糖或其混合物补充，并且使发酵在厌氧条件下继续持续足以积聚一个第二部分的乙醇的一段时间。C6糖来源可以包括由如在此所述的纤维素纸浆218制备的C6糖浆。 [0072] 使用由在高酶、上表4中所述的高固体（20%）下使纤维素纸浆218消化获得的C6糖浆进行一种使乙醇发酵的SHF方法。测试多种商业和非商业菌株，包括酿酒酵母的能够使C5糖发酵以制造乙醇的木糖工程化的重组菌株。所测试的菌株包括一种内部酿酒酵母产生菌株Y500（阿彻丹尼尔斯米德兰公司（Archer Daniels Midland Company），迪凯特（Decatur），伊利诺伊州（IL））；一种衍生自Y-500的能够进行D-木糖发酵的内部工程化的菌株，指定为134-12；一种由乐斯福集团发酵分部（Fermentis division of the LeSaffre Group）（密尔沃基（Milwaukee），威斯康星州（WI））获得的商业菌株，指定为ER2；以及一种被工程化用于木糖发酵的酿酒酵母GMO菌株，来自普渡大学（Purdue University）的南希郝（Nancy Ho）（普渡研究基金会，西拉斐特（West Lafayette），印第安纳州），指定为424a。在初始实验室规模实验中，运行分别的糖化和发酵试验，以测定使用木糖工程化的重组菌株424a的发酵能力，这描述于赛德拉克（Sedlak）等人《酶与微生物技术》（Enz.Microbial Technol.）33,19-28（2003）中。表9示出了在48小时时间段内使用来自去乙酰化玉米秆纸浆的C6和C5糖浆的葡萄糖（右旋糖）和木糖的消耗和8.5%v/v产率乙醇的同时产生。 表9 乙醇由来自经过乙酸处理的纤维素纸浆218的C6糖浆的产生 时间 右旋糖 木糖 乳酸 甘油 乙酸 乙醇 小时 g/L g/L g/L g/L g/L %，v/v 0 146.9 25.9 0 12 1.0 0 24 0.5 11.3 0 13.5 1.2 6.3 42 0 9.4 0 17.8 2.6 8.5 在前24小时中几乎所有右旋糖和56%的木糖被消耗。 [0073] 使用由使玉米秆纤维素纸浆218消化获得的C6糖浆进行用以使乙醇发酵的SHF方法的另外的研究，以产生一种乙醇溶液，该乙醇溶液对于通过蒸馏回收来说将是经济的。经济蒸馏通常达到有至少6.5%乙醇，这表明达到此浓度所需的糖溶液需要是约10%。来自酶水解的糖溶液以重量计是10%进一步表明，酶水解必须在以重量计15%-20%之间的高固体负载下进行。高固体酶水解带来了若干问题，如不充分混合、传热以及高粘度。尝试若干策略以由酶水解产生一种浓缩糖溶液，这些策略包括与蒸发浓缩结合的低固体酶水解； 在低固体酶水解期间过程性添加固体；以及在表面活性剂添加下的最终高固体酶水解。初始实验由纤维素纸浆218的低固体（6%）酶水解的发酵与两倍蒸发浓缩产生2.2%v/v乙醇。 （表10）后续实验由通过9%固体纤维素纸浆218（在初始固体溶解之后，添加纤维素纸浆 218达到14%总固体）的酶水解产生的物质的发酵产生3%v/v乙醇。（表11）由从9%固体纤维素纸浆218的酶水解两倍蒸发浓缩的物质产生6%v/v浓度的乙醇。（表12）蒸发浓缩给乙醇的商业生产增加了一个昂贵步骤，因此测试纤维素纸浆218在表面活性剂添加下的高固体酶水解的替代方案。在16.5%固体纤维素纸浆218在表面活性剂添加下的高固体酶水解的振荡烧瓶发酵期间，若干酵母菌株产生6.8-7.1%v/v的乙醇。（表13）最终，将通过 20%固体纤维素纸浆218在表面活性剂添加下的高固体酶水解产生的物质在振荡烧瓶中用酵母菌株424a进行发酵，并且产生8.3%v/v乙醇。（表14）来自表10-14的数据（包括纸浆干燥固体、所产生的糖浓度和乙醇浓度）的图解概述呈现在图6中。 表10 C6糖浆6%干燥固体和2倍浓缩下的振荡烧瓶发酵 表11 C6糖浆9%干燥固体（有5%干燥固体的连续增加）的振荡烧瓶发酵 表12 C6糖浆9%干燥固体和2倍浓缩下的振荡烧瓶发酵 表13 {0>?Shake Flask Fermentation of C6Syrup16.5%Dry Solids with Several Strains of Saccharomyces cerevisiae?<}0{>C65糖浆16.5%干燥固体用若干酿酒酵母菌株的振荡烧瓶发酵<0} 表14 {0>?Shake Flask Fermentation of C6Syrup20%Dry Solids with Recombinant Saccharomyces cerevisiae strain424a?<}0{>C6糖浆20%干燥固体用重组酿酒酵母菌株 424a的振荡烧瓶发酵<0} [0074] 一种可以使用的替代方法被称为同时糖化和发酵（缩写：SSF）。在此种方法中，半纤维素部分289或纤维素纸浆部分218的酶促消化在一种还包括微生物的介质中进行。由于糖通过消化方法释放，因此它们由微生物消耗用于生物质积聚和/或发酵产物生产。任选地，还可以在该方法期间将一种分别的糖来源馈入到消化/发酵混合物中。一种SSF方法的一个益处是，所释放的糖的消耗防止对可以对糖的反馈抑制敏感的任何消化酶的反馈抑制。该SSF方法可以在4-6的pH值下在30℃-60℃下进行5到7天，取决于酶用量、所用酶共混物的组成、酶的热稳定性、所用微生物的热和抑制剂耐受性以及发酵中干燥固体的起始浓度。在40℃下在高酶用量和高固体（20%）下使用由使纤维素纸浆218消化获得的C6糖浆进行一种SSF振荡烧瓶实验。SSF振荡烧瓶实验的结果展示在表15中，其中在24小时内不使具有20%w/w干燥固体纤维素纸浆218的振荡烧瓶消化到液化的程度，并且可以不进行取样。表15 在40℃下的振荡烧瓶同时糖化和发酵 [0075] 一种SSF方法的一种变型是一种半SSF方法，其中发酵典型地分阶段但未必用不同原料进行。在一个第一阶段中，使用一种通过可溶半纤维素289和纤维素纸浆218的水解预先制备的C5或C6糖浆作为原料进行一种典型SHF。在此初始阶段中，生物质积聚，制造或不制造所希望的发酵产物。在一个第二阶段中，将包含积聚的生物质的发酵介质在水解酶存在下添加到包含半纤维素289或纤维素纸浆218的介质中，以使得所释放的糖的发酵与其由酶的水解释放同时发生。 [0076] 图7展示了一种用于两阶段半SSF方法的最佳方法。在第一阶段中，将由可溶半纤维素部分218的酶促水解获得的一个第一部分的富集C5的糖浆用于通过在一个微生物繁殖槽中好氧生长而积聚生物质。在所展示的实施例中，酵母是一种能从C5产生乙醇的生物体（C5competent ethanologen），如能够由C5糖产生乙醇的酵母菌株424a。然后将繁殖的酵母用于接种馈入有一个第二部分的富集C5的糖浆的发酵介质，并且厌氧地生长一段足够时间，以耗尽糖并且产生一个第一部分的乙醇。图7是一幅图，展示在实验室振荡烧瓶中一式两份地进行的一个示例性第一阶段期间生产乙醇和同时利用C5糖木糖的时程。 [0077] 同时，在用于第二阶段的制备中，将如在此所述的该纤维素纸浆218用一种纤维素分解酶混合物处理持续足以由该纤维素纸浆218部分释放一个第一部分的C6糖的一段时间。在第二阶段中，将由在上文所提及的富集C5的糖浆上厌氧发酵产生的酵母培养物用于接种一种包含部分消化的纤维素纸浆和第一部分的C6糖的较大介质。发酵的此第二阶段在厌氧条件下继续持续足以使该纤维素纸浆进一步水解为另外的C6糖并且产生乙醇的一段时间。此方法将产生充足浓度的乙醇（至少8%v/v）以使其对于蒸馏和回收来说是经济的。 [0078] 在一个实验室测试中在两个阶段中进行此种半SSF方法。第一阶段在一个包含50ml经过解毒的C5糖浆的不带有档板的振荡烧瓶中，使用一种通过使木糖发酵酵母424a在由来自玉米秆的半纤维素部分289的酶促消化获得的C5糖浆上发酵获得的发酵液。通过使用以下的组合将C5糖浆处理以移除在预处理期间形成的毒性降解产物，如糠醛、羟甲基糠醛（HMF）、酚醛树脂、主要由乙酸组成的有机酸以及其他有机物：溶剂提取，以移除糠醛、HMF以及酚醛树脂；使用带电树脂的离子交换层析，以移除酸；和/或蒸发，以使挥发性组分离开。将一种25%的接种物用于一种包含C5糖浆的第二介质，将该第二介质在以100rpm旋转的密封烧瓶中在30℃下在厌氧生长条件下孵育。在72小时之后，将来自此阶段的发酵液用于接种150ml的包含玉米秆纤维素纸浆218的介质，该介质用一种纤维素分解酶混合物预处理72小时。此纤维素分解混合物由第0055段中所述的酶组成。如表16中所示，在 72小时的C6糖浆/纸浆发酵之后，一式两份地获得约8.8%v/v乙醇的产生，同时利用98.5%的可用葡萄糖和约57%的可用木糖。 表16 C5糖浆和C6糖浆的振荡烧瓶半同时糖化和发酵 时间 葡萄糖 木糖 乳酸 甘油 乙酸 乙醇 g/L g/L g/L g/L g/L %，v/v 0 147.0 13.7 0.4 0.3 6.6 72 2.0 7.3 2.5 7.3 8.0 8.4 72 2.4 8.1 2.0 8.1 8.7 8.8 [0079] 以下的实例用于展示在本披露的某些方面的示例性惯例中进行的步骤的目的，并且并不打算限制或示例本发明可以由本领域的普通技术人员实施的所有方式。实例1 玉米秆的乙酸/乙酸乙酯加工 [0080] 将1.5kg具有92%固体含量（1380克）和8%水分的切短的玉米秆添加到一个夹套旋转反应器中。添加十五个2.5英寸（500g）陶瓷球和7升70%乙酸，并且将该反应器封闭。开始反应器旋转，并且将蒸汽注射到夹套中。在10分钟内，内部反应器温度达到165℃。保持该温度持续2分钟，并且然后中断蒸汽注射。将蒸汽从该夹套中缓慢释放出来以便历时 3分钟将该反应器的内部温度降低到150℃。然后使该反应器历时1/2小时的一段时间冷却到100℃。随后，添加冷却水以便使该反应器温度达到60℃，并且打开该反应器。将煮过的秆经一个布氏漏斗（Buchner funnel）过滤，并且加压。收集五升的一种乙酸水解产物滤液。将升温到50℃的温度的五升99%乙酸用于将残余木质素和半纤维素从滤饼中溶解和洗掉，并且分开地收集。添加四升乙酸乙酯以便洗涤乙酸的滤饼，并且过滤洗液以获得乙酸乙酯滤液和滤饼。将滤饼由漏斗移出，抖松，并且空气干燥，从而形成样品A（810克）。 [0081] 将该乙酸第一滤液蒸发到1.2升。将该第二乙酸滤液添加到该第一滤液中，并且再次蒸发到1.2升的最终体积。将乙酸乙酯滤液添加到该经过蒸发的水解产物混合物中，并且将此蒸发为约800ml的一种糖浆。将此温糖浆添加到2升乙酸乙酯中，以使半纤维素和木质素沉淀出来（样品B，475克）。将滤液浓缩为一种浓糖浆，并且添加到600ml乙酸乙酯中，以便使另外50克的物质沉淀（样品C）。将残余滤液蒸发成一种包含210克溶解固体的浓糖浆（样品D）。将十克样品B分散并且放入65ml热水中以便使水溶性部分溶解，然后过滤并且保留滤液（样品E）。 [0082] 将这些样品针对溶解固体、水解糖形式、金属、N、P和K以及乙酸进行分析。除非另外指明，否则下面这些表汇总了以g/Kg为单位报道的不同分析的结果。表17 样品A的溶解固体 表18 样品B-D的无机元素 样品名称 Al P S Zn Co Ni Fe Cr Mg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg B 123 4220 1970 69.1 1.25 3.74 1330 28.5 6700 C 14.8 556 1040 35.0 0.358 1.28 171 8.87 1120 D 0.289 94.0 297 4.12 nd nd 2.58 0.604 38.0 Ca Cu Na K Mn Mo B N 灰分 mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg % % 5720 13.6 43.9 44800 159 0.907 16.8 1.63 8.9% 1590 25.5 52.2 43500 24.8 0.586 6.27 1.65 9.1% 147 4.96 29.1 18600 1.12 nd 0.604 0.411 3.6% 表19 样品B-D的糖分析 表20 样品B-D的杂项分析 *HMF=羟甲基糠醛，AcMF=乙酰氧基甲基糠醛（HMF的乙酸酯） 表21 样品E中的糖、木质素、乙酸以及元素 实例2 麦秸的乙酸/乙酸乙酯加工 [0083] 将1.7kg切短的麦秸与9升70%乙酸（v/v在水中）合并，并且在一个翻滚蒸汽夹套反应器中在160℃与170℃之间加热持续5分钟。添加二十一个陶瓷球（约2英寸直径）以辅助混合。使该反应器在环境条件下冷却到60℃与90℃之间的一个温度。将反应产物在仍然是温的时过滤，并且用70%乙酸洗涤。收集占初始秸重量的56%的乙酰化纤维素纸浆（950g干重）。 [0084] 通过蒸发将液体乙酸水解产物浓缩成40%-50%干燥固体，并且添加到约四体积的冷却的乙酸乙酯中。将包含木质素和半纤维素的沉淀物通过过滤来收集，用乙酸乙酯洗涤，并且风干。将干燥的沉淀物在剧烈搅拌下添加到90℃-92℃水（约1:4w/w）中，并且使其在环境条件下在继续搅拌下冷却到室温。将固体木质素通过过滤来收集，并且用水洗涤。溶解的半纤维素包含在水性滤液部分中。实例3 竹子的乙酸/乙酸乙酯加工 [0085] 将2.0kg切短的竹子与10kg的70%乙酸（w/w在水中）合并，并且在一个翻滚蒸汽夹套反应器中加热持续10分钟以便达到160C与170C之间。再次，添加21个陶瓷球（约2英寸直径）以辅助混合。使反应器在环境条件下冷却持续30分钟直到温度达到120C，然后快速冷却到80C-90C。将反应产物在仍然是温的时过滤，并且用75%乙酸（w/w，在水中）和水洗涤。随后将保留的乙酰化纤维素纸浆用乙酸乙酯洗涤，并且干燥，并且占初始竹子重量的52%。所选参考文献： K.P. 沃 格 尔（K.P.Vogel）,J.F. 佩 德 森（J.F.Pederson）,S.D. 麦 斯 特 森（S.D.Masterson）,J.J.特洛伊（J.J.Troy）.用于NDF、ADF以及IVDMD饲料分析的过滤袋系统的评估（Evaluation of a filter bag system for NDF,ADF and IVDMD forage analysis）.《作物科学》（Crop Scie.）39,276-279(1999)。 J.B. 斯 勒 伊 特（J.B.Sluiter）,R.O. 鲁 兹（R.O.Ruiz）,C.J. 斯 卡 拉 塔（C.J.Scarlata）,A.D.斯勒伊特（A.D.Sluiter）,D.W.邓普顿（D.W.Templeton）.木质纤维素原料的组成分析1.综述与方法描述（Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks.1.Review and description of methods）.《农业与食品化学杂志》（J.Agric.Food Chem.）58,9043-9053(2010)。 M.赛德拉克（M.Sedlak）,H.J.爱登博格（H.J.Edenberg）,N.W.Y霍（N.W.Y Ho）.在由经过代谢工程改造的酵母属宿主进行的葡萄糖与木糖共同发酵期间产生乙醇的主要酶的编码基因的表现的DNA微阵列分析（DNA microarray analysis of the expression of the genes encoding the major enzymes in ethanol production during glucose and xylose co-fermentation by metabolically engineered Saccharomyces host）.《酶与微生物技术》（Enz.Microbial Technol.）33,19-28(2003)。 S.C.贝特（S.C.Bate）,W.A.罗杰森（W.A.Rogerson）,F.G.皮奇（F.G.Peach）1953.在纤维素与纤维素衍生物制造方面的改善（Improvements in the production of cellulose and cellulose derivatives）.英国专利686311。 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