파이토프토라 유래 델타-6 불포화효소 유전자로 형질전환된 들깨 및 이의 제조방법

파이토프토라 유래 델타-6 불포화효소 유전자로 형질전환된 들깨 및 이의 제조방법{TRANSGENIC PERRILLA PLANT TRANSFORMED WITH DELTA-6 DESATURASE GENE FROM PHYTOPHTHORA CITROPHTHORA AND THE METHOD FOR PRODUCING THE SAME}

본 발명은 파이토프토라 유래 델타-6 불포화효소 유전자로 형질전환된 들깨 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

불포화 지방산(Unsaturated fatty acid)은 한 분자 속에 하나 이상의 이중결합을 가지는 사슬 모양 화합물로 동식물 속에 널리 분포하며, 일반적으로 탄소수 12 내지 20개 정도의 짝수 개로 구성되어 있다. 지방산 분자가 단 하나의 이중결합을 갖고 있으면 단일불포화지방산이라고 하며, 두 개 이상의 이중결합을 갖고 있으며 다가불포화지방산이라고 부른다. 불포화지방산은 이중결합 바로 다음의 수소원자가 결합된 형태에 따라 시스형(cis configuration)과 트랜스 형(trans configuration)으로 나뉜다. 시스 형은 인접한 수소원자가 이중결합과 같은 방향에 있는 것을 말하며, 트랜스 형은 다음 2개의 수소원자가 이중결합과 반대의 방향으로 결합한 것을 말한다. 지방산 사슬에서 이중결합이 형성되면 수소원자가 제거되어야 하는데, 이 때문에 포화지방산에서 '포화'라는 용어는 수소 원자가 포화되었다는 것을 의미한다. 세포내 대사에서 수소-탄소 결합은 에너지 생산을 위해 결합이 깨지거나 산화된다. 따라서 불포화지방산은 같은 크기의 포화지방산에 비해 에너지를 더 적게 함유한다. 또한, 불포화지방산은 더 낮은 녹는점을 갖고 있어서 세포막의 유동성을 증가시키는 작용도 하는 것으로 알려졌다.

포화지방산의 섭취는 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia), 동맥경화(atherosclerosis) 등과 같은 심혈관계 질환(cardiovascular disease)의 위험성과 관련이 깊은 반면, 불포화지방산의 섭취는 혈중 콜레스테롤의 감소 및 동맥경화의 발병 위험 감소와 관련이 있는 것으로 잘 알려져 있다. 불포화지방산의 예로는 팔미톨레산(palmitoleic acid), 올레산(oleic acid), 미리스톨레산(myristoleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid, EPA), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid, DHA) 등이 있으며, 이러한 불포화지방산을 함유하는 식품으로는 아보카도, 견과류, 카놀라유나 올리브유와 같은 식물성 기름 등이 있다. 비록 불포화지방산이 포화지방산보다는 건강에 유익하지만, 미국 식품의약국(FDA)에서는 불포화지방산의 섭취량이 하루 칼로리 섭취량의 30%를 넘지 않도록 권고한다.

불포화지방산 중 리놀레산과 알파-리놀렌산(alpha-linolenic acid)은 인간의 체내에서 합성할 수 없으므로 반드시 음식으로부터 섭취해야 하는 필수지방산이며, 이들은 식물성 기름에 널리 존재하는 것으로 알려져 있다. 필수지방산은 면역반응, 염증반응 및 혈압조절에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는데, 리놀레산은 체내에서 델타-6 불포화효소에 의해 감마-리놀렌산((γ-linolenic acid)으로 전환된 후, 아라키돈산으로 전환된다. 이 아라키돈산은 체내 중요한 염증인자인 프로스타글란딘(prostaglandin)의 전구체이다. 스테아리돈산((stearidonic acid)은 또한 델타-6 불포화효소에 의해 알파-리놀렌산으로부터 생합성된다. 스테아리돈산은 EPA와 DHA 등의 고도 불포화지방산의 전구체이기도 하다.

이러한 델타-6 불포화효소는 사람에 따라 제 기능을 못하거나 결핍되어 있을 수 있으므로, 리놀레산 및 알파-리놀렌산 보다 더 불포화된 감마-리놀렌산 및 스테아리돈산의 직접적인 섭취는 건강 유지에 큰 도움이 된다.

그러나 감마-리놀렌산과 스테아리돈산은 식물체에서 얻기 힘든 지방산이다. 감마-리놀렌산은 달맞이꽃 종자유 등으로 시판되고 있으나 생산량과 그 비율이 낮아 $100/kg 정도로 가격이 비싸다. 또한 EPA, DHA 등의 전구체인 스테아리돈산을 높은 비율로 생산한다면 성인에게 낮은 농도의 EPA, DHA를 제공하는 것보다 효과적이다.

이에, 본 발명자들은 델타-6 불포화효소를 들깨에 형질전환하여 감마-리놀렌산 및 스테아리돈산을 높은 비율로 생산하기 위한 연구를 계속하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 감마-리놀렌산 또는 스테아리돈산을 생산하는 형질전환 들깨의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 형질전환 들깨를 제공하는 것이다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 파이토프토라 시트로프토라(Phytophthora citrophthora) 유래 델타-6 불포화효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 들깨를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 감마-리놀렌산 및 스테아리돈산을 생산하는 형질전환 들깨의 제조방법을 제공한다.

상기 서열번호 1의 파이토프토라 시트로프토라(Phytophthora citrophthora) 유래 델타-6 불포화효소 유전자는 NCBI GenBank에 등록된 유전자(DQ836059)로서 크기는 1371 bp이고 아미노산 서열의 수는 456 aa이다.

상기 벡터는 도 1에 개시된 벡터지도를 갖는 pCAMBIA3300 벡터일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 들깨는 엽실 들깨일 수 있다.

본 발명은 상기 방법으로 제조된 감마-리놀렌산 또는 스테아리돈산을 생산하는 형질전환 들깨를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 형질전환 들깨의 종자를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 형질전환 들깨 및/또는 들깨 종자를 이용하여 감마-리놀렌산 및 스테아린산을 동시에 생산하는 방법을 제공한다.

본 명세서 상의 용어 "재조합"은, 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩타이드, 이종의 펩타이드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다.

또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자의 운반체를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는 데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는 데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, FA et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito RD et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein TM et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

생산량과 유지함량이 상대적으로 높은 들깨에서는 감마-리놀렌산 또는 스테아리돈산이 더 많이 생산될 것이므로 저렴한 가격에 소비자들에게 공급할 수 있을 것이다. 본 발명의 형질전환에 이용되는 식물은 들깨인데, 이용가능한 들깨의 종류에는 제한이 없다. 본 발명에서는 형질전환법이 확립된 엽실 들깨를 이용하였는데, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 형질전환 들깨는 고부가 기능성 물질인 감마-리놀렌산 및/또는 스테아리돈산을 대량 생산하는 효과를 제공한다.

도 1은 델타-6 불포화효소 유전자를 포함하는 식물의 형질전환 벡터를 나타내는 모식도이다. PcD6DES는 파이토프토라 시트로프토라(Phytophthora citrophthora) 유래 델타-6 불포화효소 유전자이며 제한효소는 약어로 표기하였으며 다음과 같다. B: BamHI, C: ClaI, H3: HindIII, K: KpnI, P: PstI, R1: EcoRI, Sc: SacI, X: XbaI.
도 2는 형질전환 들깨의 목적유전자 삽입을 나타낸 것이다. 형질전환 들깨 계통 1,2,3A 및 3B 모두 PCR로 델타-6 불포화효소 유전자( PcD6DES )와 제초제 저항성 유전자( Bar )가 증폭되었다. 대조구인 엽실 들깨는 증폭되지 않았다. M: 분자마커, C: 대조구.

본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1 : 델타-6 불포화효소 유전자의 형질전환 벡터 구축

NCBI GenBank에 등록된 (DQ836059) 유전자(서열번호 1)를, 도 1과 같이, 종자 특이 프로모터인 vicilin 프로모터를 포함하는 pVicOCS 벡터를 Bam HI과 Hin dIII로 자른 후 삽입하여 유전자 카세트를 만들고 프로모터와 터미네이터 양쪽의 Xba I으로 잘라 바스타 저항성 유전자(BAR)를 포함하는 pCAMBIA3300을 Xba I으로 잘라 삽입하여 완성하였다.

형질전환 방법은 다음과 같다. 종자를 70% 에탄올에 1분간 소독하고 2%의 차아염소산 나트륨 용액에 20분간 소독하였다. 멸균수로 3회 수세하고 멸균수에 담그어 상온에서 2 시간 방치한 후 필터페이퍼로 물기를 닦아내고 3% 수크로오스와 0.4% 파이타겔(phytagel)이 든 MS 기초배지에 치상하여 발아시켰다. 발아한 유묘의 하배축을 0.5에서 1 cm 길이로 잘라 3% 수크로오스와 3 mg/l의 BA(benzyladenine)이 든 MS 기초배지에 치상하여 하루 동안 전배양하였다. 델타-6 불포화효소가 든 벡터를 포함한 아그로박테리움의 배양액에 20분간 접종하고 물기를 닦아낸 후 같은 배지에 치상하고 2일간 암실에 두었다. 3% 수크로오스와 3 mg/l의 BA와 10 mg/l의 PPT(phosphinothricin)와 0.4% 파이카겔과 500 mg/l 카르베니실린(carbenicillin)이 든 MS 기초배지로 옮겨 2주간 키우고 8주 동안 계대배양하였다. 싹이 나오면 신장을 위해 새 선발 배지로 옮겼고 더 자라면 1/2 농도의 MS 배지에 옮겨 발근을 유도하고 순화하여 온실로 옮겼다. 목적 유전자인 델타-6 불포화효소 유전자와 바스타 저항성 유전자인 bar 유전자를 PCR로 증폭하여 형질전환을 확인하였다(도 2).

실시예 2 : 델타-6 불포화효소 유전자의 형질전환 들깨의 감마-리놀렌산 및 스테아리돈산 생합성 확인

지방산 분리방법은 다음과 같다. 종자 10립씩을 부수어 유리 시험관에 넣고 메탄올에 녹인 5% 황산을 1 ml 넣고 90℃에서 90분간 두어 지방산 용출과 더불어 메틸화를 유도하였다. 상온으로 식힌 후에 1.5 ml의 0.9% NaCl 수용액과 0.5 ml의 n-헥산을 넣어 섞고 2,000 rpm으로 원심분리하여 위의 지방산 층을 분리하였다.

가스크로마토그래피는 GC-2010 플러스(Shimadzu)를 사용하였으며 컬럼은 HP-FFAP 30 m (길이) × 0.25 mm (내경)를 사용하였다. 분석 조건은 다음과 같다. 오븐 온도는 190℃에서 시작하여 매분 3℃씩 상승시켜 230℃에서 끝나도록 하였고 질소 가스를 운반 기체로 사용하였으며 유속은 분당 1.4 ml였다.

형질전환 들깨의 1, 2, 3A, 3B의 4개체의 형질전환체를 확보하였다. 여기서 각각 파생된 5계통의 후대 세대의 종자에서 지방산을 분리하여 가스크로마토그래프 분석 결과, 아래 표1과 같이 감마-리놀렌산(GLA)과 스테아리돈산(SDA)의 두 성분의 합은 3B-1의 경우 최대 45.93%였다.

<110> Republic of Korea <120> TRANSGENIC PERRILLA PLANT TRANSFORMED WITH DELTA-6 DESATURASE GENE FROM PHYTOPHTHORA CITROPHTHORA AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME <130> P120451 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1371 <212> DNA <213> Phytophthora citrophthora <400> 1 atggtggacg gccccaagac gaaacgtatc atcacgtggc aggaagtgca gcagcactcg 60 acgtacgcca acgcgtggat tgtcattcac cacaaagttt acgacatcag caaatgggac 120 tcgcacccgg gcggcatggt catgctctcg caagctgggg aggacgctac tgacatcttc 180 acagtatgtc accccacaag ctcttggaaa ctactggagc aattctacat cggtgacgta 240 gacgagagca ctgctccggg cacgaaggac ctttcggagg agcagaagac caagaaggcc 300 aagacggacg agttcattgg tgcttaccgt cgtctgcgta tcaagatcaa gggaatggga 360 ctgtatgacg ctagtatggt ctactacgcc tggaagattc tcagcacctt cagtatctgg 420 atgacctctg tggcgatctg ctggcacttc gatagctggc ccatgtacat cctcgcggct 480 tgtgttatgg gtctcttctg gcagcaatcc ggttggcttg cacacgacgt gctgcaccac 540 caagtgtggg acaaccacat gatcggcaac gtcatgggcg tcattatcgg cgatatctgg 600 atgggtttca gtgtgcagtg gtggaagaac aagcacaact ttcaccacgc tgtcccgaac 660 ctcgtcggcg acgctaagac caagtacctc ggtgatccgg acattgacac gatgcctctg 720 ctggcttgga gcaagcacat ggcttcgcgc gcctacgagt cgagctgggg cccgttcttc 780 gtcagtaacc aggctgtcat gtacttcccg ctcctgctct tcgcccgttt cagctggttg 840 ttgcagagtt actactacgt cttcaagggc ttcgcgttcg gccagtacga ccccgtggat 900 ctccctaacg gcgagaagtt cggcctcctt gtgcactact tctggaacgt ggcgctgcct 960 atcgtcacgg gaatgtcagt tttccagggt tttactttct ttatgctctc gcaaatgtct 1020 tgcggcgcct tcctggccgc tgtcttcagc gtgggccaca acggtatgtc tgtgtacgag 1080 cgtgaagaga agcccgactt ctggcagttg caggtcacca ctacgcgcaa catcacgcct 1140 gggttcttca tggactggtt ctgcggtggt ctcaactacc agatcgagca ccacttgttc 1200 cccatgatgc cgcgtcacaa cctgcagaag gtcaatccgt tggtcaagtc gctctgcaag 1260 cagtacgatg ttcgtttcca cgagacggga ttctaccgcg gactggttga ggttgtggac 1320 aagctggcgg acatcagcaa ggagttcctg cttgaattcc ccgcgatgta a 1371