방법

방법 {METHOD}

본 발명의 분야

본 발명은 약물 개발 및 암 치료 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 단백질 키나제 분야 및 더욱 특히 암을 예후 및 치료하는 방법에 관한 것이다.

Akt

Akt (단백질 키나제 B)는 증식, 운동, 성장, 글루코스 항상성, 생존 및 세포 사멸을 비롯한, 다양한 세포 과정에 관여하는 것으로 알려져 있는, 세린/트레오닌 단백질 키나제이다. Akt는 PBK/Akt 경로의 3가지 주요 성분 (포스파티딜이노시톨 3-키나제, 그의 길항제 PTEN 및 Akt) 중 하나이다. 상기 경로의 성분 중의 돌연변이는 암에서 가장 빈번하게 관찰되는 돌연변이 중에 있으며, 유방암 중 최대 70%에서 발견된다. 인간에는 3가지 Akt 패밀리 멤버, Akt1, Akt2 및 Akt3이 존재하는데, 이는 상이한 유전자로부터 전사된 것이다. Akt에 관한 연구 공개 문헌들 중 대다수는 Akt1 또는 어떤 패밀리 멤버도 명시하지 않으면서, Akt에 관련되어 있는 바, 그 결과로 패밀리 멤버들을 식별하지 못하는 범-Akt 항체가 널리 사용되고 있다. 3가지 이소폼 중 적어도 Akt3에 대해서는 알려져 있다. 실제로, 최근 리뷰 논문 ["Key signalling nodes in mammary gland development and cancer. Signalling downstream of PI3 kinase in mammary epithelium: a play in 3 Akts" (Wickenden JA and Watson CJ, Breast Cancer Research 2010, 12 , 202)]에서, Akt3은 단 3회 언급되었는데, 이는 그에 존재를 확립하는 것에 관해 1회, 정상적인 유선 발생에서 최소의 역할을 하는 것으로 보인다고 언급하는 것에 관해 1회 및 임신 및 수유 동안에는 Stat5a 인산화에 영향을 주지 않는다고 언급하는 것에 관해 1회이다.

넉 아웃 (knock-out) 마우스에서 정상적인 발생에 있어서의 Akt1, Akt2 및 Akt3의 역할이 연구된 바 있으며, 이를 통해 Akt1은 전반적인 성장에 중요하고 (넉 아웃 마우스는 일반적으로 건강하지만, 감소된 성장을 보인다), Akt2는 주로 글루코스 대사에 관여하며 (넉 아웃 마우스는 정상적으로 성장하지만, 인슐린 저항성을 보인다), Akt3은 뇌 발생에 중요한 것으로 밝혀졌다 (예컨대, 문헌 [Dummler B, Hemmings BA. Physiological roles of PKB/Akt isoforms in development and disease. Biochem Soc Trans 2007; 35 :231-5] 참조). Akt1 및 Akt2에 대한 더욱 일반적인 역할은 그의 체내 전역에 걸친 광범위한 발현에 의해 제안된 반면, Akt3은 뇌, 신장 및 심장에서 더욱 제한적으로 발현된다.

Akt는 암 요법에 대하여 관심의 대상이 되는 표적으로 간주되며, 단독의 또는 표준 암 화학요법제와 조합된 Akt 억제가 아포프토시스성 역치를 감소시키고, 우선적으로 암 세포를 사멸시키는 것으로 가정되었다 (문헌 [Lindley CW, Curr Top Med Chem, 10 , 458, 2010]). Akt 멤버를 억제시키고자 한 시도의 최근 리뷰에서는 Akt2를 암에서 가장 일반적으로 돌연변이화된 멤버인 것으로 서술하였고, Akt1 및 Akt2를 억제시키는 것이 최적이 될 것이라고 제안하였다 (문헌 [Mattmann ME et al., "Inhibition of Akt with small molecules and biologies: historical perspective and current status of the patent landscape", Expert Opinion on Therapeutic Patents, 21 , 1309, 2011]). 상기 리뷰에 포함되어 있는 다수의 화합물들은 다른 키나제에 비하여 Akt에 대해 선택성이 부족하고, 일반적으로는 Akt1에 대해 초점을 맞추고 있다. 상이한 패밀리 멤버들 간에 선택성을 가지는, 상기 리뷰에서 보고된 화합물들은 Akt3보다는 Akt1 및/또는 Akt2를 압도적으로 억제시킨다.

문헌에서는 Akt1에 대하여 압도적으로 초점이 맞춰줬음에도 불구하고, Akt3 과다발현은 흑색종 (문헌 [Cancer Res. 2004 Oct 1; 64 (19):7002-10]) 및 난소암 (문헌 [Cancer Discov. 2012 Jan 1; 2 (1):56-67])을 비롯한, 수개의 암과 연관을 가지고 있었다.

수개의 특허 공개 문헌은 Akt3의 용도에 관한 것이다.

WO2010/091354 (H 리 모팻 캔서 인스티튜트, 인크.(H Lee Moffat Cancer Institute, Inc.))는 AKT3보다는 티로신 176-인산화된 AKT1의 발현 수준을 측정하단계를 포함하는, 대상체에서 암을 진단하는 방법에 관한 것이다.

US20120040842 (베이커(Baker) 등)에는 결장직장암 예후를 측정하는 데 평가될 수 있는 방대한 유전자 어레이 중 Akt3이 열거되어 있다. 그러나, Akt3은 바람직한 마커로서 선택되지는 않았다.

US20120028264 (샤크(Shaq) 등)에는 그의 발현 수준이 대상체에서 전립선암이 재발될 가능성을 평가하는 데 측정될 수 있는, 방대한 유전자 어레이 중 Akt3 {표 3A}이 열거되어 있다. Akt3의 중요성은 구체적으로 언급되지 않았다.

US20120021983 (치클리스(Tsichlis) 등)은 대상체의 Akt 이소폼 프로파일을 정상 Akt 이소폼 프로파일과 비교하여 상기 대상체의 Akt 이소폼 프로파일을, 특히, Akt1 대 Akt2의 비를 평가함으로써 잠재암 및 현존 암의 진행을 진단 또는 예후하는 방법에 관한 것이다.

US20120003209 (더 트랜스레이션 게노믹스 리서치 인스티튜트(The Translational Genomics Research Institute))는 Akt1 및 Akt2의 발현 수준에 기초한 침습성 아교모세포종 확인에 사용되는 방법 및 키트에 관한 것이다. Akt3 mRNA 발현은 비신생물성 뇌 시험체에서는 높고, 신경아교세포 종양에서는 감소되어 있는 것으로 나타났다 [[0130]]. 추가로, Akt3 발현은 장기간 생존해 있는 환자에서 유의적으로 더 높게 나타났다.

US8133684 (에버솔드(Aebersold) 등)에는 가능한 전립선암 바이오마커에 관한 긴 목록 중 Akt3이 언급되어 있으면서, 전립선 세포에서 안드로겐 반응을 측정하는 방법이 개시되어 있다.

상피 간엽 이행 ( EMT )

상피 조직은 결합 조직, 근육 및 신경 조직과 함께, 신체의 4가지 기본 조직 유형 중 하나를 구성한다. 상피 세포는 강력한 세포간 연결에 의해 함께 결합되어 있는 분극화된 세포의 시트를 형성하는 경향을 특징으로 한다. 그 결과로 상피 세포는 자유롭게 이동할 수 없으며, 다른 세포 유형에 비하여 거의 이동하지 않는 것으로 보인다. 그에 반해, 간엽 유사 세포 (예컨대, 섬유아세포)에는 강력한 세포간 연결이 없고, 이에 개별 세포로서 이동이 가능하다. 상기 세포는 고도로 유동성일 수 있으며, 세포외 기질을 통해 이동가능하다.

상피 간엽 이행 (EMT)은 개별 상피 세포가 상피 세포의 특징이 되는 유전자 발현 패턴 및 거동은 상실하고, 대신 간엽 세포처럼 보이고, 그와 같이 작용하며, 그에 전형적인 유전자를 발현하기 시작하는 천연 세포 프로그램이다. 상기와 같이 수행함으로써, 상피 세포는 부착 및 정단-기저 극성을 상실하고, 이동하여 세포외 기질을 침습할 수 있는 능력을 획득하게 된다. EMT는 비가역적인 것은 아니다. 간엽-상피 이행 (MET)이라 불리는 거울 과정을 통해 간엽 특징을 상실하게 되고, 세포-세포 부착 및 정단-기저 극성은 재-확립된다.

EMT는 특히 배아 발생 동안에 중요하다. 이는, 단일 상피 세포층으로 구성된 배아가 3개의 고전적 배엽인, 외배엽, 중배엽 및 내배엽을 가지는 것으로 발생하는 것인 장배 형성에서 기본적인 역할을 한다. 척추동물의 발생에서 조금 후반부에, EMT를 통해 신경관 세포가 생성된다. 상기 세포는 배아 전역에 걸쳐 이동하게 되고, 말초 신경계의 신경절, 안면 및 두부의 골 및 연골, 색소 세포 및 신경아교세포를 비롯한, 다수의 다른 구조로 생성된다. MET 및 EMT의 추가 라운드는 중배엽 및 내배엽, 둘 모두로부터의 내부 기관 형성에 필수적이다.

EMT 및 질환

배아 발생 동안의 그의 중요성과는 대조적으로, EMT 프로그램은 건강한 성인에서는 좀처럼 활성화되지는 않는다. 그러나, 손상 또는 질환 이후의 염증에 대한 반응으로 유도된다: EMT는 상처 치유 및 조직 수복에서 중요한 역할을 함, 기관 퇴행성 질환 (예컨대, 신장 섬유증) 동안 발생한다.

EMT는 또한 암 전이에서도 중요한 역할을 하는 것으로 점점 더 이해되고 있다. 암종은 상피암이며, 전이 발생을 위해서는 개별 세포가 원발성 종양을 탈출하여, 일련의 이동을 거쳐야 한다. 이는 원발성 종양으로부터 국소 순환계 또는 림프계로의 이동 및 혈관구조로부터의 혈관외유출 및 전이 부위 확립을 포함한다. 현재 종양 세포와 그의 미세환경 사이의 상호작용이 종양 세포 중 일부에서 EMT를 유도할 수 있다는 것을 입증하는 우수한 증거가 존재하며, 이는 점점 더 증가하고 있다. 이어서, 생성된 세포 이동 증가 및 상기 세포의 침습 잠재능은 전이가 확립될 가능성을 증진시킨다. 만성 골수성 백혈병-관련 온코진인 수용체 티로신 키나제 Axl이 침습-전이 캐스캐이드에서 필수적인 EMT-유도성 효과기인 것으로 최근 밝혀졌다 (WO2010/103388).

최근, EMT 프로그램은 전이성 잠재능을 증가시키는 데 있어서의 그의 역할 뿐만 아니라, 암 줄기 세포 (CSC)와 연관이 있는 것으로 나타났다. 상기 세포는 줄기 세포 특징 - 즉, 특정 암에서 발견되는 모든 세포 유형을 생성시킬 수 있는 능력 및 이에 새로운 종양을 형성할 수 있는 능력을 가지는 종양 세포의 서브세트를 나타내는 것으로 가정되었다. 비록 CSC가 종양 중 작은 세포 분획만을 나타낼 수도 있지만, 이는 특히 현존 항암 약물에 대해 저항성을 보이는 것으로 여겨진다. 비록 약물 치료가 종양 중 대부분의 세포를 사멸시킬 수는 있어도, 이에 단일의 생존 CSC가 질환을 재발시킬 수 있다. 최근 증거를 통해 EMT와 CSC 표현형 사이에 중복된다는 것이 제안된 바 있으며, 이는 EMT가 또한 화학요법 이후의 암 재발 및 약물 저항성 종양의 발생에서도 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 제안한다.

EMT 표현형에 대한 강력한 바이오마커는 전이성 또는 약물 저항성 암이 발병될 특정의 위험이 있는 환자를 확인하는 데 유용할 것이며, 동시에, EMT가 발생된 세포를 표적화하는 신규한 약물은 종래 요법 이후의 전이 및 재발을 감소시킬 것이다.

EMT 활성인자 (예컨대, 전사 인자 Slug)는 Akt1 활성/발현을 증가시킨다. 또한, Akt1 활성화 (예를 들어, 미리스틸화된 변이체 MyrAkt1)는 EMT 활성인자 (예컨대, 전사 리프레서, Snail; 문헌 [Oncogene. 2007 Nov 22; 26 (53):7445-56. Epub 2007 Jun 1])를 유도하고, 또한 바이오마커의 상피에서 간엽으로의 전환을 유발하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 요약

이에, 예상 밖으로 Akt3은 인간 세포에서 EMT 및 암 줄기 세포 소질 유도에서 중심적인 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 특히, 대조군 세포 또는 구성적으로 활성인 Akt1을 발현하는 세포와 비교하여, 구성적으로 활성인 Akt3은 생체내에서 종양 및 맘모스피어(mammosphere)를 형성할 수 있는 능력을 유의적으로 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 추가로, Akt3 억제가 EMT 및 CSC 소질을 역전시킬 수 있었다.

이것은 본 분야에서 Akt1 및 Akt2에 초점을 두고 있었다 점에 비추어 볼 때, 예상치 못한 것이었다.

또한, Akt3은 Axl 수용체 티로신 키나제 신호전달에 대한 바이오마커인 것으로 밝혀졌다. 더욱 구체적으로, Akt3은 상피 세포에서 xl 신호전달에 대한 바이오마커인 것으로 밝혀졌다. Akt3은 또한 EMT를 유지시키는 피드백 루프에 참여하는 것으로도 밝혀졌다. Akt3, 예컨대, 암 줄기 세포의 바이오마커의 적용 이외데도, 추가로 전이도 본 개시내용으로부터 자명해질 것이다.

본 발명의 한 측면에 따라, 시험을 위해 후보 제약 화합물 군을 제공하는 단계, 시험 시스템에서 후보 제약 화합물이 Akt3 활성에 미치는 효과를 시험하는 단계 및 Akt3 활성 억제에 기초하여 후보 제약 화합물을 선별하는 단계를 포함하는, Akt3-관련 병증을 예방, 억제 또는 치료하는 데 유용한 제약 화합물을 선별하는 방법을 제공한다.

별법으로, 본 발명은 시험을 위해 후보 제약 화합물 군을 제공하는 단계, 시험 시스템에서 후보 제약 화합물이 Akt3 활성에 미치는 효과를 시험하는 단계 및 그의 Akt3 활성 억제에 기초하여 후보 제약 화합물을 선별하는 단계를 포함하는, 전이성 또는 약물 저항성 암 치료에 유용한 후보 제약 화합물을 선별하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에 따라, 시험을 위해 후보 제약 화합물 군을 제공하는 단계, 시험 시스템에서 후보 제약 화합물이 Akt3 활성에 미치는 효과를 시험하는 단계 및 Akt3 활성 억제에 기초하여 후보 제약 화합물을 선별하는 단계를 포함하는, EMT의 예방 또는 억제에 유용한 후보 제약 화합물을 선별하는 방법을 제공한다.

생체내 반응을 예측하기 위해 시험관내 시험 시스템에서 후보 제약 화합물의 유효 수준을 측정할 수 있는 것이 고도로 유익하다. 이는 용량에 의존하는 방식으로 진행되는 제약 화합물의 유효 최소 투여 수준을 측정 및 또한 약물 표적 입증을 용이하게 한다. 제약에 대한 생체내 반응을 예측하는 데 특히 유용한 접근법은 RNA 간섭을 통한 표적 유전자의 조건별 선택적 넉 아웃을 통해 이루어진다. 상기 방법에서 사용하기 위한 뉴클레오티드를 생성하는 효과적인 방법은 WO2009/082488에 기술되어 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 시험 세포에서 Akt3의 발현을 선택적으로 감소시키는 단계, 시험 세포를 후보 제약 화합물과 접촉시키는 단계 및 후보 제약 화합물이 Akt3 활성 억제에 미치는 효과를 측정하는 단계를 포함하는, Akt3-관련 병증을 예방, 억제 또는 치료하는 데 유용한 제약 화합물을 선별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 시험관내 시험 시스템에서 Akt3의 발현을 낮은 수준으로 선택적으로 감소시키는 단계, 시험 시스템을 후보 제약 화합물과 접촉시키는 단계 및 Akt3 활성을 억제시키는 후보 제약 화합물을 선별하는 단계를 포함하는, Akt3-관련 병증을 예방, 억제 또는 치료하는 데 유용한 화합물을 선별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 대상체에서 또는 상기 대상체로부터 유래된 샘플에서 Akt3의 발현 또는 활성 수준을 평가하는 단계를 포함하는, Akt3-관련 병증을 앓는 대상체를 확인하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 본원에 기술된 바와 같이, 대상체에서 또는 상기 대상체로부터 유래된 샘플에서의 발현 또는 활성 수준은 대조군 샘플과의 비교로 측정될 수 있다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 대상체에서 또는 상기 대상체로부터 유래된 샘플에서 Akt3의 발현 또는 활성 수준을 평가하는 단계를 포함하고, Akt3 발현 또는 활성 수준이 증가하였다면, 이는 대상체에서 전이성 또는 약물 저항성 암이 발병될 위험이 증가되어 있음을 나타내는 것인, 전이성 또는 약물 저항성 암이 발병될 특정의 위험이 있는 대상체를 확인하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 대상체에서 또는 상기 대상체로부터 유래된 샘플에서 Akt3 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하고, Akt3 발현 또는 활성의 증가는 암 줄기 세포 (CSC)가 존재함을 나타내는 것인, 대상체에서 암 줄기 세포의 존재를 확인하는 방법을 제공한다

본 발명의 추가의 측면에 따라, 대상체에서 또는 상기 대상체로부터 유래된 샘플에서 Akt3 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하고, Akt3 발현 또는 활성의 증가는 EMT가 발생하였음을 나타내는 것인, EMT가 발생된 대상체를 확인하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 대상체에서 또는 상기 대상체로부터 유래된 샘플에서 Akt3 활성 또는 발현을 평가하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암 관련 결과를 예후하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 대조군 샘플과 비교하여 Akt3 활성 또는 발현의 증가는 암 치료제, 예를 들어, EMT를 억제시키거나, 역전시킬 수 있는 작용제에 의한 치료에 대해 감수성이라는 것을 나타내는 것이다. 상기 작용제는 본원에 기술되어 있는 것과 같은 것일 수 있고, 예컨대, Akt3 억제제 또는 Axl 억제제이다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 대상체에서 또는 상기 대상체로부터 유래된 샘플에서 Akt3 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하고, Akt3의 활성 또는 발현 증가는 Axl 활성과 상관 관계가 있는 것인, Axl 활성을 확인하는 방법을 제공한다.

예상 밖으로, Akt3의 발현 또는 활성 수준은 Akt2의 발현 또는 활성 수준과 반비례 상관 관계가 있는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 방법 및 용도는 대상체에서 또는 상기 대상체로부터 유래된 샘플에서 Akt2의 발현 또는 활성 수준을 평가하는 단계를 포함한다. Akt2 발현 또는 활성 수준의 감소는 (i) 대상체가 Akt3-관련 병증을 앓고/거나; (ii) 전이성 또는 약물 저항성 암이 발병될 위험이 증가되어 있고/거나; (iii) 암 줄기 세포가 존재하고/거나; (iv) EMT가 발생하였음을 나타내는 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, Akt2 및 Akt3, 둘 모두의 발현 또는 활성 수준을 평가한다. 반비례 상관 관계가 있는 두 바이오마커를 평가하는 것이 검정 신뢰도를 증가시킬 수 있다.

일부 실시양태에서, Akt3을 코딩하는 유전자의 카피수를 대조군 샘플과 비교하여 측정함으로써 Akt3의 발현 수준을 평가하며, 여기서, 카피수의 증가는 Akt3의 발현 수준 증가를 나타내는 것이다. 카피수 (즉, 유전자 중복 이벤트)는 당업계에 공지되어 있는 표준 기법, 예컨대, 문헌 [Jiang et al., (Jiang Q, Ho YY, Hao L, Nichols Berrios C, Chakravarti A. Copy number variants in candidate genes are genetic modifiers of Hirschsprung disease. PLoS One. 2011;6(6)]에 기술되어 있는 바와 같이, DNA 칩을 사용함으로써 측정될 수 있다.

일부 실시양태에서, Akt3 (또는 Akt2)의 발현 수준은 Akt3 (또는 Akt2) 단백질 또는 mRNA의 수준을 측정함으로써 평가된다. 단백질 및 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 당업계에 주지되어 있고, 본원에 기술되어 있다.

일부 실시양태에서, Akt3 활성은 Akt3의 인산화를 측정함으로써 평가되며, 여기서, Akt3의 인산화가 활성 Akt3을 나타낸다. Akt3 인산화는 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 472번 세린에서 측정될 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 인산화는 305번 트레오닌 및/또는 174번 티로신에서 측정될 수 있다. 상기 번호매김은 Akt3 서열을 참조하는 것이며; 상응하는 Akt1 잔기는 각각 S473, T308 및 Y176이다

이론으로 제한하지 않으면서, 305번 트레오닌에서의 인산화는 Akt3를 핵으로 국소화시켜 174번 티로신 및 472번 세린에서의 인산화를 유도하고, Akt3을 활성화시키는 데 있어서 중요한 것으로 여겨진다. 일부 실시양태에서, Akt3 활성은 Akt3 단백질의 세포내 국소화를 측정함으로써 평가되며, 여기서, 핵내 국소화가 활성 Akt3을 나타낸다.

일부 실시양태에서, Akt3 활성은 하류 표적, 예를 들어, EMT 관련 유전자의 발현 수준을 측정함으로써 평가된다. 추가의 실시양태에서, Akt3 키나제 활성은 예를 들어, 문헌 [Tuomi et al., 2009 (Sci Signal. 2009 Jun 30 2(77))]에 기술되어 있는 바와 같이, 기질 단백질 (예컨대, SNAIL) 또는 펩티드의 인산화를 측정하므로써 평가될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 대상체를 Akt3 억제제와 또는 본 발명의 제1 측면에 따른 방법에 의해 수득된 후보 화합물로서 또는 그로부터 유도된 제약 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, Akt3-관련 병증을 앓는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면은 대상체를, Akt3 활성을 억제시킬 수 있는 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 대상체에서 EMT를 억제시키는 방법을 포함한다.

본 발명의 추가의 측면은 대상체를, Akt3 활성을 억제시킬 수 있는 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 대상체에서 암 줄기 세포를 억제시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 대상체를, Akt3 활성을 억제시킬 수 있는 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 암을 앓는 대상체에서 약물 저항성을 예방 또는 억제시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 Akt3 관련 병증, 예컨대, 암 치료에서 Akt3 억제제의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 EMT 억제에서 Akt3 억제제의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 치료 방법에서 사용하기 위한 Akt3 억제제를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 대상체를, Akt3 활성을 억제시킬 수 있는 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 암을 앓는 대상체에서 약물 저항성을 예방, 억제 또는 치료하는 방법에서 Akt3 활성을 억제시킬 수 있는 화합물의 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 방법에 의해 확인된 또는 본 발명에 따른 방법 또는 용도에서 사용되는 Akt3 억제제는 단일요법으로서 또는 하기 언급되는 다른 암 치료법과 함께 하는 병용 요법에서 사용될 수 있다.

적합한 화학요법제로는 하기를 포함한다:

알킬 술포네이트, 예컨대, 부술판;

질소 머스타드, 예컨대, 클로람부실, 시클로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 멜팔란 및 우라무스틴, 에틸렌이민 유도체, 예컨대, 티오테파;

니트로소우레아, 예컨대, 카무스틴, 로무스틴 및 스트렙토조토신, 트리아젠, 예컨대, 다카바진, 프로카바진 및 테모졸라미드 및

백금 화합물, 예컨대, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 사트라플라틴 및 피코플라틴 온나플라틴, 테트라플라틴, 스피로플라틴, 이프로플라틴, 클로로(디에틸렌디아미노)-백금 (II) 클로라이드, 디클로로(에틸렌디아미노)-백금 (II), 디아미노(2-에틸말로나토)백금 (II), (1,2-디아미노시클로헥산)말로나토백금 (II), (4-카르복시프탈로)-(1,2-디아미노시클로헥산)백금 (II), (1,2-디아미노시클로헥산)-(이소시트레이토)백금 (II) 및 (1,2-디아미노시클로헥산)-시스-(피루베이토)백금 (II)을 포함하는 알킬화제;

엽산 길항제, 예컨대, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 랄티트렉세드 및 트리메트렉세이트,

피리미딘 유사체, 예컨대, 아자시티딘, 카페시타빈, 시타라빈, 에다트렉세이트, 플록수리딘, 플루오로우라실, 젬시타빈 및 트록사시타빈 및

퓨린 유사체, 예컨대, 클라드리빈, 클로로데옥시아데노신, 크로파라빈, 플루다라빈, 머캅토퓨린, 펜토스타틴 및 티오구아닌을 포함하는 항대사산물;

항종양 항생제, 예컨대, 블레오마이신, 닥티노마이신, 미트라마이신, 미토마이신, 미톡산트론, 포르피로마이신 및 안트라시클린, 예컨대, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신 및 발루비신,

유사분열 억제제, 예컨대, 빈카 알카로이드 빈블라스틴, 빈베시르(vinvesir), 빈크리스틴, 빈데신 및 비노렐빈,

효소, 예컨대, L-아스파라기나제 및 PEG-L-아스파라기나제,

미세소관 중합체 안정제, 예컨대, 탁산 파클리탁셀 및 독세탁셀,

토포이소머라제 I 억제제, 예컨대, 캄프토테신 이리노테칸 및 토포테칸 및

토포이소머라제 II 억제제, 예컨대, 포도필로톡신, 암사크린, 에토포시드, 테니포시드, 로속산트론 및 악티노마이신을 포함하는 천연생성물;

안드로겐제, 예컨대, 플루옥시메스테론 및 테스토락톤,

항안드로겐제, 예컨대, 비칼루타미드, 시프로테론, 플루타미드 및 닐루타미드, 코르티코스테로이드제, 예컨대, 덱사메타손 및 프레드니손,

아로마타제 억제제, 예컨대, 아미노글루테티미드, 아나스트로졸, 엑스메스탄, 포르메스탄 및 레트로졸,

에스트로겐제, 예컨대, 디에틸스틸베스트롤,

항에스트로겐제, 예컨대, 풀베스트란트, 랄록시펜, 타목시펜 및 토레미펜,

황체 형성 호르몬 방출 호르몬 (LHRH) 효능제 및 길항제, 예컨대, 아바렐릭스, 부세레린, 고세렐린, 류프롤라이드, 히스트렐린, 데슬로렐린, 나파렐린 아세테이트 및 트립토렐린,

프로게스틴제, 예컨대, 메드록시프로게스테론 아세테이트 및 메게스트롤 아세테이트 및

갑상샘 호르몬, 예컨대, 레보티록신 및 리오티로닌을 포함하는 호르몬 및 호르몬 길항제;

페리포신, 엔자스타우린 히드로클로라이드 및 트리시리빈,

P13K 억제제, 예컨대, 세마포어 및 SF1126 및

MTOR 억제제, 예컨대, 라파마이신 및 유사체를 포함하는 PKB 경로 억제제;

셀리시슬립, 알보시딥 및 7-히드록시스타우로스포린을 포함하는 CDK 억제제;

셀레콕시브를 포함하는 COX-2 억제제;

트리코스타틴 A, 수베로일아닐리드 히드록삼산 및 클라미도신을 포함하는 HDAC 억제제;

테모졸로미드를 포함하는 DNA 메틸라제 억제제; 및

알트레타민, 삼산화비소, 탈리도미드, 레날리도미드, 갈륨 니트레이트, 레바미솔, 미토탄, 히드록시우레아, 옥트레오티드, 프로카바진, 수라민, 광역학적 화합물, 예컨대, 메톡살렌 및 소듐 포르피머 및 프로테아좀 억제제, 예컨대, 보테조밉을 포함하는 기타 작용제,

유전자 요법제,

안티센스 요법제,

티로신 키나제 억제제, 예컨대, 에를로티닙 히드로클로라이드, 제피티닙, 이마티닙 메실레이트 및 세막사닙,

Raf 억제제, 예컨대, 소라페닙 및

유전자 발현 조절제, 예컨대, 레티노이드 및 렉시노이드, 예를 들어,아다팔렌, 벡사로텐, 트랜스-레티노산, 9-시스-레티노산 및 N-(4-히드록시페닐)레틴아미드를 포함하는 기능성 치료제; 및

모노클로날 항체, 예컨대, 알렘투주맙, 베바시주맙, 세툭시맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 리툭시맙 및 트라스투주맙, 면역독소, 예컨대, 젬투주맙 오조가미신, 방사성면역컨쥬게이트, 예컨대, I-토시투모맙 및

암 백신을 포함하는 표현형-지정 요법제를 포함하는 분자표적화제 요법제.

인터페론, 예컨대, 인터페론-α2a 및 인터페론-α2b 및

인터루킨, 예컨대, 알데스루킨, 데니루킨 디프티톡스 및 오프레베킨을 포함하는 표현형-지정 요법제. Axl 억제제, 예컨대, 1-(6,7-디히드로-5H-벤조[6,7]시클로헵타[1,2-c]피리다진-3-일)-N3-((7-(S)-피롤리딘-1-일)-6,7,8,9-테트라히드로-5H-벤조[7]안눌렌-2-일)-1H-1,2,4-트리아졸-3,5-디아민 (BGB324/R428), CH5451098 (로슈) 및 PCT/US07/089177, PCT/US2010/021275 및 PCT/EP2011/004451 (이들은 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있는 Axl 억제제.

암 세포에 대하여 작용하도록 의도되는 상기 작용제 이외에도, 항암 요법은

세포보호제, 예컨대, 아미포스틴 및 덱스라족산,

포스포네이트, 예컨대, 파미드로네이트 및 졸레드론산 및

자극제, 예컨대, 에포에틴, 다베포에틴, 필그라스팀, PEG-필그라스팀 및 사르그라모스팀을 포함하는 보호제 또는 보조제를 사용하는 것을 포함한다.

다수의 병용 화학요법제 요법, 예컨대, 카보플라틴/파클리탁셀, 카페시타빈/독세탁셀, 플루오로우라실/레바미솔, 플루오로우라실/류코보린, 메토트렉세이트/류코보린 및 트라스투주맙/파클리탁셀의 병용 단독 또는 카보플라틴과의 추가의 병용 등이 당업계에 공지되어 있다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, Akt3 활성 또는 발현이 상승된 환자를 확인하는 단계 및 상기와 같이 확인된 환자를 치료법에 대하여 선별하는 단계를 포함하는, Akt3-관련 병증 치료법에 대하여 환자, 바람직하게, 인간 환자를 선별하는 방법을 제공한다. 환자는 본원에 기술된 본 발명의 방법에 따라 확인될 수 있다.

바람직하게, Akt3-관련 병증은 암이다. 암은 하기 암 중 하나 이상의 것일 수 있다: 백혈병, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 예컨대, 골수아구성, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성, 적백혈병 백혈병 및 척수형성이상 증후군, 만성 백혈병, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 만성 골수구성 (과립구성) 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 모발상 세포 백혈병; 진성 적혈구증가증; 림프종, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 호지킨병, 비호지킨병; 다발성 골수종, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 아급성 다발성 골수종, 비분비성 골수종, 골경화성 골수종, 혈장 세포 백혈병, 고립성 형질세포종 및 골수외성 형질세포종; 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 유의성이 결정되지 않은 모노클로날 감마글로불린 장애; 양성 모노클로날 감마글로불린 장애; 중쇄 질환; 뼈 및 결합 조직 육종, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 뼈 육종, 골육종, 연골육종, 유잉 육종, 악성 거대 세포 종양, 뼈 섬유육종, 척삭종, 골막 육종, 연조직 육종, 혈관육종(angiosarcoma) (혈관육종(hemangiosarcoma)), 섬유육종, 카포시 육종, 평활근육종, 지방육종, 림프관육종, 전이성 암, 신경집종, 횡문근육종, 윤활막 육종; 뇌 종양, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 신경아교종, 성상세포종, 뇌 줄기 신경아교종, 뇌실막세포종, 희소돌기아교세포종, 비신경아교세포 종양, 청신경초종, 두개인두종, 수모세포종, 수막종, 송과체종, 송과체모세포종, 원발성 뇌 림프종; 유방암, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 샘암종, 소엽 (소세포) 암종, 관내 암종, 수질성 유방암, 점액 유방암, 관 유방암, 유두상 유방암, 원발성 암, 파젯트병 및 염증성 유방암; 부신암, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 크롬친화세포종 및 부신피질 암종; 갑상샘암, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 유두상 또는 소포성 갑상샘암, 수질성 갑상샘암 및 역형성 갑상샘암; 췌장암, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 인슐린종, 가스트린종, 글루카곤종, 비포마, 소마토스타틴-분비 종양 및 카르시노이드 또는 섬 세포 종양; 뇌하수체암, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 쿠싱 질환, 프로락틴-분비 종양, 말단거대증 및 요붕증; 눈암, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 안구 흑색종, 예컨대, 홍채 흑색종, 맥락막 흑색종 및 섬모체 흑색종 및 망막아세포종; 질암, 예컨대, 편평 세포 암종, 샘암종 및 흑색종; 외음부,암, 예컨대, 편평 세포 암종, 흑색종, 샘암종, 기저 세포 암종, 육종 및 파젯트병; 자궁경부암, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 편평 세포 암종 및 샘암종; 자궁암, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 자궁내막 암종 및 자궁 육종; 난소암, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 난소 상피 암종, 경계 종양, 생식 세포 종양 및 기질 종양; 식도암, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 편평암, 샘암종, 샘낭암종, 점액표피양 암종, 샘편평 암종, 육종, 흑색종, 형질세포종, 사마귀모양 암종 및 귀리 세포 (소세포) 암종; 위암, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 샘암종, 균상 (폴립모양), 궤양성, 표재성 확산, 미만성 확산, 악성 림프종, 지방육종, 섬유육종 및 암육종; 결장암; 직장암; 간암, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 간세포 암종 및 간아세포종, 담낭암, 예컨대, 샘암종; 담관암종, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 유두상, 결절 및 미만성; 폐암, 예컨대, 비-소세포 폐암, 편평 세포 암종 (표피모양 암종), 샘암종, 대세포 암종 및 소세포 폐암; 고환암, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 배아 종양, 고환종, 역형성, 고전 (전형), 정모세포, 비정상피종성, 배아 암종, 기형종 암종, 융모암종 (난황낭 종양), 전립선암, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 샘암종, 평활근육종 및 횡문근육종; 생식기암, 예컨대, 음경암; 구강암, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 편평 세포 암종; 기저세포암; 타액선암, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 샘암종, 점막표피모양 암종 및 샘낭암종; 인두암, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 편평 세포암 및 사마귀모양; 피부암, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종 및 흑색종, 표재성 확산 흑색종, 결절 흑색종, 흑색점 악성 흑색종, 말단 흑자 흑색종; 신장암, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 신장 세포암, 샘암종, 콩팥세포암종, 섬유육종, 이행 세포암 (신우 및/또는 요관); 윌름즈 종양; 방광암, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 이행 세포 암종, 편평 세포암, 샘암종, 암육종. 추가로, 암은 점액육종, 골육종, 내피육종, 림프관내피아세포육종, 중피종, 윤활막종, 혈관아세포종, 상피 암종, 샘낭암종, 기관지원성 암종, 땀샘 암종, 피지샘 암종, 유두상 암종 및 유두상 샘암종을 포함한다. 바람직하게, 암은 유방, 흑색종, 전립선, 난소, 결장직장, 폐 또는 신경아교종암으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게, 암은 전이성 유방암이다.

전이성 암의 치료는 원발성 종양의 위치에 의존한다. 예를 들어, 유방암이 폐로 확산된 경우, 유방암 상태 그대로 유지되고, 치료법은 현재 상기 암이 폐에 존재한다는 사실에 의해서가 아닌, 유방내 전이성 암 기원에 의해 결정된다. 약 5% 정도로 전이성 암이 발견되지만, 원발성 종양은 확인이 불가능하다. 상기 전이성 암 치료법은 그의 기원보다는 그의 위치로 지시된다. 전이성 암은 (공지된 경우) 원 종양의 조직에 의해 명명화된다. 예를 들어, 뇌로 확산된 유방암은 뇌로 전이된, 전이성 유방암이라 불린다. 본 발명의 방법에 따라 확인되거나, 선별되는 환자는 치료되거나, 치료를 위해 선별될 수 있다. 예를 들어, Akt3 발현이 원발성 종양에서 상향조절된 것으로 나타난 경우, 이를 이용함으로써 전이 가능성이 증가되었다고 추론할 수 있다. 이러한 정보는 치료 옵션, 즉, 더욱 침습성인 항암 수술, 화학요법제 또는 방사선치료제 치료법, 예컨대, 근치적 유방절제술에 대한 가이드로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료법은 Akt3 및/또는 Axl 억제제를, 임의적으로 본원에 기술된 또는 당업계에 공지된 추가의 치료제와 함께 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게, Axl 억제제는 BGB324/R428이다.

본 발명은 또한 EMT에 대한 억제제에 대하여 감수성이며, 그의 Akt3 발현 수준은 EMT를 방해하는 데 불충분한 것인 세포주를 제공한다. 바람직하게, 세포주는 인간 세포주이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 세포주로부터의 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 단계 및 세포에서 Akt3 활성 억제를 측정하는 단계를 포함하는, Akt3 활성을 억제시키는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다.

본 발명의 한 측면은 대상체에서 상피에서 간엽으로의 이행 (EMT) 발생을 검출하기 위한 바이오마커로서의 Akt3의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 의 발현 및/또는 활성화가 증가하였다면, 이는 상피에서 간엽으로의 이행 (EMT)이 발생하였음을 나타내는 것이다.

원위 부위로의 전이가 고형 종양의 가장 일반적인 사망 원인이 된다 (문헌 [Gupta 2006, Sporn 1996]). 이를 달성하기 위해, 종양 세포는 상피 구속을 버리고, 연결 복합체를 재정의하고, 침습성 운동을 획득하여 기저막 경계부를 넘어 침입하게 된다. 이어서, 상기 전이성 세포는 림프 및 혈행성 순환 내로의 혈관내유입되고, 체내 원위 부위로 파종된다. 상기 전이성 세포 중 일부는 모세관벽을 통해 성공적으로 혈관외유출을 수행하고, 드문 경우에는, 외래 조직 기질을 콜로니화시킨다 (문헌 [Weinberg et al.]). 이러한 악성 과정은, 상피 세포가 장배형성 및 기관형성 동안 일시적으로 간엽 표현형을 띠면서, 단일 세포가 상피층으로부터 떨어져 침습성 이동을 할 수 있도록 허용하는 발생적 프로그램인, 상피에서 간엽으로의 이행 (EMT)에 의해 촉진된다 (문헌 [Hall, 1985; Thierry, 2002]). EMT 프로그램은 Twist, Snail, Slug 및 Zeb2를 비롯한, 연결 복합 단백질의 발현을 변경시키는, 전사 조절 인자의 발현을 유도하는 모르포겐 신호전달 경로의 정황적 활성화에 의해 개시된다 (문헌 [Thiery and SLeeman 2006]). EMT 유전자 발현 프로파일이 표현형적 변동으로, 비멘틴 및 N-카드헤린의 유도와 함께 E-카드헤린 및 시토케라틴의 억제를 반영한다 (문헌 [Weinberg et al. 2007]).

본원에서 사용되는 바, "마커" 또는 "바이오마커"라는 용어는, 상피에서 간엽으로의 이행 (EMT)이 발생할 때, 세포 또는 포유동물로부터 유래된 샘플 중 발현이 변경되거나 또는 조절되는, 예를 들어, 상향조절되거나, 하향조절되는 유전자 또는 단백질을 의미한다. 바이오마커가 단백질인 경우, 발현 조절 또는 변경은 상이한 번역 후 변형을 통한 조절을 포함한다.

번역 후 변형은 단백질 분해 절단에 의해 또는 하나 이상의 아미노산에의 변형 기의 부가에 의해 단백질의 특성을 변화시키는 공유 프로세싱 이벤트이다. 일반적인 번역 후 변형으로는 인산화, 아세틸화, 메틸화, 아실화, 글리코실화, GPI 부착, 유비퀴틴화 등을 포함한다. 그러한 변형 및 검출 방법에 관한 리뷰는 문헌 [Mann et al. Nature Biotechnology March 2003, Vol . 21, pages 255-261 ]에서 살펴볼 수 있다.

본원에서는 또한 Axl의 발현 및/또는 활성화를 검출하기 위한 바이오마커로서의 Akt3의 용도로서, 여기서, Akt3의 발현 및/또는 활성화 증가가 Axl의 발현 및/또는 활성화 증가를 나타내는 것인, 용도를 제공한다.

"발현"이라는 용어는 유전자의 DNA 주형이 전사되어 상응하는 mRNA를 생성하고, 이 mRNA가 번역되어 상응하는 유전자 생성물 (즉, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질)을 생성하는 것 뿐만 아니라, 번역 후 변형될 수 있는 하나 이상의 형태의 단백질 "발현"을 의미한다.

유전자 발현을 포함하는 발현 수준 검출은 당업계에 공지된 방법들 중 어느 한 방법, 특히, 마이크로어레이 분석법, 웨스턴 블롯팅에 의해 또는 PCR 기법, 예컨대, QPCR에 의해 수행될 수 있다. 발현 변경은 또한 본원에 기술된 바와 같은 방법, 예컨대, ELISA, PET 또는 SELDI-TOF MS를 사용하여 및 추가의 분석 기법, 예컨대, 2D 겔 전기영동을 사용하여 샘플의 단백질 함량을 분석함으로써 검출될 수 있다. 기법, 예컨대, 상기 기법은 단백질의 선택적(alternative) 번역 후 변형 형태인 형태의 발현 변경을 검출하는 데 특히 유용할 수 있다.

적합한 샘플로는 조직 샘플, 예컨대, 생검, 혈액, 뇨, 볼 찰과물 등, 혈청, 혈장 또는 조직 배양물 상청액 샘플을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 유전자 발현은 바람직하게, 종양 세포, 특히, 종양, 예컨대, 유방암, 폐암, 위암, 두부경부암, 결장직장암, 신장암, 췌장암, 자궁암, 간암, 방광암, 자궁내막암 및 전립선암 및 백혈병으로부터로부터 유래된 세포 또는 혈액 세포, 예컨대, 림프구 및 바람직하게, 말초 림프구, 예컨대, PBMC에서 검출된다.

환자의 혈청 및 특히 혈장 샘플 중 단백질 검출시, 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 샘플을 제거하고, 그에 대해 단백질 분석 기법, 예컨대, 유세포 측정법, ELISA, PET 및 SELDI-TOF MS를 수행한다.

한 바람직한 실시양태에서, 본 방법은 상기 샘플로부터 RNA를 추출하는 단계 및 QPCR에 의해 유전자 발현을 검출하는 단계를 포함한다.

한 실시양태에서, 유전자 발현은 단백질 생성물을 예를 들어, 웨스턴 블롯에 의해 검출함으로써 검출된다.

본 발명의 추가의 측면은 세포, 세포군, 동물 모델 또는 인간으로부터 단리된 샘플 중 Akt3의 발현 수준 또는 활성화를 대조군 샘플과 비교하여 측정하며, 여기서, Akt3의 발현 수준 또는 활성화가 대조군 샘플에 비하여 증가하였다면, 이는 상피에서 간엽으로의 이행 (EMT)이 발생하였다는 것을 나타내는 것인, 샘플 중 상피에서 간엽으로의 이행 (EMT) 발생을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면은 세포, 세포군 또는 동물 모델에 상피에서 간엽으로의 이행 (EMT)을 억제시키거나, 역전시킬 수 있는 작용제를 투여하는 단계 및 Akt3의 활성화 및/또는 발현을 모니터링하는 단계를 포함하는, 상피에서 간엽으로의 이행 (EMT)을 억제시키거나, 역전시킬 수 있는 작용제를 확인하는 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 방법은

(i) 세포, 세포군 또는 인간이 아닌, 동물 모델에게 상기 작용제를 투여하는 단계;

(ii) 처리된 세포 또는 동물 모델 및 비처리 세포 또는 동물 모델로부터 유래된 샘플 중 Akt3 발현 및/또는 Akt3 활성화를 측정하는 단계; 및

(iii) 비처리 샘플과 비교하여 처리된 샘플 중 Akt3의 발현 및/또는 활성화 증가를 상피에서 간엽으로의 이행 (EMT)을 억제시키거나, 역전시킬 수 있는 능력을 나타내는 것으로서 검출하는 것인 단계를 포함한다.

일부 실시양태에서, 동물 모델은 인간이 아니다.

일부 실시양태에서, Akt3의 발현 수준은 Akt3을 코딩하는 유전자의 카피수를 대조군 샘플과 비교하여 측정함으로써 평가되며, 여기서, 카피수의 증가는 Akt3의 발현 수준이 증가하였다는 것을 나타내는 것이다.

일부 실시양태에서, Akt3의 발현 수준은 Akt3 단백질 또는 mRNA 수준을 측정함으로써 평가된다.

일부 실시양태에서, Akt3 활성은 Akt3의 인산화를 측정함으로써 평가되며, 여기서, Akt3의 인산화가 Akt3 활성을 나타낸다. Akt3 인산화는 본원에 기술된 바와 같이, 472번 세린에서 측정될 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 인산화는 305번 트레오닌 및/또는 174번 티로신에서 측정될 수 있다.

일부 실시양태에서, Akt3 활성은 Akt3 단백질의 세포내 국소화를 측정함으로써 평가되며, 여기서, 핵내 국소화가 활성 Akt3을 나타낸다.

일부 실시양태에서, Akt3 활성은 하류 표적, 예를 들어, EMT 관련 유전자의 발현 수준을 정함으로써 평가된다. 추가의 실시양태에서, Akt3 키나제 활성은 예를 들어, 문헌 [Tuomi et al., 2009]에 기술되어 있는 바와 같이, 기질 단백질 (예컨대, SNAIL) 또는 펩티드의 인산화를 측정함으로써 평가될 수 있다.

Akt3

Akt3 (이는 또한 PKB 감마로도 알려져 있다)은 인간에서 2가지 이소폼, 이소폼 1 및 이소폼 2로 존재한다. "정규" 서열인 이소폼 1의 서열 (Q9Y23, 버전 1)은 하기와 같다:

서열 번호 1

이소폼 2는 하기 서열을 가진다:

서열 번호 2

유전자/단백질 마커의 발현 변경 측정

유전자 및 단백질 발현 수준은 다수의 상이한 기법을 사용하여 측정될 수 있다.

(a) RNA 수준에서의 측정

유전자 발현을 RNA 수준에서 검출할 수 있다. 예를 들어, 산성 페놀/구아니딘 이소티오시아네이트 추출 (RNA졸 B(RNAzol B); 바이오제네시스(Biogenesis)), RN이지(RNeasy) RNA 제조용 키트 (퀴아젠(Qiagen)) 또는 PAX진(PAXgene) (프리아날리틱스(PreAnalytix: 스위스))을 이용하는 것을 비롯한, RNA 추출 기법을 사용하여 RNA를 세포로부터 추출할 수 있다. 리보핵산 하이브리드화를 이용하는 전형적인 검정법 포맷으로는 핵 런-온(nuclear run-on) 검정법, RT-PCR, RN아제 보고 검정법 (문헌 [Melton et al., Nuc . Acids Res . 12:7035]), 노던 블롯팅 및 계내 하이브리드화를 포함한다. 유전자 발현은 또한 하기 기술되는 바와 같이, 마이크로어레이 분석법에 의해 검출될 수 있다.

노던 블롯팅을 위해, RNA 샘플을 먼저 변성 조건하에서 아가로스 겔 중 전기영동을 통해 크기별로 분리한다. 이어서, RNA를 막으로 옮기고, 가교 결합시키고, 표지화된 프로브와 하이브리드화시킨다. 무작위-프라이밍된, 닉-번역된 또는 PCR-생성된 DNA 프로브, 시험관내 전사된 RNA 프로브 및 올리고뉴클레오티드를 비롯한, 비동위원소 또는 고특이 활성 방사성표지화된 프로브가 사용될 수 있다. 추가로, 오직 부분적으로만 상동성인 서열 (예컨대, 상이한 종으로부터의 cDNA 또는 엑손을 함유할 수 있는 게놈 DNA 단편)이 프로브로서 사용될 수 있다.

뉴클레아제 보호 검정법 (리보뉴클레아제 보호 검정법 및 S1 뉴클레아제 검정법, 둘 모두 포함)은 특이 mRNA를 검출하고, 정량화하는 위한 초고감도 방법을 제공한다. NPA의 기초 원리는 RNA 샘플에의 안티센스 프로브 (방사성표지화된 또는 비동위원소인 프로브)의 용액 중 하이브리드화이다. 하이브리드화 후, 단일 가닥, 하이브리드화되지 않은 프로브 및 RNA는 뉴클레아제에 의해 분해된다. 남은 보호된 단편을 아크릴아미드 겔 상에서 분리한다. NPA를 통해 수개의 RNA 종을 동시에 검출할 수 있다.

계내 하이브리드화 (ISH)는 세포 또는 조직 중 특정 mRNA의 국소화를 위한 강력한 다목적 도구이다. 프로브의 하이브리드화는 세포 또는 조직 내에서 일어난다. 세포 구조가 전 과정 동안 그대로 유지되기 때문에, ISH는 조직 샘플내 mRNA의 위치에 관한 정보를 제공한다.

본 방법은 중성 완충처리된 포르말린 중에 샘플을 고정시키고, 파라핀 중에 조직을 포매시키는 것으로 시작된다. 이어서, 샘플을 박편으로 자르고, 현미경 슬라이드 상에 탑재시킨다. 별법으로, 조직을 냉동시키고, 파라포름알데히드 중에 고정시킨 후, 절편화할 수 있다. 절편에서 밀랍을 제거하고, 재수화시키기 위해 일련으로 세척한 후, 프로테이나제 K 분해를 수행하여 프로브 접근성을 증가시킨 후, 표지화된 프로브를 샘플 절편과 하이브리드화시킨다. 방사성표지화된 프로브는 슬라이드 상에서 건조시킨 액상 필름을 이용하여 시각화시키는 반면, 비동위원소로 표지화된 프로브는 종래 방식으로 비색 또는 형광 시약을 이용하여 검출된다. 상기 후자의 검출 방법은 형광 계내 하이브리드화 (FISH)에 대한 기본 원리가 된다. 사용될 수 있는 검출 방법은 방사성 표지, 효소 표지, 화학발광성 표지, 형광성 표지 및 다른 적합한 표지를 포함한다.

전형적으로, RT-PCR은 RNA 표적을 증폭시키는 데 사용된다. 이 과정에서, 역전사 효소는 RNA를 상보성 DNA (cDNA)로 전환시키는 데 사용되며, 이어서, 이는 증폭될 수 있고, 이로써 검출은 촉진된다. 상대 정량적 RT-PCR은 관심의 대상이 되는 유전자도 함께 동시에 내부 대조군을 증폭시키는 것을 포함한다. 내부 대조군은 샘플을 정규화시키는 데 사용된다. 일단 정규화시키고 나면, 특정 mRNA의 상대적인 존재비에 대한 샘플 간의 직접적인 비교를 수행할 수 있다. 통상 사용되는 내부 대조군으로는 예를 들어, GAPDH, HPRT, 액틴 및 시클로필린을 포함한다.

DNA 증폭 방법으로 많은 방법들이 공지되어 있으며, 그들 대부분은 효소 연쇄 반응 (예컨대, 중합효소 연쇄 반응, 리가제 연쇄 반응 또는 자가 유지(self sustained) 서열 복제)에 또는 그가 클로닝되는 벡터 모두 또는 그의 일부의 복제로부터 의존한다.

다수의 표적 및 신호 증폭 (TAS) 방법이 문헌에 기술되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Landegren, U. et al., Science 242:229-237 (1988)] 및 [Lewis, R., Genetic Engineering News 10: 1, 54-55 (1990)]에 상기 방법에 관한 일반 개요가 기술되어 있다.

PCR은 그 중에서도 특히 US 4,683,195 및 4,683,202에 기술되어 있는 핵산 증폭 방법이다. PCR은 진단과 관련하여 임의의 공지된 핵산을 증폭시키는 데 사용될 수 있다 (문헌 [Mok et al., 1994, Gynaecologic Oncology 52:247-252]). 자가 유지 서열 복제 (3SR)는 효소 칵테일 및 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의해 매개되는 역전사효소 (RT), 폴리머라제 및 뉴클레아제 활성의 순차적인 순환을 통한 핵산 주형의 등온 증폭을 포함하는, TAS의 변형법이다 (문헌 [Guatelli et al., 1990, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87:1874]). 결찰 증폭 반응 또는 결찰 증폭 시스템은 DNA 리가제 및 4개의 올리고뉴클레오티드 (표적 가닥 1개당 2개씩)를 사용한다. 상기 기법은 문헌 [Wu, DY and Wallace, RB, 1989, Genomics 4:560]에 기술되어 있다. Qβ 리플리카제 기법에서는 문헌 [Lizardi et al, 1988, Bio/Technology 6: 1197]에 기술되어 있는 바와 같이, 단일 가닥 RNA를 복제하는 박테리오파지 Qβ에 대한 RNA 리플리카제를 사용하여 표적 DNA를 증폭시킨다.

정량적 PCR (Q-PCR)은 측정하고자 하는 샘플내 전사체의 상대적인 양을 측정할 수 있는 기법이다. QPCR을 수행하는 데 적합한 방법은 본원에 기술되어 있다.

본 방법에서는 대체 증폭 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, 회전 환 증폭 (문헌 [Lizardi et al, 1998, Nat Genet 19:225])은 DNA 폴리머라제에 의해 구동되고, 등온 조건하에 선형 또는 기하 동역학으로 환형 올리고뉴클레오티드 프로브를 복제시킬 수 있는, 상업적으로 이용가능한(RCAT™) 증폭 기술이다. 추가 기법인 가닥 치환 증폭 (SDA; 문헌 [Walker et al., 1992, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 80:392])은 특이 표적에 독특한 특이적으로 정의되는 서열로 시작된다.

본원에서 확인되는 Akt3 또는 Akt2의 발현을 검출하는 데 적합한 프로브는 편리하게는 적합한 용기 내에 포함되어 있는 시험용 키트 형태로 패키징되어 있을 수 있다. 상기 키트에서 프로브는 고체 지지체에 결합되어 있을 수 있는데, 여기서, 키트가 그에 대한 것으로 디자인된 것인 검정 포맷은 상기 결합을 필요로 한다. 키트는 또한 프로빙하고자 하는 샘플을 처리하는 데 적합한 시약, 프로브를 샘플 중 핵산에 하이브리드화시키는 데 적합한 시약, 대조군 시약, 설명서 등을 함유할 수도 있다. 적합한 키트는 예를 들어, QPCR 반응에 대한 프라이머 또는 FISH를 수행하기 위한 표지화되 프로브를 포함할 수 있다.

(b) 폴리펩티드 수준에서의 측정

유전자 또는 단백질 발현 변경은 또한 Akt3 또는 Akt2 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드를 측정함으로써 검출될 수 있다. 이는 Akt3 또는 Akt2 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드에 결합하는 분자를 사용함으로써 달성될 수 있다. 단백질의 존재를 검출하기 위한 것으로서, 폴리펩티드에 직접 또는 간접적으로 결합하는 적합한 분자/작용제로는 자연적으로 발생된 분자, 예컨대, 펩티드 및 단백질, 예를 들어, 항체를 포함하거나 또는 이는 합성 분자일 수 있다.

Akt3 또는 Akt2 유전자 또는 단백질에 대한 항체는 상업적 공급처로부터 또는 당업자에게 잘 알려져 있는 기법을 통해 유도될 수 있다. 한 실시양태에서 및 발현 변경이 단백질 바이오마커의 번역 후 번형된 형태의 변경의 발현을 통해 그 자체로 나타나는 경우, 상기 상이한 형태에 대해 특이적인 항체가 사용될 수 있다.

항체 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체가 바람직한 경우, 선택된 포유동물 (예컨대, 마우스, 토끼, 염소, 말 등)을, 폴리펩티드로부터 에피토프(들)를 보유하는 면역원성 폴리펩티드로 면역화시킨다. 면역화시킨 동물로부터 혈청을 수집하고, 공지된 방법에 따라 처리한다. 폴리펩티드로부터의 에피토프에 대한 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청이 다른 항원에 대한 항체도 함유하는 경우, 폴리클로날 항체를 역친화성 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 폴리클로날 항혈청을 제조하고, 프로세싱하는 기법은 당업계에 공지되어 있다. 면역원성 반응을 증가시키기 위해, 폴리펩티드 또는 그의 단편을 동물 또는 인간에서 면역원으로서 사용하기 위한 또 다른 폴리펩티드에 대하여 합텐화시킬 수 있다.

폴리펩티드 중의 에피토프에 대한 모노클로날 항체 또한 당업자에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 하이브리도마에 의해 모노클로날 항체를 제조하는 일반 방법은 주지되어 있다. 무한 증식 항체 생산 세포주는 세포 융합에 의해 및 또한 다른 기법, 예컨대, 종양원성 DNA에 의한 B 림프구의 형질전환 또는 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스에 의한 형질감염에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 중의 에피토프에 대해 생산되는 모노클로날 항체의 패널은 다양한 특성; 즉, 이소형 및 에피토프 친화성에 대하여 스크리닝될 수 있다. 대안적 기법으로는 예를 들어, 파지가 그의 코트 표면 상에, 매우 다양한 상보성 결정 영역 (CDR)을 가지는 scFv 단편을 발현하는 것인, 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함한다. 상기 기법은 당업계에 주지되어 있다.

본 발명의 목적을 위해, 달리 언급되지 않는 한, "항체"라는 용어는 전체 항체 또는 표적 항원에 대한 그의 결합 활성을 보유하는 전체 활성의 단편을 포함한다. 상기 단편으로는 Fv, F(ab') 및 F(ab') ₂ 단편 뿐만 아니라, 단일 쇄 항체 (scFv)를 포함한다. 추가로, 항체 및 그의 단편은 예를 들어, EP239400A에 기술되어 있는 것과 같이, 인간화된 항체일 수 있다. 예로는 모노클로날 및 폴리클로날 항체, 재조합 항체, 항체의 단백질 분해성 및 재조합 단편 (Fab, Fv, scFv, 디아바디), 단일-도메인 항체 (VHH, sdAb, 나노바디, IgNAR, VNAR) 및 항체와 유사한 특이 결합성을 가지도록 조작된, 항체와 관련이 없는 단백질, 예컨대, 하기와 같은 것들이 있다:

명칭 근간

어피바디 단백질 A, Z 도메인 6 kDa

어피틴 Sac7d (술포로부스 액시도칼다리우스

( Sulfolobus acidocaldarius )로부터) 7 kDa

안티칼린 리포칼린 20 kDa

DARPins 앙키린 반복 모티프 14 kDa

피노머(Fynomer) Fyn, SH3 도메인 7 kDa

쿠니츠(Kunitz) 도메인 펩티드 각종 프로테아제 억제제 6 kDa

모노바디 피브로넥틴

표준 실험실용 기법, 예컨대, 상기 기술된 바와 같은 면역블롯팅을 사용함으로써 동일 세포 집단에서의 비처리 세포와의 비교로 Akt3 또는 Akt2 활성의 수준 변경을 검출할 수 있다.

유전자 발현은 또한 폴리펩티드의 번역 후 프로세싱 또는 핵산의 전사 후 변형의 변화를 검출함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 차별적 인산화, 폴리펩티드의 절단 또는 RNA의 선택적 스플라이싱 등이 측정될 수 있다. 유전자 생성물, 예컨대, 폴리펩티드의 발현 수준 뿐만 아니라, 번역 후 변형 수준도 독점적 단백질 검정법 또는 기법, 예컨대, 2D 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하여 검출될 수 있다.

항체는 (a) 항체를 제공하는 단계; (b) 항체-항원 복합체가 형성될 수 있도록 하는 조건하에서 상기 항체와 함께 생물학적 샘플을 인큐베이션시키는 단계; 및 (c) 상기 항체를 포함하는 항체-항원 복합체가 형성되었는지 여부를 측정하는 단계를 포함하는 방법에 의해 Akt3 또는 Akt2 발현을 검출하는 데 사용될 수 있다.

적합한 샘플로는 조직, 예컨대, 뇌, 유방, 난소, 폐, 결장, 췌장, 고환, 간, 근육 및 골 조직의 추출물 또는 상기 조직으로부터 유래된 신생물성 생장물로부터의 추출물을 포함한다. 다른 적합한 예로는 혈액 또는 뇨 샘플을 포함한다.

Akt3 또는 Akt2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 체액 또는 조직 중 Akt3 또는 Akt2 단백질의 발현을 검출하거나, 정량화하기 위한 것으로, 당업계의 숙련가에게 주지되어 있는 진단용 또는 예후용 방법 및 키트에서 사용될 수 있다. 상기 시험으로부터의 결과를 이용하여 암 및 다른 세포 운동 또는 세포 생존-매개 질환의 발병 또는 재발을 진단 또는 예측할 수 있거나, 약물 투여량 및 치료법의 효과를 평가할 수 있다.

항체는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해서 면역 특이 결합에 대해 검정될 수 있다. 사용될 수 있는 면역검정법으로는 기법, 예컨대, 웨스턴 블롯을 이용하는 경쟁 및 비경쟁적 검정 시스템, 면역조직화학법, 방사성면역검정법, ELISA, 샌드위치 면역검정법, 면역침전 검정법, 침강소 반응, 겔 확산 침강소 반응, 면역확산 검정법, 응집 검정법, 보체-고정 검정법, 면역방사성측정 검정법, 형광성 면역검정법 및 단백질 A 면역검정법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 검정법들은 당업계에서 통상적인 것이다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology , Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다) 참조).

본 발명에서 사용하기 위한 항체는 바람직하게 고체 지지체에 결합되어 있고/거나, 적합한 시약, 대조군, 설명서 등과 함께 적합한 용기 내에 키트로 패키징되어 있다.

다른 방법으로는 비록 대규모 스크리닝에는 덜 적합하기는 하지만, 2D-PAGE를 포함하며, 그러나, 이에 한정되지 않는다. 보다 최신 기법으로는 매트릭스 보조된 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분석법 (MALDI-TOF MS: matrix-assisted laser desorption ionization time of fiight mass spectrometry)을 포함한다. MALDI-TOF 분석법에서, 복합 혼합물 중 단백질을 고체 금속성 매트릭스에 부착시키고, 펄스형 레이저 빔을 이용하여 탈착시켜, 필드-프리(field-free) 비행관을 횡단하는 기상 이온을 발생시킨 후, 그의 질량 의존성 속도에 따라 분리한다. 개별 단백질 및 펩티드는 단백질 및 펩티드 서열 데이터베이스를 검색하는 정보 도구를 사용함으로써 확인될 수 있다. 표면-증강 레이저 탈착/이온화 비행 시간 MS (SELDI-TOF MS)는, 단백질이 화학적으로 변형된 고체 표면에 선택적으로 흡착되고, 불순물은 세척에 의해 제거되며, 에너지-흡수 매트릭스가 적용되고, 단백질은 레이저 탈착 질량 분석에 의해 확인되는, 친화성 기반 MS 방법이다.

SELDI-TOF-MS는 온전한 단백질 또는 특이 단백질의 단편의 외관/손실을 검출하는 데 사용될 수 있다. 추가로, SELDI-TOF-MS는 또한 화학기의 부가/제거에 의해 유발되는 질량의 변화에 기인하여 단백질의 번역 후 변형을 검출하는 데에도 사용될 수 있다. 따라서, 단일 잔기의 인산화는 포스페이트 기에 기인하여 80 Da의 질량 변동을 일으킬 것이다. 번역 후 변형에 기인할 수 있는 분자량에 관한 데이터베이스는 인터넷상에서 자유롭게 이용할 수 있다 (http:/www.abrf.org/indexxfrri/dm.home?avgniass==all). 또한, 특이 폴리펩티드는, 단백질의 번역 후 변형된 형태를 특이적으로 인식하거나 또는 모든 형태의 단백질을 동등하게 잘 인식할 수 있는 항체를 사용함으로써 SELDI-TOF-MS를 이용하여 친화도-기반 접근법에 의해 포획될 수 있다.

어레이

어레이 기술 및 다양한 기법 및 그와 관련된 적용은 일반적으로 다수의 교재 및 문서에 기술되어 있다. 이는 문헌 [Lemieux et al., 1998, Molecular Breeding 4:277-289]; [Schena and Davis. Parallel Analysis with Biological Chips , in PCR Methods Manual (eds. M. Innis, D. Gelfand, J. Sninsky)]; [Schena and Davis, 1999, Genes , Genomes and Chips . In DNA Microarrays : A Practical Approach (ed. M. Schena), Oxford University Press, Oxford, UK, 1999)]; [ The Chipping Forecast {Nature Genetics special issue]; [January 1999 Supplement)]; [Mark Schena (Ed.), Microarrays Biochip Technology , (Eaton Publishing Company)]; [Cortes, 2000, The Scientist 14(17):25]; [Gwynne and Page, Microarrays analysis : the next revolution in molecular biology , Science, 1999, August 6]; [Eakins and Chu, 1999, Trends in Biotechnology , 17:217-218] 및 또한 다양한 월드 와이드 웹 사이트의 것을 포함한다.

일반적으로 "한 실험당 하나의 유전자"에 대해 실험하는 것을 기초하며, 이로 인해 처리량이 낮고, 유전자 기능에 관한 "전모"를 이해할 수 없게 된다는, 분자 생물학의 전통적 방법이 가지는 단점을 어레이 기술을 통해서 극복할 수 있다. 현재, 어레이 기술의 주요 적용으로는 서열 (유전자/유전자 돌연변이) 확인 및 유전자의 발현 수준 (존재량) 측정을 포함한다. 유전자 발현 프로파일링은 임의적으로 프로테오믹스 기법과 함께 조합하여 어레이 기술을 이용할 수 있다 (문헌 [Celis et al., 2000, FEBS Lett , 480(1):2-16]; [Lockhart and Winzeler, 2000, Nature 405(6788):827-836]; [Khan et al., 1999, 20(2):223-9]). 어레이 기술의 다른 적용 또한 당업계에 공지되어 있는데; 예로는, 유전자 발견, 암 연구 (문헌 [Marx, 2000, Science 289: 1670-1672]; [Scherf et al., 2000, Nat Genet 24(3):236-44]; [Ross et al, 2000, Nat Genet 2000, 24(3):227-35]), SNP 분석 (문헌 [Wang et al, 1998, Science 280(5366): 1077-82]), 약물 발견, 파마코게놈믹스, 질환 진단 (예를 들어, 미세 유체역학 장치 이용: 문헌 [ Chemical & Engineering News , February 22, 1999, 77(8):27-36]), 독성 (문헌 [Rockett and Dix (2000), Xenobiotica 30(2): 155-77]; [Afshari et al, 1999, Cancer Res 59(19):4759-60]) 및 톡시코게노믹스 (기능적 게노믹스 및 분자 독성학의 하이브리드)가 있다. 톡시코게노믹스의 목적은 독물에 대한 독성 반응과, 상기 독물에 노출된 객체의 유전적 프로파일의 변화 사이의 상관 관계를 찾는 것이다 (문헌 [[Nuwaysir et al, 1999, Molecular Carcinogenesis 24: 153-159]).

본 발명과 관련하여, 어레이 기술은 예를 들어, Akt3 또는 Akt2 단백질 또는 mRNA의 발현 분석에서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 어레이 기술은 후보 화합물이 Akt3 활성에 미치는 효과를 검정하는 데 사용될 수 있다.

일반적으로, 라이브러리 또는 군의 멤버들을 공간적으로 이격시켜 놓음으로써 샘플의 임의의 라이브러리 또는 군을 정돈된 방식으로 어레이에 배열할 수 있다. 어레잉을 위해 적합한 라이브러리의 예로는 그 중에서도 특히 핵산 라이브러리 (DNA, cDNA, 올리고뉴클레오티드 라이브러리 등), 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질 라이브러리 뿐만 아니라, 임의의 분자를 포함하는 라이브러리, 예컨대, 리간드 라이브러리를 포함한다. 따라서, 본 명세서에서 "라이브러리"라고 언급될 경우, 문맥상 달리 언급되지 않는 한, 상기와 같은 언급은 어레이 형태의 라이브러리를 언급하는 것을 포함하는 것으로 이해하여야 한다.

샘플 (예컨대, 라이브러리의 멤버)은 일반적으로 샘플의 확산 및 혼합을 제한하기 위해 고체상, 바람직하게, 고체 기판에 고정 또는 고정화되어 있다. 바람직한 실시양태에서, DNA 결합 리간드의 라이브러리가 제조될 수 있다. 특히, 라이브러리는 막 및 비-다공성 기판, 예컨대, 플라스틱 및 유리를 비롯한, 실질적으로 평면인 고체상에 고정화될 수 있다. 추가로, 샘플은 바람직하게 색인 (즉, 참조 특정 샘플에의 접근)이 용이하게 이루어질 수 있도록 하는 방식으로 배열된다. 전형적으로, 샘플은 스폿으로서 격자 형태로 적용된다. 일반 검정용 시스템이 본 목적을 위해 적합화될 수 있다. 예를 들어, 한 웰에 다중 샘플을 포함하거나 또는 각 웰에 단일 샘플을 포함하는, 마이크로플레이트의 표면 상에 어레이를 고정화시킬 수 있다. 추가로, 고체 기판은 막, 예컨대, 니트로셀룰로스 또는 나일론 막 (예를 들어, 블롯팅 실험에 사용되는 막)일 수 있다. 대체 기판으로 유리 또는 실리카 기반 기판을 포함한다. 따라서, 샘플은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 전하 상호 작용에 의해 또는 웰의 벽 또는 바닥 또는 막의 표면에의 화학적 커플링에 의해 고정화된다. 배열 및 고정시키는 다른 수단, 예를 들어, 피펫팅, 드롭-터치(drop-touch), 압전 수단, 잉크젯 및 버블젯 기술, 정전기적 도포 등이 사용될 수 있다. 실리콘 기반 칩의 경우, 포토리소그래피를 이용하여 샘플을 칩 상에 배열하고 고정시킬 수 있다.

샘플을 고체 기판 상에 "스폿팅"시킴으로써 배열할 수 있다; 이는 수동으로 또는 샘플을 증착시키는 로봇 공학을 이용함으로써 수행될 수 있다. 일반적으로, 어레이는 마크로어레이 또는 마이크로어레이로 기술될 수 있는데, 그 둘의 차이는 샘플 스폿의 크기이다. 마크로어레이는 전형적으로 스폿 크기가 약 300 ㎛ 이상인 샘플을 함유하고, 이는 현 겔 및 블롯 스캐너에 의해 쉽게 영상화될 수 있다. 마이크로어레이 중 샘플의 스폿 크기는 전형적으로 직경이 200 ㎛ 미만이며, 이들 어레이는 보통 수천개의 스폿을 함유한다. 따라서, 마이크로어레이는 특수 로봇 공학 및 영상화 장치가 필요하며, 이는 주문 제작화를 필요로 할 수 있다. 기기 장치는 일반적으로 문헌 [Cortese, 2000, The Scientist 14(11):26]의 개요에 기술되어 있다.

DNA 분자의 고정화된 라이브러리를 제조하는 기법은 당업계에 기술되어 있다. 일반적으로, 대부분의 선행 기술 방법은 예를 들어, 고체 기판 상의 다양한 개별 위치에 서열을 다양한 순열로 구축하는 차폐 기법을 사용함으로써 단일 가닥 핵산 분자 라이브러리를 합성하는 방법을 기술하였다. US 5,837,832 (상기 특허는 그 내용이 본원에서 참조로 포함된다)에는 매우 큰 대규모의 통합 기술에 기반하여 실리콘 기판에 고정화된 DNA 어레이를 제조하는 개선된 방법이 기술되어 있다. 특히, US 5,837,832에는 본 발명의 고정화된 DNA 라이브를 제조하는 데 사용될 수 있는 기판 상에 공간적으로 정의된 위치에서 특이 프로브 세트를 합성하는, "타일링(tiling)"으로도 불리는 전략법이 기술되어 있다. US 5,837,832는 또한 사용될 수도 있는 종래 기법에 대한 참조를 제공한다.

펩티드 (또는 펩티드 모방체)의 어레이 또한 어레이 중 미리 정의된 개별 위치에 각각의 특유의 라이브러리 멤버 (예컨대, 독특한 펩티드 서열)을 배치하는 방식으로 표면 상에서 합성될 수 있다. 각 라이브러리 멤버의 동일성은 어레이 중의 그의 공간 위치에 의해 결정된다. 사전 결정된 분자 (예컨대, 표적 또는 프로브)와 반응성 라이브러리 멤버 사이의 결합 상호 작용이 발생하는 어레이 중의 위치를 측정함으로써 공간 위치에 기반하여 반응성 라이브러리 멤버의 서열을 확인할 수 있다. 이러한 방법은 US 5,143,854; WO 90/15070 및 WO 92/10092; 문헌 [Fodor et al, 1991, Science 251 :767]; [Dower and Fodor, 1991, Am . Rep . Med . Chem. 26:271]에 기술되어 있다.

검출을 지원하기 위해, 표적 및 프로브를 쉽게 검출될 수 있는 임의의 리포터, 예를 들어, 형광성, 생체발광성, 인광성, 방사성 리포터 등으로 표지화시킬 수 있다. 상기 리포터, 그의 검출, 표적/프로브에의 커플링 등은 상기 문헌 다른 곳에서도 논의되고 있다. 프로브 및 표적을 표적화시키는 것 또한 문헌 [Shalon et al, 1996, Genome Res 6(7):639-45]에서도 논의되어 있다.

DNA 어레이의 구체적인 예로는 하기를 포함한다:

포맷 I: 프로브 cDNA (길이 ~500 - ~5,000개의 염기)를 로봇 스폿팅을 이용하여 고체 표면, 예컨대, 유리에 고정화시키고, 표적 세트에 따로따로 또는 혼합물로 노출시킨다. 상기 방법은 스탠포드 대학(Stanford University)에서 개발된 것으로서 널리 알려져 있다 (문헌 [Ekins and Chu, 1999, Trends in Biotechnology , 17:217-218]).

포맷 II: 올리고뉴클레오티드 (~20 - ~25-mer 올리고) 또는 펩티드 핵산 (PNA) 프로브의 어레이를 계내 (칩 상에서)에서 합성하거나 또는 종래 합성법에 의해 합성한 후, 이어서 칩 상에 고정화시킴으로써 합성한다. 어레이를 표지화된 샘플 DNA에 노출시키고, 하이브리드화시키고, 상보성 서열의 동일성/존재를 측정한다. 상기 DNA 칩은 진칩(GeneChip)® 상표명하에 아피매트릭스 인코퍼레이티드(Affymetrix, Inc.)에 의해 시판되고 있다. 일부 상업적으로 이용가능한 마이크로어레이 포맷의 예는 예를 들어, 문헌 [Marshall and Hodgson, 1998, Nature Biotechnology 16(1):27-31]에 기재되어 있다.

데이터 분석 또한 어레이를 포함하는 실험의 중요한 한 부분이 된다. 마이크로어레이 실험으로부터 얻은 원시 데이터는 전형적으로 영상이며, 이는 유전자 발현 행렬표로 변환되어야 하는데, 여기서, 행은 예를 들어, 유전자를 나타내고, 열은 예를 들어, 다양한 샘플, 예컨대, 조직 또는 실험 조건을 나타내며, 각 세포의 개수가 특정 샘플 중 특정 유전자의 발현 수준의 특징을 나타낸다. 기본적인 생물학적 프로세스에 대한 임의의 정보를 도출하고자 하는 경우, 상기 행렬을 추가로 분석하여야 한다. 데이터 분석 방법 (감독 및 무감독 데이터 분석 뿐만 아니라, 생물 정보학적 접근법 포함)은 문헌 [Brazma and Vilo J, 2000, FEBS Lett 480(1): 17-24]에 개시되어 있다.

상기 개시되어 있는 바와 같이, 단백질, 폴리펩티드 등 또한 어레이에 고정화될 수 있다. 예를 들어, 항체는 단백질 칩을 사용하는 프로테옴의 마이크로어레이 분석법에서 사용될 수 있다 (문헌 [Borrebaeck CA, 2000, Immunol Today 21(8):379-82]). 폴리펩티드 어레이는 예를 들어, 문헌 [MacBeath and Schreiber, 2000, Science , 289(5485): 1760-1763]에 리뷰되어 있다.

제약 조성물

추가의 측면은 제약상 허용되는 희석제, 부형제 또는 담체와 함께 혼합된, Akt3 억제제 또는 상기 기술된 방법 중 임의의 방법에 따라 확인된 다른 작용제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따라 사용하기 위해, 상기 작용제는 하나 이상의 제약상 허용되는 담체 및 임의적으로 다른 치료학적 및/또는 예방학적 성분과 함께, 화합물 또는 그의 생리학상 허용되는 염, 에스테르 또는 다른 생리학상 기능적 유도체를 포함하는 제약 제제로서 제공될 수 있다. 담체(들)는 제제의 다른 성분들과 화합성이고, 그를 받는 수혜자에게 유해하지 않아야 한다는 점에서 허용되는 것이어야 한다. 제약 조성물은 의과 및 수의학과에서 의료용 및 수의과용으로 사용될 수 있다.

본원에 기술된 각종 상이한 형태의 제약 조성물에 대하여 적합한 부형제의 예는 문헌 ["Handbook of Pharmaceutical Excipients", 2nd Edition, (1994), Edited by A Wade and PJ Weller]에서 살펴볼 수 있다.

치료 용도의 허용되는 담체 또는 희석제는 제약 업계에 주지되어 있으며, 이는 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (AR Gennaro edit. 1985)]에 기술되어 있다.

적합한 담체의 예로는 락토스, 전분, 글루코스, 메틸 셀룰로스, 마그네슘 스테아레이트, 만닛톨, 소르비톨 등을 포함한다. 적합한 희석제의 예로는 에탄올, 글리세롤 및 물을 포함한다.

최선의 제약 담체, 부형제 또는 희석제는 의도하는 투여 경로 및 표준 제약 관행과 관련하여 선택될 수 있다. 제약 조성물은 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁화제(들), 코팅제(들), 가용화제(들), 완충제(들), 향미제(들), 계면활성제(들), 증점제(들), 보존제(들) (항산화제 포함) 등 및 제제가 의도되는 수혜자의 혈액과 등장성이 되게 하는 목적으로 포함되는 물질을 담체, 부형제 또는 희석제로서 또는 그 이외에 추가로 포함할 수 있다.

적합한 결합제의 예로는 전분, 젤라틴, 천연 당, 예컨대, 글루코스, 무수 락토스, 자유 유동 락토스, 베타-락토스, 옥수수 감미제, 천연 및 합성 검, 예컨대, 아카시아, 트라가칸트 또는 알긴산 나트륨, 카르복시메틸 셀룰로스 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.

적합한 윤활제로는 소듐 올레이트, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 염화나트륨 등을 포함한다.

보존제, 안정제, 염료 및 심지어 향미제까지도 제약 조성물 중에 제공될 수 있다. 보존제의 예로는 소듐 벤조에이트, 소르브산 및 p 히드록시벤조산의 에스테르를 포함한다. 항산화제 및 현탁화제 또한 사용될 수 있다.

제약 제제는 경구, 국소 (진피, 협측 및 설하 포함), 직장 또는 비경구 (피하, 피내, 근육내 및 정맥내), 비내 및 폐 투여, 예컨대, 흡입에 의한 투여에 적합한 것을 포함한다. 재제는 적절할 경우, 개별 투여 단위로 편리하게 제공될 수 있고, 약학 분야에 주지되어 있는 방법 중 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 모든 방법은 활성 화합물을 액체 담체와 또는 미분된 고체 담체와 또는 그 둘 모두와 함께 회합시킨 후, 이어서, 필요할 경우, 생성물을 원하는 제제로 성형화시키는 단계를 포함한다.

담체가 고체인, 경구 투여용으로 적합한 제약 제제는 가장 바람직하게는 각각 사전 결장된 양으로 활성제를 함유하는, 단위 투약 제제, 예컨대, 볼루스, 캡슐제 또는 정제로서 제공된다. 정제는 임의적으로 하나 이상의 부성분과 함께 압착 또는 성형시킴으로써 제조될 수 있다. 압착 정제는 임의적으로 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 활택제, 계면활성제 또는 분산제와 함께 혼합된 예컨대, 분제 또는 과립제와 같은, 자유 유동 형태의 활성제를 적합한 기기에서 압착시킴으로써 제조될 수 있다. 성형 정제는 불활성 액체 희석제와 함께 활성제를 성형화시킴으로써 제조될 수 있다. 정제는 임의적으로 코팅될 수 있고, 코팅되지 않은 경우, 이는 임의적으로 스코어링될 수 있다. 캡슐제는 활성제를 단독으로 또는 하나 이상의 부성분과 함께 캡슐제 쉘 내로 충전시킨 후, 이어서, 상기를 일반 방식으로 실링함으로써 제조될 수 있다. 카세제는 캡슐제와 유사하며, 여기서, 활성제는 임의의 부성분(들)과 함께 라이스 페이퍼 봉투에 시링된다. 활성제는 또한 예를 들어, 투여 전에 물 중에 현탁될 수 있거나 또는 음식물에 뿌릴 수 있는, 분산가능한 과립제로 제제화될 수 있다. 과립제는 예컨대, 사세에 패키징될 수 있다. 담체가 액체인, 경구 투여용으로 적합한 제제는 수성 또는 비수성 액체 중 액제로서 또는 현탁제로서 또는 수중유 액체 에멀젼으로서 제공될 수 있다.

경구 투여용 제제는 방출 조절형 투여 형태, 예컨대, 활성제가 적절한 방출 조절 매트릭스 중에서 제제화되거나 또는 적합한 방출 조절 필름으로 코팅된 정제를 포함한다. 상기 제제는 특히 예방학적 용도에 편리할 수 있다.

담체가 고체인, 직장 투여용으로 적합한 제약 제제는 가장 바람직하게는 단위 투여 좌제로 제공된다. 적합한 담체로는 코코아 버터 및 당업계에서 일반적으로 사용되는 다른 물질을 포함한다. 좌제는 편리하게는 활성제를 연화된 또는 용융된 담체(들)와 함께 혼합한 후, 냉각시키고, 몰등에서 성형화시킴으로써 형성될 수 있다.

비경구 투여용으로 적합한 제약 제제는 수성 또는 유지성 비히클 중의 활성제로 구성된, 멸균 액제 또는 현탁제를 포함한다.

주사용 제제는 볼루스 주사 또는 연속 주입용으로 적합화될 수 있다. 상기 제제는 편리하게는 사용이 요구될 때까지 제제 도입 후 실링되는 단위 투약 또는 다회 투약 용기로 제공된다. 별법으로, 활성제는 사용 전, 예컨대, 발열원 무함유 멸균 수로 구성되는 분제 형태일 수 있다.

활성 화합물은 또한 예컨대, 피하로 또는 근육내로 근육내 주사에 의해 또는 주입에 의해 투여될 수 있는 지속성 데포 제제로서 제제화될 수 있다. 데포 제제는 예를 들어, 적합한 중합체 또는 소수성 물질 또는 이온 교환 수지를 포함할 수 있다. 상기 지속성 제제는 특히 예방학적 용도에 편리하다.

구강을 통한 폐 투여용으로 적합한 제제는, 활성 화합물을 함유하고, 바람직하게는 직경 범위가 0.5 내지 7 ㎛인 입자가 수혜자의 기관지 수상 구조로 전달될 수 있도록 제공된다.

한가지 가능성으로서 상기와 같은 제제는 미분된 분말 형태로, 이는 흡입 장치에서 사용하기 위한 것으로, 적합하게는 예를 들어, 젤라틴으로 이루어진 관통가능한 캡슐제로 또는 별법으로, 활성제, 적합한 액체 또는 기체 추진제 및 임의적으로 다른 성분, 예컨대, 계면활성제 및/또는 고체 희석제를 포함하는 자가 추진 제제로서 편리하게 제공될 수 있다. 적합한 액체 추진제로는 프로판 및 클로로플루오르카본을 포함하고, 적합한 기체 추진제로는 이산화탄소를 포함한다. 활성제가 용액 또는 현탁액의 소적 형태로 분배되는 자가 추진 제제는 또한 사용될 수 있다.

상기 자가 추진 제제는 당업계에 공지되어 있는 것과 유사하고, 확립된 방법에 의해 제조될 수 있다. 적합하게, 이는 원하는 분무 특징을 가지는 자동 기능 밸브 또는 수동식 밸브가 장착된 용기에 제공된다: 밸브는 그의 매 작동시 고정된 부피, 예를 들어, 25 내지 100 ㎕씩 전달하는 계량형인 것이 이롭다.

추가의 가능성으로서 활성제는 가속 기류 또는 초음파 교반을 사용하여 흡입을 위한 미세 소적 미스트를 생성하게 하는 분무기 또는 네블라이저에서 사용하기 위한 액제 또는 현탁제 형태의 것일 수 있다.

비내 투여용으로 적합한 제제는 일반적으로 폐 투여용으로 상기 기술된 것과 유사한 제제를 포함한다. 분배될 때, 상기 제제는 바람직하게는 비강내 잔류될 수 있도록 하기 위해 입자 직경이 10 내지 200 ㎛ 범위여야 한다; 이는 적절하게는 적절한 입자 크기의 분제를 사용하거나, 적절한 밸브를 선택함으로써 달성될 수 있다. 다른 적합한 제제로는 코에 가깝게 유지되는 용기로부터 콧구멍을 통한 신속한 흡입에 의해 투여하기 위한 것으로 입자 직경이 20 내지 500 ㎛ 범위인 조분제(coarse powder) 및 수성 또는 오일성 용액 또는 현탁액 중 0.2 내지 5% w/v의 활성제를 포함하는 점비제를 포함한다.

제약상 허용되는 담체는 당업자에게 주지되어 있고, 0.1 M 및 바람직하게, 0.05 M 포스페이트 완충제 또는 0.8% 염수를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가로, 상기 제약상 허용되는 담체는 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼일 수 있다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대, 올리브 오일 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대, 에틸 올레이트가 있다. 수성 담체로는 물, 알콜/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액 (염수 및 완충처리된 매질)을 포함한다. 비경구용 비히클로는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화된 링거 또는 고정유를 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제, 예컨대, 항미생물제, 항산화제, 킬레이팅제, 불활성 가스 등 또한 존재할 수 있다.

국소 투여용으로 적합한 제제는 예를 들어, 겔제, 크림제 또는 연고제로 제공될 수 있다. 상기 제제는 예컨대, 상처 또는 궤양 부위 표면 상에 직접 도포되거나 또는 치료하고자 하는 부위에 및 그 위에 도포될 수 있는 적합한 지지체, 예컨대, 밴드, 거즈, 메쉬 등 위에 탑재되어 있어 상처 또는 궤양 부위에 도포될 수 있다.

치료하고자 하는 부위, 예컨대, 상처 또는 궤양 부위에 직접 분무하거나 또는 뿌릴 수 있는 액체 또는 분말 제제 또한 제공될 수 있다. 별법으로, 담체, 예컨대, 밴드, 거즈, 메쉬 등이 제제와 함께 분무되거나, 뿌려질 수 있고, 이어서 치료하고자 하는 부위에 도포된다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 활성 화합물(들)을 담체와 함께 예를 들어, 혼합하여 회합시키는 단계를 포함하는, 상기 기술된 바와 같은 제약 조성물 또는 수의학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

일반적으로, 제제는 활성제를 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 그 둘 모두와 함께 균일하고 밀접하게 회합시키고, 이어서, 필요할 경우, 생성물을 성형화시킴으로써 제공된다. 본 발명은 작용제를 제약상 또는 수의학상 허용되는 담체 또는 비히클과 함께 회합시키는 단계를 포함하는, 제약 조성물을 제조하는 방법으로까지 확장된다.

투여

본 발명의 제약 조성물은 직장, 비내, 기관지내, 국소 (협측 및 설하 포함), 질 또는 비경구 (피하, 근육내, 정맥내, 동맥내 및 피내 포함), 복강내 또는 경막내 투여에 맞게 적합화될 수 있다. 바람직하게, 제제는 경구적으로 투여되는 제제이다. 제제는 편리하게 단위 투여 형태로, 즉, 단위 용량 또는 단위 용량의 다중 또는 서브 단위를 함유하는 개별 분량의 형태로 제공될 수 있다. 일례로, 제제는 정제 형태 및 지속 방출형 캡슐제 형태일 수 있고, 이는 약학 분야에 주지되어 있는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에서 경구 투여용 제제는 각각 사전 결정된 양으로 활성제를 함유하는 개별 단위, 예컨대, 캡슐제, 연질 캡슐제, 점적제, 카세제, 환제 또는 정제로서; 분제 또는 과립제로서; 수성 액체 또는 비수성 액체 중 활성제의 액제, 에멀젼 또는 현탁제로서; 또는 수중유 액체 에멀젼 또는 유중수 액체 에멀젼으로서; 또는 볼루스 등으로서 제공될 수 있다. 바람직하게, 상기 조성물은 1 용량당 1 내지 250 mg 및 더욱 바람직하게, 10-100 mg의 활성 성분을 함유한다.

경구 투영용 조성물의 경우 (예컨대, 정제 및 캡슐제), "허용되는 담체"라는 용어는 비히클, 예컨대, 일반 부형제, 예컨대, 결합제, 예를 들어, 시럽, 아카시아, 젤라틴, 소르비톨, 트라가칸트, 폴리비닐피롤리돈 (포비돈), 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 히드록시프로필-메틸셀룰로스, 수크로스 및 전분; 충전제 및 담체, 예를 들어, 옥수수 전분, 젤라틴, 락토스, 수크로스, 미정질 셀룰로스, 카올린, 만닛톨, 이인산칼슘, 염화나트륨 및 알긴산; 및 윤활제, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 스테아레이트 및 다른 금속성 스테아레이트, 글리세롤 스테아레이트, 스테아린산, 실리콘 유체, 탈크 왁스, 오일 및 콜로이드성 실리카를 포함한다. 향미제, 예컨대, 페퍼민트, 윈터그린 오일, 체리 향미제 등도 또한 사용될 수 있다. 투여 형태가 쉽게 확인될 수 있게 만드는 착색제를 첨가하는 것이 바람직할 수도 있다. 정제는 또한 당업계에 주지된 방법에 의해 코팅될 수 있다.

정제는 임의적으로 하나 이상의 부성분과 함께 압착 또는 성형시킴으로써 제조될 수 있다. 압착 정제는 임의적으로 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 활택제, 계면활성제 또는 분산제와 함께 혼합된 예컨대, 분제 또는 과립제와 같은, 자유 유동 형태의 활성제를 적합한 기기에서 압착시킴으로써 제조될 수 있다. 성형 정제는 불활성 액체 희석제로 습윤화된 분말형 화합물 혼합물을 적합한 기기에서 성형화시킴으로써 제조될 수 있다. 정제는 임의적으로 코팅되거나, 스코어링될 수 있고, 활성제가 저속으로 방출되거나, 조절식으로 방출되도록 제제화될 수 있다.

경구 투여용으로 적합한 다른 제제로는 향미가 부가된 기재, 일반적으로, 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트 중 활성제를 포함하는 로젠지; 불활성 기재, 예컨대, 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로스 및 아카시아 중 활성제를 포함하는 향정; 및 적합한 액체 담체 중 활성제를 포함하는 구강세척제를 포함한다. 투여용으로 다른 형태의 것은 정맥내로, 동맥내로, 경막내로, 피하로, 피내로, 복강내로 또는 근육내로 주사될 수 있고, 멸균 또는 멸균가능한 용액으로부터 제조되는 액제 또는 에멀젼을 포함한다. 주사가능한 형태는 전형적으로 1 용량당 10 - 1,000 mg, 바람직하게, 10 - 250 mg의 활성 성분을 함유한다.

본 발명의 제약 조성물은 또한 좌제, 페서리, 현탁제, 에멀젼, 로션제, 연고제, 크림제, 겔제, 분무제, 액제 또는 살포성 분제 형태일 수 있다.

경피 투여의 대체 수단은 피부 패치의 사용에 의한 것이다. 예를 들어, 활성 성분은 폴리에틸렌 글리콜 또는 액체 파라핀의 수성 에멀젼으로 구성된 크림제 내에 혼입되어 있을 수 있다. 활성 성분은 또한 1 내지 10중량%의 농도로 필요에 따라 안정제 및 보존제와 함께 백랍 또는 백색 연질 파라핀 기재로 구성된 연고제로 혼입될 수 있다.

투여량

당업계의 숙련가는 과도한 실험 없이도 대상체에게 투여하기 위한 본 조성물 중 하나의 적절한 용량을 쉽게 결정할 수 있다. 전형적으로, 의사는 개별 환자에 가장 적합한 실제 투여량을 결정할 것이며, 이는 사용되는 특정 작용제의 활성, 대상 안정성 및 상기 작용제의 작용 기간, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별, 섭식, 투여 모드 및 횟수, 배출 속도, 약물 조합, 특정 질환의 중증도 및 개체가 받고 있는 요법을 비롯한, 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 본원에 개시된 투여량은 평균 사례의 일례이다. 물론 더 높거나 또는 더 낮은 투여량 범위가 합당한 개별 사례도 존재할 수 있으며, 이는 본 발명의 범주 내에 포함된다.

본 발명에 따라, Akt3을 억제시키기 위해 유효량의 작용제가 투여돌 수 있다. 물론, 상기 투여량은 작용제의 투여 유형에 따라 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, 급성 요법을 위한 "유효량"을 달성하기 위해서는 비경구 투여가 바람직하다. 비록 근육내 볼루스 주사 또한 유용하기는 하지만, 물 중 5% 덱스트로스 또는 생리 식염수 중 화합물 또는 적합한 부형제를 포함하는 유사한 제제의 정맥내 주입이 가장 효과적이다. 전형적으로, 비경구적 용량은 혈장 중 약물의 농도를, 키나제를 억제시키는 데 효과적인 농도로 유지시키는 방식으로 약 0.01 내지 약 100 mg/kg; 바람직하게, 0.1 내지 20 mg/kg이 될 것이다. 작용제는 약 0.4 내지 약 400 mg/kg/일의 총 1일 용량을 달성하기 위한 수준으로 1일 1 내지 4회 투여될 수 있다. 치료학상 효과적인 활성제의 정확한 양 및 상기 작용제를 최적으로 투여하는 경로는, 작용제의 혈중 수준과, 치료학적 효과를 달성하는 데 요구되는 농도를 비교함으로써 당업계의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

본 발명의 작용제는 또한 약물의 농도가 본원에 개시된 치료학적 지표 중 하나 이상을 달성하는 데 충분할 정도의 방식으로 환자에게 경구적으로 투여될 수 있다. 전형적으로, 작용제를 함유하는 제약 조성물은 환자 상태와 일관되는 방식으로 약 0.1 내지 약 50 mg/kg의 경구 용량으로 투여된다. 바람직하게, 경구 용량은 약 0.5 내지 약 20 mg/kg이 될 것이다.

본 발명의 작용제는 주어진 약리학적 효과를 달성하는 데 필요한 작용제의 농도를 측정하기 위해 수개의 생물학적 검정법 중 하나로 시험될 수 있다.

부품들로 된 키트

본 발명의 또 다른 측면은 상기 기술된 방법 중 임의의 방법에서 사용하기 위한 Akt3 억제제, 항-Akt3 항체, Akt3에 대한 핵산 프로브 또는 Akt3에 대한 1종 이상의 QPCR 프라이머를 포함하는 키트에 관한 것이다.

진단법 및 예후법

본 발명은 또한 특히 Akt3 억제제로 치료받는 개체에서 증식성 활성을 특징으로 하는 질환의 진단 또는 예후에서의 바이오마커로서의 Akt3의 용도에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 바, "예후 방법"이라는 용어는 질환, 특히, 암 진단을 받은 인간 또는 동물의 질환 진행에 관해 예측할 수 있는 방법을 의미한다. 더욱 구체적으로, 관심의 대상이 되는 암으로는 유방암, 폐암, 위암, 두부경부암, 결장직장암, 신장암, 췌장암, 자궁암, 간암, 방광암, 자궁내막암 및 전립선암 및 백혈병을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "진단 방법"이라는 용어는 인간 또는 동물 중의 또는 인간 또는 동물 상의 암의 존재 또는 암의 유형을 측정할 수 있는 방법을 의미한다. 적합하게는 마커를 통해서 Akt3 억제제를 이용하는 치료법의 성공 여부를 평가할 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 적합한 진단법은 본원에서 확인되는 유전자 중 임의의 것으로 지시되는 프로브, 예컨대, QPCR 프라이머, FISH 프로브 등을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "예후 방법"이라는 용어는 특정 작용제/요법을 이용하는 치료법에 대하여 대상체가 감수성일 수 있는지 또는 반응성일 수 있는지의 가능성을 측정할 수 있는 방법을 의미한다. 상기 예후 방법은 특정 치료 요법의 가능한 결과에 관한 정보, 예를 들어, 대상체가 상기 치료법에 대하여 반응할 가능성 및/또는 개체가 특정 치료 요법 범위 내에서 얼마나 공격적으로 치료받아야 하는지 및/또는 개체가 종래 치료 방법, 예컨대, 방사선/화학요법으로 얼마나 공격적으로 치료받아야 하는지에 관한 정보를 제공한다. 본원에 기술된 예후 방법은 개인 맞춤형 의학 분야에서 중요하게 적용된다.

따라서, 한 바람직한 실시양태는 개인 맞춤형 의학 적용에서 상기 기술된 바와 같은 바이오마커의 용도에 관한 것이다.

한 바람직한 실시양태에서, 개인 맞춤형 의학 적용은 대상체가 Akt3 또는 Axl 억제제를 이용하는 치료법에 대하여 감수성인지 또는 반응성인지 여부를 측정하기 위한 것이다.

한 바람직한 실시양태에서, 개인 맞춤형 의학 적용은 대상체가 특히 전이성 암을 앓을 가능성이 있는지 여부를 측정하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 대상체에서 상피에서 간엽으로의 이행 (EMT)의 발생을 검출하는 단계를 포함하는, 대상체가 Akt3 또는 Axl 억제제를 이용하는 치료법에 대하여 감수성인지 여부를 측정하는 예후 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 대상체가 Akt3 또는 Axl 억제제를 이용하는 치료법에 대하여 감수성인지 또는 반응성인지 여부를 측정하기 위한 예후 작용제에서 바이오마커로서의 Akt3의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 대상체에서 상피에서 간엽으로의 이행 (EMT)의 발생을 검출하는 단계를 포함하는, 대상체가 특히 전이성 암을 앓을 가능성이 있는지 여부를 측정하는 예후 방법에 관한 것이다.

본 명세서 전역에 걸쳐 바람직하게는 본원에 기술된 방법은 시험관내 또는 생체외에서 수행된다.

이제, 본 발명은 첨부된 도면을 참조로 하여 더욱 상세하게, 예시적으로 및 제한 없이 기술될 것이다. 다수의 등가 수정 및 변형은 본 개시내용이 제공될 때 당업자에게는 자명할 것이다. 따라서, 기술된 본 발명의 예시적인 실시양태는 제한적인 것이 아니라, 예시적인 것으로 간주된다. 기술된 실시양태는 본 발명의 정신 및 범주로부터 벗어남 없이 다양하게 변형될 수 있다. 본원에서 인용된 모든 문헌들은 명백하게 참조로 포함된다.

도 1은 EMT가 발생한 유방 상피 세포에 대한 실험 결과를 도시한 면역블롯의 사진 세트이다;
도 2는 유방암에서 EMT가 발생하였을 때, Akt3이 상향조절되며, 이러한 변화는 Axl 의존성이라는 것을 보여주는 것이다;
도 3은 3중 음성 유방암 세포에서 Axl 억제에 대한 반응으로 Akt1이 아닌, Akt3이 하향조절된다는 것을 보여주는 것이다;
도 4는 EMT 유도성 유방암 세포에서 Akt 이소폼의 수준을 측정하는 면역블롯의 사진 세트이다;
도 5는 유방암 세포 및 유방암 생검에서 Akt 1 및 2 mRNA가 아닌, Akt3이 EMT 및 줄기 유전자와 상관 관계가 있다는 것을 보여주는 것이다;
도 6은 Akt3 발현 억제가 유방 상피 세포에서 EMT 및 CSC 소질을 역전시킬 수 있다는 것을 보여주는 것이다;
도 7은 Akt 이소폼의 활성에 대한 겔 실험 사진이다;
도 8은 유방암 세포의 성장 연구 사진이다;
도 9는 유방암 세포의 맘모스피어 배양물의 사진 세트 및 그래프이다;
도 10은 구성적으로 활성인 Akt1이 아닌, 구성적으로 활성인 Akt3 (myr-Akt3)이 EMT를 유도할 수 있다는 것을 보여주는 것이다;
도 11은 구성적으로 활성인 Akt1이 아닌, 구성적으로 활성인 Akt3 (MyrAkt3)이 유방 상피 세포에서 EMT 및 CSC 소질을 유도할 수 있다는 것을 보여주는 것이다;
도 12는 구성적으로 활성인 Akt1을 발현하는 세포가 아닌, 구성적으로 활성인 Akt3을 발현하는 세포가 맘모스피어에서 성장할 수 있는 능력을 나타낸다는 것을 보여주는 것이다;
도 13은 구성적으로 활성인 Akt3을 발현하는 세포가 구성적으로 활성인 Akt1을 발현하는 세포보다 훨씬 더 높은 종양 형성능을 나타낸다는 것을 보여주는 것이다;
도 14는 유방암 세포의 성장 연구 사진이다;
도 15는 유방암 세포를 Akt 억제제로 처리한 실험으로부터 얻은 겔 영상이다; 그리고,
도 16은 Akt 이소폼의 활성을 연구한 실험으로부터 얻은 겔 사진이다;
도 17은 구성적으로 활성인 Akt1이 아닌, 구성적으로 활성인 Akt3이 세포 핵으로 국소화된다는 것을 보여주는 것이다;
도 18은 Akt3 및 Snail이 핵 분획에서 발견된다는 것을 보여주는 것이다;
도 19는 Akt3이 배양된 3중 음성 유방암 세포 및 원발성 인간 유방 상피 세포 중에서 핵으로 국소화된다는 것을 보여주는 것이다;
도 20은 Axl 키나제 발현 억제가 Akt3의 EMT 유도성 핵 국소화를 감소시킨다는 것을 보여주는 것이다;
도 21은 Axl 키나제 활성 억제가 Akt3의 핵 국소화를 억제시킨다는 것을 보여주는 것이다;
도 22는 Akt1 및 Akt3 키나제가 Snail 단백질을 직접 인산화시킬 수 있다는 것을 보여주는 것이다;
도 23은 MCF7, WM115 및 LNCaP 세포에서 포스포-Akt3의 특이 검출을 보여주는 것이다.

실시예

실시예 1 유방 상피 세포에서 EMT 가 발생하였을 때, Akt3 은 상향조절되는 반면, Akt2 는 하향조절되고, 이러한 변화는 Axl 의존성이다.

정상 유방 상피 세포에 대한 모델로서 사용되는 유방 상피 세포주인 MCF10A 세포 (아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection))를, 5% 말 혈청, 20 ng/mL EGF, 0.5 ㎍/mL 히드로코르티손, 100 ng/mL 콜레라 독소, 10 ㎍/mL 인슐린, 100 U/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))으로 보충된 DMEM/F12 배지 중에서 배양하였다. 본 실험에서는 EMT 유도 인자 Slug의 발현을 구동시키는 레트로바이러스 벡터 ("Slug") 및 Axl의 발현을 넉 다운시키는 shRNA의 발현을 구동시키는 레트로바이러스 벡터 ("Axl2")와 함께 MCF10A 세포를 사용하였다 (벡터들은 문헌 [Gjerdrum C et al. Axl is an essential epithelial-to-mesenchymal transition-induced regulator of breast cancer metastasis and patient survival. Proc Natl Acad Sci US A. 2010 Jan 19; 107(3): 1124-9]에 기술되어 있다). 간략하면, Axl shRNA는 레트로바이러스 벡터 RRI-Red/L087 (진뱅크(GenBank): EU424173)의 LTR 중 변형된 인간 U6 프로모터로부터 발현시킨 반면, BC012910 (오픈 바이오시스템즈((Open Biosystems)))으로부터의 인간 Slug cDNA 서열은 CRU5-IRES-GFP 레트로바이러스 벡터로 클로닝시켰다 (문헌 [Lorens JB, Jang Y, Rossi AB, Payan DG, Bogenberger JM (2000) Optimization of regulated LTR-mediated expression. Virology 272:7-15]). MCF10A 세포에 레트로바이러스 벡터 "Slug"만을 단독으로 또는 "Slug" 및 "Axl2" 레트로바이러스 벡터, 둘 모두를 조합하여 형질도입시켰다. 대조군 세포에는 어떤 벡터도 형질도입시키지 않았다. 프로테아제 억제제 (13457200; 로슈(Roche)) 및 0.2 mM PMSF로 보충된 RIPA 완충제 (1% (vol/vol) Nonidet P-40 (Nonidet P-40), 0.5% (wt/vol) 소듐 데옥시콜레이트 및 0.1% (wt/vol) SDS를 포함하는 PBS) 중에서 용해시켜 대조군 및 형질도입된 세포 집단으로부터 단백질 추출물을 제조하였다. 브래드포드(Bradford) 검정법 (바이오래드(BioRad))에 의해 단백질 농도를 측정하고, 50 ㎍의 전체 단백질을 SDS/PAGE의 각 웰에 로딩하였다. 표준 방법에 따라 겔 전개 및 면역블롯팅을 수행하였다. 사용된 항체는 마우스 모노클로날 항-인간 Axl (MAB154; R&D 시스템즈(R&D Systems)), AKT1 (셀 시그날링(Cell Signaling) #2967), Akt2 (셀 시그날링 #3063), Akt3 (밀리포어(Millipore) #1586912), pAKT (Ser473, 셀 시그날링 2971), α-액틴 (시그마-알드리치), pERK (셀 시그날링 #4695)이었다. pAKT 항체는 Akt1 중 Ser473에 상응하는 아미노산에서 인산화된 경우에 Akt1, Akt2 및 Akt3과 반응하였다.

본 실험의 결과는 도 1에 제시되어 있다. 예상대로, pAKT는 EMT가 발생한 세포에서 증가되어 있었고 (대조군, Slug 래인과 비교), 이러한 증가는, EMT가 Axl 넉 다운에 의해 차단되었을 때에 차단되었다 (대조군, Slug, Axl2-Slug 래인과 비교). 예상 밖으로, 상기 유방 상피 세포에서 EMT가 발생하였을 때, Akt3 발현이 강력하게 상향조절되었다. 그에 반해, Akt1 발현은 일정하게 유지되었고, Akt2는 하향조절되었다. EMT 유도성 세포에서 Axl을 차단시킨 경우 (Axl2-Slug 래인)에도 또한 Akt 이소폼의 전환은 차단되었고, 이는 Akt2에서 Akt3으로의 발현 변화는 Axl에 의존한다는 것을 나타낸다. 활성화된 (인산화된) Akt (pAkt)는 Akt1 및 2 수준이 아닌, Akt3 수준을 따라 진행되었다는 점에 주목하여야 하며, 이는 상기 세포에서 주요 포스포-Akt 이소폼이 Akt3일 수 있다는 것을 제안한다. 이는 실시예 4에서 확인할 수 있다.

실시예 2 형질전환된 유방암 세포에서 EMT 가 발생하였을 때, Akt3 은 상향조절되고, 이러한 변화는 Axl 의존성이다.

실험적으로 형질전환된 유방암 세포주인 HMLE 및 HMLER 세포 (문헌 [Elenbaas B, Spirio L, and Weinberg RA. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary mammary epithelial cells. Genes Dev. 2001 Jan 1;15(1):50-65])를, 5 ng/mL EGF, 10 ㎍/mL 인슐린, 0.5 ㎍/mL 히드로코르티손, 100 U/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 (시그마-알드리치)로 보충된 MEGM (론자)/DMEMF12 (시그마-알드리치) 배지 중에서 배양하였다. 세포에 레트로바이러스 벡터 "Slug," "Axl2," 대조군 루시퍼라제 shRNA (ctr)를 또는 실시예 1에 기술된 바와 같이, "Slug" 및 "Axl2" 레트로바이러스 벡터, 둘 모두의 조합을 형질도입시켰다. 단백질 추출물 제조, 겔 전개, 면역블롯팅 및 막 프로빙은 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다.

본 실험의 결과는 도 2에 제시되어 있다. 실시예 1에서 나타난 바와 같이, 상기 유방 상피 세포에서 EMT가 발생하였을 때, Akt3 발현은 강력하게 상향조절되었다 (대조군, Slug 래인과 비교). HMLE 세포 (좌측): 활성화된 (인산화된) Akt (pAkt)는 Akt1 수준이 아닌 Akt3 수준을 따라 진행되었다. HMLER 세포 (우측): EMT 유도성 세포에서 Axl을 차단시킨 경우 (Axl2-Slug 래인)에도 또한 Akt3 발현은 차단되었고, 이는 Akt3 발현 수준이 Axl에 의존한다는 것을 나타낸다.

실시예 3 3중 음성 유방암 세포에서 Axl 억제에 대한 반응으로 Akt1 이 아닌, Akt3이 하향조절된다.

3중 음성 유방암 세포주인 MDA-MB231 세포 (아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션)를 10% 우태아 혈청, 100 U/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 (시그마-알드리치)으로 보충된 F12 배지 중에서 배양하였다. 실시예 1 및 실시예 2에 기술되어 있는 바와 같이, 세포에 shAxl을 발현하는 레트로바이러스 레트로바이러스 구축물 ("Axl2") 또는 대조군 루시퍼라제 shRNA ("대조군")를 형질도입시켰다. 단백질 추출물 제조, 겔 전개, 면역블롯팅 및 막 프로빙은 실시예 1 및 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행하였다.

결과는 도 3에 제시되어 있다. MDA-MB231 세포는 Axl, Akt1 및 Akt3을 발현하였다 ("대조군" 래인 참조). 실시예 1 및 실시예 2에 제시되어 있는 데이터와 같이, Axl ("Axl2")을 차단시킨 경우, Akt3 발현도 또한 차단되었지만, Akt1 발현에는 어떤 유의적인 효과도 미치지 못했으며, 이는 Akt1이 아닌 Akt3 발현 수준이 Axl에 의존한다는 것을 나타낸다.

실시예 4 Akt3 은 ( TGF β 처리에 의해) EMT 가 발생하도록 유도된 MCF10A 세포에서 주요 P- Akt 이소폼을 나타낸다.

MCF10A 세포을 4일 동안 TGFβ (10 ng/ml)로 처리하였다. 이어서, 세포를, NP40 세포 용해용 완충제 (40 mM HepesNAOH, 75 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% NP40, 포스파타제 억제제 칵테일 정제, 프로테아제 억제제 칵테일 정제 (로슈))를 이용하여 용해시키고, 플레이트로부터 스크랩핑하고, 4℃에서 30 분 동안 회전시키고, 13,000 rpm으로 10 분 동안 원심분리시키고, 상청액을 수거하였다. 면역침강을 위해, Akt1 (2H10, 셀 시그날링 #2967), Akt2 (셀 시그날링 #3063), Akt3 (밀리포어 # 07-383) 및 대조군 IgG (애브캄(Abcam)) 항체 (1 ㎍/용해물)를 용해물에 첨가하고, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 다음날, 용해용 완충제 중의 사전 차단된 단백질-G 비드 (GE 헬쓰케어(GE Healthcare))를 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 결합할 수 있도록 하였다. 이어서, 비드를 3회에 걸쳐 세척하고 (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% NP40), SDS-PAGE 로딩 완충제 중에서 비등시켜 단백질을 용리시켰다. SDS/PAGE 전개 및 면역블롯팅은 표준 방법에 따라 수행하였다. 막을 pAktS473 (셀 시그날링 #9271) 및 범-Akt (셀 시그날링 #9272) 항체로 프로빙하였다.

도 4에 제시되어 있는 바와 같이, 본 데이터를 통해 포스포-Akt3이 EMT 유도성 MCF10A 세포에서 주요 pAkt 이소폼을 나타낸다는 것이 입증되었다. 어떤 포스포-Akt1도 검출되지 않았다. 이는 Akt1이 Akt의 효과의 원인이 된다는 것을 제안하였던 종래 연구에 비추어 볼 때 예상하지 못했던 결과였다.

실시예 5 유방암 세포 및 유방암 생검에서 Akt 1 및 2 mRNA 가 아닌, Akt3 이 EMT 및 줄기 유전자와 상관 관계가 있다

(문헌 [Kilpinen S, Autio R, Ojala K, Iljin K, Bucher E, Sara H, Pisto T, Saarela M, Skotheim RI, Bjorkman M, Mpindi JP, Haapa-Paananen S, Vainio P, Edgren H, Wolf M, Astola J, Nees M, Hautaniemi S, Kallioniemi O. Systematic bioinformatic analysis of expression levels of 17,330 human genes across 9,783 samples from 175 types of healthy and pathological tissues. Genome Biol. 2008; 9(9):R139]에) 기술되어 있는 바와 같이 공개 및 GEO 제출된 아피매트릭스 데이터로부터 유방암 세포주 및 인간 유방암 생검 샘플 (암, 정상)의 발현 분석을 수행하였다. 양의 상관 관계는 플러스 기호 (+)로 표시되고, 보다 짙은 회색 빛깔을 나타낼수록 더욱 강력한 양의 상관 관계를 나타내며, 신뢰도가 높을수록 별표 (*)의 개수는 증가한다. 유사하게, 음의 상관 관계는 마이너스 기호 (-)로 표시되고, 보다 짙은 회색 빛깔을 나타낼수록 더욱 강력한 음의 상관 관계를 나타내며, 신뢰도가 높을수록 별표 (*)의 개수는 증가한다.

결과는 도 5에 제시되어 있다. Akt1 및 Akt2가 아닌, Akt3이 유방암 세포주 및 유방암 생검에서 EMT 및 줄기 마커와 강력한 상관 관계를 보였다.

실시예 6 Akt3 넉 다운이 유방 상피 세포에서 EMT 및 CSC 소질을 역전시킬 수 있다

MCF10A 세포 및 MDA-MB 231 세포를 실시예 1 및 3에 기술되어 있는 바와 같이 배양하였다. 실시예 1에 기술되어 있는 바와 같이, MCF10a에 EMT 구동 인자 "Slug" (Slug/대조군)를 형질도입시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라 하이퍼펙트(HiPerFect) 형질감염 시약 (퀴아젠)을 사용하여 Akt3의 siRNA-매개 침묵화를 수행하고, 세포를 2-3일 동안 배양하였다. Akt3에 대해 어닐링된 siRNA ("siAKT3"; HsAkt3_2 HP) 및 GAPDH ("대조군"; Hs_GAPDH_3)를 최종 농도 60 nM로 사용하였다 (이들 모두 퀴아젠으로부터 입수). 래트 항-인간 비멘틴 (MAB2105; R&D 시스템즈)을 제외한, SDS/PAGE, 면역블롯팅 및 항체는 실시예 1에 기술되어 있는 바와 같았다. (문헌 [Gjerdrum C, Tiron C, Hoiby T, Stefansson I, Haugen H, Sandal T, Collett K, Li S, McCormack E, Gjertsen BT, Micklem DR, Akslen LA, Glackin C, Lorens JB. Axl is an essential epithelial-to-mesenchymal transition-induced regulator of breast cancer metastasis and patient survival. Proc Natl Acad Sci US A. 2010 Jan 19; 107(3): 1124-9]에) 기술되어 있는 바와 같이 3D 마트리겔 실험을 수행하였다. 니콘(Nikon) TE2000 현미경 (니콘)을 이용하여 형광 현미경법 (DAPI 핵 염색)에 의해 세포를 시각화하였다.

도 6에 제시되어 있는 바와 같이, 본 데이터에 따르면, 3D 마트리겔에서 간엽 마커 비멘틴의 하향조절 및 침습성 성장 성장의 억제에 의해 나타난 바와 같이, Akt3 넉 다운이 2개의 상이한 유방 상피 세포에서 EMT CSC 소질을 역전시킬 수 있다.

실시예 7 구성적으로 활성인 Akt1 이 아닌, 구성적으로 활성인 Akt3 이 EMT 를 활성화시킬 수 있고, EMT 조절 인자를 활성화시킬 수 있다.

토끼 항-인간 N-카드헤린 (ab18203; 애브캄), 토끼 항-인간 E카드헤린 (24E10; 셀 시그날링), 토끼 항-인간 β-카테닌 (L54E2; 셀 시그날링), 마우스 항-인간 Twist (Twist2Cla; 애브캄)를 제외한, SDS/PAGE, 면역블롯팅 및 항체는 실시예 1 및 6에 기술되어 있는 바와 같았다.

실시예 1에 기술되어 있는 바와 같이 배양된 MCF10A 세포에 공 벡터 (실시예 1에 기술되어 있는 CRU5-IRES-GFP) 또는 구성적으로 활성인 미리스틸화된 형태의 Akt1 (myrAkt1) 또는 구성적으로 활성인 미리스틸화된 형태의 Akt3 (myrAkt3)을 보유하는 CRU5-IRES-GFP 벡터를 형질도입시켰다. src 미리스틸화 서열의 부가에 의해 막으로 지시되었을 때, Akt는 구성적으로 활성을 띠게 되었다 (문헌 [Barthel A, Kohn AD, Luo Y, Roth RA. A constitutively active version of the Ser/Thr kinase Akt induces production of the ob gene product, leptin, in 3T3-L1 adipocytes. Endocrinology. 1997 Aug; 138(8):3559-62]). MCF10A 세포에 레트로바이러스 벡터 "myr-AKT1" 또는 레트로바이러스 벡터 "myr-AKT3"을 형질도입시켰다. 대조군 세포 ("wt")에는 어떤 벡터도 형질도입시키지 않았다. 상기 세포주로부터 추출된 단백질의 면역블롯을 상피 및 간엽 세포 운명 및 EMT와 관련된 마커 패널로 프로빙하였다.

도 7에 제시되어 있는 바와 같이, 본 데이터에 따르면, 간엽 마커 (N-카드헤린, 비멘틴)의 상향조절 및 상피 마커 (E- 카드헤린, b-카테닌)의 상실에 의해 나타난 바와 같이, 예상 밖으로 구성적으로 활성인 Akt1이 아닌 구성적으로 활성인 Akt3이 EMT를 활성화시킬 수 있다. myr-Akt3이 발현되면 또한 EMT 조절 인자 Snail 및 Axl의 활성화 및 Akt의 인산화가 일어나게 되면, 이는 양성 피드백 루프가 존재한다는 것을 제안한다.

실시예 8 구성적으로 활성인 Akt1 이 아닌, 구성적으로 활성인 Akt3 (MyrAkt3)이 유방 상피 세포에서 EMT 및 CSC 소질을 유도할 수 있다

본 실험에서는 구성적으로 활성인 Akt1의 발현을 구동시키는 레트로바이러스 벡터 ("myr-AKT1") 및 구성적으로 활성인 Akt3의 발현을 구동시키는 레트로바이러스 벡터 ("myr-AKT3")과 함께 MCF10A 세포를 사용하였다. 실시예 6에 기술되어 있는 바와 같이 3D 마트리겔 실험을 수행하였다. 니콘 TE2000 현미경 (니콘)을 이용하여 위상차 및 형광 현미경법 (DAPI 핵 염색)에 의해 명시된 배율로 세포를 시각화하였다.

결과는 도 8에 제시되어 있다. 본 결과, 구성적으로 활성인 Akt1이 아닌, 구성적으로 활성인 Akt3이 유방 상피 세포에서 EMT 및 CSC 소질을 유도할 수 있는 것으로 나타났다 (2D 배양물에서 섬유아세포성(fibroblastoid) 세포 성장 및 3D 마트리겔에서 침습성, 성상 성장).

실시예 9 구성적으로 활성인 Akt1 을 발현하는 세포가 아닌, 구성적으로 활성인 Akt3 을 발현하는 세포가 맘모스피어에서 성장할 수 있는 능력을 나타낸다

사용된 세포주는 실시예 1에 기술되어 있는 것과 같았다. MCF10A 세포의 맘모스피어 배양은 (문헌 [Dontu G, Abdallah WM, Foley JM, Jackson KW, Clarke MF, Kawamura MJ, Wicha MS. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 2003 May 15; 17(10): 1253-70]에) 기술되어 있는 바와 같이 수행하였다. 간략하면, 단일 세포를 웰당 총 30,000개의 세포를 20,000개의 생존가능한 세포/ml로 35 mm 초저 부착 플레이트 (코닝(Corning: 미국), 카탈로그 번호 3471) 상에 플레이팅하였다. 맘모스피어를 10일 동안 배양하고, 영상화하고, 이미지J (http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html)를 이용하여 맘모스피어를 정량화하였다. 통계학적 분석은 스튜던츠 t 검정에 기초하여 이루어졌다. 결과는 도 9에 제시되어 있다.

다수의 세포로 구성된 큰 구조물인 맘모스피어를 형성할 수 있는 능력이 암 줄기 세포의 소질인 것으로 간주된다. 구성적으로 활성인 Akt3을 발현하는 MCF10A 세포가 맘모스피어로서 형성될 수 있었다. 그에 반해, 구성적으로 활성인 Akt1을 발현하는 세포 및 비처리된 MCF10A 세포는 맘모스피어를 형성하지 못하였다. 따라서, 맘모스피어를 형성할 수 있는 능력은 Akt1보다는 Akt3을 통한 신호전달에 의해 유발된다.

실시예 10 구성적으로 활성인 Akt1 이 아닌, 구성적으로 활성인 Akt3 ( myr -Akt3)이 EMT 를 유도할 수 있고, 이로써, EMT / 간엽 마커 ( Axl , 비멘틴 , N- 카드헤린 )는 상승되고 , 상피 마커 (E- 카드헤린 )는 상실하게 된다.

실시예 8에 기술된 바와 같이 myrAkt1 또는 myrAkt3을 발현하는 레트로바이러스 벡터를 HMLER 세포에 형질도입시키고, 실시예 7에 기술된 바와 같이 Axl 수용체 단백질, 상피 (E-카드헤린) 및 간엽 (비멘틴, N-카드헤린) 마커 발현, Akt1/3 및 pAkt 수준에 대해 분석하였다.

결과는 도 10에 제시되어 있다. 구성적으로 활성인 Akt1이 아닌, 구성적으로 활성인 Akt3이 EMT를 활성화시킬 수 있고, EMT 조절 인자를 활성화시킬 수 있다.

실시예 11 구성적으로 활성인 Akt1 이 아닌, 구성적으로 활성인 Akt3 (MyrAkt3)이 유방 상피 세포에서 EMT 및 CSC 소질을 유도할 수 있다.

myrAkt1, myrAkt3 또는 공 벡터를 발현하는 HMLER 세포를 2D (좌측) 및 3D 마트리겔 (우측)에서 성장시키고, 실시예 8에 기술된 바와 같이 위상차 현미경법에 의해 시각화하였다.

결과는 도 11에 제시되어 있다.

HMLER 세포는 전형적으로 조직 배양 플라스틱 상에서 성장시켰을 때, 상피 형태 (둥근 세포로 된 시트) (좌측), 마트리겔 중 포매되어 성장시켰을 때에는 침습성을 띠지 않았다 (우측). 이러한 데이터는 구성적으로 활성인 Akt1이 아닌, 구성적으로 활성인 Akt3이 형질전환된 유방 상피 HMLER 세포에서 EMT 및 CSC 소질을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다 (2D 배양물에서 섬유아세포성 세포 성장 및 3D 마트리겔에서 침습성, 성상 성장).

실시예 12 구성적으로 활성인 Akt1 을 발현하는 세포가 아닌, 구성적으로 활성인 Akt3 을 발현하는 세포가 맘모스피어에서 성장할 수 있는 능력을 나타낸다

myrAkt1, myrAkt3을 발현하는 HMLER 세포를 맘모스피어 배양물 중에서 성장시키고, 실시예 9에 기술된 바와 같이 정량화하였다.

결과는 도 12에 제시되어 있다.

종양구 형성은 암 줄기 세포의 특징이다. HMLER 세포는 정상적으로는 맘모스피어를 형성하지 못하며, 이는 암 줄기 세포의 특징이 없다는 것을 나타낸다. 활성화된 Akt1 (myrAkt1)을 코딩하는 벡터가 아닌, 활성화된 Akt3 (myrAkt3)을 코딩하는 벡터로 형질감염시킴으로써 맘모스피어를 형성할 수 있는 능력을 부여하였다.

실시예 13 구성적으로 활성인 Akt3 을 발현하는 세포가 구성적으로 활성인 Akt1을 발현하는 세포보다 훨씬 더 높은 종양 형성능을 나타낸다

실시예 10에 기술된 바와 같이, 레트로바이러스 벡터 "HMLER/벡터," "HMLER/myrAkt1" 및 "HMLER/myrAkt3"이 형질도입된 HMLER 세포를 (문헌 [Mani SA, Guo W, Liao MJ, Eaton EN, Ayyanan A, Zhou AY, Brooks M, Reinhard F, Zhang CC, Shipitsin M, Campbell LL, Polyak K, Brisken C, Yang J, Weinberg RA. The epithelial- mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 2008 May 16; 133(4):704-15]에) 기술된 바와 같이, 한계 희석법으로 숙주 마우스에 주사하였다.

결과는 도 13에 제시되어 있다. 본 데이터에서는 대조군 세포 또는 구성적으로 활성인 Akt1을 발현하는 세포와 비교하였을 때, 구성적으로 활성인 Akt3 (HMLER/myrAkt3)을 발현하는 것이 HMLER 세포 종양 형성능을 유의적으로 증가시키는 것으로 나타났다 (시딩된 1,000개의 세포에서 형성된 종양 개수 참조).

실시예 14 구성적으로 활성인 Akt1 이 아닌 구성적으로 활성인 Akt3 및 Slug 이 간엽 표현형 및 침습성 성장을 유도할 수 있고; Akt 억제제가 간엽 표현형을 억 제시킨다.

MCF10A 세포를 배양하고, 도 1 및 3에 제시되어 있는 바와 같이 myrAkt1, MyrAkt3 또는 Slug를 발현하는 레트로바이러스 구축물을 형질도입시켰다. 세포를 명시된 바와 같이 12시간 동안 Akt 억제제 LY294002 (10 μM, 셀 시그날링 테크놀로지(Cell Signaling Technology), 카탈로그 번호 9901) 및 Akt VIII (10 μM, 머크(Merck), 카탈로그 번호 124018)으로 처리하였다. 이어서, 세포를 위상차 현미경법에 의해 명시된 배율로 시각화하거나, 실시예 3에 기술된 바와 같이, 침습성 정장을 위해 3D 마트리겔에 시딩하였다.

결과는 도 14에 제시되어 있다.

본 결과를 통해, 구성적으로 활성인 Akt1이 아닌, 구성적으로 활성인 Akt3 및 Slug가 2D 성장에서 간엽 표현형을 유도할 수 있고, 3D 성장 마트리겔에서 침습성 성장을 유도할 수 있다는 것이 밝혀졌다. Akt 억제제 LY-294002 및 AKT VIII은 2D 및 3D 성장에서 Akt3에 의해 유도된 간엽 표현형 뿐만 아니라, Slug에 의해 유도된 간엽/침습성 표현형도 억제시켰으며, 이는 Akt3이 Slug 신호전달을 위해 요구된다는 것을 제안하는 것이다.

실시예 15 구성적으로 활성인 Akt1 이 아닌, 구성적으로 활성인 Akt3 및 Slug 가 EMT 를 활성화시킬 수 있고, Akt 억제제가 간엽 표현형을 부분적으로 역전시킬 수 있다.

MCF10A 세포를 배양하고, 도 1 및 3에 제시되어 있는 바와 같이 myrAkt1, MyrAkt3 또는 Slug를 발현하는 레트로바이러스 구축물을 형질도입시켰다. 세포를 도 6에 제시되어 있는 바와 같이 Akt 억제제로 처리하였다. SDS/PAGE, 면역블롯팅 및 항체는 실시예 1 및 4에 기술되어 있는 바와 같았다.

결과는 도 15에 제시되어 있다.

본 결과에 따르면, 마커 N-카드헤린, 비멘틴의 상향조절 및 상피 마커 E-카드헤린의 상실에 의해 나타난 바와 같이, 구성적으로 활성인 Akt1이 아닌, 구성적으로 활성인 Akt3 및 Slug가 EMT를 활성화시킬 수 있다. 간엽 마커 N-카드헤린 및 비멘틴의 유의적인 감소 (좌측)에 의해 나타난 바와 같이, Akt 억제제인 AKT VIII (좌측)은 Akt 활성화 (pAkt)를 완전하게 억제시킬 수 있고, 간엽 표현형을 부분적으로 역전시킬 수 있다. 비멘틴 발현 감소로 나타난 바와 같이, Akt 억제제인 LY-294002는 유사하게 EMT를 부분적으로 억제시키는 것으로 나타났다. 어떤 억제제도 상피 마커 E-카드헤린의 재발현을 유도하지 않았다.

실시예 16 (H- RasV12 또는 Slug 의 발현에 의해) EMT 가 발생되도록 유도된 MCF10A 세포에서 Akt1 의 침묵화가 아닌, Akt3 의 RNAi 침묵화가 P- Akt 수준을 유의적으로 감소시킨다

MCF10A 세포에 EMT 유도 인자인 Slug 및 H-RasV12를 코딩하는 레트로바이러스 벡터를 형질도입시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라 하이퍼펙트 형질감염 시약 (퀴아젠)을 사용하여 상기 세포로부터 소형 간섭 RNA-매개 침묵화를 수행하고, 세포를 3일 동안 배양하였다. Akt1에 대해 어닐링된 siRNA (Hs_AKT1-5 플렉시튜브(Flexitube) siRNA), Akt3에 대해 어닐링된 siRNA Akt3 (Hs_AKT3_2 HP siRNA) 및 대조군으로서의 GAPDH (Hs_GAPDH_3 HP 입증된 siRNA) (이들 모두 퀴아젠으로부터 입수)를 최종 농도 60 nM로 사용하였다. 침묵화시킨 후, 세포를 SDS-PAGE 로딩 완충제로 용해시키고, 초음파처리하고, 비등시켰다. 용해물에 대해 웨스턴 블롯 분석을 수행하고, 도 2에 제시되어 있는 바와 같이 Akt1, Akt3, pAkt Ser473 항체 및 α-튜불린 12g10 (Hybridoma Bank; http://dshb .biology.uiowa.edu/12G10-anti-alpha-tubulin)을 사용하여 블롯을 프로빙시켰다.

본 결과는 도 16에 제시되어 있다. 본 결과에 따르면, EMT가 발생되도록 유도된 세포에서 Akt1의 수준을 넉 다운시키는 것이 아니라, Akt3의 수준을 넉 다운시키는 것이 전체 P-Akt 수준을 유의적으로 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다. 이는 포스포-Akt3이 EMT 유도성 MCF10A 세포에서 주요 pAkt 이소폼을 나타낸다는 것을 제안한다.

실시예 17 구성적으로 활성인 Akt1 이 아닌, 구성적으로 활성인 Akt3 이 세포 핵으로 국소화된다

실시예 1에 기술되어 있는 바와 같이 HMLER 세포를 배양하고, 항-히스톤 3 (셀 시그날링, 히스톤 H3 항체 #9715)을 제외하면, SDS/PAGE, 면역블롯팅 및 항체는 실시예 1에 기술되어 있는 바와 같았다. 제조사의 설명서에 따라 핵 추출을 수행하였다 (유니버살 마그네틱 코-IP 키트(Universal Magnetic Co-IP Kit), 액티브 모티프(Active Motif), 54002). 제조사에 의해 기술된 방법 (셀 시그날링, 면역형광 일반 프로토콜)에 의해 실시예 1의 항체를 사용하여 고정화된 세포의 구성적으로 활성인 Akt1 및 Akt3의 면역형광 염색을 수행하였다.

본 결과는 도 17에 제시되어 있다. 활성화된 Akt3 (MyrAkt3)은 HMLER 세포에서 핵 분획으로 국소화되었다 (상단). 면역형광 염색 결과, myrAkt3의 경우, 핵/핵 주변이 염색된 것으로 나타났고, myrAkt1의 경우, 핵으로부터 배제된 것으로 나타났다.

실시예 18 Akt3 및 전사 인자 Snail 은 배양된 3중 음성 유방암 세포의 핵 분획에서 압도적으로 발견된다. 튜뷸린 (세포질) 및 라민 (핵) 마커를 통해 성공적인 분별화를 확인할 수 있다.

실시예 3에 기술되어 있는 바와 같이 MDA-MB 231 세포를 배양하였다. 산타 크루즈(Santa Cruz), sc-7292를 제외하면, SDS/PAGE, 면역블롯팅 및 항체는 실시예 1 및 6에 기술된 바와 같았다. 세포질 및 핵 단백질을 실시예 17에 기술된 바와 같이 단리시켰다.

본 실험 결과는 도 18에 제시되어 있다. 예상대로, 전사 인자 Snail은 핵에서 발견되었다. 예상 밖으로, Akt3 또한 거의 독점적으로 핵에서 발견되었다.

실시예 19 Akt3 은 배양된 3중 음성 유방암 세포 및 원발성 인간 유방 상피 세포에서 핵으로 국소화된다

MDA-MB-231 세포를 실시예 3에 기술되어 있는 바와 같이 배양하였다. 원발성 인간 유방 상피 세포 (HMEC)를 (문헌 [Garbe JC, Pepin F, Pelissier FA, Sputova K, Fridriksdottir AJ, Guo DE, Villadsen R, Park M, Petersen OW, Borowsky AD, Stampfer MR, Labarge MA. Accumulation of multipotent progenitors with a basal differentiation bias during aging of huamn mammary epithelia. Cancer Res. 2012 Jul 15;72(14):3687-701]에) 기술되어 있는 바와 같이 단리시켰다. MDA-MB-231 및 원발성 인간 유방 상피 세포 (HMEC)에서 Akt3 (항-Akt3-FITC, 상단 패널)의 국소화는 실시예 17에서와 같았다. 핵을 DAPI로 염색하였다 (하단 패널). 바: 50 ㎛.

본 실험 결과는 도 19에 제시되어 있다. Akt3 단백질 (상단 패널)은 유방암 세포 및 원발성 유방 상피 세포, 둘 모두에서 핵으로 국소화되었다 (핵 염색 (하단 패널)과 비교).

실시예 20 Axl 키나제의 넉 다운이 EMT 유도성 Akt3 의 핵 국소화를 유의적으 로 감소시킨다

HMLER 및 HMLER/Slug 세포에 Axl-표적화 shRNA (shAxl2) 또는 대조군 루시퍼라제 shRNA (shLuc)를 발현하는 레트로바이러스 벡터를 형질도입시켰다. 실시예 17에 기술되어 있는 바와 같이, 세포질 및 핵 세포 분획을 단리시키고, 핵 및 세포질 세포 분획 중에서 면역블롯팅에 의해 Akt3 단백질 수준을 측정하였다. 항- Akt3-FITC (핵 녹색) 또는 DAPI 핵 염색으로 염색된, 형질도입된 세포 (GFP, 세포질 녹색)의 면역형광을 나타내었다.

본 실험 결과는 도 20에 제시되어 있다. Slug에 의한 EMT 유도가 Axl 의존성 과정에서 Akt3의 핵 국소화를 일으키는 것으로 나타났다.

실시예 21 Axl 키나제 활성의 억제가 Akt3 의 핵 국소화를 억제시킨다

비히클 (DMSO), cKit TKI (1 uM 이마티닙) 및 Axl TKI (600 nM BGB324)로 처리된 유방 상피 세포 (HMEC)에서 핵 Akt3 면역형광 (항-Akt3-FITC, 상단 패널)의 정량화. 바: 50 ㎛. *P<0.05.

도 21에 제시되어 있는 결과에 따르면, Axl 활성 (BGB324)을 차단시키면, Akt3 핵 국소화가 억제되는 반면, cKit (이마티닙) 억제는 Akt3 핵 국소화에는 어떤 영향도 미치지 않는 것으로 나타났다.

실시예 22 Akt1 및 Akt3 키나제는 다른 단백질을 함유하지 않는 생화학적 검정법에서 Snail 단백질을 직접적으로 인산화시킬 수 있다

SNAIl/Snail 코딩 서열을 pGEX-4T-l 벡터 (프로메가(Promega))로 클로닝하고, 서열을 확인하였다. GST 융합 단백질을 에스케리키아 콜라이( Escherichia coli ) (로제타(Rosetta) BL21DE3)에서 발현시키고, 제조사의 설명서 (BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences)에 따라 정제하였다; 트롬빈을 사용하여 GST 모이어티를 절단하였다. 재조합 Akt1 및 Akt3 (프로키나제 게엠베하(ProQinase GmbH)), Snail 및 Slug 기질 단백질 및 ³² P-ATP를 사용하여 시험관내 키나제 검정법을 수행하고, (문헌 (Tuomi et al, 2009])에 기술된 바와 같이, 자가조직방사선촬영술에 의해 검출하였다.

도 22에 제시되어 있는 결과에 따르면, Akt1 및 Akt3 키나제는 다른 단백질을 함유하지 않는 생화학적 검정법에서 Snail 단백질을 직접적으로 인산화시킬 수 있는 것으로 나타났다.

실시예 23 슈어파이어 ( SureFire ) 검정법을 통해 Akt3 을 발현하는 인슐린 자극성 흑색종 세포 ( WM115 )에서 포스포 - Akt3 을 검출할 수 있다. Akt3 이 아닌, Akt1 및 Akt2 를 발현하는 유방암 및 전립선 세포주 ( MCF7 및 LNCaP )에서는 어떤 신호도 검출되지 않는다.

슈어파이어 검정법을 사용하여 WM115, MCF7 및 LNCaP 세포에서 활성화된 (인산화된) Akt3을 특이적으로 검출하였다. 간략하면, 세포를 용해시키고, 제조사 (퍼킨엘머(PerkinElmer))에 의해 기술된 바와 같이, 인산화된 Akt (p473) 및 Akt3을 인식하는 항체를 수용체 및 공여체 비드에 커플링시켰다. 세포를 자극시키지 않거나 또는 10분 동안 10 nM 인슐린으로 자극시켜 Akt를 활성화시켰다.

본 실험 결과는 도 23에 제시되어 있다. 예상대로, 인슐린은 WM115 흑색종 세포에서 Akt3 활성 (인산화)을 유의적으로 유도할 수 있었지만, MCF7 유방 상피 또는 LNCaP 전립선 세포에서는 어떤 신호도 관찰되지 않았다.

실시예 24 Akt3 의 발현 감소

예를 들어, US2008014037에 기술되어 있는 바와 가이, 적합한 shRNA 서열을 확인함으로써 Akt3의 발현을 상이한 수준으로 (예컨대, 20%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%) 넉 다운시킬 수 있었다. Akt3을 상이한 수준으로 넉 다운시키면서 포유동물, 바람직하게, 인간, 세포에서 EMT를 유도하는 시도를 사용함으로써 EMT를 방해하는 데 요구되는 최소 Akt3 넉 다운 정도를 정의할 수 있었고, 이로써, 치료창을 확인할 수 있었다. 추가로, 단지 EMT를 방해하는 데 불충분한 Akt3 넉 다운 수준을 선택함으로써 EMT의 억제제에 대해 특별히 감수성인 포유동물, 바람직하게, 인간, 세포주를 생성할 수 있었다. 상기 세포주에서의 Akt3 발현은 단지 EMT가 발생할 수 있을 정도로만 충분히 이루어졌고, Akt3 신호전달을 억제시키는 화합물도 비록 미세하기는 하지만 EMT를 차단시킬 수 있었다. 따라서, 상기 세포주는 EMT의 억제제 및 특히, Akt3의 억제제에 대해 스크리닝하는 데 있어 유용한 도구가 된다.

산업상 이용가능성

본 발명은 본 발명에 따른 방법의 실시를 통해 산업상으로 이용가능하다.