一种含有肽键的His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联泛素化蛋白及其提取方法和应用 |
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| 申请号 | CN201610180004.1 | 申请日 | 2016-03-25 | 公开(公告)号 | CN105777910A | 公开(公告)日 | 2016-07-20 |
| 申请人 | 东南大学; | 发明人 | 王立新; 沈艳飞; 赵金金; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种含有肽键的His?Vx3?eGFP蛋白?纳米 铝 共价偶联泛素化蛋白及其提取方法和应用，所述泛素化蛋白是由His?Vx3?eGFP蛋白和经过修饰后的纳米铝，通过肽键形成偶联物，然后偶联物再与经过处理后的 肿瘤 细胞裂解液孵育，即得所述泛素化蛋白。相对于 现有技术 ，本发明所得α?Al2O3?His?Vx3?eGFP性质稳定，能够大大提高泛素化蛋白的募集效果，简化了实验操作；此外，还克服了原有泛素化蛋白 疫苗 使用时添加佐剂的 缺陷 。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种含有肽键的His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联泛素化蛋白，其特征在于，所述泛素化蛋白是由His-Vx3-eGFP蛋白和经过修饰后的纳米铝，通过肽键形成偶联物，然后偶联物再与经过处理后的肿瘤细胞裂解液孵育，即得所述泛素化蛋白。 |
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| 说明书全文 | 一种含有肽键的His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联泛素化蛋白及其提取方法和应用 技术领域背景技术[0002] 肿瘤严重威胁人类的健康。治愈性切除手术或化疗、放疗是目前肿瘤病人首选的治疗方法。临床资料显示，大部分肿瘤病人对化疗、放疗等治疗不敏感，因此，肿瘤的临床治疗迫切需要新的方法和手段。肿瘤生物治疗作为一种新的肿瘤治疗策略，具有特异性强、毒副作用小等优点，越来越受到人们重视。其中，以树突状细胞(DC)为载体的肿瘤疫苗目前已成为肿瘤生物治疗的研究热点。 [0003] 在肿瘤发生发展过程中，肿瘤抗原不能有效呈递给T细胞是导致免疫逃逸的重要原因。同时在荷瘤机体中，由于存在抗原递呈细胞的功能低下甚至缺陷，特别是DC在数量和功能的改变，可造成肿瘤细胞逃避机体的免疫监视，导致肿瘤的形成和发展。目前，基于DC的肿瘤疫苗被认为是最有效的肿瘤疫苗之一，已开展大量基础研究和临床试验。DC疫苗功能的实现主要取决于两部分因素，一是DC的有效抗原提呈作用；二是负载有效的抗原，抗原信息得以充分表达。然而，研究试验中存在许多问题有待解决，包括DC来源、制备过程、DC的抗原负载、用量、使用频度、免疫途径和次数，以及如何更好的募集肿瘤抗原等成为目前关注的热点。 [0004] pAPC(professional antigen pressing cell,专职抗原提成细胞)交叉递呈的抗原多肽是诱导特异性效应细胞的物质基础、而肿瘤细胞直接递呈的抗原多肽是效应细胞有效识别并杀伤肿瘤细胞的靶点。一方面，肿瘤细胞直接递呈的抗原多肽主要来源于肿瘤细胞的短寿蛋白(平均半衰期约为10分钟)；另一方面，pAPC交叉递呈的抗原多肽主要来源于肿瘤细胞的长寿蛋白(经自噬途径降解)，两者间可能存在着不对称现象，因此，解决上述的不对称性是肿瘤免疫需要解决的课题。如何充分利用肿瘤细胞产生的全部抗原信息，诱导能更有效识别肿瘤细胞的特异性效应细胞是目前以“长寿蛋白”为基础的肿瘤疫苗所面临的难题。 [0005] 目前认为抗原供者细胞主要有两条蛋白降解途径：泛素-蛋白酶体途径和细胞自噬途径。其中，泛素-蛋白酶体途径主要由蛋白酶体降解处理泛素化短寿蛋白，短寿蛋白主要包括一些错误编码、错误翻译等产生的核糖体废产品，半衰期仅为10分钟。近年来发现，肿瘤细胞MHC I(major histocompatibility complex I,主要组织相容性复合体I)类分子直接递呈的抗原肽有80％以上来源于短寿蛋白。泛素分子作为胞内信号分子能以一种极其严密的方式标记蛋白分子。泛素分子与靶蛋白或者另一个泛素分子偶联的过程是由一系列分子调控完成的，这些分子有泛素活化酶(E1)，泛素交联酶(E2)和泛素连接酶(E3)；最终使泛素分子偶联到多肽链Lys残基的ε-氨基或者末端氨基酸的最末端基团，随后，另一个泛素分子会通过与前一个泛素分子的Lys48连接而形成泛素链。这种连接类型的泛素链在很大程度上是作为蛋白酶体识别的标志。被泛素化的底物进入蛋白酶体后很快就被蛋白酶体所降解。 [0006] 前期我们通过将一个人工构建的泛素化蛋白结合蛋白(His-Vx3-eGFP)的基因序列导入大肠杆菌(DH5α)并诱导其表达，采用镍离子层析的方法以得到泛素化蛋白并且具有显著的抗肿瘤效果。 [0007] 目前，现有技术中虽然已经有泛素化蛋白的研究，但是，仍存在以下问题需要解决，如募集泛素化蛋白的方法复杂难以大批量生产；所得的泛素化蛋白稳定性差不利于保存；将其作为肿瘤疫苗时需要添加纳米铝佐剂。 发明内容[0008] 发明目的：为了解决上述技术问题，本发明公开了一种His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联泛素化蛋白及其提取方法。 [0009] 技术方案：为了实现上述发明目的，本发明提供了一种含有肽键的His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联泛素化蛋白，所述泛素化蛋白是由His-Vx3-eGFP蛋白和经过修饰后的纳米铝，通过肽键形成偶联物，然后偶联物再与经过处理后的肿瘤细胞裂解液孵育，即得所述泛素化蛋白。 [0010] 本发明还公开了所述含有肽键的His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联泛素化蛋白的提取方法，包括以下步骤： [0011] (1)利用对羟基苯甲酸，对纳米铝颗粒进行修饰； [0012] (2)将修饰后的纳米铝活化，加入His-Vx3-eGFP蛋白，通过生成肽键形成His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联物； [0013] (3)培养肿瘤细胞，抑制泛素化蛋白的降解，经细胞裂解液处理，离心得上清液； [0014] (4)将步骤(2)所得共价偶联物和步骤(3)所得上清液共孵育，即得所述泛素化蛋白α-Al2O3-His-Vx3-eGFP-Ub。 [0015] 作为优选，步骤(1)中所述修饰方法为：纳米铝与对羟基苯甲酸在加热油浴条件下搅拌反应，使对羟基苯甲酸与纳米铝上的羟基反应。 [0016] 所述纳米铝在制作过程中与水发生化学反应，形成大量羟基。 [0017] 作为另一种优选，步骤(2)中所述活化方法为：EDC/NHS与对羟基苯甲酸修饰后的纳米铝常温搅拌反应以活化羧基。 [0018] 作为另一种优选，步骤(2)中所述His-Vx3-eGFP蛋白是由以下方法制得： [0019] 复苏转化了His-Vx3-eGFP表达质粒的大肠杆菌，诱导其表达蛋白，采用镍离子层析法提取所述His-Vx3-eGFP蛋白。 [0020] 所述His-Vx3-eGFP蛋白为具有泛素结合结构域的Vx3(A7)融合蛋白，Vx3(A7)融合蛋白为串联了三个来源于Vps27(a yeast homologue of HRS,Hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate)的UIM(ubiquitin-interacting motif)的人工构建体，是近年来报道的人工构建串联有泛素结合结构域的对泛素化蛋白有很高亲和力的蛋白。 [0021] 作为另一种优选，步骤(3)中所述培养肿瘤细胞为按照常规方法培养； [0022] 作为另一种优选，步骤(3)中所述抑制泛素化蛋白的降解的方法为：培养的肿瘤细胞生长至80％，加入万珂和氯化铵，加入量分别为(160-240)nmol/L和(25-35)mmol/L，干预肿瘤细胞14-18小时，抑制泛素化蛋白的降解。 [0023] 作为另一种优选，步骤(4)中所述孵育为4℃共孵育过夜。 [0024] 具体地，本发明所述His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联泛素化蛋白，主要是由以下步骤提取所得： [0025] (1)纳米铝颗粒的修饰： [0026] (1a)称取干燥的纳米铝(α-Al2O3)100mg，置于100ml圆底反应釜中加超纯水50ml，于超声清洗仪中超声30分钟(min)充分活化纳米铝上的羟基； [0027] (1b)称取不同量的对羟基苯甲酸(500、50、5mg)分别加入上述反应釜中，90℃油浴下搅拌反应2h； [0029] (2)His-Vx3-eGFP蛋白共价偶联至纳米铝颗粒： [0030] (2a)复苏转化了His-Vx3-eGFP表达质粒的大肠杆菌，涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，14h后挑取单克隆至含有氨苄青霉素的LB培养液中37℃震荡培养6h后，吸取1ml接种至100ml LB培养液中，待其生长至对数期加入终浓度100mM的IPTG低温诱导16h； [0032] (2c)将上述上清加入镍离子亲和层析柱中4℃摇荡反应过夜，第二天用Washing buffer洗去杂蛋白，Elution buffer洗脱His-Vx3-eGFP蛋白； [0033] (2d)用EDC/NHS将(1c)中的产物活化，PBS洗涤三次后加入步骤(2c)所得His-Vx3-eGFP蛋白4℃搅拌反应过夜，第二天低温高速离心收集纳米铝与His-Vx3-eGFP蛋白的共价偶联产物(α-Al2O3-His-Vx3-eGFP)； [0034] (3)肿瘤细胞的培养： [0035] 复苏冻存4T1细胞，40℃水浴融化后立即加入含10％(V/V)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI-1640培养基，重悬细胞至1×106个/ml，并将其移入500ml细胞培养瓶中，在37℃、5％(V/V)CO2的恒温培养箱中培养，每1～2天换液一次，常规0.25％(g/mL)胰蛋白酶消化传代； [0036] (4)肿瘤细胞的处理： [0037] 按步骤(3)方法培养细胞待细胞生长至80％，万珂和氯化铵，加入量分别为(160-240)nmol/L和(25-35)mmol/L，干预肿瘤细胞14-18小时，抑制泛素化蛋白的降解；将所得细胞经细胞裂解液处理后，离心得到上清； [0038] (5)募集泛素化蛋白： [0039] 将步骤(4)所得细胞裂解液与步骤(2)所得的共价偶联后的纳米铝颗粒4℃共孵育过夜，第二天低温高速离心得到泛素化蛋白与纳米铝的连接产物(α-Al2O3-His-Vx3-eGFP-Ub)； [0040] (6)western blot检测募集到的泛素化蛋白： [0041] 将步骤(5)所得α-Al2O3-His-Vx3-eGFP-Ub用适量PBS重悬，吸取100μl高速离心后弃去上清，加入100μl SDS-PAGE loading buffer，沸水浴5min，离心取上清SDS-PAGE后，加抗ub抗体和K63抗体检测所得Ub蛋白； [0042] 本发明最后还公开了所述的His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联泛素化蛋白在制备抗肿瘤疫苗中的应用。所述His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联泛素化蛋白能够有效抑制肿瘤细胞生长，延长荷瘤活体的存活时间。 [0043] 技术效果：相对于现有技术，本发明具有以下优点： [0044] 1、本发明能够大量的募集泛素化蛋白，大幅提高对疫苗的产量。 [0045] 2、本发明所得α-Al2O3-His-Vx3-eGFP性质稳定可长期贮存，能够从不同肿瘤细胞裂解液中方便快捷的募集泛素化蛋白。 [0047] 图1：红外光谱检测纳米铝同对羟基苯甲酸的反应； [0048] 图2：激光共聚焦显微镜观察α-Al2O3特异性共价偶联His-Vx3-eGFP蛋白； [0049] 图3：激光共聚焦观察α-Al2O3-His-Vx3-eGFP的稳定性； [0050] 图4：.药物处理不同时间4T1细胞活性的检测； [0051] 图5：.药物处理不同时间4T1细胞泛素化蛋白的表达情况； [0052] 图6：不同药物处理4T1细胞泛素化蛋白表达的情况； [0053] 图7：A.α-Al2O3-His-Vx3-eGFP募集泛素化蛋白及募集后蛋白的检测方法；B.westernblot检测α-Al2O3-His-Vx3-eGFP募集到的泛素化蛋白。 具体实施方式[0054] 下面结合附图进一步描述本发明的技术解决方案。 [0055] 实施例1：纳米铝颗粒的修饰 [0056] 1.称取干燥的纳米铝(α-Al2O3)100mg，置于100ml圆底反应釜中加超纯水50ml，于超声清洗仪中超声30min充分活化纳米铝上的羟基； [0057] 2.称取不同量的对羟基苯甲酸(500、50、5mg)分别加入上述反应釜中，90℃油浴下搅拌反应2h； [0058] 3.将上述反应所得产物用超纯水充分洗涤干净后，离心得到沉淀，冷冻干燥后与适量的干燥溴化钾(KBr)混合压片，红外光谱仪下检测羟基的变化； [0059] 如图1所示：纳米铝颗粒上的羟基峰很强，随着与对羟基苯甲酸反应量的增加纳米铝上的羟基峰逐渐减弱，证实对羟基苯甲酸成功的连接至纳米铝并且随着对羟基苯甲酸的量的增加，纳米铝结合的对羟基苯甲酸逐渐增多。 [0060] 实施例2：His-Vx3-eGFP蛋白共价偶联至纳米铝颗粒 [0061] 1.复苏转化了His-Vx3-eGFP表达治疗的大肠杆菌，涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，14h后挑取单克隆至含有氨苄青霉素的LB培养液中37℃震荡培养6h后，吸取1ml接种至100ml LB培养液中，待其生长至对数期加入终浓度100mM的IPTG低温诱导16h； [0062] 2.将上部所得菌液低温高速离心得到细菌，PBS洗三次，buffer重悬后加入100μg/ml的溶菌酶冰上作用20min后与超声波破碎仪上作用20min，高速低温离心得到上清； [0063] 3.将上述上清加入镍离子亲和层析柱中4℃摇荡反应过夜，第二天用Washing buffer洗去杂蛋白，Elution buffer洗脱His-Vx3-eGFP蛋白； [0064] 4.用EDC/NHS将(1c)中的产物活化，PBS洗涤三次后加入步骤(2c)所得His-Vx3-eGFP蛋白4℃搅拌反应过夜，第二天低温高速离心收集纳米铝与His-Vx3-eGFP蛋白的共价偶联产物(α-Al2O3-His-Vx3-eGFP)； [0065] 实施例3：纳米铝共价偶联His-Vx3-eGFP蛋白的特异性 [0066] 1.纳米铝经对羟基苯甲酸修饰后，不经EDC/NHS催化直接同His-Vx3-eGFP蛋白共孵育后再同R-PE标记的小鼠IgG抗体共孵育。如图2所示，在激光共聚焦显微镜下观察到：经对羟基苯甲酸修饰后的氧化铝即能结合His-Vx3-eGFP蛋白也能同小鼠IgG结合，证明修饰后的纳米铝可以结合任意蛋白。 [0067] 2.纳米铝经对羟基苯甲酸修饰后，用EDC/NHS催化，继而与His-Vx3-eGFP蛋白共孵育，反应结束后，PBS洗三次再加入P-PE标记的小鼠IgG抗体共孵育。如图2所示，在激光共聚焦显微镜下观察到：经对羟基苯甲酸修饰后的纳米铝经EDC/NHS催化后可以同His-Vx3-eGFP蛋白偶联，但是偶联后的产物依然有结合其他蛋白的能力。 [0068] 3.纳米铝经对羟基苯甲酸修饰后，再用正丁醇修饰，不经EDC/NHS催化直接同His-Vx3-eGFP蛋白共孵育后再同R-PE标记的小鼠IgG抗体共孵育。如图2所示，在激光共聚焦显微镜下观察到：经正丁醇修饰后的纳米铝不能结合任何蛋白。 [0069] 4.纳米铝经对羟基苯甲酸修饰后，再用正丁醇修饰，经EDC/NHS催化后，同His-Vx3-eGFP蛋白反应，PBS洗三次后加入R-PE标记的小鼠IgG抗体共孵育。如图2所示，在激光共聚焦显微镜下观察到：His-Vx3-eGFP蛋白可以共价结合至纳米铝，并且产物不能再结合其他蛋白的量大大减少。 [0070] 5.纳米铝经对羟基苯甲酸修饰后，再用正丁醇修饰，经EDC/NHS催化后，同His-Vx3-eGFP蛋白反应，PBS洗三次后加入5％BSA共孵育2h，继而同R-PE标记的小鼠IgG抗体共孵育。如图2所示，在激光共聚焦显微镜下观察到：His-Vx3-eGFP蛋白可以共价结合至纳米铝，并且经BSA作用后产物不能再结合其他蛋白。 [0071] 实施例4：纳米铝共价偶联His-Vx3-eGFP蛋白产物稳定性的研究 [0072] 1.将共价偶联后的α-Al2O3-His-Vx3-eGFP置于4℃，静置3周。激光共聚焦显微镜观察，如图3(a)：共价偶联的产物静置3周后依然有很强的荧光，证明α-Al2O3-His-Vx3-eGFP有很好的稳定性。 [0073] 2.将纳米铝与His-Vx3-eGFP蛋白的混合物(α-Al2O3+His-Vx3-eGFP)置于4℃，静置3周。激光共聚焦显微镜观察，如图3(b)：纳米铝与His-Vx3-eGFP蛋白刚刚混合时荧光强度很高，但是静置3周后基本看不到荧光，证明α-Al2O3-His-Vx3-eGFP同纳米铝与His-Vx3-eGFP蛋白的混合物(α-Al2O3+His-Vx3-eGFP)相比有很好的稳定性。 [0074] 实施例5：4T1细胞表达泛素化蛋白最高的条件 [0075] 1.肿瘤细胞的培养： [0076] 复苏冻存4T1细胞(小鼠乳腺癌细胞)，40℃水浴融化后立即加入含10％(V/V)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI-1640培养基，重悬细胞至1×106个/ml，并将其移入500ml细胞培养瓶中，在37℃、5％(V/V)CO2的恒温培养箱中培养，每1～2天换液一次，常规0.25％(g/mL)胰蛋白酶消化传代； [0077] 2.肿瘤细胞的处理： [0078] 1)按步骤1方法培养细胞待细胞生长至80％，万珂和氯化铵，加入量100nmol/L和20mmol/L，干预肿瘤细胞3、6、9、12小时，抑制泛素化蛋白的降解；CCK-8法检测细胞的活性。 如图4所示：随着作用时间的增长细胞的活性越来越受到抑制，作用12h细胞活性仅有80％。 [0079] 2)按步骤1方法培养细胞待细胞生长至80％，万珂和氯化铵，加入量100nmol/L和20mmol/L，干预肿瘤细胞3、6、9、12小时，抑制泛素化蛋白的降解；收集细胞加入RIPA细胞裂解液冰上作用20min，离心后收集上清，取适量上清加入SDS-PAGE loading buffer，电泳后将蛋白转至PVDF膜，加入抗ub的抗体和抗K63ub的抗体。4℃孵育过夜，第二天PBST洗膜5次，每次5min，加入相应的HRP标记的二抗，室温孵育1h，PBST细胞5次，每次5min，加显色试剂并拍照。如图5所示，western blot条带显示，药物作用9h，细胞内总ub和K63ub的表达量最高。 [0080] β-tubilin [0081] 3)按步骤1方法培养细胞待细胞生长至80％，分别加入万珂100nmol/L或氯化铵20mmol/L，干预肿瘤细胞9h，抑制泛素化蛋白的降解；收集细胞加入RIPA细胞裂解液冰上作用20min，离心后收集上清，取适量上清加入SDS-PAGE loading buffer，电泳后将蛋白转至PVDF膜，加入抗ub的抗体和抗K63ub的抗体。4℃孵育过夜，第二天PBST洗膜5次，每次5min，加入相应的HRP标记的二抗，室温孵育1h，PBST细胞5次，每次5min，加显色试剂并拍照。如图 6所示，western blot条带显示，两种药物共同作用9h，细胞内总ub和K63ub的表达量最高。 [0082] 实施例6：偶联至纳米铝的His-Vx3-eGFP蛋白从细胞裂解液中募集泛素化蛋白[0083] 1.将实施例5所得细胞裂解液与实施例1所得的共价偶联后的纳米铝颗粒4℃共孵育过夜，第二天低温高速离心得到泛素化蛋白与纳米铝的连接产物(α-Al2O3-His-Vx3-eGFP-Ub)。 [0084] 2.将步骤1所得α-Al2O3-His-Vx3-eGFP-Ub用适量PBS重悬，吸取100μl高速离心后弃去上清，加入100μl SDS-PAGE上样缓冲液(loading buffer)，沸水浴5min，离心取上清SDS-PAGE后，加抗ub抗体和K63抗体检测所得Ub蛋白；结果如图7所示，α-Al2O3-His-Vx3-eGFP能够募集到大量的泛素化蛋白。 |
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