카바모일 포스페이트 및 우레아 제조 방법

카바모일 포스페이트 및 우레아 제조 방법 {METHODS OF PRODUCING CARBAMOYL PHOSPHATE AND UREA}

본 발명은 카바메이트 키나아제의 존재 하에 조성물 내에서 암모니아, ATP, 중탄산염 및 CO ₂ , 또는 이들의 수화형을 반응시키는 단계를 포함하는 카바모일 포스페이트 생산 방법에 관한 것으로서, 여기서 상기 암모니아 및 CO ₂ , 또는 이들의 수화형은 화학 반응 내에서 카바메이트로 전환되고 상기 카바메이트 및 ATP는 카바메이트 키나아제에 의하여 효소-촉매되는 반응에서 카바모일 포스페이트로 전환되며, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 8 내지 약 12이다. 또한, 본 발명은 우레아 생산 방법에 관한 것이다.

우레아는 가장 일반적인 질소 비료이며, 세계 비료 시장의 50% 이상을 차지한다. 이 비료는 현재 에너지 집약적 보쉬-마이저 공정 (Bosch-Meiser process)을 이용, 하버 공정을 사용하여 제조된 암모니아로부터 제조된다. 우레아 생산에 큰 에너지와 천연 가스 투입에 대한 요구가 있으므로 충분한 화석 연료 공급원을 갖는 지역으로 우레아 생산이 집중되어 왔는데, 이는 많은 국가들이 우레아 상당 부분을 수입하고 관련 운송 비용이 높은 결과이다. 고 에너지 투입, 천연 가스에 대한 의존 및 높은 운송 비용은 화석 연료의 가격과 함께 우레아 비료의 가격과도 커플링되어 있는데, 이는 공급-의존성 변동에 민감하다. 우레아 비료 비용에 대하여 향후 영향을 미칠 추가적인 고려사항은 2015년으로 계획된 탄소 오염 감소 계획의 도입 제안으로서, 비료 생산 및 운송과 관련된 CO ₂ 배출에 대한 관련 비용 때문이다.

우레아 비료로 이용된 대부분의 질소는 다양한 폐기물 스트림, 예컨대 동물 폐기물 및 도시 폐기물로 사라진다. 이들 폐기물 스트림은 질산염, 아질산염, 암모니아 및 유기 질소 화합물들 (아미노산 및 뉴클레오티드)로서 상당량의 질소를 함유하는데, 부영양 효과 (예컨대 세균 창궐)를 방지하기 위하여 이들은 상기 폐기물 스트림으로부터 제거되어야 한다. 폐수 처리에 있어서 질소는 가스 질소 산화물 (N ₂ O, 강력한 GHG 및 NO)와 질소 (N ₂ )로서 궁극적으로 사라진다. 이러한 시스템에서 질소 재활용은 i) 저에너지, 저 GHG원 질소 비료를 제공하고, ii) 폐기물 스트림으로부터 질소를 제거하여 하류 스트림의 부영양 효과를 방지하고 iii) 질소 산화물의 생성을 저감시킬 것이다. 또한, 회수 폐질소로부터 얻어지는 우레아 비료의 생산은 지역적 분산으로 운송 비용 및 그 제품의 환경에 대한 전체적인 영향을 감소시킬 것이다.

우레아 사이클은 그 공정을 통하여 질소가 5종의 일련의 효소들에 의하여 적절히 퍼지게 되는 대사 공정이고, 동물에서 암모니아를 배설되는 우레아로 해독하고 다른 생물체들에서는 질소 대사 중간물들을 제공하게 된다. 우레아 사이클의 제1 단계는 카바모일 포스페이트 합성효소에 의하여 카본산, 유기 인 (ATP), 및 암모니아나 글루타메이트 중 어느 하나로부터 카바모일 포스페이트를 생산하는 것이다.

암모니아는 pKa가 9.25이고, 그러므로 생물학적 pH에서 주로 존재하는 것은 암모니아가 아니고 암모늄이다. 실제로, 99.4%의 암모니아가 pH 7에서 양성자를 받은 상태이다. 우레아 사이클은 대부분의 생물체에서 암모니아의 수준이 낮음으로 인하여 카바모일 포스페이트를 우레아로 전환시키기 위하여 필요하다 (Jones and Lipman, 1960). 카바모일 포스페이트는 또 다른 4종의 효소 전환을 거쳐 결국 우레아를 형성하게 된다. 화학적으로, 이러한 동시적인 단계들은 암모니아를 처리함에 있어서 카바모일 포스페이트를 우레아로 전환시키는 것을 이용하여 제거될 수 있다.

카바모일 포스페이트는 생리적 pH 및 온도에서 5 분의 반감기 (t _{1 /2} )로 불안정하다 (Wang et al., 2008). 이러한 불안정성에도 불구하고, 시트룰린, 아르기닌, 피리미딘 뉴클레오티드 및 우레아를 제공하는 추가적인 변형을 겪는다. 카바모일 포스페이트의 열분해는 트랜스카바모일라제에 의한 안정화를 통하여 회피된다. 아스파테이트 및 오르니틴 트랜스카바모일라제는 카바모일 포스페이트의 열분해율을 5000배 낮춘다. 트랜스카바모일라제가 없는 용액에서, 카바모일 포스페이트는 평면적인 중간체를 통해 분해된다 (Allen and Jones, 1964). 이러한 형상은 아스파테이트 및 오르니틴 트랜스카바모일라제의 활성 부위에서는 금지되므로, 안정화되고 안정한 우레이도 산물로 변형될 수 있다.

카바모일 포스페이트는 수성 조건에서 불안정하고 쉽게 분해된다 (Wang et al., 2008). 그를 통하여 분해가 일어나는 경로는 pH 의존적이다. 산 분해하에서는 암모늄, 오르소인산 및 이산화탄소로 분해가 일어나지만 (Allen and Jones, 1964), 알칼리 조건에서 존재하는 2 음이온 (dianion)은 오르소인산 및 시아네이트로 분해된다 (Allen and Jones, 1964). 이 분해 경로는 후속 변형에 중요한데, 추가적인 질소 치환이 암모니아 및 탄산염으로는 가능하지 않고 시아네이트로만 쉽게 일어나는 것으로 알려져 있기 때문이다 (Wen and Brooker, 1994). 예컨대, 우레아의 형성은 탄산염을 암모니아로 처리하는 경우에 일어나지 않지만, 시아네이트를 암모니아로 처리하는 경우 형성되고 우레아의 생성은 암모니아 농도를 증가시킴으로써 증가한다.

카바모일 인산의 불안정성은 그것을 상업적인 중간체로서 실용적이지 못한 것으로 여겨지게 한다. 따라서, 카바모일 포스페이트를 생산하는 방법 및 우레아를 생산하는 방법에 대한 요구가 있다. 또한, 폐기 물질로부터 암모니아 수준을 낮추기 위한 방법에 대한 수요가 있다.

발명의 요약

본 발명의 발명자들은 하나의 효소를 이용하여 암모니아가 카바모일 포스페이트로 전환될 수 있는 방법을 개발하였다.

따라서, 본 발명의 제1 측면은 카바메이트 키나아제의 존재 하에 조성물 내에서 암모니아, ATP, 중탄산염 및 CO ₂ , 또는 이들의 수화형을 반응시키는 단계를 포함하는 카바모일 포스페이트 생산 방법에 관한 것으로서, 여기서 상기 암모니아 및 CO ₂ , 또는 이들의 수화형은 화학 반응 내에서 카바메이트로 전환되고 상기 카바메이트 및 ATP는 카바메이트 키나아제에 의하여 효소-촉매되는 반응에서 카바모일 포스페이트로 전환되며, 여기서 상기 조성물의 pH는 약 8 내지 12이다.

양호한 구현예에 있어서, 상기 pH는 약 9.9, 약 9 내지 약 11, 약 9.25 내지 약 11.25, 약 10.25 내지 약 11.25, 또는 약 10.5 내지 약 11.5이다. 이 구현예에 있어서, 상기 카바메이트 키나아제는 초고온성 (hyperthermophile) 박테리아로부터 유래한 것 또는 그들의 생물학적 활성 돌연변이가 양호하다. 초고온성 박테리아는 피로코쿠스 종 ( Pyrococcus sp . ) 및 써모코쿠스 종 ( Thermococcus sp . )을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 피로코쿠스 종의 예로는 피로코쿠스 아비씨 ( Pyrococcus abyssi ), 피로코쿠스 엔데보리 ( Pyrococcus endeavori ) , 피로코쿠스 글리코보란스 ( Pyrococcus glycovorans ), 피로코쿠스 호리코시이 ( Pyrococcus horikoshii ) 및 피로코쿠스 우에세이 ( Pyrococcus woesei ) 를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다 . 써모코쿠스 종의 예로는 써모코쿠스 아시다미노보란스 ( Thermococcus acidaminovorans ), 써모코쿠스 애개우스 ( Thermococcus aegaeus ), 써모코쿠스 아그레간스 ( Thermococcus aggregans ), 써모코쿠스 알칼리필러스 (T hermococcus alcaliphilus ), 써모코쿠스 아틀란티쿠스 ( Thermococcus atlanticus ), 써모코쿠스 바로필러스 ( Thermococcus barophilus ), 써모코쿠스 바로시이 ( Thermococcus barossii ), 써모코쿠스 셀레르 ( Thermococcus celer ), 써모코쿠스 셀레리크레센스 ( Thermococcus celericrescens ), 써모코쿠스 키토노파거스 ( Thermococcus chitonophagus ), 써모코쿠스 코알레센스 ( Thermococcus coalescens ), 써모코쿠스 퓨미콜란스 ( Thermococcus fumicolans ), 써모코쿠스 감마톨레란스 ( Thermococcus gammatolerans ), 써모코쿠스 고르고나리우스 ( Thermococcus gorgonarius ), 써모코쿠스 과이마센시스 ( Thermococcus guaymasensis ), 써모코쿠스 하이드로써말리스 ( Thermococcus hydrothermalis ), 써모코쿠스 코닥카렌시스 ( Thermococcus kodakarensis ), 써모코쿠스 리토랄리스 ( Thermococcus litoralis ), 써모코쿠스 마리누스 ( Thermococcus marinus ), 써모코쿠스 멕시칼리스 ( Thermococcus mexicalis ), 써모코쿠스 노틸러스 ( Thermococcus nautilus ), 써모코쿠스 오눌리뉴스 ( Thermococcus onnurineus ), 써모코쿠스 파시피쿠스 ( Thermococcus pacificus ), 써모코쿠스 펩토노필러스 ( Thermococcus peptonophilus ), 써모코쿠스 프로펀더스 ( Thermococcus profundus ), 써모코쿠스 라디오톨레란스 ( Thermococcus radiotolerans ), 써모코쿠스 시비리쿠스 ( Thermococcus sibiricus ), 써모코쿠스 시쿨리 ( Thermococcus siculi ), 써모코쿠스 스테테리 ( Thermococcus stetteri ), 써모코쿠스 티오레듀센스 ( Thermococcus thioreducens ), 써모코쿠스 와이만겐시스 ( Thermococcus waimanguensis ), 써모코쿠스 와이타퓨엔시스 ( Thermococcus waiotapuensis ) 및 써모코쿠스 질리기이 ( Thermococcus zilligii )를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 이러한 카바메이트 키나아제의 예시로는,

a) SEQ ID NOs:1 내지 9 중 어느 하나의 것으로 제공되는 아미노산 서열,

b) SEQ ID NOs:1 내지 9 중 임의의 하나 이상의 것과 50% 이상 상동성인 아미노산 서열, 및/또는

c) a) 또는 b)의 생물학적 활성 단편

을 포함하는 것들을 들 수 있다.

또 다른 구현예에 있어서, 상기 카바메이트 키나아제는

a) SEQ ID NOs:4 내지 9 중 어느 하나의 것으로 제공되는 아미노산 서열,

b) SEQ ID NOs:4 내지 9 중 임의의 하나 이상의 것과 50% 이상 상동성인 아미노산 서열, 및/또는

c) a) 또는 b)의 생물학적 활성 단편

을 포함한다.

또 다른 구현예에 있어서, 상기 카바메이트 키나아제는

a) SEQ ID NOs:1, 8 또는 9 중 어느 하나의 것으로 제공되는 아미노산 서열,

b) SEQ ID NOs:1, 8 또는 9 중 임의의 하나 이상의 것과 50% 이상 상동성인 아미노산 서열, 및/또는

c) a) 또는 b)의 생물학적 활성 단편

을 포함한다.

또 다른 구현예에 있어서, 상기 카바메이트 키나아제는

a) SEQ ID NOs:8 또는 9 중 어느 하나의 것으로 제공되는 아미노산 서열,

b) SEQ ID NOs:8 또는 9 중 임의의 하나 이상의 것과 50% 이상 상동성인 아미노산 서열, 및/또는

c) a) 또는 b)의 생물학적 활성 단편

을 포함한다.

상기 구현예들에 있어서, 온도는 약 10℃ 내지 약 100℃이다. 한 가지 구현예에 있어서, 상기 온도는 약 20℃ 내지 약 80℃이다. 또 다른 구현예에 있어서, 상기 온도는 약 20℃ 내지 약 60℃이다. 또 다른 구현예에 있어서, 상기 온도는 약 20℃ 내지 약 30℃이다.

또 다른 양호한 구현예에 있어서, pH 11에서 0.5 μM의 카바메이트 키나아제는 40℃, NaHCO ₃ (0.2 M), ATP (10 mM) 및 20 mM NH ₄ OH에서 30 분간의 반응 후 0.5 μmol/min/mg 이상, 0.9 μmol/min/mg 이상, 또는 0.5 내지 3 μmol/min/mg ADP를 생산한다.

또 다른 양호한 구현예에 있어서, pH 11에서 0.5 μM의 카바메이트 키나아제는 40℃, NaHCO ₃ (0.2 M), ATP (10 mM) 및 20 mM NH ₄ OH에서 30 분간의 반응 후 0.25 μmol/min/mg 이상, 0.6 μmol/min/mg 이상, 또는 0.25 내지 2.5 μmol/min/mg ADP를 생산한다.

다른 구현예에 있어서, 상기 pH는 약 9 내지 10.5, 또는 약 9.5 내지 약 10.5이다. 이 구현예에 있어서, 상기 카바메이트 키나아제는 고온성 박테리아로부터 유래하는 것, 또는 그의 돌연변이인 것이 양호하다. 고온성 박테리아로는 페르비도박테리움 종 ( Fervidobacterium sp . )(예컨대, 페르비도박테리움 노도섬 ( Fervidobacterium nodosum )), 써모시포 종 ( Thermosipho sp . )(예컨대, 써모시포 멜라네시엔시스 ( Thermosipho melanesiensis )), 언에어로배큘럼 종 ( Anaerobaculum sp .)(예컨대, 언에어로배큘럼 하이드로게니포만스 ( Anaerobaculum hydrogeniformans ) 및 아미노박테리움 콜롬비엔스 ( Aminobacterium colombiense )), 써만에어로비브리오 종 ( Thermanaerovibrio sp . )(예컨대, 써만에어로비브리오 아시다미노보란스 ( Thermanaerovibrio acidaminovorans )), 할로써모트릭스 종 ( Halothermothrix sp . )(예컨대, 할로써모트릭스 오레니이 ( Halothermothrix orenii )), 코스모토가 종 ( Kosmotoga sp . )(예컨대, 코스모토가 올레아리아 ( Kosmotoga olearia )) 및 무렐라 종 ( Moorella sp . )(예컨대, 무렐라 써모아세티카 ( Moorella thermoacetica ))을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 카바메이트 키나아제의 예시로는

a) SEQ ID NOs:28 내지 35 중 어느 하나의 것으로 제공되는 아미노산 서열,

b) SEQ ID NOs:28 내지 35 중 임의의 하나 이상의 것과 50% 이상 상동성인 아미노산 서열, 및/또는

c) a) 또는 b)의 생물학적 활성 단편

을 포함하는 것들을 들 수 있다. 또한, 한 가지 구현예에 있어서, 상기 온도는 약 10℃ 내지 약 60℃, 약 20℃ 내지 약 60℃, 약 20℃ 내지 약 40℃, 또는 약 20℃ 내지 약 30℃이다. 또한, 한 가지 구현예에 있어서, pH 10.5에서 0.5 μM의 카바메이트 키나아제는 40℃, NaHCO ₃ (0.2 M), ATP (10 mM) 및 200 mM NH ₄ OH에서 30 분간의 반응 후 0.6 μmol/min/mg 이상의 ADP를 생산한다.

양호한 구현예에 있어서, 상기 카바메이트 키나아제는 4℃에서 1년간 보관 후 및/또는 40℃에서 60 시간 보관 후 그 활성의 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 80% 이상을 유지한다.

또 다른 구현예에 있어서, 압력은 약 0 내지 350 MPa, 또는 약 1 atm 내지 약 10 atm이다.

한 가지 구현예에 있어서, 상기 방법은 연속적인 시스템으로 수행된다.

또 다른 구현예에 있어서, 상기 카바메이트 키나아제는 고체 기판 상에 고정화된다.

또 한가지 다른 구현예에 있어서, 암모니아 제공원은 폐기 물질이다.

또 한가지 구현예에 있어서, 상기 방법은 카바모일 포스페이트 중 적어도 일부의 분해를 통하여 시아네이트 및 시안산 중 하나 또는 양자 모두를 더 생산한다.

또 다른 구현예에 있어서, 상기 카바메이트 키나아제는 하나 이상의 다른 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질이다. 상기 하나 이상의 다른 폴리펩타이드는, 예컨대 상기 카바메이트 키나아제의 안정성을 증가시키는 폴리펩타이드, 박테리아 세포 또는 효모 세포와 같은 세포로부터 상기 융합 단백질의 분비를 촉진하는 폴리펩타이드, 상기 융합 단백질의 정제를 돕는 폴리펩타이드 및/또는 상기 폴리펩타이드의 고체 기판에의 결합을 돕는 폴리펩타이드일 수 있다.

카바모일 포스페이트의 우레아 및/또는 기타 안정하고 이동 가능한 산물로의 인 시투 (in situ) 변환은 현재의 에너지 집약적인 상업 공정을 효율적인 생물학적 경로로 대체하는 것을 가능케 한다. 따라서, 또 하나의 측면에 있어서, 본 발명은 카바모일 포스페이트로부터 화합물을 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은

i) 본 발명의 방법을 수행하여 카바모일 포스페이트를 생산하는 단계 및

ii) 하나 이상의 추가 반응들을 수행하여 상기 화합물을 생산하는 단계

를 포함한다.

본 발명의 발명자들은 우레아를 생산하는 간이한 방법을 고안하였다. 따라서, 특정 양호한 구현예에 있어서, 상기 화합물은 우레아이고 단계 ii)는 단계 i)로부터 생산된 카바모일 포스페이트와 암모니아를 반응시켜 시아네이트 및 시안산 중 하나 또는 양자 모두인 중간체를 거쳐 우레아를 생산하는 것을 포함한다. 암모니아는 단계 i)에서 존재하는 것 및/또는 단계 ii) 도중에 첨가되는 추가적인 암모니아일 수 있다.

한 가지 구현예에 있어서, 우레아를 생산할 때, 적어도 단계 ii)는 양 90℃ 이상의 온도에서 수행된다. 더욱 좋기로는, 우레아를 생산할 때, 적어도 단계 ii)는 약 90℃ 내지 약 100℃의 온도에서 수행된다.

또 하나의 구현예에 있어서, 상기 방법은

i) 본 발명의 방법을 수행하여 고체 기판 상에 고정화된 카바메이트 키나아제를 이용하여 카바모일 포스페이트를 생산하는 단계,

ii) 단계 i)에 의하여 생산된 상기 카바모일 포스페이트를 상기 고체 기판으로부터 분리하는 단계,

iii) 상기 카바모일 포스페이트를 수지에 결합시키는 단계, 및

iv) 암모니아를 포함하는 용액에 상기 수지를 수세시켜 상기 카바모일 포스페이트를 시아네이트 및 시안산 중 하나 또는 양자 모두인 중간체를 거쳐 우레아로 전환시키는 단계

를 포함한다.

단계 iv)는 우레아를 생산할 뿐 아니라 그 분자를 수지로부터 유리시켜 상기 우레아가 상기 수지로부터 용리된 물질 내에 수집될 수 있도록 한다.

한 가지 구현예에 있어서, 단계 iv)는 약 90℃ 내지 약 100℃의 온도에서 수행된다.

또 한 가지 구현예에 있어서, 상기 화합물은 시트룰린, 아르기니노숙신산염, 아르기닌, 오르니틴 및 이들 중 2 이상의 조합으로부터 선택되는 우레아 사이클의 중간체이다.

또 다른 구현예에 있어서, 상기 방법은 본 발명의 방법을 수행하여 시아네이트 및 시안산 중 하나 또는 양자 모두를 생산하는 단계 및 상기 시아네이트 및/또는 시안산을 친핵체와 반응시키는 단계를 포함한다.

한 가지 구현예에 있어서, 상기 화합물은 피리미딘이다. 피리미딘의 예로는 우라실, 시토신 또는 티민 또는 1개, 2개 또는 3개의 포스페이트기를 갖는 이들의 유도체를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

한 가지 구현예에 있어서, 상기 방법은 하나의 용기 내에서 수행된다.

또 하나의 측면에 있어서, 본 발명은 폐기 물질 내에서 암모니아의 농도를 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 방법을 수행하는 단계를 포함한다.

한 가지 구현예에 있어서, 상기 폐기 물질은 수(水) 중에 있다.

또한, 본 발명의 발명자들은 박테리아 세포에서 발현되는 경우 본래의 오픈 리딩 프레임 (SEQ ID NO:11)보다 SEQ ID NO:1로 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 카바메이트 키나아제를 고수준으로 생산하는 결과를 낳는 폴리뉴클레오티드를 동정하였다. 따라서, 또 하나의 측면에 있어서, 본 발명은 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 단리된 및/또는 외부 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:10으로 제공되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 단리된 및/또는 외부의 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NOs:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 또는 36 내지 43 중 어느 하나로 제공되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

양호한 구현예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 이끌 수 있는 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다.

또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 제공된다.

또 하나의 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포 또는 그들의 추출물을 제공한다. 적절한 숙주 세포의 예시로는 박테리아 세포, 효모 세포 또는 식물 세포를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 좋기로는, 상기 숙주 세포는 박테리아 세포이다. 한 가지 구현예에 있어서, 상기 박테리아 세포는 대장균 ( E. coli ) 세포이다. 또 하나의 구현예에 있어서, 상기 방법은 hs 발명의 숙주 세포의 추출물 및/또는 본 발명의 벡터를 이용하여 무(無)세포 시스템에서 수행된다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 카바메이트 키나아제를 생산하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명의 숙주 세포, 또는 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 그들의 추출물을 상기 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 배양하는 것을 포함한다.

한 가지 구현예에 있어서, 상기 방법은 1 그램의 세포로부터 10 mg 이상, 더 좋기로는 15 mg 이상의 카바메이트 키나아제를 생산한다.

또 하나의 측면에 있어서, 본 발명의 방법을 사용하여 생산되는 카바모일 포스페이트가 제공된다.

또한, 본 발명의 방법을 사용하여 생산되는 화합물이 제공된다. 좋기로는, 상기 화합물은 우레아, 시트룰린, 아르기니노숙신산염, 아르기닌, 오르니틴, 또는 피리미딘이다.

본 발명의 임의의 구현예는 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 임의의 다른 구현예에 준용 ( mutatis mutandis ) 적용되는 것으로 이해될 것이다.

본 발명은 본 명세서에 개시된 구체적인 구현예들에 의하여 범위가 한정되지 아니하고, 이는 예시의 목적만을 의도하는 것이다. 기능적으로 균등한 산물들, 조성물들 및 방법들은 본 명세서에 개시한 바와 같이 명백히 본 발명의 범주 내이다.

본 명세서를 통관하여, 구체적으로 달리 언급되거나 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 하나의 단계, 물질 조성물, 단계들로 이루어지는 그룹 또는 물질 조성물들로 이루어지는 그룹은 하나 및 복수개 (예컨대, 하나 이상)의 상기 단계들, 물질 조성물들, 단계들의 그룹들 또는 물질 조성물들의 그룹을 포함하는 것으로 이해될 것이다.

이하, 본 발명을 동반 도면을 참고하여 비제한적 실시예의 방식으로 설명한다.

동반 도면의 간단한 설명

도 1. (A) 카바모일 포스페이트 음이온의 분해. (B) 카바모일 포스페이트 2 음이온의 분해.

도 2. AMP ADP 및 ATP를 a) 0.2 mM; b) 0.4 mM; c) 0.6 mM; 및 d) 0.8 mM의 농도로 함유하는 다수의 표준 용액들의 HPLC 분석.

도 3. 40℃, NaHCO ₃ (0.2 M), ATP (10 mM) 및 NH ₄ OH (<= 200 mM, u = 20 mM, p = 2 mM)에서 ADP의 Pfu CK (0.5 μM) 촉매적 생산에 대한 pH 의존.

도 4. pH 9.9, NaHCO ₃ (0.2 M), ATP (10 mM) 및 NH ₄ OH (20 mM)에서 ADP의 Pfu CK 촉매적 생산에 대한 온도 의존.

도 5. 40℃, NaHCO ₃ , ATP (10 mM) 및 NH ₄ OH (200 mM 및 20 mM)에서 30 분 반응 후 ADP의 Pfu CK 촉매적 생산에 대한 pH 의존.

도 6. pH 7.2, 8.4, 8.9, 9.4, 9.9, 10.4, 10.9 및 11.4로 조정된, 암모니아 (2 M) 및 ¹³ C-표지 중탄산나트륨 (0.2 M) 수용액에서 관찰된 탄소 공명의 적분값 (integration) 비교.

도 7. 40℃, NaHCO ₃ , ATP (10 mM) 및 NH ₄ OH (200 mM 및 20 mM)에서 30 분 반응 후 ADP의 CKs 촉매적 생산의 pH 의존.

도 8. pH 9.9, NaHCO ₃ (0.2 M), ATP (10 mM) 및 NH ₄ OH (200 mM)에서 ADP의 CKs 촉매적 생산의 온도 의존.

도 9. pH 9.9, NaHCO ₃ (0.2 M), ATP (10 mM) 및 NH ₄ OH (200 mM)에서 ADP의 CKs 촉매적 생산의 온도 의존.

도 10. DMSO 용해, a) ¹ H NMR 및 b) ¹³ C NMR에 의한 진정 우레아의 분석.

도 11. 100℃에서 4 시간 동안 암모니아 수용액 (2.5 M) 중에서 카바모일 포스페이트 (10 mg)의 반응 후 우레아 산물의 분석. DMSO 용해, a) ¹ H NMR 및 b) ¹³ C NMR.

도 12. 100℃에서 4 시간 동안 중탄산나트륨 (0.2 M), ATP (10 mM) 및 암모니아 수용액 (2.5 M) 중에서 Pfu CK (0.5 μM)의 반응 후 우레아 산물의 분석. DMSO 용해, a) ¹ H NMR 및 b) ¹³ C NMR.

도 13. (A) 및 (B). 본 발명에 유용한 몇 가지 카바메이트 키나아제의 정렬. P. 퓨리오서스 ( P. furiosus ) 카바메이트 키나아제로부터 변화한 아미노산만을 표시.

핵심 서열 목록

SEQ ID NO:1 -피로코쿠스 퓨리오서스 카바메이트 키나아제의 아미노산 서열 (NCBI Ref: NP_578405.1).

SEQ ID NO:2 -피로코쿠스 호리코시이 카바메이트 키나아제의 아미노산 서열 (NCBI Ref: NP_143170).

SEQ ID NO:3 -피로코쿠스 아비씨 카바메이트 키나아제의 아미노산 서열 (NCBI Ref: NP_126565.1).

SEQ ID NO:4 -써모코쿠스 종 카바메이트 키나아제의 아미노산 서열 (NCBI Ref: ZP_04879925.1).

SEQ ID NO:5 -써모코쿠스 감마톨레란스 카바메이트 키나아제의 아미노산 서열 (NCBI Ref: YP_002958486.1).

SEQ ID NO:6 -써모코쿠스 코다카렌시스 카바메이트 키나아제의 아미노산 서열 (NCBI Ref: YP_184571.1).

SEQ ID NO:7 -써모코쿠스 온누리뉴스 카바메이트 키나아제의 아미노산 서열 (NCBI Ref: YP_002307889.1).

SEQ ID NO:8 -써모코쿠스 바로필러스 카바메이트 키나아제의 아미노산 서열 (NCBI Ref: YP_004071992.1).

SEQ ID NO:9 -써모코쿠스 시비리쿠스 카바메이트 키나아제의 아미노산 서열 (NCBI Ref: YP_002995234.1).

SEQ ID NO:10 -피로코쿠스 퓨리오서스 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열.

SEQ ID NO:11 - 피로코쿠스 퓨리오서스 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (NCBI Ref: NC_003413).

SEQ ID NO:12 -피로코쿠스 호리코시이 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열.

SEQ ID NO:13 -피로코쿠스 호리코시이 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (NCBI Ref: NC_000961).

SEQ ID NO:14 -피로코쿠스 아비씨 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열.

SEQ ID NO:15 -피로코쿠스 아비씨 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (NCBI Ref: NC_000868).

SEQ ID NO:16 -써모코쿠스 종 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열.

SEQ ID NO:17 -써모코쿠스 종 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (reverse complement of NCBI Ref: NZ_DS999059).

SEQ ID NO:18 -써모코쿠스 감마톨레란스 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열.

SEQ ID NO:19 -써모코쿠스 감마톨레란스 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (NCBI Ref: NC_012804).

SEQ ID NO:20 -써모코쿠스 코다카렌시스 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열.

SEQ ID NO:21 -써모코쿠스 코다카렌시스 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (NCBI Ref: NC_006624).

SEQ ID NO:22 -써모코쿠스 온누리뉴스 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열.

SEQ ID NO:23 -써모코쿠스 온누리뉴스 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (NCBI Ref: NC_011529).

SEQ ID NO:24 -써모코쿠스 바로필러스 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열.

SEQ ID NO:25 -써모코쿠스 바로필러스 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (NCBI Ref: NC_014804).

SEQ ID NO:26 -써모코쿠스 시비리쿠스 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열.

SEQ ID NO:27 -써모코쿠스 시비리쿠스 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 (NCBI Ref: NC_012883).

SEQ ID NO:28 -페르비도박테리움 노도섬 카바메이트 키나아제의 아미노산 서열 (NCBI Ref: A7HNY8).

SEQ ID NO:29 -써모시포 멜라네시엔시스 카바메이트 키나아제의 아미노산 서열 (NCBI Ref: A6LPA8).

SEQ ID NO:30 -언에어로배큘럼 하이드로게니포만스 카바메이트 키나아제의 아미노산 서열 (NCBI Ref: D3L0Z7).

SEQ ID NO:31 -아미노박테리움 콜롬비엔스 카바메이트 키나아제의 아미노산 서열 (NCBI Ref: D5ECR9).

SEQ ID NO:32 -써만에어로비브리오 아시다미노보란스 카바메이트 키나아제의 아미노산 서열 (NCBI Ref: D1B8A3).

SEQ ID NO:33 -할로써모트릭스 오레니이 카바메이트 키나아제의 아미노산 서열 (NCBI Ref: B8D2J8).

SEQ ID NO:34 -코스모토가 올레아리아 카바메이트 키나아제의 아미노산 서열 (NCBI Ref: C5CE22).

SEQ ID NO:35 -무렐라 써모아세티카 카바메이트 키나아제의 아미노산 서열 (NCBI Ref: Q2RGN0).

SEQ ID NO:36 -페르비도박테리움 노도섬 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열.

SEQ ID NO:37 -써모시포 멜라네시엔시스 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열.

SEQ ID NO:38 -언에어로배큘럼 하이드로게니포만스 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열.

SEQ ID NO:39 -아미노박테리움 콜롬비엔스 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열.

SEQ ID NO:40 -써만에어로비브리오 아시다미노보란스 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열.

SEQ ID NO:41 -할로써모트릭스 오레니이 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열.

SEQ ID NO:42 -코스모토가 올레아리아 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열.

SEQ ID NO:43 -무렐라 써모아세티카 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열.

SEQ ID NO:44 -엔테로코쿠스 파에칼리스 카바메이트 키나아제의 아미노산 서열 (NCBI Ref: P0A2X7).

SEQ ID NO:45 -클로스트리듐 테타니 카바메이트 키나아제의 아미노산 서열 (NCBI Ref: Q890W1).

SEQ ID NO:46 -엔테로코쿠스 파에칼리스 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열.

SEQ ID NO:47 -클로스트리듐 테타니 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열.

SEQ ID NO:48 및 49 - 올리고뉴클레오티드 프라이머.

발명의 상세한 설명

일반 기법들 및 정의

구체적으로 달리 정의되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 이 기술 분야 (예컨대, 세포 배양, 분자 유전학, 효소학, 우레아 생산, 단백질 화학, 및 생화학)의 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 같은 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다.

달리 표시되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 재조합 단백질, 세포 배양체 및 면역학 기법들은 이 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 표준 방법들이다. 이러한 기법들은, 예컨대 문헌 [J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)], [J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)], [TA Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991)], [DM Glover and BD Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996)], 및 [FM Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present)]을 통하여 기술되고 설명된다.

"및/또는"이라는 용어, 예컨대 "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y" 중 하나를 의미하는 것으로 이해되어야 하고, 양자 모두의 의미 또는 어느 하나의 의미에 대하여 명확히 뒷받침을 제공하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명에서 사용되는 바, 반대로 언급되지 아니하는 한 "약"이라는 용어는 소정 값의 +/- 20%, 더 좋기로는 +/- 10%, 더 좋기로는 +/- 5%를 말한다.

본 명세서를 통관하여, "포함하다"라는 용어, 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹의 포함을 암시하는 것으로 이해되지만 임의의 기타 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 제외를 암시하는 것으로 이해되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 바, "고온성"은 약 45℃ 내지 약 70℃의 온도에서 생존할 수 있는 생물체, 좋기로는 박테리아이다. 본 발명에서 사용되는 바, "초고온성"은 약 70℃ 내지 약 120℃의 온도에서 생존할 수 있는 생물체, 좋기로는 박테리아이다.

카바모일 포스페이트의 합성

카바모일 포스페이트는 생물학적 시스템에서 질소 전달의 핵심 대사물질이고, 카바모일 포스페이트 합성효소 (CPS) 및 카바메이트 키나아제 (CK) 효소에 의하여 합성된다. 피로코쿠스 퓨리오서스 (Pfu) CK (EC6.3.4.16) (SEQ ID NO:1)는 그 진정한 기질이 카바메이트이고 오로지 1 몰의 ATP를 이용한다는 것이 밝혀지기까지 처음에는 CPS로서 분류되었다. 카바메이트를 효소적으로 생산한 후 카바모일 포스페이트로 전환하는 CPS와는 달리, Pfu Ck는 이산화탄소와 암모니아로부터 화학적으로 형성된 카바메이트를 전환한다 (식 1).

암모니아, 이산화탄소 및 카바메이트로 형성된 평형은 NH ₃ 에 대한 CO ₂ 의 비에 의하여 주로 결정된다 (Mani et al., 2006). 용액 내에 암모니아 및 CO ₂ 의 양이 동일할 때, 중탄산암모늄이 주 산물이다 (식 2). 이용 가능한 암모니아가 과량이라면, 평형은 암모늄 카바메이트의 형성을 선호한다 (식 3).

본 발명의 발명자들은 하나의 공정에서 암모니아가 카바모일 포스페이트로 전환될 수 있는 방법을 개발하였다. 이러한 시스템의 장점은 pH가 높고 암모니아의 농도가 낮은 두 가지 조건 모두에서 수행될 수 있다는 것이다. 고 pH는 대부분의 암모니아가 암모늄의 형태가 아니도록 하지만, 비교적 낮은 암모니아 농도는 상기 방법으로 하여금 생물학적 폐기물 및 수 폐기물과 같은 제공원으로부터 암모니아를 제거하기에 적합하도록 만든다.

실시예에서 제시되는 효소 pH-속도 프로파일은 2 mM, 20 mM 및 200 mM의 암모니아의 존재 하, 대략 pH 9.9에서 카바메이트 키나아제의 최대 속도를 나타내고 있다. 이것은 Durbecq et al. (1997)에 의하여 보고된 결과와는 반대되는 것이다. 또한, 연구된 이 암모니아 농도에서, pH 농도가 더 중성일수록 실제로 연관 카바메이트 가용성 감소에 기인하여 카바모일 포스페이트 합성에 해가 된다는 것은 명백하다.

생성물의 안정성은 pH에 의하여도 영향을 받는다. 카바모일 포스페이트는 수용성 조건에서 불안정하고 쉽게 분해된다 (Wang et al., 2008). 분해가 일어나는 경로는 pH 의존성이다. pH 2 내지 4에서 존재하는 음이온은 암모니아, 탄산염 및 포스페이트로 분해되지만 (도 1A), 알칼리 조건에서 존재하는 2 음이온은 포스페이트와 시아네이트로 분해된다 (도 1B). 분해 경로는 후속 변환에 중요한데, 추가적인 질소 치환은 암모니아와 탄산염으로는 불가능하고 시아네이트와는 쉽게 일어난다고 알려져 있기 때문이다 (Wen and Brooker, 1994). 예컨대, 우레아 형성은 탄산염을 암모니아로 처리하는 경우에는 일어나지 않지만, 시아네이트 및 시안산 중 하나 이상을 암모니아로 처리하는 경우에는 형성되고 우레아 생산은 암모니아 농도가 증가함에따라 증가한다.

졸기로는 카바모일 포스페이트를 생산하는 반응에서 암모니아의 농도는 약 1 mM 이상이다. 한 가지 구현예에 있어서, 상기 암모니아 농도는 약 1 mM 내지 약 5 M이다. 또 한 가지 구현예에 있어서, 상기 암모니아 농도는 약 2 mM 내지 약 2 M이다. 암모니아의 농도가 높은 경우, 우레아는 본 발명에서 개시하는 중간체를 거쳐 카바모일 포스페이트로부터 형성될 수 있다.

한 가지 구현예에 있어서, ATP 농도는 약 0.1 mM 이상이다. 또 한 가지 구현예에 있어서, 상기 ATP 농도는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM이다. 또 한 가지 구현예에 있어서, 상기 ATP 농도는 약 1 mM 내지 약 20 mM이다. 또 한 가지 구현예에 있어서, 상기 ATP 농도는 약 10 mM이다.

한 가지 구현예에 있어서, 중탄산염은 중탄산나트륨으로 제공된다. 한 가지 구현예에 있어서, 상기 중탄산염의 농도는 약 10 mM 이상이다. 또 한 가지 구현예에 있어서, 상기 중탄산염의 농도는 약 10 mM 내지 약 1 M이다. 또 한 가지 구현예에 있어서, 상기 중탄산염의 농도는 약 100 mM 내지 약 500 mM이다. 또 한 가지 구현예에 있어서, 상기 중탄산염의 농도는 약 200 mM이다.

구체적인 효소가 내인할 수 있는 온도에 따라, 반응은 약 10℃ 내지 약 100℃를 포함하는 온도 범위에서 수행될 수 있다. 한 가지 구현예에 있어서, 상기 온도는 약 10℃ 내지 약 80℃이다. 그러나, 일부 상황에서는, 상기 반응을 효소의 최적 온도보다 낮은 온도, 예컨대 약 20℃ 내지 30℃에서 수행하는 것이 더욱 경제적 및/또는 실용적일 수 있다 (예컨대, 폐수에서 암모늄/암모니아를 사용하는 경우). 예컨대, SEQ ID NOs 1 내지 9로 제공되는 특정 효소에 대하여는 고온, 예컨대 약 90℃ 내지 약 100℃에서 및 충분한 수준의 암모니아의 존재하에서 우레아가 생산될 것이다.

또 다른 구현예에 있어서, 카바메이트 키나아제는 pH 10.5, 11 또는 11.5에서 그 최대 활성의 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상 또는 60% 이상을 유지한다. 이것은, 예컨대 20mM 또는 200mM의 NH ₄ OH 농도를 이용하여 실시예 5에 기술된 과정을 이용하여 측정될 수 있다.

본 발명은 물, 예컨대 폐수, 물질로부터 암모니아를 제거 또는 적어도 그 농도를 감소시키는 데 사용될 수 있다. 예컨대, 상기 폐기물은 농업 공정 또는 공업 공정으로부터 유래할 수 있다. 한 가지 구현예에 있어서, 상기 폐기 물질은 댐 또는 스트림으로부터의 물과 같은 액체형이다. 또 다른 구현예에 있어서, 상기 폐기 물질은, 특히 인간 및/또는 동물 폐기물을 포함하는 하수이다. 또 다른 구현예에 있어서, 상기 폐기 물질은 배기 가스와 같은 기체이다.

한 가지 구현예에 있어서, 상기 폐기 물질은 현탁된 고체물을 제거하기 위한 정화되는 액체형이다. 정화는 종래의 장비, 예컨대 릴리프 정화기, 연마 필터 등을 이용하여 수행될 수 있다.

우레아의 합성

암모늄과 시아네이트 (예를 들자면)를 우레아로 전환시키기 위하여 두 가지 상이한 경로가 제안되었다. 첫째는 이온 메커니즘을 통한 NH ₄ ⁺ + NCO ^- → CO(NH ₂ ) ₂ 이고 다른 것은 암모니아와 시안산의 반응을 이용하는 비-이온 메커니즘 NH ₃ + HNCO → CO(NH ₂ ) ₂ 이다. 실제 메커니즘인 것의 가장 설득력있는 증거는 Wen and Brooker (1994)에 의하여 보고되었다. 이들은 시아네이트의 우레아로의 반응 속도가 암모니아보다는 암모늄의 농도에 직접적으로 비례한다고 보고하였고 이온 메커니즘을 뒷받침하였다.

본 발명의 방법을 이용하여 생산되는 카바모일 포스페이트는 우레아 합성에 사용될 수 있다. 그 반응에 암모니아가 필요하고, 이는 일반적으로 약 90℃ 이상의 고온에서 수행된다.

한 가지 구현예에 있어서, 우레아는 하나의 용기에서, 좋기로는 연속적인 시스템으로 생산된다.

또 다른 구현예에 있어서, 다수의 단계로 생산된다. 예컨대, CK는 90℃보다 높은 온도에서 (예컨대, 90℃ 내지 100℃)에서 기능하지만, 카바모일 포스페이트의 생산은 통상 더 낮은 온도 (예컨대, 60℃)에서 더 효율적이다. 한 가지 예시에 있어서, 카바모일 포스페이트는 본 발명에 따라 고체 기판 상에 고정된 효소를 이용하여 생산된다. 생산된 상기 카바모일 포스페이트는 그 후 상기 고체 기판으로부터 분리되는데, 예컨대 고체 기판은 컬럼형이고 카바모일 포스페이트가 그 컬럼으로부터 용리되는 것이다. 이 용리된 카바모일 포스페이트는 그 후 적절한 수지에 결합되고 이어서 암모니아를 포함하는 용액으로 이 수지를 수세하여 상기 카바모일 포스페이트는 본 발명에서 정의하는 중간체를 거쳐 우레아로 전환된다. 이것은 우레아를 생산할 뿐 아니라 그 분자를 수지로부터 유리되도록 하여 우레아가 수지로부터 용리된 물질 내로 수집되도록 한다.

본 발명에 적합한 수지로는 모노- 또는 디-음이온성 수지, 예컨대 폐기수 및 토양으로부터 포스페이트를 제거하는 데 사용되는 것들을 들 수 있다. 예시로는 KFR-3tT-40, SBS-3 및 Amberlite IRA-400 (Rohm & Haas)를 들 수 있다.

좋기로는 우레아를 생산하기 위한 이 반응의 암모니아 농도는 약 2.5 M 이상이다. 한 가지 구현예에 있어서, 상기 암모니아 농도는 약 2.5 M 내지 약 40 M이다. 또 다른 구현예에 있어서, 상기 암모니아 농도는 약 2.5 M 내지 약 10 M이다.

카바메이트 키나아제

본 발명에서 사용되는 바, "카바메이트 키나아제" 또는 "CK"는 카바메이트를 카바모일 포스페이트로 전환할 수 있는 효소이다. 본 발명의 방법에 있어서, 암모니아와 CO ₂ , 또는 그들의 수화형은 화학 반응에서 카바메이트로 전환되고, 결과물 카바메이트 및 ATP는 카바메이트 키나아제에 의한 효소-촉매 반응에서 카바모일 포스페이트로 전환된다. 본 발명의 방법에서 사용되는 카바메이트 키나아제는 일부 카바모일 포스페이트 합성효소 (CPS) 활성을 가지거나 갖지 않을 수 있고, 따라서 3 단계로 암모니아, 중탄산염 및 ATP로부터 비가역적으로 카바모일 포스페이트를 합성할 수 있다. 양호한 구현예에 있어서, 상기 카바메이트 키나아제는 어떠한 CPS 활성을 갖지 않는다.

"폴리펩타이드", "단백질" 및 "카바메이트 키나아제"라는 용어들은 일반적으로 상호교환적으로 사용되고 비-아미노산기의 부가로 변형되거나 변형되지 않을 수 있는 하나의 폴리펩타이드쇄를 말한다. 이러한 폴리펩타이드쇄가 다른 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 다른 분자, 예컨대 공-인자 (co-factor)와 관련될 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명에서 사용되는 바 "단백질", "폴리펩타이드", "카바메이트 키나아제"라는 용어들은 또한 본 발명에서 개시하는 폴리펩타이드의 변이체, 돌연변이체, 생물학적 활성 단편, 변형체, 유사체 및/또는 유도체를 포함한다.

폴리펩타이드의 % 상동성은 갭 형성 벌점 (gap creation penalty) = 5, 및 갭 확장 벌점 (gap extension penalty) = 0.3인 GAP (Needleman and Wunsch, 1970) 분석 (GCG program)에 의하여 결정된다. 쿼리 서열 (query sequence)은 25개 아미노산 길이 이상이고, GAP 분석은 25개 아미노산의 영역에 걸쳐 두 서열을 정렬한다. 더욱 좋기로는, 상기 쿼리 서열은 50개 아미노산 길이 이상이고, 상기 GAP 분석은 50개 아미노산 이상의 영역에 걸쳐 두 서열을 정렬한다. 더욱 좋기로는, 상기 쿼리 서열은 100개 아미노산 길이 이상이고, 상기 GAP 분석은 100개 아미노산 이상의 영역에 걸쳐 두 서열을 정렬한다. 더 더욱 좋기로는, 상기 쿼리 서열은 250개 아미노산 길이 이상이고, 상기 GAP 분석은 250개 아미노산 이상의 영역에 걸쳐 두 서열을 정렬한다. 더 더욱 좋기로는, 상기 쿼리 서열은 300개 아미노산 길이 이상이고, 상기 GAP 분석은 300개 아미노산 이상의 영역에 걸쳐 두 서열을 정렬한다. 더 더욱 좋기로는 상기 GAP 분석은 전장에 걸쳐 두 서열을 정렬한다.

본 발명에서 사용되는 바, "생물학적 활성 단편"은 카바메이트와 ATP를 카바모일 포스페이트로 전환하는 능력을 보유하는 본 발명에 개시되는 폴리펩타이드의 일부분이다. 생물학적 활성 단편은 그들이 그 정의된 활성을 보유하는 한 임의의 크기일 수 있다. 좋기로는, 생물학적 활성 단편들은 200개 아미노산 길이 이상, 더욱 좋기로는 300개 아미노산 길이 이상이다.

정의된 폴리펩타이드에 관하여, 상기 제공된 것들보다 높은 % 상동성 수치들이 양호한 구현예들을 포함할 것이라는 것을 이해할 것이다. 따라서, 적용 가능한 경우, 최소 % 상동성 수치의 관점에서 상기 폴리펩타이드는 지명된 해당 SEQ ID NO와 상동성이 55% 이상, 더욱 좋기로는 60% 이상, 더욱 좋기로는 70% 이상, 더욱 좋기로는 75% 이상, 더욱 좋기로는 80% 이상, 더욱 좋기로는 85% 이상, 더욱 좋기로는 90% 이상, 더욱 좋기로는 91% 이상, 더욱 좋기로는 92% 이상, 더욱 좋기로는 93% 이상, 더욱 좋기로는 94% 이상, 더욱 좋기로는 95% 이상, 더욱 좋기로는 96% 이상, 더욱 좋기로는 97% 이상, 더욱 좋기로는 98% 이상, 더욱 좋기로는 99% 이상, 더욱 좋기로는 99.1% 이상, 더욱 좋기로는 99.2% 이상, 더욱 좋기로는 99.3% 이상, 더욱 좋기로는 99.4% 이상, 더욱 좋기로는 99.5% 이상, 더욱 좋기로는 99.6% 이상, 더욱 좋기로는 99.7% 이상, 더욱 좋기로는 99.8% 이상, 및 더 더욱 좋기로는 99.9% 이상인 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명에 개시되는 폴리펩타이드의 아미노산 서열 돌연변이는 본 발명에서 정의되는 핸산 내로 적당한 뉴클레오티드 변화를 도입하거나, 원하는 폴리펩타이드를 실험실 내 ( in vitro ) 합성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 돌연변이는, 그 아미노산 서열 내에, 예컨대 잔기에의 결실, 삽입 또는 치환을 포함한다. 최종 폴리펩타이드 산물이 원하는 특성을 갖는다면, 상기 최종 컨스트럭트에 이르기 위하여 결실, 삽입 및 치환의 조합이 이루어질 수 있다.

돌연변이 (변경된) 폴리펩타이드는 이 기술 분야에 알려진 임의의 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 예컨대, 본 발명에 개시된 폴리뉴클레오티드에는 실험실 내 돌연변이화 (mutagenesis)가 가해질 수 있다. 이러한 실험실 내 돌연변이화 기법은 적절한 벡터로 폴리뉴클레오티드를 서브-클로닝하고, 상기 벡터를 대장균 XL-1 레드 (Stratagene)와 같은 "돌연변이 유발 (mutator)" 균주에 형질전환시키고 상기 형질전환된 박테리아를 적절한 수의 세대에 걸쳐 전파시키는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 예시에 있어서, 본 발명에 개시된 폴리뉴클레오티드 (예컨대, SEQ ID NOs 10 내지 27 또는 36 내지 43)에는 Harayama (1998)에 광범위하게 개시된 DNA 셔플링 기법이 가해진다. 돌연변이된/변경된 DNA로부터 유래되는 산물들은 그들이 카바메이트 키나아제 활성을 갖는지 결정하기 위하여 본 발명에 개시된 기법들을 이용하여 쉽게 스크리닝될 수 있다.

아미노산 서열 돌연변이를 설계하는 데 있어서, 돌연변이의 자리의 위치 및 돌연변이의 성질은 변형될 특성(들)에 달려있다. 돌연변이 자리는 개별적으로 또는 시리즈로 변형될 수 있는데, 예컨대 (1) 우선 보존적 아미노산을 선택하여 치환한 후 이루어진 결과에 따라 보다 급진적인 선택으로 치환하거나, (2) 표적 잔기를 결실시키거나, 또는 (3) 상기 위치한 자리에 인접한 다른 잔기들을 삽입함으로써 그러하다.

아미노산 서열 결실은 일반적으로 약 1개 내지 15개 잔기들의 범위이고, 더욱 좋기로는 약 1개 내지 10개 잔기, 통상적으로 약 1개 내지 5개의 인접 잔기들에 걸쳐 있다.

치환 돌연변이는 폴리펩타이드 분자 내 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거되고 그 위치에 다른 잔기가 삽입되는 것이다. 대상 자리는 다양한 균주들 또는 종들로부터 온 특정 잔기가 동일한 자리이다. 이러한 위치는 생물학적 활성상 중요할 수 있다. 특히 적어도 3개의 다른 동일하게 보존된 자리들의 서열 내에 있는 이들 자리는 좋기로는 비교적 보존적인 방식으로 치환된다. 이러한 보존적 치환이 표 1에 나타나 있다.

한 가지 양호한 구현예에 있어서, 돌연변이체/변이체 폴리펩타이드는 자연적으로 존재하는 폴리펩타이드에 비하여 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개의 보존적 아미노산 변화가 있거나, 레퍼런스 서열, 예컨대 SEQ ID NOs: 1 내지 9 또는 28 내지 35의 서열에 대하여 10개 또는 15개 또는 20개 이하의 아미노산 변화가 있다. 보존적 아미노산 변화 상세가 표 1에 제시되어 있다. 당업자라면 인식할 바와 같이, 재조합 세포에서 발현시 이러한 미약한 변화가 그 폴리펩타이드의 활성을 변화시키지 않을 것을 타당하게 예측할 수 있을 것이다.

표 1. 예시적 치환.

P. 퓨리오서스 CK (SEQ ID NO:1)의 결정 구조, 및 구조/기능 관계가 Ramon-Maiques et al. (2000)에 설명되어 있다. 이들의 연구는 구조가 어떻게 그 열안정성과 관련되어 있는지 및 활성 자리의 구조가 어떻게 그 기능과 관련되어 있는지를 논의하고 있다. 이들은 상기 효소의 열안정성이 서브유닛간 소수성 접촉 연장의 결과 및 노출된 이온쌍의 수가 많은 결과일 것이라고 결론지을 수 있었고, 37℃에서의 낮은 속도는 아마도 느린 산물 해리의 결과이다. Ramon-Maiques et al. (2000)은 산물 해리가 늦는 원인을 "Met274 및 TYR244 사이에 샌드위치된" 퓨린 고리의 강한 결합, 및 Ala241의 아데닌 NH ₂ 및 NH와 수소 결합을 형성하는 His268 및 Ala241의 산소 원자들과의 결합이 아데닌 N1에서 또 다른 수소 결합을 만들기 때문이라고 여기고 있다. 이들은 그 결합들이 상기 효소의 아데닌 뉴클레오티드에 대한 특이성 정도를 높이는 결과를 낳는 것이라고 말하고 있다. 또한, 카바모일 모이어티는 10Gly-Gly-Asn 및 52Gly-Asn-Gly과 상호작용하고, 포스포릴기 이동은 3개의 온전히 보존된 리신 잔기들, Lys131, Lys215 및 Lys277과 연루되어 있는데 (Ramon-Maiques et al., 2000), 이들은 모두 실시예 5에서 시험된 효소들에서 보존되어 있다. 또한, Asp65 및 Tyr71는 알파 베타 나선 간 2-폴드 대칭 관련 상호작용을 규정하는 반면, Gln94는 수소 결합 네트워크를 확장하는 데 참여한다. Asp65는 분석된 모든 써모코치 ( Thermococci )에 보존되어 있다. 전하를 띠는 잔기는 시험된 모든 카바메이트 키나아제를 통하여 글루타메이트 또는 아스파테이트로서 보존되어 있다. P. 퓨리오서스 CK의 71번 아미노산은 모든 써모코치에서 티로신 또는 히스티딘이지만 시험된 다른 카바메이트 키나아제에는 존재하지 않는다. P. 퓨리오서스 CK의 94번 아미노산은 써모코치에서 글루타민 또는 글리신이고, 시험된 다른 카바메이트 키나아제에서는 알라닌 또는 글루타민이다. 당업자라면 인식할 바와 같이, Ramon-Maiques et al.에 의한 것과 같은 연구는 본 발명에 유용한 자연적으로 존재하는 CKs의 기능적 변이체 설계에 있어 고려할 만한 지침을 제공한다.

당업자는 이해할 바와 같이, 본 발명에 개시된 폴리펩타이드들 (예컨대, SEQ ID NOs: 1 내지 9 또는 28 내지 35 중 2 이상으로 제공되는 서열을 갖는 것들)은 변이체/돌연변이체 효소들의 설계를 돕기 위하여 정렬될 수 있다 (예컨대, 도 13 참조). 좋기로는, 고도로 보존된 아미노산은 유지되거나, 또는 가능하게는 보존되는 방식으로 치환된다 (표 1 참조). 또 다른 구현예에 있어서, 단백질의 아미노산이 변경된다면, 다른 카바메이트 키나아제, 예컨대 SEQ ID NOs: 1 내지 9 또는 28 내지 35로 제공되는 것들 중 하나의 대응 위치에서 발견되는 아미노산으로 치환된다.

또한, 필요하다면, 비천연 아미노산 또는 화학적 아미노산 유사체들이 본 발명에 개시되는 폴리펩타이드에 치환체 또는 부가체로서 도입될 수 있다. 이러한 아미노산으로는 일반적인 아미노산의 D-이성질체, 2,4-디아미노부티르산, α-아미노 이소부티르산, 4-아미노부티르산, 2-아미노부티르산, 6-아미노헥산산, 2-아미노이소부티르산, 3-아미노프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사르코신 , 시트룰린, 호모시트룰린, 시스테산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, 플루오로-아미노산, 디자이너 아미노산, 예컨대 β-메틸 아미노산, Cα-메틸 아미노산, N알파-메틸 아미노산, 및 일반적인 아미노산 유사체를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 합성 중 또는 합성 후 차등적으로 변형, 예컨대 비오티닐화, 벤질화, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지의 보호기/블록화기에 의한 유도체화, 단백질 분해 절단, 항체 분자 또는 기타 세포 리간드와의 연결 등에 의하여 변형되는 폴리펩타이드들이 본 발명의 범위에 포함된다. 이들 변형은 폴리펩타이드의 안정성 및/또는 생활성을 증가시키는 데 기여할 수 있다.

본 발명에 개시된 폴리펩타이드들은 다양한 방법으로 생산될 수 있는데, 예컨대 천연 폴리펩타이드의 생산 및 회수, 재조합 폴리펩타이드의 생산 및 회수, 및 폴리펩타이드의 화학 합성을 들 수 있다. 한 가지 구현예에 있어서, 효소는 그 폴리펩타이드를 생산하기에 효과적인 조건하에서 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 세포를 배양하고, 그 폴리펩타이드를 회수함으로써 생산된다. 배양하기에 양호한 세포는 본 발명에 기재된 것과 같은 재조합 세포이다. 효과적인 배양 조건으로는 효과적인 배지, 바이오리액터, 온도, pH 및 폴리펩타이드 생산을 가능케 하는 산소 조건을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 효과적인 배지는 상기 폴리펩타이드를 생산하기 위하여 세포가 배양되는 임의의 배지를 말한다. 이러한 배지는 통상적으로 동화가능한 탄소, 질소 및 포스페이트 원, 및 적절한 염, 미네랄, 금속 및 기타 영양소, 예컨대 비타민을 갖는 수성 배지이다. 세포는 관용적인 발효 바이오리액터, 쉐이크 플라스크, 시험관, 마이크로타이터 디쉬, 및 페트리 플레이트에서 배양될 수 있다. 배양은 재조합 세포용으로 적당한 dhse도, pH 및 산소 함량에서 수팽될 수 있다. 이러한 배양 조건은 이 기술 분야의 당업자의 전분 분야 내이다. 또 다른 구현예에 있어서, 본 발명에 기재된 폴리펩타이드는 무세포 시스템에서 생산될 수 있다. 무세포 시스템은 통상적으로 생물학적 추출물 및/또는 정의된 시약들을 포함하는 반응 혼합물을 포함한다. 상기 반응 혼합물은 폴리펩타이드의 생산을 위한 주형, 예컨대 DNA, mRNA 등; 아미노산, 효소 및 기타 합성에 필요한 시약들, 예컨대 리보좀, tRNA, 중합효소, 전사 인자 등을 포함할 것이다. 예컨대, 상기 생물학적 추출물은 상기 폴리펩타이드를 생산하는 대장균, 써모코쿠스 종 또는 피로코쿠스 종 세포의 것일 수 있다. 이러한 합성 반응 시스템은 이 기술 분야에 잘 알려져 있고 문헌에 개시되어 왔다. 무세포 합성 반응은 이 기술 분야에 알려져 있는 바 뱃치, 연속 흐름, 또는 세미-연속 흐름식으로 수행될 수 있다.

한 가지 구현예에 있어서, 상기 효소는 세포로부터 상기 폴리펩타이드의 분비를 이끌어 낼 수 있는 신호 서열을 포함한다. 이러한 신호 서열 중 다수가 단리되었는데, 이들은 N- 및 C-말단 신호 서열을 포함한다. 원핵 및 진핵 N-말단 신호 서열은 유사하고, 진핵 N-말단 신호 서열이 박테리아에서 분비 서열로서 기능할 수 있음이 알려졌다. 이러한 N-말단 신호 서열의 예시는 박테리아 β-락타마아제 신호 서열이고, 이는 잘 연구된 서열로, 외부 환경으로 폴리펩타이드의 분비를 촉진하는데 광범위하게 이용되어 왔다. C-말단 신호 서열의 예시로는 대장균의 헤모리신 A (hly A) 신호 서열을 든다. 신호 서열들의 또 다른 예시들로는 아에로리신 (aerolysin), 알칼라인 포스파타아제 유전자 (phoA), 키티나아제, 엔도키티나아제, α-헤모리신, MIpB, 풀루라나아제, Yops 및 TAT 신호 펩타이드를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

폴리뉴클레오티드

예컨대, DNA, RNA, 또는 이들의 조합, 단일 가닥 또는 이중 가닥, 센스 또는 안티센스 배향 또는 이들 양자의 조합, dsRNA 또는 기타 등을 포함하는 "단리된 폴리뉴클레오티드"라는 용어로써, 본 발명자들은 그가 관련되어 있거나 그 본래 상태와 연결된 폴리뉴클레오티드 서열로부터 적어도 부분적으로 분리되어 있는 폴리뉴클레오티드를 의도한다. 좋기로는, 이 단리된 폴리뉴클레오티드는 그들이 자연적으로 관련되어 있는 다른 요소들로부터 60% 이상, 좋기로는 75% 이상, 가장 좋기로는 90% 이상 자유롭다. 또한, "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 본 발명에서 "핵산"이라는 용어와 상호교환적으로 사용된다.

폴리뉴클레오티드의 맥락상 "외인성"라는 용어는 세포 내에 또는 무세포 발현 시스템 내에 그 본래 상태에 비하여 변화된 양으로 존재하는 경우의 폴리뉴클레오티드를 말한다. 한 가지 구현예에 있어서, 상기 세포는 자연적으로 그 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 세포이다. 그러나, 상기 세포는 인코딩되는 폴리펩타이드의 생산량을 변화, 좋기로는 증가시키는 결과를 낳는 비-내인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포일 수 있다. 본 발명의 외인성 폴리뉴클레오티드는 그가 존재하는 트랜스제닉 (재조합) 세포, 또는 무세포 발현 시스템의 다른 요소들로부터 분리되지 않은 폴리뉴클레오티드 및 후속하여 적어도 몇몇 다른 요소들로부터 정제되는 이러한 세포 또는 무세포 시스템에서 생산된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명으로 제공되는 분자들과 비교할 때 뉴클레오티드 잔기의 결실, 삽입, 또는 치환인 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 돌연변이체는 자연적으로 존재하거나 (즉, 천연 제공원으로부터 단리) 또는 합성 (예컨대 핵산 상에 자리-지정 돌연변이화를 수행함으로써 이루어짐)인 것 중 하나일 수 있다.

보통, 폴리뉴클레오티드의 단량체는 포스포디에스테르 결합 또는 그 유사한 것으로 연결된다. 포스포디에스테르 연결의 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐리데이트 및 포스포르아미데이트를 포함한다.

재조합 벡터

본 발명의 한 가지 구현예는 재조합 벡터를 포함하는데, 이는 숙주 세포 내로 그 폴리뉴클레오티드 분자를 전달할 수 있는 임의의 벡터 내에 삽입된 본 발명의 단리/외인성 폴리뉴클레오티드를 하나 이상 포함한다. 또한, 재조합 벡터는 본 발명에 유용한 카바메이트 키나아제를 생산하는 데 사용될 수 있는데, 예컨대 재조합 벡터는 SEQ ID NOs: 10 내지 27 또는 36 내지 43 중 어느 하나로 제공되는 뉴클레오티드 서열 또는 그들 중 하나 이상과 50% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 벡터는 이형 폴리뉴클레오티드 서열, 즉 자연적으로 카바메이트 키나아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자와 인접하는 것으로 밝혀져 있지 않고 좋기로는 상기 폴리뉴클레오티드 분자(들)이 유래하는 종 이외의 종으로부터 유래하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 벡터는 RNA 또는 DNA 중 어느 하나, 원핵 또는 진핵 중 어느 하나일 수 있고, 통상 트랜스포존 (예컨대 US 5,792,924에 기재), 바이러스 또는 플라스미드일 수 있다.

재조합 벡터의 한 가지 유형은 발현 벡터와 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오티드(들)을 포함한다. "작동적으로 연결된"이라는 구문은 분자가 숙주 세포로 형질전환될 때 발현될 수 있는 방식으로 발현 벡터 내로 그 폴리뉴클레오티드 분자를 삽입하는 것을 말한다. 본 발명에서 사용되는 바, 발현 벡터는 숙주 세포를 형질전환할 수 있고 특정된 폴리뉴클레오티드 분자의 발현에 영향을 미칠 수 있는 DNA 또는 RNA 벡터이다. 좋기로는, 발현 벡터는 그 숙주 세포 내에서 자기복제할 수도 있다. 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 중 어느 하나일 수 있고, 통상적으로 바이러스 또는 플라스미드이다. 발현 벡터는 재조합 세포, 예컨대 박테리아, 곰팡이, 내부 기생충, 절지동물, 동물 및 식물 세포에서 기능하는 (즉, 직접적 유전자 발현) 임의의 벡터를 포함한다. 본 발명의 벡터는 또한 무세포 발현 시스템에서 폴리펩타이드를 생산하는 데 사용될 수 있고, 이러한 시스템은 이 기술 분야에 잘 알려져 있다.

본 발명에서 사용되는 바 "작동적으로 연결된"이라는 용어는 2 이상의 핵산 (예컨대, DNA) 분절 간 기능적 관계를 말한다. 통상적으로, 이것은 전사 조절 요소의 전사되는 서열에 대한 기능적 관계를 말한다. 예컨대, 프로모터는, 그것이 적절한 숙주 세포에서 및/또는 무세포 발현 시스템에서 코딩하는 서열의 전사를 자극하거나 조절한다면 코딩하는 서열, 예컨대 본 발명에 정의된 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결된 것이다. 일반적으로, 전사되는 서열과 작동적으로 연결되는 프로모터 전사 조절 요소들은 물리적으로 전사되는 서열과 인접하여 있는데, 즉 이것이 시스-액팅 ( cis -acting)이다. 그러나, 몇몇 전사 조절 요소들, 예컨대 인핸서들은 그 전사를 그들이 증가시키는 코딩 서열과 물리적으로 인접하거나 가까이 접하여 위치할 필요가 없다.

특히, 발현 벡터는 조절 서열들, 예컨대 전사 조절 서열, 번역 조절 서열, 복제 오리진 및 기타 재조합 세포와 상용되고 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 조절하는 조절 서열들을 포함한다. 특히, 재조합 분자들은 전사 조절 서열들을 포함한다. 전사 조절 서열들은 전사의 개시, 연장, 및 종결을 제어하는 서열들이다. 특히 중요한 전사 조절 서열들은 전사 개시를 조절하는 서열들, 예컨대 프로모터, 인핸서, 작동자 (operator) 및 억제자 (repressor) 서열들이다. 적절한 전사 조절 서열들은 본 발명에서 개시하는 재조합 세포들 중 하나 이상에서 기능할 수 있는 임의의 전사 조절 서열을 포함한다. 이러한 다양한 전사 조절 서열들이 이 기술 분야에 알려져 있다. 양호한 전사 조절 서열들은 박테리아, 효모, 절지동물, 선충, 식물 또는 동물 세포에서 기능하는 것들을 포함하는데, 예컨대 tac, lac, trp, trc, oxy-pro, omp/lpp, rrnB, 박테리오파지 람다, 박테리오파지 T7, T7lac, 박테리오파지 T3, 박테리오파지 SP6, 박테리오파지 SP01, 메탈로티오네인, 알파-결합 인자, 피키아 알코올 산화효소, 알파바이러스 하위유전자 프로모터들 (예컨대 신드비스 바이러스 하위유전자 프로모터들), 항생제 내성 유전자, 배큘로바이러스, 헬리오티스 제아 ( Heliothis zea ) 곤충 바이러스, 우두 바이러스, 헤르페스바이러스, 너구리 폭스바이러스, 기타 폭스바이러스, 아데노바이러스, 싸이토메갈로바이러스 (예컨대, 중간체 초기 프로모터), 시미안 바이러스 40, 레트로바이러스, 액틴, 레트로바이러스 장말단 반복, 루스 사코마 바이러스, 히트 쇼크, 포스페이트 및 질산염 전사 조절 서열들 및 기타 원핵 또는 진핵 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 서열들을 들 수 있다.

숙주 세포

본 발명의 또 다른 구현예는 본 발명에 개시된 하나 이상의 재조합 분자들로 형질전환된 숙주 세포, 또는 숙주 세포의 용도 또는 그들의 자손을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 분자의 세포 내로의 형질전환은 그 방법에 의하여 폴리뉴클레오티드 분자가 세포 내로 삽입될 수 있는 임의의 방법으로 달성될 수 있다. 형질전환 기법으로는 트랜스펙션, 전기천공, 마이크로인젝션, 리포펙션, 흡착 및 원형질 융합을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 재조합 세포는 단세포로 남거나 조직, 기관 또는 다세포 생물체로 자랄 수 있다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드 분자들은 염색체 밖에 잔류하거나 형질전환된 (즉, 재조합) 세포의 염색체 내 하나 이상의 위치에 그들의 발현능을 유지하는 방식으로 통합될 수 있다.

형질전환에 적합한 숙주 세포는 본 발명에 정의된 폴리뉴클레오티드로 형질전환될 수 있는 임의의 세포를 포함한다. 숙주 세포는 내인적으로 (즉, 자연적으로) 본 발명에 개시된 폴리펩타이드를 생산할 수 있거나 또는 본 발명에 기재된 바와 같이 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자로 형질전환된 후 이러한 폴리펩타이드를 생산할 수 있을 수 있다. 숙주 세포는 본 발명에 정의된 하나 이상의 단백질을 생산할 수 있는 임의의 세포일 수 있고, 박테리아, 곰팡이 (효모 포함), 기생충, 선충, 절지동물, 동물 및 식물 세포를 포함한다. 숙주 세포의 예시로는 살모넬라 ( Salmonella ), 에스케리치아 ( Escherichia ), 바실러스 ( Bacillus ), 리스테리아 ( Listeria ), 새커로마이세스 ( Saccharomyces ), 스포도프테라 ( Spodoptera ), 마이코박테리아 ( Mycobacteria ), 트리코플러시아 ( Trichoplusia ), BHK (새끼 햄스터 신장) 세포, MDCK 세포, CRFK 세포, CV-1 세포, COS (예컨대, COS-7) 세포, 및 베로 세포를 들 수 있다. 숙주 세포의 또 다른 예시로는 대장균, 예컨대 대장균 K-12 유도체; 살모넬라 타이피 ( Salmonella typhi ); 살모넬라 타이피우리움 ( Salmonella typhimurium ), 예컨대 약독 균주; 스포도프테라 프루기페르다 ( Spodoptera frugiperda ); 트리코플루시아 나이 ( Trichoplusia ni ); 및 비종양성 마우스 근모세포 G8 세포 (예컨대, ATCC CRL 1246)를 들 수 있다. 유용한 효모 세포로는 피치아 종 ( Pichia sp .), 아스페르길러스 종 ( Aspergillus sp .) 및 새커로마이세스 종 ( Saccharomyces sp .)을 들 수 있다. 특히 양호한 숙주 세포는 박테리아 세포, 효모 세포 또는 식물 세포이다.

재조합 DNA 기법은, 예컨대 숙주 세포 내에서의 폴리뉴클레오티드 분자의 카피 수, 폴리뉴클레오티드 분자가 전사되는 효율, 결과물 전사체가 번역되는 효율 및 번역-후 변형의 효율을 조작함으로써 형질전환되는 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 향상시키는 데 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 분자의 발현 증가에 유용한 재조합 기법들로는 폴리뉴클레오티드 분자의 카피 수가 많은 플라스미드로의 작동적 연결, 하나 이상의 숙주 세포 염색체로의 폴리뉴클레오티드 분자의 통합, 벡터 안정 서열의 플라스미드로의 첨가, 전사 조절 신호의 치환 또는 변형 (예컨대, 프로모터, 작동자, 인핸서), 번역 조절 신호의 치환 또는 변형 (예컨대, 리보좀 결합 자리, 샤인-달가노 서열), 숙주 세포의 코돈 이용에 대응하는 폴리뉴클레오티드 분자의 변형 (예컨대, SEQ ID NOs:10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 또는 36 내지 43 참조), 및 전사체를 불안정화하는 서열의 결실을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

조성물

본 발명에 유용한 조성물은 부형제를 포함하는데, 본 발명에서 "허용가능한 캐리어"라고도 말한다. 부형제의 예로는 물, 염용액, 링거액, 덱스트로스 용액, 행크 용액 및 기타 수성 생리적으로 균형잡힌 염 용액을 들 수 있다. 비(非)수성 비히클, 예컨대 고정화 오일, 참기름, 에틸 올리에이트 또는 트리글리세리드 또한 사용될 수 있다. 기타 유용한 제형으로는 점도 증강제, 예컨대 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 소르비톨, 또는 덱스트란을 함유하는 현탁액을 들 수 있다. 또한, 부형제는 미량의 첨가제, 예컨대 등장성 및 화학적 안정성을 증가시키는 물질들을 함유할 수 있다. 완충액의 예시로는 포스페이트 완충액, 중탄산염 완충액 및 트리스 완충액을 들 수 있고, 보존제의 예시로는 티메로살 또는 o-크레솔, 포르말린 및 벤질 알코올을 들 수 있다. 부형제는 또한 조성물의 반감기를 증가시키는 데 사용될 수 있고, 예컨대 방출 제어 중합 비히클, 생분해성 임플란트, 리포좀, 박테리아, 바이러스, 기타 세포들, 오일, 에스테르 및 글리콜이지만 이에 한정되는 것은 아니다.

한 가지 구현예에 있어서, 카바메이트 키나아제는 고체 기판상에 고정화되낟. 이것은 카바모일 포스페이트의 생산을 강화 및/또는 폴리펩타이드의 안정성을 증가시킬 수 있다. 예컨대, 폴리펩타이드는 폴리우레탄 매트릭스 상에 고정화되거나 (Gordon et al., 1999), 또는 적당한 리포좀에 캡슐화될 수 있다 (Petrikovics et al., 2000a 및 b). 또한, 폴리펩타이드는 소화에 통상적으로 사용되는 것들과 같은 발포체를 포함하는 조성물에 포함될 수도 있다 (LeJeune et al., 1998). 당업자에게 이해될 것과 같이, WO 00/64539에 개시된 것과 같이 카바메이트 키나아제는 스폰지 또는 발포체에 쉽게 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 기타 고체 기판은 아크릴형 구조를 갖는 수지, 에폭시 관능성기를 갖는 수지, 예컨대 Sepabeads EC-EP (Resindion srl--Mitsubishi Chemical Corporation) 및 Eupergit C (Rohm-Degussa), 또는 1차 아미노기를 갖는 수지, 예컨대 Sepabeads EC-has 및 EC-EA (Resindion srl--Mitsubishi Chemical Corporation)를 들 수 있다. 임의의 경우에 있어서, 효소를 매트릭스에 결합시키기 위하여 상기 폴리펩타이드를 고체 기판과 접하게 하고 관능기 (에폭사이드)의 고반응성이나 2 기능성 제제, 예컨대 글루타르알데하이드와 기판의 활성화를 통하여 고정화시킨다. 본 발명에 적합한 기타 기판으로는 폴리스티렌 수지, 거대망상 수지 및 염기성 관능기를 갖는 수지, 예컨대 Sepabeads EC-Q1A이고, 상기 폴리펩타이드는 수지에 흡수된 후 2 기능성 제제 (글루타르알데하이드)와 가교결합됨으로써 안정화된다.

한 가지 구현예에 있어서, 상기 조성물은 주변 (예컨대, 토양 및 물 시료들)으로 상기 조성물을 서서히 방출할 수 있는 방출 제어 제형의 형태이다. 본 발명에서 사용되는 바, 방출 제어 제형은 방출 제어 비히클을 포함한다. 적절한 방출 제어 비히클로는 생체적합성 고분자, 기타 고분자 매트릭스, 캡슐, 마이크로캡슐, 마이크로입자, 알약 제제, 삼투압 펌프, 확산 장치, 리포좀, 리포스피어 및 경피 전달 시스템을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 양호한 방출 제어 제형은 생분해성이다 (즉, 생체침식성).

효소의 농도는, 예컨대 정화될 시료의 성질, 시료 중의 암모니아 농도 및 조성물의 제형에 달려있다. 조성물 내 효소의 유효 농도는 본 발명의 방법을 사용하여 실험적으로 용이하게 결정될 수 있다.

용도

카바모일 포스페이트

카바모일 포스페이트의 화학적 또는 생물학적 인 시투 변환은 가치있는 범용품을 제공한다. 카바모일 포스페이트는 본 발명에 개요된 것과 같이 우레아를 생산하는 데 사용될 수 있다.

카바모일 포스페이트는 시아네이트 및/또는 시안산과 같은 중간체를 통하여 친핵체와 반응할 것이기 때문에 카바모일 유도체 어레이로 변환될 수 있다. 알코올은 시아네이트와 반응하여 카바메이트를 형성한다 (Love and Kormendy, 1963). 예컨대, 페놀의 알코올 관능기는 카바모일 포스페이트와 반응하여 페닐 카바메이트를 형성하는데, 이것은 통상 우레아 유도체들에 대한 합성 전구체로 사용된다 (Xiao et al., 1997). 유사하게, 카바모일 포스페이트는 티올과 반응하여 카바모티오에이트를 생산하는 결과를 낳는데, 이것은 널리 제초제로서 사용된다 (Wootton et al., 1993). 또한, 카바모일 포스페이트는 펩타이드에 우레아 기능성을 도입하는 데 사용될 수 있다.

아마이드 결합의 우레아 치환체로의 대체는 흥미로운 것이고, 이들 비천연 펩타이드는 HIV 단백질 분해효소 억제제 (Kempf et al., 1991), 및 β-턴 단백질 모방체 (Nowick et al., 1995)로 연구되어 왔다.

카바모일 포스페이트는 충치에 대하여 예방 및 치료 가능 효과를 보였다, 카바모일 포스페이트 및 기타 카바메이트 화합물들은 골 조직의 안정화 또는 생장과 골 밀도에 유익한 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다 (US 20030096741).

카바모일 포스페이트는 반응의 에너지원일 수 있다 (US 20020168706).

아스파르트산과 반응하는 경우, 카바모일 포스페이트는 유리딘-5'-모노포스페이트를 형성하는 데 사용될 수 있다 (US 20020058244).

피리미딘, 피리미딘 뉴클레오시드, 및 피리미딘 뉴클레오티드는 다단계 경로의 방식으로 (O'Donovan and Neuhard, 1970 참조) 아스파르트산과 카바모일 포스페이트 (글루타민 및 CO ₂ 로부터 유래)로부터 합성된다.

우레아 사이클에서 카바모일 포스페이트로부터 생화학적으로 형성되는 시트룰린은 심장 질환의 치료용 약제로 사용된다 (Barr et al., 2007).

우레아

전세계 우레아 생산량의 90% 이상은 질소-방출 비료로서 사용된다. 우레아는 범용의 모든 고체 질소 비료들 중에서 가장 높은 질소 함량을 갖는다. 많은 토양 박테리아는 효소 우레아제를 갖고 있고, 이것은 우레아 분자를 2개의 암모니아 분자와 하나의 이산화탄소 분자로 전환시키는 것을 촉매하여, 따라서 우레아 비료는 토양 내에서 매우 신속하게 암모니아 형태로 변환된다. 암모니아 및 질산염은 식물에 의하여 쉽게 흡수되고 식물 생장에 우세한 질소 제공원이다. 우레아는 물에 매우 용해성이고, 그러므로 비료 용액으로 (질산암모늄과 조합하여), 예컨대 '엽면 보급' 비료로 사용하기에 매우 적합하다. 비료 용도로, 과립이 프릴 (prill)보다 양호한데, 그들의 입도 분포가 좁은 것이 물리적 적용에 있어서 이점이기 때문이다.

우레아는 보통 40 내지 300 kg/ha의 비율로 퍼뜨리지만 비율은 변할 수 있다. 적게 적용할수록 침출로 인한 손실 발생은 더 적다. 여름에는, 휘발 (질소가 암모니아 기체로서 대기 중으로 손실되는 과정)로 인한 손실을 최소화하기 위하여 우레아를 종종 비가 내리기 전 또는 비가 내리는 동안에 퍼뜨린다. 우레아는 스프레이로 적용하거나 관개 시스템을 통하여 이용하기 위하여 물에 용해된다.

우레아는 대기로부터 수분을 흡수하므로 통상적으로 닫힌/밀폐된 백 내에 펠렛으로 보관되거나, 또는 대량으로 보관되는 경우, 방수포가 있는 덮개 아래 보관된다. 대부분의 고체 비료와 같이 시원하고, 건조한, 환기가 잘 되는 공간에서의 보관이 권장된다.

우레아는 많은 중요한 화학적 화합물의 제조 원료인데, 예컨대 몇몇 플라스틱 (예컨대, 우레아-포름알데하이드 수지), 몇몇 접착제 (예컨대, 우레아-포름알데하이드 또는 선발용 합판에 사용되는 우레아-멜라민-포름알데하이드), 시안산칼륨 (공업적 원료), 및 질산우레아 (폭발성)를 들 수 있다.

자동차 시스템에서, 우레아는 디젤, 이중 연료, 및 린-번 천연 가스 엔진의 연소로부터 오는 배기 가스 중의 NOx를 감소시키는 선택적 비촉매 환원 및 선택적 촉매 환원 반응에 사용된다. BlueTec 시스템은, 예컨대 배기 시스템으로 수(水)계 우레아 용액을 주입한다. 우레아의 가수분해로 생성된 암모니아는 산화질소 방출량과 반응하고 촉매 컨버터 내에서 질소와 물로 전환된다.

우레아는 연료 전지에서 후속 전력 생성의 수소원으로 작용할 수 있다. 소변/폐수에 존재하는 우레아가 직접적으로 사용될 수 있다 (보통 신속히 우레아를 분해시키는 박테리아를 통하여). 우레아의 전기분해를 통한 수소 생산은 낮은 전압 (0.37 V)에서 일어나고, 따라서 물의 전기분해 (1.2 V)보다 적은 에너지를 소모한다.

의료적 사용에 관하여, 우레아는 피부의 재수화를 촉진하는 국소적 피부과 제품에 사용된다. 폐색성 드레싱으로 덮여 있다면, 40% 우레아 제제는 손톱의 비수술적 괴사 조직 제거를 위하여도 사용될 수 있다. 특정 유형의 일시적 냉각팩 (또는 아이스 팩)은 물과 단리된 우레아 결정을 포함한다. 내부의 물 주머니 파열은 흡열 반응을 개시시키고 팩이 부풀어 오르는 것을 감소시키는 데 사용되도록 한다. 염용액과 같이, 우레아 주입은 낙태를 수행하는 데 사용된다. 우레아는 소변 요법이라고 불리우는 대체 의학 치료의 주요 성분이다. 탄소-14 또는 탄소-13으로 표지된 우레아는 우레아 호기 테스트에 사용되는데, 이는 소화성 궤양과 관련된 인간의 위 및 십이지장의 헬리코박터 파일로리 ( Helicobacter pylori ) 박테리아의 존재를 검출하는 데 사용된다.

기타 본 발명의 방법을 이용하여 생산된 우레아의 사용 가능성은 니트로셀룰로오스 폭약의 안정화제, 동물 사료 성분, 도로 제빙용 암염의 부식 대체물, 스노우보드 하프파이프 및 터레인 파크 (terrain parks)의 재포장, 담배의 향미 강화 첨가제, 제모제의 성분, 공장 생산 프레즐의 갈색 제제, 일부 피부 크림의 성분, 보습제, 및 헤어 컨디셔너, 응급용 일부 완성품 냉 컴프레서, 구름 핵 제제, 불꽃 방지제, 치아 미백 제품의 성분, 주방 세제 성분, 당의 에탄올로의 발효용 효모 양분, 지구공학 목적의 해양 영양 실험에서 플랑크톤에 의하여 사용되는 양분, 가죽 아교의 작업 온도 및 오픈 타임을 늘리는 첨가제, 섬유 염색 또는 인쇄용 염색조의 용해도 강화 및 수분-보유 첨가제, 및 단백질 변성제를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 - 피로코쿠스 퓨리오서스 카바메이트 키나아제의 생산

Pfu CK의 발현을 위한 본 문헌의 방법은 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 상기 효소의 게놈 DNA ( cpk A, Y09829.1)의 PCR 증폭을 포함하는데, 이 프라이머들은 개시 ATG에 Nco I 자리를 도입하고 종결 코돈 하류에 Blp I 자리를 도입하기 위하여 설계된 것이다 (5'-GTGGTTTCCATGGGTAAGAGGGTAGTGATTGC-3' (SEQ ID NO:48) 및 5'-GCATTCGCTAAGCTGGGTCTTCTAAAGTTCCTCAGG-3' (SEQ ID NO:49)) (Dubecq et al., 1997). 그 후, PCR 생성물을 Nco I 및 Blp I 제한 효소로 절단하여, 플라스미드 pET-15b의 대항 자리에 삽입하여 재조합 Pfu CK 플라스미드 (pCPS184)를 대장균 DH5α 세포에 형질전환시킨다. 추가적인 플라스미드 (pSJS1240) 또한 형질전환되어 아르기닌 (AGA 및 AGG) 및 이소류신 (ATA) tRNA 코돈의 발현이 가능하도록 한다 (이들 코돈은 대장균에서는 거의 사용되지 않지만 Pfu CK 유전자에서는 자주 출현한다). 그 후, 형질전환된 대장균 DH5α 세포를 37℃, 교반 인큐베이터, 3 L의 Luria-Bertani 배지 (0.1 mg/mL 앰피실린 및 0.05 mg/mL 스펙티노마이신으로 보충)에서 밤새 배양한 후, 1 mM 이소프로필 β-D-티오갈락토시드로 3 시간 인덕션 (induction) 후, 세포를 원심분리에 의하여 수확한다. 이 발현 방법을 이용하여 대략 10 g의 세포가 수득될 수 있다 (Dubecq et al., 1997).

그 후, 일련의 정제 과정을 이용하여 0~4℃에서 이들 세포로부터 Pfu CK를 단리한다. 우선, 세포를 50 mM 트리스-HCl, pH 7.5에 현탁하고, 소니케이션으로 용해시키며 (초음파 오실레이터, 250 W, 10 kHz, 20 분) 원심분리한다 (80000 xg, 30 분). 그 후, 황산암모늄을 40% 포화도로 첨가하고 용액을 30 분간 교반하여 원심분리한다 (12000 xg, 20 분). 그 후, 황산암모늄을 80% 포화도로 증가시키고 용액을 30 분간 다시 교반하여 원심분리한다 (12000 xg, 20 분). 이러한 황산암모늄 분획화 후 얻어진 Pfu CK 펠렛을 50 mM 트리스-HCl, pH 7.2에 현탁, 동일한 완충액에서 투석하여 일련의 크로마토그래피 정제 (DEAE sepharose, Blue Sepharose, DEAE Affi-gel Blue (Bio-Rad))로 Pfu CK를 단리한다. 이러한 발현 및 정제 방법을 이용하여, 50 g의 세포는 대략 0.75 mg의 단백질을 생산한다 (0.015 mg/g) (Uriate et al., 1999).

이러한 낮은 단백질 수율을 해결하기 위하여, 대신하여 재설계된 효소 발현 및 정제 프로토콜을 이용하여 Pfu CK를 얻었다. 우선, Pfu CK 게놈 DNA 서열을 대장균 발현용으로 최적화시켜, pSJS1240를 재사용하였다. 그 후, N-말단 (His) ₆ 태그를 갖는 차후 발현을 위하여, 최적화된 cpk A 유전자를 T7 프로모터 벡터 pETMCSIII에, Nde I 및 Eco RI 제한효소 자리 사이로 삽입하고, 재조합 플라스미드를 대장균 BL21 (DE3)로 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 100 mL의 Luria-Bertani 배지 (0.1 mg/mL 앰피실린 보충), 37℃, 교반 인큐베이터에서 밤새 배양하고 세포를 원심분리하여 수확하였다 (4000 xg, 5 분). 대략 1 g의 세포가 얻어졌다.

Pfu CK의 단리를 0~4℃에서 수행하였다. 세포를 500 mM NaCl 및 20 mM 이미다졸로 보충된 20 mM 인산나트륨, pH 7.4에 현탁하고 프렌치 프레스를 이용하여 용해시켰다. 그 후, 원심분리로 세포 파편을 제거하고 (12000 xg, 30 분) 금속-이온 친화 크로마토그래피 (His GraviTrap (GE Healthcare))로 상층액으로부터 Pfu CK를 단리하였는데 이때 500 mM NaCl 및 500 mM 이미다졸로 보충된 20 mM 인산나트륨, pH 7.4으로 용리시켰다. 초기 1 g의 세포 펠렛으로부터 대략 16 mg의 Pfu CK를 단리, 효소 수율에 있어서 1,000-배의 향상을 보였다.

실시예 2- 카바모일 포스페이트의 생산

Pfu CK에 의한 ATP의 ADP로의 전환에 관한 종전의 분석은 피루베이트 키나아제 및 락테이트 탈수소효소의 커플링 시험을 포함하였다 (Uriarte et al., 1999). 포포에놀피루베이트의 존재시, 피루베이트 키나아제는 ADP를 ATP로 전환하고 피루베이트를 생산하는데, 이는 그 후 NADH의 산화와 함께 락테이트 탈수소효소에 의하여 락테이트로 전환된다. 정상 상태에서, UV 모니터링된 NADH 농도의 감소는, 그 후 Pfu CK 촉매된 ADP 생산의 척도로 사용된다. 이러한 동역학적 분석은 2차 산물의 검출에 기초하기 때문에, 보다 직접적으로 Pfu CK 촉매되는 ADP 생산을 측정할 대안의 분석법이 설계되었다. 이러한 분석법은 tRNA 합성효소의 HPLC 모니터링된 활성에 대하여 Buchan (2009)에 의하여 설계된 것에 기초한다.

AMP, ADP 및 ATP 표준 용액의 HPLC 분리는 Alltech Alltima HP C18 컬럼을 이용하여 이루어지고, 이때 표 2에 개요된 용매 시스템에 따라, 수중의 60 mM 암모늄 이수소 포스페이트 및 5 mM 테트라부틸암모늄 이수소 포스페이트 (용매 A)와 메탄올 중의 5 mM 테트라부틸암모늄 포스페이트 (용매 B) 구배로 용리하였다. AMP, ADP 및 ATP 표준에 대하여 관찰된 머무름 시간은 각각 7.9 분, 17.4 분 및 25.6 분이었다. HPLC 분석을 촉진하기 위하여, AMP 또는 ADP의 공-용리 없이 27 분의 분석당 4개의 인젝션을 모니터링할 수 있다고 결정하였다 (도 2 참조).

그 후, ATP를 ADP로 촉매 전환하는 Pfu CK의 활성을 다양한 조건에서 모니터링하였다. 0.2 M 중탄산나트륨 및 10 mM ATP의 분석 용액은 2 mM, 20 mM 또는 200 mM 암모니아를 포함하도록 하였고, 2 M NaOH로 pH를 pH 8.9 내지 11.4로 조정하였다. 분석 온도는 40℃로 유지되었다. 완충된 분석법이 pH 8에서 수행되도록 하기 위하여, 분석 혼합물에 0.1 M 트리스-HCl을 첨가하고 5 M HCl로 pH를 조정하였다 (대조군 분석은 트리스-HCl의 첨가가 효소 활성에 영향을 미치지 않음을 확인시켰다). Pfu CK (최종 농도 0.5 μM)를 첨가함으로써 반응이 개시되었고 20 μL의 반응 분취액을 0.1% 소듐 도데실 술페이트 수용액으로 반응 중단시킨 후 표 2에 개요된 대로 HPLC 분석을 수행하여 ADP 농도를 4 시간에 걸쳐 모니터링하였다. 반응 분취액 중의 ADP 농도를 표준 교정을 이용하여 결정하고, ADP 농도 변화율을 백그라운드에 대하여 보정하였다.

표 2. AMP, ADP 및 ATP의 분리에 사용된 HPLC 용매 시스템.

도 3에 2 mM, 20 mM 및 200 mM 암모니아의 존재하 Pfu CK의 pH-속도 프로파일을 나타내었다. 모든 세 가지 암모니아 농도에서, 대략 pH 9.9에서 최대 속도가 관찰된다. 이 pH에서, 200 mM로부터 20 mM까지 10 배의 암모니아 농도 감소의 효과는, 양 조건 모두가 효소 mg당 대략 1.2 μmol/min/효소mg의 속도로 ADP를 생산하도록 함으로써 ADP 생산 속도에 무시할 만한 정도의 영향만을 미친다. 그러나, pH 9.9에서 2 mM까지 암모니아 농도를 10 배 더 감소시키자 효소 mg당 0.26 μmol/min/효소mg의 속도로 78%의 속도 감소라는 결과를 낳았다. 이러한 결과들은 pH 9.9에서, ≥20 mM 암모니아를 0.2 M 중탄산나트륨과 혼합하면 카바메이트가 효소 농도 포화 상태로 화학적 합성될 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 37℃에서는 최대 활성이 pH 7.8 내지 8에서 얻어지고, 60℃에서는 pH 7.6에서 얻어진다고 보여주고 있는 Dubecq et al. (1997)의 결과와는 상반되는 것이다.

도 3에 나타낸 바와 같이, pH 9.9 아래에서 200 mM 에서 20 mM로 암모니아 농도의 10 배 감소는 효소 활성에 부정적인 효과를 나타낸다. 이것은, 이 조건의 포화 농도에서 카바메이트를 덜 생산할 수 있음을 나타낸다. 이는 암모니아의 p K _a (9.25)보다 낮은 pH에 의하여 설명될 수 있는데, 이 pH는 효소가 이용할 수 있는 카바메이트의 농도를 제한하는 암모니아/암모늄 비를 감소시키기 때문이다. 그러므로, 암모니아 농도를 10 배 증가시켜 (200 mM) 이 비를 증가시키면 카바메이트 농도는 포화 수준에 근접하게 증가한다. 이러한 경향은 2 mM 암모니아를 이용하면 더욱 명백한데, 모든 pH에서 카바메이트 농도가 추가로 감소함을 나타내며 속도가 감소한다.

최적의 온도 조건을 조사하는 추가 실험 역시 수행되었다. 이것은 전술한 바와 같이 pH 9.9에서 20 mM 암모니아의 존재하에 Pfu CK 분석을 반복하는 것으로 이루어졌지만, 분석 온도를 40℃에서 60℃ 및 80℃로 상승시켰다. 도 4에 이러한 변경된 온도에서 ADP 생산에 대한 Pfu CK의 활성을 나타내었다. 온도를 40℃에서 60℃로 증가시키자 ADP 생산에 있어서 대략 3 배의 증가가 관찰되었다. 그러나, 80℃까지 온도를 더 증가시키자 유사한 증가라는 결과를 나타내지 않았는데, ADP 생산은 60℃에서 관찰된 것과 대략 동일하였다. 이러한 관찰은 Pfu CK의 효소 활성의 최적 온도가 60℃ 내지 80℃ 사이임을 시사한다.

요약하자면, Pfu CK는 다양한 온도, 높은 pH 및 낮은 암모니아 농도로 작동이 가능하고, 그러므로 폐수로부터 유독성 암모니아를 제거하는데 사용되어 카바모일 포스페이트를 생산할 수 있다.

실시예 3 - 카바모일 포스페이트의 생산에 대한 추가 분석

실시예 2에서 제시된 데이터를 얻은 후, 본 발명의 발명자들은 일부 파라미터들을 최적화하는 추가 분석을 시행하였다. 사용된 과정은 실시예 1에서와 같지만, 세포 파편을 20,000 xg, 60 분으로 원심분리하였고 효소 수율에 있어서 1,000-배 증가가 있었다.

AMP, ADP 및 ATP 표준 용액의 HPLC 분리는 Alltech Alltima HP C18 컬럼을 이용하여 이루어지고, 이때 표 3에 개요된 용매 시스템에 따라, 수중의 60 mM 암모늄 이수소 포스페이트 및 5 mM 테트라부틸암모늄 이수소 포스페이트 (용매 A)와 메탄올 중의 5 mM 테트라부틸암모늄 포스페이트 (용매 B) 구배로 용리하였다. AMP, ADP 및 ATP 표준에 대하여 관찰된 머무름 시간은 각각 8 분, 17.5 분 및 25.5 분이었다.

표 3. AMP, ADP 및 ATP의 분리에 사용된 HPLC 용매 시스템. 모든 구배는 선형이다.

그 후, 다양한 조건하에서 ATP의 ADP로의 촉매 전환에 대한 Pfu CK의 활성을 모니터링하였다. 0.2 M 중탄산나트륨 및 10 mM ATP의 분석 용액은 2 mM, 20 mM 또는 200 mM 암모니아를 포함하도록 하였고, 5 M HCl 또는 2 M NaOH로 pH를 pH 8.9 내지 11.4로 조정하였다. 분석 온도는 40℃로 유지되었다. Pfu CK (최종 농도 0.5 μM)를 첨가함으로써 반응이 개시되었고 20 μL의 반응 분취액을 0.1% 소듐 도데실 술페이트 수용액으로 반응 중단시킨 후 표 3에 개요된 대로 HPLC 분석을 수행하여 ADP 농도를 4 시간에 걸쳐 모니터링하였다. 반응 분취액 중의 ADP 농도를 표준 교정을 이용하여 결정하였다.

도 5에 2 mM, 20 mM 및 200 mM 암모니아의 존재하 10~30 분 대표적 정상 상태에서의 Pfu CK의 pH-활성 프로파일을 나타내었다. 대략 pH 9.9에서 최대 속도가 관찰된다. 더 중요하게는, 활성이 매우 높은 pH에서 유지되고 pH 11.4에서 최대치의 1/3 내지 2/3 만큼만 감소한다. 이것은 최대 pH를 넘어서는 활성에 있어서 급감을 나타내는 것으로 보고된 (Jones, 1962) 중온성 카바메이트 키나아제와는 대조적이다. 이러한 결과는 Pfu CK가 pH 9.9 (40℃)에서 최대 속도를 갖는다는 것을 보여주지만 상기 최대치는 종래에는 7.8 내지 8로 보고되었다 (Dubecq et al., 1997). 또한, 이것은 40℃에서 11.4와 같은 높은 pH에서 Pfu CK가 활성이라는 최초의 보고이다. 더 높은 암모니아/암모늄 비가 높은 pH에서 상기 효소가 이용가능한 카바메이트의 농도를 증가시키고, 이것이 높은 pH에서의 놀라운 효소 활성에 기여한다는 것이 가능하다.

실시예 4 - 카바메이트 종 분화

카바메이트 농도가 Pfu CK pH 프로파일과 관련되어 있는지 결정하기 위하여, pH의 함수로서 카바메이트의 농도 모니터링 실험을 수행하였다. 암모니아 수용액 (2 M) 및 ¹³ C-표지된 중탄산나트륨 수용액 (0.2 M)을 염산 또는 수산화나트륨을 이용하여 각각 pH 7.2, 8.4, 8.9, 9.4, 9.9, 10.4, 10.9 및 11.4로 조정하고 D ₂ O 동축 인서트 (coaxial insert)를 사용하여 ¹³ C NMR 분광분석으로 분석하였다. pH 7.2에서, 탄소 공명은 159.5 ppm으로 관찰되었다. 이 피크는 신속히 전환되는 중탄산염/탄산염 쌍에 주어졌다. pH를 8.4로 증가시키자 이 피크는 160.0 ppm으로 이동하였고, 제2 탄소 공명이 164.9 ppm에 나타났다. 이 제2 피크는 암모니아와 중탄산염의 반응을 통하여 형성된 카바메이트에 주어졌다 (Mani et al., 2006). 그 후, 이들 피크들 및 그들의 상대적인 적분값을 7.2 내지 11.4의 pH 인터벌 범위에 걸쳐 모니터링하였다. 이들 화합물들이 오로지 하나의 탄소 원자를 함유하고 있고, NMR 분석 중 매우 유사한 이완 시간을 나타낼 것이므로 (Mani et al., 2006), 이들 피크의 적분은 용액 내에서 그들의 상대적인 농도의 척도로서 사용되었다. 이들 적분값 및 화학 시프트를 표 4에 나타내었다. 상대적인 적분값의 경향 역시 도 6에 나타내었다.

표 4. pH 7.2, 8.4, 8.9, 9.4, 9.9, 10.4, 10.9 및 11.4로 조정된 암모니아 수용액 (2 M) 및 ¹³ C-표지된 중탄산나트륨 수용액 (0.2 M)에서 관찰된 탄소 공명의 화학적 시프트 및 상대적 적분값.

표 4에 나타낸 바와 같이, pH 7.2에서 중탄산염/탄산염의 쌍 교환에 할당된 탄소 공명 (159.5 ppm)은 pH가 증가함에 따라 더 큰 화학적 시프트로 움직였다. 이러한 효과는 카바메이트에 할당된 탄소 공명으로는 관찰되지 않았는데, 모든 pH 값에서 일정한 164.9 ppm의 화학적 시프트가 관찰되었다. 중탄산염/탄산염 및 카바메이트에 대한 공명의 상대적 적분값 (도 6)은 카바메이트 농도가 pH 9.9에서 가장 높다는 것을 또한 보여주는데, 카바메이트가 중탄산염/탄산염에 비하여 32% 많다. 이것은 카바메이트 기질의 농도 변화가 Pfu CK의 활성 프로파일에 기여할 수 있음을 나타낸다.

실시예 5 - 추가적인 효소의 선택 및 분석

Pfu CK의 pH-활성 프로파일이 피로코쿠스 퓨리오서스 특유한 것인지 결정하기 위하여, 다른 생물들로부터 일련의 카바메이트 키나아제를 분석용으로 선택하고 Pfu CK의 그것과 그 활성을 비교하였다. 본 발명의 발명자들은 다른 초고온성 생물들로부터의 카바메이트 키나아제 및 Pfu CK와 유사한 구조를 갖는 고온성 및 중온성 종들로부터의 카바메이트 키나아제 역시 시험하였다. 카바메이트 키나아제 구조는 Pfu CK에 대한 아미노산 서열 상동성에 기초하여 비교되었다. 추가 분석을 위하여 선택된 6개의 효소를 표 5에 나열하였다.

표 5. 카바메이트 키나아제 효소들.

써모코쿠스 시비리쿠스 (TS CK, 표 5)의 카바메이트 키나아제는 서열 분석에 기초하여 예측되었으나 (Mardanov et al. (2009)) 현재까지 단리되지 않았다. 유사하게, 써모코쿠스 바로필러스 (TB CK, 표 5)의 온전한 게놈 서열이 2011년 3월에 보고되었으나, TB CK가 단리되지는 아니하였다 (Vannier et al., 2011). 페르비도박테리움 노도섬의 게놈 서열은 2007년에 완성되었다. 이러한 작업은 미국 과학, 생물 및 환경 연구 프로그램 에너지국 (Department of Energy's Office of Science, Biological and Environmental Research Program) 및 캘리포니아 대학에서 수행되었다. 페르비도박테리움 노도섬 (FN CK, 표 5)의 카바메이트 키나아제는 단리되지 않았다. 써모시포 멜라네시엔시스 (TM CK, 표 5)의 카바메이트 키나아제도 역시 단리되지는 않았지만 그 게놈은 2009년에 보고되었다 (Zhaxybayeva et al., 2009). 엔테로코쿠스 파에칼리스 (EF CK, 표 5) (종래 스트렙토코쿠스 파에칼리스 ( Streptococcus faecalis )로 불림)의 카바메이트 키나아제는 1964년 이래 널리 연구되어 왔다 (Kalman and Duffield, 1964). 클로스트리디듐 테타니 ( Clostrididium tetani )(CT CK, 표 5)의 카바메이트 키나아제는 종래 단리되지 아니하였다. 게놈 서열은 2003년에 완성되었다 (Bruggemann et al., 2003). 표 6은 시험된 여러 가지 효소들 간의 아미노산 상동성의 요약을 제공하고 있다.

표 6. 카바메이트 키나아제의 아미노산 서열 상동성.

TB CK를 제외하고, 표 5에 열거된 효소들은 Pfu CK에 대하여 전술한 최적화된 프로토콜을 이용하여 발현 및 정제되었다. TB CK는 IPTG (이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드)를 이용한 화학적 인덕션에 의하여 성공적으로 과발현되었다. IPTG 인덕션을 위하여, 37℃에서 밤새 성장시킨 사전배양체 10 mL을 1 L LBA 배지로 접종하였다. 세포들을 OD가 0.55에 이르기까지 생장시킨 후 1 mL IPTG (1 M, 최종 1 mM)를 첨가하였다. IPTG로 인덕션된 세포는 37℃에서 밤새 생장시켰다. 세포를 수확, 4℃, 5,000 rpm, 15 분 원심분리하였다. 모든 추가 효소들의 정제 수율을 표 7에 열거하였다. EF CK의 수율은 100 mL당 7 mg으로, 종래 보고된 발현량 (Marina et al., 1998)보다 대략 3-배 향상을 나타내었다. 또한, 사용된 상기 프로토콜은 하나의 정제 단계를 포함하였고, 하루에 용이하게 완료되는 반면, 종래 보고는 3일의 기간에 걸친 다수의 단계들을 포함한다 (2개 컬럼 및 2회 침전을 포함) .

표 7. 발현된 추가적인 CK 효소의 정제 수율. 100 ml 액체 배양체에 기초한 수율.

발현 및 단리 이후, CK 효소를 HPLC 활성 분석하였다. 활성 분석은 10 분간 사전반응 후 20 분 분석에 기초하며, 중온성 포자 형성 박테리아 효소 CT CK를 제외한 모든 효소에 대한 pH 프로파일은 도 7에 나타나 있는데, CT CK는 적용되는 모든 조건하에서 활성이지 않았으므로 더 이상 연구를 진행하지 않았다. 활성 결과는 Pfu CK에 대하여 높은 서열 상동성을 갖는 2개의 초고온성 효소 (TS CK 및 TB CK, 표 5)가 Pfu CK의 그것과 유사한 pH 활성 프로파일을 나타낸다는 것을 보여준다 (도 7). 전술한 바와 같이, Pfu CK는 통상, 높은 pH에서 그 활성을 유지한다. Pfu CK, TS CK 및 TB CK는 pH 9.4~9.9에서 pH-속도 최대치를 나타내고, pH 11.4에서 실질적으로 이러한 활성의 실질적 비율을 유지한다. 이러한 결과에 기초하면, CK Pfu에 대하여 높은 서열 상동성을 갖는 카바메이트 키나아제는 유사한 pH-활성 프로파일을 나타낼 것이다.

Pfu CK에 대하여 서열 상동성이 덜한 2개의 고온성 카바메이트 키나아제 (FN CK 및 TM CK)는 중온성 효소들에 대하여 보고된 것 (Jones and Lipmann, 1960)과 유사한 pH-활성 프로파일을 나타내었고, 즉 pH 9.4 내지 10.4에서 급격한 활성의 감소가 관찰되고 (활성이 약간 하락 또는 전혀 하락하지 않는 Pfu CK, TS CK 및 TB CK와 비교) pH 10.9~11.4에서 활성을 보유하지 못한다 (도 7).

전술한 바와 같이, 중온성 포자 형성 박테리아 효소 CT CK는 모든 조건하에서 활성이지 않았다. 기타 중온성 효소 EF CK는 고온성 효소 FN CK 및 TM CK의 그것과 유사한 pH-활성 프로파일을 나타내어, 즉 pH 9.5 이상에서는 급격한 활성 감소를 보였다 (도 7).

따라서, 선별된 효소들의 pH-활성 프로파일은 Pfu CK에 대한 그들의 아미노산 서열 상동성으로 범주화될 수 있다.

실시예 6 - 여러 가지 카바메이트 키나아제의 온도 프로파일

구조 및 활성 간 상관성을 더 연구하기 위하여, 온도-활성 실험이 수행되었다.

전술한 바와 같이 pH 9.9 및 200 mM 암모니아의 존재하에서 분석이 수행되었으나, 분석 온도는 20℃, 40℃, 60℃ 및 80℃로 유지되었다. 도 8은 소정의 온도에서 시간의 함수로서의 정상 상태 온도 프로파일을 보여준다. 초고온성 생물들로터의 Pfu CK (TS CK 및 TB CK, 표 5)에 대하여 높은 서열 상동성을 갖는 카바메이트 키나아제 모두는 4 가지 소정의 온도 중에서 80℃에서 최대 활성을 나타내며 온도에 따라 활성 증가를 보인다. 20℃에서, ADP의 효소적 생산은 백그라운드 수준 근처까지 감소한다. 고온성이고 Pfu (FN CK 및 TM CK, 표 5)에 대하여 덜 서열 상동성인 카바메이트 키나아제는 고온에서 덜 활성이다 (도 8). FN CK는 40℃에서 가장 활성이고, TM CK는 40~60℃에서 그러하다. 중온성 (EF)의 활성 카바메이트 키나아제는 40℃에서 가장 활성이었고 (도 8) 60℃ 또는 80℃에서는 약한 활성을 나타내었다. 도 8의 EF CK 프로파일에서 80℃에서의 ADP 생산은 아마도 ATP 가수분해 백그라운드 잡음이다.

온도 프로파일 요약 그래프를 도 9에 나타내었다. 80℃에서, Pfu CK 및 Pfu CK에 대하여 높은 서열 상동성을 갖는 카바메이트 키나아제는 9.5 μmol/min/mg 범위의 활성을 보이지만, 다른 카바메이트 키나아제는 이 온도에서 활성이지 않다.

실시예 7 - 여러 가지 카바메이트 키나아제의 안정성

Pfu CK 및 유사 서열 상동성 효소 TS CK 및 TB CK는 높은 pH에서 안정하고 예측치않게 기능적이다. 또한, 이들은 온도 상승에도 활성의 증가를 보이면서 안정하고 기능적이고, 보관시에도 기능 및 구조를 보유하는 것 같다. 이들 비범한 특성은 상업적 활용에 중요한 기여 부분이고 본 발명의 발명자들은 그러므로 상기 카바메이트 키나아제의 안정성을 평가하기 위한 설정을 하였다.

예비적인 안정성 분석은 Pfu CK, TS CK, TB CK, FN CK, TM CK 및 EF CK에 대하여 수행되었다. 40℃에서 60 시간 반응 후, Pfu CK, TS CK 및 TB CK는 실질적으로 그들의 활성을 유지하였지만, 나머지는 비활성이었다. 또한, Pfu CK는 4℃에서 1년간 보관한 후에 그 활성을 보유하였고, 이는 그 상업적 활용 잠재력을 증명한 것이다.

실시예 8 - 우레아의 생산

생합성된 카바모일 포스페이트의 우레아로의 인 시투 화학적 전환 가능성을 결정하기 위하여, 다양한 농도의 암모니아의 존재하에서 카바모일 포스페이트의 반응성을 측정하는 모델 연구를 수행하였다. -78℃에서 카바모일 포스페이트 (50 mg) 및 액체 암모니아 (10 mL)의 혼합물에 대하여, 최소한의 용해가 관찰되었다. 액체 암마노아를 다루는 데 요구되는 낮은 온도가 카바모일 포스페이트 용해도에는 잘 수용되지 않는 것으로 여겨졌다. 그러므로, 카바모일 포스페이트 용해도를 촉진하는 추가 실험이 수행되었다. 카바모일 포스페이트 (10 mg)를 수성 암모니아 (1 mL, 14.8 M)와 혼하하고 4 시간 동안 100℃에서 가열하였다. 이러한 변경된 조건을 이용하여 카바모일 포스페이트의 용해가 관찰되었다. 크루드 반응 산물을 건조하자, 진정한 시료와 비교한 분석 (TLC, ¹ H/ ¹³ C NMR, HPLC)은 카바모일 포스페이트의 우레아로의 전환이 이루어졌음을 확인하여 주었다 (스펙트럼 분석인 도 10 및 11 참조). 암모니아의 농도 10 M, 5 M, 및 2.5 M로 감소시키며 카바모일 포스페이트와 혼합한 추가적인 실험은 HPLC 분석에 의하여 ㄴ나타난 바와 같이 우레아 생산에 미치는 영향이 무시할만한 것임을 보여주었다. 그러나, 암모니아 농도를 2.5 M 아래로 낮추면 관찰되는 우레아 농도는 명백히 감소하였다.

이러한 모델 연구의 조건은 그 후, 생합성된 카바모일 포스페이트의 우레아로의 전환을 시도함에 있어서 Pfu CK의 평가에 적용되었다. Pfu CK (0.5 μM 최종 농도)를 0.2 M 중탄산나트륨, 10 mM ATP 및 2 M 암모니아 (pH 11) 용액에 첨가하고, 반응은 4 시간 동안 100℃에서 가열 진행하였다. 그 후, 질소로 용액을 건조시키고 ¹ H 및 ¹³ C NMR로 분석하였다 (도 12). 이들 분석은 우레아가 합성되었음을 확인하여 주었다.

본 출원은 2011년 6월 17일자 출원된 미국 출원 61/498,395에 대한 우선권을 주장하며, 그 모든 내용이 본 발명에 참조로서 포함된다.

이 기술 분야의 당업자라면 구체적인 구현예로 나타낸 바와 같이 본 발명의 핵심 또는 범위와 동떨어짐이 없이 기재된 바 넓게 본 발명에 다양한 변형 및/또는 변경이 가하여질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그러므로, 본 발명의 구현예는 설명된 모든 측면에서 고려되어야 하고 제한되어서는 아니된다.

언급 및/또는 참조된 모든 간행물은 전체가 본 발명에 포함된다.

본 명세서에 포함된 문서, 규정, 재료, 장치, 물품 등등에 대한 임의의 언급은 본 발명을 위한 문맥을 제공할 목적일 뿐이다. 이들 중 임의의 것 또는 모두가 그것이 본 출원의 각 청구항의 우선일 전에 존재하였다는 이유로 종래 기술 기초의 일부를 형성한다거나 본 발명의 관련 분야에서 일반적인 상식이라는 것을 인정하는 것으로 받아들여져서는 아니된다.

참조

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gttatgaagt tgttatcacc catggtaatg gtccgcaggt tggcaccatt 180 ctgctgcata tggatgcagg tcagagcctg catggtattc cggcacagcc gatggatgtt 240 gccggtgcaa tgagccaggg ttggattggt tatatgattc agcaggcact gcgtaatgaa 300 ctgcgtaaac gtggtattga aaaagaagtg gtgaccatta ttacccagac catcgtggat 360 aaaaaagatc cggcatttca gaatccgacc aaaccggtgg gtccgtttta tgatgagaaa 420 accgcaaaaa aactggccaa agaaaaaggt tgggtggtta aagaagatgc cggtcgcggt 480 tggcgtcgtg ttgttccgag tccggatccg aaaggtcatg ttgaagcaga aaccattcgt 540 cgtctggttg aaagcggtat tattgtgatt gcaagcggtg gtggtggcgt tccggttatt 600 gaagaaaatg gtgaaatcaa aggtgtggaa gccgtgattg ataaagatct ggcaggcgag 660 aaactggcag aagaagttaa cgcagatatt ctgatgattc tgaccgatgt taatggtgca 720 gcactgtatt atggcaccga aaaagaaacc tggctgcgca atgttaaagt tgaggaactg 780 gaaaaatact accaagaggg tcattttaaa gcaggtagca tgggtccgaa agttctggca 840 gcaattcgtt ttatcaaaaa tggtggtaaa cgtgccatta tcgcccatct ggaaaaagca 900 gttgaagcac tggaaggtaa aaccggcacc caggttaccc cgtaa 945 <210> 13 <211> 945 <212> DNA <213> Pyrococcus horikoshii <400> 13 atgcccgaga gagttgttat cgccctggga ggaaacgcac tccagcagag agggcaaaaa 60 gggacttatg atgagatgat ggagaacgta aggaaaacgg ctaaacagat agctgagata 120 attgcgaggg gttacgaagt cgttataact cacggtaacg gacctcaggt tgggacgatt 180 ctccttcata tggatgcggg acaatccctt catggaatac cagcccaacc catggatgtt 240 gccggggcga tgagccaagg atggataggt tacatgattc aacaagcgtt gaggaatgaa 300 ctcaggaaaa gagggataga aaaggaagtt gtcactataa taactcaaac gatagttgac 360 aaaaaagatc cagcatttca aaatccaacg aagcctgtag gcccattcta tgatgaaaaa 420 actgcaaaga aacttgcaaa ggagaaagga tgggttgtca aggaagatgc aggaagggga 480 tggagaaggg ttgtcccaag cccagatccc aagggacacg tcgaggctga aacgataaga 540 agactcgtcg aaagtgggat tatagttata gcaagtgggg gaggaggagt ccccgtaatt 600 gaagagaatg gagaaataaa aggcgttgaa gccgtgatag acaaagatct agctggcgaa 660 aaattggccg aggaggttaa tgcagatata cttatgatac taacggatgt caacggggcc 720 gccctatact atggaacgga gaaggaaact tggcttagaa acgttaaggt ggaagaactg 780 gagaagtact accaagaggg gcactttaag gctggaagca tgggtcctaa agttcttgca 840 g caataaggt tcattaaaaa tggaggaaaa agagcaataa tagctcacct tgagaaagct 900 gttgaagccc ttgaaggaaa gacaggaacc caggtgactc cctaa 945 <210> 14 <211> 945 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized nucleotide sequence encoding Pyrococcus abyssi carbamate kinase <400> 14 atgccggaac gtgttgttat tgcactgggt ggtaatgcac tgcagcagcg tggtcagaaa 60 ggcacctatg aagaaatgat ggaaaacgtg aaaaaaaccg ccaaacaaat cgccgaaatt 120 attgcacgtg gttatgaagt tgttatcacc catggtaatg gtccgcaggt tggcaccatt 180 ctgctgcata tggatgcagg tcagagcctg catggtattc cggcacagcc gatggatgtt 240 gccggtgcaa tgagccaggg ttggattggt tatatgattc agcaggcact gcgtaatgaa 300 ctgcgtaaac gtggtattga acgtgaagtt gtgaccattg ttacccagac cattgtggat 360 aaagatgatc cggcatttga aaatccgacc aaaccggtgg gtccgtttta tgatgaagaa 420 accgcaaaaa aactggccaa agaaaaaggt tgggtggtta aagaagatgc cggtcgcggt 480 tggcgtcgtg ttgttccgag tccggatccg aaacgtcatg ttgaagcaga aaccatcaaa 540 aaactggttg aagatggcgt tattgttatc gcaagcggtg gtggtggcgt tccggttatt 600 gaagaggatg gtgaaatcaa 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80 tggaggaggg tagttccaag cccagatcca aagaggcacg tagaggctga gaccataaag 540 aagttagttg aggatggcgt tatagttata gcgagcggcg ggggaggagt gccggtaata 600 gaggaggatg gagagataaa aggggtcgaa gcggtaatag acaaggatct agcgggagag 660 aggttagctg aggaggttaa cgctgacata ctgatgatct taacggatgt aaacggggca 720 gcactctact acggaaccga gaaggagacc tggcttagag aagttaaggt ggacgagatg 780 gagaggtact atcaagaagg gcacttcaag gccggaagca tggggccaaa ggttttagct 840 gctataaggt tcgtgaagaa cggaggaaag agggcaataa ttgctcacct tgagaaagct 900 gttgaagccc tggaaggaaa gaccgggaca caggttattc cctga 945 <210> 16 <211> 948 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized nucleotide sequence encoding Thermococcus sp. carbamate kinase <400> 16 atgaaacgtg ttgttattgc cctgggtggt aatgcaattc tgcagcgtgg tcagaaaggc 60 acctatgaag aacaaatggc caatgttatg aaaaccgcca aacaaatcgt ggatattatt 120 ctggatggcg attatgaagt ggtgattacc catggtaatg gtccgcaggt tggtgcactg 180 ctgctgcata tggatgcagg tcaggcaacc catggcattc cggcacagcc gatggatgtt 240 gccggtgcaa 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sequence encoding Thermococcus onnurineus carbamate kinase <400> 22 atgaaacgtg ttgttattgc cctgggtggt aatgcaattc tgcagcgtgg tcagaaaggc 60 acctatgaag aacaaatgac caatgttatg aaaaccgcca aacaaatcgt ggatattatt 120 ctggatggcg attatgaagt ggtgattacc catggtaatg gtccgcagat tggtgcactg 180 ctgctgcata tggatgcagg tcagcagatt catggtattc cggcacagcc gatggatgtt 240 gccggtgcaa tgacccaggg tcagattggt tacatgattc agcaggcaat tcgcaatgaa 300 ctgaaacgtc gtggtgttga acgtccggtt gccaccattg ttacccagac cctggttgat 360 aaaaatgatc cggcatttca gaatccgagc aaaccggttg gtccgtttta tgatgaagaa 420 accgcaaaac gtctggccaa agaaaaaggt tggaccgtta ttgaagatag cggtcgtggt 480 tggcgtcgtg ttgttccgag tccggatccg attggtcatg ttgaaacacc ggttattcag 540 gatctggttg aaaaaggctt tattgtgatt gcaagcggtg gtggcggtgt tccggtgatt 600 gaagaggatg gtatgctgaa aggtgttgaa gcggttattg ataaagatct ggcaggcgaa 660 aaactggcag aagaagttaa cgcagatatc tttatgattc tgaccgat gt taatggcgca 720 gcgattaact atggtaaacc ggatgaaaaa tggctgggtc gtgttaccgt tgaagaactg 780 aaacgctatt acaatgaagg 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tgccggagag 660 aagctcgcag aagaggtaaa cgccgacatc ttcatgattc taaccgacgt gaacggtgcg 720 gcgataaact acggaaagcc cgacgagaag tggctcggaa gagttaccgt cgaagagctc 780 aagcgctact ataatgaggg ccacttcaag aagggcagca tggggccaaa ggttctcgcc 840 gctatacgct tcgtcgagtg gggcggcgag agggcggtta tagccgcgct ggataaggcc 900 gtggaagcgc ttgaaggcaa aaccgggact caggtcataa agggctga 948 <210> 24 <211> 948 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized nucleotide sequence encoding Thermococcus barophilus carbamate kinase <400> 24 atgcgtaaac gtgttgttat tgcactgggt ggtaatgcaa ttctgcagcg tggtcagaaa 60 ggcacctatg atgaacaaat ggaaaatgtg aaaaaaaccg ccaaacaaat tgtggatatt 120 attctgaata atgattatga agtggtgatt acccatggta atggtccgca ggttggtgca 180 ctgctgctgc acatggatgc aggtcagcag ctgtatggta ttccggcaca gccgatggat 240 gttgccggtg caatgaccca gggtcagatt ggttacatga ttcagcaggc aattaccaat 300 gaactgaaac gtcgcggtat ctataaac cg gttgcaacca ttgttaccca ggttctggtt 360 gataaaaatg atccggcatt tcagaatccg agcaaaccgg ttggtccgtt ttatgatgaa 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ggtaatgcaa ttctgcagcg tggtcagaaa 60 ggcacctatg aagaacaaat ggaaaatgtt cgtaaaaccg cacgtcagat tgtggatatt 120 attctggata atgaatatga agtggtgatt acccatggta atggtccgca ggttggtgca 180 ctgctgcttc agcaggatgc cggtgaacat gtgcatggta ttccggcaca gccgatggat 240 gtttgtggtg caatgagcca gggtcagatt ggttatatga ttcagcaggc cattatgaat 300 gaactgcgtc gtcgtggtgt tgaacgtccg gttgcaacca ttgttaccca gaccattgtt 360 gataaaaatg atccggcatt tcagcatccg agcaaaccgg ttggtccgtt ttatagcgaa 420 gaaaccgcaa aaaaactggc caaagaaaaa ggttgggtgg ttattgaaga tgcaggtcgt 480 ggttggcgtc gtgttgttcc gagtccggat ccgaaaggtc atgttgaagc accgattatt 540 caggatctgg tggaaaaaga atttattgtg attagcagcg gtggtggtgg tattccggtt 600 gttgaagaaa atggtgaact gaaaggtgtt gaagccgtga ttgataaaga tctggcaggc 660 gaacgtctgg ccgaagaagt taacgcagat atctttatga ttctgaccga tgtgaatggc 720 gcagccatta actatggtcg tccgaatgaa aaatggctgg aaaaagttac cctgggcgaa 780 attaaacgct actatgaaga agg ccatttc aaaaaaggta gcatgggtcc gaaagttctg 840 gcagcaattc gttttattga atggggtggt gaacgtgcaa 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taaaaacctg agcgaaaccg cacattatct ggcaggtatg 120 ctggatgaat atgatattat cattacccat ggcaatggtc cgcaggttgg taatctgctg 180 gttcagcagg atctggcaaa acatgttatt cctccatttc cgattgatgt taatgatgca 240 cagacccagg gtagcttagg ttatatgatt gcactgaccc tggaaaatga actgaaacgt 300 cgtaatattg aacgtcagat tgcagcaatt gtgacccaga ttgaagtgga taaaaatgat 360 ccggcatttc agaaaccgac caaaccggtg ggtccgtttt atagcaaaga agaagcagaa 420 aaactggccc aagaaaaagg ttggattatg aaagaagatg caggtcgcgg ttatcgtcgt 480 gttgttccga gcccgattcc gctggatatt gttgaaaaag aagtgattaa aatgctggtt 540 gaaaaagatg ttattgtgat tgcagccggt ggtggtggta ttccggttgt taaagaaaat 600 ggtatgttta aaggtgtgga agccgtgatt gataaagatc gtgcaagcgc actgctggca 660 aaagaagttg aagcagatat tctgattatt ctgaccggtg ttgaaaaagt gtgcattaat 720 tacaaaaaac cggatcagtt tgaagttgat aaactgaccg ttgaagaagc caaaaaatac 780 ctggcagaag gtcagtttcc gagcggtagc atgggtccga aaattgaagc agcaattgat 840 tttgttagca gcaccggtcg tgaatgcatt attaccgata tggca gttct ggataaagcc 900 ctgaaaggtg aaaccggcac caaaattgtt ccg 933 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ttgttccgag tccggatccg aaaaaaatcg ttgaaggtga agtgatcaaa 540 cacctgagtg atgaacgtta tctggttatt gcatgcggtg gtggtggtat tccggttatt 600 aaagatgaag atggcaccta tcgtggtgtt gaagcagtta ttgataaaga tctggcaggc 660 gaacgtctgg cacaagaagt tggcgcagat atctttatga ttctgaccga tgttccgaaa 720 gtggccatca attacaaaaa accggatgag aaatggctgg atgttgttac accggaagaa 780 ctgcgtgcat atgaagcaga aggtcatttt aaagcaggta gcatgggtcc gaaagttaaa 840 gcagcactgc gttttgttga aaatggtggt aaacgtgcca ttatcgcaaa actggatagc 900 gcactggaag ccctggaagg taaaaccggt acacaggttg ttccggttaa agaaaaaatc 960 tgctgtcgct aa 972 <210> 39 <211> 948 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized nucleotide sequence encoding Aminobacterium colombiense carbamate kinase <400> 39 atgggtaaac gtattctggt tgcactgggt ggtaatgcaa ttctgcagcc tggtcagaaa 60 ggcaccagcg cagaacaggt taccaatatt gataaaaccg tgaaacagct gatcgatgtg 120 gtggaaaaag gttatgaact ggttctgacc catggtaatg gtccgcaggt tggtgcgatt 180 c tgattcagc atgaaatggc aaaagaagca attccggcaa tgccgctgga 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kinase. <400> 40 atggcagcaa ccaaagttgt tgttgcactg ggtggtaatg cactgcaaga agcaggcacc 60 cctccgaccg cagaagcaca gctggaagtt gtgaaaaaaa ccgcaaccta tctggccgaa 120 attagcaaac gtggttatga aatggcagtg gttcatggta atggtccgca ggttggtcgt 180 attgttctga gccaagaaat tgcagcacag gcaaatccgg aaacaccggc aatgccgttt 240 gatgtttgtg gtgcaatgag ccagggttat attggttatc agattcagca ggcactgcgt 300 gatgcactgc gtaatcgtaa tctgaatatt ccggttgtta ccctggttac ccaggttgtt 360 gtggatgcaa atgatccggc attcaaaaat ccgaccaaac cgattggtcc gttttatacc 420 gaagaagagg caaaaaaact gatggccgaa aaaggctatg tgatgaaaga agatgcaggt 480 cgcggttggc gtcgtgttgt tgccagtccg gaaccgaaaa aaatcaccga aatttcagca 540 gttaaacgcc tgtgggatac caccattgtt gttaccgcag gcggtggtgg tattccggtg 600 gttgaaaata tggatggtag cctgagcggt gttgcagcag ttattgataa agatctggca 660 gcagaaaaac tggccgaaga aattgaagcc gatattctgc tgattctgac cgaagttgat 720 aaagtgtgca tcaacttcaa aaaaccgaat cagcaagaac tgagccatat gaccgttgcc 780 gaagcaatca aatatatgga agaaggtcat tttgcaccgg gtagcatgct gccgaaagtt 840 atggcagccg t taaatttgc acgtaccttt ccgggtaaaa aagccattat taccagcctg 900 tataaagcag ttgatgccct ggaaggtcgt gaaggcaccg ttgttaccat ggcataa 957 <210> 41 <211> 933 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized nucleotide sequence encoding Halothermothrix orenii carbamate kinase <400> 41 atggcacgta ttgttattgc actgggtggt aatgccctgg gtaaaacacc gctggaacag 60 cgtgaagcag tgaaaaatac cgcacagccg attgttgatc tgattgaaga tggccatgaa 120 attattctgg cacatggtaa tggtccgcag gttggtatga ttaatctggc atttgaaacc 180 gcagcacaga atgatgataa tgttccggaa atgccgtttc ctgaatgtgg tgcaatgagc 240 cagggttata ttggttatca tctgcagaat gccattcgca atgaactggt taatcgcggt 300 attaacaaaa gcattaccag cgttgttacc caggttctgg ttgataaaaa tgataacgca 360 tttgagcatc cgaccaaacc ggttggtagc ttttataccg aagatgaagc acgcaaactg 420 atcgaagaaa aaggttatcg tatggtggaa gatagcggtc gtggttatcg tcgtgttgtt 480 ccgagcccga ttccggttga tattgttgaa aaagagatca tcaaaaacct ggtcgaagat 540 ggcaatattg tgattgcgtg cggtggtggt ggcgttccgg ttgttgagga tgaagaaggt 600 ctgaaaggcg ttcc tgcagt tattgataaa gattttgcca gcgaaaaaat ggccgaaatt 660 gttaatgccg atctgctggt tattctgacc gcagtggaaa aagttgcaat caactttggc 720 aaagaaaacg aagaatggct gagcgaaatg aatgttgaac tggcacagca gtattgtgat 780 gaaggtcatt ttgcaccggg tagcatgctg ccgaaagtta aagcagcaat gaaatttgca 840 agcagcaaag aaggtcgtaa agcactgatt accagcctgg aaaaagcaaa agaaggcctg 900 gcaggtaaaa ccggcaccct ggttaccgca taa 933 <210> 42 <211> 939 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized nucleotide sequence encoding Kosmotoga olearia carbamate kinase <400> 42 atgaaaaaag ccgttgttgc cattggtggt aatgcactga ataaaccggg tgaaaaaccg 60 agcgcagaag caatgaaaaa aaacctgctg ggcaccgtta aacatctggc agatctgatt 120 gaagatggtt atgatctggt tattacccat ggtaatggtc cgcaggttgg taatctgctg 180 gttcagcaag aaattgcaaa agataccctg cctccgtttc cgattgatgt taatgatgca 240 atgacccagg gtagcattgg ttatctgatt acccagaccc tgggcaatga actgaaaagc 300 cgtggcaccg aacgtcagat tgcatgtgtt ctgacccaga ttattgtgga tcgtaatgat 360 ccgggttttg agaatccgac caaaccggtg ggtccgtttt atgat gaaga aaccgcaaaa 420 aaactgcagg cagaaaaagg ctggatcatg aaagaagatg caggtcgcgg ttggcgtcgt 480 gttgttccga gcccgaaacc gctggatgtt gttgaaattg aagcaattaa agccctgacc 540 ggcaacgatt ttattctggt tgccggtggt ggtggcggta ttccggttgt taaaaaagat 600 gatggcaccc tggaaggtgt tgaagcagtt attgataaag atcgtgcaag cgcactgctg 660 gcacgtctgc tggatgcaga cctgtttctg attctgaccg cagttgatca tgcctatatc 720 aattttggta aaccggatca gaaagccctg gaacgtatta gcgttaatga agccaaaaaa 780 ctgatggatg aaggccattt tgccaaaggt agcatgtatc cgaaaattga aagcgccatt 840 gattttgttg aaagcaccgg taaagaagcc attattacca gcctggaaaa agtgaaagaa 900 gcgattcagg gtaaaagcgg cacccatatt accaaataa 939 <210> 43 <211> 939 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized nucleotide sequence encoding Moorella thermoacetica carbamate kinase <400> 43 atggaacgtc tggcagttat tgcaattggt ggtaatagcc tgatcaaaaa caaaaaactg 60 atcagcctgt atgatcagct ggcaaccatg cgtgaaacct gtcgtaatat tgcagatatg 120 gttgaaaaag gctggaacgt tgttattacc catggtaatg gtccgcaggt tggttttctg 180 at tcgtcgtg cagaactggc atgtggtgaa ctgccgctga ttccgctgga atttgcagtt 240 gcagataccc agggtgccat tggttatatg attcagcaga gcctgatgaa tgaatttcgt 300 cgtcgtggta ttaaacgtca ggccattaca attgttaccc aggttgttgt ggatcagaat 360 gatgaagcat ttcagaatcc gaccaaaccg attggtagct ttatgacccg tgaagaagca 420 cagcgtcacg ttgaagaaga tggttgggtt gttgttgaag atgcaggtcg tggttggcgt 480 cgtgttgttc cgagtccgga accgaaagca attgttgaaa ttcgtgcaat caaagacctg 540 atcgaagatg gctatattgt tatttgtacc ggtggtggtg gtattccggt tgttgaacat 600 gatggtaatc tgaaaggtgt tgcagccgtt gtggataaag ataatgcaag cgcactgctg 660 gccaatgaaa tcaaagcaga tgttctggtt attagcaccg gtgtgaataa agtggcaatt 720 aactttggtc gtccggatca gaaagaactg gatcgtctga ccattgccga agccgaagca 780 tatatggcag caggtcattt tccgcctggt aatatgggtc cgaaaattac agcactgctg 840 cgctatctga aaaatggtgg taaagaaggt attattacca gcccgaccga actggttgca 900 gcactggaag gtaaaagcgg cacccgtatt gttctgtaa 939 <210> 44 <211> 310 <212> PRT <213> Enterococcus faecalis <400> 44 Met Gly Lys Lys Met Val Val Ala 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