고 올레산 오일

고 올레산 오일{HIGH OLEIC ACID OILS}

본 발명은 높은 수준, 예를 들어 90 내지 95 중량%의 올레산을 갖는 추출된 지질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 지질의 생산에 사용될 수 있는 유전자 변형된 식물, 특히 잇꽃과 같은 유지종자 (oilseed)를 제공한다. 더욱 또한, 상기 지질의 생산에 사용될 수 있는 식물의 유전형질분석 및 선택 방법을 제공한다.

식물 오일 (plant oil)은 선진국에서 열량 섭취의 약 25%를 대변하는, 인체용 식이성 지방의 중요한 공급원이다(Broun et al., 1999). 식물 오일의 세계 생산은 적어도 연간 약 1억 1천만 톤이며, 이중 86%가 인간 소비에 사용된다. 상기 오일의 거의 전부는 대두, 카놀라, 잇꽃, 해바라기, 목화씨 및 땅콩과 같은 유지종자 작물, 또는 팜, 올리브 및 코코넛과 같은 조림 나무로부터 수득된다(Gunstone, 2001; Oil World Annual, 2004). 인간 건강의 다양한 측면에 대한 식품 오일의 개별적인 지방산 성분의 영향에 대해 점점 더 커지는 과학적 이해 및 사회적 인식은 다양한 식품 용도의 필요한 기능성을 유지하면서 개선된 영양가를 갖도록 변형된 식물성 오일의 개발을 유도하고 있다. 이러한 변형은 식물 지방산 합성을 위한 대사 경로 및 상기 경로에 대한 효소를 암호화하는 유전자에 관한 지식을 필요로 한다(Liu et al., 2002a; Thelen and Ohlrogge, 2002).

다양한 지방 및 오일의 영양학적 영향, 특히 심혈관 질병, 암 및 다양한 염증 상태에 대한 지방 및 오일 구성성분의 영향이 상당히 주목되고 있다. 음식물 중의 높은 수준의 콜레스테롤 및 포화 지방산은 심장병의 위험을 증가시키는 것으로 생각되며 이는 콜레스테롤-풍부 포화 동물성 지방의 소비를 콜레스테롤이 없는 불포화 식물 오일쪽으로 줄이라는 영양학적 충고를 도출하였다(Liu et al., 2002a).

동물성 지방 중에 존재하는 콜레스테롤의 식이섭취가 혈중 총 콜레스테롤 수준을 현저하게 증가시킬 수 있지만, 상기 지방 및 오일을 포함하는 지방산 자체도 또한 혈청 콜레스테롤 수준에 상당한 영향을 미칠 수 있는 것으로 밝혀졌다. 특히 중요한 것은 혈중 바람직하지 못한 저밀도 지단백질(LDL) 및 바람직한 고밀도 지단백질(HDL) 형태의 콜레스테롤에 대한 식이성 지방산의 영향이다. 일반적으로, 식물 오일 중에 존재하는 주요 포화물인, 포화 지방산, 특히 미리스트산(14:0) 및 팔미트산(16:0)은 혈청 LDL-콜레스테롤 수준을 상승시키고 결과적으로 심혈관 질병의 위험성을 증가시키는 바람직하지 못한 성질을 갖는다(Zock et al., 1994; Hu et al., 1997). 그러나, 식물 오일 중에 존재하는 다른 주요 포화물인 스테아르산(18:0)은 LDL-콜레스테롤을 상승시키지 않고 실제로 총 콜레스테롤을 낮출 수도 있음이 널리 확립되고 있다(Bonanome and Grundy, 1988; Dougherty et al., 1995). 따라서 스테아르산은 일반적으로 심혈관 질병의 위험에 관하여 적어도 중립인 것으로 간주된다(Tholstrup, et al., 1994). 다른 한편으로, 불포화 지방산, 예를 들어 일가불포화물인 올레산(18:1)은 LDL-콜레스테롤을 강하시키고(Mensink and Katan, 1989; Roche and Gibney, 2000), 따라서 심혈관 질병의 위험을 감소시키는 이로운 성질을 갖는다.

올레산 함량이 높은 오일은 또한 다수의 산업적인 용도, 예를 들어 이로 제한되지 않지만, 종종 지방산 에스테르 형태의 윤활제, 생물연료, 지방 알콜에 대한 원료 물질, 가소제, 왁스, 금속 스테아레이트, 유화제, 개인 위생 제품, 비누 및 세제, 계면활성제, 약제, 금속 작용 첨가제, 섬유 유연제용 원료 물질, 잉크, 투명 비누, PVC 안정제, 알키드 수지, 및 다수의 다른 유형의 하류 부문 올레오화학 유도체에 대한 중간체와 같은 용도를 갖는다.

오일 가공처리자 및 식품 제조자는 전통적으로 오일 중 불포화 지방산의 수준을 감소시키기 위해 수소화에 의존하였으며, 이에 의해 튀김 용도에서 상기 오일의 산화 안정성을 증가시키고 또한 마가린 및 쇼트닝에 사용하기 위한 고체 지방을 제공하여 왔다. 수소화는 탄소-탄소 이중 연결을 탄소-탄소 단일 연결으로 전환시킴으로써 오일의 불포화도를 감소시키는 화학 공정이다. 완전한 수소화는 완전히 포화된 지방을 생성시킨다. 그러나, 일부분 수소화 공정은 포화 지방산과 일가불포화 지방산 모두의 수준을 증가시킨다. 일부분 수소화 중에 형성된 일가불포화물 중 일부는 천연의 시스 이성질체라기보다는 트랜스 이성질체 형태(예를 들어 올레산의 트랜스 이성질체인 엘라이드산)로 존재한다(Sebedio et al., 1994; Fernandez San Juan, 1995). 시스-불포화 지방산과 대조적으로, 트랜스-지방산은 현재 혈청 LDL 콜레스테롤 수준을 상승시키고(Mensink and Katan, 1990; Noakes and Clifton, 1998) 혈청 HDL 콜레스테롤을 강하시킴(Zock and Katan, 1992)에 있어서 팔미트산만큼 효능 있는 것으로 공지되어 있으며, 따라서 심혈관 질병의 증가된 위험에 원인이 된다(Ascherio and Willett, 1997). 트랜스-지방산의 영양-억제 효과의 증가된 인지의 결과로서, 현재 식품 산업에서 수소화된 오일의 사용으로부터, 영양적으로 이롭고 수소화 없이 필요한 기능성을 제공할 수 있는 지방 및 오일, 특히 액체 오일이 필요한 경우 올레산 또는 고체 또는 반-고체 지방이 바람직한 경우 스테아르산이 풍부한 것들쪽으로의 추세가 점점 더 커지고 있다.

고 올레산 함량을 갖는 추가적인 지질 및 오일 및 이들의 공급원이 필요하다.

발명의 요약

본 발명자들은 신규의 지질 조성물 및 상기 지질의 생산 방법을 생성시켰다.

첫 번째 태양에서, 본 발명은 글리세롤로 에스테르화된 지방산으로 이루어지는 트라이아실글리세롤(TAG)을 포함하는, 유지종자로부터 추출된 지질을 제공하며, 여기서

i) 상기 지방산은 팔미트산 및 올레산을 포함하고,

ii) 상기 지질의 적어도 95 중량%는 TAG이고,

iii) 상기 지질의 총 지방산 함량의 약 90 내지 약 95 중량%는 올레산이고,

iv) 상기 지질의 총 지방산 함량의 약 3.1 중량% 미만은 팔미트산이고,

v) 상기 지질은 약 0.037 미만의 올레산 불포화 비율(ODP) 및/또는 약 0.063 미만의 팔미트산-리놀레산-올레산 값(PLO)을 갖는다.

하나의 실시태양에서, 상기 지질은 하기의 특징들의 하나 이상 또는 전부를 갖는다

a) 상기 지질의 총 지방산 함량의 약 90 내지 약 94 중량%, 또는 약 91 내지 약 94 중량%, 또는 약 91 내지 약 92 중량%, 또는 약 92 중량%, 또는 약 93 중량%가 올레산이고,

b) 상기 지질의 총 지방산 함량의 약 3 중량% 미만, 또는 약 2.75 중량% 미만, 또는 약 2.5 중량% 미만, 또는 약 3 중량%, 또는 약 2.75 중량%, 또는 약 2.5 중량%, 또는 약 2.3 중량%가 팔미트산이고,

c) 상기 지질의 총 지방산 함량의 약 0.1 내지 약 3 중량%, 또는 약 2 내지 약 3 중량%, 또는 약 3 중량%, 또는 약 2 중량%가 다가불포화된 지방산(PUFA)이고,

d) 상기 지질의 총 지방산 함량의 약 3 중량% 미만, 또는 약 2.5 중량% 미만, 또는 약 2.25 중량% 미만, 또는 약 3 중량%, 또는 약 2.5 중량%, 또는 약 2.25 중량%가 리놀레산이고,

e) 상기 지질의 총 지방산 함량의 약 1 중량% 미만, 또는 약 0.5 중량% 미만이 α-리놀렌산(ALA)이고,

f) 상기 지질의 총 지방산 함량의 약 0.5 내지 약 1 중량%가 18:1Δ11이고,

g) 상기 지질의 지방산 함량의 ODP가 약 0.033 내지 약 0.01, 또는 약 0.033 내지 약 0.016, 또는 약 0.033 내지 약 0.023이거나, 또는 약 0.03, 또는 약 0.02, 또는 약 0.01이고,

h) 상기 지질의 지방산 함량의 PLO 값이 약 0.020 내지 약 0.063, 또는 약 0.020 내지 약 0.055, 또는 약 0.020 내지 약 0.050, 또는 약 0.050 내지 약 0.055, 또는 약 0.063, 또는 약 0.055, 또는 약 0.050, 또는 약 0.040, 또는 약 0.030, 또는 약 0.020이고,

i) 상기 지질의 총 지방산 함량의 약 90 내지 약 96 중량%, 또는 약 92 내지 약 96 중량%, 또는 약 93 중량%, 또는 약 94 중량%가 일가불포화된 지방산이고,

j) 상기 지질이 약 0.02 미만, 또는 약 0.015 미만, 또는 약 0.005 내지 약 0.02의 올레산 일가불포화 비율(OMP)을 가지며,

k) 상기 지질이 정제된 오일의 형태로 존재하고,

l) 상기 지질이 수소화되지 않는다.

하나의 실시태양에서,

1) 상기 지질의 총 지방산 함량의 약 91 내지 약 94 중량%가 올레산이고,

2) 상기 지질의 총 지방산 함량의 약 2.75 중량% 미만이 팔미트산이고,

3) 상기 지질의 총 지방산 함량의 약 3 중량% 미만이 리놀레산이고,

4) α-리놀렌산이 상기 지질의 지방산 함량 중에서 검출될 수 없다,

5) 상기 지질의 지방산 함량의 ODP가 약 0.033 내지 약 0.023, 또는 약 0.033 내지 약 0.018이고,

6) 상기 지질의 지방산 함량의 PLO 값이 약 0.020 내지 약 0.063이고,

7) 상기 지질의 총 지방산 함량의 약 96 중량%, 또는 약 93 중량%, 또는 약 94 중량%가 일가불포화된 지방산이고,

8) 상기 지질이 약 0.02 미만, 또는 약 0.015 미만, 또는 약 0.005 내지 약 0.02의 올레산 일가불포화 비율(OMP)을 갖는다.

추가의 실시태양에서,

1) 상기 지질의 총 지방산 함량의 약 91 내지 약 94 중량%가 올레산이고,

2) 상기 지질의 총 지방산 함량의 약 2.75 중량% 미만이 팔미트산이고,

3) 상기 지질의 총 지방산 함량의 약 3 중량% 미만이 리놀레산이고,

4) α-리놀렌산이 상기 지질의 지방산 함량 중에서 검출될 수 없다,

5) 상기 지질의 총 지방산 함량의 약 96 중량%, 또는 약 93 중량%, 또는 약 94 중량%가 일가불포화된 지방산이고,

6) 상기 지질이 약 0.02 미만, 또는 약 0.015 미만, 또는 약 0.005 내지 약 0.02의 올레산 일가불포화 비율(OMP)을 갖는다.

하나의 실시태양에서, 상기 PUFA는 리놀레산이다.

하나의 실시태양에서, α-리놀렌산은 상기 지질의 지방산 함량 중에서 검출될 수 없다.

추가의 실시태양에서, 상기 지질의 TAG 함량의 약 55% 내지 약 80%, 또는 약 60% 내지 약 80%, 또는 약 70% 내지 약 80%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 약 60%, 또는 약 70%, 또는 약 80%는 트라이올레인이다.

또 다른 실시태양에서, 상기 지질의 올레산 함량의 약 5% 미만, 또는 약 2% 미만, 또는 약 0.1% 내지 약 5%는 다이아실글리세롤(DAG)의 형태로 존재한다.

추가의 실시태양에서, 상기 지질은 오일의 형태로 존재하며, 여기서 상기 오일의 적어도 90 중량%, 또는 적어도 95 중량%, 적어도 약 98 중량%, 또는 약 95 내지 약 98 중량%는 지질이다.

바람직한 실시태양에서, 상기 유지종자는 비-광합성 유지종자이다. 비-광합성 유지종자의 예는 이로 제한되지 않지만, 잇꽃, 해바라기, 목화 또는 아주까리로부터의 종자를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 비-광합성 유지종자는 잇꽃 종자이다.

하나의 실시태양에서, 상기 지질은 하나 이상의 스테롤을 추가로 포함한다.

추가의 실시태양에서, 상기 지질은 오일의 형태로 존재하며, 약 5 ㎎ 미만의 스테롤/g의 오일, 또는 약 1.5 ㎎의 스테롤/g의 오일 내지 약 5 ㎎의 스테롤/g의 오일을 포함한다.

하나의 실시태양에서, 상기 지질은 하기의 하나 이상 또는 전부를 포함한다:

a) 총 스테롤 함량의 약 1.5% 내지 약 4.5%, 또는 약 2.3% 내지 약 4.5%가 에르고스트-7-엔-3β-올이고,

b) 총 스테롤 함량의 약 0.5% 내지 약 3%, 또는 약 1.5% 내지 약 3%가 트라이터페노이드 알콜이고,

c) 총 스테롤 함량의 약 8.9% 내지 약 20%가 Δ7-스티그마스테롤/스티그마스트-7-엔-3β-올이고,

d) 총 스테롤 함량의 약 1.7% 내지 약 6.1%가 Δ7-아베나스테롤이다.

추가의 실시태양에서, 상기 지질은 적어도 1 리터의 부피 및/또는 적어도 1 ㎏의 중량을 갖고/갖거나 필드에서 재배한 식물로부터 수득한 유지종자로부터 추출되었다.

하나의 실시태양에서, 상기 지질은 파쇄에 의해 유지종자로부터 추출되었으며 약 7 중량% 미만의 물을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 지질은 정제된 지질(용매 추출되고 정제된)이며 약 0.1 중량% 미만, 또는 약 0.05 중량% 미만의 물을 포함한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 지질인 제1 성분, 및 제2 성분을 포함하는 조성물을 제공하며, 바람직하게는 상기 조성물을 상기 지질을 제2 성분과 혼합하여 제조하였다.

당업자가 이해하는 바와 같이, 제2 성분은 광범위하게 상이한 화합물/조성물 중에서 선택될 수 있다. 일례로, 제2 성분은 비-지질 물질, 예를 들어 효소, 비-단백질(비-효소성) 촉매 또는 화학물질(예를 들어 수산화 나트륨, 메탄올 또는 금속), 또는 사료의 하나 이상의 성분이다.

본 발명은 또한 오일의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은

i) 오일을 포함하는 오일 종자, 및/또는 오일을 포함하는 유지종자를 생산하는 식물을 생산할 수 있는 유지종자를 수득하는 단계로, 상기 유지종자의 오일 함량이 본 발명에 정의된 바와 같은 지질인 단계, 및

ii) 상기 유지종자로부터 오일을 추출하여 오일을 생산하는 단계를 포함한다.

바람직한 실시태양에서, 상기 유지종자는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드가 없는 상응하는 유지종자에 비해, 발생하는 유지종자에서 Δ12 불포화효소(FAD2) 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 제1 침묵화 RNA (first silencing RNA)를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드가 발생하는 유지종자에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시하는 프로모터에 작동적으로 연결된다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 오일의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은

i) 글리세롤에 에스테르화된 지방산으로 이루어진 트라이아실글리세롤(TAG)을 포함하는 오일 함량을 갖고/갖거나, 상기 오일 함량을 갖는 종자를 생산하는 식물을 생산할 수 있는 잇꽃 종자를 수득하는 단계로,

a) 상기 지방산이 팔미트산 및 올레산을 포함하고,

b) 상기 종자의 오일 함량의 적어도 95 중량%가 TAG이고,

c) 상기 종자의 오일 함량의 총 지방산의 약 75 내지 약 95 중량%가 올레산이고,

d) 상기 종자의 오일 함량의 총 지방산의 약 5.1 중량% 미만이 팔미트산이고,

e) 상기 종자의 오일 함량이 약 0.17 미만의 올레산 불포화 비율(ODP) 및/또는 약 0.26 미만의 팔미트산-리놀레산-올레산(PLO) 값을 가지는 것인 단계, 및

ii) 상기 유지종자로부터 오일을 추출하여 오일을 생산하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 잇꽃 종자는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드가 없는 상응하는 잇꽃 종자에 비해, 발생하는 잇꽃 종자에서 Δ12 불포화효소(FAD2) 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 제1 침묵화 RNA를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드가 발생하는 잇꽃 종자에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시하는 프로모터에 작동적으로 연결된다.

하나의 실시태양에서, 상기 유지종자 또는 잇꽃 종자는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드가 없는 상응하는 유지종자 또는 잇꽃 종자에 비해, 발생하는 오일 종자 또는 잇꽃 종자에서 팔미토일-ACP 티오에스테라제(FATB) 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 제2 침묵화 RNA를 암호화하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 발생하는 유지종자 또는 잇꽃 종자에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시하는 프로모터에 작동적으로 연결된다.

또 다른 실시태양에서, 상기 유지종자 또는 잇꽃 종자는 제3 외인성 폴리뉴클레오티드가 없는 상응하는 유지종자 또는 잇꽃 종자에 비해, 발생하는 오일 종자 또는 잇꽃 종자에서 색소체 ω6 지방산 불포화효소(FAD6) 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 제3 침묵화 RNA를 암호화하는 제3 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제3 외인성 폴리뉴클레오티드는 발생하는 유지종자 또는 잇꽃 종자에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시하는 프로모터에 작동적으로 연결된다.

하나의 실시태양에서,

1) 상기 FAD2 유전자는 CtFAD2-1 유전자, CtFAD2-2 유전자, 및 CtFAD2-10 유전자의 하나 이상 또는 각각, 바람직하게는 CtFAD2-1 유전자 및/또는 CtFAD2-2 유전자이고/이거나,

2) 상기 FATB 유전자는 CtFATB-3 유전자이고/이거나,

3) 상기 FAD6 유전자는 CtFAD6 유전자이다.

하나의 실시태양에서, 상기 잇꽃 종자의 오일 함량은 하기의 특징들의 하나 이상 또는 전부를 갖는다:

a) 상기 종자의 오일 함량의 총 지방산의 약 80 내지 약 94 중량%, 또는 약 85 내지 약 94 중량%, 또는 약 90 내지 약 94 중량%, 또는 약 91 내지 94 중량%, 또는 약 91 내지 약 92 중량%, 또는 약 92 중량%, 또는 약 93 중량%가 올레산이고,

b) 상기 종자의 오일 함량의 총 지방산의 약 5 중량% 미만, 또는 약 4 중량% 미만, 또는 약 3 중량% 미만, 또는 약 2.75 중량% 미만, 또는 약 2.5 중량% 미만, 또는 약 3 중량%, 또는 약 2.75 중량%, 또는 약 2.5 중량%가 팔미트산이고,

c) 상기 종자의 오일 함량의 총 지방산의 약 0.1 내지 약 15 중량%, 또는 약 0.1 내지 약 10 중량%, 또는 약 0.1 내지 약 7.5 중량%, 또는 약 0.1 내지 약 5 중량%, 또는 약 0.1 내지 약 3 중량%, 또는 약 2 내지 약 3 중량%, 또는 약 3 중량%, 또는 약 2 중량%가 다가불포화된 지방산(PUFA)이고,

d) 상기 종자의 오일 함량의 총 지방산의 약 15 중량% 미만, 또는 약 10 중량% 미만, 또는 약 5 중량% 미만, 또는 약 3 중량% 미만, 또는 약 2.5 중량% 미만, 또는 약 2.25 중량% 미만, 또는 약 3 중량%, 또는 약 2.5 중량%, 또는 약 2.25 중량%가 리놀레산(LA)이고,

e) 상기 지질의 총 지방산 함량의 약 80 내지 약 96 중량%, 또는 약 90 내지 약 96 중량%, 또는 약 92 내지 약 96 중량%, 또는 약 93 중량%, 또는 약 94 중량%가 일가불포화된 지방산이고,

f) 상기 지질이 약 0.05 미만, 또는 약 0.02 미만, 또는 약 0.015 미만, 또는 약 0.005 내지 약 0.05, 또는 약 0.005 내지 약 0.02의 올레산 일가불포화 비율(OMP)을 가지며,

g) 상기 종자의 오일 함량의 ODP가 약 0.17 내지 약 0.01, 또는 약 0.15 내지 약 0.01, 또는 약 0.1 내지 약 0.01, 또는 약 0.075 내지 약 0.01, 또는 약 0.050 내지 약 0.01, 또는 약 0.033 내지 약 0.01, 또는 약 0.033 내지 약 0.016, 또는 약 0.033 내지 약 0.023이거나, 또는 약 0.03, 또는 약 0.02, 또는 약 0.01이고,

h) 상기 종자의 오일 함량의 PLO 값이 약 0.20 내지 약 0.026, 또는 약 0.020 내지 약 0.2, 또는 약 0.020 내지 약 0.15, 또는 약 0.020 내지 0.1, 또는 약 0.020 및 약 0.075, 또는 약 0.050 및 약 0.055이거나, 또는 약 0.05, 또는 약 0.040, 또는 약 0.030, 또는 약 0.020이다.

하나의 실시태양에서, 상기 오일을 추출하는 단계는 상기 유지종자 또는 잇꽃 종자를 파쇄하는 단계를 포함한다.

더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 방법은 상기 유지종자 또는 잇꽃 종자로부터 추출된 오일을 정제하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 상기 정제 단계는 추출된 오일의 정련, 탈취, 탈색, 건조 및/또는 분별하고/하거나 추출된 오일로부터 왁스 및/또는 왁스 에스테르의 적어도 일부, 바람직하게는 실질적으로 전부를 제거하는 단계로 이루어지는 그룹의 하나 이상 또는 전부를 포함한다.

또 다른 단계에서, 본 발명은 글리세롤로 에스테르화된 지방산으로 이루어지는 트라이아실글리세롤(TAG)을 포함하는 오일 함량을 갖고/갖거나, 상기 오일 함량을 갖는 유지종자를 생산하는 식물을 생산할 수 있는 유지종자를 제공하며, 여기서

i) 상기 지방산은 팔미트산 및 올레산을 포함하고,

ii) 상기 유지종자의 오일 함량의 적어도 95 중량%는 TAG이고,

iii) 상기 유지종자의 오일 함량의 총 지방산의 약 90 내지 약 95 중량%는 올레산이고,

iv) 상기 유지종자의 오일 함량의 총 지방산의 약 3.1 중량% 미만은 팔미트산이고,

v) 상기 유지종자의 오일 함량은 약 0.037 미만의 올레산 불포화 비율(ODP) 및/또는 약 0.063 미만의 팔미트산-리놀레산-올레산(PLO) 값을 갖는다.

하나의 실시태양에서, 상기 유지종자는 비-광합성 유지종자, 바람직하게는 잇꽃, 해바라기, 목화 또는 아주까리로부터의 종자이다.

또 다른 실시태양에서, 상기 유지종자는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드가 없는 상응하는 유지종자에 비해, 발생하는 유지종자에서 Δ12 불포화효소(FAD2) 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 제1 침묵화 RNA를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 발생하는 유지종자에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시하는 프로모터에 작동적으로 연결된다.

더욱 추가의 태양에서, 본 발명은 글리세롤로 에스테르화된 지방산으로 이루어지는 트라이아실글리세롤(TAG)을 포함하는 오일 함량을 갖고/갖거나, 상기 오일 함량을 갖는 종자를 생산하는 식물을 생산할 수 있는 잇꽃 종자를 제공하며, 여기서

i) 상기 지방산은 팔미트산 및 올레산을 포함하고,

ii) 상기 종자의 오일 함량의 적어도 95 중량%는 TAG이고,

iii) 상기 종자의 오일 함량의 총 지방산의 약 75 내지 약 95 중량%는 올레산이고,

iv) 상기 종자의 오일 함량의 총 지방산의 약 5.1 중량% 미만은 팔미트산이고,

v) 상기 종자의 오일 함량은 약 0.17 미만의 올레산 불포화 비율(ODP) 및/또는 약 0.26 미만의 팔미트산-리놀레산-올레산(PLO) 값을 가지며,

여기서 상기 잇꽃 종자는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드가 없는 상응하는 잇꽃 종자에 비해, 발생하는 잇꽃 종자에서 Δ12 불포화효소(FAD2) 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 제1 침묵화 RNA를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제1 외인성 폴리뉴클레오티드는 발생하는 잇꽃 종자에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시하는 프로모터에 작동적으로 연결된다.

하나의 실시태양에서, 상기 잇꽃 종자의 오일 함량은 하기의 특징들의 하나 이상을 갖는다;

a) 상기 종자의 오일 함량의 총 지방산의 약 80 내지 약 94 중량%, 또는 약 85 내지 약 94 중량%, 또는 약 90 내지 약 94 중량%, 또는 약 91 내지 약 94 중량%, 또는 약 91 내지 약 92 중량%, 또는 약 92 중량%, 또는 약 93 중량%가 올레산이고,

b) 상기 종자의 오일 함량의 총 지방산의 약 5 중량% 미만, 또는 약 4 중량% 미만, 또는 약 3 중량% 미만, 또는 약 2.75 중량% 미만, 또는 약 2.5 중량% 미만, 또는 약 3 중량%, 또는 약 2.75 중량%, 또는 약 2.5 중량%가 팔미트산이고,

c) 상기 종자의 오일 함량의 총 지방산의 약 0.1 내지 약 15 중량%, 또는 약 0.1 내지 약 10 중량%, 또는 약 0.1 내지 약 7.5 중량%, 또는 약 0.1 중량% 내지 약 5 중량%, 또는 약 0.1 내지 약 3 중량%, 또는 약 2 내지 약 3 중량%, 또는 약 3 중량%, 또는 약 2 중량%가 다가불포화된 지방산(PUFA)이고,

d) 상기 종자의 오일 함량의 총 지방산의 약 15 중량% 미만, 또는 약 10 중량% 미만, 또는 약 5 중량% 미만, 또는 약 3 중량% 미만, 또는 약 2.5 중량% 미만, 또는 약 2.25 중량% 미만, 또는 약 3 중량%, 또는 약 2.5 중량%, 또는 약 2.25 중량%가 리놀레산(LA)이고,

e) 상기 지질의 총 지방산 함량의 약 80 내지 약 96 중량%, 또는 약 90 내지 약 96 중량%, 또는 약 92 내지 약 96 중량%, 또는 약 93 중량%, 또는 약 94 중량%가 일가불포화된 지방산이고,

f) 상기 지질이 약 0.05 미만, 또는 약 0.02 미만, 또는 약 0.015 미만, 또는 약 0.005 내지 약 0.05, 또는 약 0.005 내지 약 0.02의 올레산 일가불포화 비율(OMP)을 가지며,

g) 상기 종자의 오일 함량의 ODP가 약 0.17 내지 약 0.01, 또는 약 0.15 내지 약 0.01, 또는 약 0.1 내지 약 0.01, 또는 약 0.075 내지 약 0.01, 또는 약 0.050 내지 약 0.01, 또는 약 0.033 내지 약 0.01, 또는 약 0.033 내지 약 0.016, 또는 약 0.033 내지 약 0.023이거나, 또는 약 0.03, 또는 약 0.02, 또는 약 0.01이고,

h) 상기 종자의 오일 함량의 PLO 값이 약 0.020 내지 약 0.26, 또는 약 0.020 내지 약 0.2, 또는 약 0.020 내지 약 0.15, 또는 약 0.020 내지 0.1, 또는 약 0.020 및 약 0.075, 또는 약 0.050 및 약 0.055이거나, 또는 약 0.05, 또는 약 0.040, 또는 약 0.030, 또는 약 0.020이다.

추가의 실시태양에서, 상기 유지종자 또는 잇꽃 종자의 오일 함량은 상기 언급한 특징들의 하나 이상을 추가의 특징으로 하는 지질이다.

또 다른 실시태양에서, 상기 유지종자 또는 잇꽃 종자는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드가 없는 상응하는 유지종자 또는 잇꽃 종자에 비해, 발생하는 유지종자 또는 잇꽃 종자에서 팔미토일-ACP 티오에스테라제(FATB) 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 제2 침묵화 RNA를 암호화하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제2 외인성 폴리뉴클레오티드는 발생하는 유지종자 또는 잇꽃 종자에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시하는 프로모터에 작동적으로 연결된다.

추가의 실시태양에서, 상기 유지종자 또는 잇꽃 종자는 제3 외인성 폴리뉴클레오티드가 없는 상응하는 유지종자 또는 잇꽃 종자에 비해, 발생하는 유지종자 또는 잇꽃 종자에서 색소체 ω6 지방산 불포화효소(FAD6) 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 제3 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제3 외인성 폴리뉴클레오티드는 발생하는 유지종자 또는 잇꽃 종자에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시하는 프로모터에 작동적으로 연결된다.

또 다른 실시태양에서, 제1 침묵화 RNA는 발생하는 유지종자 또는 잇꽃 종자에서 FAD2를 암호화하는 하나 이상의 내인성 유전자의 발현을 감소시키고/시키거나, 제2 침묵화 RNA는 발생하는 유지종자 또는 잇꽃 종자에서 FATB를 암호화하는 하나 이상의 내인성 유전자의 발현을 감소시킨다.

더욱 추가의 실시태양에서, 제1 외인성 폴리뉴클레오티드, 및 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 제3 외인성 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다는, 임의로 제1, 제2 및/또는 제3 외인성 폴리뉴클레오티드들 간의 DNA 서열들이 연결되면서, 단일의 DNA 분자상에 공유적으로 연결한다.

또 다른 실시태양에서, 제1 외인성 폴리뉴클레오티드, 및 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 제3 외인성 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다는, 제1 외인성 폴리뉴클레오티드 및 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 제3 외인성 폴리뉴클레오티드가 발생하는 유지종자 또는 잇꽃 종자에서 전사될 때, 제1 침묵화 RNA 및 제2 침묵화 RNA 및/또는 제3 침묵화 RNA가 단일의 RNA 전사체의 일부분으로서 공유적으로 연결되도록 단일의 프로모터의 조절 하에 있다.

또 다른 실시태양에서, 상기 유지종자 또는 잇꽃 종자는 상기 유지종자 또는 잇꽃 종자의 게놈에 통합된 단일의 전달 DNA를 포함하며, 여기서 상기 단일의 전달 DNA는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드, 및 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 제3 외인성 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함한다.

바람직하게는, 상기 유지종자 또는 잇꽃 종자는 상기 전달 DNA에 대해서 동형접합성이다.

하나의 실시태양에서, 제1 침묵화 RNA, 제2 침묵화 RNA 및 제3 침묵화 RNA는 각각 독립적으로 안티센스 폴리뉴클레오티드, 센스 폴리뉴클레오티드, 촉매적 폴리뉴클레오티드, 미세RNA 및 이중 가닥 RNA로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.

추가의 실시태양에서, 상기 프로모터들 중 임의의 하나 이상, 바람직하게 전부는 종자 특이적이며, 바람직하게는 발생하는 유지종자 또는 잇꽃 종자의 배에서 우선적으로 발현된다.

또 다른 실시태양에서, 상기 유지종자 또는 잇꽃 종자는 하나 이상의 FAD2 유전자 중의 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 돌연변이(들)는 상기 돌연변이(들)가 없는 상응하는 유지종자 또는 잇꽃 종자에 비해, 발생하는 유지종자 또는 잇꽃 종자에서 상기 하나 이상의 FAD2 유전자의 활성을 감소시킨다.

또 다른 실시태양에서, 상기 유지종자 또는 잇꽃 종자는 상응하는 유지종자 또는 잇꽃 종자에서 야생형 FAD2 유전자에 비해 FAD2 유전자의 돌연변이를 포함하며, 상기 돌연변이는 결실, 삽입, 역위, 틀이동, 조기 (premature) 번역 정지 코돈, 또는 하나 이상의 비-보존적 아미노산 치환이다.

추가의 실시태양에서, 상기 돌연변이는 상기 FAD2 유전자의 삭제 돌연변이이다.

또 다른 실시태양에서, 적어도 하나의 상기 돌연변이는 발생하는 유지종자 또는 잇꽃 종자에서 임의의 다른 FAD2 유전자보다 상기 돌연변이(들)가 없는 발생하는 유지종자 또는 잇꽃 종자에서 더 많은 FAD2 활성을 암호화하는 FAD2 유전자 중에 있다.

또 다른 실시태양에서, 상기 종자는 잇꽃 종자이며 상기 FAD2 유전자는 CtFAD2-1 유전자이다. 상기 실시태양에서, 제1 침묵화 RNA는 CtFAD2-2 유전자의 발현이 적어도 가능하거나 또는 상기 발현을 감소시키는 것이 또한 바람직하다.

또 다른 실시태양에서, 상기 종자는 상기 CtFAD2-1 유전자의 ol 대립유전자 또는 상기 CtFAD2-1 유전자의 ol1 대립유전자, 또는 상기 두 대립유전자를 모두 포함하는 잇꽃 종자이다. 하나의 실시태양에서, 상기 CtFAD2-1 유전자의 ol 대립유전자 또는 ol1 대립유전자는 상기 동형접합성 상태로 존재한다.

또 다른 실시태양에서, FAD2 단백질은 상기 유지종자 또는 잇꽃 종자 중에서 검출될 수 없다.

또 다른 실시태양에서, 상기 종자는 잇꽃 종자이며 제1 침묵화 RNA는 CtFAD2-1 및 CtFAD2-2 유전자 모두의 발현을 감소시킨다.

또 다른 실시태양에서, 상기 종자는 잇꽃 종자이며, 이때

1) 상기 FAD2 유전자는 CtFAD2-1 유전자, CtFAD2-2 유전자, 및 CtFAD2-10 유전자의 하나 이상, 바람직하게는 CtFAD2-1 유전자 및/또는 CtFAD2-2 유전자이고/이거나,

2) 상기 FATB 유전자는 CtFATB-3 유전자이고/이거나,

3) 상기 FAD6 유전자는 CtFAD6 유전자이다.

본 발명의 종자를 생산할 수 있는 유지종자 식물 또는 잇꽃 식물을 또한 제공한다.

하나의 실시태양에서, 상기 식물은 각각의 외인성 폴리뉴클레오티드에 대해 트랜스제닉 및 동형접합성이고/이거나, 제1 외인성 폴리뉴클레오티드, 및 제2 외인성 폴리뉴클레오티드 및 제3 외인성 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 서열번호 27 내지 37, 44, 45 및 48 중 어느 하나에 제공된 바와 같은 서열을 갖는 아미노산, 그의 생물학적 활성 단편, 또는 서열번호 27 내지 37, 44, 45 및 48 중 임의의 하나 이상과 적어도 40% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 정제된 및/또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다.

하나의 실시태양에서, 상기 폴리펩티드는 지방산 변형 효소, 바람직하게는 올리에이트 Δ12 불포화효소, Δ12-아세틸레나제, 팔미트올리에이트 Δ12 불포화효소 또는 팔미토일-ACP 티오에스테라제(FATB)이다.

추가의 태양에서, 본 발명은 하기의 하나 이상을 포함하는 단리된 및/또는 외인성의 폴리뉴클레오티드를 제공한다

i) 서열번호 1 내지 25, 40 내지 43, 46 및 47 중 어느 하나에 제공된 바와 같은 서열을 갖는 뉴클레오티드,

ii) 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 갖는 뉴클레오티드,

iii) 서열번호 1 내지 25, 40 내지 43, 46 및 47 중 어느 하나에 제공된 바와 같은 서열에 하이브리드화하는 뉴클레오티드, 및

iv) 유지종자 식물의 종자에서 발현시 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 발현을 감소시키도록 하는 서열을 갖는 뉴클레오티드.

특히 바람직한 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드는 유지종자 식물의 종자에서 발현시 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 발현을 감소시키도록 하는 서열을 갖는 뉴클레오티드를 포함한다.

하나의 실시태양에서, 상기 iv) 일부분의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 49 내지 51(여기서 티민(T)은 유라실(U)임) 중 어느 하나에 제공된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

하나의 실시태양에서, 상기 iv) 일부분의 폴리뉴클레오티드는 안티센스 폴리뉴클레오티드, 센스 폴리뉴클레오티드, 촉매성 폴리뉴클레오티드, 미세RNA, 이중 가닥 RNA(dsRNA) 분자 또는 이들의 가공처리된 RNA 산물 중에서 선택된다.

추가의 실시태양에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 25, 40 내지 43, 46, 47 및 49 내지 51(여기서 티민(T)은 유라실(U)임) 중 임의의 하나 이상의 보체와 적어도 95% 동일한 적어도 19 개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는, dsRNA 분자, 또는 그의 가공처리된 RNA 산물이다.

또 다른 실시태양에서, 상기 dsRNA 분자는 미세RNA(miRNA) 전구체이고/이거나 그의 가공처리된 RNA 산물은 miRNA이다.

더욱 추가의 실시태양에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 단일 프로모터의 조절 하에서 발생하는 유지종자 또는 잇꽃 종자에서 전사되며, 여기서 상기 dsRNA 분자는 단일 가닥 RNA 영역에 의해 연결된, 서로 하이브리드화할 수 있는 상보성 센스 및 안티센스 서열을 포함한다.

더욱 추가의 실시태양에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 발생하는 잇꽃 종자 중에 존재시

i) 발생하는 종자에서 올리에이트 Δ12 불포화효소(FAD2)를 암호화하는 내인성 유전자의 발현을 감소시키고, 상기 FAD2는 서열번호 27, 28 및 36 중 임의의 하나 이상, 바람직하게는 서열번호 27 및 28 중 적어도 하나 또는 둘 다에 제공된 바와 같은 아미노산 서열을 가지며;

ii) 발생하는 종자에서 팔미토일-ACP 티오에스테라제(FATB)를 암호화하는 내인성 유전자의 발현을 감소시키고, 상기 FATB는 서열번호 45에 제공된 바와 같은 아미노산 서열을 가지며; 및/또는

iii) 발생하는 종자에서 ω6 지방산 불포화효소(FAD6)를 암호화하는 유전자의 발현을 감소시키고, 상기 FAD6는 서열번호 48에 제공된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.

또한 프로모터에 작동적으로 연결된, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메릭 벡터를 제공한다.

하나의 실시태양에서, 상기 프로모터는 유지종자에서 작용성이거나, 또는 종자 특이적 프로모터이고, 바람직하게는 발생하는 유지종자의 배에서 우선적으로 발현된다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.

상기 세포는 임의의 세포 유형, 예를 들어 이로 제한되지 않지만, 세균 세포, 효모 세포 또는 식물 세포일 수 있다.

바람직하게는 상기 세포는 식물 세포, 바람직하게는 식물 종자 세포이다. 보다 바람직하게, 상기 식물 세포는 유지종자 식물 세포이다. 훨씬 더 바람직하게, 상기 식물 세포는 비-광합성 종자 세포, 바람직하게는 잇꽃, 해바라기, 목화 또는 아주까리 종자 세포이다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드들의 하나 이상, 본 발명의 벡터, 및 본 발명의 세포를 포함하는 트랜스제닉 비-인간 유기체를 제공한다.

바람직하게, 상기 트랜스제닉 비-인간 유기체는 식물, 보다 바람직하게 유지종자 식물이다.

더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 세포를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 벡터를 세포에 도입하는 단계를 포함한다.

또한 재조합 세포를 생산하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 벡터의 용도를 제공한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 종자를 생산하는 트랜스제닉 유지종자 식물 또는 그의 종자의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은

i) 본 발명의 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 적어도 하나의 벡터를 유지종자 식물의 세포에 도입하는 단계,

ii) 상기 세포로부터 트랜스제닉 식물을 재생하는 단계, 및

iii) 임의로 상기 트랜스제닉 식물로부터 하나 이상의 자손 식물 또는 그의 종자를 생산하고, 이에 의해 트랜스제닉 유지종자 식물 또는 그의 종자를 생산하는 단계를 포함한다.

하나의 실시태양에서, 상기 종자는 본 발명의 잇꽃 종자이다.

추가의 실시태양에서, 상기 하나 이상의 자손 식물 또는 그의 종자는

i) 제1 외인성 폴리뉴클레오티드, 및/또는

ii) 제2 외인성 폴리뉴클레오티드, 및/또는

iii) 제3 외인성 폴리뉴클레오티드,

바람직하게는 상기 3 개의 모든 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

추가의 실시태양에서, 상기 하나 이상의 자손 식물 또는 그의 종자는 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.

더욱 추가의 태양에서, 본 발명은 유지종자 식물의 수득 방법을 제공하며, 상기 방법은

i) 본 발명의 제1 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 제1 벡터를 포함하는 제1 모체 (parent) 유지종자 식물을, 본 발명의 제2 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 제1 벡터를 포함하는 제2 모체 유지종자 식물과 교배하는 단계,

ii) 상기 교배로부터의 자손 식물을 상기 두 폴리뉴클레오티드 모두 또는 두 벡터 모두의 존재에 대해 선별하는 단계; 및

iii) (a) 제1 폴리뉴클레오티드 또는 제1 벡터 및 (b) 제2 폴리뉴클레오티드 또는 제2 벡터 모두를 포함하고, 추가로 상기 식물의 종자의 오일 함량 중 증가된 비율의 올레산 및 감소된 비율의 팔미트산을 추가로 갖는 자손 식물을 선택하는 단계를 포함한다.

추가의 태양에서, 본 발명은 잇꽃 식물의 유전형질 분석 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 식물의 핵산 분자를 검출하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 핵산 분자는 잇꽃 식물의 CtFAD2-1, CtFAD2-2 및 CtFAD2-10 유전자의 하나 이상, 바람직하게는 CtFAD2-1 및 CtFAD2-2 유전자 중 적어도 하나 또는 둘 다, 또는 적어도 CtFAD2-1 유전자에 연결되고/되거나 상기 유전자의 적어도 일부를 포함한다.

하나의 실시태양에서, 상기 방법은 상기 식물의 CtFAD2-1, CtFAD2-2 및 CtFAD2-10 유전자의 하나 이상의 발현 수준 및/또는 서열을 측정하는 단계를 포함한다.

하나의 실시태양에서, 상기 방법은

i) 제2 핵산 분자를 상기 식물의 상기 핵산 분자에 하이브리드화하는 단계,

ii) 임의로 적어도 하나의 다른 핵산 분자를 상기 식물의 상기 핵산 분자에 하이브리드화하는 단계; 및

iii) 상기 하이브리드화 단계(들)의 생성물 또는 상기 하이브리드화 단계(들)로부터의 생성물의 부재를 검출하는 단계를 포함한다.

더욱 추가의 실시태양에서, 제2 핵산 분자는 상기 식물의 상기 핵산 분자의 적어도 일부를 역전사하거나 복제하기 위한 프라이머로서 사용된다.

상기 핵산을 다수의 널리 공지된 기법들, 예를 들어 이로 제한되지 않지만, 제한 단편 길이 다형성 분석, 증폭 단편 길이 다형성 분석, 미소부수체 증폭, 핵산 서열분석 및/또는 핵산 증폭을 사용하여 검출할 수 있다.

하나의 실시태양에서, 상기 방법은 상기 CtFAD2-1 유전자의 대립유전자, 바람직하게는 ol 대립유전자의 존재 또는 부재를 검출한다.

추가의 태양에서, 본 발명은 잇꽃 식물의 집단으로부터 잇꽃 식물을 선택하는 방법을 제공하며, 상기 방법은

i) 본 발명의 방법을 사용하여 상기 식물의 집단을 유전형질 분석하는 단계로, 여기서 상기 식물의 집단을, 적어도 하나의 식물이 CtFAD2-1, CtFAD2-2 또는 CtFAD2-10 유전자, 바람직하게는 CtFAD2-1 및 CtFAD2-2 유전자 중 적어도 하나 또는 둘 다, 또는 적어도 CtFAD2-1 유전자의 대립유전자(상기 식물의 종자 발생시에, 상기 대립유전자가 없는 잇꽃 식물의 상응하는 종자에 비해 감소된 수준의 Δ12 불포화효소 활성을 부여함)를 포함하는 2 개의 식물간의 교배로부터 수득하는 단계, 및

ii) 상기 잇꽃 식물을 상기 대립유전자의 존재 또는 부재를 근거로 선택하는 단계를 포함한다.

추가의 태양에서, 본 발명은 CtFAD2-1, CtFAD2-2 또는 CtFAD2-10 유전자의 대립유전자를 상기 대립유전자가 없는 잇꽃 식물에 도입하는 방법을 제공하며, 상기 방법은

i) 제1 모체 잇꽃 식물을 제2 모체 잇꽃 식물과 교배하는 단계로, 여기서 제2 식물이 상기 CtFAD2-1, CtFAD2-2 또는 CtFAD2-10 유전자의 대립유전자를 포함하는 것인 단계,

ii) 상기 단계 i)의 교배의 자손을, 대일부분 제1 부모의 유전자형을 갖지만 상기 대립유전자를 포함하는 식물을 생산하기에 충분한 횟수 동안 제1 모체 식물과 동일한 유전자형의 식물과 역교배하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 대립유전자는 상기 식물의 종자 발생시에, 상기 대립유전자가 없는 잇꽃 식물의 상응하는 종자에 비해 감소된 수준의 Δ12 불포화효소 활성을 부여하고, 상기 자손 식물을 본 발명의 방법을 사용하여 상기 대립유전자의 존재 또는 부재에 대해 유전형질 분석한다.

또한, 본 발명의 방법을 사용하여 생산된 트랜스제닉 식물, 또는 그의 자손 식물, 또는 그의 종자를 제공한다.

추가의 태양에서, 본 발명은 종자의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은

a) 본 발명의 식물을, 바람직하게는 필드에서, 적어도 1000 개의 상기와 같은 식물의 집단의 일부분으로서 재배하는 단계, 및

b) 상기 종자를 수확하는 단계를 포함한다.

더욱 추가의 태양에서, 본 발명은 본 발명의 유지종자 또는 잇꽃 종자로부터, 본 발명의 상기 식물 또는 그의 일부분으로부터 본 발명의 세포로부터, 및/또는 본 발명의 비-인간 트랜스제닉 유기체 또는 그의 일부분으로부터 본 발명의 방법들의 하나 이상에 의해 수득되거나 또는 수득될 수 있는 오일을 제공한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 지질, 본 발명의 유지종자 또는 잇꽃 종자, 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 벡터, 본 발명의 숙주 세포, 및 본 발명의 오일의 하나 이상, 및 하나 이상의 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.

또한 공업용 제품의 제조를 위한 본 발명의 지질, 본 발명의 조성물, 본 발명의 방법, 본 발명의 유지종자 또는 잇꽃 종자, 본 발명의 식물 또는 그의 일부분, 본 발명의 숙주 세포, 본 발명의 비-인간 트랜스제닉 유기체 또는 그의 일부분, 및 본 발명의 오일의 하나 이상의 용도를 제공한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 공업용 제품의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은

i) 본 발명의 지질, 본 발명의 조성물, 본 발명의 유지종자 또는 잇꽃 종자, 본 발명의 식물 또는 그의 일부분, 본 발명의 숙주 세포, 본 발명의 비-인간 트랜스제닉 유기체 또는 그의 일부분, 및 본 발명의 오일의 하나 이상을 수득하는 단계,

ii) 임의로 단계 i)의 본 발명의 지질, 본 발명의 조성물, 본 발명의 유지종자 또는 잇꽃 종자, 본 발명의 식물 또는 그의 일부분, 본 발명의 숙주 세포, 본 발명의 비-인간 트랜스제닉 유기체 또는 그의 일부분, 및 본 발명의 오일의 하나 이상을 물리적으로 가공처리하는 단계,

ii) 본 발명의 지질의 적어도 일부, 또는 본 발명의 조성물, 본 발명의 유지종자 또는 잇꽃 종자, 본 발명의 식물 또는 그의 일부분, 본 발명의 숙주 세포, 본 발명의 비-인간 트랜스제닉 유기체 또는 그의 일부분, 및 본 발명의 오일의 하나 이상 중의 지질의 적어도 일부, 또는 단계 ii)의 물리적으로 가공처리된 생성물의 적어도 일부를, 열, 화학적 또는 효소적 수단, 또는 이들의 임의의 조합을 상기 지질에 적용시킴으로써 공업용 제품으로 전환시키는 단계; 및

iii) 상기 공업용 제품을 회수하여 공업용 제품을 생산하는 단계를 포함한다.

더욱 추가의 태양에서, 본 발명은 연료의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은

i) 본 발명의 지질의 하나 이상, 또는 본 발명의 조성물, 본 발명의 유지종자 또는 잇꽃 종자, 본 발명의 식물 또는 그의 일부분, 본 발명의 숙주 세포, 본 발명의 비-인간 트랜스제닉 유기체 또는 그의 일부분, 및 본 발명의 오일의 하나 이상 중의 지질을, 임의로 촉매의 존재 하에서 알콜과 반응시켜 알킬 에스테르를 생성시키는 단계; 및

ii) 임의로, 상기 알킬 에스테르를 석유 기재 연료와 블렌딩하는 단계를 포함한다.

하나의 실시태양에서, 상기 알킬 에스테르는 메틸 에스테르이다.

추가의 태양에서, 본 발명은 식품류의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 지질, 본 발명의 조성물, 본 발명의 유지종자 또는 잇꽃 종자, 본 발명의 식물 또는 그의 일부분, 본 발명의 숙주 세포, 본 발명의 비-인간 트랜스제닉 유기체 또는 그의 일부분, 및 본 발명의 오일의 하나 이상을 적어도 하나의 다른 식품 성분과 혼합하는 단계를 포함한다.

또한 본 발명의 지질, 본 발명의 조성물, 본 발명의 유지종자 또는 잇꽃 종자, 본 발명의 식물 또는 그의 일부분, 본 발명의 숙주 세포, 본 발명의 비-인간 트랜스제닉 유기체 또는 그의 일부분, 및 본 발명의 오일의 하나 이상을 포함하는 식품류, 화장품 또는 화학제품을 제공한다.

더욱 추가의 태양에서, 본 발명의 지질의 하나 이상, 또는 본 발명의 조성물, 본 발명의 방법, 본 발명의 유지종자 또는 잇꽃 종자, 본 발명의 식물 또는 그의 일부분, 본 발명의 숙주 세포, 본 발명의 비-인간 트랜스제닉 유기체 또는 그의 일부분, 및 본 발명의 오일의 하나 이상 중의 지질으로부터 생산되거나 또는 이를 사용하여 생산되는 제품을 제공한다.

본 발명의 임의의 실시태양은 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 임의의 다른 실시태양에 중용하여 적용하는 것으로 간주될 것이다.

본 발명은, 오직 예시를 목적으로 의도된 본 발명에 개시된 구체적 실시태양들에 의해 범위가 제한되지 않는다. 작용적으로 동등한 생성물, 조성물 및 방법은, 본 발명에 개시된 바와 같이, 분명히 본 발명의 범위 내에 있다.

본 명세서 전체를 통해서, 달리 구체적으로 언급되거나 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단일의 단계, 물질의 조성물, 단계들의 그룹, 또는 물질 조성물들의 그룹은 하나 및 다수(즉 하나 이상)의 상기 단계들, 물질의 조성물들, 단계들의 그룹들, 또는 물질 조성물들의 그룹을 포함하는 것으로 간주될 것이다.

이하, 본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해, 첨부된 도면을 참조하여 개시한다.

도 1은 잇꽃 FAD2-유사 유전자 과에 의해 암호화된 아미노산 서열과 다른 식물로부터의 분기된 FAD2-유사 효소의 계통발생적 비교이다. 도시된 계통수는 벡터 NTI(인비트로젠(invitrogen))의 사용에 의해 생성되었다. 상기 정렬에 FAD2 불포화효소(DES), 하이드록실라제(OH), 에폭시게나제(EPOX), 아세틸레나제(ACET), 및 접합체(CONJ)가 포함되었다. 상기 계통수에 나타낸 아미노산 서열들의 진뱅크(GeneBank) 수탁 번호는 하기와 같다: coCONJ, AAK26632.1; caACET, ABC00769.1; cpEPOX, CAA76156.1; haACET, ABC59684.1; dsACET, AAO38036.1; dcACET, AAO38033.1; hhACET, AAO38031.1; haDES-2, AAL68982.1; haDES-3, AAL68983.1; luDES, ACF49507; haDES-1, AAL68982.1; ntDES, AAT72296.2; oeDES, AAW63040; siDES, AAF80560.1; ghDES-1, CAA65744.1; rcOH, AAC49010.1; atDES, AAM61113.1; pfOH:DES, AAC32755.1; plOH, ABQ01458.1; ghDES-4, AAQ16653.1; ghDES-2, CAA71199.1.(co, 칼렌듈라 오피시날리스( Calendula officinalis ); ca, 크레피스 알피네( Crepis alpine ); cp, 크레피스 팔라에스티나( Crepis palaestina ); ha, 헬리안투스 안누우스( Helianthus annuus ); ds, 디몰포테카 시누아테( Dimorphotheca sinuate ); dc, 다우쿠스 카로타( Daucus carota ); hh, 헤데라 헬릭스( Hedera helix ); lu, 리눔 유시타티시뮴( Linum usitatissimum ); nt, 니코티아나 타바쿰( Nicotiana tabacum ); oe, 올레아 에우로파에아( Olea europaea ); si, 세사뮴 인디쿰( Sesamum indicum ); rc, 리시누스 코뮤니스( Ricinus communis ); at, 아라비도프시스 탈리아나( Arabidopsis thaliana ); pf, 피사리아 펜들레리( Physaria fendleri ); pl, 피사리아 린드헤이메리( Physaria lindheimeri ).
도 2는 잇꽃 유전자형 SU에서 CtFAD2-유사 게놈 구조의 서던 블럿 하이브리드화 분석이다. 게놈 DNA를 아가로스 젤 상에서 분리전에 8 개의 상이한 제한 효소로 절단하였다. 이들 효소는 AccI(레인 1), BglII (2), BamHI (3), EcoRI (4), EcoRV (5), HindIII (6), XbaI (7) 및 XhoI (8)이었다. 상기 블럿을 CtFAD2-6의 방사성-표지된 전체 암호화 영역으로 탐침 조사하고 낮은 엄격성 조건에서 세척하였다.
도 3은 CtFAD2-1 (B), CtFAD2-2 (C), CtFAD2-9 (D), CtFAD2-10 (E) 및 CtFAD2-11 (F)를 발현하는 효모로부터의 지방산 조성물의 GC-MS 지방산 분석이다. 빈 벡터(A) 및 C18:2 이성질체의 혼합물의 GC 자취 (G)이다.
도 4는 CtFAD2-11이 엔 벤타미아나( N. benthamiana ) 잎에서 일시적으로 발현된 후의 지방산 조성물의 GC-MS 지방산 분석이다.
도 5는 잇꽃 CtFAD2 유전자의 RT-qPCR 발현 분석이다.
도 6은 야생형 SU 및 3 개의 고 올레산 유전자형들, 즉 S-317, CW99-OL 및 Lesaf496(돌연변이체 중 CtFAD2-1 암호화 영역의 가운데에 뉴클레오티드 결실을 나타냄)으로부터의 CtFAD2-1 대립유전자의 영역의 뉴클레타이드 비교이다.
도 7은 야생형 품종 SU 및 고 올레산 유전자형 S-317 중 CtFAD2-1 5'UTR 인트론의 DNA 서열 비교이다. 상자 안의 DNA 서열을 사용하여 고 올레산 특이적 및 야생형 특이적 PCR 산물들에 대한 완전한 PCR 마커를 설계하였다.
도 8은 3 개의 발생 단계, 초기(7 DPA), 중기(15 DPA), 및 말기(20 DPA)의 발생하는 배 중의 CtFAD2-1 및 CtFAD2-2 mRNA 수준의 실시간 q-PCR 분석이다. 상기 잇꽃 품종들은 야생형 SU, 및 3 개의 고 올레산 품종: S-317, CW99-OL 및 Lesaf496을 포함한다.
도 9는 잇꽃 품종 SU의 잎, 뿌리 및 발생하는 배 중의 CtFatB 유전자의 실시간 qPCR 분석이다. Em-1(초기 단계), Em-2(중기 단계), 및 Em-3(말기 단계).
도 10은 잇꽃 FAD6 서열과 보다 고등 식물에서 확인된 전형적인 FAD6 색소체 Δ12 불포화효소 간의 계통발생적 관계를 나타내는 계통도이다. 자트로파 쿠르카스( Jatropha curcas )(EU106889); 올레아 에우로파에아( Olea europaea )(AY733075); 포풀루스 트리코카르파( Populus trichocarpa )(EF147523); 아라비도프시스 탈리아나( Arabidopsis thaliana )(AY079039); 데스쿠리아나 소피아( Descuriana sophia )(EF524189); 글리시네 맥스( Glycine max )(AK243928); 브라시카 나푸스( Brassica napus )(L29214); 포르툴라카 올레라세아( Portulaca oleracea )(EU376530); 아라키스 히포가에아( Arachis hypogaea )(FJ768730); 진코 빌로바( Ginkgo biloba )(HQ694563).
도 11은 단일 종자의 LC-MS 분석에 의한 S317 대 S317+603.9 중의 다이아실글리세롤(DAG) 조성(몰%)이다.
도 12는 단일 종자의 LC-MS 분석에 의한 S317 대 S317+603.9 중의 트라이아실글리세롤(TAG) 조성(몰%)이다.
도 13은 2011/2012년 여름 오스트레일리아의 나라브리에서 필드 조건 하의 잇꽃 품종의 올레산 함량이다.
도 14는 (A) 고리 및 측쇄 넘버링을 갖는 기본 피토스테롤 구조이고, (B) 상기 피토스테롤 중 일부의 화학 구조이다.
서열 목록에 대한 풀이
서열번호 1 - 잇꽃 FAD2-1을 암호화하는 cDNA.
서열번호 2 - 잇꽃 FAD2-2를 암호화하는 cDNA.
서열번호 3 - 잇꽃 FAD2-3을 암호화하는 cDNA.
서열번호 4 - 잇꽃 FAD2-4를 암호화하는 cDNA.
서열번호 5 - 잇꽃 FAD2-5를 암호화하는 cDNA.
서열번호 6 - 잇꽃 FAD2-6을 암호화하는 cDNA.
서열번호 7 - 잇꽃 FAD2-7을 암호화하는 cDNA.
서열번호 8 - 잇꽃 FAD2-8을 암호화하는 cDNA.
서열번호 9 - 잇꽃 FAD2-9를 암호화하는 cDNA.
서열번호 10 - 잇꽃 FAD2-10을 암호화하는 cDNA.
서열번호 11 - 잇꽃 FAD2-11을 암호화하는 cDNA.
서열번호 12 - 잇꽃 FAD2-1을 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 13 - 잇꽃 FAD2-2를 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 14 - 잇꽃 FAD2-3을 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 15 - 잇꽃 FAD2-4를 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 16 - 잇꽃 FAD2-5를 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 17 - 잇꽃 FAD2-6을 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 18 - 잇꽃 FAD2-7을 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 19 - 잇꽃 FAD2-8을 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 20 - 잇꽃 FAD2-9를 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 21 - 잇꽃 FAD2-10을 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 22 - 잇꽃 FAD2-11을 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 23 - 잇꽃 FAD2-1 유전자의 인트론 서열.
서열번호 24 - 잇꽃 FAD2-2 유전자의 인트론 서열.
서열번호 25 - 잇꽃 FAD2-10 유전자의 인트론 서열.
서열번호 26 - 절두된 잇꽃 FAD2-1(HO 돌연변이체)을 암호화하는 cDNA.
서열번호 27 - 잇꽃 FAD2-1.
서열번호 28 - 잇꽃 FAD2-2.
서열번호 29 - 잇꽃 FAD2-3.
서열번호 30 - 잇꽃 FAD2-4.
서열번호 31 - 잇꽃 FAD2-5.
서열번호 32 - 잇꽃 FAD2-6.
서열번호 33 - 잇꽃 FAD2-7.
서열번호 34 - 잇꽃 FAD2-8.
서열번호 35 - 잇꽃 FAD2-9.
서열번호 36 - 잇꽃 FAD2-10.
서열번호 37 - 잇꽃 FAD2-11.
서열번호38 - 절두된 잇꽃 FAD2-1(HO 돌연변이체).
서열번호 39 - 잇꽃 FATB-1의 cDNA.
서열번호 40 - 잇꽃 FATB-2를 암호화하는 cDNA.
서열번호 41 - 잇꽃 FATB-3을 암호화하는 cDNA.
서열번호 42 - 잇꽃 FATB-2를 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 43 - 잇꽃 FATB-3을 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 44 - 잇꽃 FATB-2.
서열번호 45 - 잇꽃 FATB-3.
서열번호 46 - 잇꽃 FAD6을 암호화하는 cDNA.
서열번호 47 - 잇꽃 FAD6을 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 48 - 잇꽃 FAD6.
서열번호 49 - RNA 침묵화 구조에 사용된 CtFAD2-2 서열.
서열번호 50 - RNA 침묵화 구조에 사용된 CtFATB-3 서열.
서열번호 51 - RNA 침묵화 구조에 사용된 CtFAD6 서열.
서열번호 52 - 아라비도프시스 탈리아나 올레오신 프로모터.
서열번호 53 - 아마 리닌 프로모터.
서열번호 54 - Nos 폴리아데닐화 신호.
서열번호 55 - Ocs 폴리아데닐화 신호.
서열번호 56 - ol 대립유전자의 영역에 상응하는 야생형 CtFAD2-1 서열.
서열번호 57 - 틀이동(S-317, CW99-OL 및 LeSaf496의 경우와 동일)을 갖는 ol 대립유전자 CtFAD2-1 서열.
서열번호 58 내지 158 - 올리고뉴클레오티드 프라이머들.
서열번호 159 내지 169 - CtFAD2 효소의 동기들.
서열번호 170 - 야생형 잇꽃 품종 SU CtFAD2-1 5'UTR 인트론.
서열번호 171 - 고 올레산 잇꽃 품종 S-317 CtFAD2-1 5'UTR 인트론.

일반적인 기법 및 정의

달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 본 발명에 사용되는 모든 과학기술 용어들은 당해 분야(예를 들어 세포 배양, 분자 유전학, 면역학, 면역조직화학, 단백질 화학, 및 생화학)의 통상적인 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는 것으로 간주될 것이다.

달리 나타내지 않는 한, 본 발명에 사용되는 재조합 단백질, 세포 배양, 및 면역학적 기법은 당해 분야의 당업자들에게 널리 알려진 표준 과정이다. 상기와 같은 기법은 하기와 같은 출처들에서 문헌 전체를 통해 개시되고 설명된다: J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), TA Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), DM Glover and BD Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and FM Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), 및 JE Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (현재까지의 모든 업데이트물들 포함).

"및/또는", 예를 들어 "X 및/또는 Y"란 용어는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y"를 의미하는 것으로 이해될 것이며 이들 둘 다의 의미 또는 어느 한 의미에 대한 명백한 지지를 제공하는 것으로 간주될 것이다.

본 발명에 사용된 바와 같이, 약이란 용어는, 달리 언급되지 않는 한, 지시된 값의 +/-10%, 보다 바람직하게 +/-5%, 보다 바람직하게 +/-4%, 보다 바람직하게 +/-3%, 보다 바람직하게 +/-2%, 보다 바람직하게 +/-1.5%, 보다 바람직하게 +/-1%, 훨씬 더 바람직하게 +/-0.5%를 지칭한다.

본 명세서 전체를 통해서 "~들을 포함하다"란 단어, 또는 "~를 포함한다" 또는 "~를 포함하고 있는"과 같은 변형어들은 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹을 포함함을 의미하지만, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹을 제외하는 것은 아니다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "추출된 지질"이란 용어는 적어도 60%(w/w)의 지질을 포함하고, 예를 들어 트랜스제닉 유기체 또는 그의 일부분으로부터 파쇄에 의해 추출된 지질 조성물을 지칭한다. 더욱 또한, 본 발명에 사용된 바와 같이, "추출된 오일"이란 용어는 적어도 60%(w/w)의 오일을 포함하고 트랜스제닉 유기체 또는 그의 일부분으로부터 추출된 오일 조성물을 지칭한다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "정제된"이란 용어는 본 발명의 지질 또는 오일과 관련하여 사용될 때 전형적으로 추출된 지질 또는 오일에 상기 지질/오일 성분의 순도를 증가시키는 하나 이상의 가공처리 단계들이 가해진 것을 의미한다. 예를 들어, 정제 단계는 추출된 오일의 정련, 탈취, 탈색, 건조 및/또는 분별로 이루어진 그룹의 하나 이상 또는 전부를 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명에 사용된 바와 같이, "정제된"이란 용어는 총 지방산 함량의 백분율로서 올레산 함량을 증가시키기 위해 본 발명의 지질 또는 오일의 지방산 조성을 변경시키는 트랜스에스테르화 공정 또는 다른 공정은 포함하지 않는다. 즉, 상기 정제된 지질 또는 오일의 지방산 조성은 정제되지 않은 지질 또는 오일의 경우와 필수적으로 동일하다. 추출된 지질 또는 오일의 지방산 조성, 예를 들어 올레산, 리놀레산 및 팔미트산 함량은 상기 지질 또는 오일이 수득되는 식물 종자에서 상기 지질 또는 오일의 지방산 조성과 필수적으로 동일하다. 이와 관련하여, "필수적으로 동일한"은 +/-1%, 또는 바람직하게는 +/-0.5%를 의미한다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "올레산 불포화 비율" 또는 "ODP"란 용어는 올레산, 리놀레산 및 α-리놀렌산의 상대적인 양(각각 백분율로서 나타냄)의 합에 의해, 상기 지질 지방산 조성물의 백분율로서 나타낸 리놀레산 및 α-리놀렌산의 상대적인 양을 나눔을 수반하는 계산을 지칭한다. 상기 식은 다음과 같다:

ODP = (리놀레산% + α-리놀렌산%)/(올레산% + 리놀레산% + α-리놀렌산%)

예를 들어, 실시예 15의 TG603.12(5)는 2.15%의 총 리놀레산 및 α-리놀렌산 함량 및 93.88%의 리놀레산, α-리놀렌산 올레산 함량을 갖고 ODP 0.0229를 만든다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "팔미트산-리놀레산-올레산 값" 또는 "PLO"는 백분율로서 나타낸 올레산의 상대적인 양으로, 상기 지질 지방산 조성물의 백분율로서 나타낸 리놀레산 및 팔미트산의 상대적인 양을 나누는 것을 수반하는 계산을 지칭한다. 상기 식은 다음과 같다:

PLO = (팔미트산% + 리놀레산%)/올레산%

예를 들어, 실시예 15의 TG603.12(5)는 4.71%의 총 리놀레산 및 팔미트산 함량 및 91.73%의 올레산 함량을 갖고 PLO 0.0513을 만든다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "올레산 일가불포화 비율" 또는 "OMP"란 용어는 백분율로서 나타낸 올레산의 상대적인 양으로, 상기 지질 지방산 조성물의 백분율로서 나타낸 비-올레산 일가불포화된 지방산의 상대적인 양을 나누는 것을 수반하는 계산을 지칭한다. 상기 식은 다음과 같다:

OMP = (일가불포화된 지방산% - 올레산%)/올레산%

예를 들어, 실시예 15의 TG603.12(5)는 1.13%의 올레산을 제외한 총 일가불포화된 지방산 함량(0.84% C18:1Δ11 + 0.29% C20:1) 및 91.73%의 올레산 함량을 갖고 OMP 0.0123을 만든다.

"상응하는"이란 용어는 본 발명의 세포 또는 식물 또는 그의 일부분(종자)과 동일하거나 유사한 유전자 배경을 갖지만 본 발명에 개시된 바와 같이 변형되지는 않은(예를 들어 상기 세포, 또는 식물 또는 그의 일부분에 본 발명의 외인성 폴리뉴클레오티드가 없음) 세포, 또는 식물 또는 그의 일부분을 지칭한다. 상응하는 세포, 또는 식물 또는 그의 일부분(종자)을, 예를 들어 본 발명에 개시된 바와 같이 변형된 세포, 또는 식물 또는 그의 일부분(종자)과, 예를 들어 생성되는 올레산의 양, FAD2 활성, FATB 활성 또는 FAD6 활성의 하나 이상을 비교하기 위한 대조군으로서 사용할 수 있다. 당해 분야의 당업자는 상기와 같은 비교를 위해 적합한 "상응하는" 세포, 식물 또는 그의 일부분(종자)을 쉽게 결정할 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "종자오일"이란 용어는 60%(w/w) 이상의 지질을 포함하는 식물의 종자로부터 수득되거나, 또는 상기 종자오일이 종자 중에 여전히 존재하는 경우 상기 종자로부터 수득할 수 있는 조성물을 지칭한다. 즉, 본 발명의 종자오일, 또는 본 발명을 사용하여 수득되는 종자오일은, "추출된 종자오일"로서 또는 유사한 용어(이 경우 상기는 상기 종자로부터 추출된 오일임)로서 지칭되지 않는 한, 상기 종자 또는 그의 일부분, 예를 들어 떡잎 또는 배 중에 존재하는 종자오일을 포함한다. 상기 종자오일은 바람직하게는 추출된 종자오일이다. 종자오일은 전형적으로 실온에서 액체이다. 바람직하게, 상기 종자오일 중의 총 지방산(TFA) 함량은 >70% C18 지방산, 바람직하게는 >90% 올레산(C18:1Δ9)이다. 상기 지방산은 전형적으로는 예를 들어 TAG, DAG, 아실-CoA 또는 인지질과 같은 에스테르화된 형태로 존재한다. 달리 언급되지 않는 한, 상기 지방산은 유리 지방산 및/도는 에스테르화된 형태일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 종자오일 중의 지방산의 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 91%, 보다 바람직하게는 적어도 92%, 보다 바람직하게는 적어도 93%, 보다 바람직하게는 적어도 94%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 96%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99%가 TAG로서 발견될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 종자오일은 하나 이상의 다른 지질, 핵산, 폴리펩티드, 또는 상기 종자 또는 조 추출물 중에 연결된 다른 오염 분자들로부터 분리된 "실질적으로 정제되거나" 또는 "정제된" 오일이다. 상기 실질적으로 정제된 종자오일은 상기 종자 또는 추출물 중에 연결된 다른 성분들이 적어도 60% 없고, 보다 바람직하게는 적어도 75% 없고, 보다 바람직하게는 적어도 90% 없는 것이 바람직하다. 본 발명의 종자오일은 비-지방산 분자, 예를 들어 이로 제한되지 않지만, 스테롤을 추가로 포함할 수 있다(실시예 17 참조). 하나의 실시태양에서, 상기 종자오일은 잇꽃 오일(카르타무스 팅크토리우스( Carthamus tinctorius )), 해바라기 오일(헬리안투스 안누스( Helianthus annus )), 면실유(고시피움 히르수툼( Gossypium hirsutum )), 아주까리 오일(리시누스 코뮤니스( Ricinus communis )), 카놀라 오일(브라시카 나푸스( Brassica napus ), 브라시카 라파 스페시즈( Brassica rapa ssp. )), 머스터드 오일(브라시카 준세아( Brassica juncea )), 다른 배추속 오일(예를 들어, 브라시카 나포브라시카( Brassica napobrassica ), 브라시카 카멜리나(Brassica camelina)), 린종자 오일(리늄 유시타티시뮴( Linum usitatissimum )), 대두 오일(글리시네 맥스( Glycine max )), 옥수수 오일(제아 메이스( Zea mays )), 담배 오일(니코티아나 타바쿰( Nicotiana tabacum )), 땅콩 오일((아라키스 히포가에아( Arachis hypogaea )), 팜 오일(엘라에이스 귀닌시스( Elaeis guineens is )), 코코넛 오일(코코스 누시페라(Cocos nucifera)), 아보카도 오일(페르세아 아메리카나( Persea americana )), 올리브 오일(올레아 유로파에아(Olea europaea)), 캐슈 오일(아나카르디움 옥시덴탈레( Anacardium occidentale )), 마카다미아 오일(마카다미아 인테르그리폴리아( Macadamia intergrifolia )), 아몬드 오일(프루누스 아미그달루스( Prunus amygdalus )), 오트종자 오일(아베나 사티바( Avena sativa )), 라이스 오일(오리자 사티바( Oryza sativa ) 또는 오리자 글라베리마( Oryza glaberrima )), 카멜리나 오일(카멜리나 사티바( Camelina sativa )), 크람베 오일(크람베 아비시니카( Crambe abyssinica )) 또는 아라비도프시스 종자오일(아라비도프시스 탈리아나)이다. 종자오일을 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 종자로부터 추출할 수 있다. 이는 전형적으로, 상기 종자의 첫 번째 파쇄 또는 롤링과 일반적으로 관련된 비극성 용매, 예를 들어 헥산, 다이에틸 에테르, 석유 에테르, 클로로폼/메탄올 또는 부탄올 혼합물에 의한 추출을 수반한다. 상기 곡식 중 전분과 연결된 지질을 수-포화된 부탄올로 추출할 수 있다. 상기 종자오일을 당해 분야에 공지된 방법에 의해 "정련"하여 폴리사카라이드 및/또는 인지질을 제거하거나 또는 다른 방식으로 처리하여 오염물질을 제거하거나 순도, 안정성 또는 색상을 개선시킬 수 있다. 상기 종자오일 중 TAG 및 다른 에스테르를, 예를 들어 산 또는 알칼리 처리에 의해 또는 리파제의 작용에 의해 가수분해시켜 유리 지방산을 방출시키거나, 또는 상기 종자오일을 수소화시키거나, 당해 분야에 공지된 바와 같이 화학적으로 또는 효소에 의해 처리할 수 있다. 그러나, 일단 상기 종자오일이 더 이상 TAG를 포함하지 않도록 가공처리되면, 상기는 더 이상 본 발명에 언급된 바와 같은 종자오일로 간주되지 않는다.

상기 정제된 및/또는 추출된 지질 또는 오일 중 유리 및 에스테르화된 스테롤(예를 들어 시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, Δ5-아베나스테롤, 시토스타놀, 캄페스타놀, 및 콜레스테롤) 농도는 문헌[Phillips et al.(2002)]에 개시된 바와 같고/같거나 실시예 17에 제공된 바와 같을 수 있다. 식물 오일 중 스테롤은 스테롤의 유리 알콜, 지방산과의 에스테르(에스테르화된 스테롤), 글리코사이드 및 아실화된 글리코사이드로서 존재한다. 천연 식물성 오일(종자오일) 중의 스테롤 농도는 최대 약 1100 ㎎/100 g 이하의 범위이다. 수소화된 팜 오일은 약 60 ㎎/100 g의, 천연 식물성 오일의 최저 농도들 중 하나를 갖는다. 본 발명의 회수되거나 추출된 종자오일은 약 100 내지 약 1000 ㎎의 총 스테롤/오일 100 g을 갖는다. 식품 또는 사료로서 사용하기 위해서, 스테롤은 주로 글리코실화된 형태보다는 유리 또는 에스테르화된 형태인 것이 바람직하다. 본 발명의 종자오일에서, 상기 에스테르화된 스테롤의 약 25%를 갖는 대두 종자오일을 제외하고, 바람직하게는 상기 오일 중 상기 스테롤의 적어도 50%가 에스테르화된 스테롤로서 존재한다. 본 발명의 잇꽃 종자오일은 바람직하게는 약 150 내지 약 400 ㎎ 총 스테롤/100 g, 전형적으로 약 300 ㎎ 총 스테롤/100 g의 종자오일을 가지며, 이때 시토스테롤이 주 스테롤이다. 본 발명의 카놀라 종자오일 및 평지씨 오일은 바람직하게는 약 500 내지 약 800 ㎎ 총 스테롤/100 g을 가지며, 이때 시토스테롤이 주 스테롤이고 캄페스테롤이 다음으로 풍부하다. 본 발명의 옥수수 종자오일은 바람직하게는 약 600 내지 약 800 ㎎ 총 스테롤/100 g을 가지며, 이때 시토스테롤이 주 스테롤이다. 본 발명의 대두 종자오일은 바람직하게는 약 150 내지 약 350 ㎎ 총 스테롤/100 g을 가지며, 이때 시토스테롤이 주 스테롤이고 스티그마스테롤이 다음으로 풍부하며, 유리 스테롤이 에스테르화된 스테롤보다 많다. 본 발명의 면실유는 바람직하게는 약 200 내지 약 350 ㎎ 총 스테롤/100 g을 가지며, 이때 시토스테롤이 주 스테롤이다. 본 발명의 코코넛 오일 및 팜 오일은 바람직하게는 약 50 내지 약 100 ㎎ 총 스테롤/100 g을 가지며, 이때 시토스테롤이 주 스테롤이다. 본 발명의 땅콩 종자오일은 바람직하게는 약 100 내지 약 200 ㎎ 총 스테롤/100 g을 가지며, 이때 시토스테롤이 주 스테롤이다. 본 발명의 참깨 종자오일은 바람직하게는 약 400 내지 약 600 ㎎ 총 스테롤/100 g을 가지며, 이때 시토스테롤이 주 스테롤이다. 본 발명의 해바라기 종자오일은 바람직하게는 약 200 내지 400 ㎎ 총 스테롤/100 g을 가지며, 이때 시토스테롤이 주 스테롤이다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "지방산"이란 용어는 포화되거나 불포화된, 적어도 8 개의 탄소 원자 길이의 긴 지방족 꼬리를 갖는 카복실산을 지칭한다. 전형적으로, 지방산은 적어도 12 개의 탄소 원자 길이의 탄소-탄소 연결된 쇄를 갖는다. 대일부분의 천연 지방산은 그의 생합성이 2 개의 탄소 원자를 갖는 아세테이트를 수반하므로 짝수의 탄소 원자를 갖는다. 상기 지방산은 유리 상태(비-에스테르화된)이거나 또는 에스테르화된 형태, 예를 들어 TAG, DAG, MAG, 아실-CoA(티오-에스테르) 연결된, 또는 다른 공유적으로 연결된 형태로 존재할 수 있다. 에스테르화된 형태로 공유적으로 연결되는 경우, 상기 지방산을 본 발명에서는 "아실"기라 칭한다. 상기 지방산은 인지질, 예를 들어 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 또는 다이포스파티딜글리세롤로서 에스테르화될 수 있다. 포화 지방산은 상기 쇄를 따라 어떠한 이중 연결이나 다른 작용기들도 함유하지 않는다. "포화"란 용어는 모든 탄소(카복실산[-COOH] 기와 별개로)가 가능한 한 많은 수소를 함유한다는 점에서 수소를 지칭한다. 즉, 오메가(ω) 단부가 3 개의 수소(CH3-)를 함유하고, 쇄 내의 각각의 탄소가 2 개의 수소(-CH2-)를 함유한다. 불포화 지방산은 포화 지방산과 유사한 형태를 가지나, 단 하나 이상의 알켄 작용기가 상기 쇄를 따라 존재하며, 이때 각각의 알켄은 상기 쇄의 단일-연결된 "-CH2-CH2-" 일부분이 이중으로-연결된 "-CH=CH-" 일부분(즉, 또 다른 탄소에 이중 연결된 탄소)으로 치환된다. 상기 이중 연결의 어느 한쪽에 연결되는 상기 쇄 중의 2 개의 다음 탄소 원자들은 시스 또는 트랜스 형태로 존재할 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "다가불포화 지방산" 또는 "PUFA"란 용어는 탄소쇄 중에 적어도 12 개의 탄소 원자 및 적어도 2 개의 알켄기(탄소-탄소 이중 연결)를 포함하는 지방산을 지칭한다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "일가불포화 지방산"이란 용어는 아실쇄 중에 하나의 이중 연결을 갖는 지방산, 예를 들어 올레산(C18:1Δ9), C18:1D11 및 C20:1을 지칭한다.

"트라이아실글리세라이드" 또는 "TAG"는 글리세롤이 3 개의 지방산으로 에스테르화된 글리세라이드이다. TAG 합성의 케네디 경로에서, DAG가 상술한 바와 같이 형성되고, 이어서 세 번째 아실기가 DGAT의 활성에 의해 글리세롤 주쇄에 에스테르화된다. TAG의 형성에 대한 또 다른 경로는 효소 PDAT에 의해 촉매화되는 것 및 MGAT 경로(PCT/AU2011/000794)를 포함한다.

"다이아실글리세라이드" 또는 "DAG"는 글리세롤이 2 개의 지방산으로 에스테르화된 글리세라이드이다. 본 발명에 사용된 바와 같이, DAG는 sn-1,3 또는 sn-1,2/2,3 위치에 하이드록실기를 포함하고, 따라서 DAG는 인산화된 분자, 예를 들어 PA 또는 PC를 포함하지 않는다. 따라서 DAG는 세포 중 중성 지질의 성분이다. DAG 합성의 케네디 경로에서, 전구체 sn-글리세롤-3-포스페이트(G-3-P)는, sn-1 위치에서 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(GAPT)에 의해 촉매화되는 제1 반응에서, 2 개의 아실기(이들은 각각 지방산 조효소 A 에스테르로부터 나온다)에 에스테르화되어 리소PA를 형성한 다음, sn-2 위치에서 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제(LPAAT)에 의해 촉매화되는 제2 아실화에 의해 포스파티드산(PA)을 형성한다. 이어서 상기 중간체는 탈인산화되어 DAG를 형성한다. 또 다른 동화작용 경로에서, DAG는 MGAT에 의해 촉매화되는, sn-1 MAG 또는 바람직하게는 sn-2 MAG의 아실화에 의해 형성될 수도 있다. DAG는 또한 리파제에 의한 아실기의 제거에 의해서 TAG로부터, 또는 필수적으로 효소 CPT, PDCT 및 PLC 중 어느 하나에 의한 콜린 헤드그룹의 제거에 의해 PC로부터 형성될 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "불포화효소"란 용어는 전형적으로 에스테르화된 형태, 예를 들어 지방산 CoA 에스테르인 지방산 기질의 아실기에 탄소-탄소 이중 연결을 도입시킬 수 있는 효소를 지칭한다. 상기 아실기는 인지질, 예를 들어 포스파티딜콜린(PC)에, 또는 아실 담체 단백질(ACP), CoA, 또는 바람직하게는 PC에 에스테르화될 수도 있다. 불포화효소는 일반적으로 3 개의 그룹으로 상응하게 분류될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 불포화효소는 전면-단부 불포화효소이다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "Δ12 불포화효소" 및 "FAD2"는 올레산(18:1 ^Δ9 )을 리놀레산(C18:2 ^Δ9,12 )으로 전환시키는 불포화효소 반응을 수행하는 막 연결된 Δ12 지방산 불포화효소를 지칭한다. 따라서 "Δ12 불포화효소 활성"이란 용어는 올레산을 리놀레산으로 전환시킴을 지칭한다. 이들 지방산은 에스테르화된 형태, 예를 들어 인지질의 일부분으로서, 바람직하게는 PC의 형태로 존재할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명에 정의된 바와 같은 FAD2 효소는 3 개의 히스티딘-풍부 동기(His 상자)를 포함한다(예를 들어 본 발명의 효소의 His 상자에 대해서 표 5를 참조한다). 상기와 같은 His-풍부 동기는 FAD2 효소에서 고도로 보존되며 생화학적 촉매반응에 사용되는 이철-산소 착체의 형성에 관련되었다(Shanklin et al., 1998).

본 발명에 사용된 바와 같이, "FAD2-1" 및 "CtFAD2-1"이란 용어 및 이들의 변형어들은 서열번호 27로서 제공된 아미노산 서열을 갖는 잇꽃 FAD2 폴리펩티드, 예를 들어 서열번호 12로서 제공된 서열을 갖는 뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 지칭한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, FAD2-1 유전자는 상기와 같은 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 또는 그의 돌연변이 대립유전자이다. 이들 용어는 또한 천연으로 또는 인공적으로 유도되거나 생성된 제공된 서열들의 변이체를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 FAD2-1은 서열번호 27로서 제공된 서열에 적어도 95% 동일하고, 보다 바람직하게는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. CtFAD2-1 유전자는 돌연변이체, 즉 변경된 불포화효소 활성, 예를 들어 감소된 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하거나, 또는 작용성 폴리펩티드(삭제 대립유전자)를 암호화하지 않는 대립유전자를 포함한다. 상기와 같은 대립유전자는 천연이거나 또는 인공 돌연변이에 의해 유도될 수 있다. 상기와 같은 대립유전자의 일례는 본 발명에 개시된 FAD2-1 ol 대립유전자이다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "FAD2-2" 및 "CtFAD2-2"란 용어 및 이들의 변형어는 서열번호 28로서 제공된 아미노산 서열을 갖는 잇꽃 FAD2 폴리펩티드, 예를 들어 서열번호 13으로서 제공된 서열을 갖는 뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 지칭한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, FAD2-2 유전자는 상기와 같은 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 또는 그의 돌연변이 대립유전자이다. 이들 용어는 또한 천연으로 또는 인공적으로 유도되거나 생성된 제공된 서열들의 변이체를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 FAD2-2는 서열번호 28로서 제공된 서열에 적어도 95% 동일하고, 보다 바람직하게는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. CtFAD2-2 유전자는 돌연변이체, 즉 변경된 불포화효소 활성, 예를 들어 감소된 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하거나, 또는 작용성 폴리펩티드(삭제 대립유전자)를 암호화하지 않는 대립유전자를 포함한다. 상기와 같은 대립유전자는 천연이거나 또는 인공 돌연변이에 의해 유도될 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "FAD2-10" 및 "CtFAD2-10"이란 용어 및 이들의 변형은 서열번호 36으로서 제공된 아미노산 서열을 갖는 잇꽃 FAD2 폴리펩티드, 예를 들어 서열번호 21로서 제공된 서열을 갖는 뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 지칭한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, FAD2-10 유전자는 상기와 같은 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 또는 그의 돌연변이 대립유전자이다. 이들 용어는 또한 천연으로 또는 인공적으로 유도되거나 생성된 제공된 서열들의 변이체를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 FAD2-10은 서열번호 36으로서 제공된 서열에 적어도 95% 동일하고, 보다 바람직하게는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. CtFAD2-10 유전자는 돌연변이체, 즉 변경된 불포화효소 활성, 예를 들어 감소된 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하거나, 또는 작용성 폴리펩티드(삭제 대립유전자)를 암호화하지 않는 대립유전자를 포함한다. 상기와 같은 대립유전자는 천연이거나 또는 인공 돌연변이에 의해 유도될 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "팔미토일-ACP 티오에스테라제" 및 "FATB"란 용어는 팔미토일-ACP를 가수분해시켜 유리 팔미트산을 생성시키는 단백질을 지칭한다. 따라서, "팔미토일-ACP 티오에스테라제 활성"이란 용어는 유리 팔미트산을 생성시키는 팔미토일-ACP의 가수분해를 지칭한다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "FATB-3" 및 "CtFATB-3"이란 용어 및 이들의 변형은 서열번호 45로서 제공된 아미노산 서열을 갖는 잇꽃 FATB 폴리펩티드, 예를 들어 서열번호 43으로서 제공된 서열을 갖는 뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 지칭한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, FATB-3 유전자는 상기와 같은 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 또는 그의 돌연변이 대립유전자이다. 이들 용어는 또한 천연으로 또는 인공적으로 유도되거나 생성된 제공된 서열들의 변이체를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 FATB-3은 서열번호 45로서 제공된 서열에 적어도 95% 동일하고, 보다 바람직하게는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. CtFATB-3 유전자는 돌연변이체, 즉 변경된 팔미토일-ACP 티오에스테라제 활성, 예를 들어 감소된 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하거나, 또는 작용성 폴리펩티드(삭제 대립유전자)를 암호화하지 않는 대립유전자를 포함한다. 상기와 같은 대립유전자는 천연이거나 또는 인공 돌연변이에 의해 유도될 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "색소체성 ω6 지방산 불포화효소", 그의 변형, 및 "FAD6"는 포스파티딜 글리세롤, 모노갈락토실다이아실글리세롤, 다이갈락토실-다이아실글리세롤, 및 설포귀노보실다이아실글리세롤을 포함한 모든 16:1- 또는 18:1-함유 엽록체 막 지질상에서 16:1 및 18:1 지방산을 각각 16:2 및 18:2로 불포화시키는 엽록체 효소를 지칭한다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "FAD6" 및 "CtFAD6"란 용어 및 이들의 변형은 서열번호 48로서 제공된 아미노산 서열을 갖는 잇꽃 FAD6 폴리펩티드, 예를 들어 서열번호 47로서 제공된 서열을 갖는 뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 지칭한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, FAD6 유전자는 상기와 같은 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 또는 그의 돌연변이 대립유전자이다. 이들 용어는 또한 천연으로 또는 인공적으로 유도되거나 생성된 제공된 서열들의 변이체를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 FAD6는 서열번호 48로서 제공된 서열에 적어도 95% 동일하고, 보다 바람직하게는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. CtFAD6 유전자는 돌연변이체, 즉 변경된 불포화효소 활성, 예를 들어 감소된 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하거나, 또는 작용성 폴리펩티드(삭제 대립유전자)를 암호화하지 않는 대립유전자를 포함한다. 상기와 같은 대립유전자는 천연이거나 또는 인공 돌연변이에 의해 유도될 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "아세틸레나제" 또는 "지방산 아세틸레나제"란 용어는 지방산에 삼중 연결을 도입시켜 아세틸렌계 지방산을 생성시키는 효소를 지칭한다.

"Ct"란 용어는 효소/유전자가 잇꽃으로부터의 것임을 가리키기 위해 본 발명에서 FAD2, FATB 및 FAD6와 같은 용어 앞에 사용된다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "~의 발현을 감소시킬 수 있는 침묵화 RNA"란 용어 및 그의 변형어는 생산 및/또는 활성(예를 들어 siRNA, hpRNAi를 암호화하는)을 감소(하향-조절)시키거나, 또는 자신이 내인성 효소, 예를 들어 Δ12 불포화효소, 팔미토일-ACP 티오에스테라제, 색소체성 ω6 지방산 불포화효소, 또는 이들 중 2 개 이상 또는 3 개 전부의 조합의 생산 및/또는 활성을 하향 조절하는(예를 들어 세포로 직접 전달될 수 있는 siRNA인) RNA 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 상기 침묵화 RNA는, 세포에서 트랜스유전자로부터 생산되며, 예를 들어 상기 내인성 효소를 암호화하는 mRNA의 양을 감소시키거나 그의 번역을 감소시킴으로써 세포에서 생산된 내인성 효소의 양을 전사에 의해서 및/또는 전사-후에 감소시키는 외인성 RNA이다. 상기 침묵화 RNA는 전형적으로는, 상기 내인성 mRNA에 상보성이고 상기 세포에서 RISC로서 공지된 침묵화 복합체와 연결될 수도 있는 21 내지 24 뉴클레오티드 길이의 RNA이다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "돌연변이(들)가 활성을 감소시킨다"란 용어는 표현형적으로 정상적인 종자(예를 들어 서열번호 27, 28 및 36으로서 제공된 아미노산 서열을 포함하는 FAD2 효소를 생산하는 종자)와 비교시 더 낮은 수준의 한정된 효소 활성(예를 들어 종자 중 FAD2 효소 활성)을 갖는 천연 또는 인공 돌연변이(예를 들어 화학적 돌연변이 또는 부위-특이적 돌연변이에 의해 생성된)를 지칭한다. 표현형적으로 정상적인 잇꽃 품종의 예는 이로 제한되지 않지만, 센테니얼, 핀치, 뉴트라새프 및 카디날을 포함한다. 인도로부터 잇꽃 도입시 발견된, 잇꽃에서 최초로 확인된 고 올레산 특징은 단일 자리 OL에서 ol 로 표시되는 일부분 열성 대립유전자에 의해 억제되었다(Knowles and Hill, 1964). 본 발명에 개시된 바와 같이, 상기 OL 자리는 CtFAD2-1 유전자에 상응한다. olol 유전자형 중 종자오일의 올레산 함량은 온실재배된 식물의 경우 대개 71 내지 75%였다(Knowles, 1989). 노울스(Knowles)(1968)는 상기 ol 대립유전자를 잇꽃 재배 프로그램에 통합시켰고 미국에서 1966년 고 올레산(HO) 잇꽃 품종 "UC-1"을 출하하였으며, 이어서 개량된 품종 "올레익 리드" 및 새폴라(Saffola) 317(S-317), S-517 및 S-518을 포함한 새폴라 시리즈를 출하하였다. 상기 고 올레산( olol ) 유전자형은 필드에서 상이한 온도에서 재배시 올레산 수준이 비교적 안정하였다(Bartholomew, 1971). 또한, 노울스(1972)는 동형접합성 조건에서 35 내지 50% 올레산을 생성시키는, 동일한 자리의 상이한 대립유전자 ol ₁ 을 또한 개시하였다. olol 유전자형과 대조적으로, ol ₁ ol ₁ 유전자형은 온도에 강한 반응을 나타내었다(Knowles, 1972). 본 발명에서 측정된 바와 같이, 잇꽃 종자에서 감소된 FAD2-1 활성(및 전체적인 FAD2 활성)을 부여하는 ol 돌연변이의 대립유전자는 도 6에 도시된 틀이동 돌연변이(단일 뉴클레오티드의 결실로 인한)를 포함하는 돌연변이 FAD2-1 유전자이다(또한 실시예 7 및 서열번호 26 및 38 참조).

본 발명에 사용된 바와 같이, "포함하는 오일 함량을 갖는 종자를 생산하는 식물을 생산할 수 있는" 또는 "오일 함량을 갖는 유지종자를 생산하는 식물을 생산할 수 있는"이란 어구 또는 이들의 변형어는 종자로부터 생산된 식물, 바람직하게는 유지종자 식물 및 보다 바람직하게는 잇꽃 식물이 최적의 조건, 예를 들어 온실 조건, 예를 들어 실시예들에서 언급된 조건들 하에서 재배시 한정된 성분을 갖는 오일을 생산하는 능력을 가짐을 의미한다. 식물로부터 종자의 가공처리시, 적합한 온실 조건 하에서 상기 종자 중 적어도 하나로부터 자손 식물을 성장시키고 본 발명에 개시된 것들과 같은 표준 과정을 사용하여 상기 자손 식물로부터 종자오일 중 오일 함량 및 지방산 조성을 시험하는 것이 통상적이다. 따라서, 당업자가 이해하는 바와 같이 필드에서 재배된 종자는 특정한 해의 불리한 조건, 예를 들어 열, 저온, 가뭄, 홍수, 서리, 해충 스트레스 등으로 인해 본 발명에서 정의된 요건들을 모두 충족시킬 수 없지만, 그럼에도 불구하고 상기 종자는 보다 유리한 조건 하에서 재배시 한정된 오일 함량 또는 지방산 조성을 생산하는 자손 식물을 생산할 수 있기 때문에 상기와 같은 종자는 본 발명에 의해 포함된다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "중량 당"이란 용어는 물질(예를 들어 올레산, 팔미트산 또는 PUFA, 예를 들어 리놀레산 또는 리놀렌산)의, 상기 물질을 포함하는 조성물 또는 상기 조성물 중의 성분의 중량의 백분율로서 상기 물질의 중량을 지칭한다. 예를 들어, 특정 지방산, 예를 들어 올레산의 중량을 상기 지질 또는 종자 오일, 또는 종자의 총 지방산 함량의 중량의 백분율로서 측정할 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "생물연료"란 용어는 에너지가 화석 연료로부터라기보다는 생물학적 탄소 고정으로부터 유래되는, 전형적으로 자동차, 트럭 또는 석유 동력 모터와 같은 동력 기계류에 사용되는 바와 같은 임의의 유형의 연료를 지칭한다. 생물연료는 바이오매스 전환으로부터의 연료뿐만 아니라 고체 바이오매스, 액체 연료 및 바이오가스를 포함한다. 생물연료의 예는 바이오알콜, 바이오디젤, 합성 디젤, 식물성 오일, 바이오에테르, 바이오가스, 신가스, 고체 바이오연료, 조류-유래된 연료, 바이오수소, 바이오메탄올, 2,5-다이메틸퓨란(DMF), 바이오다이메틸 에테르(bioDME), 피셔-트로프쉬 디젤, 바이오수소 디젤, 혼합된 알콜 및 목재 디젤을 포함한다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "공업용 제품"이란 용어는 탄소 및 수소로 우세하게 제조된 탄화수소 생성물, 예를 들어 지방산 메틸- 및/또는 에틸-에스테르 또는 알칸, 예를 들어 메탄, 주변 온도에서 전형적으로 액체인 장쇄 알칸의 혼합물, 생물연료, 일산화 탄소 및/또는 수소, 또는 바이오알콜, 예를 들어 에탄올, 프로판올, 또는 부탄올, 또는 바이오목탄을 지칭한다. "공업용 제품"이란 용어는 다른 공업용 제품으로 전환될 수 있는 중간 생성물들을 포함하고자 한다, 예를 들어 신가스는 자체가, 또한 공업용 제품인 것으로 간주되는 탄화수소 생성물을 합성하는데 사용될 수 있는 공업용 제품인 것으로 간주된다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 공업용 제품이란 용어는 상기 화합물들의 순수한 형태, 또는 보다 통상적으로 다양한 화합물들 및 성분들의 혼합물 모두를 포함한다, 예를 들어 상기 탄화수소 생성물은 당해 분야에서 잘 이해되는 바와 같이, 일련의 탄소쇄 길이를 함유할 수 있다.

폴리뉴클레오티드

"폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"이란 용어들은 호환적으로 사용된다. 이들은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체성 형태, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 지칭한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 게놈, cDNA, 반합성, 또는 합성 기원, 이중가닥 또는 단일 가닥의 것일 수 있으며, 그의 기원 또는 조작에 의해 (1) 자연에서는 연결된 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 연결되지 않거나, (2) 자연에서 연결된 것외의 폴리뉴클레오티드에 연결되거나, 또는 (3) 자연에서 존재하지 않는다. 하기는 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 암호화 또는 비-암호화 영역, 연결 분석으로부터 정의된 자리들(자리), 엑손, 인트론, 전령 RNA(mRNA), 전달 RNA(tRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 임의의 서열의 키메릭 DNA, 핵산 탐침 및 프라이머. 본 발명의 바람직한 폴리뉴클레오티드는 식물 세포에서 전사될 수 있는 이중가닥 DNA 분자 및 침묵화 RNA 분자를 포함한다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "유전자"란 용어는 그의 가장 넓은 의미로 해석되어야 하며 전사된 영역, 및 번역된 경우, 구조 유전자의 단백질 암호화 영역을 포함하고 어느 한 단부에, 적어도 약 2 kb의 거리로 5' 및 3' 단부 모두상의 암호화 영역에 인접하여 위치한 서열을 포함하며 상기 유전자의 발현에 관련되는 데옥시리보뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이에 관하여, 상기 유전자는 주어진 유전자와 자연적으로 관련된 조절 신호, 예를 들어 프로모터, 인헨서, 종결 및/또는 폴리아데닐화 신호, 또는 이종 조절 신호(이 경우에, 상기 유전자를 "키메릭 유전자"라 칭함)를 포함한다. 상기 단백질 암호화 영역의 5'에 위치하고 mRNA상에 존재하는 서열을 5' 비-번역 서열이라 칭한다. 상기 단백질 암호화 영역의 3' 또는 하류에 위치하고 mRNA상에 존재하는 서열을 3' 비-번역 서열이라 칭한다. "유전자"란 용어는 유전자의 cDNA 및 게놈 형태 모두를 포함한다. 유전자의 게놈 형태 또는 클론은 "인트론", "중재 영역" 또는 "중재 서열"이라 칭하는 비-암호화 서열로 중단될 수도 있는 암호화 영역을 함유한다. 인트론은 핵 RNA(nRNA)로 전사되는 유전자의 분절이다. 인트론은 조절 요소, 예를 들어 인헨서를 함유할 수도 있다. 인트론은 핵 또는 1차 전사체로부터 제거되거나 "연접 파괴"된다; 따라서 인트론은 상기 mRNA 전사체에 존재하지 않는다. 상기 mRNA는 번역하는 동안 발생 폴리펩티드 중의 아미노산의 서열 또는 순서를 명시하는 작용을 한다. "유전자"란 용어는 본 발명에 개시된 본 발명의 단백질 전부 또는 그의 일부를 암호화하는 합성 또는 융합 분자 및 상기 중 어느 하나에 대한 상보성 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

"대립유전자"는 세포, 개별적인 식물 또는 집단내의 유전자 서열(예를 들어 유전자)의 한 가지 특이한 형태를 지칭하며, 상기 특이한 형태는 상기 유전자의 서열 내의 적어도 하나, 및 흔히는 하나 이상의 상이한 부위의 서열이 동일한 유전자의 다른 형태들과 상이하다. 상이한 대립유전자들간에 상이한, 이러한 상이한 부위에서의 서열을 "불동일", "다형성" 또는 "돌연변이"라 칭한다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "키메릭 DNA"는 자연에서 자연적으로 발견되지 않는 임의의 DNA를 지칭하며; 또한 본 발명에서 "DNA 구조물"이라 칭한다. 전형적으로, 키메릭 DNA는 자연에서 함께 자연적으로 발견되지 않는 조절 및 전사 또는 단백질 암호화 서열을 포함한다. 따라서, 키메릭 DNA는 상이한 출처로부터 유래되는 조절 서열 및 암호화 서열, 또는 동일한 출처로부터 유래되지만 자연에서 발견되는 것과 상이한 방식으로 배열되는 조절 서열 및 암호화 서열을 포함할 수 있다. 개방 판독 프레임이 그의 천연 상류 및 하류 조절 요소에 연결될 수도, 연결되지 않을 수도 있다. 상기 개방 판독 프레임을, 예를 들어 식물 게놈내에, 비-천연 위치에, 또는 세균 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같이 자연적으로 발견되지 않는 레플리콘 또는 벡터에 통합시킬 수도 있다. "키메릭 DNA"란 용어는 숙주에서 복제될 수 있는 DNA 분자로 제한되지 않고, 예를 들어 특정한 연결 서열에 의해 레플리콘으로 연결될 수 있는 DNA를 포함한다.

"트랜스유전자"는 형질전환 과정에 의해 게놈내로 도입된 유전자이다. 상기 트랜스유전자는 형질전환된 식물 세포로부터 재생에 의해 생산된 초기 형질전환 식물, 또는 자가-수정 또는 초기 형질전환체로부터 교배에 의해 생산된 자손 식물, 또는 종자와 같은 식물 일부분 중에 존재할 수 있다. "유전자 변형된"이란 용어 및 그의 변형들은 유전자를 형질전환 또는 형질도입에 의해 세포에 도입시키거나, 유전자를 세포에서 돌연변이시키고 세포에서 유전자의 조절을 유전적으로 변경 또는 조절하거나, 또는 상술한 바와 같이 변형된 임의의 세포의 자손을 포함한다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "게놈 영역"은 트랜스유전자, 또는 트랜스유전자들의 그룹(또한 본 발명에서 클러스터라 칭함)이 감수분열 후 자손 세포에서 함께 물려지도록, 세포 또는 그의 선조에 삽입된, 게놈내 위치를 지칭한다.

본 발명의 "재조합 폴리뉴클레오티드" 또는 "외인성 폴리뉴클레오티드"는 인공 재조합 방법에 의해 제작되거나 변형된 핵산 분자를 지칭한다. 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 그의 본래의 상태에 비해, 세포 중에 변경된 양으로 존재하거나 또는 변경된 비율(예를 들어 mRNA의 경우에)로 발현될 수 있다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드를 자연적으로 포함하지 않는 세포에 도입된 폴리뉴클레오티드이다. 전형적으로 외인성 DNA는 mRNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되며 이어서 형질전환된 세포내에서 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 아미노산 잔기의 연속 서열로 번역된다. 또 다른 실시태양에서, 상기 외인성 폴리펩티드의 일부분은 상기 세포에 내인성적이며 그의 발현이 재조합 수단에 의해 변경된다, 예를 들어 외인성 조절 서열이 내인성적인 폴리뉴클레오티드의 상류에 도입되어 상기 형질전환된 세포가 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드를 발현할 수 있게 한다. 예를 들어, 외인성 폴리뉴클레오티드는 내인성적인 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 RNA를 발현할 수 있다.

본 발명의 재조합 폴리뉴클레오티드는 존재하는 세포 기재 또는 무세포 발현 시스템의 다른 성분들로부터 분리되지 않은 폴리뉴클레오티드, 및 상기 세포-기재 또는 무세포 시스템에서 생산되고 후속으로 적어도 일부 다른 성분들로부터 정제되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 자연에 존재하는 뉴클레오티드의 연속적인 신장부이거나, 또는 단일 폴리뉴클레오티드를 형성하기 위해 연결된 상이한 출처(천연 및/또는 합성)로부터의 뉴클레오티드의 2 개 이상의 연속적인 신장부를 포함할 수 있다. 전형적으로, 상기와 같은 키메릭 폴리뉴클레오티드는, 목적 세포 중에서 개방 판독 프레임의 전사를 구동하기에 적합한 프로모터에 작동적으로 연결된 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 적어도 포함한다.

상기 정의된 폴리뉴클레오티드에 관하여, 상기에 제공된 것을 초과하는 동일율% 숫자는 바람직한 실시태양을 포함함을 알 것이다. 따라서, 적용가능한 경우, 최소 동일율% 숫자에 비추어, 상기 폴리뉴클레오티드는 관련된 지명된 서열번호에 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 65% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 91%, 보다 바람직하게는 적어도 92%, 보다 바람직하게는 적어도 93%, 보다 바람직하게는 적어도 94%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 96%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99%, 보다 바람직하게는 적어도 99.1%, 보다 바람직하게는 적어도 99.2%, 보다 바람직하게는 적어도 99.3%, 보다 바람직하게는 적어도 99.4%, 보다 바람� �하게는 적어도 99.5%, 보다 바람직하게는 적어도 99.6%, 보다 바람직하게는 적어도 99.7%, 보다 바람직하게는 적어도 99.8%, 보다 바람직하게는 적어도 99.9% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의, 또는 본 발명에 유용한 폴리뉴클레오티드는 엄격한 조건 하에서 본 발명에 정의된 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 하이브리드화할 수 있다. 본 발명에 사용된 바와 같은 엄격한 조건은 (1) 하이브리드화 동안 42 ℃에서 변성제, 예를 들어 포름아미드, 예를 들어 50%(v/v) 포름아미드를 0.1%(w/v) 소 혈청 알부민, 0.1% 피콜(Ficoll), 0.1% 폴리비닐피롤리돈, pH 6.5에서 750 mM NaCl, 75 mM 나트륨 시트레이트를 갖는 50 mM 나트륨 포스페이트 완충제와 함께 사용하거나; 또는 (2) 42 ℃에서, 0.2 x SSC 및 0.1% SDS 중의 50% 포름아미드, 5 x SSC(0.75 M NaCl, 0.075 나트륨 시트레이트), 50 mM 나트륨 포스페이트(pH 6.8), 0.1% 나트륨 피로포스페이트, 5 x 덴하르트 용액, 초음파 처리된 연어 정자 DNA(50 g/㎖), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 설페이트를 사용하고/하거나, (3) 낮은 이온 강도 및 높은 세척 온도, 예를 들어 50 ℃에서 0.015 M NaCl/0.0015 M 나트륨 시트레이트/0.1% SDS를 사용하는 것들이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 천연 분자에 비해 뉴클레오티드 잔기의 결실, 삽입, 또는 치환인 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 기준 서열에 비해 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드는 천연(즉, 천연 출처로부터 단리된)이거나 합성(예를 들어 상술한 바와 같이 핵산상에서 부위-지향된 돌연변이 또는 DNA 셔플링을 수행함으로써)일 수 있다.

내인성 단백질의 발현 수준을 감소시키기 위한 폴리뉴클레오티드

하나의 실시태양에서, 본 발명의 세포/종자/식물/유기체는 내인성 효소의 생산 및/또는 활성을 하향조절하는, 전형적으로는 도입된 돌연변이 또는 외인성 폴리뉴클레오티드가 없는 상응하는 세포에 비해 올레산의 증가된 생산 및 바람직하게는 팔미트산 및 PUFA, 예를 들어 리놀레산의 감소된 생산을 생성시키는 상기 도입된 돌연변이 또는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기와 같은 폴리뉴클레오티드의 예는 안티센스 폴리뉴클레오티드, 센스 폴리뉴클레오티드, 촉매성 폴리뉴클레오티드, 미세RNA, 내인성 효소와 연결하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 이중 가닥 RNA를 포함한다.

RNA 간섭

RNA 간섭(RNAi)은 특정 단백질의 생산을 특이적으로 억제하기에 특히 유용하다. 상기 기술은 목적한 유전자의 mRNA와 필수적으로 동일한 서열 또는 그의 일부분 및 이에 상보성인 서열을 함유하는 dsRAN 분자의 존재에 의존한다. 편의상, 상기 dsRNA를 재조합 벡터 또는 숙주 세포에서 단일 프로모터로부터 생성시킬 수 있으며, 이때 센스 및 안티센스 서열은 서열, 바람직하게는 관련없는 서열에 의해 공유적으로 연결되고, 이는, 표적 RNA 또는 그의 보체에 동일한 서열이 고리 구조를 형성할 수 있지만, 상응하는 전사체 중의 상기 센스 및 안티센스 서열이 하이브리드화하여 고리 구조를 형성하는 연결 서열과 상기 dsRAN 분자를 형성할 수 있게 한다. 전형적으로, 상기 dsRNA는 중단된 팔린드롬으로서 배열된, 반전된 반복 구조 중에 센스 및 안티센스 서열을 갖는 이중 가닥 DNA 구조물에 의해 암호화되며, 이때 상기 반복된 서열은 전사되어 상기 dsRNA 분자 중에 하이브리드화 서열을 생성시키고, 상기 중단 서열은 전사되어 상기 dsRNA 분자 중에 고리를 형성한다. 적합한 dsRNA 분자의 설계 및 제조는, 특히 문헌[Waterhouse et al. (1998)], [Smith et al. (2000)], WO 99/32619, WO 99/53050, WO 99/49029, 및 WO 01/34815을 고려하여, 당해 분야의 당업자의 능력 내에서 충분하다.

일례로, 상동성인, 바람직하게는 표적 RNA의 불활성화시킬 영역에 상보성인 적어도 19 개의 연속적인 뉴클레오티드를 갖는 적어도 일부분적으로 이중 가닥인 RNA 산물(들)의 합성을 지시하는 DNA를 도입시킨다. 따라서 상기 DNA는, RNA로 전사시, 하이브리드화하여 상기 이중 가닥 RNA 영역을 형성시킬 수 있는 센스 및 안티센스 서열을 모두 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 센스 및 안티센스 서열은, RNA로 전사시, 연접 파괴되는 인트론을 포함하는 이격 영역에 의해 분리된다. 이러한 배열은 보다 높은 유전자 침묵화 효율을 생성시키는 것으로 나타났다. 상기 이중 가닥 RNA 영역은 하나 또는 2 개의 DNA 영역으로부터 전사된 하나 또는 2 개의 RNA 분자를 포함할 수 있다. 상기 이중 가닥 분자의 존재는, 상기 이중 가닥 RNA 및 또한 표적 유전자로부터의 동종 RNA 전사체 모두를 파괴하는 내인성 시스템으로부터의 반응을 촉발하여, 상기 표적 유전자의 활성을 효율적으로 감소시키거나 제거하는 것으로 생각된다.

상기 하이브리드화하는 센스 및 안티센스 서열의 길이는 각각 표적 mRNA의 일부분에 상응하는, 적어도 19 개의 연속적인 뉴클레오티드이어야 한다. 전체 유전자 전사체에 상응하는 완전-길이 서열을 사용할 수도 있다. 표적 전사체에 대한 상기 센스 및 안티센스 서열의 동일 정도는 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 100%가어야 한다. 상기 RNA 분자는 물론 상기 분자를 안정화시키는 작용을 할 수 있는 관련되지 않은 서열들을 포함할 수도 있다. 상기 RNA 분자는 RNA 폴리머라제 II 또는 RNA 폴리머라제 III 프로모터의 조절 하에서 발현될 수도 있다. 후자의 예는 tRNA 또는 snRNA 프로모터를 포함한다.

바람직한 작은 간섭 RNA("siRNA") 분자는 표적 mRNA의 약 19 내지 21 연속 뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직하게, 상기 siRNA 서열은 다이뉴클레오티드 AA로 시작하며, 약 30 내지 70%(바람직하게는 30 내지 60%, 보다 바람직하게는 40 내지 60%, 및 보다 바람직하게는 약 45% 내지 55%)의 GC-함량을 포함하고, 예를 들어 표준 BLAST 연구에 의해 측정된 바와 같이, 도입시키려는 유기체의 게놈 중의 표적 이외의 임의의 뉴클레오티드 서열과 높은 동일율 퍼센트를 갖지 않는다.

일례로서, 본 발명의 dsRNA는 서열번호 49 내지 51(여기서 각각의 T는 U임) 중 어느 하나로서 제공된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

미세RNA

미세RNA(약어 miRNA)는 일반적으로, 불완전한 줄기-고리 구조를 형성하는 보다 큰 전구체로부터 유래하는 19 내지 25 뉴클레오티드(통상적으로 식물에서 약 20 내지 24 뉴클레오티드) 비-암호화 RNA 분자이다.

miRNA는 표적 전령 RNA 전사체(mRNA)상의 상보성 서열에 연결하여, 대개는 번역 억제 또는 표적 분해 및 유전자 침묵화를 발생시킨다.

식물 세포에서, miRNA 전구체 분자는 처음에 핵에서 가공처리되는 것으로 여겨진다. pri-miRNA(하나 이상의 국소 이중가닥 또는 "헤어핀" 영역뿐만 아니라 mRNA의 통상적인 5' "캡" 및 폴리아데닐화된 꼬리를 함유함)는 보다 짧은 miRNA 전구체 분자(또한 줄기-고리 또는 폴드-백 구조를 포함하며 "pre-miRNA"라 칭함)로 가공처리된다. 식물에서, 상기 pre-miRNA는 독특한 DICER-유사(DCL) 효소, 특히 DCL-1에 의해 절단되어, miRNA:miRNA ^* 듀플렉스를 제공한다. 상기 듀플렉스는 상기 핵 밖으로 전달 전에, 메틸화된다. 대조적으로, 보다 긴 dsRNA 영역을 갖는 헤어핀 RNA 분자는 특히 DCL-3 및 DCL-4에 의해 가공처리된다.

세포질에서, 상기 miRNA:miRNA 듀플렉스로부터의 miRNA 가닥은 표적 인식을 위해 활성 RNA-유도된 침묵화 듀플렉스(RISC)에 선택적으로 통합된다. 상기 RISC-복합체는, 전사 후 서열-특이적 유전자 억제를 발휘하는 아코너트 단백질의 특정 일부분집합을 함유한다(예를 들어 문헌[Millar and Waterhouse, 2005]; [Pasquinelli et al., 2005]; [Almeida and Allshire, 2005]을 참조한다).

공억제

유전자는 게놈 중에 이미 존재하는 관련된 내인성 유전자 및/또는 트랜스유전자의 발현을 억제할 수 있으며, 이는 상동성-의존적인 유전자 침묵화라 칭하는 현상이다. 상동성 의존적인 유전자 침묵화 경우는 대일부분 2 개의 부류, 즉 상기 트랜스유전자의 전사 수준에서 작용하는 것과, 전사 후에 작동하는 것으로 분류된다.

전사-후 상동성-의존적인 유전자 침묵화(즉 공억제)는 트랜스제닉 식물에서 트랜스유전자 및 관련된 내인성 또는 바이러스 유전자의 발현 손실을 개시한다. 공억제는 종종,항상은 아니지만, 트랜스유전자 전사체이 풍부한 경우 발생하며, 일반적으로 mRNA 처리, 국소화 및/또는 분해의 수준에서 촉발되는 것으로 생각된다. 공억제가 어떻게 작용하는지를 설명하는 여러 모델들이 존재한다(문헌[Taylor, 1997]을 참조한다).

공억제는 유전자 또는 그의 단편의 잉여 사본을, 발현을 위한 프로모터에 대해 센스 배향으로 식물내로 도입시킴을 수반한다. 당업자는 상기 센스 단편의 크기, 표적 유전자 영역에 대한 그의 대응, 및 상기 표적 유전자에 대한 서열 동일성의 정도가 다양할 수 있음을 알 것이다. 일부의 경우에, 상기 유전자 서열의 추가적인 사본은 상기 식물 표적 유전자의 발현을 간섭한다. 공-억제 접근법의 실행 방법에 대해서 WO 97/20936 및 EP 0465572를 참조한다.

발현 벡터

본 발명에 사용된 바와 같이, "발현 벡터"는 숙주 세포의 형질전환 및 하나 이상의 명시된 폴리뉴클레오티드의 발현의 실행이 가능한 DNA 또는 RNA 벡터이다. 바람직하게, 상기 발현 벡터는 또한 숙주 세포내에서 복제가 가능하며 상기 숙주 세포 게놈내로 통합될 수 있다. 발현 벡터는 전형적으로 바이러스 또는 플라스미드이다. 본 발명의 발현 벡터는 진균, 조류 및 식물 세포를 포함하여, 본 발명의 숙주 세포에서 작용하는(즉 유전자 발현을 지시하는) 임의의 벡터를 포함한다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "작동적으로 연결된"은 2 개 이상의 핵산(예를 들어 DNA) 분절간의 작용 관계를 지칭한다. 전형적으로, 전사된 서열에 대한 전사 조절 요소(프로모터)의 작용 관계를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는, 이것이 적합한 세포 중의 암호화 서열의 전사를 자극하거나 조절하는 경우, 본 발명에서 정의된 폴리뉴클레오티드의 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 일반적으로, 전사된 서열에 작동적으로 연결된 프로모터 전사 조절 요소는 상기 전사된 서열에 물리적으로 인접한다, 즉 상기는 시스-작용이다. 그러나, 일부 전사 조절 요소, 예를 들어 인헨서는 이들이 증대시키는 전사를 갖는 암호화 서열에 물리적으로 인접하거나 가깝게 위치할 필요가 없다.

본 발명의 발현 벡터는 조절 서열, 예를 들어 전사 조절 서열, 번역 조절 서열, 복제 기원, 및 숙주 세포와 양립성이고 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는 다른 조절 서열들을 함유한다. 특히, 본 발명의 발현 벡터는 전사 조절 서열을 포함한다. 전사 조절 서열은 전사의 개시, 연장 및 종결을 조절하는 서열이다. 특히 중요한 전사 조절 서열은 전사 개시를 조절하는 것, 예를 들어 프로모터, 인헨서, 오퍼레이터 및 리프레서 서열이다. 적합한 전사 조절 서열은 본 발명의 재조합 세포들 중 적어도 하나에서 작용할 수 있는 임의의 전사 조절 서열을 포함한다. 사용되는 조절 서열의 선택은 표적 유기체, 예를 들어 목적 식물 및/또는 표적 기관 또는 조직에 따라 변한다. 상기와 같은 조절 서열을 식물 또는 식물 바이러스와 같은 임의의 진핵생물 유기체로부터 수득하거나, 또는 화학적으로 합성할 수 있다. 다양한 상기와 같은 전사 조절 서열은 당해 분야의 당업자들에게 공지되어 있다. 특히 바람직한 전사 조절 서열은 식물 또는 그의 일부분(들)의 용도에 따라, 구성적으로 또는 단계 및/또는 조직 특이적으로, 상기 식물에서의 전사를 지시하는데 활성인 프로모터이다.

식물 세포의 안정한 형질감염 또는 트랜스제닉 식물의 확립에 적합한 다수의 벡터들이 예를 들어 하기의 문헌들에 개시되었다: Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987, Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989, 및 Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. 전형적으로, 식물 발현 벡터는 예를 들어 5' 및 3' 조절 서열의 전사 조절 하에 하나 이상의 클로닝된 식물 유전자 및 우세한 선택성 마커를 포함한다. 상기와 같은 식물 발현 벡터는 또한 프로모터 조절 영역(예를 들어 유도성 또는 구성적인, 환경적으로 또는 발생적으로-조절된, 또는 세포- 또는 조직-특이적인 발현을 조절하는 조절 영역), 전사 개시 출발 부위, 리보솜 연결 부위, RNA 가공처리 신호, 전사 종결 부위, 및/또는 폴리아데닐화 신호를 함유할 수 있다.

식물 세포에서 활성인 다수의 구성 프로모터가 개시되었다. 식물에서 구성적 발현에 적합한 프로모터는 이로 제한되지 않지만, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스(FMV) 35S, 사탕수수 막대모양 바이러스 프로모터, 코멜리나 황색 반점 바이러스 프로모터, 리뷸로스-1,5-비스-포스페이트 카복실라제의 작은 서브유닛으로부터의 빛-유도성 프로모터, 벼 시토솔 트라이오스포스페이트 아이소머라제 프로모터, 아라비도프시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 프로모터, 벼 액틴 1 유전자 프로모터, 만노핀 신타제 및 옥토핀 신타제 프로모터, Adh 프로모터, 슈크로스 신타제 프로모터, R 유전자 복합체 프로모터, 및 클로로필 α/β 연결 단백질 유전자 프로모터를 포함한다. 이들 프로모터를 사용하여 식물에서 발현되는 DNA 벡터를 생성시켰으며, 예를 들어 WO 84/02913을 참조한다. 이들 프로모터를 모두 다양한 유형의 식물-발현성 재조합 DNA 벡터의 생성에 사용하였다.

잎, 종자, 뿌리 또는 줄기와 같은 식물의 출처 조직들에서의 발현을 위해서, 본 발명에서 사용되는 프로모터들은 이들 특정 조직에서 비교적 높은 발현을 갖는 것이 바람직하다. 이를 위해서, 조직- 또는 세포-특이적, 또는 -증대된 발현을 갖는 유전자에 대한 다수의 프로모터들 중에서 하나를 선택할 수 있다. 문헌에 보고된 상기와 같은 프로모터들의 예는 완두콩으로부터의 엽록체 글루타민 신타제 GS2 프로모터, 밀로부터의 엽록체 프럭토스-1,6-바이포스파타제 프로모터, 감자로부터의 핵 광합성 ST-LS1 프로모터, 세린/쓰레오닌 키나제 프로모터 및 아라비도프시스 탈리아나로부터의 글루코아밀라제(CHS) 프로모터를 포함한다.

(1) 열, (2) 빛(예를 들어 완두콩 RbcS-3A 프로모터, 옥수수 RbcS 프로모터), (3) 호르몬, 예를 들어 아브시스산, (4) 상처(예를 들어 WunI), 또는 (5) 화학물질, 예를 들어 메틸 자스모네이트, 살리실산, 스테로이드 호르몬, 알콜, 완화제(WO 97/06269)에 의해 조절되는 프로모터를 포함하여, 환경, 호르몬, 화학적 및/또는 발생 신호에 응답하여 조절되는 다양한 식물 유전자 프로모터들을 또한 식물 세포에서의 RNA-연결 단백질 유전자의 발현에 사용하거나, 또는 (6) 기관-특이적 프로모터를 사용하는 것이 또한 유리할 수도 있다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "식물 저장 기관 특이적 프로모터"란 용어는 다른 식물 조직에 비해 식물의 저장 기관에서의 유전자 전사를 우선적으로 지시하는 프로모터를 지칭한다. 상기 식물 저장 기관은 바람직하게는 종자이다. 바람직하게, 상기 프로모터는 오직 상기 저장 기관에서 목적 유전자의 발현만을 지시하고/하거나, 상기 식물의 다른 일부분, 예를 들어 잎에서의 목적 유전자의 발현은 노던 블럿 분석 및/또는 RT-PCR에 의해 검출될 수 없다. 전형적으로, 상기 프로모터는 상기 저장 기관의 성장 및 발달 동안, 특히 상기 저장 기관에서의 저장 화합물의 합성 및 축적 단계 동안 유전자의 발현을 구동한다. 상기와 같은 프로모터는 전체 식물 저장 기관 또는 단지 그의 일부분, 예를 들어 종피, 쌍떡잎 식물의 종자 중 배 또는 떡잎 또는 외떡잎 식물의 종자의 내배유 또는 호분층에서 유전자 발현을 구동할 수 있다.

다른 프로모터들을 또한 종자 또는 열매와 같은 특정 조직 중 단백질 발현에 사용할 수 있다. β-콘글리시닌에 대한 프로모터 또는 다른 종자-특이적 프로모터, 예를 들어 나핀, 제인, 리닌 및 파세올린 프로모터를 사용할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 프로모터는 지질 생합성이 일어나는 조직 및 기관에서 발현을 지시한다. 상기와 같은 프로모터는 종자중 지질 조성의 변형에 적합한 시간에 종자 발생시 작용한다. 하나의 실시태양에서, 상기 식물 저장 기관 특이적 프로모터는 종자 특이적 프로모터이다. 보다 바람직한 실시태양에서, 상기 프로모터는 잎과 같은 식물의 다른 기관에서의 발현에 비해, 쌍떡잎 식물의 종자 중 배 및/또는 떡잎 또는 외떡잎 식물의 종자의 내배유에서의 발현을 우선적으로 지시한다. 종자-특이적 발현에 바람직한 프로모터는 1) 지질 생합성 및 종자 중 축적에 관련된 효소, 예를 들어 불포화효소 및 엘론가제를 암호화하는 유전자로부터의 프로모터, 2) 종자 저장 단백질을 암호화하는 유전자로부터의 프로모터, 및 3) 종자중 탄수화물 생합성 및 축적에 관련된 효소를 암호화하는 유전자로부터의 프로모터를 포함한다. 적합한 종자 특이적 프로모터는 아마 리닌 프로모터(예를 들어 Cnl1 또는 Cnl2 프로모터), 유지종자 유채 나핀 유전자 프로모터(US 5,608,152), 누에콩 USP 프로모터(Baumlein et al., 1991), 아라비도프시스 올레오신 프로모터(WO 98/45461), 파세올루스 불가리스 파세올린 프로모터(US 5,504,200), 브라시카 Bce4 프로모터(WO 91/13980), 또는 레구민 B4 프로모터(Baumlein et al., 1992), 및 옥수수, 보리, 밀, 호밀, 벼 등과 같은 외떡잎식물에서의 종자-특이적 발현을 도출하는 프로모터들이다. 적합한 주목할만한 프로모터들은 보리 lpt2 또는 lpt1 유전자 프로모터(WO 95/15389 및 WO 95/23230), 또는 WO 99/16890에 개시된 프로모터들(보리 호르데인 유전자, 벼 글루텔린 유전자, 벼 오리진 유전자, 벼 프롤아민 유전자, 밀 글리아딘 유전자, 밀 글루텔린 유전자, 옥수수 제인 유전자, 귀리 글루텔린 유전자, 수수 카시린 유전자, 호밀 세칼린 유전자로부터의 프로모터들)이다. 다른 프로모터는 하기에 개시된 것들을 포함한다: Broun et al. (1998), Potenza et al. (2004), US 20070192902 및 US 20030159173. 하나의 실시태양에서, 상기 종자 특이적 프로모터는 배, 떡잎(들) 또는 내배유와 같은 종자의 한정된 일부분들에서 우선적으로 발현된다. 떡잎 특이적 프로모터의 예는 이로 제한되지 않지만, FP1 프로모터(Ellerstrom et al., 1996), 완두콩 레구민 프로모터(Perrin et al., 2000), 및 콩 피토헤마글루티닌 프로모터(Perrin et al., 2000)를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 종자 특이적 프로모터는 상기 배에서 및/또는 종자 발아 후 발현되지 않거나, 또는 단지 낮은 수준으로 발현된다.

다수의 프로모터가 존재할 때, 각각의 프로모터는 독립적으로 동일하거나 상이할 수 있다.

5' 비-번역 리더 서열은 상기 폴리뉴클레오티드의 이종 유전자 서열을 발현하도록 선택된 프로모터로부터 유래하거나, 또는 생성되는 효소의 암호화 영역에 대해서 이종일 수 있으며, 경우에 따라 mRNA의 번역을 증가시키기 위해서 특이적으로 변형될 수도 있다.

전사의 종결은 발현 벡터에서 목적 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 3' 비-번역 DNA 서열에 의해 수행된다. 재조합 DNA 분자의 3' 비-번역 영역은, 식물에서 상기 RNA의 3' 단부에 대한 아데닐레이트 뉴클레오티드의 첨가를 야기하는 작용을 하는 폴리아데닐화 신호를 함유한다. 상기 3' 비-번역 영역을 예를 들어 식물 세포에서 발현된 다양한 유전자로부터 획득할 수 있다. 노팔린 신타제3' 비번역 영역, 완두콩 작은 서브유닛 루비스코 유전자로부터의 3' 비번역 영역, 대두 7S 종자 저장 단백질 유전자로부터의 3' 비번역 영역들이 상기 능력에 통상적으로 사용된다. 아그로박테리움 종양-유도(Ti) 플라스미드 유전자의 폴리아데닐화 신호를 함유하는 3' 전사된, 비-번역 영역이 또한 적합하다.

재조합 DNA 기술을 사용하여, 예를 들어 숙주 세포내 폴리뉴클레오티드의 사본수, 상기 폴리뉴클레오티드가 전사되는 효율, 생성되는 전사체이 번역되는 효율, 및 번역-후 변형의 효율을 조작함으로써 형질전환된 폴리뉴클레오티드의 발현을 개선시킬 수 있다.

형질전환체의 확인을 용이하게 하기 위해서, 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 선택성 또는 선별성 마커 유전자를 본 발명에서 정의된 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열로서 또는 상기 서열 외에 포함한다. "마커 유전자"는 상기 마커 유전자를 발현하는 세포에 독특한 표현형을 부여하고, 따라서 상기와 같은 형질전환된 세포를 상기 마커를 갖지 않는 세포와 구분될 수 있게 하는 유전자를 의미한다. 선택성 마커 유전자는 선택성 작용제(예를 들어 제초제,항생제, 방사선, 열, 또는 형질전환되지 않은 세포에 대한 다른 처리 손상)에 대한 내성을 근거로 "선택"할 수 있는 특성을 부여한다. 선별성 마커 유전자(또는 리포터 유전자)는 관찰 또는 시험을 통해서, 즉 "선별"(예를 들어 β-글루쿠로니다제, 루시페라제, GFP 또는 형질전환되지 않은 세포 중에 존재하지 않는 다른 효소 활성)에 의해서 확인할 수 있는 특성을 부여한다. 상기 마커 유전자 및 목적 뉴클레오티드 서열을, 예를 들어 US 4,399,216에 개시된 바와 같이 연결되지 않은 유전자의 공-형질전환도 또한 예를 들어 식물 형질전환에 효율적인 과정이므로, 연결시킬 필요가 없다. 마커의 실제 선택은, 상기 마커가 식물 세포와 같은 선택 세포와 함께 작용성인(즉 선택성인)한 중요하지 않다.

식물 형질전환체의 선택에 예시적인 선택성 마커는 이로 제한되지 않지만, 하이그로마이신 B 내성을 암호화하는 hyg 유전자; 가나마이신, 파로모마이신, G418에 대한 내성을 부여하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(nptII) 유전자; 예를 들어 EP 256223에 개시된 바와 같이 글루타치온 유도된 제초제에 대한 내성을 부여하는 래트 간으로부터의 글루타치온-S-트랜스퍼라제 유전자; 예를 들어 WO 87/05327에 개시된 바와 같이 과발현시 포스피노트리신과 같은 글루타민 신타제 억제제에 대한 내성을 부여하는 글루타민 신타제 유전자; 예를 들어 EP 275957에 개시된 바와 같이 선택성 작용제 포스피노트리신에 대한 내성을 부여하는 스트렙토마이세스 비리도크로모제네스로부터의 아세틸트랜스퍼라제 유전자; 예를 들어 문헌[Hinchee et al. (1988)]에 개시된 바와 같이 N-포스포노메틸글리신에 대한 내성을 부여하는 5-에놀쉬키메이트-3-포스페이트 신타제(EPSPS)를 암호화하는 유전자; 예를 들어 WO91/02071에 개시된 바와 같은 바이알라포스에 대한 내성을 부여하는 bar 유전자; 브로목시닐에 대한 내성을 부여하는 클렙시엘라 오자에나에로부터의 bxn과 같은 니트릴라제 유전자(Stalker et al., 1988); 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 다이하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자(Thillet et al., 1988); 이미다졸리논, 설포닐유레아, 또는 다른 ALS-억제성 화학물질에 대한 내성을 부여하는 돌연변이 아세토락테이트 신타제 유전자(ALS)(EP 154,204); 5-메틸 트립토판에 대한 내성을 부여하는 돌연변이된 안트라닐레이트 신타제 유전자; 또는 제초제에 대한 내성을 부여하는 달라폰 데할로게나제 유전자를 포함한다.

바람직한 선별성 마커는 이로 제한되지 않지만, 다양한 색원성 기질들이 공지된 β-글루쿠로니다제(GUS) 효소를 암호화하는 uidA 유전자; 색원성 기질들이 공지된 효소를 암호화하는 β-갈락토시다제 유전자; 칼슘-민감성 생물발광 검출에 사용될 수 있는 에쿠오린 유전자(Prasher et al., 1985); 녹색 형광 단백질 유전자(Niedz et al., 1995) 또는 그의 유도체; 또는 생물발광 검출을 허용하는 루시페라제(luc) 유전자(Ow et al., 1986)를 포함한다. "리포터 분자"는 그의 화학적 성질에 의해 단백질 산물을 기준으로 프로모터 활성의 측정을 용이하게 하는, 분석학적으로 확인 가능한 신호를 제공하는 분자를 의미한다.

바람직하게, 상기 재조합 벡터는 식물 세포와 같은 세포의 게놈에 안정하게 통합된다. 따라서, 상기 재조합 벡터는 상기 벡터가 상기 세포의 게놈 또는 염색체내로 통합될 수 있게 하는 적합한 요소들을 포함할 수 있다.

전달 핵산

전달 핵산을 사용하여 외인성 폴리뉴클레오티드를 세포로 전달할 수 있으며, 상기 핵산은 하나, 바람직하게는 2 개의 경계 서열 및 목적 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 전달 핵산은 선택성 마커를 암호화할 수도, 하지 않을 수도 있다. 바람직하게, 상기 전달 핵산은 세균내에 2원 벡터의 일부분을 형성하며, 이때 상기 2원 벡터는 상기 세균에서 상기 벡터의 복제, 상기 2원 벡터를 함유하는 세균 세포의 선택 또는 유지를 허용하는 요소들을 추가로 포함한다. 진핵생물 세포로 전달 시, 상기 2원 벡터의 전달 핵산 성분은 상기 진핵생물 세포의 게놈내로 통합이 가능하다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "염색체외 전달 핵산"은 세균, 예를 들어 아그러박테리움 스페시즈로부터 진핵생물 세포, 예를 들어 식물 세포로 전달될 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 염색체외 전달 핵산은 전달될 수 있는 요소로서 널리 공지된 유전자 요소이며, 후속으로 그의 경계내에 함유된 뉴클레오티드 서열이 수용 세포의 게놈내로 통합된다. 이에 관하여, 전달 핵산은 전형적으로 2 개의 "경계" 서열이 인접하고 있지만, 일부의 경우에 한쪽 단부에 단일 경계가 사용될 수 있고 상기 전달된 핵산의 두 번째 단부가 상기 전달 과정에서 무작위로 생성된다. 목적 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 전달 핵산의 왼쪽 경계-형 서열과 오른쪽 경계-형 서열 사이에 위치한다. 상기 전달 핵산 내에 함유된 폴리뉴클레오티드는 그의 발현, 즉 상기 폴리뉴클레오티드의 전사 및/또는 번역을 촉진하는 다양한 상이한 프로모터 및 종결자 조절 요소에 작동적으로 연결될 수 있다. 아그로박테리움 스페시즈( Agrobacterium sp. ), 예를 들어 아그로박테리움 튜메파시엔스( Agrobacterium tumefaciens ) 또는 아그로박테리움 리조제네스( Agrobacterium rhizogenes )로부터의 전달 DNA(T-DNA), 및 그의 인공 변이체/돌연변이체가 추정상 전달 핵산의 특성화된 예들이다. 또 다른 예는 식물로부터의 T-DNA 경계-형 서열을 포함하는 P-DNA("식물-DNA")이다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "T-DNA"는 예를 들어 아그로박테리움 튜메파시엔스 Ti 플라스미드 또는 아그로박테리움 리조제네스 Ri 플라스미드의 T-DNA, 또는 T-DNA로서 작용하는 그의 인공 변이체를 지칭한다. 상기 T-DNA는 오른쪽 및 왼쪽 경계 서열을 모두 포함하는 전체 T-DNA를 포함할 수 있지만, 전달의 경우 단지 시스에 필요한 최소 서열, 즉 오른쪽 및 T-DNA 경계 서열만을 포함할 필요가 있다. 본 발명의 T-DNA는 목적 폴리펩티드에, 오른쪽 및 왼쪽 경계 서열(존재하는 경우) 사이의 어딘가에 삽입되었다. 상기 T-DNA의 식물 세포내로의 전달의 경우 트랜스에 필요한 인자, 예를 들어 vir 유전자를 암호화하는 서열을 상기 T-DNA에 삽입하거나, 또는 상기 서열이 상기 T-DNA와 동일한 레플리콘상에 존재하거나, 또는 바람직하게는 상기 아그로박테리움 숙주 중의 양립성 레플리콘상에 트랜스로 존재한다. 상기와 같은 "2원 벡터 시스템"은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "P-DNA"는 식물 게놈으로부터 단리된 전달 핵산, 또는 그의 인공 변이체/돌연변이체를 지칭하며, 각각의 단부에 또는 단지 한쪽 단부에, T-DNA 경계-형 서열을 포함한다. 상기 경계-형 서열은 바람직하게는 아그로박테리움 스페시즈, 예를 들어 아그로박테리움 튜메파시엔스 또는 아그로박테리움 리조제네스로부터의 T-DNA 경계 서열과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 100% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 따라서, P-DNA를, 예를 들어 아그로박테리움으로부터 또 다른 세포로, P-DNA내에 함유된 또 다른 뉴클레오티드 서열을 전달하기 위해 T-DNA 대신 사용할 수 있다. 상기 P-DNA를, 전달하고자 하는 외인성 폴리뉴클레오티드의 삽입 전에 변형시켜 클로닝을 촉진할 수 있으며 상기는 바람직하게는 어떠한 단백질도 암호화하지 않아야 한다. 상기 P-DNA는 적어도 오른쪽 경계 서열 및 바람직하게는 또한 왼쪽 경계 서열을 함유함을 특징으로 한다.

본 발명에 사용된 바와 같이, 전달 핵산의 "경계" 서열을 선택된 유기체, 예를 들어 식물 또는 세균으로부터 단리하거나, 또는 상기 서열은 그의 인공 변이체/돌연변이체일 수 있다. 상기 경계 서열은 연결되는 폴리뉴클레오티드의 전달을 촉진하고 용이하게 하며, 수용 세포 게놈내 그의 통합을 촉진시킬 수 있다. 하나의 실시태양에서, 경계-서열은 길이가 5 내지 100 염기쌍(bp), 10 내지 80 bp, 15 내지 75 bp, 15 내지 60 bp, 15 내지 50 bp, 15 내지 40 bp, 15 내지 30 bp, 16 내지 30 bp, 20 내지 30 bp, 21 내지 30 bp, 22 내지 30 bp, 23 내지 30 bp, 24 내지 30 bp, 25 내지 30 bp, 또는 26 내지 30 bp이다. 아그로박테리움 스페시즈로부터 T-DNA의 경계 서열은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 문헌[Lacroix et al. (2008)], [Tzfira and Citovsky (2006)] 및 [Glevin (2003)]에 개시된 것들을 포함한다.

전통적으로 오직 아그로박테리움 스페시즈만이 유전자를 식물 세포로 전달하는데 사용되었지만, 현재 아그로박테리움 스페시즈와 유사한 방식으로 작용하는 확인되고/개발된 다수의 시스템들이 존재한다. 다수의 비-아그로박테리움 스페시즈들이 최근에 유전자 전달에 능숙하게 유전자 변형되었다(Chung et al., 2006; Broothaerts et al., 2005). 이들은 리조븀 스페시즈( Rhizobium sp. ) NGR234, 시노리조븀 멜리로티( Sinorhizobium meliloti ) 및 메조리조븀 로티( Mezorhizobium loti )를 포함한다. 상기 세균은 상기 세균에, 형질전환 과정에 필요한 기구, 즉 별도의 작은 2원 플라스미드상에 주재하는 T-DNA 및 아그로박테리움 Ti-플라스미드에 의해 암호화된 독성 유전자의 세트를 제공함으로써, 유전자 전달에 능숙하게 된다. 이러한 방식으로 조작된 세균은 상이한 식물 조직(잎절편, 캘러스 및 타원 조직), 외떡잎 또는 쌍떡잎, 및 다양한 상이한 식물 종들(예를 들어 담배, 벼)을 형질전환시킬 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "형질감염", "형질전환"이란 용어 및 이들의 변형어는 일반적으로 서로 호환적으로 사용된다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 세포를 조작하여 목적 폴리뉴클레오티드(들)를 도입시키거나, 또는 상기 세포는 이로부터 유도된 자손 세포일 수 있다.

재조합 세포

본 발명은 또한 본 발명에 정의된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터 또는 이들의 조합으로 형질전환된 숙주 세포인 재조합 세포, 예를 들어 재조합 식물 세포를 제공한다. "재조합 세포"란 용어는 본 발명에서 "트랜스제닉 세포"란 용어와 서로 호환적으로 사용된다. 본 발명의 적합한 세포는, 예를 들어 본 발명에 개시된 폴리펩티드 또는 효소를 암호화하는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 벡터로 형질전환될 수 있는 임의의 세포를 포함한다. 상기 세포는 바람직하게는 지질의 생산에 사용될 수 있는 세포이다. 상기 재조합 세포는 배양물 중 세포, 시험관내, 또는 예를 들어 식물과 같은 유기체 중, 또는 종자 또는 잎과 같은 기관 중 세포일 수 있다. 바람직하게, 상기 세포는 식물 중에, 보다 바람직하게는 식물의 종자 중에, 보다 바람직하게는 유지종자 식물, 예를 들어 잇꽃의 종자 중에 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 식물 세포는 본 발명에 개시된 바와 같은 지방산 조성을 갖는 지질 또는 오일을 포함한다.

상기 폴리뉴클레오티드(들)가 도입되는 숙주 세포는 형질전환되지 않은 세포 또는 적어도 하나의 핵산으로 이미 형질전환된 세포일 수 있다. 상기와 같은 핵산은 지질 합성과 관련될 수도, 관련되지 않을 수도 있다. 본 발명의 숙주 세포는 본 발명에 정의된 폴리펩티드(들)를 내인성적으로(즉 천연으로) 생산할 수 있으며, 이 경우 상기로부터의 재조합 세포는 상기 폴리펩티드(들)를 생산하는 증대된 능력을 갖거나, 또는 오직 본 발명의 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 후에만 상기 폴리펩티드(들)를 생산할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 재조합 세포는 비-극성 지질을 생산하는 증대된 능력을 갖는다 상기 세포는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다. 바람직한 숙주 세포는 효모, 조류 및 식물 세포이다. 바람직한 실시태양에서, 상기 식물 세포는 종자 세포, 특히 종자의 떡잎 또는 내배유 중의 세포이다. 본 발명의 숙주 세포로서 유용한 조류 세포의 예는 예를 들어 클라미도모나스 스페시즈( Chlamydomonas sp. )(예를 들어 클라미도모나스 레인하르트티이( Chlamydomonas reinhardtii ), 듀날리엘라 스페시즈( Dunaiella sp. ), 하에마토코커스 스페시즈( Haematococcus sp. ), 클로렐라 스페시즈( Chlorella sp. ), 트라우스토키트리움 스페시즈( Thraustochytrium sp. ), 스키조키트리움 스페시즈( Schizochytrium sp. ) 및 볼복스 스페시즈( Volvox sp. )를 포함한다.

상기 숙주 세포들은 발효 과정에 적합한 유기체, 예를 들어 야로위아 리포리티카( Yarrowia lipolytica ) 또는 다른 효모의 것일 수 있다.

트랜스제닉 식물

본 발명은 또한 본 발명의 외인성 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 본 발명의 세포, 본 발명의 벡터, 또는 이들의 조합을 포함하는 식물을 제공한다. "식물"이란 용어는 전체 식물을 지칭하지만, "그의 일부분"이란 용어는 식물 기관(예를 들어 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 열매), 단세포(예를 들어 꽃가루), 종자, 종자 일부분, 예를 들어 배, 내배유, 배반, 또는 종피, 식물 조직, 에를 들어 관 조직, 식물 세포 및 그의 자손을 지칭한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 식물 일부분은 식물 세포를 포함한다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "식물"이란 용어는 가장 넓은 의미로 사용된다. 상기는 이로 제한되지 않지만, 임의의 종의 잔디, 장식용 식물, 농작물 또는 곡식(예를 들어 유지종자 식물, 옥수수, 대두), 꼴 또는 마초, 열매 또는 채소, 허브 식물, 목재 식물, 화초 식물 또는 나무를 포함한다. 식물을 임의의 특정한 구조로 제한하고자 하지 않는다. 또한 상기는 단세포 식물(예를 들어 미세조류)을 지칭한다. 식물에 관하여 "그의 일부분"이란 용어는 식물 세포 및 그의 자손, 주로 콜로니(예를 들어 볼복스)로 분화되는 다수의 식물 세포, 식물의 임의의 발생 단계에서 존재하는 구조, 또는 식물 조직을 지칭한다. 상기와 같은 구조는 이로 제한되지 않지만, 잎, 줄기, 꽃, 열매, 너트, 뿌리, 종자, 종피, 배를 포함한다. "식물 조직"이란 용어는 잎, 줄기, 꽃, 열매, 너트, 뿌리, 종자 중에 존재하는 것들을 포함하여 식물의 분화 및 미분화된 조직, 예를 들어 배 조직, 내배유, 피부 조직(예를 들어 표피, 주피), 관 조직(예를 들어 목질부, 인피부), 또는 기본 조직(유조직, 후각조직 및/또는 후막조직 세포 포함)뿐만 아니라 배양물 중 세포(예를 들어 단세포, 원형질체, 캘루스, 배 등)을 포함한다. 식물 조직은 식물체내, 기관 배양물, 조직 배양물 또는 세포 배양물내에 있을 수 있다.

"트랜스제닉 식물", "유전자 변형된 식물" 또는 이들의 변형은 동일한 종, 품종 또는 품종의 야생형 식물에서 발견되지 않는 트랜스유전자를 함유하는 식물을 지칭한다. 본 발명과 관련하여 정의된 바와 같은 트랜스제닉 식물은 재조합 기법을 사용하여 유전자 변형시켜 원하는 식물 또는 그의 일부분에 본 발명에 정의된 적어도 하나의 폴리펩티드를 생성시킨 식물 및 그의 자손을 포함한다. "트랜스제닉 식물 일부분"은 상응하는 의미를 갖는다.

"종자" 및 "그레인"이란 용어는 본 발명에 사용된 바와 같이 관련된 용어이며, 중복되는 의미를 갖는다. "그레인"은 성숙한 그레인, 예를 들어 수확된 그레인, 또는 여전히 식물상에 있지만 수확할 준비가 된 그레인을 지칭하지만, 문맥에 따라 침윤 또는 발아 후의 그레인을 지칭할 수도 있다. 성숙한 그레인은 통상적으로 약 18 내지 20% 미만의 수분 함량을 갖는다. "종자"는 "발생하는 종자"뿐만 아니라 성숙한 그레인인 "그레인"을 포함하지만, 침윤 또는 발아후 그레인은 포함하지 않는다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "발생하는 종자"는 수정 또는 개화 후 식물의 생식 구조에서 전형적으로 발견되는, 성숙전의 종자를 지칭하지만, 식물로부터 단리된 성숙전의 상기와 같은 종자를 또한 지칭할 수 있다. 식물내 종자 발생은 전형적으로 발생 초기, 중기 및 말기로 분류된다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "식물 저장 기관"이란 용어는 예를 들어 단백질, 탄수화물, 지질의 형태로 에너지를 저장하도록 분화된 식물의 일부분을 지칭한다. 식물 저장 기관의 예는 종자, 열매, 괴근 및 괴경이다. 본 발명의 바람직한 식물 저장 기관은 종자이다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "생장 조직" 또는 "생장 식물 일부분" 또는 이들의 변형은 식물의 성적인 번식을 위한 기관 또는 종자 함유 기관 또는 밀접하게 관련된 조직 또는 기관, 예를 들어 꽃, 열매 및 종자를 포함하지 않는 임의의 식물 조직, 기관 또는 일부분이다. 생장 조직 및 일부분은 적어도 식물 잎, 줄기(통나무 및 새싹을 포함하지만 머리 일부분은 제외), 괴경 및 뿌리를 포함하지만, 꽃, 꽃가루, 종피, 배 및 내배유를 포함한 종자, 중과피 조직을 포함한 열매, 종자-함유 꼬투리 및 종자-함유 머리 일부분은 제외된다. 하나의 실시태양에서, 상기 식물의 생장 일부분은 기생 식물 일부분이다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 상기 생장 식물 일부분은 녹색 일부분, 예를 들어 잎 또는 줄기이다. 생장 일부분은 상기 식물의 광합성 능력 또는 관련된 기능을 제공하거나 지지하거나, 또는 상기 식물을 고정시키는데 주로 관련된 일부분들을 포함한다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "표현형적으로 정상적인"이란 용어는 변형되지 않은 식물 또는 그의 일부분에 비해 성장 및 번식 능력이 현저하게 감소되지 않은 본 발명의 종자와 같은 유전자 변형된 식물 또는 그의 일부분, 특히 저장 기관을 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 표현형적으로 정상적인 유전자 변형된 식물 또는 그의 일부분은 본 발명에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하고 상기 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하지 않는 상응하는 식물 또는 그의 일부분과 필수적으로 동일한 성장 또는 번식 능력을 갖는다. 바람직하게, 바이오매스, 증식률, 발아율, 저장 기관 크기, 종자 크기 및/또는 생산된 생육성 종자의 수는 동일한 조건 하에서 생육시 상기 외인성 폴리뉴클레오티드가 없는 식물의 경우의 적어도 90%이다. 상기 용어는, 야생형 식물과 상이할 수 있지만 상업적인 목적을 위해 상기 식물의 유용성을 성취하지 못하는 상기 식물의 특징들은 포함하지 않는다.

본 발명의 실시에 사용하기 위해 제공되거나 고려되는 식물은 외떡잎 및 쌍떡잎 식물 모두를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 식물은 농작물(예를 들어 곡류 및 콩류, 옥수수, 밀, 감자, 타피오카, 벼, 수수, 기장, 카사바, 보리 또는 완두콩), 또는 다른 콩과 식물이다. 상기 식물을 식용 뿌리, 괴경, 잎, 줄기, 꽃 또는 열매의 생산을 위해 재배할 수 있다. 상기 식물은 야채 또는 관상용 식물일 수 있다. 본 발명의 식물은 잇꽃(카르타무스 팅크토리우스), 옥수수(제아 메이스), 카놀라(브라시카 나푸스, 브라시카 라파 스페시즈), 다른 배추속, 예를 들어 루타바가(브라시카 나포브라시카), 머스터드(브라시카 준세아), 에티오피아 머스터드(브라시카 카리나타), 크람베(크람베 오비시니카), 카멜리나(카멜리나 사티바), 사탕무(베타 불가리스), 클로버(트리폴리움 스페시즈), 아마(리눔 우시타티시뮴), 알팔파(메디카고 사티바), 벼(오리자 사티바), 호밀(세칼레 세랄레), 수수(소르검 비콜로르, 소르검 불가레), 해바라기(헬리안투스 안누스), 밀(트리티움 아에스티븀), 대두(글리시네 맥스), 담배(니코티아나 타바쿰), 감자(솔라늄 튜베로슘), 땅콩(아라키스 히포가에아), 면(고시피움 히르수툼), 고구마(로프모에아 바타투스), 카사바(마니호트 에스큘렌타), 커피(� �페아 스페시즈), 코코넛(코코스 누시페라), 파인애플(아나나 코모수스), 시트리스 나무(시트러스 스페시즈), 코코아(테오브로마 카카오), 차(카멜리아 세넨시스), 바나나(뮤사 스페시즈), 아보카도(페르세아 아메리카나), 무화과(피쿠스 카시카), 구아바(프시디움 구아자바), 망고(만지페르 인디카), 올리브(올레아 유로파에아), 파파야(카리카 파파야), 캐슈(아나카르디움 옥시덴탈레), 마카다미아(마카다미아 인테르그리폴리아), 아몬드(프루누스 아미그달루스), 자트로파(자트로파 쿠르카스), 루핀, 유칼립투스, 팜, 넛 세이지, 퐁가미아, 귀리 또는 보리일 수 있다.

다른 바람직한 식물은 C4 잔디류, 예를 들어 안드로포곤 제라르디( Andropogon gerardi ), 부텔로나 커티펜둘라( Bouteloua curtipendula ), 비 그라실리스( B. gracilis ), 부클로에 닥틸로이데스( Buchloe dactyloides ), 파니쿰 비르가툼( Panicum virgatum ), 스키자키리움 스코파리움( Schizachyrium scoparium ), 미스칸투스 종( Miscanthus species ), 예를 들어 미스칸투스 엑스 기간테우스( Miscanthus x giganteus ) 및 미스칸투스 시넨시스( Miscanthus sinensis ), 소르가스트룸 누탄스( Sorghastrum nutans ), 스포로볼루스 크립탄드루스( Sporobolus cryptandrus ), 스위치그래스( Switchgrass )(파니쿰 비르가툼), 사탕수수(사카룸 오피시나룸)( Saccharum officinarum ), 브라키아리아; C3 잔디류, 예를 들어 엘리무스 카나덴시스( Elymus canadensis ), 콩류 레스페데자 카피타타( Lespedeza capitata ) 및 페탈로스테뮴 빌로슘( Petalostemum villosum ), 활엽 초본 아스터 아주레우스( Aster azureus ); 및 목본 식물, 예를 들어 퀘르쿠스 엘립소이달리스( Quercus ellipsoidalis ) 및 큐 마크로카르파( Q. macrocarpa )를 포함한다.

바람직한 실시태양에서, 상기 식물은 속씨식물이다.

바람직한 실시태양에서, 상기 식물은 유지종자 식물, 바람직하게는 유지종자 농작물이다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "유지종자 식물"은 상기 식물의 종자로부터 상업적인 지질 생산에 사용되는 식물 종이다. 본 발명에서 "상업적인 생산"은 소득의 대가로 판매하기 위한 지질, 바람직하게는 오일의 생산을 의미한다. 상기 유지종자 식물은 오일-종자 유채(예를 들어 카놀라), 옥수수, 해바라기, 잇꽃, 대두, 수수, 아마(아마인) 또는 사탕무일 수 있다. 더욱 또한, 상기 유지종자 식물은 다른 배추속, 면, 땅콩, 양귀비, 순무, 겨자, 아주까리, 참깨, 잇꽃, 또는 너트 생산 식물일 수 있다. 상기 식물은 그의 열매, 예를 들어 올리브, 오일팜 또는 코코넛 중에 높은 수준의 지질을 생산한다. 본 발명이 적용될 수 있는 원예식물은 상추, 앤다이브, 또는 양배추, 브로콜리 또는 콜리플라워를 포함한 채소 배추속이다. 본 발명을 담배, 박, 당근, 딸기, 토마토 또는 후추에 적용할 수도 있다. 보다 바람직한 식물은 발생하는 종자가 비-광합성인 유지종자 식물(또한 "백색 종자"라 칭함), 예를 들어 잇꽃, 해바라기, 면 및 아주까리이다.

바람직한 실시태양에서, 상기 트랜스제닉 식물은 그의 자손이 원하는 표현형에 대해 분리되지 않도록 도입된 모든 유전자(트랜스유전자)에 대해 동형접합성이다. 상기 트랜스제닉 식물은 또한 도입된 트랜스유전자(들)에 대해서 이형접합성, 바람직하게는 예를 들어 하이브리드 종자로부터 번식된 F1 자손에서 트랜스유전자에 대해 균일하게 이형접합성일 수 있다. 상기와 같은 식물들은 당해 분야에 널리 공지된, 잡종 강세와 같은 이점을 제공할 수 있다.

식물의 형질전환

트랜스제닉 식물을 당해 분야에 공지된 기법, 예를 들어 문헌[Slater et al., Plant Biotechnology - The Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003)], 및 [Christou and Klee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley and Sons (2004)]에 일반적으로 개시된 바와 같은 기법을 사용하여 생산할 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "안정하게 형질전환되는", "안정하게 형질전환된"이란 용어들 및 그의 변형어들은 세포 분열 동안 그의 존재에 대한 양의 선택의 필요 없이 자손 세포로 전달되도록 세포의 게놈에 폴리뉴클레오티드를 통합시킴을 지칭한다. 안정한 형질전환체, 또는 그의 자손을 당해 분야에 공지된 임의의 수단, 예를 들어 염색체 DNA 상에서의 서던 블럿 또는 게놈 DNA의 원위치 하이브리드화에 의해 선택하고/하거나 확인할 수 있다.

아그로박테리움-매개된 전달은, DNA를 상기 DNA의 식물 세포 게놈내로의 일시적인 발현 또는 안정한 통합을 위해 전체 식물 조직, 식물 기관 또는 조직 배양물 중의 외식체 중의 세포에 도입시킬 수 있으므로, 유전자를 식물 세포에 도입시키기 위해 널리 적용할 수 있는 시스템이다. DNA를 식물 세포에 도입시키기 위한 아그로박테리움-매개된 식물 통합 벡터의 용도는 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어 US 5177010, US 5104310, US 5004863, 또는 US 5159135를 참조한다). 전달되는 DNA의 영역은 경계 서열에 의해 한정되며, 중재 DNA(T-DNA)가 대개 식물 게놈내로 삽입된다. 더욱이, 상기 T-DNA의 통합은 거의 재배열을 생성시키지 않는 비교적 정밀한 과정이다. 아그로박테리움-매개된 형질전환이 효율적인 식물 품종들에서, 상기는 상기 유전자 전달의 용이하고 한정된 성질로 인해 선택되는 방법이다. 바람직한 아그로박테리움 형질전환 벡터는 개시된 바와 같이 이 콜라이뿐만 아니라 아그로박테리움에서 복제가 가능하여 편리한 조작을 허용한다(Klee et al., In: Plant DNA Infectious Agents, Hohn and Schell, eds., Springer-Verlag, New York, pp. 179-203 (1985)).

사용될 수 있는 가속화 방법은 예를 들어 미세입자 투사법 등을 포함한다. 식물 세포에 형질전환 핵산 분자의 전달 방법의 일례가 미세입자 투사법이다. 상기 방법은 문헌[Yang et al., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, England (1994)]에 리뷰되어 있다. 비-생물 입자(미세투사물)를 핵산으로 코팅하고 추진력에 의해 세포내로 전달할 수 있다. 상기와 같은 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 또 다른 실시태양에서, 색소체를 안정하게 형질전환시킬 수 있다. 보다 고등 식물에서 색소체 형질전환에 대해 개시된 방법은, 선택성 마커를 함유하고 동종 재조합을 통해 상기 색소체 게놈에 대해 DNA를 표적화하는, DNA의 입자 건 전달을 포함한다(US 5,451,513, US 5,545,818, US 5,877,402, US 5,932479, 및 WO 99/05265).

식물 원형질체의 형질전환을 칼슘 포스페이트 침전, 폴리에틸렌 글리콜 처리, 일렉트로포레이션 및 이들 처리의 조합에 근거한 방법을 사용하여 성취할 수 있다. 상이한 식물 품종들에 대한 상기 시스템들의 적용은 원형질체로부터 특정한 식물 품종을 재생시키는 능력에 따라 변한다. 원형질체로부터 곡류의 재생에 대한 예시적인 방법들이 개시되어 있다(Fujimura et al., 1985; Toriyama et al., 1986; Abdullah et al., 1986).

세포 형질전환의 다른 방법들을 또한 사용할 수 있으며 여기에는 이로 제한되지 않지만, 꽃가루내로의 직접적인 DNA 전달에 의해서, 식물의 번식 기관내로의 DNA의 직접 주입에 의해서, 또는 미성숙 배의 세포내로 DNA를 직접 주입한 다음 탈수된 배의 재수화에 의해서 식물내로 DNA를 도입시킴이 포함된다.

단일 식물 원형질체 형질전환체로부터 또는 다양한 형질전환된 외식체로부터 식물의 재생, 발생, 및 배양은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(Weissbach et al., In: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, Calif., (1988)). 상기 재생 및 생육 과정은 전형적으로 형질전환된 세포의 선택, 뿌리내린 묘목 단계를 통한 배 발생의 통상적인 단계를 통해 개별화된 세포들의 배양을 포함한다. 트랜스제닉 배 및 종자는 유사하게 재생된다. 그 후에 생성된 트랜스제닉의 뿌리내린 어린싹을 토양과 같은 적합한 식물 생육 배지에 심는다.

상기 외인성, 외부 유전자를 함유하는 식물의 발생 또는 재생은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 바람직하게, 상기 재생된 식물은 자가-수분되어 동형접합성 트랜스제닉 식물을 제공한다. 달리, 상기 재생된 식물로부터 수득된 꽃가루를 작물학적으로 중요한 계통의 종자-생육된 식물과 교배한다. 환원하면, 상기 중요한 계통의 식물로부터의 꽃가루를 사용하여 재생된 식물을 수분한다. 원하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 본 발명의 트랜스제닉 식물을 당해 분야의 당업자들에게 널리 공지된 방법을 사용하여 재배한다.

주로 아그로박테리움 튜메파시엔스의 사용에 의해, 쌍떡잎을 형질전환시키고 트랜스제닉 식물을 수득하는 방법들이 목화((US 5,004,863, US 5,159,135, US 5,518,908), 대두(US 5,569,834, US 5,416,011), 배추속 식물(US 5,463,174), 땅콩(Cheng et al., 1996), 및 완두콩(Grant et al., 1995)에 대해서 공개되었다.

외인성 핵산의 도입에 의한 식물 내로의 유전자 변이 도입 및 원형질체 또는 미성숙 식물 배로부터의 식물의 재생을 위한 곡류 식물, 예를 들어 밀 및 보리의 형질전환 방법들이 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 하기를 참조한다: CA 2,092,588, AU 61781/94, AU 667939, US 6,100,447, PCT/US97/10621, US 5,589,617, US 6,541,257. 이들 재생성 밀 세포는 바람직하게는 미성숙 배, 성숙한 배의 배반, 이들로부터 유도된 캘루스, 또는 분열조직으로부터의 것이다.

트랜스제닉 세포 및 식물 중의 상기 트랜스유전자의 존재를 확인하기 위해서, 폴리머라제 쇄 반응(PCR) 증폭 또는 서던 블럿 분석을 당해 분야의 당업자들에게 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 일단 트랜스제닉 식물이 수득되었으면, 상기 식물을 원하는 표현형을 갖는 식물 조직 또는 일부분을 생산하도록 생육시킬 수 있다. 상기 식물 조직 또는 식물 일부분을 수확하고/하거나 종자를 수거할 수 있다. 상기 종자는 상기 원하는 특성들을 갖는 조직 또는 일부분을 갖는 추가의 식물들을 생육시키기 위한 공급원으로서 작용할 수 있다.

아그로박테리움 또는 다른 형질전환 방법을 사용하여 형성된 트랜스제닉 식물은 전형적으로 하나의 염색체상에 단일의 트랜스제닉 자리를 함유한다. 상기와 같은 트랜스제닉 식물을 첨가된 유전자(들)에 대해 반접합성인 것으로 칭할 수 있다. 첨가된 유전자(들)에 대해 동형접합성인 트랜스제닉 식물, 즉 하나의 염색체 쌍의 각각의 염색체상의 동일한 자리에 하나씩, 2 개의 첨가된 유전자를 함유하는 트랜스제닉 식물이 보다 바람직하다. 동형접합성 트랜스제닉 식물을, 반접합성 트랜스제닉 식물을 자가-수분하고, 생성된 종자 중 일부를 발아시키고, 목적 유전자에 대해 생성된 식물을 분석함으로써 수득할 수 있다.

2 개의 독립적으로 분리되는 외인성 유전자 또는 자리를 함유하는 2 개의 상이한 트랜스제닉 식물을 또한 교배(교잡)시켜 상기 두 유전자 또는 자리 세트를 모두 함유하는 자손을 생산할 수 있는 것으로 생각된다. 적합한 F1 자손의 자가수정은 상기 두 외인성 유전자 또는 자리에 대해 동형접합성인 식물들을 생산할 수 있다. 모체 식물에 대한 역-교배 및 비-트랜스제닉 식물과의 이종교배가 또한, 생장 번식과 같이, 고려된다. 상이한 특성 및 작물에 대해 통상적으로 사용되는 다른 육종 방법들에 대한 설명을 문헌[Fehr, In: Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987)]에서 찾을 수 있다.

잇꽃의 형질전환에 대해서, 특히 유용한 방법들이 벨리데(Belide) 등(2011)에 의해서 개시되어 있다.

TILLING

하나의 실시태양에서, TILLING(게놈 중 유도된 국소 병변의 표적화)를 사용하여 내인성 유전자, 예를 들어 Δ12 불포화효소, 팔미토일-ACP 티오에스테라제, ω6 또는 Δ6 불포화효소 활성, 또는 이들 중 2 개 이상의 조합을 암호화하는 유전자가 녹아웃된 식물을 생산할 수 있다.

첫 번째 단계에서, 도입된 돌연변이, 예를 들어 새로운 단일 염기쌍 변화를, 종자(또는 꽃가루)를 화학적 돌연변이원으로 처리하고 이어서 식물을 돌연변이가 안정하게 유전되는 세대로 진행시킴으로써 식물 집단 중에 유도한다. DNA를 추출하고, 종자를 상기 집단의 모든 구성원들로부터 저장하여 시간이 지남에 따라 반복적으로 접근할 수 있는 자원을 생성시킨다.

TILLING 분석을 위해서, PCR 프라이머를 목적의 단일 유전자 표적을 특이적으로 증폭시키도록 설계한다. 표적이 배수성 게놈의 유전자 군 또는 일부분의 구성원인 경우 특이적이 특히 중요하다. 이어서, 염료-표지된 프라이머를 사용하여 다수의 개체들로부터 모은 DNA로부터의 PCR 산물을 증폭시킬 수 있다. 이들 PCR 산물을 변성시키고 재어닐링하여 불합치된 염기쌍이 형성되게 한다. 불합치 또는 이형이중가닥은 천연 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)(즉 상기 집단으로부터 여러 식물들이 동일한 다형성을 수반하는 듯하다) 및 유도된 SNP(즉 단지 드물게 개별적인 식물들이 돌연변이를 나타내는 듯하다)를 모두 나타낸다. 이형이중가닥 형성 후에, 불합치된 DNA를 인식하여 절단하는 CelI과 같은 엔도뉴클레아제의 사용이 TILLING 집단내 신규 SNP를 발견하는 핵심이다.

상기 접근법을 사용하여, 수천의 식물들을 선별하여 임의의 유전자 또는 특정한 게놈 영역에서 단일 염기 변화뿐만 아니라 작은 삽입 또는 결실(1 내지 30 bp)을 갖는 임의의 개체를 확인할 수 있다. 분석되는 게놈 단편은 어디에서나 크기가 0.3 내지 1.6 kb의 범위일 수 있다. 분석당 8-배 풀링, 1.4 kb 단편(SNP 검출이 소음으로 인해 문제가 되는 경우 단편들의 단부는 무시함) 및 96 개 레인에서, 상기 조합은 단일 분석당 게놈 DNA의 백만개 이하의 염기쌍을 선별할 수 있게 하여, TILLING을 대량자료처리 기법으로 만든다. TILLING은 문헌[Slade and Knauf (2005)] 및 [Henikoff et al. (2004)]에 추가로 개시되어 있다.

돌연변이의 효율적인 검출을 허용하는 것 외에, 대량자료처리 TILLING 기술은 천연 다형성의 검출에 이상적이다. 따라서, 공지의 서열에의 이형이중가닥화에 의해 미지의 상동 DNA의 정보를 얻는 것은 다형성 부위의 수 및 위치를 밝혀낸다. 적어도 일부의 반복수의 다형성을 포함하여, 뉴클레오티드 변화 및 작은 삽입 및 결실이 모두 확인된다. 이를 Ecotilling 이라 칭하였다(Comai et al., 2004).

각각의 SNP를 몇 개의 뉴클레오티드내 그의 대략적인 위치에 의해 기록한다. 따라서, 각각의 단상형을 그의 이동성을 근거로 기록할 수 있다. 서열 데이터를 상기 불합치-절단 분석에 사용되는 동일한 증폭된 DNA의 분액들을 사용하여 비교적 적게 증가된 노력으로 획득할 수 있다. 단일 반응에 대한 좌측 또는 우측 서열분석 프라이머를 상기 다형성에 대한 그의 근접성에 의해 선택한다. 시퀀서 소프트웨어는 다수의 정렬을 수행하며 각각의 경우에 젤 밴드를 입증하는 염기 변화를 발견한다.

Ecotilling을 전체 서열분석보다 더 저렴하게 수행할 수 있으며, 상기 방법은 현재 대일부분의 SNP 발견에 사용된다. 돌연변이를 일으킨 식물로부터의 DNA의 풀보다는 배열된 생태형 DNA를 함유하는 플레이트를 선별할 수 있다. 검출은 거의 염기쌍 분석으로 젤상에서 수행되고 배경 패턴은 레인들에 걸쳐 균일하기 때문에, 동일한 크기를 갖는 밴드들이 합치될 수 있고, 따라서 단일 단계로 SNP를 발견하여 유전형질분석할 수 있다. 이렇게 하여, 상기 SNP의 최종적인 서열분석는 간단하고 효율적이며, 선별에 사용된 동일한 PCR 산물의 분액들에 DNA 서열분석를 가할 수 있다는 점에서 보다 더 그렇다.

돌연변이유발 과정

돌연변이 식물 계통을 발생시키기 위한 기법들은 당해 분야에 공지되어 있다. 돌연변이 식물을 생산하기 위해 사용될 수 있는 돌연변이원의 예는 조사 및 화학적 돌연변이유발을 포함한다. 돌연변이체는 또한 T-DNA 삽입 및 트랜스포손-유발 돌연변이 유발과 같은 기법들에 의해 생산될 수 있다. 식물에서 임의의 원하는 유전자의 돌연변이를 당해 분야에 공지된 바와 같은 인공 아연 집게 뉴클레아제(ZFN), TAL 효과기(TALEN) 또는 CRISPR 기술(Cas9 유형 뉴클레아제)에 의해 부위-특이적 방식으로 도입시킬 수 있다. 상기 돌연변이유발 과정을 식물 중 임의의 모체 세포상에서, 예를 들어 조직 배양물 중 종자 또는 모체 세포상에서 수행할 수 있다.

화학적 돌연변이원은 화학적 성질, 예를 들어 알킬화제, 가교연결제 등에 의해 분류할 수 있다. 유용한 화학적 돌연변이원은 이로 제한되지 않지만, N-에틸-N-나이트로소유레아(ENU); N-메틸-N-나이트로소유레아(MNU); 프로카바진 하이드로클로라이드; 클로람부실; 사이클로포스파미드; 메틸 메탄설포네이트(MMS); 에틸 메탄설포네이트(EMS); 다이에틸 설페이트; 아크릴아미드 단량체; 트라이에틸렌 멜라민(TEM); 멜팔란; 질소 머스터드; 빈크리스틴; 다이메틸니트로소아민; N-메틸-N'-나이트로-나이트로소구아니딘(MNNG); 7,12 다이메틸벤즈안트라센(DMBA); 에틸렌 옥사이드; 헥사메틸포스포아미드; 및 바이설판을 포함한다.

돌연변이를 유발하기에 적합한 조사의 예는 세슘 137 원에 의해 공급되는 것과 같은 감마선에 의한다. 상기 감마선은 바람직하게는 상기 식물세포에 대략 60 내지 200 Krad.의 투여량, 및 가장 바람직하게는 대략 60 내지 90 Krad.의 투여량으로 공급된다.

식물을 전형적으로는 원하는 유전자 변형을 완수하기에 충분하지만, 세포의 생육성 및 식물로 재생되는 그의 능력을 완전히 파괴하기에는 불충분한 지속기간 동안 돌연변이원에 노출시킨다.

상기 개시된 돌연변이유발 과정은 전형적으로 1000 개 식물 중 적어도 1 개의 빈도로 목적 유전자의 돌연변이를 발생시키며, 이는 상기 식물의 돌연변이된 집단의 선별이 임의의 목적 유전자의 돌연변이체를 확인하기에 실용적인 수단임을 의미한다. 상기 돌연변이체의 확인을 또한 대량의 병행 뉴클레오티드 서열분석 기술에 의해 성취할 수 있다.

마커 지원 선택

마커 지원 선택은 고전적인 품종개량 프로그램에서 반복친과의 역교배시 필요한 이형접합성 식물에 대해 널리 인정된 선택 방법이다. 각각의 역교배 세대의 식물 집단은 역교배 집단에서 1:1 비로 통상적으로 존재하는 목적 유전자에 대해 이형접합성일 것이며, 분자 마커를 사용하여 상기 유전자의 2 개의 대립유전자를 구별할 수 있다. 예를 들어 어린 새싹으로부터 DNA를 추출하고 침투된 바람직한 특성에 대해서 특이적 마커로 시험함으로써, 보다 적은 식물에 에너지와 자원을 집중시키면서 추가의 역교배를 위한 식물의 조기 선택이 이루어진다. 상기 역교배 프로그램을 더욱 가속화하기 위해서, 미성숙 종자(개화 25일 후)로부터 배를 절제하고, 완전한 종자 성숙을 허용하기 보다는 멸균 조건 하에서 영양 배지상에서 증식시킬 수 있다. 3엽 단계에서 DNA 추출과 함께 사용되는 상기 과정("배 회생"이라 칭함) 및 원하는 유전자형에 대한 분석은 원하는 특성을 갖는 식물을 빠르게 선택할 수 있게 하며, 상기 식물을 상기 반복친에 대한 후속의 역교배를 위해서 온실이나 필드에서 성숙하게 육성시킬 수 있다.

FAD2, FATB 또는 FAD6 유전자를 검출할 수 있는 당해 분야에 공지된 임의의 분자 생물학 기법을 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 상기와 같은 방법은 이로 제한되지 않지만, 핵산 증폭, 핵산 서열분석, 적합하게 표지된 탐침과의 핵산 하이브리드화, 단일 가닥 구조 분석(SSCA), 변성제 농도 구배 젤 전기영동(DGGE), 이형이중가닥 분석(HET), 화학적 절단 분석(CCM), 촉매 핵산 절단 또는 이들의 조합을 사용함을 포함한다(예를 들어 문헌[Lemieux, 2000]; [Langridge et al., 2001]을 참조한다). 본 발명은 또한 원하는 표현형을 부여하는 (예를 들어) FAD2, FATB 또는 FAD6 유전자의 대립유전자에 연결된 다형성을 검출하기 위한 분자 마커 기법의 용도를 포함한다. 상기와 같은 방법은 제한 단편 길이 다형성(RFLP), RAPD, 증폭된 단편 길이 다형성(AFLP) 및 미소부수체(간단한 서열 반복부, SSR) 다형성의 검출 또는 분석을 포함한다. 상기 가깝게 연계된 마커들을 당해 분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어 문헌[Langridge et al.(2001)]에 리뷰된 바와 같은, 벌크 분리자 분석에 의해 쉽게 수득할 수 있다.

"폴리머라제 쇄 반응"("PCR")은 복제 사본을 "상류" 및 "하류" 프라이머로 이루어지는 "한 쌍의 프라이머" 또는 "프라이머 세트", 및 중합 촉매, 예를 들어 DNA 폴리머라제, 및 전형적으로 열-안정성 폴리머라제 효소를 사용하여 표적 뉴클레오티드를 제조하는 반응이다. PCR에 대한 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌["PCR" (Ed. MJ McPherson and SG Moller (2000) BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford)]에 교시되어 있다. PCR을 식물 세포로부터 단리된 역전사 mRNA로부터 수득된 cDNA 상에서 수행할 수 있다. 그러나, PCR을 식물로부터 단리된 게놈 DNA상에서 수행하는 것이 일반적으로 더 용이할 것이다.

프라이머는 표적 서열에 서열 특이적인 방식으로 하이브리드화할 수 있고 PCR 동안 연장될 수 있는 올리고뉴클레오티드 서열이다. 앰플리콘 또는 PCR 산물 또는 PCR 단편 또는 증폭 산물은 상기 프라이머 및 새롭게 합성된 표적 서열의 사본을 포함하는 연장 산물이다. 다중 PCR 시스템은 하나 이상의 앰플리콘을 동시에 생성시키는 다수의 프라이머들의 세트를 함유한다. 프라이머는 표적 서열에 완벽하게 동일되거나 또는 특정한 표적 서열 중의 제한 효소 또는 촉매 핵산 인식/절단 부위를 도입시킬 수 있는 내부 불합치 염기를 함유할 수도 있다. 프라이머는 또한 앰플리콘의 포획 또는 검출을 용이하게 하기 위해서 추가적인 서열을 함유하고/하거나 변형된 또는 표지된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 상기 DNA의 열 변성, 프라이머의 그의 상보성 서열에의 어닐링 및 폴리머라제에 의한 상기 어닐링된 프라이머의 연장의 반복된 주기는 표적 서열의 기하급수적인 증폭을 생성시킨다. 표적 또는 표적 서열 또는 주형이란 용어는 증폭되는 핵산 서열을 지칭한다.

뉴클레오티드 서열의 직접 서열분석 방법은 당해 분야의 당업자들에게 널리 공지되어 있으며 예를 들어 상기 문헌 [Ausubel et al.] 및 [Sambrook et al.]에서 찾을 수 있다. 서열분석를 임의의 적합한 방법, 예를 들어 다이데옥시 서열분석, 화학적 서열분석 또는 그의 변형에 의해 수행할 수 있다. 직접 서열분석는 특정 서열의 임의의 염기쌍 중 변화를 측정하는 이점을 갖는다.

하이브리드화 기재 검출 시스템은 이로 제한되지 않지만, TaqMan 분석 및 분자 비콘 분석(US 5,925,517)을 포함한다. 상기 TaqMan 분석(US 5,962,233)은 염료쌍이 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 통해 상호작용하도록, 한쪽 단부상에 공여 염료 및 다른쪽 단부상에 수용 염료를 갖는 대립유전자 특이적(ASO) 탐침을 사용한다.

하나의 실시태양에서, 실시예 7에 개시된 방법을 ol 돌연변이를 갖는 잇꽃 식물을 확인하고 선택하기 위해서 선택 및 품종개량 프로그램에 사용한다. 예를 들어, 상기 방법은 하기 프라이머 세트 중 하나 또는 둘 다를 사용하여 식물로부터 수득된 게놈 DNA상에서 증폭 반응을 수행함을 포함한다:

i) 5'-ATAAGGCTGTGTTCACGGGTTT-3'(서열번호 140) 및 5'-GCTCAGTTGGGGATACAAGGAT-3'(서열번호 141), 및

ii) 5'-AGTTATGGTTCGATGATCGACG-3'(서열번호 142) 및 5'-TTGCTATACATATTGAAGGCACT-3'(서열번호 143).

폴리펩티드

"폴리펩티드" 및 "단백질"이란 용어는 일반적으로 호환적으로 사용된다.

폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 부류는 기준 아미노산 서열에 대한 그의 아미노산 서열의 동일 정도(동일성퍼센트)에 의해서, 또는 또 다른 경우보다 하나의 기준 아미노산에 대해 더 큰 동일성퍼센트를 갖는 것으로써 정의될 수 있다. 기준 아미노산 서열에 대한 폴리펩티드의 동일성퍼센트을 전형적으로는 중단 발생 벌점 = 5 및 중단 연장 벌점 = 0.3의 매개변수를 갖는 GAP 분석(Needleman and Wunsch, 1970; GCG 프로그램)에 의해 측정한다. 조회 서열은 적어도 100 개의 아미노산 길이이며 GAP 분석은 상기 두 서열을 적어도 100 개의 아미노산의 영역에 걸쳐 정렬시킨다. 훨씬 더 바람직하게는, 상기 조회 서열은 길이가 적어도 250 개의 아미노산이며 상기 GAP 분석은 상기 두 서열을 적어도 250 개의 아미노산의 영역에 걸쳐 정렬시킨다. 훨씬 더 바람직하게는, 상기 GAP 분석은 2 개의 서열을 그들의 전체 길이에 걸쳐 정렬시킨다. 상기 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 부류는 기준 폴리펩티드와 동일한 활성을 갖거나, 또는 이와 상이한 활성을 갖거나, 또는 상기 활성이 없을 수도 있다. 바람직하게, 상기 폴리펩티드는 상기 기준 폴리펩티드의 활성의 10% 이상의 효소 활성을 갖는다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "생물학적 활성 단편"은 완전 길이 기준 폴리펩티드의 한정된 활성, 예를 들어 Δ12 불활성효소, 팔미토일-ACP 티오에스테라제 또는 Δ6 불활성효소 활성을 유지하는 본 발명의 폴리펩티드의 일부이다. 본 발명에 사용된 바와 같은 생물학적 활성 단편은 완전 길이 폴리펩티드를 제외한다. 생물학적 활성 단편은 상기가 상기 한정된 활성을 유지하는 한 임의의 크기 일부분일 수 있다. 바람직하게, 상기 생물학적 활성 단편은 완전 길이 폴리펩티드의 활성의 10% 이상을 유지한다.

한정된 폴리펩티드 또는 효소에 관하여, 본 발명에 제공된 경우보다 더 큰 동일성퍼센트 숫자가 바람직한 실시태양을 포함함을 알 것이다. 따라서, 적용 가능한 경우, 최소 동일성퍼센트 숫자에 비추어, 상기 폴리펩티드/효소가 관련하는 지명된 서열번호에 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 65% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 91%, 보다 바람직하게는 적어도 92%, 보다 바람직하게는 적어도 93%, 보다 바람직하게는 적어도 94%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 96%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99%, 보다 바람직하게는 적어도 99.1%, 보다 바람직하게는 적어도 99.2%, 보다 바람직하게는 적어도 99.3%, 보다 바람직하게는 적어도 99.4%, 보� � 바람직하게는 적어도 99.5%, 보다 바람직하게는 적어도 99.6%, 보다 바람직하게는 적어도 99.7%, 보다 바람직하게는 적어도 99.8%, 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 99.9% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에 정의된 폴리펩티드의 아미노산 서열 돌연변이체를, 적합한 뉴클레오티드 변화를 본 발명에 정의된 핵산에 도입시키거나, 또는 원하는 폴리펩티드의 시험관내 합성에 의해 제조할 수 있다. 상기와 같은 돌연변이체는 예를 들어 상기 아미노산 서열내 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 조합을, 최종 폴리펩티드 산물이 원하는 특성을 갖는 한, 최종 구조물에 도달하게 만들 수 있다.

돌연변이(변경된) 폴리펩티드를 당해 분야에 공지된 임의의 기법을 사용하여, 예를 들어 방향 진화 또는 합리적인 설계 전략(하기 참조)을 사용하여 제조할 수 있다. 돌연변이된/변경된 DNA로부터 유도된 산물을, 상기가 Δ12 불활성효소, 팔미토일-ACP 티오에스테라제 또는 ω6Δ6 불활성효소 활성을 갖는지 또는 갖지 않는지를 결정하기 위해서 본 발명에 개시된 기법을 사용하여 쉽게 선별할 수 있다.

아미노산 서열 돌연변이체 설계에서, 상기 돌연변이 부위의 위치 및 상기 돌연변이의 성질은 변형되는 특성(들)에 따라 변할 것이다. 상기 돌연변이 부위를 예를 들어 (1) 먼저 보존적 아미노산 선택, 및 이어서 성취되는 결과에 따른 보다 근본적인 선택으로 치환하거나, (2) 표적 잔기를 결실시키거나, 또는 (3) 배치된 부위에 인접하여 다른 잔기들을 삽입함으로써 개별적으로 또는 연속해서 변형시킬 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 비-보존적인 치환의 사용은 감소된 효소 활성을 갖는 돌연변이체를 생성시키는 경우 사용될 수 있다.

아미노산 서열 결실은 일반적으로 약 1 내지 15 잔기, 보다 바람직하게는 약 1 내지 10 잔기, 및 전형적으로 약 1 내지 5의 연속적인 잔기의 범위일 수 있으나, 특히 상기 돌연변이체를 효소 활성을 감소시키도록 설계하는 경우 훨씬 더 길 수도 있다.

치환 돌연변이체는 폴리펩티드 중에 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되고 대신에 상이한 잔기가 삽입된다. 효소를 불활성화시키기 위한 치환 돌연변이유발에 가장 크게 중요한 부위는 활성 부위(들)로서 확인된 부위를 포함한다. 다른 목적 부위들은 다양한 계통 또는 종들로부터 획득된 특정 잔기들이 동일한 부위들이다. 이들 위치는 생물학적 활성에 중요할 수 있다. 보존적 치환을 표 1에 나타내는 반면, 비-보존적 치환은 보존적 치환이 아닌 치환들이다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 Δ12 불활성효소이며 서열번호 27 내지 34, 36 및 37의 하나 이상에 제공된 바와 같은 서열을 갖는 아미노산, 그의 생물학적 활성 단편, 또는 서열번호 27 내지 34, 36 및 37 중 임의의 하나 이상과 적어도 40% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 유지종자 식물의 종자(유지종자) 중에 존재하는 올리에이트 Δ12 불활성효소이며 서열번호 27, 28 및 36의 하나 이상에 제공된 바와 같은 서열을 갖는 아미노산, 그의 생물학적 활성 단편, 또는 서열번호 27, 28 및 36 중 임의의 하나 이상과 적어도 40% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 37에 제공된 바와 같은 서열을 갖는 아미노산, 그의 생물학적 활성 단편, 또는 서열번호 37과 적어도 40% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 Δ12-아세틸레나제이다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 35에 제공된 바와 같은 서열을 갖는 아미노산, 그의 생물학적 활성 단편, 또는 서열번호 35와 적어도 40% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 팔미트올리에이트 Δ12 불포화효소이다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 44 및 45 중 어느 하나에 제공된 바와 같은 서열을 갖는 아미노산, 그의 생물학적 활성 단편, 또는 서열번호 44 및 45 중 어느 하나와 적어도 40% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 팔미토일-ACP 티오에스테라제(FATB)이다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 45에 제공된 바와 같은 서열을 갖는 아미노산, 그의 생물학적 활성 단편, 또는 서열번호 45와 적어도 40% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 유지종자 식물의 종자 중에 존재하는 팔미토일-ACP 티오에스테라제(FATB)이다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 48에 제공된 바와 같은 서열을 갖는 아미노산, 그의 생물학적 활성 단편, 또는 서열번호 48과 적어도 40% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 Δ6 불활성효소이다.

본 발명의 효소들의 바람직한 특성들을 잇꽃 FAD2와 관련하여 실시예 섹션, 특히 실시예 2에 제공한다.

본 발명에 개시된 바와 같은 폴리펩티드는 적어도 하나의 다른 폴리펩티드에 대한 융합물로서 나타낼 수도 있다. 바람직한 실시태양에서, 적어도 하나의 다른 폴리펩티드는 상기 융합 단백질의 안정성을 증대시키는 폴리펩티드, 및 상기 융합 단백질의 정제를 지원하는 폴리펩티드로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.

올레산이 많은 지질 및/또는 오일의 제조

당해 분야에서 통상적으로 실시되는 기법들을 사용하여 본 발명의 식물, 특히 종자에 의해 생산되는 지질을 추출, 처리, 정제 및 분석할 수 있다. 상기와 같은 기법들은 하기와 같은 출처들의 문헌 전체를 통해 개시되고 설명된다: Fereidoon Shahidi, Current Protocols in Food Analytical Chemistry, John Wiley & Sons, Inc. (2001) D1.1.1-D1.1.11, and Perez-Vich et al. (1998).

종자오일의 제조

전형적으로, 식물 종자를 쿠킹하고, 압착하고/하거나 추출하여 조 종자오일을 생성시키고, 이어서 정련, 정제, 표백 및 탈취시킨다. 일반적으로, 종자 파쇄 기법은 당해 분야에 알려져 있다. 예를 들어, 유지종자를 물로 분무하여 수분 함량을 예를 들어 8.5%까지 상승시킴으로써 불리고, 0.23 내지 0.27 ㎜의 간격 설정을 갖는 매끄러운 롤러를 사용하여 박편화하였다. 종자의 유형에 따라, 물을 파쇄 전에 가하지 않을 수도 있다. 열을 적용하여 효소를 불활성화시키고, 추가적인 세포 파괴를 촉진하고, 지질 소적을 유합시키고, 단백질 입자를 응집시키며, 이들은 모두 추출 공정을 용이하게 한다.

하나의 실시태양에서, 상기 종자오일의 대일부분이 스크류 프레스를 통과하여 방출된다. 이어서 상기 스크류 프레스로부터 배출된 덩어리를, 예를 들어 헥산으로, 열 추적 컬럼을 사용하여 용매 추출한다. 한편으로, 상기 압착 작업에 의해 생성된 조 종자오일을, 상기 압착 작업 동안 상기 종자오일과 함께 압착된 고체를 제거하기 위해서 슬롯망 배수 탑이 있는 침전조에 통과시킬 수 있다. 상기 압착 및 추출로부터의 고체 잔사는 상기 헥산의 제거 후에 종자밀로 되며, 이는 전형적으로 동물 사료로 사용된다. 상기 클래리파이드 종자오일 (clarified seedoil)을 평판형 필터에 통과시켜 임의의 잔류 미세 고체 입자를 제거할 수 있다. 경우에 따라, 상기 추출 공정으로부터 회수된 종자오일을 상기 클래리파이드 종자오일과 합하여 블렌딩된 조 종자오일을 생성시킬 수 있다.

일단 용매가 상기 조 종자오일로부터 스트리핑되면, 상기 압착되고 추출된 일부분들을 합하고 통상적인 지질 처리 과정, 예를 들어 정련, 가성 정제, 표백 및 탈취를 가한다. 일부 또는 모든 단계를 생성물 경로의 성질에 따라 생략할 수도 있으며, 예를 들어 사료 등급 오일의 경우 제한된 처리가 필요할 수도 있는 반면 함유화학제품 용도의 경우, 보다 많은 정제 단계들이 요구된다.

정련

정련은 오일의 정제에서 초기 단계이며 그의 주목적은 상기 오일로부터 대일부분의 인지질(전체 추출된 지질의 대략 1 내지 2%로서 존재할 수 있다)을 제거하는 것이다. 70 내지 80 ℃에서, 전형적으로 인산을 함유하는, 약 2%의 물을 상기 조 오일에 첨가하여 미량 금속 및 안료에 의해 동반되는 인지질의 대일부분을 분리시킨다. 제거되는 불용성 물질은 주로 인지질과 트라이아실글리세롤의 혼합물이며 또한 레시틴으로서 공지되어 있다. 정련은 농축된 인산을 조 종자오일에 가하여 비-수화성 포스파티드를 수화성 형태로 전환시키고, 존재하는 소량 금속을 킬레이트화함으로써 수행될 수 있다. 원심분리에 의해 상기 종자오일로부터 검이 분리된다.

알칼리 정제

알칼리 정제는 조 오일의 처리를 위한 정제 공정들 중 하나(때때로 또한 중화라고도 칭함)이다. 상기는 대개 정련에 이어지고 표백에 선행한다. 정련에 이어서, 상기 종자오일을, 상기 지방산 및 인산 모두를 적정하기에 충분한 양의 알칼리 용액을 첨가하고 따라서 형성된 비누를 제거함으로써 처리할 수 있다. 적합한 알칼리성 물질은 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 탄산 나트륨, 수산화 리튬, 수산화 칼슘, 탄산 칼슘 및 수산화 암모늄을 포함한다. 상기 공정은 전형적으로는 실온에서 수행되며 유리 지방산 분획을 제거한다. 비누는 원심분리에 의해서 또는 상기 비누에 대한 용매내로의 추출에 의해서 제거되며, 중화된 오일을 물로 세척한다. 경우에 따라, 상기 오일 중 임의의 과잉 알칼리를 적합한 산, 예를 들어 염산 또는 황산으로 중화시킬 수도 있다.

표백

표백은 오일을 90 내지 120 ℃에서 10 내지 30 분 동안 표백토(0.2 내지 2.0%)의 존재 하에서 및 질소 또는 증기와 함께 또는 진공 하에서 작동시킴으로써 산소의 부재 하에서 가열하는 정제 공정이다. 오일 가공처리에서 상기 단계는 불필요한 색소(카로티노이드, 클로로필, 고시폴 등)를 제거하도록 설계되며 상기 공정은 또한 산화 생성물, 미량 금속, 황 화합물 및 잔량의 비누를 제거한다.

탈취

탈취는 고온(200 내지 260 ℃) 및 저압(0.1 내지 1 mmHg)에서의 오일 및 지방의 처리이다. 이는 전형적으로 상기 종자오일내로 증기를 약 0.1 ㎖/분/100 ㎖ 종자오일의 속도로 도입시킴으로써 성취된다. 약 30 분의 살포 후에, 상기 종자오일을 진공 하에서 냉각시킨다. 상기 종자오일을 전형적으로는 유리 용기로 옮기고 아르곤으로 플러싱시킨 후에 냉장 하에서 보관한다. 이러한 처리는 상기 종자오일의 색상을 개선시키고 임의의 잔류 유리 지방산, 모노아실글리세롤 및 산화 생성물을 포함하는 휘발성 물질 또는 냄새나는 화합물의 대일부분을 제거한다.

동결방지 처리

동결방지 처리는 때때로 주변 온도 이하의 온도에서 결정화에 의해 오일 및 지방의 고체(스테아린) 및 액체(올레인) 분획으로의 분리를 위해 오일의 상업적인 생산에 사용되는 공정이다. 이는 원래 고체-부재 생성물을 생성시키기 위해 면실유에 적용되었다. 이를 전형적으로는 오일의 포화 지방산 함량을 감소시키기 위해 사용한다.

트랜스에스테르화

트랜스에스테르화는 초기에 TAG로부터 지방산을 유리 지방산으로서 또는 지방산 에스테르, 대개는 지방산 에틸 에스테르로서 방출시킴으로써 TAG 내 및 TAG 간 지방산을 교환하는 공정이다. 분별 공정과 병행시, 트랜스에스테르화를 사용하여 지질의 지방산 조성을 변형시킬 수 있다(Marangoni et al., 1995). 트랜스에스테르화는 화학적 또는 효소적 수단을 사용할 수 있으며, 후자는 TAG 상의 지방산에 대해 위치-특이적(sn-1/3 또는 sn-2 특이적)일 수 있는 리파제를 사용하거나, 또는 다른 것들에 대해 일부 지방산에 바람직하다(Speranza et al, 2012). 오일 중 LC-PUFA의 농도를 증가시키기 위한 상기 지방산 분별은 당해 분야에 공지된 방법들 중 어느 하나, 예를 들어 동결 결정화, 유레아를 사용하는 복합체 형성, 분자 증류, 초임계 유체 추출 및 은 이온 복합화에 의해 성취될 수 있다. 유레아와의 복합체 형성이 그의 간편성 및 오일 중 포화 및 일가불포화 지방산 수준의 감소에서의 효율성으로 인해 바람직한 방법이다(Gamez et al., 2003). 처음에, 상기 오일의 TAG를 그의 구성 지방산, 종종 지방산 에스테르의 형태로 가수분해에 의해서 또는 리파제에 의해서 분할하고 이어서 상기 유리 지방산 또는 지방산 에스테르를 복합체 형성을 위해 유레아의 에탄올 용액과 혼합한다. 상기 포화 및 일가불포화된 지방산은 유레아와 쉽게 복합화하며 냉각시 결정화되고 후속으로 여과에 의해 제거될 수 있다. 이에 의해 상기 비-유레아 복합화된 분획은 LC-PUFA가 농축된다.

수소화

지방산의 수소화는 전형적으로 촉매의 존재 하에서 수소에 의한 처리를 수반한다. 비-촉매 수소화는 오직 매우 높은 온도에서만 발생한다.

수소화는 식물 오일의 가공처리에 흔히 사용된다. 수소화는 불포화 지방산을 포화 지방산으로 전환시키며, 일부의 경우에 트랜스 지방으로 전환시킨다. 수소화 결과 액체 식물 오일이 고체 또는 반-고체 지방, 예를 들어 마가린에 존재하는 것들로 전환된다. 상기 지방의 포화 정도의 변화는 일부 중요한 물성들, 예를 들어 용융 범위를 변화시키며, 이것이 액체 오일이 반-고체로 되는 이유이다. 고체 또는 반-고체 지방은 베이킹에 바람직한데, 그 이유는 상기 지방을 밀가루와 혼합하는 방식이 베이킹된 제품에서 보다 바람직한 질감을 생성시키기 때문이다. 일부분적으로 수소화된 식물성 오일이 동물성 지방보다 더 저렴하고, 광범위한 점조도로 입수할 수 있으며, 다른 바람직한 특성들(예를 들어 증가된 산화 안정성/보다 긴 저장 수명)을 갖기 때문에, 대일부분의 상업적인 베이킹된 상품들에 쇼트닝으로서 사용되는 우세한 지방이다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 지질/오일은 수소화되지 않았다. 지질 또는 오일이 수소화되지 않았다는 표시는 그의 TAG 중에 어떠한 트랜스 지방산도 없다는 것이다.

지질의 용도

본 발명에 개시된 방법들에 의해 생산된 종자오일, 바람직하게는 잇꽃 종자오일과 같은 지질은 다양한 용도를 갖는다. 일부의 실시태양에서, 상기 지질은 식품 오일로서 사용된다. 다른 실시태양에서, 상기 지질은 윤활제로서 또는 플라스틱의 합성과 같은 다른 산업적인 용도를 위해 정제되고 사용된다. 상기를 화장품, 비누, 섬유 유연제, 전기 절연 또는 세제의 제조에 사용할 수도 있다. 상기를 계면활성제 또는 유화제와 같은 농약의 생산에 사용할 수도 있다. 일부 실시태양에서, 상기 지질을 정제하여 바이오디젤을 생성시킨다. 본 발명의 오일은, 리놀렌산의 부재가 쉽게 변색되지 않음을 의미하기 때문에, 도료 또는 바니쉬에 유리하게 사용될 수 있다.

본 발명의 방법을 사용하여 제조된 공업용 제품은 탄화수소 생성물, 예를 들어 지방산 에스테르, 바람직하게는 지방산 메틸 에스테르 및/또는 지방산 에틸 에스테르, 알칸, 예를 들어 메탄, 에탄 또는 장쇄 알칸, 장쇄 알칸들의 혼합물, 알켄, 바이오연료, 일산화 탄소 및/또는 수소 기체, 바이오알콜, 예를 들어 에탄올, 프로판올 또는 부탄올, 바이오목탄, 또는 일산화 탄소, 수소 및 바이오목탄의 조합일 수 있다. 상기 공업용 제품은 이들 성분들의 임의의 혼합물, 예를 들어 알칸들의 혼합물, 또는 알칸과 알켄의 혼합물, 바람직하게는 우세하게(>50%) C4-C8 알칸, 또는 우세하게 C6 내지 C10 알칸, 또는 우세하게 C6 내지 C8 알칸인 혼합물일 수 있다. 상기 공업용 제품은 이산화 탄소가 아니고 물이 아니지만, 이들 분자가 상기 공업용 제품과 함께 생성될 수도 있다. 상기 공업용 제품은 대기압/실온에서 기체, 또는 바람직하게는 액체 또는 고체, 예를 들어 바이오목탄이거나, 또는 상기 공정은 기체 성분, 액체 성분 및 고체 성분, 예를 들어 일산화 탄소, 수소 기체, 알칸 및 바이오목탄의 조합을 생성시킬 수 있고, 이들을 후속으로 분리시킬 수도 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 탄화수소 생성물은 우세하게는 지방산 메틸 에스테르이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 탄화수소 생성물은 지방산 메틸 에스테르 외의 생성물이다.

열은, 예를 들어 열분해, 연소, 기체화와 같은 공정에서 또는 효소적 소화(혐기성 소화, 퇴비화, 발효)와 함께 적용할 수도 있다. 보다 저온의 기체화는 예를 들어 약 700 내지 약 1000 ℃에서 발생한다. 보다 고온의 기체화는 예를 들어 약 1200 내지 약 1600 ℃에서 발생한다. 보다 저온의 열분해(보다 느린 열분해)는 약 400 ℃에서 발생하는 반면, 보다 고온의 열분해는 약 500 ℃에서 발생한다. 중온 소화는 약 20 내지 약 40 ℃에서 발생한다. 호열성 소화는 약 50 내지 약 65 ℃에서 발생한다.

화학적 수단은 이로 제한되지 않지만, 촉매 분해, 혐기성 소화, 발효, 퇴비화 및 트랜스에스테르화를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 화학적 수단은 촉매 또는 촉매들의 혼합물을 사용하며, 이들을 열과 함께 적용할 수도 있다. 상기 공정은 동종 촉매, 이종 촉매 및/또는 효소 촉매를 사용할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 촉매는 전이금속 촉매, 분자체 유형 촉매, 활성화된 알루미나 촉매 또는 촉매로서 탄산 나트륨이다. 촉매는 산 촉매, 예를 들어 황산 또는 알칼리 촉매, 예를 들어 수산화 칼륨 또는 나트륨 또는 다른 수산화물을 포함한다. 상기 화학적 수단은 상기 지질 중 지방산의 트랜스에스테르화를 포함할 수 있으며, 상기 공정은 동종 촉매, 이종 촉매 및/또는 효소 촉매를 사용할 수 있다. 상기 전환은 열분해를 포함할 수 있으며, 이는 열을 적용하고 화학적 수단을 적용할 수 있으며 전이 금속 촉매, 분자체 유형 촉매, 활성화된 알루미나 촉매 및/또는 촉매로서 탄산 나트륨을 사용할 수 있다.

효소적 수단은 이로 제한되지 않지만, 예를 들어 혐기성 소화 발효 또는 퇴비화에서 미생물에 의한 소화, 또는 재조합 효소 단백질에 의한 소화를 포함한다.

바이오연료

본 발명에 사용된 바와 같이 "바이오연료"란 용어는 바이오디젤 및 바이오알콜을 포함한다. 바이오디젤은 식물, 조류 및 진균으로부터 유래된 오일로부터 제조할 수 있다. 바이오알콜은 당의 발효로부터 생산된다. 상기 당은 식물(예를 들어 사탕수수)로부터 직접 추출되거나, 식물 전분(예를 들어 옥수수 또는 밀)로부터 유도되거나, 또는 셀룰로스(예를 들어 목재, 잎 또는 줄기)로부터 제조될 수 있다.

바이오연료는 현재 석유 연료보다 생산에 비용이 더 많이 든다. 가공처리 비용 외에, 바이오연료 작물은 조림, 수정, 살충제 및 제초제 적용, 수확 및 운반을 요한다. 본 발명의 식물, 조류 및 진균은 바이오연료의 생산 비용을 감소시킬 수 있다.

바이오연료의 생산에 대한 일반적인 방법은 예를 들어 하기의 문헌들에서 찾을 수 있다: Maher and Bressler (2006), Maher and Bressler (2007), Greenwell et al. (2011), Karmakar et al. (2010), Alonso et al. (2010), Lee and Mohamed (2010), Liu et al. (2010), Gong and Jiang (2011), Endalew et al. (2011) 및 Semwal et al. (2011).

바이오디젤

바이오디젤, 또는 알킬 에스테르의 생산은 널리 알려져 있다. 지질로부터 에스테르의 생성에 대한 3 가지 기본적인 경로가 존재한다: 1) 상기 지질과 알콜의 염기 촉매화된 트랜스에스테르화; 2) 상기 지질과 메탄올의 직접적인 산 촉매화된 트랜스에스테르화; 및 3) 산 촉매화에 의한 상기 지질의 지방산으로, 및 이어서 알킬 에스테르로의 전환.

지방산 알킬 에스테르 및 글리세릴 에테르(여기서 글리세롤상의 하이드록시기의 하나, 둘 또는 세 개가 에테르화된다)의 임의의 제조 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 지방산을, 예를 들어 트라이글리세라이드를 각각 산 또는 염기 촉매로 가수분해 또는 비누화시키거나, 또는 리파제 또는 에스테라제와 같은 효소를 사용함으로써 제조할 수 있다. 지방산 알킬 에스테르는 지방산을 산 촉매의 존재 하에서 알콜과 반응시켜 제조할 수 있다. 지방산 알킬 에스테르를 또한 트라이글리세라이드를 산 또는 염기 촉매의 존재 하에서 알콜과 반응시켜 제조할 수 있다. 글리세롤 에테르를, 예를 들어 글리세롤을 염기의 존재 하에서 알킬 할라이드와, 또는 산 촉매의 존재 하에서 올레핀 또는 알콜과 반응시켜 제조할 수 있다.

일부 바람직한 실시태양에서, 상기 지질을 트랜스에스테르화시켜 메틸 에스테르 및 글리세롤을 생성시킨다. 일부 바람직한 실시태양에서, 상기 지질을 알콜(예를 들어 메탄올 또는 에탄올)과, 촉매(예를 들어 수산화 칼륨 또는 나트륨)의 존재 하에서 반응시켜 알킬 에스테르를 생성시킨다. 상기 알킬 에스테르를 바이오디젤용으로 사용하거나 또는 석유 기재 연료와 블렌딩할 수 있다.

상기 알킬 에스테르를 디젤 연료와 직접 블렌딩하거나, 또는 블렌딩 전에 물 또는 다른 수용액으로 세척하여, 촉매를 포함한 다양한 불순물들을 제거할 수 있다. 산 촉매를 염기로 중화시키는 것이 가능하다. 그러나, 상기 공정은 염을 생성시킨다. 엔진 부식을 피하기 위해서, 연료 첨가제 조성물 중의 상기 염 농도를 최소화하는 것이 바람직할 수 있다. 염을, 예를 들어 상기 조성물을 물로 세척함으로써, 상기 조성물로부터 실질적으로 제거할 수 있다.

또 다른 실시태양에서, 상기 조성물을 세척 후에, 예를 들어 황산 칼슘과 같은 건조제에 통과시킴으로써 건조시킨다.

더욱 또 다른 실시태양에서, 중성 연료 첨가제를, 염을 생성시키지 않거나 세척 단계를 사용하지 않고, 중합체성 산, 예를 들어 설폰산기를 함유하는 수지인 다우엑스(Dowex) 50(상표)을 사용함으로써 수득한다. 상기 촉매는 상기 에스테르화 및 에테르화 반응의 완료 후에 여과에 의해 쉽게 제거된다.

바이오연료 공급원으로서 식물 트라이아실글리세롤

바이오연료의 생산을 위한 식물 트라이아실글리세롤의 용도는 문헌[Durrett et al.(2008)]에서 검토되어 있다. 간단히, 식물 오일은 주로 다양한 트라이아실글리세롤(TAG), 즉 글리세롤로 에스테르화된 3 개의 지방산 쇄(대개 18 또는 16 탄소 길이)로 이루어지는 분자로 구성된다. 상기 지방 아실 쇄는 가솔린 및 디젤에서 발견되는 상기 분자의 부피를 구성하는 지방족 탄화수소와 화학적으로 유사하다. 상기 가솔린 중의 탄화수소는 분자당 5 내지 12 개의 탄소 원자를 함유하며, 상기 휘발성 연료는 통상적인 엔진에서 공기와 혼합되고 스파크에 의해 점화된다. 대조적으로, 디젤 연료 성분은 전형적으로 분자당 10 내지 15 개의 탄소 원자를 가지며 디젤 엔진에서 획득된 매우 높은 압축에 의해 점화된다. 그러나, 대일부분의 식물 TAG는 통상적인 디젤의 경우보다 훨씬 더 높은 점도 범위, 즉 각각 1.9 내지 4.1 ㎜ ^2s-1 에 비해 17.3 내지 32.9 ㎜ ² S ^-1 을 갖는다(ASTM D975; Knothe and Steidley, 2005). 상기 보다 높은 점도는 현대식 디젤 엔진에 불량한 연료 분무를 생성시켜, 불완전 연소로부터 유도되는 문제들, 예를 들어 탄소 침착 및 코킹을 도출한다(Ryan et al., 1984). 이러한 문제를 극복하기 위해서, TAG를 1차 알콜, 가장 통상적으로 메탄올과의 에스테르화에 의해 덜 점성인 지방산 에스테르로 전환시킨다. 생성되는 연료를 통상적으로 바이오디젤이라 칭하며 이는 1.9 내지 6.0 ㎜ ² S ^-1 (ASTM D6751) 범위의 동적 점도를 갖는다. 상기 바이오디젤에서 발견되는 지방산 메틸 에스테르(FAME)는 그의 높은 연소열에 의해 반영되는 바와같이 높은 에너지 밀도를 가지며, 이는 통상적인 디젤의 경우와, 더 크지 않다면, 유사하다(Knothe, 2005). 유사하게, 디젤연료에서 발견되는 FAME의 세탄가(디젤 점화 품질의 크기)는 통상적인 디젤의 값을 초과한다(Knothe, 2005).

식물 오일은 대개 5 개의 통상적인 지방산, 즉 팔미테이트(16:0), 스테아레이트(18:0), 올리에이트(18:1), 리놀리에이트(18:2) 및 리놀레네이트(18:3)로 구성되지만, 특정한 종에 따라 보다 길거나 보다 짧은 지방산이 또한 주성분일 수도 있다. 이들 지방산은 아실 쇄 길이 및 이중 연결의 수에 관하여 서로 상이하여, 상이한 물성을 도출한다. 결과적으로, 지방산들의 혼합물로부터 유도되는 바이오디젤의 연료 성질은 상기 조성에 따라 변한다. 따라서 상기 지방산 프로파일을 변경시켜 바이오디젤의 연료 성질, 예를 들어 저온 유동 특성, 산화 안정성 및 NO _x 방출을 개선시킬 수 있다. 상기 TAG의 지방산 조성을 변경시켜 상기 식물 오일의 점도를 감소시켜, 화학적 변형의 필요성을 제거할 수 있으며, 따라서 바이오연료의 비용-유효성을 개선시킬 수 있다.

식료품

본 발명의 지질/오일은 그의 매우 높은 올레산 함량 및 낮은 수준의 리놀레산(<3.2%) 및 포화 지방산, 예를 들어 팔미트산, 및 필수적으로 0 수준의 리놀렌산으로 인해 식품 용도에 이점을 갖는다. 이는 상기 오일에 높은 산화 안정성을 제공하여, 적은 산패를 생성시키고 가열이 필요한 식품 용도, 예를 들어 튀김 용도, 예를 들어 프렌치 프라이에 이상적으로 만든다. 상기 오일은 오일이 110 ℃에서 유지될 수 있는 시간의 길이로서 측정되는 높은 OSI(산화 안정성 지수), 예를 들어 20 또는 25 시간 초과, 바람직하게는 30 시간 초과 또는 50 시간 초과를 갖는다. 다른 식물성 오일에 비해 낮은 수준의 포화 지방산은, 상기 포화 지방산이 건강에 해로운 영향과 관련되기 때문에 건강상 이점을 제공한다. 상기 오일은 또한 필수적으로 0의 트랜스지방산 함량을 가지며, 이는, 트랜스 지방산이 또한 심장 건강 또는 LDL 콜레스테롤의 상승에 대한 부정적인 영향과 관련되었기 때문에, 일부 시장에 바람직하다. 더욱 또한, 상기 오일은 그의 매우 낮은 수준의 다가불포화 지방산으로 인해, PUFA의 수준을 낮추기 위해서 수소화를 필요로 하지 않는다 - 상기와 같은 수소화는 트랜스 지방산을 생성시킨다. 상기 오일은 또한 비만 및 당뇨병의 발병률 또는 중증도를 감소시키기에 유리하다. 이는 또한 오직 천연 지방산만을 함유한다는 점에서 식품 용도에 바람직할 수 있다(Scarth and Tang, 2006).

본 발명의 목적을 위해서, "식료품"은 체내로 섭취시 (1) 자양분을 주거나 또는 조직을 형성시키거나 에너지를 공급하는 작용을 하고/하거나, (2) 적합한 영양 상태 또는 대사 기능을 유지하거나, 회복하거나 지지하는 인간 또는 동물 소비용(경구 및/또는 비경구 소비를 포함하여)의 임의의 식품 또는 제제를 포함한다. 본 발명의 식료품은 아기 및/또는 아동을 위한 영양 조성물을 포함한다.

본 발명의 식료품은 예를 들어 본 발명의 세포, 본 발명의 식물, 본 발명의 식물 일부분, 본 발명의 종자, 본 발명의 추출물, 본 발명 방법의 생성물, 또는 적합한 담체(들)를 갖는 조성물을 포함한다. "담체"란 용어는 그의 가장 넓은 의미에서 영양가를 갖거나 갖지 않을 수도 있는 임의의 성분을 포함하는 것으로 사용된다. 당해 분야의 당업자가 이해하는 바와 같이, 상기 담체는 식료품을 소비하는 유기체에 대해 유해한 영향을 미치지 않도록, 상기 식료품에 사용하기에(또는 충분히 낮은 농도로 사용하기에) 적합해야 한다.

본 발명의 식료품은 본 발명에 개시된 방법, 세포 또는 유기체의 사용에 의해 직접 또는 간접적으로 생산된 지질을 포함한다. 상기 조성물은 고체 또는 액체 형태로 존재할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 식용 다량영양소, 비타민 및/또는 미네랄을 특정 용도에 원하는 양으로 포함할 수 있다. 상기 또는 다른 성분들의 양은 상기 조성물을 정상적인 개인에 사용하고자 하는지 또는 대사 질환 등을 앓고 있는 개인과 같이 특수한 필요를 갖는 개인에 사용하고자 하는지에 따라 다양할 것이다.

상기 식품을, 상기 식품이 상기 오일을 포함하도록 상기 오일을 하나 이상의 다른 성분들과 혼합함으로써 제조하거나, 또는 샐러드 드레싱 또는 마요네즈와 같은 식품 첨가제를 제조하기 위해 하나 이상의 다른 성분들과 혼합할 수도 있다. 상기 식품 또는 식품 첨가제는 1 내지 10 중량% 이상의 상기 오일을 포함할 수 있다. 상기 오일을 다른 식물성 오일과 블렌딩하여 최적의 조성을 제공하거나 고체 지방 또는 팜유와 블렌딩하여 반고체 쇼트닝을 제공할 수도 있다. 상기 오일로부터 생성된 식품 또는 식품 첨가제는 샐러드 드레싱, 마요네즈, 마가린, 빵, 케이크, 비스킷(쿠키), 크루와상, 베이킹된 상품, 팬케이크 또는 팬케이크 믹스, 커스터드, 냉동 디저트, 비-유제품을 포함한다.

영양가가 있는 적합한 담체의 예는 이로 제한되지 않지만, 식용 지방, 탄수화물 및 단백질과 같은 다량영양소를 포함한다. 상기와 같은 식용 지방의 예는 이로 제한되지 않지만, 코코넛 오일, 보리지 오일, 진균 오일, 블랙커런트 오일, 대두 오일, 및 모노- 및 다이-글리세라이드를 포함한다. 상기와 같은 탄수화물의 예는 이로 제한되지 않지만, 글루코스, 식용 락토오스 및 가수분해된 전분을 포함한다. 또한, 본 발명의 영양 조성물에 사용될 수 있는 단백질의 예는 이로 제한되지 않지만, 대두 단백질, 전기투석된 유장, 전기투석된 탈지유, 유장, 또는 이들 단백질의 가수분해산물을 포함한다.

비타민 및 미네랄에 관하여, 하기를 본 발명의 식료품 조성물에 첨가할 수 있다: 칼슘, 인, 칼륨, 나트륨, 클로라이드, 마그네슘, 망간, 철, 구리, 아연, 셀레늄, 요오드 및 비타민 A, E, D, C 및 B 복합체. 다른 상기와 같은 비타민 및 미네랄을 또한 첨가할 수도 있다.

본 발명의 식료품 조성물에 사용되는 성분들은 반-정제되거나 정제된 기원의 것일 수 있다. 반-정제된 또는 정제된이란 천연 물질의 정제에 의해 제조된 물질을 의미한다.

본 발명의 식료품 조성물을 또한 상기 음식물의 보충이 필요하지 않은 경우에조차 식품에 첨가할 수도 있다. 예를 들어, 상기 조성물을 임의의 유형의 식품, 예를 들어 이로 제한되지 않지만, 마가린, 변성 버터, 치즈, 우유, 요거트, 초콜릿, 캔디, 스낵, 샐러드 오일, 쿠킹 오일, 쿠킹 지방, 고기, 생선 및 음료에 첨가할 수 있다.

또한, 본 발명에 따라 제조된 지질 또는 주제 유전자를 함유하고 발현하도록 형질전환된 숙주 세포를 또한 동물 식품 보충제로서 사용하여 동물의 조직 또는 우유 지방산 조성 또는 계란의 지방산 조성을 인간 또는 동물 소비에, 또는 동물의 건강 및 안녕에 바람직한 하나 이상으로 변경시킬 수 있다. 상기와 같은 동물의 예는 양, 소, 말, 가금류, 애완동물, 예를 들어 개 및 고양이 등을 포함한다.

더욱 또한, 본 발명의 식료품을 수산양식에 사용하여 인간 또는 동물 소비용 생선 중 지방산 수준을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 식료품은 인간 또는 다른 동물용 식품 또는 사료로서 직접 사용될 수 있는 식물, 종자 및 다른 식물 일부분, 예를 들어 잎, 열매 및 줄기이다. 예를 들어, 동물은 들판에서 자란 상기와 같은 식물을 직접 뜯어 먹거나, 또는 조절된 급식에서 보다 표준에 맞는 양을 먹을 수 있다.

조성물

본 발명은 또한 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 하나 이상의 지질 또는 오일을 포함하는 조성물, 특히 약학 조성물을 포함한다.

약학 조성물은 상기 지질의 하나 이상을, 표준의, 널리 공지된, 무독성의 약학적으로 허용 가능한 담체, 보조제 또는 비히클, 예를 들어 인산염 완충된 염수, 물, 에탄올, 폴리올, 식물성 오일, 습윤제, 또는 유화제, 예를 들어 수/오일 유화제와 함께 포함할 수 있다. 상기 조성물은 액체 또는 고체 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 정제, 캡슐, 삼킬 수 있는 액체, 분말, 국소 연고 또는 크림의 형태로 존재할 수 있다. 적합한 유동성이, 예를 들어 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해서 및 계면활성제의 사용에 의해서 유지될 수 있다. 등장화제, 예를 들어 당, 염화 나트륨 등을 포함하는 것도 또한 바람직할 수 있다. 상기와 같은 불활성 희석제 외에, 상기 조성물은 또한 보조제, 예를 들어 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 풍미제 및 방향제를 포함할 수 있다.

현탁액은 상기 활성 화합물 외에, 현탁제, 예를 들어 에톡실화된 아이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 솔비톨 및 솔비탄 에스테르, 미정질 셀룰로스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가-아가 및 트라가칸트, 또는 이들 물질의 혼합물을 포함할 수 있다.

고체 투여형, 예를 들어 정제 및 캡슐을 당해 분야에 널리 공지된 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라 제조된 지질을 통상적인 정제 베이스, 예를 들어 락토스, 슈크로스 및 옥수수 전분으로, 연결제, 예를 들어 아카시아, 옥수수전분 또는 젤라틴, 붕해제, 예를 들어 감자 전분 또는 알긴산, 및 윤활제, 예를 들어 스테아르산 또는 마그네슘 스테아레이트와 함께 타정할 수 있다. 캡슐은 상기 부형제들을 젤라틴 캡슐에, 산화방지제 및 적합한 지질(들)과 함께 혼입시킴으로써 제조할 수 있다.

정맥내 투여를 위해서, 본 발명에 따라 제조된 지질 또는 그의 유도체를 상업적인 제형에 혼입시킬 수 있다.

특정 지방산의 전형적인 투여량은 0.1 ㎎ 내지 20 g으로, 하루에 1 내지 5 회 복용되며(매일 100 g 이하), 바람직하게는 매일 약 10 ㎎ 내지 약 1, 2, 5 또는 10 g(1 회 또는 수회 용량으로 복용)의 범위이다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 최소 약 300 ㎎/일의 지방산이 바람직하다. 그러나, 어떤 양의 지방산이 환자에게 이로울 것인지를 알 것이다.

본 발명의 약학 조성물의 가능한 투여 경로는 예를 들어 경장 및 비경구를 포함한다. 예를 들어, 액체 제제는 경구 투여될 수 있다. 또한, 균일한 혼합물을 물에 완전히 분산시키고, 멸균 조건 하에서 생리학적으로 허용 가능한 희석제, 보존제, 완충제 또는 추진제와 혼합하여 스프레이 또는 흡입제를 형성시킬 수 있다.

환자에게 투여되는 조성물의 투여량은 당해 분야의 통상적인 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 다양한 인자들, 예를 들어 상기 환자의 체중, 연령, 전반적인 건강, 과거 병력, 면역 상태 등에 따라 변할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물을 화장용으로 사용할 수도 있다. 상기 조성물을 기존의 화장품 조성물에, 혼합물이 형성되도록 첨가하거나, 또는 본 발명에 따라 제조된 지방산을 화장품 조성물 중의 유일한 "활성" 성분으로서 사용할 수도 있다.

실시예

실시예 1. 일반적인 물질 및 방법

식물 물질 및 생육 조건

잇꽃 식물(카르타무스 팅크토리우스) 유전자형 SU, S-317, S-517, LeSaf496, CW99-OL, 및 Ciano-OL을 온실에서 펄라이트 및 모래 옥토 포팅 믹스 중에서 16 시간(25 ℃)/8 시간(22 ℃)의 명/암 주기로 종자로부터 증식시켰다. 고 리놀레산 품종인 야생형 품종 SU를 NSW에서 헤페르난 시즈(Heffernan Seeds)로부터 수득하였다. PI 603208(LeSaf496, ATC 120562) 및 CW 99-OL(ATC 120561)의 종자를 호주 온대성 농작물 콜렉션으로부터 수득하였다.

잎, 뿌리, 떡잎 및 배축을 포함하는 DNA 및 RNA 추출용 식물 조직을 발아 후 10일째에 잇꽃 묘종으로부터 수확하였다. 개화 첫날에 꽃머리를 수득하고 발생하는 배를 개화후 7일(초기), 15일(중기) 및 20일(말기)(DPA)의 3 개의 발생 단계에서 수확하였다. 샘플들을 액체 질소에서 바로 냉각시키고 DNA 및 RNA 추출이 수행될 때까지 -80 ℃에서 보관하였다.

잇꽃의 꽃 일부분은 관상이며 일반적으로 10% 미만의 이종교배로 주로 자가-수분한다(Knowles 1969). 바람이 아닌, 곤충이 들판에서 이종교배의 수준을 증가시킬 수 있다. 수분되지 않은 암술머리는 수일 동안 수용성으로 남아있을 수 있다. 각각의 두상화(잇꽃 머리)는 약 15 내지 30 개의 수과를 함유한다. 상기 식물 중 발생하는 종자의 종자 질량은 개화후 처음 15일 동안 급속히 증가한다. 오일 함량은 10 내지 15 DAP의 기간 동안 5- 내지 10-배 증가하여 약 28 DPA에서 최대 수준에 도달한다(Hill and Knowles 1968). 잇꽃 종자 및 식물은 개화후 약 5 주째에 생리학적으로 성숙하며 상기 종자는, 대일부분의 잎이 갈색으로 변하고 오직 녹색의 기운만이 가장 늦은 개화 머리의 포엽상에 남아있을 때 수확할 준비가 된다. 종자를 손으로 상기 머리를 문질러 쉽게 수확하였다.

지질 분석

신속한 지방산 조성 분석을 위해 단일 종자로부터 지질 샘플의 단리

잇꽃 종자를 식물 성숙기에서 수확 후, 37 ℃에서 3일 동안 보관함으로써 건조시키고 바로 분석하지 않는 경우 후속으로 실온에서 건조시켰다. 단일 종자 또는 모은 종자를 작은 여과지 사이에서 파쇄시키고 상기 여과지에 스며든 삼출된 종자오일 샘플을 하기 개시된 바와 같이 GC 방법에 의해 지방산 조성에 대해서 분석하였다.

발아후 반자엽으로부터 전체 지질 단리

선별을 위해서, 예를 들어 트랜스제닉 식물로부터 자손 종자의 선별을 위해서, 잇꽃 종자를 페트리 디쉬 중의 습윤 여과지 상에서 1 일 동안 발아시켰다. 지질 분석을 위해서 떡잎을 각각의 발아된 종자로부터 조심스럽게 제거하였다. 각 묘종의 나머지를 토양으로 옮기고 생성된 식물을 성숙하게 증식시킨 다음 상기 트랜스제닉 품종을 유지하는 종자를 수확하였다.

속슬렛 장치를 사용하여 종자로부터 오일의 추출

종자오일의 정량적인 추출을 위해서, 수확한 잇꽃 종자를 오븐에서 105 ℃에서 밤새 건조시키고 이어서 퍽 밀(Puck Mill)에서 1 분간 분쇄하였다. 상기 분쇄된 종자 물질(약 250 그램)을 미리 칭량한 심블에 수거하고 오일 추출 전에 칭량하였다. 상기 거친 가루의 상부에 탈지면층을 가한 후에, 상기 오일을 처음에 70 내지 80 ℃에서 용매(경유 40-60 C)가 있는 속슬렛 추출 장치에서 추출하였다. 이어서 상기 혼합물을 매 15 내지 20 분 마다 상기 추출 플라스크로의 용매 사이퍼닝에 의해 밤새 환류시켰다. 상기 용해된, 추출된 오일을 진공 하에서 회전 증발기를 사용하여 상기 용매를 증발시킴으로써 회수하였다. 추출된 오일의 중량을 측정하고 상기 오일 함량을 측정하였다. 추출된 오일의 지방산 조성을 측정하기 위해서, 작은 분액들을 클로로폼 중에서 희석하고 기체 크로마토그래피에 의해 분석하였다.

잎 물질로부터 전체 지질 단리

문헌[Bligh and Dyer (1959)]에 개시된 바와 같이 잎 조직 샘플을 동결-건조시키고, 칭량하고 전체 지질을 대략 10 ㎎ 건조 중량의 샘플로부터 추출하였다.

지질의 분별화

필요한 경우, TAG 분획을 예비-코팅된 실리카젤 플레이트(실리카젤 60, 머크(Merck)) 상에서 2-상 박층 크로마토그래피(TLC) 시스템을 사용하여 다른 지질 성분들로부터 분리시켰다. 10 ㎎의 잎 조직 건조 중량과 동등한 추출된 지질 샘플을 첫 번째 상에서 헥산/다이에틸 에테르(98/2 v/v)로 크로마토그래피시켜 비-극성 왁스를 제거하고 이어서 두 번째 상에서 헥산/다이에틸 에테르/아세트산(70/30/1 v/v/v)을 사용하여 크로마토그래피시켰다. 필요한 경우, 극성 지질을 2-차원 TLC(실리카젤 60, 머크)를 사용하여, 첫 번째 방향의 경우 클로로폼/메탄올/물(65/25/4 v/v/v) 및 두 번째 방향의 경우 클로로폼/메탄올/NH ₄ OH/에틸프로필아민(130/70/10/1 v/v/v/v)을 사용하여, 5 ㎎ 건조 중량과 동일한 잎으로부터 추출된 지질 샘플 중 비-극성 지질로부터 분리시켰다. 상기 동일한 TLC 플레이트상의 상기 지질 반점, 및 적합한 표준 흐름을 요오드 증기에의 짧은 노출에 의해 가시화하고, 바이알에 수거하고, 트랜스메틸화시켜 하기와 같은 GC 분석용 FAME를 생성시켰다.

지방산 메틸 에스테르(FAME) 제조 및 기체 크로마토그래피(GC) 분석

GC에 의한 지방산 조성 분석을 위해서, 상술한 바와 같이 제조된 추출된 지질 샘플을 유리 튜브로 옮기고 80 ℃에서 3 시간 동안 메탄올(슈펠코(Supelco)) 중의 2 ㎖의 1M HCl 중에서 트랜스메틸화시켰다. 실온으로 냉각 후, 1.3 ㎖의 0.9% NaCl 및 800 ㎕ 헥산을 각 튜브에 가하고 FAME를 상기 헥산 상내로 추출하였다. 상기 지방산 조성을 측정하기 위해서, 상기 FAME를, 필수적으로 문헌[Zhou et al.(2011)]에 개시된 바와 같이, 단 온도 경사 프로그램을 150 ℃에서 초기 온도로 변화시키고, 1 분 동안 유지시키고, 3 ℃/분으로 210 ℃까지 기울이고, 이어서 2 분의 최종 유지 동안 50 ℃/분으로 240 ℃까지 기울임을 제외하고, 30-m BPX70 컬럼이 구비된 에이질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies) 7890A 기체 크로마토그래프(미국 캘리포니아주 팔로알토 소재)를 사용하여 기체-크로마토그래피(GC)에 의해 분리시켰다. 피크들을 에이질런트 테크놀로지스 켐스테이션(ChemStation) 소프트웨어(Rev B.03.01(317), 미국 캘리포니아주 팔로알토 소재)로 정량분석하였다. 피크 반응들은, 교정을 위해 사용된, 18:1, 18:0, 20:0 및 22:0을 포함하여, 같은 비율의 31 개의 상이한 지방산 메틸 에스테르를 함유한 진정한 Nu-체크 GLC 표준-411(Nu-체크 프렙 인코포레이티드, 미국 미네소타주 소재)의 지방산의 경우와 유사하였다. 상기 샘플 중 각 지방산의 비율을 상기 지방산의 개별 및 전체 피크 면적을 근거로 계산하였다.

기체 크로마토그래피 - 질량 분광분석법에 의한 FAME의 분석

2,4-다이메틸옥사졸린(DMOX) 변형 및 GC-MS 분석에 의한 FAME 중 이중 가닥 위치의 확인을 앞서 개시된 바와 같이(Zhou et al., 2011), 단 30-m BPX70 컬럼이 구비된 시마츠(Shimadzu) GC-MS QP2010 플러스를 사용하여 수행하였다. 상기 컬럼 온도를 150 ℃에서 1 분의 초기 온도, 5 ℃/분으로 200 ℃까지 기울고, 이어서 5 분간 유지시키면서 10 ℃/분으로 240 ℃까지 기울도록 프로그램화하였다. 질량 스펙트럼을 획득하였으며 GCMSolution 소프트웨어(시마츠, 버전 2.61)로 처리하였다. 상기 유리 지방산 및 FAME 표준을 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich)(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 구입하였다.

LC-MS에 의한 지질 종의 분석

성숙한 개별적인 단일 종자에 대해서, 맬버른 대학 식물학교에서 LC-MS를 사용하여 리피도믹스 분석을 수행하였다. 전체 지질을 문헌[Bligh and Dyer(1959)]에 개시된 바와 같이 추출하고 CHCl ₃ 에 용해시켰다. 1 ㎎ 분액의 지질을 N ₂ 와 함께 건조시키고, 1 ㎖의 부탄올:메탄올(1:1 v/v) 중의 10 mM 부틸화된 하이드록시톨루엔에 용해시키고, 에이질런트 1200 시리즈 LC 및 6410B 전기분무 이온화 삼중 4극자 LC-MS를 사용하여 분석하였다. 지질을 에이센티스 익스프레스(Ascentis Express) RP-아미드 컬럼(5 ㎝ x 2.1 ㎜, 슈펠코) 및 0.2 ㎖/분 유량의 2원 구배를 사용하여 크로마토그래피에 의해 분리시켰다. 이동상은 A, H ₂ O:메탄올:테트라하이드로퓨란(50:20:30, v/v/v) 중의 10 mM 암모늄 포르메이트; B. H ₂ O:메탄올:테트라하이드로퓨란(5:20:75, v/v/v) 중의 10 mM 암모늄 포르메이트이었다. 지방산 16:0, 16:1 18:0, 18:1, 18:2, 18:3을 갖는 포스포콜린(PC) 및 선택된 중성 지질(TAG 및 DAG) 을 25 V의 충돌 에너지 및 135 V의 단편화 전압을 사용하여 다중 반응 모니터링(MRM)에 의해 분석하였다. 개별적인 MRM TAG 및 DAG를 암모니아와 화합된 전구체 이온 및 지방산의 중성 손실로부터의 생성물 이온을 근거로 확인하였다. TAG 및 DAG를 10 uM 트라이스테아린 외부 표준을 사용하여 정량분석하였다.

오일 샘플의 스테롤 함량의 분석

내부 표준으로서 C24:0 모놀의 분액이 첨가된 대략 10 ㎎의 오일 샘플을 4 ㎖의 80% MeOH 중의 5% KOH를 사용하여 비누화시키고 테프라이닝 스크류-캡핑된 유리 튜브 중에서 80 ℃에서 2 시간 동안 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각시킨 후에, 2 ㎖의 밀리-Q 수를 가하고 상기 스테롤을 2 ㎖의 헥산:다이클로로메탄(4:1 v/v) 내로 진탕 및 와동에 의해 추출하였다. 상기 혼합물을 원심분리시키고 스테롤 추출물을 제거하고 2 ㎖의 밀리-Q 수로 세척하였다. 이어서 상기 스테롤 추출물을 진탕 및 원심분리 후 제거하였다. 상기 추출물을 질소 기체의 스트림을 사용하여 증발시키고 상기 스테롤을 200 ㎖의 BSTFA를 사용하여 실릴화하고 80 ℃에서 2 시간 동안 가열하였다.

상기 스테롤의 GC/GC-MS 분석을 위해서, 스테롤-OTMSi 유도체를 40 ℃ 열 블록상에서 질소 기체의 스트림 하에 건조시키고 이어서 GC/GC-MS 분석 직전에 클로로폼 또는 헥산에 재용해시켰다. 상기 스테롤-OTMS 유도체를 슈펠코 이쿠이티(Supelco Equity)(상표)-1 융합된 실리카 모세관 컬럼(15 mx 0.1 ㎜ 직경, 0.1 ㎛ 필름 두께), FID, 분할/비분할 주입기 및 에이질런트 테크놀로지스 7683B 시리즈 자동 샘플러 및 주입기가 구비된 에이질런트 테크롤로지스 6890A GC(미국 캘리포니아주 팔로알토 소재)를 사용하여 기체 크로마토그래피(GC)에 의해 분석하였다. 헬륨이 캐리어 기체였다. 샘플을 120 ℃의 오븐 온도에서 비분할 방식으로 주입하였다. 주입 후, 상기 오븐 온도를 10 ℃ 분 ^-1 으로 270 ℃까지 상승시키고 최종적으로 5 ℃ 분 ^-1 으로 300 ℃까지 상승시켰다. 피크들을 에이질런트 테크놀로지스 켐스테이션 소프트웨어(미국 캘리포니아주 팔로알토 소재)에 의해 정량분석하였다. GC 결과에 개별 성분 면적의 ±5%의 오차를 가한다.

GC-질량 분광측정(GC-MS) 분석을 피니간 써모퀘스트(Finnigan Thermoquest) GCQ GC-MS 및 피니간 써모 일렉트론 코포레이션 GC-MS 상에서 수행하였으며; 이 두 시스템은 모두 온-컬럼 주입기 및 써모퀘스트 엑스칼리버(Xcalibur) 소프트웨어(미국 텍사스주 오스틴 소재)가 구비되어 있다. 각각의 GC는 상술한 바와 유사한 극성을 갖는 모세관 컬럼이 구비되어 있다. 개별적인 성분들을, 질량 스펙트럼 데이터를 사용하고 체류시간 데이터를 진정한 표준 및 실험용 표준에 대해 획득된 경우와 비교함으로써 확인하였다. 전체 과정 블랭크 분석을 상기 샘플 배치와 동시에 수행하였다.

이아트로스캔(Iatroscan)을 통한 TAG의 정량분석

1 ㎕의 각각의 식물 추출물을 TLC-FID 이아트로스캔(상표)(미츠비시 케미칼 메디언스 코포레이션(Mitsubishi Chemical Medience Corporation), 일본 소재)용의 하나의 크로마로드(Chromarod)-SII 상에 로딩한다. 이어서 상기 크로마로드 랙을 70 ㎖의 헥산/CHCl ₃ /2-프로판올/폼산(85/10.716/0.567/0.0567 v/v/v/v) 용매 시스템을 함유하는 평형화된 현상용 탱크로 옮긴다. 30 분의 배양 후에, 상기 크로마로드 랙을 100 ℃에서 3 분 동안 건조시키고 이아트로스캔 MK-6s TLC-FID 분석기(미츠비스 케미칼 메디언스 코포레이션, 일본 소재)상에서 바로 스캐닝한다. DAGE 내부 표준 및 TAG의 피크 면적을 SIC-480II 적분 소프트웨어(버전: 7.0-E SIC 시스템스 인스트루먼츠 캄파니 리미티드, 일본 소재)를 사용하여 적분한다.

TAG 정량분석을 2 단계로 수행한다. 먼저, 상기 DAGE 내부 표준을 모든 샘플에서 스캐닝하여 추출 수율을 보정하고 그 후에 농축된 TAG 샘플을 선택하고 희석한다. 이어서, 상기 TAG의 양을 외부 표준으로서 글리세릴 트라이리놀리에이트(시그마-알드리치)를 사용하는 외부 교정에 따라 두 번째 스캔으로 희석된 샘플에서 정량분석한다.

사카로마이세스 세레비지아에에서 후보 FAD2 유전자의 발현

후보 FAD2 cDNA의 전체 개방 판독 프레임을 함유하는 DNA 단편을 EcoRI 단편으로서 pGEMT-이지 벡터로부터 절제하고 벡터 pENTR11(인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)의 상응하는 부위에 삽입하였다. 이어서 상기 삽입물을, 게이트웨이(Gateway)(등록상표) 클로닝 재조합 기술(스트라타진(Stratagene), 미국 캘리포니아주 라졸라 소재)을 사용하여, 목적 발현 벡터 pYES2-DEST52에 클로닝하여 상기 개방 판독 프레임을 효모 세포에서의 유도성 유전자 발현을 위한 GAL1 프로모터의 조절 하에 두었다. 상기 생성된 플라스미드 중의 유전자 서열을 DNA 서열분석에 의해 입증하였다. 상기 생성 플라스미드 및 대조용으로서 임의의 cDNA 삽입물이 없는 pYES2-DEST52 벡터를 리튬 아세테이트-매개된 형질전환에 의해 효모 사카로마이세스 세레비지아에 균주 YPH499의 세포에 도입시켰다. 외인성 지방산 기질의 공급과 함께 또는 공급 없이 효모 세포에서 상기 후보 FAD2 유전자의 발현은 필수적으로 문헌[Zhou et al.(2006)]에 의해 앞서 개시된 바와 같았다. 각각의 실험을 3회 중복 수행하였다.

일시적인 발현 시스템에서 식물 세포에서 유전자의 발현

유전자를 필수적으로 문헌[Voinnet et al. (2003)] 및 [Wood et al. (2009)]에 개시된 바와 같이 일시적인 발현 시스템을 사용하여 니코티아나 벤타미아나 잎 세포에서 발현시켰다. CaMV 35S 프로모터의 조절 하에서 바이러스 침묵화 억제제 단백질의 구성적 발현을 위한 벡터, P19를 피터 워터하우스, CSIRO 플랜트 인더스트리(Peter Waterhouse, CSIRO Plant Industry)의 실험실(오스트레일리아 캔버라 소재)로부터 수득하였다. 키메릭 2원 벡터 35S:P19를 아그로박테리움 튜메파시엔스 균주 AGL1에 도입시켰다. 프로모터, 종종 상기 35S 프로모터로부터 식물 세포에서 발현시키려는 암호화 영역을 함유하는 모든 다른 2원 벡터를 또한 에이 튜메파시엔스 균주 AGL1에 도입시켰다. 상기 재조합 세포를, 50 ㎎/L 리팜피신 및 상기 2원 벡터상의 선택성 마커 유전자에 따라 50 ㎎/L 가나마이신 또는 80 ㎎/L 스펙티노마이신이 보충된 5 ㎖ LB 브로쓰에서 28 ℃에서 정지상으로 생육시켰다. 각각의 배양물로부터의 세균을 실온에서 5 분간 3000 xg에서 원심분리에 의해 펠릿화한 후에 5 mM MES, pH 5.7, 5 mM MgSO ₄ , 및 100 μM 아세토시링온을 함유하는 침윤 완충액 1.0 ㎖에 재현탁하였다. 이어서 상기 재현탁된 세포 배양물을 28 ℃에서 추가로 3 시간 동안 진탕하면서 배양하였다. 이어서 침윤 완충액 중의 각 배양물의 10 배 희석물을 동부피의 35S:P19 배양물과 혼합하고, 동일한 방식으로 희석하고, 상기 혼합물을 충분히 확대된 엔 벤타미아나 잎의 뒷면에 침윤시켰다. 발현시키려는 유전자를 포함하는 혼합된 배양물은 달리 언급되지 않는 한 아그로박테리움 중의 35S:P19 구조물을 포함하였다. 대조용 침윤물은 아그로박테리움 중에 오직 35S:P19 구조물만을 포함하였다.

잎들을 상기 아그로박테리움 세포 혼합물로 침윤시키고 상기 식물을 전형적으로는, 침윤후 잎 원반을 전체 지질 단리 및 지방산 분석을 위해 회수하기 전에, 추가로 5일 동안 증식시켰다. 엔 벤타미아나 식물을 24 ℃항온 하에 오스람 '소프트 화이트'(Osram 'Soft White') 형광 조명을 식물 위에 직접 놓아 대략 200 룩스의 광 강도의 14/10 명/암 주기로 생육 캐비넷에서 증식시켰다. 전형적으로 6주된 식물을 실험에 사용하였으며 거의 완전히-확대된 전형적인 잎을 침윤시켰다. 모든 비-침윤된 잎은 그늘짐을 피하기 위해서 침윤후 제거하였다.

실시간 정량적인 PCR(RT-qPCR)

유전자 발현 분석을 바이오래드(BIORAD) CFX96(상표) 실시간 PCR 검출 시스템 및 iQTM SYBR(등록상표) 그린 슈퍼믹스(바이오래드(BioRad), 미국 캘리포니아주 헤르큘레스 소재)를 사용하여 정량적인 RT-PCR에 의해 수행하였다. 길이가 19 내지 23 뉴클레오티드이고 약 65 ℃의 용융 온도(Tm)를 갖는 프라이머를 약 100 내지 200 bp의 증폭 산물을 생성시키는 유전자-특이적 증폭을 위해 설계하였다. PCR 반응을 96-웰 플레이트에서 수행하였다. 모든 RT-PCR 반응을 3 회 중복해서 수행하였다. 상기 반응 혼합물은 1 x iQTM SYBR(등록상표) 그린 슈퍼믹스(바이오래드, 미국 캘리포니아주 헤르큘레스 소재), 5 μM 순방향 및 역방향 프라이머 및 400 ng의 cDNA를 함유하였으며 이를 웰당 10 uL의 부피로 사용하였다. 열 순환 조건은 95 ℃ 3 시간에 이어서 40 주기의 95 ℃ 10 초, 60 ℃ 30 초 및 68 ℃ 30 초이었다. 상기 PCR 증폭의 특이적을 0.1 ℃/초로, 60 ℃ 내지 95 ℃의 PCR의 최종 단계에 따른 용융 곡선 분석에 의해 모니터하였다. 또한, PCR 산물을 아가로스 젤 전기영동에 의해 순도에 대해 또한 검사하고 서열분석에 의해 확인하였다. 구성적으로 발현된 유전자 KASII를 발현 수준의 표준화를 위한 내인성적인 기준으로서 사용하였다. 상기 데이터를 상대적인 정량분석을 위해 2 ^-ΔΔCt 방법에 따라 상응하는 유전자 발현에 대해 교정하였다(Schmittgen, 2008). 상기 데이터를 독립적인 96-웰 플레이트상에서 수행된 3 개 반응의 평균±SD로서 나타내었다.

DNA 단리 및 서던 블럿 분석

잇꽃 묘종의 게놈 DNA, 유전자형 "SU"를 CTAB 완충제를 사용하여 문헌[Paterson et al.(1993)]에 개시된 방법에 따라 완전히 확대된 잎으로부터 단리하였다. 추가의 정제를 앞서 개시된 바와 같이 CsCl 구배를 사용하여 수행하였다(Liu et al., 1999). 10 ㎍ 분액의 잇꽃 게놈 DNA를 별도로 8 개의 상이한 제한 효소들, 즉 AccI, BglII, BamHI, EcoRI, EcoRV, HindIII, XbaI 및 XhoI로 절단하였다. 각각의 제한 효소로 절단된 게놈 DNA를 1% 아가로스 젤을 통해 전기영동하였다. 상기 젤을 30 분간 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl 중에 함침시키고, DNA를 하이본드(Hybond)-N ⁺ 나일론 멤브레인(애머샴(Amersham), 영국 소재) 상에 블럿팅하였다. 상기 필터를, 낮은 엄격성 하이브리드화 조건에서 CtFAD2 유전자 과의 전형으로서 잇꽃 CtFAD2-6 유전자의 전체 암호화 영역에 상응하는 α-P ³² dCTP-표지된 DNA 단편으로 탐침하였다. 상기 하이브리드화를 65 ℃에서 6 x SSPE, 10% 덴하르트 용액, 0.5% SDS 및 100 ㎍/㎖의 변성된 연어 정자 DNA를 함유하는 용액 중에서 밤새 수행하였다. 상기 하이브리드화에 이어서 50 ℃에서 2 x SSC/0.1% SDS에서 간단한 세척 후에, 상기 필터를 자동방사선사진술 전에 50 ℃에서 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 매번 20분씩 3 회 세척하였다.

잇꽃 및 아라비도프시스 탈리아나의 형질전환

아라비도프시스를 형질전환시키기 위해 사용되는 유전자를 포함하는 키메릭 벡터를, 형질전환을 위한 플로럴 ?(floral dip) 방법(Clough and Bent, 1998)을 사용하여 에이 탈리아나(생태형 콜럼비아(Columbia))를 처리하기 위해 사용된 형질전환된 아그로박테리움의 배양물로부터의 세포 및 에이 튜메파시엔스 균주 AGL1에 도입시켰다. 형질전환된 잇꽃 식물을, 형질전환된 아그로박테리움 배양물을 사용하여 문헌[Belide et al.(2011)]에 개시된 바와 같이 생성시켰다.

실시예 2. FAD2를 암호화하기 위한 후보인 잇꽃 cDNA의 단리

전체 RNA 추출 및 cDNA 합성

잇꽃으로부터 cDNA를 생산하기 위해서, 전체 RNA를 발생 배, 잎, 뿌리 및 배축을 포함하는 동결된 잇꽃 조직의 100 ㎎ 샘플로부터 단리하였다. 이를 공급자의 프로토콜에 따라 RNeasy(등록상표) 식물 전체 RNA 키트(퀴아겐(Qiagen), 독일 힐덴 소재)를 사용하여 각각의 조직에 대해 별도로 수행하였다. 제제 중 RNA 농도를 나노드롭(NanoDrop)(상표) 분광광도계 ND1000(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 오스트레일리아 빅토리아 소재)으로 측정하고 RNA 농도를 분석 전에 균등화하였다. 각 제제 중의 RNA의 질 및 상대량을, 폼알데하이드를 함유하는 1%(w/v) 아가로스 젤을 통한 샘플들의 젤 전기영동에 의해 가시화하였다. 상기 RNA 제제를 RQ1 RNase-비함유 DNase(퀴아겐, 독일 힐덴 소재)로 처리하여 오염 게놈 DNA를 제거하였다. 첫 번째 가닥 cDNA를 제조사의 설명에 따라, 올리고(dT) ₂₀ 프라이머와 함께 슈퍼스크립트(SuperScript) III 첫 번째 가닥 합성 시스템(퀴아겐, 독일 힐덴 소재)을 사용하여 400 ng의 각각의 DNA-비함유 RNA 제제로부터 합성하였다.

발생 종자 cDNA 라이브러리로부터 종자-발현된 FAD2 cDNA의 단리

처음에, 상기 종자 발현된 잇꽃 FAD2 cDNA를, 잇꽃 유전자유형 "SU"(야생형, 고 리놀레산 수준)의 발생 배로부터 유도된 cDNA 라이브러리를 선별하여 수득하였다. 라이브러리 제작은, 수확되고 액체 질소 중에서 분말로 분쇄된 상이한 발생 단계의 미성숙 배의 혼합물로부터의 RNA 추출로 시작하며 RNA 추출을 제조사의 설명(인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)에 따라 TRIzol을 사용하여 수행하였다. 폴리(A)-함유 RNA를 퀴아겐 mRNA 정제 키트(퀴아겐, 독일 힐덴 소재)를 사용하여 단리하였다.

첫 번째 가닥 올리고(dT)-프라이머 자극된 cDNA를 합성하고 제조사의 설명에 따라(스트라타진, 미국 캘리포니아주 라졸라 소재), 스트라타진 cDNA 합성 키트를 사용하여 이중 가닥 DNA로 전환시켰다. 평활 단부 cDNA를 EcoRI 어댑터와 연결하고, 인산화하고, 크로마(Chroma) 스핀+TE-400 컬럼(클론테크(Clontech), 미국 캘리포니아 소재)에서 젤-여과에 의해 크기 분류하였다. 재조합 cDNA를 스트라타진 예비절단된 람다 ZAPII/EcoRI/CIAP 클로닝 키트를 사용하여 이 콜라이 균주 XL-1 블루 MRF에서 번식시켰다.

상기 FAD2 클론을 확인하기 위해서, 상기 라이브러리를 앞서 개시된 프로토콜에 따라(Liu et al., 1999), 아라비도프시스 FAD2(진뱅크 수탁 번호 L26296)의 암호화 영역에 상응하는 DNA 단편을 사용하여 선별하였다. 양의 플라크를 2 회의 연속적인 라운드의 선별을 통해 정제하고 추정적인 FAD2 cDNA를 함유하는 정제된 파지미드를 스트라타진 λZAPII cDNA 합성 키트 설명 매뉴얼에 개략된 바와 같이 절제하였다. 상기 FAD2 서열의 서열 분석을 NCBI 블라스트 프로그램(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)에 의해 수행하였다. 개방 판독 프레임을 벡터NTI를 사용하여 예견하였다. 2 개의 상이한 완전 길이 cDNA를 발생 종자 cDNA 라이브러리로부터 단리하고 각각 CtFAD2-1 및 CtFAD2-2라 명명하였다.

후보 FAD2 유전자에 대한 EST의 확인

추가의 후보 FAD2 cDNA를 확인하기 위해서, 잇꽃의 국화과 게놈 프로젝트(CGP) 발현된 서열 태그(EST) 데이터베이스(cgpdb.ucdavis.edu/cgpdb2.)를, 에이 탈리아나 FAD2(진뱅크 수탁 번호 L26296)와 유사성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 EST에 대해 프로그램 BLASTp를 사용하여 정보를 얻었다. 적어도 11 개의 독특한 FAD2 cDNA 서열 콘틱을 확인하였으며, 이 중 2 개의 콘틱이 잇꽃 종자 cDNA 라이브러리로부터 단리된 CtFAD2-1 및 CtFAD2-2와 동일한 서열을 나타내었다. 또한, 9 개의 상이한 cDNA를 확인하였으며 각각 CtFAD2-3 내지 CtFAD2-11로서 표시하였다.

3'- 및 5' RACE

9 개의 콘틱(CtFAD2-3 내지 CtFAD2-11) 각각의 가장 긴 EST 클론을 상응하는 완전 길이 cDNA 서열의 단리를 위한 출발점으로서 선택하였다. 상기 과정은 발생 배, 잎, 뿌리, 배축 및 꽃을 포함한 다양한 잇꽃 조직들로부터 수득된 RNA로부터 생성된 cDNA를 사용하는 cDNA 단부의 3'- 및 5'-고속 증폭(RACE)을 사용하였다. 유전자 특이적 프라이머(GSP)를 각각의 콘틱의 가장 긴 EST 클론으로부터 설계하였다. 3'-RACE를 제조사의 설명(바이오라인(Bioline), 영국 런던 소재)에 따라 1-단계 RT-PCR 키트를 사용하여 수행하였다. 유전자-특이적 프라이머(GSP)를 3' 단부에 NotI 부위를 갖는 폴리(dT) 프라이머와 함께 상기 선택된 EST 각각에 대한 첫 번째 라운드의 PCR 증폭에 사용하였다. 두 번째 라운드의 PCR을 상기 폴리(dT) 프라이머와 함께 네스티드(nested) GSP를 사용하여 상기 첫 번째 라운드의 생성물상에서 수행하였다. 3' RACE에 대한 GSP를 표 2에 나열한다.

상기 CtFAD2-6 cDNA의 5' 단부의 클로닝을 5' RACE 시스템 키트(인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 사용하여 수행하였다. 오직 CtFAD2-6 mRNA만을 유전자-특이적 프라이머 GSP1, 5'-ACCTAACGACAGTCATGAACAAG-3'(서열번호 76)을 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 네스티드 유전자-특이적 프라이머 GSP2, 5'- GTGAGGAAAGCGGAGTGGACAAC -3'(서열번호 77)를 상기 첫 번째 PCR 증폭에 사용하였다. 상기 반응 조건은 상기 폴리머라제 첨가전 95 ℃에서 4 분의 고온 출발, 33 주기의 94 ℃에서 45 초의 변성, 55 ℃에서 1 분간 어닐링 및 72 ℃에서 2 분간 연장을 사용하였다.

상기 증폭된 3' 및 5' 단편들을 벡터 pGEM-Teasy에 서브클로닝하고 양방향으로 서열분석하였다. 상기 상응하는 EST를 갖는 클로닝된 단편들의 3' 및 5' 단부 서열 비교는, 서로 합치하여 각각의 유전자에 대한 3' 및 5' 서열을 제공하고 상기 11 개 cDNA 각각에 대한 추정적인 완전 길이 서열의 조립을 허용하는 중복 영역을 나타내었다.

후보 CtFAD2 유전자에 대한 완전 길이 cDNA 서열의 단리

상기 9 개 CtFAD2 유전자에 대한 완전 길이 단백질 암호화 영역을 단리하기 위해서, ORF를 발생 배, 잎, 뿌리, 배축 및 꽃을 포함하는 다수의 잇꽃 조직들로부터 유래된 전체 RNA를 사용하는 1-단계 RT-PCR 키트(스트라타진, 미국 캘리포니아주 라졸라 소재)를 사용하여 증폭시켰다. 상기 ORF의 증폭에 사용된 프라이머들(표 3)은 각 cDNA의 5' 및 3' UTR에 위치한 DNA 서열들을 기본으로 하였다. 상기 증폭된 PCR 산물들을 벡터 pGEM-Teasy(등록상표)에 클로닝하고, 그들의 뉴클레오티드 서열을 DNA 서열분석에 의해 획득하였다.

잇꽃으로부터 후보 FAD2 서열들의 특징

상기 11 개 cDNA의 특징을 표 4에 요약하고 상기 폴리펩티드들의 특징을 표 5에 요약한다.

상기 암호화된 폴리펩티드 CtFAD2-1 내지 CtFAD2-11의 예견된 아미노산 서열은 서로 약 44% 내지 86% 동일성으로, 광범위한 서열 동일성을 공유하였다. 이들은 아라비도프시스 FAD2와 53% 내지 62% 서열 동일성을 보였다. 상기 예견된 폴리펩티드들의 크기는 372 내지 388 아미노산의 범위였다, 즉 이들은 모두 길이가 약 380 aa 잔기이었다. 상기 cDNA는 독특한 5' 및 3' 번역되지 않은 영역(UTR) 서열을 가졌으며, 따라서 상기 내인성 유전자들은 그들의 UTR 서열에 의해 쉽게 인식될 수 있었다. 잇꽃 게놈 DNA로부터의 단백질 암호화 영역의 증폭은 상기 11 개 유전자들 각각에 대해 상응하는 cDNA와 동일한 DNA 서열을 생성시켰으며, 이는 그들의 단백질-암호화 영역을 중단시키는 인트론이 존재하지 않음을 가리킨다.

공지된 FAD2 효소에 대한 상기 잇꽃 후보 FAD2 폴리펩티드의 관계를 조사하기 위해서, 상기 11 개의 추론된 폴리펩티드 서열을 식물 FAD2 서열과 정렬시켰으며 벡터 NTI를 사용하여 이웃-연결 가계도를 작성하였다(도 1). 도 1에 나타낸 바와 같이, CtFAD2-1 및 CtFAD2-10의 아미노산 서열이, 무엇보다도 서로 및 이어서 다른 종들로부터 종자 발현된 FAD2와 가장 가깝게 관련되었다. CtFAD2-2는 잇꽃 중 다른 후보 FAD2보다 다른 종으로부터 구성적으로 발현된 유전자와 더 가깝게 관련되었다. CtFAD2-3, -4, -5, -6 및 -7이, 가장 그럴듯하게는 최근에 분기된 유전자가 잇꽃에서 번식되는 진화의 결과로서, 상기 이웃-연결 가계도에서 새로운 가지를 형성하였다. 흥미롭게, 다른 종들과의 관련성에 있어서, 이들은 칼렌둘라 오피시날리스( Calendula officinalis )로부터의 작용상 분지 FAD2 접합효소와 가장 가깝게 관련되었다. FAD2-11은 진균 유도인자에 의해 유도된 해바라기 vFAD2를 포함한 다수의 식물 종으로부터의 아세틸레나제와 보다 가깝게 관련되었다(Cahoon et al., 2003). CtFAD2-8 및 -9는 잇꽃으로부터의 다른 후보 FAD2들보다 더 분기된 것으로 나타났다. 그러나, 상기 분석은 또한 상기 서열 비교가, 상기가 가능한 작용에 대한 일부 힌트를 제공하였지만, 단독으로 상이한 FAD2 후보들의 작용에 대한 신뢰할만한 결론을 제공할 수는 없음을 보였다. 따라서, 각각의 유전자/폴리펩티드의 작용에 대한 결론을 내리기 위해서는 작용 분석이 필요하였다.

상기 서열 비교는 잇꽃 후보 FAD2 폴리펩티드가 다른 종들로부터의 공지된 FAD2 효소와 약 50% 내지 60% 서열 동일성 및 52% 내지 65% 유사성을 공유함을 보였다. 상기 잇꽃 CtFAD2 유전자들간의 DNA 서열 분기성의 정도는, CtFAD2-3, -4 및 -5가 모두 CtFAD2-1, 또는 CtFAD2-10에 대해서보다는 서로 더 유사하며 이와 역도 마찬가지라는 점에서, 이들의 계통발생적 관계를 반영하였다. 숫자들은 아미노산 동일성 행렬에서 극히 유사함을 나타낸다(표 6).

후보 CtFAD2 폴리펩티드들의 특징

상기 11 개 후보 CtFAD2의 예견된 폴리펩티드는 각각 C-말단의 맨끝에 방향족 아미노산-풍부 동기를 함유하였다. 상기와 같은 동기는 다른 식물 FAD2 폴리펩티드들에서 확인되었으며, ER에서 국소화를 유지하기에 필요한 것으로 생각된다(McCartney et al., 2004). 다른 식물 막 연결된 지방산 불포화효소와 일관되게, 상기 예견된 CtFAD2 폴리펩티드는 각각 3 개의 히스티딘-풍부 동기(His 상자)를 함유하였다. 상기와 같은 His-풍부 동기는 FAD2 효소에서 고도로 보존되며 생화학 촉매작용에 사용된 2철-산소 착체의 형성에 관련되었다(Shanklin et al., 1998). 대일부분의 상기 후보 CtFAD2 폴리펩티드 서열에서, 첫 번째 히스티딘 동기는 HECGHH이며, 예외적으로 CtFAD2-5 및 -6은 각각 HDCGHH 및 HDLGHH를 가졌다. CtFAD2-8 중의 첫 번째 His 상자(HECGHQ)의 마지막 아미노산은 H라기보다는 Q이었다. 발명자들은 55 개의 공지된 식물 FAD2 효소들에서 상기 동기를 찾았으며 상기 H에서 Q로의 치환이, 우세하게 지방산 하이드록실라제 활성을 갖는 레스퀘렐라 린드헤이메리( Lesquerella lindheimeri )로부터 분기된 FAD2 동족체 중에 또한 존재한다(진뱅크 수탁 번호 EF432246; Dauk et al., 2007). 두 번째 히스티딘 동기는, CtFAD2-1, -2, -8, -9 및 -10을 포함하여, 다수의 후보 잇꽃 FAD2 중에서, 아미노산 서열 HRRHH로서 고도로 보존되었다. 상기 아미노산 N이 CtFAD2-11에서 상기 동기의 +3번 위치에서 발견되었으며, 이는 또한 크렙시스 알피나( Crepis alpina ) CREP1, 크렙시스 팔라에스티나( Crepis palaestina ) Cpal2 및 해바라기 vFAD2(AY166773.1), 칼렌둘라 오피시날리스 FAC2(AF343064.1), 루드벡키아 히르타( Rudbeckia hirta ) 아세틸레나제(AY166776.1)를 포함한 다수의 작용성으로 분기된 FAD2-유형 효소들에서 보였다. CtFAD2-3, -4, -5, -6 및 -7에서 상기 위치의 아미노산은 S 또는 T이었다.

상기 CtFAD2-1, -2, -9 및 -10 폴리펩티드 각각에서, 첫 번째 히스티딘 상자에 바로 선행하는 아미노산은, 다른 식물 지방산 Δ12-불포화효소의 경우와 같이 알라닌이었다. 알라닌보다는 아미노산 발린(V)이 CtFAD2-5 중 상기 위치에서 존재한 반면, 다른 6 개의 CtFAD2 폴리펩티드는 상기 위치에 글리신을 가졌다. 상기 위치에서 알라닌에 대한 글리신 치환이, 지방산 Δ12-하이드록실라제를 제외하고, 작용성으로 분기된 FAD2 효소들에서 발견됨이 문헌[Cahoon et al.(2003)]에서 제안되었다. 하기의 실시예들에 개시된 바와 같이, 상기 후보들의 작용을 시험하는 후속의 이종 발현 실험들은 상기 각각의 CtFAD2-1, -2 및 -10 폴리펩티드들이 올리에이트 Δ12-불포화효소인 반면, CtFAD2-9는 올리에이트보다는 팔미트올리에이트(C16:1)에 대해 불포화효소 특이적을 보임을 입증하였다.

상기 11 개 후보 CtFAD2 중, 오직 CtFAD2-11 폴리펩티드만이 세 번째 His 상자의 -5 내지 -2 위치에서 DVTH 서열을 가지며, 이는 모든 식물 아세틸레나제 중에 존재하는 것으로 제시된 (D/N)VX(H/N)과 동일함이 주목되었다(Blacklock et al., 2010). 상기 CtFAD2-1, -2 및 -10 폴리펩티드의 세 번째 히스티딘 상자 바로 다음의 5 개 아미노산은, 다른 공지된 식물 FAD2 올리에이트 불활성효소의 경우와 같이, LFSTM이었다. 대조적으로, CtFAD2-9, 팔미트올리에이트 특이적 지방산 불활성효소는 +4 및 +5 번 위치에서 2 개의 아미노산 치환과 함께 상기 위치에서 LFSYI 동기를 가졌다. CtFAD2-3, -4 및 -5 폴리펩티드에서, +3번 위치에서 S는 P에 의해 치환되었으며, 상기는 또한 칼렌둘라 오피시날리스(FAC2, 수탁 번호 AAK26632) 및 트리코산테스 키릴로위이( Trichosanthes kirilowii )(수탁 번호 AAO37751)로부터의 경우를 포함하여 다른 FAD2 지방산 접합체들에 독점적으로 존재하였다.

상기 대두 FAD2-1 효소의 세린-185가 그의 효소 활성을 위해 조절 기전으로서 종자 발생 중 인산화됨이 입증되었다(Tang et al., 2005). 상기 11 개 후보 CtFAD2 폴리펩티드 중에서, 오직 CtFAD2-1만이 대두 FAD2-1에 비해 상응하는 위치에 세린을 가졌다(세린-181). 동일한 번역후 조절 기전이 잇꽃 종자 발생 중 실행될 수 있고 발생 종자 중 마이크로솜 Δ12 올리에이트 불활성화를 조절하기 위한 세린-185의 인산화를 통해 오일 축적이 실행될 수 있다는 결론을 내렸다.

실시예 3. FAD2 후보에 대한 게놈 서열의 단리

후보 CtFAD2 유전자의 5'UTR 인트론의 단리

FAD2 유전자의 인트론-엑손 구조는 다수의 꽃 식물에서 보존된다. 지금까지 연구된 모든 FAD2 유전자는, 첫 번째 ATG, 번역 개시 코돈 바로 다음의 암호화 영역에 인트론이 위치한 대두 FAD2-1을 제외하고, 5'UTR에 위치한 단지 하나의 인트론만을 함유한다(Liu et al., 2001; Kim et al., 2006; Mroczka et al., 2010). 인트론 서열 분기를 분류학적으로 밀접하게 관련된 종들간의 진화상 거리의 척도로서 사용할 수 있었다(Liu et al., 2001).

상기 후보 CtFAD2 유전자의 5'-UTR내에 위치한 가능한 인트론의 DNA 서열을 단리하기 위해서, 전형적인 인트론 연접 부위(AG:GT)가 각 CtFAD2 cDNA 서열의 5'UTR 중에서 예견되었으며, PCR 프라이머를 예견된 연접 부위의 인접 서열들을 기본으로 설계하였다. 상기 프라이머들을 표 7에 나열한다. 잇꽃 유전자형 SU로부터 단리된 게놈 DNA를 PCR 반응에서 주형으로서 사용하여 상기 5'UTR에 상응하는 게놈 영역을 증폭시켰다. 증폭을 100 ng의 게놈 DNA, 20 pmol의 각각의 프라이머 및 제조사에 의해 공급된 핫스타(Hotstar)(퀴아겐, 독일 힐덴 소재)를 갖는 50 ㎕ 반응물에서 수행하였다. PCR 온도 순환을 하기와 같이 수행하였다: 1 주기 동안 94 ℃ 15 분, 35 주기 동안 94 ℃ 30 초, 55 ℃ 1 분, 72 ℃ 2 분; 키라텍(Kyratec) 슈퍼사이클러 SC200(키라텍, 오스트레일리아 퀸즈랜드 소재)을 사용하여 72 ℃ 10 분. 상기 PCR 산물을 pGEM-T Easy에 클로닝하고 이어서 서열분석하였다.

발명자들은 상기 11 개 후보 CtFAD2 유전자들 중 8 개, 즉 CtFAD2-1, -2, -3, -4, -5, -7, -10 및 -11로부터 예견된 5' 인트론을 획득할 수 있었다. 이들 인트론의 주요 특징들을 표 8에 제공한다. 상기 인트론은 CtFAD2-6, -8 및 -9로부터 성공적으로 증폭되지 않았는데, 이는 추정상 상기 인트론들이 존재하는 5' UTR의 불충분한 길이에 기인하는 듯하다. 인트론-없는 FAD2는 보고되지 않은 것으로 보이지만, 핵 유전자로부터 인트론 상실은 보다 고등 식물에서 통상적으로 관찰되었다(Loguercio et al., 1998; Small et al., 2000a;b).

상기 8 개 유전자 각각의 인트론 서열은, 상기 추정적인 번역 개시 코돈, 각 개방 판독 프레임 중의 첫 번째 ATG의 11 내지 38 bp 상류 범위에 있는 위치에서, 각 유전자의 5'-UTR 내에 위치하였다. 상기 인트론 길이는 104 bp(CtFAD2-11) 내지 3,090 bp(CtFAD2-2)의 범위였다(표 8). CtFAD2-1의 경우, 상기 인트론 크기는 1,144 bp로, 아라비도프시스(The Arabidopsis Information Resource, http://www.arabidopsis.org), 목화(Liu et al., 2001) 및 참깨(세사뮴 인디쿰( Sesamum indicum ))(Kim et al., 2006)로부터의 FAD2 유전자에서 확인된 인트론과 크기가 유사하였다. 상기 추정적인 연접 부위, AG 및 GT에서 다이뉴클레오티드는 상기 검사된 8 개 CtFAD2 유전자 모두에서 보존되었으나, 그렇지 않았으면 상기 인트론 서열은 모두 이들간에 임의의 유의수준의 상동성 없이 서열이 서로 달랐다. 상기 인트론 서열은 모두 61% 내지 75%의 A/T 함량으로 A/T-풍부하였으며, 이는 쌍떡잎 식물로부터의 다수의 다른 인트론 서열과 동일하였다. 다른 쌍떡잎 식물로부터의 유전자에서, 아라비도프시스 FAD2 유전자는 그의 ATG 번역 개시 코돈으로부터 단지 5 bp 상류에 1,134-bp 인트론을 가졌다. 상기 고시피움 FAD2-1 유전자의 5'-UTR 인트론의 크기는 1,133 bp이었으며, 이는 상기 번역 개시 코돈의 상류 9 bp에 위치하였다. 대조적으로, 상기 목화 FAD2-4 및 FAD2-3 유전자는 각각 2,780 bp 및 2,967 bp의 보다 큰 5'-UTR 인트론을 가졌으며, 상기 번역 개시 코돈으로부터 12 bp 상류에 위치하였다. 각각의 후보 CtFAD2 유전자는 각 유전자에서 5'-UTR 인트론의 위치 및 크기의 차이에 의해 구분될 수 있다. 상기 차이는 또한 상기 유전자의 차별적인 발현을 제공하는데 중요할 수 있다. 상기와 같은 인트론은 참깨에서 리포터 유전자의 발현에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 보고되었다(Kim et al., 2006). 상응하는 인트론은 대두에서 FAD2의 전사후 유전자 침묵화에 유효한 표적인 것으로 나타났다(Mroczka et al, 2010).

인트론은 유전자 발현 프로파일에 큰 영향을 미칠 수 있는 것으로 공지되어 있다. PLACE 프로그램(www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)에 의한 인트론 서열의 분석은 다수의 추정적인 시스-조절 요소들을 나타내었다. 예를 들어, 종자-특이적 프로모터 중에 통상적으로 존재하는 ABRE 및 SEF4와 같은 몇몇 동기들은 종자-특이적 CtFAD2-1에 위치하였다. 다양한 스트레스, 예를 들어 상처 또는 유도인자 처리에 의해 유도된 방어-관련된 유전자의 프로모터에서 통상적으로 발견되는 AG-동기는 잇꽃 어린 묘종의 배축 및 떡잎에서 특이적으로 발현되는 CtFAD2-3에 위치하였다.

실시예 4. 후보 잇꽃 FAD2 유전자의 서던 블럿 하이브리드화 분석

잇꽃 중 FAD2-유사 유전자 과의 복잡성을 서던 블럿 하이브리드화 분석에 의해 검사하였다. 낮은 엄격성 하이브리드화 분석은, 잇꽃에서 FAD2가 복잡한 다중유전자 과에 의해 암호화됨을 입증하였다(도 2). 게놈 DNA를 절단하는 다양한 제한 효소들을 사용함으로써 수득된 하이브리드화 단편을 카운팅함으로써, 잇꽃 중에 10 개 초과의 FAD2 또는 FAD2-유사 유전자가 존재하는 것으로 평가되었다. 상이한 단편들에 대한 하이브리드화 강도에 나타난 차이는 추측상 사용된 탐침 DNA에 대한 서열 동일성의 상대적인 수준과 상관있었다. 잇꽃은 이배성 종이며 단일의 야생형 선조 종, 씨 팔라에스티누스( C. palaestinus )(Chapman and Burke, 2007)를 갖는 것으로 생각된다. 발명자들은 잇꽃 중 대단히 큰 FAD2 유전자 과가 아마도 일부 고대의 유전자 배가로부터 유래하며, 이는 상기 유전자 과의 상이한 구성원들의 분화 및 차별적인 활성을 도출하는 것으로 추정한다.

실시예 5. 효모 및 식물 세포에서 후보 유전자들의 작용성 분석

효모-작용성 분석에서 후보 CtFAD2 유전자의 발현

편리한 숙주 세포로서, 효모 에스 세레비지아에가 여러 식물 FAD2 Δ12 올리에이트 지방산 불포화효소의 작용성 발현을 연구하기 위해 사용되었다(Covello and Reed 1996; Dyer et al., 2002; Hernandez et al., 2005). 에스 세레비지아에는 비교적 간단한 지방산 프로파일을 가지며, FAD2 효소에 대한 기질로서 사용될 수 있는 그의 인지질 중에 충분한 올레산을 함유한다. 상기는 또한 내인성적인 FAD2 활성이 없다. 따라서, 상기 11 개 후보 CtFAD2 유전자들을 pYES2 유도된 구조물을 사용하여 효모 균주 YPH499에서 시험하였으며, 각각의 개방 판독 프레임은 실시예 1에 개시된 바와 같이 GAL1 프로모터의 조절 하에 있다.

도 3에 도시된 바와 같이, "빈 벡터" pYES2를 함유하는 효모 세포의 지방산 조성을 분석했을 때, 효모가 내인성적인 FAD2가 없기 때문에 예상된 바와 같이, 리놀레산(18:2) 또는 헥사데카다이에노산(16:2)이 검출되지 않았다. 대조적으로, CtFAD2-1, CtFAD2-2 및 CtFAD2-10 개방 판독 프레임을 발현하는 효모 세포로부터 수득된 지방산에 대한 기체 크로마토그램은 각각 11.293 분의 체류 시간을 갖는 지방산 피크를 나타내었으며, 이는 리놀레산(C18:2)에 상응하고, CtFAD2-9 및 CtFAD2-10에 대한 기체 크로마토그램은 8.513 분의 체류 시간을 갖는 지방산 피크를 나타내었으며, 이는 C16:2에 상응하였다. 이러한 데이터는 CtFAD2-1, CtFAD2-2 및 CtFAD2-10이 올레산을 리놀레산으로 전환시킬 수 있었으며, 따라서 Δ12 올리에이트 불포화효소임을 가리켰다. 그러나, 상기 생성된 18:2의 수준은 양성 대조군으로서 사용된 아라비도프시스 AtFAD2 구조물의 경우보다 더 낮았다. CtFAD2-10은 기질로서 각각 올레산(C18:1) 및 팔미트올레산(C16:1)을 사용하여 리놀레산(C18:2) 및 헥사데카다이에노산(C16:2)을 모두 생성시킨 반면, CtFAD2-9는 팔미트올레산을 불포화시켰고 따라서 Δ12 팔미트올리에이트 불포화효소였다. CtFAD2-11을 발현하는 효모 세포로부터 FAME의 크로마토그램 중에 나타난 2 개의 작은 새로운 피크는 이들의 피롤리다이드 부가물의 GC-MS, 및 DMOX에 의해 리놀레산(18:2 ^Δ9(Z),12(Z) ) 및 그의 트랜스 이성질체(18:2 ^Δ9(Z),12(E) )로서 확인되었다(도 3H). 표 9는 CtFAD2 암호화 영역을 발현하는 효모 세포의 지방산 조성을 요약한다. CtFAD2-3, -4, -5, -6, -7 및 -8을 발현하는 효소 세포에서 새로운 피크는 검출되지 않았다.

상기 후보 CtFAD2 폴리펩티드들 중 어떤 것이 지방산 하이드록실라제 활성을 갖는지를 검사하기 위해서, 상기 CtFAD2 개방 판독 프레임 각각을 발현하는 효모 세포로부터 제조된 FAME를, 하이드록실 잔기를 TMS-에테르 유도체로 전환시키는 실릴화 시약과 반응시켰으며 이로부터 질량 스펙트럼을 검사할 수 있었다. 그러나, 올레산과 같은 통상적인 지방산의 하이드록실 유도체는 상기 후보 CtFAD2 개방 판독 프레임을 발현하는 효모 세포주들 중 어느 것에서도 검출되지 않았다. 이는 상기 11 개 CtFAD2 유전자 중 어느 것도 효모에서 지방산 하이드록실라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하지 않음을 가리켰다.

Δ12-에폭시게나제 및 Δ12-아세틸레나제 활성(이 둘은 모두 지방산 기질로서 리놀레산을 사용함)을 검출하기 위해서, 동일한 효모 세포주의 생육 배지에 유리 리놀레산을 보충하고 그 후에 상기 지방산 조성을 분석함으로써 추가적인 실험을 수행하였다. 상기 보충은 상기 구조물을 발현시키기 위해서 상기 배양물에 갈락토스를 첨가한 후에 수행되었다. 에폭시 및 아세틸렌계 지방산 유도체를 나타내는 것들을 포함하여, 새로운 지방산 피크들이 상기 기체 크로마토그램에서 검출되지 않았다. 외부적인 유리 지방산의 보충과 함께, 효모 중 이들 새로운 지방산의 이종 발현은 활성을 입증하는데 약간의 어려움에 부닥친다(Lee et al., 1998; Cahoon et al., 2003). 따라서, 식물 세포에서 작용성 분석은 하기와 같이 수행되었다.

엔 벤타미아나에서 후보 CtFAD2 유전자의 일시적인 발현

식물 세포, 특히 식물 잎에서 구성적인 방식으로 상기 유전자들을 발현시키기 위해서, 각각의 CtFAD2 ORF를 변형된 pORE04 2원 벡터에, 증대된 CaMV-35S 프로모터와 폴리아데닐화 신호 서열(Coutu et al., 2007)(서열번호 54)을 함유하는 nos3' 종결자 사이에 센스 배향으로 삽입하였다. 선행의 연구는 트랜스유전자의 발현을 상기 바이러스 침묵화 억제 단백질, P19의 공-발현에 의해 현저하게 증대시켜, 엔 벤타미아나 잎-기재 일시 분석에서 숙주 트랜스유전자 침묵화를 감소시킬 수 있음을 가리켰다(Voinnet et al., 2003; Wood et al., 2009; Petrie et al., 2010). 이들 실험을 실시예 1에 개시된 바와 같이 수행하였다.

상술한 바와 같이, CtFAD2-11의 작용을 처음에 에스 세레비지아에의 발현에 의해 평가하였으며 2 개의 새로운 지방산이 GC-MS에 의해, 각각 18:2 ^Δ9(Z),12(Z) 및 18:2 ^Δ9(Z),12(E) 로서 확인되었다. 효모로부터 획득된 결과와 동일되게, 엔 벤타미아나 잎에서 CtFAD2-11의 발현은 새로운 18:2 트랜스 이성질체를 제공하였다. 상기 이성질체의 메틸 에스테르는 메틸 18:2 ^Δ9(Z),12(E) 의 것에 동일한 GC 체류 시간을 나타내었다(도 4B). 상기 새로운 18:2 ^Δ9(Z),12(E) 는 CtFAD2-11의 일시 발현 후 잎 중 지방산의 0.35%를 차지하였다(표 10). 또한, 상기 효모 배양물에서 관찰되지 않은 또 다른 새로운 피크가 검출되었다. 상기 새로운 지방산의 전체 이온 크로마토그램 및 질량 스펙트럼은 크레페닌산(18:2 ^Δ9(Z),12(c) )의 경우와 동일하였으며(도 4B 및 C), 이는 상기 CtFAD2-11 폴리펩티드가 Δ12-아세틸레나제 활성을 가짐을 입증한다. 표 10에 나타낸 바와 같이, 크레페닌산은 전체 지방산의 0.51%를 차지하였다.

엔 벤타미아나 세포에서 일시적인 CtFAD2-11의 발현은 형질전환되지 않은 대조군에 비해 상기 18:2 ^Δ9(Z),12(Z) 의 함량의 감소를 생성시키는 것으로 관찰되었다(표 10). 이는 엔 벤타미아나 세포에서 CtFAD2-11과 내인성적인 시스-Δ12 올리에이트 불포화효소의 올레산(상기 두 효소 모두에 대한 기질)의 이용가능한 풀에 대한 경쟁에 기인하는 듯하였다. 전체적으로, 상기 효모 및 엔 벤타미아나 발현 실험으로부터의 결과는 CtFAD2-11이 주로 입체-특이적이 없는 올리에이트 Δ12-불활성효소로서 작용하여, 리놀레산 및 그의 트랜스-Δ12 이성체를 모두 생성시킴을 가리켰다. 또한, 상기는 리놀레산의 Δ12 이중연결을 추가로 불활성화시켜 크레페닌산의 아세틸렌 연결을 형성시킬 수 있었다.

다른 10 개의 후보 CtFAD2 폴리펩티드들도 또한 같은 방식으로 엔 벤타미아나 잎에서 일시적으로 발현시켰으나, 이미 높은 수준의 FAD2를 갖는 엔 벤타미아나 잎 중에 내인성적으로 존재하지 않는 어떠한 새로운 지방산도 관찰하지 못했다.

논의

잇꽃에서 확인된 상술한 11 개 후보 CtFAD2 유전자들은 지금까지 검사된 임의의 식물 종들에서 관찰된 가장 큰 FAD2 유전자과를 나타낸다. 오직 단일의 FAD2 유전자만이 아라비도프시스에서 확인되었지만(Okuley et al., 1994), FAD2는 지금까지 연구된 대일부분의 다른 식물 게놈들에서 다수의 유전자들에 의해 암호화되는 것으로 보인다. 2 개의 독특한 FAD2 유전자가 대두(Heppard et al., 1996), 아마(Fofana et al., 2004; Khadake et al., 2009) 및 올리브(Hernanze et al., 2005)에서 개시되었으며; 해바라기(Martinez-Rivas et al., 2001) 및 카멜리나 사티바( Camelina sativa )(Kang et al., 2011)에서 3 개의 유전자; 및 목화(Liu et al., 1998)에서 5 개의 유전자가 개시되었다. 양쪽사배체 종 브라시카 나푸스에서, 4 내지 6 개의 상이한 FAD2 유전자가 각각 이배체 서브-게놈에서 확인되었다(Scheffler et al., 1997). 상기 후보 CtFAD2 유전자들은 모두, 상기 서열들이 cDNA로부터 단리되었기 때문에, 잇꽃 식물에서 발현되었다. 이를 실시예 6에 개시된 바와 같이 추가로 검사하였다.

필적할만한 연구들은 없지만, 잇꽃은 FAD2 유전자과 진화에 관하여 특별함이 분명하다. 잇꽃은 야생형 이배체 종 카르타무스 팔라에스티누스에 가장 가깝게 관련된 자가-수분 이배체 식물종이며 광범위한 게놈 중복 또는 재배열을 갖지 않는 것으로 알려져 있다(Chapman and Burke, 2007). 확인된 다수의 FAD2 cDNA들은, 상기 후보 FAD2 유전자들이 암호화 영역 서열에 인트론을 함유하지 않기 때문에 대체 연접에 기여할 수 없었다. 오히려, 유전자 중복이 잇꽃에서 FAD2 과 복잡성을 생성시키는데 보다 더 원인이 되는 듯하였다. 계통수의 위상은 유전자 증복이 다수의 계층적 수준으로 발생할 수도 있음을 보였다. 예를 들어, CtFAD2-3, -4 및 -5 폴리펩티드는, 이들이 다른 잇꽃 FAD2 서열에 대해서보다 상기 계통군에서 다른 것들과 더 밀접하게 관련되었으며, 이는 보다 최근의 유전자 중복이 상기 계통군의 출현에 기여할 수도 있음을 가리킨다.

실시예 6. 잇꽃에서 FAD2 후보 유전자의 발현 수준

상이한 조직들에서 FAD2 유전자의 발현 프로파일

다양한 후보 CtFAD2 유전자의 조직 발현 패턴을 측정하기 위해서, RT-PCR 분석을 실시예 1에 개시된 바와 같이 수행하였다. 전체 RNA를 고 리놀레산 유전자형 SU의 10 DAG의 잇꽃 묘종으로부터 유래한 떡잎, 배축, 뿌리 및 잎 조직으로부터, 및 꽃 식물로부터의 꽃 조직 및 발생 배로부터 추출하고, 상기 분석에 사용하였다. 상기 분석에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 표 11에 나열한다.

상기 11 개 CtFAD2 유전자의 시간상 및 공간산 발현 패턴을 도 5에 나타낸다. RT-qPCR 분석은 CtFAD2-1이 발생 종자에서 광범위하게 발현됨을 보였다. 대조적으로, CtFAD2-2는 종자뿐만 아니라 검사된 다른 조직들에서 낮은 수준으로 발현되었다. 더욱이, CtFAD2-4, -5, -6, -7, -8, -9의 발현은 발생 배에서 관찰되지 않았다. 낮지만, 여전히 검출 가능한, CtFAD2-10 및 -11의 발현 수준이 발생 종자에서 관찰되었으며, 상기 잇꽃 종자가 성숙에 접근하는 말기 발생 단계에서는 더 그랬다. CtFAD2-4, -6, -7, -9 및 -11은 모두 떡잎 및 배축을 포함하여 어린 묘종 조직에서 높은 수준의 발현을 나타내었다. CtFAD2-5 및 -8은 뿌리-특이적인 것으로 나타났고 CtFAD2-10은 꽃 조직에서 우선적으로 발현되었으며, 발생 종자, 및 10일된 묘종 조직을 포함한 검사된 다양한 다른 조직들에서 비교적 낮은 수준으로 검출되었다.

전체 RNA 주형은 있지만 역전사효소는 없는 대조용 반응에서 40 주기의 증폭 후에 증폭 산물은 검출되지 않았으며, 이는 상기 RNA 제제 중 오염 게놈 DNA의 부재를 가리킨다.

실시예 7. 잇꽃 품종 S317에서 유전자 돌연변이의 입증

인도로부터 잇꽃 도입시 발견된, 처음으로 확인된 잇꽃 중 고올레산 특성은 단일 자리 OL에서 ol로 표시된 일부분적으로 수용성인 대립유전자에 위해 조절되었다(Knowles and Hill, 1964). 상기 olol 유전자형의 올레산 함량은 온실-재배된 식물의 경우 대개 71 내지 75%가었다(Knowles, 1989). 노울스(1968)는 상기 ol 대립유전자를 잇꽃 품종개량 프로그램에 통합시켰으며 미국에서 1966년에 최초 고 올레산(HO) 잇꽃 품종 "UC-1"을 출하하였고, 이어서 개량된 품종 "올레익 리드" 및 새폴라 317(S-317), S-517 및 S-518을 포함하여, 새폴라 시리즈를 출하하였다. 상기 고 올레산(olol) 유전자형은 상이한 온도에서 비교적 안정하였다(Bartholomew, 1971). 또한, 노울스(1972)는 동형접합성 조건에서 35 내지 50% 올레산을 생성시키는, 동일한 자리의 상이한 대립유전자 ol ₁ 을 또한 개시하였다. olol 유전자형과 대조적으로, ol ₁ ol ₁ 유전자형은 온도에 강한 반응을 나타내었다(Knowles, 1972).

보다 높은 올레산 함량(>85%)을 갖는 추가의 생식질이 보고되었다(Fernandez-Martinez et al., 1993; Bergman et al., 2006). 잇꽃에서 89% 이하의 올레산 함량이 원래 방글라데시로부터 기원한 생식질 수탁물 PI401472에서, 페르난데즈-마르티네즈(1993)에 의해 보고되었다. 버그만(Bergman) 등(2006)에 의해 개발된 몬톨라(Montola) 시리즈는 80% 초과의 올레산을 함유하며, 이는 분명히 노울스와 힐스(1964)에 의해 개시된 바와 같은 olol 대립유전자를 함유하는 "UC-1" 품종 중 올레산의 최고 수준 이상이다. 교배 및 분리 분석을 통한 유전자 분석에서, 높은 올레산 및 매우 높은 올레산 품종은 이들 두 품종이 모두 OL 자리에 동일하 대립유전자를 공유함을 암시하였다. 상기 매우 높은 올레산 함량(85%)은 ol 대립유전자 및 올레산에 작은 양의 효과를 갖는 변형 유전자의 조합에 의해 생성되었다(Hamdan et al., 2009).

고 올레산 돌연변이 품종 S-317의 시험관내 생화학적 특성화

잇꽃 마이크로솜을 문헌[Stymne and Appelqvist (1978)]에 개시된 바와 같이, 개화 후(DPA) 약 15일째에, 중간-성숙기에서 고 올레산 유전자형 S-317의 발생 종자로부터 새로 제조하였다. 표준 90 ㎕ 반응 혼합물은 0.1 mmol 칼륨 포스페이트 완충제 pH 7.2 중에 40 ㎍ 마이크로솜 단백질, 2 nmol [ ¹⁴ C]올레오일-CoA를 함유하였다. 이어서, 10 ㎕의 50 mM NADH를 가하고 추가로 5, 10 또는 20 분 동안 배양을 계속하였다. 상기 반응을, 90 ㎕의 0.15 M 아세트산을 가하여 정지시키고 지질을 500 ㎕ CHCl ₃ :MeOH(1:1)로 추출하였다. 보다 하부의 CHCl ₃ 상을 회수하고 이로부터 극성 지질을 용매 시스템 CHCl ₃ /MeOH/HAc/H ₂ 0(90:15:10:3 v/v/v/v)을 사용하여 박층 크로마토그래피(TLC)에 의해 분리시켰다. PC에 상응하는 스폿을 상기 플레이트로부터 긁어내고 회합된 지방 아실기를 90 ℃에서 30 분 동안 MeOH 중의 2% 황산 2 ㎖ 중에서 트랜스메틸화하였다. 생성된 FAME를 헥산:DEE:HAc(85:15:1 v/v/v)으로 AgNO ₃ 처리된 TLC 플레이트상에서 분리시켰다. ¹⁴ C 표지된 올리에이트 및 리놀리에이트 메틸에스테르 표준을 기준으로서 상기 플레이트상에 스폿팅하였다. 상기 플레이트를 노출시키고 후지필름 FLA-5000 포스포이미저에 의해 분석하였다. 각 샘플의 방사성을 후지필름 멀티 게이지 소프트웨어에 의해 정량분석하였다.

야생형 마이크로솜과의 반응에 NADH의 첨가시, 상기 첨가된 [ ¹⁴ C]올레오일-CoA가 [ ¹⁴ C]리놀리에이트의 출현과 동시에 10 분 이내에 급속히 사라지는 것이 관찰되었으며, 이는 야생형 잇꽃 마이크로솜에서 올리에이트의 리놀리에이트로의 효율적인 전환을 가리킨다. 대조적으로 고 올레산 유전자형 S-317의 경우, [ ¹⁴ C]올리에이트 대 [ ¹⁴ C] 리놀리에이트의 현저하게 더 높은 비가 상기 시간 과정 전체를 통해서 시험관내 반응에서 발견되었으며(표 12), 이는 상기 마이크로솜에 의한 올리에이트의 불활성화를 통한 리놀레산의 생합성이 상기 유전자형에서 극적으로 감소하였음을 가리킨다.

고 올레산 대립유전자 ol의 분자 특성화

잇꽃에서 고 올레산 유전자형(olol)의 분자 기준을 이해하기 위해서, 2 개의 종자-발현된 FAD2 cDNA, 즉 CtFAD2-1 및 CtFAD2-2를 3 개의 고 올레산 품종: S-317, LeSaf 496 및 CW99-OL로부터 PCR에 의해 증폭시켰으며 서열분석하였다. 3 개의 고 올레산 품종 모두로부터의 CtFAD2-1 유전자들의 전체 암호화 영역을 포함하는 cDNA는 뉴클레오티드 서열에 있어서 서로 동일하였으며, 야생형 품종 SU(야생형에 비해 HO 유전자형에서 하나의 뉴클레오티드 결실 및 22 개의 뉴클레오티드 치환을 포함함)로부터 유도된 CtFAD2-1 cDNA와 약 98%의 서열 동일성을 공유하였다. 단일 염기쌍 결실이 상기 CtFAD2-1 암호화 영역의 대략 중간에서, 첫 번째 ATG로부터 카운트하여 606 뉴클레오티드에서 발견되었다. 상기 결실은 상기 결실 후 바로 정지 코돈을 생성시킨 번역 판독 프레임 중의 이동을 야기하였으며, 따라서 상기 3 개의 olol 품종 중 돌연변이 유전자는 야생형 단백질 중에 존재하는 세 번째 히스티딘 상자 없이 예견되는 평활화된 폴리펩티드를 암호화하였다(도 6). 상기 ol 대립유전자의 결실된 단일 뉴클레오티드 부위 부근의 DNA 서열 중 비교적 높은 수준의 서열 변화가 존재함은 주목할만하였으며, 이는 추가적인 돌연변이가 돌연변이 유전자에 축적됨을 암시한다.

CtFAD2-1 및 CtFAD2-2의 5'UTR 인트론을 포함한 DNA 영역을 또한 상기 olol 돌연변이 S-317로부터 단리하였으며 야생형 인트론과 비교하였다. S-317로부터의 CtFAD2-1 인트론은 길이가 1144 bp이고, 길이가 1083 bp인 야생형 SU 인트론보다 61 bp 더 길었다. 상기 CtFAD2-1 인트론의 뉴클레오티드 서열의 비교는 76.8%의 전체 서열 동일성을 나타내었으며, 상기 인트론은 27 개의 삽입결실 및 95 개의 단일 뉴클레오티드 치환이 상이하였다(도 7).

흥미롭게도, 상기 돌연변이 유전자에서 상기 뉴클레오티드 치환은, 22 개 치환 중 14 개(63.6%)가 상기 뉴클레오티드 결실 부근에 존재하며 대일부분 상기 단일 뉴클레오티드 결실의 바로 하류 123 bp내에 존재한다는 점에서, 결함 CtFAD2-1의 암호화 영역에 상응하는 1142 bp 길이 영역 전체에 고르게 분포되지 않았다. 대조적으로, 야생형 및 돌연변이 유전자형 중 CtFAD2-2 인트론은 전체 99.5% 서열 동일성을 공유하였으며, 단지 12 개의 뉴클레오티드 치환 및 하나의 2-nt 삽입결실을 가졌다. 이는 상기 HO 돌연변이체 중 상기 결함 CtFAD2-1 유전자 중에 약간의 선택 압력이 발생했거나, 또는 추정상 더 그럴듯하게, 상기 CtFAD2-1 돌연변이가 고대 기원이고 씨 팔라에스티누스와 같은 잇꽃의 선조 종으로부터 기원했음을 가리킨다.

상업적인 고 올레산 품종 S-518로부터 유도된 EMS 돌연변이체(S-901)가 US 5,912,416에 개시되었다. 유전자 연구는 상기 새로운 유전자형 중 소위 ol ₂ 대립유전자가 상기 OL 자리 중 ol 및 ol ₁ 대립유전자와 별개임을 가리켰지만, 그의 분자 성질은 웨이스커(Weisker)(US 5,912,416)에 의해 측정되지 않았다. 상기 S-901 유전자형은 성숙한 종자에서 전체 지방산의 89.5 내지 91.5%의 올레산 수준의 증가를 특징으로 하였다. 포화 지방산의 감소가 존재하였다, 즉 팔미트산이 약 4%로 감소하였고 스테아르산이 약 2.5%로 감소하였다. 그러나, S-901은 통상적인 식물 표현형을 나타내지 않았으며 일부 훼손된 생육 및 수율이 문제가 되었다. 형태학적으로, 상기는 그의 모체 계통 S-518에 비해 보다 짧았으며 꽃 머리는 더 작았다. 상기는 또한 상기 종자에서 늦게 개화하고 적은 오일을 함유한다.

고 올레산 품종개량을 위한 완벽한 PCR 마커의 설계

상기 HO 표현형에 원인이 되는 원인 돌연변이인 것으로 결론내려진, 돌연변이 CtFAD2-1 대립유전자 중 단일 뉴클레오티드 결실-서열 다형성을, 상기 돌연변이 ol 대립유전자를 추적하기 위한 고도로 효율적인 분자 마커의 분자 기준으로 개발하였다. 따라서 발명자들은 이형접합성 상태로 존재하는 경우에조차, 품종개량 목적 또는 품종 확인 목적을 위해 상기 돌연변이 ol 대립유전자의 확인 및 선택을 허용하는 분자 마커 분석을 개발하였다. 분자 마커 지원된 선택은 상기 지방산 표현형에 대해 선별해야 하는 식물의 잉여 세대를 생성시킬 필요성을 제거한다. 완벽한 분자 마커 분석과 병용되는 간단한 유전학은 잇꽃 품종개량자가 고 올레산 특성을 그의 품종개량 프로그램에 신속하게 통합시킬 수 있게 할 것이다.

야생형 SU와 고 올레산 유전자형 S-317 사이의 CtFAD2-1의 엑손에 PCR 반응을 근거로 차별적인 마커를 쉽게 생성시키에 불충분한 서열 변이가 존재하는 것으로 나타났다. 그러나, 발명자들은 OL과 ol 대립유전자 사이의 CtFAD2-1의 5'UTR 인트론 중의 비교적 높은 서열 분기를 이용할 수 있었다. 이들 두 대립유전자 사이에 고도로 가변성인 서열의 신장부가 존재하였으며, 이는 독특한 PCR 프라이머의 설계를 가능하게 하였다. 하기의 예시적인 프라이머들을, 야생형 SU 중에는 존재하지 않는, 상기 olol 돌연변이 대립유전자를 수반하는 고-올레산 유전자형으로부터 315 bp 길이의 특이적인 산물을 증폭하도록 설계하였다. HO-센스: 5'-ATAAGGCTGTGTTCACGGGTTT-3' (서열번호 140); 및 HO-안티센스: 5'-GCTCAGTTGGGGATACAAGGAT-3' (서열번호 141) (도 7). 603 bp PCR 산물을 생성시키는 품종 SU 중의 야생형 유전자에 특이적인 또 다른 예시적인 프라이머들의 쌍은 하기와 같다: HL-센스: 5'-AGTTATGGTTCGATGATCGACG-3' (서열번호 142); 및 HL-안티센스: 5'-TTGCTATACATATTGAAGGCACT -3' (서열번호 143) (도 7). 상기 잇꽃 KASII 유전자로부터 유도된 한 쌍의 프라이머, ctkasII-센스: 5'- CTGAACTGCAATTATCTAGG-3' (서열번호 144) 및 ctkasII-안티센스 5'- GGTATTGGTATTGGATGGGCG -3' (서열번호 145)를 주형 DNA의 동일한 로딩 및 양호한 PCR 성능을 보장하기 위해서 양성 대조군으로서 사용하였다.

상기 PCR 반응 조건은 94 ℃ 2 분에 이어서, 40 주기의 94 ℃ 30 초, 58 ℃ 30 초 및 72 ℃ 30 초였다. 상기 반응 생성물을 1% 아가로스 젤상에서 전기영동에 의해 분리시키고 상기 젤의 에티디움 브로마이드 염색에 따라 UV 광 하에서 가시화하였다. 약 300 bp의 단편이 검사된 5 개의 고 올레산 유전자형, 즉 S-317, S-517, CW99-OL, LeSaf496 및 Ciano-OL 모두에 대한 증폭 반응에서 관찰된 반면, 상기와 같은 단편은 야생형 유전자형 SU의 경우에는 부재하였다. 반대로, 약 600 bp의 단편은 야생형 잇꽃 SU에 대한 증폭에서 존재하였지만, 시험된 고 올레산 품종 중 어느 것에서도 존재하지 않았다. 양성 대조군으로서, KASII 유전자로부터 유도된 198 bp 밴드를 상기 시험된 품종 모두에 대한 반응에서 증폭시켰다. 상기 앰플리콘의 정체를 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.

상기 고 올레산 및 야생형 잇꽃 대립유전자 사이의 CtFAD2-1 유전자의 5'UTR 인트론 영역에서 서열 분기는 상기 CtFAD2-1 돌연변이의 존재 또는 부재에 대한 PCR 마커 진단의 개발을 촉진시켰다. 이는 상기 유전적 배경이 무엇이든간에 상기 ol 대립유전자와 완벽하게 연결되었다, 즉 상기는 완벽하게 연결된 마커이었다. 그러나, 상기 분자 마커는 우성 마커이며 결과적으로 상기 마커의 단독적인 사용은 상기 ol 대립유전자에 대한 동형접합성 및 이형접합성 유전자형 간의 구별을 허용하지 않을 것이다. 이를 극복하기 위해서, 오직 야생형 Ol 대립유전자만을 증폭시키는 또 다른 쌍의 PCR 프라이머를 설계하였다. 결과적으로, 고 올레산 특이적 PCR 프라이머와 함께 상기와 같은 야생형 특이적 프라이머의 사용은 CtFAD2-1 자리에서 동형접합성과 이형접합성 유전자형 사이를 구분할 수 있게 하였다.

CtFAD2-1 발현은 고 올레산 유전자형에서 대단히 감소된다

상기 섹션에서, CtFAD2-1은 오직 발생 종자의 발생 배에서만 발현되었으며 어린 잇꽃 묘종으로부터 유래된 잎, 뿌리, 꽃, 떡잎 및 배축을 포함하여, 다양한 다른 검사된 조직들에서 검출가능하게 발현되지 않았다. CtFAD2-1은 지방산 대사율이 높은 발생 종자에서 고도로 발현되었으며, 비교적 짧은 기간 동안 대개 C18:2를 갖는 활성 오일 축적을 이끌었다. CtFAD2-1은 종자 발생 중 대략 중간 지점에서 최고의 발현 수준을 가졌으며, 종자 발생의 초기 및 말기 모두에서는 보다 보통의 발현 수준을 가졌다.

상기 RT-qPCR 분석 방법을 사용하여, 상기 CtFAD2-1 유전자의 표준화된 유전자 발현 수준을 3 개의 고 올레산 품종, 즉 S-317, Lesaff496 및 CW99-OL에서 측정하고, 야생형 유전자형 SU의 발생 종자에서 것과 비교하였다. 도 8에서 볼 수 있는 바와 같이, CtFAD2-1 발현이 야생형 잇꽃 유전자형 SU에서 발생 배의 3 개 단계 모두에서 검출되었으며, 이때 최고 수준의 발현은 중간-성숙기에서 관찰되었고, 이는 선행의 결과와 동일하였으며 상기 핵심 FAD2 유전자에 대한 시간상 전사 패턴을 입증하였다. 그러나, CtFAD2-1 전사체은 상기 3 개의 고 올레산 품종 S-317, Lesaff496 및 CW99-OL에서 거의 검출할 수 없었고(도 8), 이는 상기 돌연변이 배에서 상기 유전자로부터의 RNA 전사체의 높은 수준의 불안정성을 가리킨다.

대조적으로, CtFAD2-2로부터의 전사체 수준은 야생형 및 고 올레산 유전자형에 대해서 유사하였으며, 이는 CtFAD2-2 발현이 상기 HO 배에서 영향을 받지 않음을 나타낼 뿐만 아니라 상기 RNA 제제가 상기 분석에 적합하게 순수함을 입증한다. 따라서, CtFAD2-2 발현이 또한 발생 잇꽃 종자에서 저장 지질에 대한 지방산의 Δ12-불포화에, 상기 야생형 종자에서 CtFAD2-1에 대한 것보다 훨씬 더 낮은 수준으로 기여할 수 있을 뿐만 아니라 뿌리, 잎 및 줄기 중 막 지질에 대한 지방산의 Δ12-불포화에 관련된다고 결론 내렸다. CtFAD2-2 발현이 상기 CtFAD2-1 돌연변이의 발생 잇꽃 종자 중 CtFAD2-1 활성에 반응하거나, 또는 이에 대한 보상으로서 고 올레산 돌연변이체에서 상승된다는 증거는 없다.

HO 계통에서 극적으로 감소된 CtFAD2-1 전사체은 비-센스 매개된 RNA 분해(NMD)에 의해 야기된다

HO 배에서 CtFAD2-1 전사체의 대단히 감소된 수준은 CtFAD2-1 mRNA의 비-센스 매개된 mRNA 분해(NMD)에 의해 유발되었을 수도 있는데, 그 이유는 조기 정지 코돈이 상기 단일 뉴클레오티드 결실 후 바로 암호화 서열의 중간에서 발견되었기 때문이다. 상기 NMD 시스템은 예상밖의 오차들, 예를 들어 게놈 돌연변이, 전사 오차 및 오-연접으로부터 생성되는 조기 종결 코돈(PTC)을 함유하는 이상 mRNA의 분해에 관련된 기전인 것으로 생각된다. 상기는 진핵생물에서 보편적으로 존재하는 기전이고, 특히 상기는 효모 및 포유동물에서 광범위하게 연구되었다. 고등 식물에서는 오히려 불충분하고 연구되고 있지만, 대두 쿠니츠(Kunitz) 트립신 억제제 인자(Kti3), 강낭콩으로부터의 피토헤마글루티닌 유전자(PHA)(Jofuku et al., 1989; Voelker et al., 1990), 완두콩 피리독신 유전자(FED1)(Dickey et al., 1994) 및 찹쌀 유전자(Isshiki et al., 2001)를 포함하는 소수의 보고서가 존재한다.

이들 실험에서 잇꽃 종자오일 중 고 올레산 특성을 유도하는 ol 돌연변이가 발생 종자 중 낮은 수준의 CtFAD2-1 mRNA 축적과 상관있음이 입증되었다. 선행의 연구는 상기 ol 대립유전자가 반 열성이며, 이는 작은 RNA에 의해 매개된 전사후 유전자 침묵화 기전과 동일하지 않았다. 유전자 침묵화는, 안티센스 또는 헤어핀 RNA의 전사로부터 생성되는 이중 가닥 RNA로부터 생성된 21 내지 24 nt siRNA를 수반하며, 유전적으로 우성 또는 반 우성 자리로서 작용할 수 있다(Brodersen and Voinnet, 2006). 상기 ol 돌연변이의 기전이 RNAi 관련된 유전자 침묵화와 별개인지를 입증하기 위해서, 우리는 하기와 같이 작은 RNA 서열분석를 수행하였다.

고 올레산 유전자형 S-317 및 야생형 SU로부터 유도된 2 개의 작은 RNA 라이브러리를 중간-성숙 발생 배로부터 단리하여 모은 RNA를 사용하여 발생시켰다. 상기 작은 RAN 라이브러리의 벌크 서열분석를 솔렉사(Solexa) 기술로 수행하였다(Hafner et al., 2008). 이들 두 라이브러리의 서열분석를 일루미나(Illumina)의 솔렉사 서열분석기상에서 수행하였으며 상기 샘플들을 나란히 실행하였다. SU 및 S-317 작은 RNA 라이브러리의 서열분석는 각각 총 23,160,261 및 21,696,852의 원 판독치를 생성시켰다. 이들 판독치의 분석은 각각 18 내지 30 뉴클레오티드(nt) 범위 길이의 22,860,098 및 21,427,392 서열을 확인시켰다. 상기 SU 및 S-317 라이브러리 중의 CtFAD2-1에 상응하는 작은 RNA의 존재 및 분포를 측정하였다. 오직 낮은, 거의 검출할 수 없는 수준의, CtFAD2-1에 상응하는 작은 RNA가 상기 두 작은 RNA 라이브러리로부터 검출되었으며 CtFAD2-1 유전자의 암호화 영역에 걸쳐 거의 균일하게 분포되었다. 상기 야생형과 고 올레산 라이브러리간에 분명한 차이는 없었다.

상기 데이터로부터, 작은-RNA 매개된 전사후 유전자 침묵화가 상기 돌연변이 CtFAD2-1 전사체의 축적을 방지하는 주요 기전이 아니라는 결론을 내렸다.

엔 벤타미아나 잎에서 일시적인 발현 연구

상기 NMD 현상을 추가로 조사하기 위해서, 발명자들은 엔 벤타미아나 잎에서 야생형 및 고 올레산 유전자형 모두로부터 유도된 CtFAD2-1의 일시적인 발현에 대한 실험을 수행하였다.

각각의 상기 CtFAD2-1 ORF를 CaMV-35S 프로모터의 조절 하에서 변형된 pORE04 2원 벡터에 센스 배향으로 삽입하였다. 35S:CtFAD2-1 또는 그의 돌연변이 형 35S:CtFAD2-1Δ를 갖는 아그로박테리움 튜마파시엔스 균주 AGL1을 실시예 5에 개시된 바와 같이, 35S:P19와 함께 엔 벤타미아나의 충분히 팽창된 잎의 아랫면에 침윤시켰다. 24 ℃에서 5 일의 추가 생육 기간에 이어서, 상기 침윤된 영역을 절제하고 전체 RNA를 RNeasy 미니 키트(퀴아겐)를 사용하여 상기 샘플들로부터 수득하였다. CtFAD2-1 RNA 수준을 측정하기 위해서, 실시간 qPCR 분석을 플라티늄 SYBR 그린 qPCR 슈퍼믹스-UDG(인비트로젠)를 사용하여 3 회 중복해서 수행하고 실시예 1에 개시된 바와 같이 ABI 7900HT 서열 검출 시스템 상에서 실행하였다. PCR을 하기의 조건 하에서 수행하였다: 초기 48 ℃ 30 분, 이어서 95 ℃ 10 분, 이어서 40 주기의 95 ℃ 15 초 및 60 ℃ 60 초. 상기 외인성 CtFAD2-1 유전자에 대한 프라이머는 하기와 같았다: 센스: 5'- GTGTATGTCTGCCTCCGAGA -3' (서열번호 146); 안티센스: 5'- GCAAGGTAGTAGAGGACGAAG - 3' (서열번호 147). 기준 유전자, 잇꽃 CtKASII를 사용하여 상기 발현 수준을 표준화하였다; 그의 특이적 프라이머는 하기와 같았다: 센스: 5'- CTGAACTGCAATTATCTAGG-3' (서열번호 144); 및 안티센스: 5'- GGTATTGGTATTGGATGGGCG-3' (서열번호 145). 높은 수준의 CtFAD2-1 발현이 야생형 SU 품종으로부터 유도된 35S-CtFAD2-1 유전자로부터 엔 벤타미아나 잎에서 관찰되었다. 비교에서, 훨씬 더 낮은 수준의 발현이 상기 고 올레산 유전자형으로부터 유도된 35S-CtFAD2-1Δ 유전자에 대해서 관찰되었다.

에이 탈리아나 생태형 Col-0 플랜트를 문헌[Clough and Bent(1998)]의 방법에 따라, 상기 CtFAD2-1 또는 상기 CtFAD2-1Δ 암호화 영역을 구동하는 종자-특이적 프로모터 Fp1을 갖는 2원 벡터를 갖는 에이 튜메파시엔스 균주 AGL1으로 형질전환시켰다. 전체 RNA를 RNeasy 미니 키트(퀴아겐)를 사용하여 상기 생성된 형질전환된 식물의 자손의 중간-성숙기 배를 함유하는 장각과로부터 단리하였다. 유전자 발현 연구를 상술한 바와 같이 3 회 중복 수행된, 실시간 RT-qPCR 분석에 의해 상기 RNA 제제를 사용하여 수행하였다. 높은 수준의 CtFAD2-1 발현이 SU로부터 유도된 Fp1-CtFAD2-1을 발현하는 아라비도프시스 장각과에서 관찰되었지만, 상기 고 올레산 유전자형으로부터 유도된 Fp1-CtFAD2-1Δ의 발현은 비교시 대단히 감소하였다.

CtFAD2-1 특이적 작은 RNA는, 돌연변이 CtFAD2-1 전사체의 양이 대단히 감소한다 하더라도, 야생형 유전자로부터의 작은 RNA에 비해 고 올레산 잇꽃 종자의 발생에 있어서 그다지 높은 수준으로 생성되지 않음을 입증하였다. 따라서, 고 올레산 유전자형에서 CtFAD2-1 RNA의 감소는 NMD에 기인하며, 이는 작은 RNA 매개된 전사후 유전자 침묵화 기전과 다른 것으로 결론이 내려졌다. 상기 NMD 현상은 또한 돌연변이 암호화 영역이 엔 벤타미아나 잎 또는 아라비도프시스 장각과에서 외부적으로 발현될 때 관찰되었다.

실시예 8. FATB 암호화를 위한 후보인 잇꽃 cDNA의 단리

잇꽃 FATB cDNA 서열의 단리

잇꽃 종자 오일은 대략 7% 팔미트산을 함유한다. 상기 지방산은 발생 종자 세포의 색소체에서 합성되며, 이로부터 트라이아실글리세롤에의 통합을 위해 상기 세포의 시토솔로 송출된다. 상기 팔미트산 송출에 핵심 효소는 팔미토일-ACP 티오에스테라제이며, 이는 상기 팔미토일 일부분과, 아실기가 상기 색소체에서 합성되는 동안 공유적으로 연결되는 아실 담체 단백질(ACP) 사이의 티오에스테르 연결을 가수분해시키는 팔미토일-ACP 티오에스테라제이다. 상기 효소 팔미토일-ACP 티오에스테라제는 FATB로 표시되는 용해성 색소체-표적화된 효소의 그룹에 속한다. 종자오일 식물에서, 상기 효소는 기질로서 단쇄 포화된 아실-ACP를 향한 특이적을 나타낸다. FATB 효소를 암호화하는 유전자는 처음에 캘리포니아 배이 트리(움벨룰라리아 칼리포르니카( Umbellularia californica ))로부터 중간쇄-길이 포화 지방산, 예를 들어 라우르산(C12:0)을 축적하는 식물 종으로부터 단리되었다. 후속의 연구는 FATB 상동기관이 모든 식물 조직 중에, 우세하게는 종자 중에 존재하며, 이때 기질 특이적 범위는 C8:0-ACP 내지 C18:0-ACP임을 입증하였다. 아라비도프시스 및 잇꽃을 포함한 대일부분의 온대성 유지종자 작물에서, 팔미트산이 종자오일 중 주요 포화 지방산이다.

FATB에 대한 후보를 암호화하는 잇꽃 cDNA를 단리하기 위해서, 발생 잇꽃 종자의 cDNA 라이브러리를 실시예 1에 개시된 바와 같이 목화(고시피움 히르수툼)로부터의 FATB cDNA 단편으로 이루어진 이종 탐침을 사용하여 선별하였다. CtFATB-T12라 칭하는, 하나의 완전길이 cDNA를 잇꽃 종자 cDNA 라이브러리로부터 단리하였다. 상기 cDNA는 1029 뉴클레오티드 길이의 개방 판독 프레임을 함유하였으며, 343 아미노산의 폴리펩티드를 암호화한다. 그의 5' 및 3' URT은 각각 길이가 236 nt 및 336 nt이었다. 상기 CtFATB-T12 폴리펩티드는 약 60 개 아미노산, 및 소위 핫도그 폴딩 단백질에 공통으로 폴딩되는 나선 및 다중가닥 종자의 2 개 반복부를 함유하는 210 개 아미노산 잔기 코어의 예견된 운송 펩티드를 가졌다.

잇꽃에 대한 국화과 게놈 프로젝트(CGP) 발현된 서열 태그(EST) 데이터베이스(cgpdb.ucdavis.edu/cgpdb2.)로부터, 3 개의 상이한 EST, 즉 EL379517, EL389827, 및 EL396749가 CtFATB-T12에 상동성을 갖는 것으로 확인되었다. 각각은 일부분적인 길이를 가졌다. 상응하는 유전자들을 각각 CtFATB-A, CtFATB-B 및 CtFATB-C라 표시하였다. 상기 잇꽃 종자 cDNA 라이브러리로부터 단리된 완전길이 cDNA CtFATB-T12는 그의 중복 영역 중 CtFATB-C로부터의 EST와 뉴클레오티드 서열이 동일하였다. CtFATB-A는 다른 2 개의 CtFATB 서열에 비해 그의 뉴클레오티드 서열이 보다 분기된 것으로 보인다.

실시간 qPCR 분석에 의한 CtFATB 유전자의 발현 프로파일

상기 3 개의 CtFATB 유전자의 유전자 발현 프로파일을 실시예 1에 개략된 바와 같이 실시간 qPCR에 의해 연구하였다. 상기 3 개 유전자 각각의 독특한 영역에 상응하는 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 하기와 같이 설계하였다: CtFATB-A, 센스 프라이머: 5'-AGAGATCATTGGAGACTAGAGTG-3' (서열번호 148); 안티센스 프라이머: 5'-CCCATCAAGCACAATTCTTCTTAG-3' (서열번호 149); CtFATB-B, 센스 프라이머: 5'-CTACACAATCGGACTCTGGTGCT-3' (서열번호 150); 안티센스 프라이머: 5'- GCCATCCATGACACCTATTCTA-3' (서열번호 151); CtFATB-C, 센스 프라이머: 5' -CCTCACTCTGGGACCAAGAAAT-3' (서열번호 152); 안티센스 프라이머: 5' -TTCTTGGGACATGTGACGTAGAA-3' (서열번호 153). PCR 반응들을 실시예 1에 개시된 바와 같이 3 회 중복수행하였다.

도 9에 도시된 바와 같이, CtFATB-A는 검사된 잎, 뿌리 및 발생 배의 3 개의 단계 모두에서 낮은 발현 수준을 나타내었다. CtFATB-B는 잎 및 뿌리에서 활성이었으나, 잎 및 뿌리에서보다는 발생 배에서 더 낮은 발현을 나타내었다. 이는 상기 유전자가 발생 종자에서 지방산 생합성에 있어서 단지 작은 역할(존재하는 경우)만을 할뿐임을 암시하였다. 대조적으로, CtFATB-C는 검사된 모든 조직들, 특히 발생 배에 걸쳐 높은 발현 수준을 나타내었다. 이는 CtFATB-C가 잇꽃 종자오일에서 팔미트산의 생산에 핵심적인 FATB 암호화 유전자임을 가리켰다. 이는 상기 종자 배 라이브러리로부터의 단지 하나의 FATB cDNA 클론, 즉 CtFATB-C와 서열이 동일한 CtFATB-T12에 대한 우리의 발견과 동일하였다. 이러한 데이터를 근거로, CtFATB-T12(CtFATB-C)로부터 유도된 대략 300 bp DNA 단편을 하기의 실시예들에 개시하는 바와 같이, 잇꽃 종자에서 FATB의 하향 조절을 위한 hpRNA 구조물의 제조에 사용되는 유전자 서열로서 선택하였다.

실시예 9: FAD6 를 암호화하는 잇꽃 cDNA 의 단리 및 발현

잇꽃 FAD6 cDNA 서열의 단리

마이크로솜 및 엽록체 막 지질 및 종자 저장 오일에서 발견되는 독특한 지방산 조성은, 지방산 생합성 및 소위 원핵생물 및 진핵생물 경로 모두를 통한 유출의 조절에 의해 상기 조성을 조절하는 작용을 하는 복잡한 대사 네트워크의 결과이다. 마이크로솜 FAD2 효소가 상기 색소체로부터 올레산의 송출 및 세포질에서 CoA 에스테르로의 전환에 따른, ER에서의 올리에이트에서 리놀리에이트로의 전환에 큰 역할을 함은 분명하다. 엽록체 오메가-6 불포화효소(FAD6)는 포스파티딜 글리세롤, 모노갈락토실다이아실글리세롤, 다이갈락토실다이아실글리세롤 및 설포구이노보실다이아실글리세롤을 포함하여 모든 16:1- 또는 18:1-함유 엽록체 막 지질상의 각각 16:1 및 18:1 지방산을 16:2 및 18:2로 불포화시키는 효소이다. 아라비도프시스 fad6 돌연변이체는 모든 엽록체 지질상에서 각각 16:1 및 18:1의 16:2 및 18:2로의 불포화가 결핍된 것으로 보고되었다(Browse et al., 1989). 상기 fad6 돌연변이체가 저온(5 ℃)에서 생육시, 상기 잎은 백화되며 생육속도는 야생형에 비해 현저하게 감소되었다(Hugly and Somerville, 1992). FAD6 암호화 cDNA 서열은 처음에 아라비도프시스로부터 단리되었다(Falcone et al., 1994). 이로부터, FAD6 및 FAD6 유전자를 암호화하는 cDNA가 브라시카 나푸스, 포르툴라카 올레라세아, 대두, 및 리시누스 콤뮤니스를 포함한 여러 식물 종들로부터 단리되었다.

잇꽃으로부터 상기 FAD6 유전자에 의해 암호화된 염록체 ω6 불포화효소를 암호화하는 cDNA 클론을 단리하기 위해서, CPG 데이터베이스를 상동 서열에 대해 탐색하였다. 8 개의 EST 서열, 즉 EL378905, EL380564, EL383438, EL385474, EL389341, EL392036, EL393518, EL411275가 확인되었으며 808 nt의 단일 콘틱 서열로 조립되었다. 상기 서열은 완전한 5' 단부를 가졌으나 3'-단부는 불완전하였다. 후속으로 완전길이 cDNA를, 주형으로서 잇꽃(SU)의 발생 종자로부터 제조된 람다 cDNA 라이브러리로부터 추출된 DNA를 사용하여 3' RACE PCR 증폭을 통해 수득하였다. PCR 조건은 실시예 2에 개시된 바와 같다. ctFAD6-s2로 표시된 단일 올리고 프라이머를 M13 순방향 프라이머와 함께 상기 증폭 반응에 사용하였는데, 그 이유는 상기 프라이머에 대한 서열이 cDNA 라이브러리의 벡터 중에 존재하기 때문이다. 상기 ctFAD6-s2 프라이머의 서열은 5'-CATTGAAGTCGGTATTGATATCTG-3' (서열번호 154)이었다. 435 아미노산의 후보 FAD6 폴리펩티드를 암호화하는 1305 bp의 개방 판독 프레임을 갖는 1545 bp의 cDNA를 수득하였다. 상기 폴리펩티드는 다른 클로닝된 식물 FAD6 폴리펩티드와 60 내지 74% 아미노산 서열 동일성을 공유하였다. 상기 잇꽃 FAD6 서열과 보다 고등 식물에서 확인된 전형적인 FAD6 색소체 Δ12 불포화효소간의 계통발생 관계를 나타내는 계통도가 벡터 NTI에 의해 생성되었다(도 10).

실시간 qPCR 분석에 의한 CtFAD6의 발현 프로파일

CtFAD6의 발현 프로파일을, 플라티늄 SYBR 그린 qPCR 슈퍼믹스-UDG(인비트로젠)를 사용하여 수행되고 실시예 1에 개시된 바와 같이 디폴트 매개변수와 함께 ABI 7900HT 서열 검출 시스템 상에서 실행되는 실시간 RT-qPCR에 의해 연구하였다. 사용된 프라이머들은 하기와 같다: ctFAD6-S2: 5'-CATTGAAGTCGGTATTGATATCTG -3' (서열번호 155) 및 ctFAD6-a2: 5' -GTTCCAACAATATCTTCCACCAGT- 3' (서열번호 156). 반응을 20 ng의 전체 RNA 주형, 800 mM의 각각의 프라이머, 0.25 ㎕의 역전사효소 및 5 ㎕의 1-단계 RT-PCR 마스터 믹스 시약을 함유하는 10 ㎕의 전체 부피로 3 회 중복 수행하였다. RT 및 증폭에 대한 조건은 48 ℃ 30 분, 이어서 95 ℃ 10 분, 이어서 40 주기의 95 ℃ 15 초 및 60 ℃ 60 초였다. 기준 유전자 잇꽃 CtkasII의 발현을 사용하여 상기 FAD6 발현 수준을 표준화하였다. 계산을 실시예 1에 개시된 바와 같이 수행하였다.

상기 분석은 CtFAD6이 잎, 뿌리 및 발생 배의 3 개의 연속적인 단계들에서 비교적 낮은 수준으로 발현됨을 보였다. 상기 발생 배에서 관찰된 낮은 발현 수준은 FAD6이 종자 중 올리에이트의 불포화에서 비교적 작은 역할을 할 수도 있다는 언급과 동일하였다.

실시예 10. 잇꽃에서 지방산 생합성 유전자의 침묵화를 위한 유전자 구조물의 설계 및 제조

헤어핀 RNA(hpRNA)는 식물에서 유전자 발현을 감소시키기 위해 광범위하게 사용된 RNA 분자의 한 유형이다. 헤어핀 RNA는 전형적으로 침묵화시키려는 유전자로부터 유도된 서열의 거꾸로 된 반복부를 함유하는 DNA 구조물로부터 식물 세포에 전사된다. 상기 hpRNA 전사체은 이에 의해 상보성 센스 및 안티센스 서열을 가지며, 이들은 고리 서열에 의해 연결된 이중 가닥 RNA(dsRNA) 영역을 형성한다. 상기와 같은 dSRNA 구조물은 식물 세포에서 내인성적인 침묵화 기구에 의해 처리되어, 활성을 감소시키고자 하는 유전자에 서열이 상응하는 약 21 내지 24 뉴클레오티드의 작은 RNA 분자를 형성한다. 이들 작은 RNA는 목적 유전자를 특이적으로 침묵화시키는 내인성 단백질과 복합체를 형성할 수 있다. 상기와 같은 침묵화는 전사 수준에서 발생할 수 있으며, 상기 표적 유전자의 일부분의 DNA 메틸화에 의해, 상기 표적 mRNA의 분해에 의한 전사후 수준에서, 또는 mRNA에 연결하여 그의 번역을 억제하고 이에 의해 상기 유전자에 의해 암호화된 단백질 합성을 감소시킴으로써 매개된다. 상기 hpRNA가 유전자 과의 구성원들간에 공통인 서열을 포함하는 경우, 상기 hpRNA는 상기 서열을 갖는 유전자들 각각을 침묵화시킬 수 있다.

잇꽃은 큰 FAD2 유전자 과를 가지며, 본 발명에 개시된 바와 같이(실시예 2 내지 6) 확인된 적어도 11 개의 구성원을 갖는다. 잇꽃은 또한 확인된 적어도 3 개의 구성원(실시예 8) 및 적어도 하나의 FAD6 유전자(실시예 9)와 함께, FATB 폴리펩티드를 암호화하는 다수의 유전자를 갖는다. 실제로, 상술한 실험들은 잇꽃 중 유전자 과의 확인된 모든 구성원들을 가질 수는 없다. 상기 FAD2 및 FATB 유전자 과 중 어느 구성원이 잇꽃 종자 오일에서 발견된 리놀레산 또는 포화 지방산, 특히 팔미트산의 생합성에 관련되었는지, 및 또한 FAD6가 FAD2, FATB 및 FAD6 유전자의 다양한 조합을 침묵화시키는지를 결정하기 위해서, 잇꽃 종자에서 hpRNA 분자를 발현하는 다수의 유전자 구조물을 제조하였다. 이들 hpRNA 구조물을 각각 상기 오일 합성 기간 동안 발생 잇꽃 종자에서 특이적으로 발현되도록 설계하였다. 이는 외인성 프로모터 또는 잇꽃으로부터 단리된 프로모터를 사용하여, 식물 형질전환에 의해 잇꽃으로 도입되는 상기 구조물을 발현시킴으로써 수행되었다.

pCW600의 제작

식물 2원 발현 벡터를 아라비도프시스 올레소인1 유전자(TAIR 웹사이트 유전자 주석 At4g25140)(서열번호 52)의 프로모터를 사용하여 종자에서 트랜스유전자의 발현을 위해 설계하였다. 상기 단리된 프로모터는 수탁번호 NC003075.7의 뉴클레오티드 12899298로부터 출발하는 1192 bp 길이였으나, 단 상기 1198 bp 서열내, 6 bp는 나중의 클로닝 단계들을 지원하기 위해서 공통의 제한 절단 서열들 피하기 위해 생략시켰다. 상기 AtOleosin 프로모터는 앞서 잇꽃 및 배추종에서 트랜스유전자의 강한, 종자-특이적 발현에 사용되었다(Nykiforuk et al., 1995; Vanrooijen and Moloney, 1995). 상기 프로모터는 양방향 프로모터인 듯하며, 상기 프로모터 단편의 양쪽 단부에 연결된 암호화 영역의 강한 종자-특이적 발현을 향한다. 상기 아라비도프시스 올레오신 프로모터는 이중 작용성을 가짐을 특징으로 하는, 브라시카 나푸스 올레오신 프로모터와 특징을 공유한다(Sadanandom et al., 1996). 상기 프로모터를 화학적으로 합성하고, 클레나우 단편 효소 대리 반응을 통해 평활화된 프로모터를 함유하는 pGEMT-Easy 및 EcoRI 단편에 클로닝되고, pCW265의 클레나우-평활 HindIII 부위에 연결되어(Belide et al., 2011), pCW600(AtOleosinP::빈)을 생성시켰다. 상기 벡터는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(HPT)를 암호화하는 선택성 마커 유전자를 가지며, 이에 의해 상기 형질전환 과정 동안 조직 배양물 중 하이그로마이신에 대한 허용성에 대한 선택이 허용된다. 상기 벡터는 또한 UV 광 조명 하에서 형광에 의해 형질전환된 세포 또는 조직의 선택을 허용하는 35S::GFP 유전자를 포함하였다. 상기 AtOleosin 프로모터를 삽입함으로써, 상기 벡터를 상기 프로모터의 하류 및 nos 폴리아데닐화 신호(nos3')의 상류에 위치한 다수의 클로닝 부위에 삽입될 수 있는 목적 암호화 영역의 발현을 위해 설계하였다. 상기 벡터는 하기에 개시된 구조물 pCW602 및 pCW603에 대한 지주 벡터로서 작용하였다.

pXZP410의 제작

아마 리닌 프로모터(US 7,642,346)(서열번호 53)를 2원 벡터 pT7-HELLSGATE12 (Wesley et al., 2001)에 NotI-XhoI 단편으로서 삽입하여, 게이트웨이 침묵화 2원 벡터 pXZP410을 생성시켰다. 상기 벡터 pXZP410은 조직 배양 중 가나마이신에 대한 내성을 부여하고 상기 리닌 프로모터의 조절 하에서 헤어핀 RNA 구조물의 종자 특이적 발현을 허용하는 선택성 마커 유전자를 가졌다. 상기 벡터는 2 개의 인트론, 즉 상기 프로모터에 대해 센스 배향의 하나 및 안티센스 배향의 다른 하나를 가졌으며, 상기 인트론에 인접하는 AttL1 및 AttL2 재조합 부위를 가졌다.

pXZP410으로부터 침묵화 구조물을 제조하기 위해서, 상기 침묵화시키려는 게이트웨이 진입 벡터 중 표적 유전자로부터의 서열의 2 개의 사본이, 하나는 상기 두 인트론의 5'에 및 다른 하나는 3'에, 서로에 대해 거꾸로 된 배향으로 삽입되어 거꾸로된 반복부를 형성하였다. 상기 재조합 부위는 앞서 개시된 바와 같이(Wesley et al., 2001), 게이트웨이 리콤비나제 클로닝 시스템(인비트로젠, 미국 칼스바드 소재)을 사용함으로써 상기 두 사본의 삽입을 쉽게 허용하였다. 상기 벡터 pXZP410을 하기에 개시하는 바와 같이 pCW631 및 pCW632를 생성시키기 위한 지주 벡터로서 사용하였다.

pCW571의 제작

CtFATB-3 cDNA의 뉴클레오티드 485-784에 상응하는 잇꽃 유전자 CtFATB-3의 영역과 동일한 300 bp 서열(서열번호 50)을 화학적으로 합성하고 제조사의 설명에 따라 pENTR/D 토포(인비트로젠)에 삽입하여 pCW569라 표시되는 게이트웨이 진입 클론을 생성시켰다. 뉴클레오티드 427-1182에 상응하는, CtFAD2-2에 대한 cDNA의 756 bp 단편(서열번호 49)을 합성하고 발생 잇꽃 종자로부터 단리된 RNA로부터 RT-PCR에 의해 증폭시켰다. 상기 프라이머는 각각 D28-PstI-5 (5'-CCTGCAGGTACCAATGGCTCGACGACACTG-3') (서열번호 157) 및 D28-AscI-3 (5'- CGGCGCGCCTTCACCTCCTCATCTTTATCC-3') (서열번호 158)이었다. 상기 프라이머들은 5' PstI 및 3' AscI 제한 효소 부위를 포함하였으며, 이에 의해 상기 증폭된 단편의 pCW569의 상응하는 부위내로의 삽입을 허용하여 pCW570을 생성시켰다. 상기 벡터는 재조합 부위, AttL1 및 AttL2에 인접한 1080 bp의 단편으로서 CtFATB 및 CtFAD2-2 유전자로부터 융합된 영역을 함유하였다. 이어서 상기 FATB-FAD2-2 단편의 2 개의 사본을 공급자의 설명(인비트로젠, 미국 칼스바드 소재)에 따라 LR 클로나제를 사용하여, 두 번째 사본을 첫 번째에 대해 역으로, pXZP410에 삽입하였다. 생성된 플라스미드 pCW571은, 종자 중 CtFATB 및 CtFAD2-2 유전자의 발현을 감소시키기 위해 hpRNA 를 생성시키기 위해서, 종자-특이적인 방식으로 상기 거꾸로된 반복부 영역을 전사하는 아마 리닌 프로모터를 가졌다.

pCW603의 제작

상기 2 개의 중재 인트론을 갖는 CtFATB-CtFAD2-2 단편의 거꾸로된 반복부를 함유하는 pCW571로부터의 DNA 단편을 SpeI로 절단하고, DNA 폴리머라제의 클레나우 I 단편을 사용하여 평활화시키고, pCW600의 EcoRV 부위에 연결시켜 pCW603을 생성시켰다. 상기 구조물 pCW603은 잇꽃의 종자에서 AtOleosin 프로모터의 조절 하에 hpRNA를 발현시켜 CtFATB 및 CtFAD2-2의 발현을 감소시킬 수 있었다.

pCW581의 제작

pCW571에 관하여, CtFAD6에 대한 cDNA의 뉴클레오티드 451 내지 750에 상응하는 CtFAD6의 290 bp 단편, 및 CtFATB의 300 bp 단편으로 구성된 DNA의 590 bp 단편(서열번호 51)을 화학적으로 합성하고 pENTR/D 토포에 삽입하여 pCW579를 생성시켰다. 상기 pCW570에 관하여 상술한 바와 같이, CtFAD2-2의 780 bp 단편을 pCW579의 AscI 부위에 클로닝하여, pCW580을 생성시켰다. 상기 구조물은 인접한 재조합 부위, AttL1 및 AttL2를 갖는 1370 bp의 DNA 단편으로서 순서대로 연결된 CtFATB, CtFAD6 및 CtFAD2-2 유전자들로부터의 서열을 함유하는 진입 클론이었다. 이어서 상기 FATB-FAD6-FAD2-2 단편의 2 개 사본을 LR 클로나제를 사용하여 pXZP410에 거꾸로된 반복부로서 삽입하여 pCW581을 생성시켰다. 상기 구조물 pCW581은 상기 거꾸로된 반복부에 작동적으로 연결된 아마 리닌 프로모터를 갖는 2원 벡터이며, 이는 발생 잇꽃 종자 세포에서 전사시 hpRNA를 발현시켜 상기 CtFATB, CtFAD6 및 CtFAD2-2 유전자들의 발현을 감소시킬 수 있었다.

pCW602의 제작

상기 2 개의 중재 인트론을 갖는, 연결된 CtFATB-CtFAD6-CtFAD2-2 영역의 거꾸로된 반복부를 함유하는 DNA 단편을 Not1으로 pCW571로부터 효소에 의해 절단하고, 클레나우 I 단편을 사용하여 평활화시키고, 이어서 pCW600의 EcoRV 부위에 연결시켜 pCW602를 생성시켰다. pCW602는 상기 리닌 프로모터의 경우를 제외하고 동일한 설계 및 유전자 단편을 갖는 pCW581과 대조적으로, AtOleosin 프로모터의 조절 하에 CtFATB-CtFAD6-CtFAD2-2 서열을 가졌다.

pCW631 및 pCW632의 제작

상기 리닌 프로모터는 종자에서 hpRNA의 발현에 유용하지만, pCW571 및 pCW581은 모두 가나마이신 내성을 부여하는 선택성 마커를 가졌다. 예비 잇꽃 형질전환 실험에서, 우리는 상기 외식체가 가나마이신에 충분히 민감성이지 않음을 관찰하였다. 따라서, 상기 pCW571 및 pCW581의 가나마이신 내성 카세트를 상기 선택성 마커 유전자로서 하이그로마이신 내성 카세트로 대체하였다. enCUP 프로모터:하이그로마이신:nos3'폴리아데닐화 영역으로 구성된 하이그로마이신 내성 유전자를 SpeI-AvrII 제한 절단으로 pCW265로부터 절단하고 이를 사용하여 pCW571 및 pCW581 중 가나마이신 내성 카세트를 대체시켜, 각각 pCW631 및 632를 생성시켰다.

요약하면, 상기 첫 번째 잇꽃 형질전환 세트에 사용된 구조물은 하기의 주요 요소들을 함유하였다:

벡터 프로모터 거꾸로 된 반복부 중 유전자 단편

pCW631 linin CtFAD2-2 및 CtFATB

pCW632 linin CtFAD2-2, CtFAD6 및 CtFATB

pCW602 AtOleosin CtFAD2-2, CtFAD6 및 CtFATB

pCW603 AtOleosin CtFAD2-2 및 CtFATB

이들 구조물을 아그로박테리움 균주 AGL1에 도입시키고 실시예 1에 개시된 바와 같이 잇꽃의 형질전환에 사용하여, 하기와 같은 결과를 얻었다.

실시예 11. 유전자 침묵화 구조에 의한 잇꽃의 형질전환

상기 유전자 구조물들을 이식을 사용하여, 재생된 새싹의 구제와 함께 아그로박테리움-매개된 방법을 사용하여 잇꽃 품종 S317의 절제된 떡잎 및 배축을 형질전환시켰다(Belide et al., 2011). 비-형질전환된 뿌리-줄기상에서 성장하는 30 개 이상의 독립적인 형질전환된 새싹(이후부터 T ₀ 식물이라 칭함)이 상기 벡터 pCW603의 경우 재생되었고 실시예 1에 개시된 바와 같이 성숙하게 증식하였다. 상기 T ₀ 잇꽃 어린가지의 T-DNA의 통합을 문헌[Belide et al.(2011)]에 개시된 바와 같이 T-DNA 벡터-특이적 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 검사하였다. 조직 배양물에서 재생 중 하이그로마이신 선택으로부터 "이탈되는" 것으로 추정되는, 특정 형질전환에 사용된 T-DNA가 없는 것으로 밝혀진 대일부분의 식물들은 버렸다. 그러나, 일부는 상기 형질전환된 식물과의 비교를 위한 '삭제' 식물 또는 음성 대조군으로서 유지시켰다. 이들 대조용 식물을 조직 배양물 중 형질전환된 물질, 이식 및 온실 조건과 동일한 조건 하에서 처리하였다.

실시예 12. 트랜스제닉 잇꽃의 종자오일의 지방산 조성의 분석

지방산 분석을 하기와 같이, 형질전환된 잇꽃 식물로부터 수득된 개별적인 T ₁ 종자상에서 수행하였다. S317 유전자 배경에서 pCW603으로 형질전환된 30 개의 독립적인 T ₀ 식물을 온실에서 재배하고 자가-수정시켜 종자를 생성시켰다. 각각의 T ₀ 식물로부터의 단일의 종자헤드로부터 10 개 정도로 많은 성숙한 종자를 실시예 1에 개시된 바와 같이 GC 분석을 사용하여 지질 조성에 대해 분석하였다. pCW603으로 형질전환된 잇꽃 S317의 종자로부터 지방산 조성 분석의 결과를 표 13에 요약한다. 각각의 형질전환된 T ₀ 잇꽃 식물이 T-DNA에 대한 이형접합성이고 따라서 T ₁ 종자의 분리 집단을 생성시키는 것으로 예상되기 때문에, 각각의 식물로부터 5 내지 10 개 종자의 분석은 일부 삭제(분리개체) 종자를 포함할 것으로 예상되었다. 상기와 같은 삭제 분리개체 종자는 동일한 식물로부터 형질전환된 종자와 동일한 종자헤드 내에서 생육되고 발생되기 때문에 본 실험에서 양호한 음성 대조군이었다. 표 13의 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, 87%(전체 지방산 함량의 중량%로서) 이상의 올레산의 수준이 상기 생성된 30 개 계통 중 6 개의 독립적인 계통(계통 9, 12, 14, 20, 34 및 36)에서 관찰되었다. 상기 형질전환된 종자 중 다수는 87 내지 91.7% 범위의 올레산 함량을 가졌으며, 이때 리놀레산 수준은 2.15 내지 5.9%가고 팔미트산 수준은 2.32 내지 3.45%였다. 상기 종자 중 다른 지방산의 수준은 형질전환되지 않은 대조군과 크게 다르지 않았다. pCW603으로 형질전환된 T ₁ 잇꽃 종자에서 관찰된 최대 올레산 함량은, 형질전환되지 않은 S317 대조용 종자 및 삭제 분리개체 종자의 대략 77%에 비해 91.7%가었다. 현저하게, 상기 종자 지질이 또한 16:0의 수준에서 현저하게 감소하였으며, 4.5%에서 2.3% 정도로 낮게 감소되었다. TLC 플레이트상에서 정제된 바와 같은 상기 종자오일의 TAG 분획들의 지방산 프로파일은 상기 종자로부터 추출된 전체 지질의 경우와 크게 다르지 않았다.

상기 종자오일 중 가장 중요한 지방산을 설명하기 위한 2 개의 지표를, 상기 잇꽃 종자의 전체 지방산 조성을 기준으로 계산하였다. 이들은 올레산 불포화 비율(ODP) 및 팔미트산+리놀레산 대 올레산 비율(PLO)이었다. 이들을 각각의 종자에 대해서 계산하고 데이터를 표 13에 나타낸다. 야생형 종자(S317, 형질전환되지 않은 것) 및 삭제 분리개체는 약 0.1500의 ODP 비 및 약 0.2830의 PLO 값을 가졌다. pCW603으로부터의 T-DNA로 형질전환된 종자는 상기 ODP 및 PLO 값의 현저한 감소를 나타내었다. 6 개의 독립적인 사건들로부터 생성된 13 종자는 0.1 미만의 PLO 값 및 0.06 미만의 ODP를 가졌다. 하나의 형질전환된 계통은 0.0229의 ODP 및 0.0514의 PLO를 가졌다.

하나의 정예 계통의 성숙한 개별적인 단일 종자, pCW603으로 형질전환된 S317, 계통 9, 및 형질전환되지 않은 모체 S317에 LC-MS 리피도믹스 분석을 수행하였다. 상기 분석은 AtOleosinp:CtFATB-CtFAD2-2 RNAi 헤어핀 구조물로 형질전환된 종자로부터의 오일이 대단히 변경된 TAG 및 DAG 조성을 가짐을 명백히 나타내었다(도 11 및 12). TAG(54:3) 수준의 분명한 증가 및 TAG(54:5)의 감소가 존재하였으며, 이들은 각각 우세하게 18:1/18:1/18:1-TAG (트라이올레인) 및 18:1/18:2/18:2-TAG이었다. LC-MS에 의해 분석된 종자들 중에서, TAG 중 트라이올레인(=54:3) 함량은, 47% 내지 53% 범위의 트라이올레인 수준을 갖는 형질전환되지 않은(S-317) 부모에 비해, RNAi 침묵화 계통으로부터의 종자의 경우 최고 올레산 수준(>90%, 표 14)에서 64.6%(몰%) 정도로 많았다. 두 번째로 가장 풍부한 올리에이트-함유 TAG는 18:0/18:1/18:1, 이어서 18:1/18:1/18:2였다. 이들 잇꽃 오일간의 가장 분명한 차이를 또한 DAG 지질 부류에서 볼 수 있었다. DAG(36:1) 수준은 상기 모체 종자에 비해, 형질전환된 종자로부터의 종자오일에서 배가된 반면, DAG(36:4)는 10% 이하까지 감소되었다. DAG(36.1)는 우세하게는 18:0/18:1-DAG이고 DAG(36:4)는 18:2/18:2-DAG(다이-리놀리에이트)이다. 상기 종자 지질 중 DAG는, 전체 TAG의 수준이 전체 DAG보다 약 100 배 더 많기 때문에, 단지 소량 성분이었다.

트랜스제닉 식물의 생육 및 형태

pCW603으로부터의 T-DNA를 함유하는 T ₀ 잇꽃 형질전환체는 동형접합체, 반접합체 및 삭제 분리개체의 세트를 제공하는 T-DNA에 대해 분리된 T ₁ 종자를 생성시켰다. 이들 하위-집단들의 비는 멘델 유전학에 따라 예상되는 바와 같이, T ₀ 식물에서 T-DNA 삽입 사건의 수 및 연관에 의존하였다. 따라서 각각의 T ₀ 식물로부터의 T ₁ 종자를 개별적으로 분석하였다. 개별적인 종자로부터의 지질 프로파일의 분석은 단일 종자 헤드가 삭제 및 트랜스제닉 사건을 모두 함유함을 명백히 나타내었다.

^* 본 규약에서 표지된 샘플들: TS603.12(5)는 벡터 pCW603, 사건 12, 종자 5로 형질전환된 식물을 나타낸다. '삭제'로서 표지된 샘플들은 식물 형질전환에서 비-형질전환된 일탈로서 PCR 분석을 통해 측정된다.

^** PLO (16:0+18:2)/18:1로서 계산된 지표

^*** ODP(18:2+18:3)/(18:1+18:2+18:3)으로서 계산된 지표

상기 트랜스제닉 계통들 중 일부로부터의 종자를 온실에서 통제된 조건(온도, 토양, 최적 급수 및 시비, 그러나 자연 광 하에서) 하에서 재배하여 상기 식물 형태 및 증식률을 관찰하였다. 상기 형질전환된 T ₁ 식물과 그의 삭제 분리개체 형제간에 표현형 차이는 관찰되지 않았다. 형질전환된 종자는 형질전환되지 않은 종자와 동일한 속도로 발아하였으며 동일한 조기 묘종 증식률(활기)을 갖는 묘종을 제공하였다. 파종된 종자들이 모두 확립되었으며 충분히 생식능력이 있는 식물로 자랐다. DNA를 T ₁ 세대의 개별적인 식물로부터의 진정한 잎의 끝으로부터 제조하고 PCR 분석을 수행하여 삭제 및 트랜스제닉 식물의 비를 측정하였다. 예상된 바와 같이, 삭제 분리개체가 확인되었다.

이러한 표현형 분석은 잇꽃 식물이 pCW603의 T-DNA로 형질전환되었고 상기 트랜스유전자의 발현이 삭제 분리개체에 비해 어떠한 유해 효과도 문제가 되지 않음을 가리켰다.

상기 T2 세대의 잇꽃 종자를 오일 조성에 대해 시험하였다. 높은 수준의 올레산을 갖는 여러 식물로부터의 종자(표 13)를 2 세대 종자(T2 종자)를 생산하는 성숙한 식물로 증식시켰다. 성숙시 상기 종자를 수확하고 그의 오일의 지방산 조성에 대해 분석하였다. 상기 데이터를 표 16에 제공한다. 상기 T1 종자가 약 92% 이하의 올레산을 나타내었지만, 상기 T2 종자는 94.6% 올레산에 도달하였다. 상기 T1 세대에 비해 상기 T2 세대에서 관찰된 증가는 상기 트랜스유전자의 동형접합성, 또는 단순히 분석된 다수의 계통들에 기인하는 것일 수도 있다.

서던 블럿 하이브리드 분석을 사용하여 각 형질전환된 계통 중 T-DNA 삽입의 수를 측정하고, 단일 T-DNA 삽입을 갖는 계통을 선택한다. T2 종자의 오일 함량은, 동일한 유전자 배경을 갖고 동일한 조건 하에서 재배된 형질전환되지 않은 대조용 종자의 경우와 그다지 다르지 않다.

pCW631로부터 T-DNA로 형질전환된 잇꽃 종자의 분석

pCW631로 형질전환된 잇꽃 품종 S-317의 T1 종자를 그의 지방산 조성에 대해 유사하게 분석하였다. 표 17은 이들 종자에 대한 데이터 및 ODP 및 PLO 지표를 나타낸다. 이들 종자의 지질 중 올레산 함량은 94.19% 이하였다. 가장 높은 수준의 올레산을 갖는 종자 TS631-01 T1(21)의 팔미트산 함량은 2.43%가고, 상기 ODP는 0.0203이고, 상기 PLO는 0.0423이었다. 이러한 분석은 pCW631 중 헤어핀 RNA 구조물이, S-317 유전자 배경의 잇꽃내로 형질전환시 일반적으로 pCW603 중 구조물보다 더 높은 올레산 수준을 생성시킴을 입증하였다. 이러한 관찰은 pCW631에 사용된 리닌 프로모터가, pCW603에 사용된 AtOleosin 프로모터에 비해, 상기 헤어핀 RNA를 보다 강하게 또는 보다 양호한 발현 타이밍으로, 또는 이 둘의 조합으로 발현시킴을 가리켰다.

pCW631로부터 T-DNA로 형질전환된 잇꽃 품종 S-317의 T2 종자를 GC에 의해 분석하였다. 94.95% 이하의 올레산 수준이, 0.01의 OPD 및 0.035의 PLO와 함께 관찰되었다.

상기 구조물 pCW632 및 pCW602로부터의 T-DNA로 형질전환된 잇꽃 종자 및 식물을 상기 pCW603 및 pCW631로 형질전환된 종자 및 식물의 경우와 동일한 방식으로 분석하였다. pCW632로 형질전환된 잇꽃 품종 S-317의 T1 종자의 CG 분석은, 0.0102의 ODP 및 0.0362의 PLO와 함께 94.88% 이하의 올레산 수준을 나타내었다. 이들의 T2 종자는 0.0164의 ODP 및 0.0452의 PLO와 함께 93.14% 이하의 올레산을 나타내었다.

보다 큰 부피의 잇꽃 종자 오일의 추출

TS603-22.6으로 표시된 동형접합성 트랜스제닉 계통으로부터의 T4 종자를 수확하고 전체 종자오일을 실시예 1에 개시된 바와 같이 속슬렛 장치를 사용하여 추출하였다. 추출된 오일의 분액들을 GC에 의해 분석하였다(표 18). 총 643 그램의 오일이 회수되었다. 추출 2, 3, 5 및 6을 모은 반면, 추출 4, 7 및 8은 별도의 로트에 모았다. 상기 혼합물들을 GC에 의해 지방산 조성에 대해 추가 분석하였다. 데이터를 표 18에 나타낸다.

실시예 13: 추가의 유전자 침묵화 구조물의 설계 및 제조

실시예 10 내지 12에 개시된 결과들을 근거로, 다른 유전자 침묵화 구조물을 하기와 같이 잇꽃 종자 오일의 올레산 함량을 증가시키고 ODP 또는 PLO 비를 감소시키도록 제조하였다. 이들 유전자 침묵화 구조물은 잇꽃 공급원뿐만 아니라 비-잇꽃 공급원으로부터의 상이한 프로모터들을 겸비하여 잇꽃 FAD2-2, FATB-3 및 FAD6 유전자 발현의 최대의 감소, 및 FAD2-2외에 하나 이상의 FAD2 유전자의 추가의 침묵화를 성취하였다. 이들 구조물을 사용하여 내인성적인 CtFAD2-1 유전자의 불활성화된 버전들을 갖는 잇꽃의 품종들, 예를 들어 S-317, Ciano-OL 및 Lesaff496을 형질전환시킨다.

pCW700의 제작

상기 식물 2원 발현 벡터는 하나의 프로모터보다는, 잇꽃 중의 상이하지만 중복되는 발현 패턴을 갖는 2 개의 외인성(비-잇꽃) 프로모터를 가져, 헤어핀 RNA를 생성시켜 내인성적인 CtFATB 및 CtFAD2-2의 발현을 감소시킨다. 상기 두 프로모터는 AtOleosin 프로모터 및 아마 리닌 프로모터이고, 상기 두 hpRNA 발현 카세트는 동일한 T-DNA 분자 중에 있다. 상기 벡터를, CtFAD2-2 및 CtFATB의 침묵화를 위한 hpRNA 암호화 영역 및 리닌 프로모터를 갖는, pCW631로부터의 hpRNA 유전자 발현 카세트의 제한 절단에 의해 제작하고, 이를 pCW603의 T-DNA에 삽입하여, 이들 2 개의 잇꽃 유전자들에 대한 헤어핀 RNA를 암호화하는 구조물을 생성시킨다. 상기 구조물을 사용하여 잇꽃 품종들, 예를 들어 Lesaff496, Ciano-OL 및 S-317을 형질전환시킨다.

pCW701 - pCW710 의 제작

잇꽃 종자에서 최적의 활성을 갖는 것으로 예상된 잇꽃-유도된 프로모터를, 발현된 유전자의 DNA 상류 및 하류의 영역들에 대한 정확한 서열 정보를 제공하는 DNA 서열분석 기술을 사용하여 단리한다. 실시예 2 내지 6에 개시된 바와 같은 선행의 결과들은 상기 CtFAD2-1 유전자가 잇꽃에서 종자 발생 중 고도로 발현됨을 입증하였다. 따라서, 상기 유전자의 프로모터 영역은 잇꽃 종자에서 효율적인 트랜스유전자 발현을 구동하기에 탁월한 후보이다. 실시예 6에 나타낸 바와 같이, CtFAD2-2는 CtFAD2-1이 돌연변이에 의해 불활성화된 유전자 배경에서 활성이었다. 따라서 CtFAD2-2의 프로모터를 잇꽃에서 사용하여, 다른 유전자들 중에서도 CtFAD2-2 활성을 표적화하는 헤어핀 RNA의 발현을 구동한다. 잇꽃 종자에서 트랜스유전자의 발현에 유용한 다른 프로모터 요소는 올레오신에 대한 유전자의 상류 일부분 중의 내인성적인(즉 잇꽃) 프로모터 요소(CtOleosin) 및 종자-저장 단백질, 예를 들어 2S 및 11S 단백질(Ct2S 및 Ct11S)을 포함하였다. CtFAD2-1, CtOleosin, Ct2S 및 Ct11S의 프로모터 요소들을 잇꽃 게놈 서열을 근거로 표준 PCR-기재 기법을 사용하여 단리하고, 식물 2원 발현 벡터에 통합시킨다. 이들 프로모터 요소들을 사용하여 구조물 pCW701-pCW710에서 또는 동일하거나 상이한 hpRNA 유전자를 발현하는 다른 비-잇꽃 프로모터와 함께, 예를 들어 pCW602, pCW603, pCW631 또는 pCW632에서 hpRNA 침묵화 분자를 발현시킨다. hpRNA 유전자와 상이한 프로모터들과의 조합은 또한, 전형적으로 hpRNA 유전자가 연결되지 않은 경우, 형질전환된 식물을 개별적인 유전자들과 교배함으로써 생성된다.

상기 CtFAD2-1 프로모터를 단리하기 위해서, 상기 CtFAD2-1 번역 개시 ATG 코돈의 약 3000 bp 상류의 게놈 DNA 단편을 PCR-기재 기법을 사용하여 단리하고 이를 사용하여 pCW603 및 pCW602로부터 AtOleosin 프로모터를 대체하여, 각각 구조물 pCW701 및 pCW702를 생성시킨다.

상기 CtFAD2-2 프로모터를 단리하기 위해서, 상기 CtFAD2-2 번역 개시 ATG 코돈의 약 3000 bp 상류의 게놈 DNA 단편을 PCR-기재 기법을 사용하여 단리하고 이를 사용하여 pCW603 및 pCW602로부터 AtOleosin 프로모터를 대체하여, 각각 구조물 pCW703 및 pCW704를 생성시킨다.

상기 CtOleosin-1 프로모터를 단리하기 위해서, 상기 CtOleosin 번역 개시 ATG 코돈의 약 1500 염기쌍 상류의 게놈 DNA 단편을 PCR-기재 기법을 사용하여 단리하고 이를 사용하여 pCW603 및 pCW602로부터 AtOleosin 프로모터를 대체하여, 각각 구조물 pCW705 및 pCW706을 생성시킨다.

상기 Ct2S 프로모터를 단리하기 위해서, 상기 Ct2S 번역 개시 ATG 코돈의 약 1500 염기쌍 상류의 게놈 DNA 단편을 PCR-기재 기법을 사용하여 단리하고 이를 사용하여 pCW603 및 pCW602로부터 AtOleosin 프로모터를 대체하여, 각각 구조물 pCW707 및 pCW708을 생성시킨다.

상기 Ct11S 프로모터를 단리하기 위해서, 상기 Ct11S 개시 ATG 코돈의 약 1500 염기쌍 상류의 게놈 DNA 단편을 PCR-기재 기법을 사용하여 단리하고 이를 사용하여 pCW603 및 pCW602로부터 AtOleosin 프로모터를 대체하여, 각각 구조물 pCW709 및 pCW710을 생성시킨다.

이들 각각의 벡터를 실시예 1에 개시된 바와 같이 잇꽃 품종들로 형질전환시킨다.

실시예 14. 잇꽃 품종의 현장 성능

잇꽃의 일련의 비-형질전환된 품종 및 수탁물을 2011-2012년 여름에 뉴사우스 웨일즈의 나라브리에 위치한 현장 연구소에서 재배하였다. 종자를 상기 나라브리 지역에서 흔하게 발견되는 중점토에 5 mx 3 m 포장시험구내에 파종하였다. 식물을 자연광 및 강우에 노출시켰으나, 단 생육 4 주 후에 1 회 관개하였다. 성숙한 종자를 수확하고 약 50 개 종자의 샘플들을 종자오일 중 지질 함량 및 지방산 조성에 대해 분석하였다. 다양한 품종 및 수탁물의 종자오일 중 올레산 함량을 표 19 및 도 13에 나타낸다.

상기 필드 시험으로부터의 데이터는 상기 잇꽃 종자 중 일련의 올레산 함량이 존재하며, 이는 관찰된 범위의 정도에서 놀라운 것임을 가리켰다. 가장 현저하게는, '고 올레산'으로서 개시되었고 앞서 적어도 70%의 올레산을 갖는 종자오일을 제공하는 것으로 보고된 다양한 수탁물, 예를 들어 Ciano-OL이 단지 약 42 내지 46%의 올레산만을 생산하였다. 리놀레산 수준은 선행 보고서들을 근거로 예상된 것보다 훨씬 더 높았다. 대조적으로, 고 올레산 함량을 제공하는 것으로 보고된 다른 수탁물들, 예를 들어 수탁물 PI-5601698 및 PI-560169는 실제로 필드 조건 하에서 종자오일 중 고 올레산 수준(60% 내지 76%)을 생성시켰다. 일부의 수탁물에서 예상된 것보다 상당히 더 낮은 올레산 수준에 대한 이유는 ol 대립유전자 이외에 CtFAD2-1 대립유전자, 예를 들어 온도 민감성인 oll 대립유전자의 존재, 및 2011-12년 계절 중 덜 이상적인 생육 조건에 관련되는 것으로 여겨졌다. 필드 재배된 잇꽃으로부터 수득된 종자에 대한 추가의 지방산 분석을, 일부 수탁물의 올레산 함량에서 관찰된 변동을 확인하기 위해서 수행할 것이다.

상기 실험은 또한 필드에서 재배된 식물로부터 수득된 종자오일 중 올레산의 수준이, 상기 필드에서 가장 잘 수행된 수탁물의 경우에조차, 온실에서 재배된 식물로부터의 경우보다 전형적으로 약 5 내지 10% 더 낮음을 보였다. 이에 대한 이유는 필드 생육 조건이 온실에서의 경우보다 덜 이상적이기 때문인 것으로 생각된다.

추가의 실험에서, 잇꽃 재배종 S317의 식물을 종자오일의 지방산 조성을 비교하기 위해서 필드 또는 온실에서 재배하였다. 상기 필드 조건이 2011-12 계절에 비해 생육 계절 동안 더 유리하다 하더라도, 상기 필드에서 재배된 식물로부터의 20 개 종자의 중량은 온실에서 재배된 식물로부터의 1.202 g에 비해 0.977 g이었다. 각 그룹의 18 내지 20 개 종자를 GC 분석에 의해 지방산 조성에 대해 분석하였다. 필드 재배된 종자 중 올레산 수준은, 평균 76.33+/-1.00으로 75.15 내지 78.44의 온실 재배된 종자의 범위에 비해, 평균(+/1 sd) 78.52+/-1.53으로 74.83 내지 80.65의 범위였다. 다른 지방산들은 표 20의 수준으로 존재하였다.

실시예 15. 다른 잇꽃 품종내로의 트랜스유전자의 교배

잇꽃 품종을, 예를 들어 문헌[Mundel and Bergman(2009)]에 개시된 바와 같이, 잘-확립된 방법을 사용하여 수동으로 교배시킨다. 상술한 구조물들을 함유하는 형질전환된 계통 중 최상, 특히 오직 단일의 T-DNA 삽입만을 함유하는 형질전환된 계통을 선택하고, 최적의 작물학 성능을 갖는, 비-형질전환되거나 또는 상이한 구조물로 이미 형질전환된, 다른 품종의 잇꽃 식물과 교배시킨다. 상기 재현 부모와 반복된 라운드의 역-교배, 예를 들어 4 또는 5 회 역교배를 사용하고, 이어서 자가수정하여, 최적의 작물학 성능을 위한 유전자 배경에서 원하는 구조물(들)에 대해 동형접합성인 식물을 생성시킨다. 마커 지원된 선택, 예를 들어 실시예 7에 개시된 바와 같이 ol 대립유전자의 완벽한 마커의 사용을 품종개량 공정에 사용할 수 있다.

실시예 16. 인공 미세RNA-매개된 유전자 침묵화에 의한 종자오일 조성의 개질

미세RNA(miRNA)는 내인성적인 유전자 활성을 조절하는, 식물 및 동물 모두에 대해 내인성적인 20 내지 24 뉴클레오티드(nt) 조절성 작은 RNA(sRNA)의 부류이다. 변형된 miRNA 전구체 RNA(인공 miRNA 전구체)의 트랜스제닉 발현은 내인성 유전자를 침묵화시키기 위해 최근에 개발된 RNA-기재 및 서열 특이적 전략을 나타낸다. 인공 miRNA 전구체의 제조를 위한 상기 miRNA 전구체 서열내 다수 뉴클레오티드의 치환은 상기 전구체 줄기 고리내 합치 및 불합치의 위치가 영향을 미치지 않는 채로 남아있는 한, 상기 mRNA의 생물발생에 영향을 미치지 않는다.

CSIRO 소프트웨어 패키지 매치포인트(MatchPoint)(www.pi.csiro.au/RNAi) (Horn and Waterhouse, 2010)를 사용하여, 아라비도프시스 게놈 중 독특하고 인공 miRNA로서 발현시 비-표적 유전자(유전자-벗어난 표적화)의 침묵화를 덜 야기할 듯한 아라비도프시스 FAD2, FATB 및 FAE1 유전자 중 특이적인 21-머 서열을 확인하였다. 독특한 21-머 서열을 상기 3 개의 유전자 각각에 대해 선택하였으며, 각각의 경우에 상기 21-머는 상응하는 유전자의 전사체 영역에 완전히 상보성(안티센스)이다. 인공 miRNA 전구체 분자를 에이 탈리아나 ara-miR159p 전구체 서열을 기본으로, 각각에 대해 설계하였다. 각각의 경우에, 상기 miR159b 전구체 서열을 그의 줄기에서 안티센스 21-머 서열을 수용하도록 변형시켰다. 각각 상기 전구체 RNA들 중 하나를 암호화하는 3 개의 구조물을 제조하였으며, 이들은 각각 종자-특이적 FP1 프로모터의 조절 하에 있었고, 이들을 2원 발현 벡터내로 클로닝시켜 pJP1106, pJP1109 및 pHP1110으로 표시된 구조물을 생성시켰다.

이들 구조물을 일렉트로포레이션에 의해 에이 튜메파시엔스 AGL1에 별도로 형질전환시켰고 상기 형질전환된 균주를 사용하여 상기 유전자 구조물을 꽃 침지법(실시예 1)에 의해 에이 탈리아나(생태형 콜럼비아)에 도입시켰다. 상기 처리된 식물로부터의 종자(T ₁ 종자)를 3.5 ㎎/L PPT가 보충된 MS 배지상에 도말하여 형질전환된 묘종을 선택하고, 이를 토양으로 옮겨 확인된 T ₁ 트랜스제닉 식물을 확립시켰다. 이들 T ₁ 식물 대일부분은 상기 도입된 유전자 구조물에 대해서 이형접합성인 것으로 예상되었다. 상기 트랜스제닉 식물로부터의 T ₂ 종자를 성숙기에서 모으고 이들의 지방산 조성에 대해 분석하였다. 이들 T ₂ 식물은 상기 유전자 구조물에 대해 동형접합성인 계통뿐만 아니라 이형접합성인 것들도 포함하였다. 동형접합성 T ₂ 식물을 자가-수정시켜 T ₃ 종자를 생성시키고, 차례로 상기 종자로부터 수득된 T ₃ 자손 식물을 사용하여 T ₄ 자손 식물을 수득하였다. 따라서 이는 3 개의 자손 식물 세대에 걸친 유전자 침묵화 안정성의 분석을 허용하였다.

T ₂ , T ₃ 및 T ₄ 종자 로트로부터 수득한 종자오일의 지방산 프로파일을 실시예 1에 개시된 바와 같이 GC에 의해 분석하였다. FAD2-기재 트랜스유전자의 작용에 의해 유발된 Δ12-불포화효소의 활성에 대한 변경은 상기 종자 오일 프로파일 중 올레산량의 증가로서 나타났다. 종자 지방산 합성 중 Δ12-불포화효소 활성의 누적 효과를 평가하는 관련된 방법은 하기식을 사용하여 수득된, 각 종자오일에 대한 올레산 불포화 비율(ODP) 매개변수 계산을 통해서였다: ODP = %18:2 + %18:3/%18:1 + %18:2 + %18:3. 야생형 아라비도프시스 종자오일은 전형적으로 대략 0.70 내지 0.79의 ODP 값을 갖는데, 이는 상기 종자 중 지방산 합성 중에 형성된 18:1의 70% 내지 79%가, 무엇보다도 18:2를 생성시키는 Δ12-불포화효소의 작용에 의해서 및 이어서 18:3으로의 추가의 불포화에 의해서 다가불포화된 C18 지방산으로 후속 전환됨을 의미한다. 따라서 상기 ODP 매개변수는 내인성적인 Δ12-불포화효소 활성의 수준에 대한 FAD2 유전자-침묵화의 정도를 측정하는데 유용하였다.

상기 pJP1106 구조물(FAD2 표적)로 형질전환된 T ₂ 종자 중 C18:1 ^Δ9 (올레산)의 수준은 14.0%±0.2의 평균 야생형 C18:1 수준에 비해 30 개의 트랜스제닉 사건에서 32.9% 내지 62.7%의 범위였다. 식물 선택성 마커(PPT)의 분리 비(3:1)에 의해 측정된, 단일 트랜스유전자 삽입된 고도로 침묵화된 계통(식물 ID-30)은 다음 세대(T ₃ )를 향했다. 18:1 ^Δ9 의 유사하게 높은 수준이 57.3±5.0%의 평균으로 46.0% 내지 63.8%의 범위로 T ₃ 종자에서 관찰되었다. 다음 세대에서, T ₄ 종자는 또한 63.3±1.06%의 평균으로 61% 내지 65.8%의 범위의 18:1 ^Δ9 의 유사하게 높은 수준을 나타내었다. T ₂ 트랜스제닉 종자오일 중 총 PUFA 함량(18:2+18:3) 범위는 6.1% 내지 38%가었으나, 동형접합성 계통 ID-30으로부터의 종자오일 중, 총 PUFA 함량은 더욱 감소되었고 4.3 내지 5.7%의 범위였다. 대조용 아라비도프시스 생태형 콜럼비아 종자오일은 0.75 내지 0.79 범위의 ODP 값을 가졌으며, 이는 발생 종자에서 생성된 올레산의 적어도 75%가 후속으로 18:2 또는 18:3으로 전환되었음을 의미한다. 대조적으로, 아라비도프시스의 fad2-1 돌연변이체로부터의 종자오일은 0.17의 ODP 값을 가졌으며, 이는 상기 fad2-1 돌연변이로 인한 Δ12-불포화의 약 75% 감소를 가리킨다. 상기 ODP 값 범위는, 대조용 아라비도프시스 종자오일에서 0.75의 값과 대조적으로, T ₂ 트랜스제닉 종자오일에서 0.08 내지 0.48이고, T ₃ 종자오일에서 0.07 내지 0.32이며, T ₄ 종자오일에서 0.06 내지 0.08이었다. 상기 트랜스제닉 계통에서 ODP 값의 극적인 감소는 인공 미세RNA 접근법을 사용하는 내인성적인 FAD2 유전자의 효율적인 침묵화를 가리켰다. 상기 실험은 또한 3 개의 세대에 걸친 상기 유전자 침묵화의 안정성을 보였다. 유전자 침묵화의 유사한 정도가 상응하는 유전자를 하향조절하는 다른 2 개의 구조물에서 보였다.

인공 미세RNA를 사용하여 상기 연구에서 관찰된 FAD2 유전자 침묵화의 정도 및 18:1 ^Δ9 (63.3±1.06%)의 양은 잘 특성화된 FAD2-2 돌연변이체(59.4%), 헤어핀 RNA 접근법을 사용한 FAD2 침묵화된 계통(56.9±3.6%) 및 헤어핀-안티센스 접근법(61.7±2.0%)에서보다 더 높았다. miRNA를 사용하여 FAD2 침묵화된 종자오일 중 평균 18:2+18:3% 함량은 4.8±0.37%가었으며, 이는 앞서 보고된 FAD2-2 돌연변이체(7.5±1.1%) 및 헤어핀-안티센스 접근법을 사용하여 FAD2 침묵화된 계통(7.2±1.4%)보다 더 낮았다. 따라서 이러한 데이터는 침묵화 정도에 있어서 인공 미세RNA의 이점뿐만 아니라 자손 세대에 대한 침묵화의 안정성을 나타내었다.

실시예 17. 오일 중 스테롤 함량 및 조성 분석

오스트레일리아의 상업적인 공급원으로부터 구입한 12 개 식물성 오일 샘플로부터의 피토스테롤을 실시예 1에 개시된 바와 같이 GC 및 GC-MS 분석에 의해 O-트라이메틸실릴 에테르(OTMSi-에테르) 유도체로서 특성화하였다. 스테롤은 체류 데이터, 질량 스펙트럼의 해석 및 문헌 및 실험 표준 질량 스펙트럼 데이터와의 비교에 의해 확인되었다. 상기 스테롤을 5β(H)-콜란(Cholan)-24-올 표준의 사용에 의해 정량분석하였다. 상기 확인된 스테롤 중 일부의 기본적인 피토스테롤 구조 및 화학 구조를 도 14 및 표 21에 나타낸다.

상기 분석된 식물성 오일은 하기로부터였다: 참깨(세사뮴 인디쿰( Sesamum indicum )), 올리브(올레아 에우로파에( Olea europaea )), 해바라기(헬리안투스 안누스( Helianthus annus )), 아주까리(리시누스 코뮤니스( Ricinus communis )), 카놀라(브라시카 나푸스( Brassica napus )), 잇꽃(카르타무스 팅크토리우스( Carthamus tinctorius )), 땅콩(아라키스 히포가에아( Arachis hypogaea )), 아마(리늄 유시타티슘( Linum usitatissimum )) 및 대두(글리시네 맥스( Glycine max )). 상대적인 풍부성이 감소함에 있어서, 상기 오일 샘플 전체에 걸쳐, 주요 피토스테롤은 β-시토스테롤(범위 전체 스테롤 함량의 28 내지 55%), Δ5-아베나스테롤(아이소퓨코스테롤)(3 내지 24%), 캄페스테롤(2 내지 33%), 5-스티그마스테롤(0.7 내지 18%), Δ7-스티그마스테롤(1 내지 18%) 및 Δ7-아베나스테롤(0.1 내지 5%)이었다. 다수의 다른 소량 스테롤들이 확인되었으며, 이들은 콜레스테롤, 브라시카스테롤, 칼리나스테롤, 캄페스타놀 및 에부리콜이었다. 4 개의 C29:2 및 2 개의 C30:2 스테롤이 또한 검출되었으나, 이들 소량 성분의 확인을 완료하기 위해서는 추가의 연구가 필요하다. 또한, 다수의 다른 확인되지 않은 스테롤들이 상기 오일 중 일부에 존재하였으나, 이들의 매우 낮은 풍부성으로 인해, 질량 스펙트럼은 이들 구조의 확인이 가능할 정도로 충분히 강하지 못했다.

오일의 ㎎/g으로서 표현되는 감소하는 스테롤 함량은 카놀라 오일(6.8 ㎎/g), 참깨 오일(5.8 ㎎/g), 아마 오일(4.8 내지 5.2 ㎎/g), 해바라기 오일(3.7 내지 4.1 ㎎/g), 땅콩 오일(3.2 ㎎/g), 잇꽃 오일(3.0 ㎎/g), 대두 오일(3.0 ㎎/g), 올리브 오일(2.4 ㎎/g), 피마자 오일(1.9 ㎎/g)이었다. 상기 스테롤 조성% 및 총 스테롤 함량을 표 22에 나타낸다.

상기 모든 종자 오일 샘플들 중에서, 주요 피토스테롤은 일반적으로 β-시토스테롤(범위 전체 스테롤 함량의 30 내지 57%)이었다. 상기 오일 중에서 광범위한 다른 주요 스테롤들이 존재하였다: 캄페스테롤(2 내지 17%), Δ5-스티그마스테롤(0.7 내지 18%), Δ5-아베나스테롤(4 내지 23%), Δ7-스티그마스테롤(1 내지 18%). 상이한 종들로부터의 오일은 상이한 스테롤 프로파일을 가졌으며, 일부는 매우 독특한 프로파일을 가졌다. 카놀라 오일은 최고 비율의 캄페스테롤(33.6%)을 가진 반면, 다른 종 샘플들은 일반적으로 보다 낮은 수준, 예를 들어 땅콩 오일에서 17% 이하를 가졌다. 잇꽃 오일은 비교적 높은 비율의 Δ7-스티그마스테롤(18%)을 가진 반면, 상기 스테롤은 대개 다른 종 오일에서, 해바라기 오일에서 9% 이하로 낮았다. 따라서 스테롤 프로파일은 각각의 종들에 대해 독특하였기 때문에, 특정 식물성 또는 식물 오일의 확인을 돕고 다른 오일의 진정성 또는 섞임을 검사하는데 사용될 수 있다.

해바라기 및 잇꽃의 2 개 샘플들을 각각 비교하였으며, 각각의 경우에 하나는 종자의 저온 압착에 의해 생성되고 정제되지 않은 반면, 다른 것은 저온-압착되지 않고 정제되었다. 약간의 차이가 관찰되었지만, 상기 두 오일 공급원들은 유사한 스테롤 조성 및 총 스테롤 함량을 가졌으며, 이는 처리 및 정제가 이들 두 매개변수에 거의 영향을 미치지 않음을 암시한다. 상기 샘플들 가운데 스테롤 함량은 1.9 ㎎/g 내지 6.8 ㎎/g의 범위로 3배까지 다양하였다. 카놀라 오일은 최고의 스테롤 함량을, 아주까리 오일은 최저의 스테롤 함량을 가졌다.

C29:2 ^* 및 C30:2 ^* 는 각각 2 개의 이중 연결을 가진 C29스테롤 및 2 개의 이중 연결을 가진 C30 스테롤을 나타낸다.

별도의 분석을 온실 유래된 대조용 종자(S 시리즈), 유전자 변형된 고 올레산 종자(T 시리즈) 및 2 개의 상업적인 잇꽃 오일로부터의 잇꽃 오일들에 대해 수행하였다. 다수의 특징들이 관찰되었다(표 23). 먼저, 상기 대조군과 변형된 종자간에 스테롤 패턴의 높은 정도의 유사성이 존재하며, 둘 째로 상기 상업적인 잇꽃 오일은 별도의 그룹으로 존재하고 따라서 현저하게 상이한 피토스테롤 프로파일을 갖는 것으로 나타났다. 상기 피토스테롤 프로파일의 추가적인 검사는 또한 상기 대조군 및 변형된 잇꽃 종자 샘플로부터의 피토스테롤 프로파일의 유사성을 나타내었다.

당해 분야의 기술자들은 광범위하게 개시된 바와 같은 본 발명의 정신 또는 범위로부터 이탈됨 없이 구체적인 실시태양에 나타낸 바와 같은 본 발명에 대해 다수의 변화 및/또는 변형들이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 실시태양들은 모든 태양에서 예시적이고 비제한적인 것으로 간주되어야 한다.

본 출원은 2012년 4월 25일자로 출원된 US 61/638,447 및 2012년 9월 11일자로 출원된 AU 2012903992로부터의 우선권을 주장하며, 이들 출원은 본 발명에 참고로 인용된다.

본 발명에 논의되고/되거나 참고한 모든 공보들은 이들 내용 전체가 본 발명에 인용된다.

본 명세서에 포함된 서류, 행위, 물질, 장치, 물품 등에 대한 임의의 논의는 오직 본 발명에 대한 배경을 제공하기 위한 것이다. 이들 자료 모두가 본 출원의 각 청구항의 우선일 이전에 존재하는 것으로서 종래 기술 토대의 일부분을 형성하거나 본 발명과 관련된 분야의 통상적인 일반 지식임을 인정하는 것으로서 간주해서는 안 된다.

참고문헌

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tinctorius <400> 27 Met Gly Gly Gly Gly Cys Met Ser Ala Ser Glu Thr Lys Ala Glu Glu 1 5 10 15 Lys Lys Asn Pro Leu Asp Arg Val Pro Cys Ala Lys Pro Pro Phe Thr 20 25 30 Ile Ser Asp Ile Lys Gln Ala Ile Pro Ser His Cys Phe Asn Arg Ser 35 40 45 Leu Ile Arg Ser Phe Ser Tyr Ile Val Tyr Asp Leu Ala Ile Ala Phe 50 55 60 Val Phe Tyr Tyr Leu Ala Thr Thr Tyr Ile His Arg Leu Pro Thr Pro 65 70 75 80 Phe Ser Tyr Leu Ala Trp Leu Ala Tyr Trp Ile Val Gln Gly Cys Val 85 90 95 Leu Thr Gly Ala Trp Val Val Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe 100 105 110 Ser Asp Tyr Gln Trp Val Asp Asp Thr Val Gly Phe Ile Val His Ser 115 120 125 Phe Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His 130 135 140 His Ser Asn Thr Ala Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys 145 150 155 160 Pro Arg Ser Lys Leu Pro Trp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Pro 165 170 175 Gly Arg Ile Ile Ser Leu Phe Ala Thr Leu Thr Leu Gly Trp Pro Leu 180 185 190 Tyr Leu Ser Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Arg Phe Ala Cys 195 200 205 H 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thamus tinctorius <400> 45 Met Val Ala Thr Ala Ala Thr Ala Ser Leu Phe Pro Val Ser Ser Pro 1 5 10 15 Gln Pro His Ser Gly Thr Lys Lys Ser Gly Lys Leu Gly Gly Val Pro 20 25 30 Asp Gly Val Asp Val Arg Gly Ile Lys Thr Lys Ser Val Thr Ser Gly 35 40 45 Gly Leu Gln Val Lys Ala Ala Gln Ala Pro Ala Glu Val Asn Gly Thr 50 55 60 Arg Val Arg Pro Met Ile Lys Thr Asp Asp Asn Ser Thr Ser His Val 65 70 75 80 Pro Arg Thr Phe Ile Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser Met Leu Leu Ala 85 90 95 Ala Ile Thr Thr Ile Phe Leu Ala Ala Glu Lys Gln Trp Met Met Leu 100 105 110 Asp Trp Lys Thr Lys Arg Pro Asp Met Leu Ala Asp Leu Asp Pro Phe 115 120 125 Gly Leu Gly Arg Ile Val Gln Asp Gly Leu Val Phe Arg Gln Asn Phe 130 135 140 Ser Ile Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Ala Asp Arg Thr Ala Ser Ile Glu 145 150 155 160 Thr Leu Met Asn His Leu Gln Glu Thr Ala Leu Asn His Val Lys Thr 165 170 175 Ala Gly Leu Leu Gly Asp Gly Phe Gly Ser Thr Pro Glu Met Cys Lys 180 185 190 Lys Asn Leu Phe Trp Val Val Thr Lys Met Gln Val Met Val Asp Arg 195 200 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gcag 1080 acccatctgt gccactcgta caattacgag agttgttttt tttgtgattt tcctagtttc 1140 tcgttgatgg tgagctcata ttctacatcg tatggtctct caacgtcgtt tcctgtcatc 1200 tgatatcccg tcatttgcat ccacgtgcgc cgcctcccgt gccaagtccc taggtgtcat 1260 gcacgccaaa ttggtggtgg tgcgggctgc cctgtgcttc ttaccgatgg gtggaggttg 1320 agtttggggg tctccgcggc gatggtagtg ggttgacggt ttggtgtggg ttgacggcat 1380 tgatcaattt acttcttgct tcaaattctt tggcagaaaa caattcatta gattagaact 1440 ggaaaccaga gtgatgagac ggattaagtc agattccaac agagttacat ctcttaagaa 1500 ataatgtaac ccctttagac tttatatatt tgcaattaaa aaaataattt aacttttaga 1560 ctttatatat agttttaata actaagttta accactctat tatttatatc gaaactattt 1620 gtatgtctcc cctctaaata aacttggtat tgtgtttaca gaacctataa tcaaataatc 1680 aatactcaac tgaagtttgt gcagttaatt gaagggatta acggccaaaa tgcactagta 1740 ttatcaaccg aatagattca cactagatgg ccatttccat caatatcatc gccgttcttc 1800 ttctgtccac atatcccctc tgaaacttga gagacacctg cacttcattg tccttattac 1860 gtgttacaaa atgaaaccca tgcatccatg caaactgaag aatggcgcaa gaacccttcc 1 920 cctccatttc ttatgtggcg accatccatt tcaccatctc ccgctataaa acacccccat 1980 cacttcacct agaacatcat cactacttgc ttatccatcc aaaagatacc cac 2033 <210> 54 <211> 253 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nos polyadenylation signal <400> 54 gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60 atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120 atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180 gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240 atgttactag atc 253 <210> 55 <211> 708 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ocs polyadenylation signal <400> 55 ctgctttaat gagatatgcg agacgcctat gatcgcatga tatttgcttt caattctgtt 60 gtgcacgttg taaaaaacct gagcatgtgt agctcagatc cttaccgccg gtttcggttc 120 attctaatga atatatcacc cgttactatc gtatttttat gaataatatt ctccgttcaa 180 tttactgatt gtaccctact acttatatgt acaatattaa aatgaaaaca atatattgtg 240 ctgaataggt ttatagcgac atctatgata gagcgccaca ataacaaaca attgcgtttt 300 attattac aa atccaatttt aaaaaaagcg gcagaaccgg tcaaacctaa aagactgatt 360 acataaatct tattcaaatt tcaaaaggcc ccaggggcta gtatctacga cacaccgagc 420 ggcgaactaa taacgttcac tgaagggaac tccggttccc cgccggcgcg catgggtgag 480 attccttgaa gttgagtatt ggccgtccgc tctaccgaaa gttacgggca ccattcaacc 540 cggtccagca cggcggccgg gtaaccgact tgctgccccg agaattatgc agcatttttt 600 tggtgtatgt gggccccaaa tgaagtgcag gtcaaacctt gacagtgacg acaaatcgtt 660 gggcgggtcc agggcgaatt ttgcgacaac atgtcgaggc tcagcagg 708 <210> 56 <211> 50 <212> DNA <213> Carthamus tinctorius <400> 56 tgtctttcaa cgtctccgga agaccctatg accgtttcgc ctgccactac 50 <210> 57 <211> 49 <212> DNA <213> Carthamus tinctorius <400> 57 tgtctttcaa cgtctctgga agacctacaa ccgtttcgcc tgccactat 49 <210> 58 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 58 cttcagcgag taccaatggc tcgac 25 <210> 59 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligionucleotide <400> 59 ggtttcatcg tccactcctt ga 22 <210> 60 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial S equence <220> <223> oligionucleotide <400> 60 cttcagcgag taccaatggc tcgac 25 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligionucleotide <400> 61 ggtttcatcg tccactcctt ga 22 <210> 62 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligionucleotide <400> 62 atgacaccat tggcttcatc tgcca 25 <210> 63 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligionucleotide <400> 63 ctttctgctc actccatact tc 22 <210> 64 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligionucleotide <400> 64 agcgaatatc agtggcttga cgatg 25 <210> 65 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligionucleotide <400> 65 actccgcttt cctcactccg tac 23 <210> 66 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligionucleotide <400> 66 catgaatgtg gtcatcatgc ctttag 26 <210> 67 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligionucleotide <400> 67 cttcttcatc cattcggttt gc 22 <210> 68 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligio nucleotide <400> 68 cgtggttgaa tgacaccatt ggttac 26 <210> 69 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligionucleotide <400> 69 accttctaca caccggtatg cct 23 <210> 70 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligionucleotide <400> 70 catggaagat aagccaccgt cgacatc 27 <210> 71 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligionucleotide <400> 71 aacacgggtt cgcttgagca cga 23 <210> 72 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligionucleotide <400> 72 tgcatacccg caagcaaaac cg 22 <210> 73 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligionucleotide <400> 73 ccatctctcg agagttcctt ac 22 <210> 74 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligionucleotide <400> 74 atgtggtcac catgccttta gtgag 25 <210> 75 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 75 tggaatggtc ctccattccg ctc 23 <210> 76 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 76 acctaac gac agtcatgaac aag 23 <210> 77 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 77 gtgaggaaag cggagtggac aac 23 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 78 tgaaagcaag atgggaggag g 21 <210> 79 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 79 tcacaacttt acttattctt gt 22 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 80 attgaacaat gggtgcaggc 20 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 81 catcatcttc aaatcttatt c 21 <210> 82 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 82 aatcagcagc agcacaagc 19 <210> 83 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 83 caaacatacc accaaatgct act 23 <210> 84 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 84 ctcagtaacc agcctcaaaa cttg 24 <210> 85 <211> 22 <212> DNA <21 3> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 85 gcggattgat caaatacttg tg 22 <210> 86 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 86 atcacaggaa gctcaaagca tct 23 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 87 gtaggttatg taacaatcgt g 21 <210> 88 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 88 tgaagacgtt aagatgggag ctg 23 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 89 gtaggttatg taacaatcgt g 21 <210> 90 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 90 cagatccaac acttcaccac cag 23 <210> 91 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 91 agatctaaag aatttccatg gtg 23 <210> 92 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 92 ctgctctcta cgacactaaa ttcac 25 <210> 93 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonuc leotide <400> 93 tctatctaat gagtatcaag gaac 24 <210> 94 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 94 ctgaattcac acccacagat agctag 26 <210> 95 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 95 acatcccttc ttagctttaa cta 23 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 96 acttcgccct ctgttatctg g 21 <210> 97 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 97 ccatacacat acatcctaca cgat 24 <210> 98 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 98 actcacaata acttcatctc tctc 24 <210> 99 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 99 ctactagcca tacaatgtct tcg 23 <210> 100 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 100 gagattttca gagagcaagc gctt 24 <210> 101 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 101 ctttggtctc gga ggcagac ata 23 <210> 102 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 102 caaaaggagt ttcagaaagc ctcc 24 <210> 103 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 103 actcgttgga tgccttcgag ttc 23 <210> 104 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 104 aatcagcagc agcacaagc 19 <210> 105 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 105 aaggcggtga caattatgat atc 23 <210> 106 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 106 ctcagtaacc agcctcaaaa cttg 24 <210> 107 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 107 aaggcggaga cgattatgat atc 23 <210> 108 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 108 atcacaggaa gctcaaagca tct 23 <210> 109 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 109 atcatctctt cggtaggtta tg 22 <210> 110 <21 1> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 110 cagatccaac acttcaccac cag 23 <210> 111 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 111 ctaaagaatt tccatggtgt tac 23 <210> 112 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 112 acttcgccct ctgttatctg g 21 <210> 113 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 113 gagagacggt ggaagtaggt g 21 <210> 114 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 114 ctcacaataa cttcatctct ctc 23 <210> 115 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 115 aaagacatag gcaacaacga gatc 24 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 116 gtgtatgtct gcctccgaga 20 <210> 117 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 117 gcaaggtagt agaggacgaa g 21 <210> 118 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 118 gcctccaaag attcattcag gtc 23 <210> 119 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 119 caagatggat gcgatggtaa gg 22 <210> 120 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 120 acgtggcggt ctcaggtt 18 <210> 121 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 121 aggcggtgac aattatgata tc 22 <210> 122 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 122 aaggcaggcc gtgatgccga t 21 <210> 123 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 123 agtatttgat caatccgctg g 21 <210> 124 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 124 caatacggta gaggccacac ag 22 <210> 125 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 125 atcatctctt cggtaggtta tg 22 <210> 126 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide < 400> 126 gacatgtgct cacgtggtgc at 22 <210> 127 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 127 gttgctaata tccacaccct a 21 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 128 cgaatcacac ccacgggatc 20 <210> 129 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 129 ctaaagaatt tccatggtgt tac 23 <210> 130 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 130 gagcaacgga gagaagtaac c 21 <210> 131 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 131 gagggatgat agaaagaggt cc 22 <210> 132 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 132 catgtgtggc tggaggattc ga 22 <210> 133 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 133 gcaccgagtt tagcctttgt ct 22 <210> 134 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 134 ccaacaaaca aaccatctct cg 22 <210> 135 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 135 gagagacggt ggaagtaggt g 21 <210> 136 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 136 ccattgatcc acccttcacc tta 23 <210> 137 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 137 aaagacatag gcaacaacga gatc 24 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 138 ctgaactgca attatctagg 20 <210> 139 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 139 ggtattggta ttggatgggc g 21 <210> 140 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 140 ataaggctgt gttcacgggt tt 22 <210> 141 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 141 gctcagttgg ggatacaagg at 22 <210> 142 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 142 agttatggtt cgatgatcga cg 22 <210> 143 <211> 23 <212> DNA <213 > Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 143 ttgctataca tattgaaggc act 23 <210> 144 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 144 ctgaactgca attatctagg 20 <210> 145 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 145 ggtattggta ttggatgggc g 21 <210> 146 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 146 gtgtatgtct gcctccgaga 20 <210> 147 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 147 gcaaggtagt agaggacgaa g 21 <210> 148 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 148 agagatcatt ggagactaga gtg 23 <210> 149 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 149 cccatcaagc acaattcttc ttag 24 <210> 150 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 150 ctacacaatc ggactctggt gct 23 <210> 151 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> o ligonucleotide <400> 151 gccatccatg acacctattc ta 22 <210> 152 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 152 cctcactctg ggaccaagaa at 22 <210> 153 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 153 ttcttgggac atgtgacgta gaa 23 <210> 154 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 154 cattgaagtc ggtattgata tctg 24 <210> 155 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 155 cattgaagtc ggtattgata tctg 24 <210> 156 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 156 gttccaacaa tatcttccac cagt 24 <210> 157 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 157 cctgcaggta ccaatggctc gacgacactg 30 <210> 158 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 158 cggcgcgcct tcacctcctc atctttatcc 30 <210> 159 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motifs of C 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tgtt gtgatggtgg cattacataa 1080 tattcacctt tagctaaaaa ctagatgttc acctacgaac tgatccatat ggaacatttt 1140 gcag 1144