VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON 7-DEHYDROCHOLESTEROL UND/ODER DESSEN BIOSYNTHETISCHEN ZWISCHEN- UND/ODER FOLGEPRODUKTEN IN TRANSGENEN ORGANISMEN

Verfahren zur Herstellung von 7-Dehydrocholesterσl und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten in trans- genen Organismen

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 7-Dehydrocholesterol und/oder dessen biosynthetischen Zwi- sehen- und/oder Folgeprodukten durch Kultivierung von Organismen, insbesondere Hefen. Ferner betrifft die Erfindung die zur Herstellung der genetisch veränderten Organismen benötigten Nuklein- säurekonstrukte, sowie die genetisch veränderten Organismen, insbesondere Hefen selbst .

7-Dehydrocholesterol, auch als Cholesta-5 , 7-dienol oder Provitamin D3 bezeichnet, dessen biosynthetische Zwischenprodukte des Sterolstoffwechsels, wie beispielsweise Zymosterol, Farnesol, Geraniol, Squalen, Lanosterol, Cholesta 5, 7, 24-trienol und Cho- lesta-5, 7, 22, 24-tetraenol sowie dessen biosynthetischen Folgeprodukte des Sterolstoffwechsels, wie Vitamin D ₃ und Cholesterol sind Verbindungen mit hohem wirtschaftlichen Wert.

Die wirtschaftliche Bedeutung von 7-Dehydrocholesterol liegt vor allem in der Gewinnung von Vitamin D3 aus 7-Dehydrocholesterol über UV-Bestrahlung.

Squalen wird als Synthesebaustein für die Synthese von Terpenen benutzt. In hydrierter Form findet es als Squalan Verwendung in Dermatologie und Kosmetik sowie in verschiedenen Derivaten als Inhaltstoff von Haut- und Haarpflegemitteln.

Weiterhin wirtschaftlich nutzbar sind Sterole, wie Zymosterol und Lanosterol, wobei Lanosterol Roh- und Synthesepivotal für die chemische Synthese von Saponinen und Steroidhormonen ist. Wegen seiner guten Hautpenetration und Spreadingeigenschaften dient Lanosterol als Emulsionshilfs- und Wirkstoff für Hautcremes.

Ein wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung von 7-Dehydrocho- lesterol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten ist daher von großer Bedeutung.

Besonders wirtschaftliche Verfahren sind biotechnologische Verfahren unter Ausnutzung -von durch genetische Veränderung opti- mierter Organismen, die 7-Dehydrocholesterol und/oder dessen biosynthetische Zwischen- und/oder Folgeprodukte herstellen. Während der Sterolstoffwechsel in Bakterien, Pilzen, Hefen und einigen Insekten im wesentlichen von Zymosterol über Fecosterol,

Episterol, Ergosta-5 , 7-dienol und Ergosta-5, 7, 22, 24-tetraen-3ß-ol zu Ergosterol (Provitamin D) führt, führt der Sterolstoffwechsel in Säugern im wesentlichen von Zymosterol über Cholesta-7, 24-die- nol, Lathosterol zu 7-Dehydro-Cholsterol (Provitamin D ₃ ) .

7-Dehydro-Cholsterol (Provitamin D ₃ ) wird durch die 7-Dehydro-Cho- lesterolreduktase in Cholesterol und Cholesterol in Steroidhor- mone, Corticoide und Gallensäuren wie Progesteron, Testosteron, Estradiol, Aldosteron, Cortison und Cholat überführt.

Einige Gene des 7-Dehydrocholsterol-Stoffwechsels in Säugern sind bekannt und kloniert, wie beispielsweise

Nukleinsäuren kodierend eine humane Δ8-Δ7-Isomerase (auch Emopamil Binding Protein (EBP) genannt) , ACCESSION NM_006579 und eine murine Δ8-Δ7-Isomerase (Braverman,N. et al.,(1999): Mutations in the gene encoding 3beta-hydroxysteroid-delta8 , delta7-isomerase cause X-linked dominant Conradi-Hunermann syndrome.Nat .Ge- net.22(3) ,291-294. ,

Nukleinsäuren kodierend eine humane Δ5-Desaturase (auch Sterol- C5-Desaturase genannt) , ACCESSION AB016247 und eine murine Δ5-De- saturase (Nishi,S. et al., (2000) :cDNA cloning of the mammalian sterol C5-desaturase and the expression in yeast mutant. Bio- chi .Biophys.Acta 1490(1-2) ,106-108) ,

Nukleinsäuren kodierend eine humane Δ24-Reduktase (auch 24-Dehy- drocholesterol Reduktase (DHCR24) genannt), ACCESSION NM_014762 und eine murine Δ24-Reduktase (Waterham,HR et al. (2001) : Mutations in the 3beta-hydroxysterol Delta24-redύctase gene cause desmosterolosis, an autosomal recessive disorder of cholesterol biosynthesis. Am.J.Hum.Genet.69 (4) , 685-694 und

Nukleinsäuren kodierend eine humane Sterol-Acyltransferase (Chang, CC et al . ,Molecular cloning and functional expression of human acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase cDNA in mutant Chinese hamster ovary cells, J. Biol. Che . 1993, Oct 5;268(28) :20747-55) und eine murine Sterol-Acyltransferase (Uel- men, PJ : Tissue-specific expression and cholesterol regulation of acylcoenzyme A: cholesterol acyltransferase (ACAT) in mice. Mo- lecular cloning of inouse ACAT cDNA, chromosomal localization, and regulation of ACAT in vivo and in vitro, J. Biol. Chem. 1995 Nov 3;270(44) :26192-201. Die Gene des Ergosterol-Stoffwechsels in Hefe sind weitgehend bekannt und kloniert, wie beispielsweise

Nukleinsäuren kodierend eine Δ8-Δ7-Isomerase (ERG2) (Ashman, WH et al. (1991) :Cloning and disruption of the yeast C-8 sterol iso- merase gene.Lipids.Aug;26 (8) : 628-32. ) ,

Nukleinsäuren kodierend eine Δ5-Desaturase (ERG3) (Arthington, BA et al. (1991): Cloning, disruption and sequence of the gene encoding yeast C-5 sterol desaturase. Gene.Junl5;102 (1) :39-44. ) ,

Nukleinsäuren kodierend eine Δ24-Reduktase (ERG 4) (Lai, MH et al., (1994): The identification of a gene family in the Saccharo- myces cerevisiae ergosterol biosynthesis pathway. Gene.Marll; 140 (1): 41-9.) ,

Nukleinsäuren kodierend eine HMG-CoA-Reduktase (HMG) (Bason ME et al, (1988) Structural and functional conservation between yeast and human 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzy e A reductases, the rate-limiting enzyme of sterol biosynthesis. Mol Cell Biol 8:3797-3808,

Nukleinsäuren kodierend eine trunkierte HMG-CoA-Reduktase (t- HMG) (Polakowski T, Stahl U, Lang C. (1998) Overexpression of a cy- tosolic hydroxy ethylglutaryl-CoA reductase leads to squalene accu ulation in yeast. Appl Microbiol Biotechnol. Jan; 49(1) :66-71,

Nukleinsäuren kodierend eine Lanosterol-C14-Demethylase (ERG11) (Kalb VF, Loper JC, Dey CR, Woods CW, Sutter TR (1986) Isolation of a cytochro e P-450 structural gene from Saccharomyces cerevisiae. Gene 45 (3) : 237-45,

Nukleinsäuren kodierend eine Squalensynthetase (ERG9) (Jennings, SM , (1991): Molecular cloning and characterization of the yeast gene for squalene synthetase. Proc Natl Acad Sei USA. Jull5;88(14) : 6038-42) ,

Nukleinsäuren kodierend eine Sterol-Acyltransferase (SAT1) und (SAT2) (Yang, H. : Sterol esterification in yeast: a two-gene pro- cess. Science. 1996 May 31;272 (5266) :1353-6. ) sowie eine weitere Sterol-Acyltransferase (J. Biol. Chem. 1996, Sep 27;271(39) :24157-63), Nukleinsäuren kodierend eine Squalenepoxidase (ERGl) (Jandrositz, A. , et al (1991) The gene encoding squalene epoxidase from Sac- charomyces cerevisiae: cloning and characterization. Gene 107:155-160) ,

Nukleinsäuren kodierend eine C24-Methyltransferase (ERG6) (Hard- wick, KG et al.,:SED6 is identical to ERG6, and encodes a puta- tive methyltransferasere quired for ergosterol synthe- sis.Yeast.Feb; 10 (2 ): 265-9) und

Nukleinsäuren kodierend eine Delta22-Desaturase (ERG5) (Skaggs, BA et al, : Cloning and characterization of the Saccharomyces cerevisiae C-22 sterol desaturase gene, encoding a second cytoch- rome P-450 involved in ergosterol biosynthesis, Gene.1996 Feb22; 169(1) : 105-9. ) .

Weiterhin sind Verfahren bekannt, die eine Erhöhung des Gehalts an spezifischen Intermediaten und Endprodukten des Sterolstoff- wechsels in Hefen und Pilzen zum Ziel haben.

Es ist aus EP 486 290 bekannt, daß der Gehalt an Squalen und weiteren spezifischen Sterolen, wie beispielsweise Zymosterol in Hefen erhöht werden kann, indem man die Expressionsrate der HMG- CoA-Reduktase erhöht und gleichzeitig den Stoffwechselweg der Zy- mosterol-C24-Methyltransferase (ERG6) und der Ergo- sta-5,7,24 (28) -trienol-22-dehydrogenase (ERG5) unterbricht.

Aus T. Polakowski, Molekularbiologische Beeinflussung des Ergo- sterolstoffwechsels der Hefe Saccharomyces cerevisiae, Shaker Verlag Aachen, 1999, Seite 59 bis 66 ist bekannt, daß die Erhöhung der Expressionsrate der HMG-CoA-Reduktase alleine ohne Unterbrechung des abfließenden Stoffwechselflußes wie in EP 486 290 lediglich zu einer leichten Erhöhung des Gehalts an frühen Sterolen, sowie Squalen führt, während sich der Gehalt an späteren Sterolen, wie Ergosterol nicht signifikant ändert, bzw. bei Ergosterol sogar tendenziell abnimmt.

WO 99/16886 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Ergosterol in Hefen, die eine Kombination der Gene tHMG, ERG9, SATl und ERGl überexprimieren.

Tainaka et al., J, Ferment. Bioeng. 1995, 79, 64-66, beschreiben ferner, daß die Überexpression von ERG11 (Lanosterol-C14-Demethy- lase) zu einer Anreicherung von 4, 4-Dimethylzymosterol jedoch nicht von Ergosterol führt. Die Transformante zeigte gegenüber dem Wildtyp einen, je nach Fermentationsbedingungen, um den Faktor 1,1 bis 1,47 gesteigerten Zymosterolgehalt.

Avruch et al, Can.J.Biochem 1976, 54(7), 657-665 sowie Xu et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988, 155(1), 509-517 beschreiben, daß durch spezifische Hemmung der C24-Methyltransferase und auch durch eine Mutation am Genlocus ergδ in S. cerevisiae neben Zymosterol, auch Spuren von Cholesterol nachzuweisen sind.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zu Herstellung von 7-Dehydrocholesterol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten mit vorteilhaften Eigenschaften, wie einer höheren Produktausbeute, zur Verfügung zu stellen.

Demgemäß wurde ein Verfahren zur Herstellung von 7-Dehydrochole- sterol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten gefunden, indem man Organismen kultiviert, die gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte Aktivität mindestens einer der Ak- tivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, Δ5-Desaturase-Aktivität und Δ24-Reduktase-Aktivität aufweisen.

Eine erhöhte Aktivität gegenüber dem Wildtyp bedeutet für den Fall, daß der AusgangsOrganismus diese Aktivität nicht aufweist, daß die Aktivität verursacht wird. Für den Fall, daß der Ausgangsorganismus die Aktivität bereits aufweist, bedeutet eine gegenüber dem Wildtyp erhöhte Aktivität eine um einen Prozentsatz erhöhte Aktivität.

Unter Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer Δ8-Δ7-Isomerase, auch Δ8-Δ7-Sterolisomerase genannt, verstanden.

Unter einer Δ8-Δ7-Isomerase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Zymosterol in Chole- sta-7,2 -dienol umzuwandeln.

Dementsprechend wird unter Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Δ8-Δ7-Isomerase umgesetzte Menge Zymosterol bzw. gebildete Menge Cholesta-7, 24-dienol ver- standen.

Bei einer erhöhten Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Δ8-Δ7-Isomerase die umgesetzte Menge Zymosterol bzw. die gebildete Menge Cholesta-7, 24-dienol erhöht. Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität mindestens 5%, weiter bevorzugt mindestens 20%, weiter bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 100%, bevorzugter mindestens 300%, noch bevorzugter mindestens 500%, insbesondere mindestens 600% der Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität des Wildtyps.

Unter Δ5-Desaturase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer

Δ5-Desaturase, auch Lathosterol-5-desaturase oder Sterol-C5-Desa- turase genannt, verstanden.

Unter einer Δ5-Desaturase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Cholesta-7,24-dienol in Chole- sta-5 , 7, 24-trienol umzuwandeln.

Dementsprechend wird unter Δ5-Desaturase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Δ5-Desaturase umgesetzte Menge Cholesta-7,24-dienol bzw. gebildete Menge Cholesta-5, 7, 24-trienol verstanden.

Bei einer erhöhten Δ5-Desaturase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Δ5-Desaturase die umgesetzte Menge Chole- sta-7,24-dienol bzw. die gebildete Menge Cholesta-5 , 7 , 24-trienol erhöht.

Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der Δ5-Desaturase-Aktivität mindestens 5%, weiter bevorzugt mindestens 20%, weiter bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 100%, bevorzugter mindestens 300%, noch bevorzugter mindestens 500%, insbesondere mindestens 600% der Δ5-Desaturase-Aktivität des Wildtyps.

Unter Δ24-Reduktase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer Δ24-Reduktase, auch 24-Dehydrocholesterol-Reduktase genannt, verstanden.

Unter einer Δ24-Reduktase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, die Doppelbindung zwischen C24 und C25 von Cholesterol-Verbindungen in eine Einfachbindung zu überführen, wie beispielsweise Cholesta-5,7, 24-trienol in 7-Dehy- drocholesterol oder Zymosterol in Lathosterol oder Chol- sta-7,24-dienol in Cholesta-7-enol umzuwandeln.

Dementsprechend wird unter Δ24-Reduktase-Aktivität vorzugsweise die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Δ24-Reduktase u - gesetzte Menge Cholesta-5, 7, 24-trienol bzw. gebildete Menge 7-De- hydrocholesterol verstanden. Bei einer erhöhten Δ24-Reduktase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Δ24-Reduktase die umgesetzte Menge Chole- sta-5, 7, 24-trienol bzw. die gebildete Menge 7-Dehydrocholesterol erhöht.

Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der Δ24-Reduktase-Aktivität mindestens 5%, weiter bevorzugt mindestens 20%, weiter bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 100%, bevorzugter mindestens 300%, noch bevorzugter mindestens 500%, insbesondere mindestens 600% der Δ24-Reduktase-Aktivität des Wildtyps.

Unter einem Wildtyp wird der entsprechende nicht genetisch veränderte Ausgangsorganismus verstanden. Vorzugsweise und insbeson- dere in Fällen in denen der Organismus oder der Wildtyp nicht eindeutig zuordenbar ist, wird unter Wildtyp für die Erhöhung der Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, die Erhöhung der Δ5-Desaturase-Aktivi- tät, die Erhöhung der Δ24-Reduktase-Aktivität, die Reduzierung der nachstehend beschriebenen C24-Methyltransferase-Aktivität, die Reduzierung der nachstehend beschriebenen Δ22-Desaturase-Ak- tivität, die Erhöhung der nachstehend beschriebenen HMG-CoA-Re- duktase-Aktivität, die Erhöhung der nachstehend beschriebenen La- nosterol-C14-Demethylase-Aktivität, die Erhöhung der nachstehend beschriebenen Squalenepoxidase-Aktivität, die Erhöhung der nach- stehend beschriebenen Squalensynthetase-Aktivität und die Erhöhung der nachstehend beschriebenen Sterol-Acyltransferase-Aktivi- tät sowie für die Erhöhung des Gehalts an 7-Dehydrocholesterol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten ein Referenzorganismus verstanden. Dieser ReferenzOrganismus ist vorzugsweise der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae AH22.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden Organismen kultiviert, die gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte Aktivität mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, Δ5-Desaturase-Aktivität und Δ24-Reduktase-Aktivität aufweisen.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden Organismen kultiviert, die gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase- Aktivität, Δ5-Desaturase-Aktivität oder Δ24-Reduktase-Aktivität aufweisen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weisen die Organismen gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte Aktivität mindestens zwei der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, Δ5-Desaturase-Aktivität und Δ24-Reduktase-Aktivität auf. Besonders bevorzugte Kombinationen sind eine im Vergleich zum Wildtyp erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität und Δ5-Desaturase-Akti- vität, Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität und Δ24-Reduktase-Aktivität sowie eine im Vergleich zum Wildtyp erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität und Δ24-Reduktase-Aktivität .

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weisen die Organismen gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, Δ5-Desaturase-Aktivi- tat und Δ24-Reduktase-Aktivität auf.

Die Erhöhung der Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, Δ5-Desaturase-Aktivi- tät und Δ24-Reduktase-Aktivität sowie der der nachstehend beschriebenen HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, Lanosterol-C14-Demethy- lase-Aktivität, Squalenepoxidase-Aktivität, Squalensynthetase-Ak- tivität und Sterol-Acyltransferase-Aktivität kann unabhängig voneinander durch verschiedene Wege erfolgen, beispielsweise durch Ausschalten von hemmenden Regulationsmechanismen auf Expressionsund Proteinebene oder durch Erhöhung der Genexpression der ent- sprechenden Nukleinsäuren, also Nukleinsäuren codierend eine

Δ8-Δ7-Isomerase, Δ5-Desaturase, Δ24-Reduktase, HMG-CoA-Reduktase, Lanosterol-C14-Demethylase, Squalenepoxidase, Squalensynthetase oder Sterol-Acyltransferase gegenüber dem Wildtyp.

Die Erhöhung der Genexpression der entsprechenden Nukleinsäure gegenüber dem Wildtyp kann ebenfalls durch verschiedene Wege erfolgen, beispielsweise durch Induzierung der entsprechenden Gene durch Aktivatoren, also durch Induzierung des Δ8-Δ7-Isomerase- Gens, des Δ5-Desaturase-Gens, des Δ24-Reduktase-Gens, des HMG- CoA-Reduktase-Gens , des Lanosterol-C14-Demethylase-Gens, des Squalenepoxidase-Gens, des Squalensynthetase-Gens oder des Ste- rol-Acyltransferase-Gens durch Aktivatoren oder durch Einbringen von einer oder mehrerer Genkopien der entsprechenden Nukleinsäuren, also durch Einbringen einer oder mehrerer Nukleinsäuren co- dierend eine Δ8-Δ7-Isomerase, Δ5-Desaturase, Δ24-Reduktase, HMG- CoA-Reduktase, Lanosterol-C14-Demethylase, Squalenepoxidase, Squalensynthetase oder Sterol-Acyltransferase in den Organismus.

Unter Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine Δ8-Δ7-Isomerase, Δ5-Desaturase, Δ24-Reduktase, HMG-CoA- Reduktase, Lanosterol-C14-Demethylase, Squalenepoxidase, Squalensynthetase oder Sterol-Acyltransferase wird erfindungsgemäß auch die Manipulation der Expression der Organismus eigenen, insbesondere der Hefen eigenen, endogenen Δ8-Δ7-Isomerasen, Δ5-Desatura- sen, Δ24-Reduktasen, HMG-CoA-Reduktasen, Lanosterol-C14-Demethy- lasen, Squalenepoxidasen, Squalensynthetasen oder Sterol-Acyl- transferasen verstanden.

Dies kann beispielsweise durch Veränderung der Promotor DNA-Se- quenz für Δ8-Δ7-Isomerase, Δ5-Desaturase, Δ24-Reduktase, HMG-CoA- Reduktase, Lanosterol-C14-Demethylase, Squalenepoxidase, Squalensynthetase oder Sterol-Acyltransferase kodierende Gene erreicht werden. Eine solche Veränderung, die eine erhöhte Expressionsrate des entsprechenden Gens zur Folge hat, kann beispielsweise durch Deletion oder Insertion von DNA Sequenzen erfolgen.

Es ist, wie vorstehend beschrieben, möglich, die Expression der endogenen Δ8-Δ7-Isomerase, Δ5-Desaturase, Δ24-Reduktase, HMG-CoA- Reduktase, Lanosterol-C14-Demethylase, Squalenepoxidase, Squalen- synthetase oder Sterol-Acyltransferase durch die Applikation exogener Stimuli zu verändern. Dies kann durch besondere physiologische Bedingungen, also durch die Applikation von Fremdsubstanzen erfolgen.

Desweiteren kann eine veränderte bzw. erhöhte Expression endogener Δ8-Δ7-Isomerase-, Δ5-Desaturase-, Δ24-Reduktase-, HMG-CoA-Reduktase-, Lanosterol-C14-Demethylase-, Squalenepoxidase-, Squalensynthetase- oder Sterol-Acyltransferase-Gens dadurch erzielt werden, dass ein im nicht transformierten Organismus nicht vor- kommendes Regulator-Protein mit dem Promotor dieser Gene in Wechselwirkung tritt.

Solch ein Regulator kann ein chimäres Protein darstellen, welches aus einer DNA-Bindedomäne und einer Transkriptionsaktivator-Do- mäne besteht, wie beispielsweise in WO 96/06166 beschrieben.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp durch eine Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine Δ8-Δ7-Isomerase.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine Δ8-Δ7-Isome- rase durch Einbringen von einer oder mehrer Nukleinsäuren codie- rend eine Δ8-Δ7-Isomerase in den Organismus.

Dazu kann prinzipiell jedes Δ8-Δ7-Isomerase-Gen, also jede Nukleinsäure, die eine Δ8-Δ7-Isoπιerase codiert, verwendet werden.

Bei genomischen Δ8-Δ7-Isomerase-Nukleinsäure-Sequenzen aus euka- ryontischen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall daß der WirtsOrganismus nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechenden Δ8-Δ7-Isomerase zu ex- primieren, bevorzugt bereits prozessierte Nukleinsäuresequenzen, wie die entsprechenden cDNAs zu verwenden.

Beispiele für Δ8-Δ7-Isomerase-Gene sind Nukleinsäuren, codierend eine murine Δ8-Δ7-Isomerase (Nukleinsäure: Seq. ID. No. 1, Protein: Seq. ID. No. 2) oder eine humane Δ8-Δ7-Isomerase (Nukleinsäure: Seq. ID. No. 3, Protein: Seq. ID. No. 4) (Braverman,N. et al.,(1999): Mutations in the gene encoding 3beta-hydroxyste- roid-delta8,delta7-isomerase cause X-linked dominant Conradi- Hunermann syndrome, Nat. Genet. 22(3), 291-294), aber auch Nukleinsäuren die Proteine codieren, die beispielsweise aufgrund einer breiten Substratspezifität die Aktivität einer Δ8-Δ7-Isome- rase aufweisen, wie beispielsweise Nukleinsäuren, codierend eine C8-Isomerase aus Saccharomyces cerevisiae (ERG2) , Nukleinsäure: Seq. ID. No. 5, Protein: Seq. ID. No. 6), (Ashman, WH et al. (1991) :Cloning and disruption of the yeast C-8 sterol isomerase gene.Lipids.Aug;26(8) : 628-32.) .

In den erfindungsgemäßen transgenen Organismen liegt also in dieser bevorzugten Ausführungsform gegenüber dem Wildtyp mindestens ein weiteres Δ8-Δ7-Isomerase-Gen vor.

Die Anzahl der Δ8-Δ7-Isomerase-Gene in den erfindungsgemäßen transgenen Organismen beträgt mindestens zwei, vorzugsweise mehr als zwei, besonders bevorzugt mehr als drei, ganz besonders bevorzugt mehr als fünf.

Alle in der Beschreibung erwähnten Nukleinsäuren können bei- spielsweise eine RNA-, DNA- oder cDNA-Sequenz sein.

Bevorzugte Δ8-Δ7-Isomerase-Gene sind Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, die eine hohe Substratspezifität für Zymosterol aufweisen. Demnach sind insbesondere Δ8-Δ7-Isomerase-Gene und die ent- sprechenden Δ8-Δ7-Isomerasen aus Säugetieren und deren funktioneile Äquivalente bevorzugt.

Dementsprechend bevorzugt verwendet man im vorstehend beschriebenen Verfahren Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50%, bevorzugter mindestens 70%, noch bevorzugter mindestens 90%, am bevorzugtesten mindestens 95% auf Amino- säureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2, und die die enzymatische Eigenschaft einer Δ8-Δ7-Isomerase aufweisen. Die Sequenz SEQ. ID. NO. 2 stellt die Aminosäuresequenz der Δ8-Δ7-Isomerase aus Mus musculus dar.

Weitere Beispiele für Δ8-Δ7-Isomerasen und Δ8-Δ7-Isomerase-Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SeQ ID. NO. 2 leicht auffinden.

Die Δ8-Δ7-Isomerase aus Homo sapiens (Seq. ID. No. 4) weist beispielsweise mit der Δ8-Δ7-Isomerase aus Mus musculus (Seq. ID. No. 2) eine Identität von 74 % auf.

Weitere Beispiele für Δ8-Δ7-Isomerasen und Δ8-Δ7-Isomerase-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ. ID. No. 1 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungs- und PCR-Techni- ken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.

Unter dem Begriff "Substitution" ist in der Beschreibung der Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren durch eine oder mehrere Aminosäuren zu verstehen. Bevorzugt werden sog. konservative Austausche durchgeführt, bei denen die ersetzte Aminosäure eine ähn- liehe Eigenschaft hat wie die ursprüngliche Aminosäure, beispielsweise Austausch von Glu durch Asp, Gin durch Asn, Val durch Ile, Leu durch Ile, Ser durch Thr.

Deletion ist das Ersetzen einer Aminosäure durch eine direkte Bindung. Bevorzugte Positionen für Deletionen sind die Termini des Polypeptides und die Verknüpfungen zwischen den einzelnen Proteindomänen.

Insertionen sind Einfügungen von Aminosäuren in die Polypeptid- kette, wobei formal eine direkte Bindung durch ein oder mehrere Aminosäuren ersetzt wird.

Unter Identität zwischen zwei Proteinen wird die Identität der Aminosäuren über die jeweils gesamte Proteinlänge verstanden, insbesondere die Identität die durch Vergleich mit Hilfe der Lasergene Software der Firma DNASTAR, inc.Madison, Wisconsin (USA) unter Anwendung der Clustal Methode (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5 (2) :151-1) unter Einstellung fol- gender Parameter berechnet wird: Multiple alignment parameter:

Gap penalty 10

Gap length penalty 10

Pairwise alignment parameter:

K-tuple 1

Gap penalty 3

Window 5

Diagonals saved 5

Unter einem Protein, das eine Identität von mindestens 30 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweist, wird dementsprechend ein Protein verstanden, das bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2, insbesondere nach obigen Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Identität von mindestens 30 % aufweist.

In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform werden zur Erhöhung der Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäu- resequenz der Δ8-Δ7-Isomerase aus Mus musculus (SEQ. ID. NO. 2) .

Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.

Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der organismusspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.

Soll das Protein beispielsweise in Hefe exprimiert werden, so ist es häufig vorteilhaft, die codon usage der Hefe bei der Rückübersetzung zu verwenden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ. ID. NO. 1 in den Organismus ein.

Die Sequenz SEQ. ID. NO. 1 stellt die cDNA aus Mus musculus dar, die die Δ8-Δ7-Isomerase der Sequenz SEQ ID NO. 2 codiert.

Alle vorstehend erwähnten Δ8-Δ7-Isomerase-Gene sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleo- tidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligo- nukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow- Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989) , Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der

Δ5-Desaturase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp durch eine Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine Δ5-Desatu- rase.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine Δ5-Desaturase durch Einbringen von einer oder mehrer Nukleinsäuren codierend eine Δ5-Desaturase in den Organismus .

Dazu kann prinzipiell jedes Δ5-Desaturase-Gen, also jede Nukleinsäure die eine Δ5-Desaturase codiert, verwendet werden.

Bei genomischen Δ5-Desaturase-Nukleinsäure-Sequenzen aus euka- ryontischen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall daß der Wirtsorganismus nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechenden Δ5—Desaturase zu expri- mieren, bevorzugt bereits prozessierte Nukleinsäuresequenzen, wie die entsprechenden cDNAs zu verwenden.

Beispiele für Δ5—Desaturase-Gene sind Nukleinsäuren, codierend eine murine Δ5-Desaturase (Nukleinsäure: Seq. ID. No. 7, Protein: Seq. ID. No. 8 oder eine humane Δ5-Desaturase (Nukleinsäure: Seq. ID. No. 9, Protein: Seq. ID. No. 10) (Nishi,S. et al., (2000): cDNA cloning of the mammalian sterol C5-desaturase and the ex- pression in yeast mutant. Biochim. Biophys. Acta, 1490, (1-2), 106-108) , aber auch Nukleinsäuren die Proteine codieren, die beispielsweise aufgrund einer breiten Substratspezifität die Aktivität einer Δ5-Desaturase aufweisen, wie beispielsweise Nukleinsäuren, codierend eine C5-Desaturase aus Saccharomyces cerevisiae (ERG3) , (Nukleinsäure: Seq. ID. No. 11, Protein: Seq. ID. No. 12), (Arthington, BA et al. (1991): Cloning, disruption and sequence of the gene encoding yeast C-5 sterol desaturase. Gene.Junl5; 102 (1) :39-44.) . In den erfindungsgemäßen transgenen Organismen liegt also in dieser bevorzugten Aus ührungsform gegenüber dem Wildtyp mindestens ein weiteres Δ5-Desaturase-Gen vor.

Die Anzahl der Δ5-Desaturase-Gene in den erfindungsgemäßen transgenen Organismen beträgt mindestens zwei, vorzugsweise mehr als zwei, besonders bevorzugt mehr als drei, ganz besonders bevorzugt mehr als fünf.

Bevorzugte Δ5-Desaturase-Gene sind Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, die eine hohe Substratspezifität für Cholesta-7,24-die- nol aufweisen. Demnach sind insbesondere Δ5-Desaturase-Gene und die entsprechenden Δ5-Desaturasen aus Säugetieren und deren funktioneilen Äquivalente bevorzugt.

Dementsprechend bevorzugt verwendet man im vorstehend beschriebenen Verfahren Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 8 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abge- leitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50%, bevorzugter mindestens 70%, noch bevorzugter mindestens 90%, am bevorzugtesten mindestens 95% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 8, und die die enzymatische Eigenschaft einer Δ5-Desaturase aufweisen.

Die Sequenz SEQ. ID. NO. 8 stellt die Aminosäuresequenz der Δ5-Desaturase aus Mus musculus dar.

Weitere Beispiele für Δ5-Desaturasen und Δ5-Desaturase-Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz bekannt ist durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäurese- quenzen aus Datenbanken mit der SeQ ID. NO. 2 leicht auffinden.

Die Δ5-Desaturase aus Homo sapiens (Seq. ID. No. 10) weist beispielsweise mit der Δ5-Desaturase aus Mus musculus (Seq. ID. No. 8) eine Identität von 84% auf.

Weitere Beispiele für Δ5-Desaturasen und Δ5-Desaturase-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ. ID. No. 7 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungs- und PCR-Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.

Unter einem Protein, das eine Identität von mindestens 30 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 8 aufweist, wird dementsprechend ein Protein verstanden, das bei einem Ver- gleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 8, insbesondere nach obigen Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Identität von mindestens 30 % aufweist.

In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform werden zur Erhöhung der Δ5-Desaturase-Aktivität Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der Δ5-Desaturase aus Mus musculus (SEQ. ID. NO. 8) .

Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.

Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der organismusspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.

Soll das Protein beispielsweise in Hefe exprimiert werden, so ist es häufig vorteilhaft, die codon usage der Hefe bei der Rückübersetzung zu verwenden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ. ID. NO. 7 in den Organismus ein.

Die Sequenz SEQ. ID. NO. 7 stellt die cDNA aus Mus musculus dar, die die Δ5-Desaturase der Sequenz SEQ ID NO. 8 codiert.

Alle vorstehend erwähnten Δ5-Desaturase-Gene sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotid- bausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Dop- pelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamidit- methode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow-Fragmentes der DNA- Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungs- verfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory anual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Δ24-Reduktase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp durch eine Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine Δ24-Reduk- tase.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine Δ24-Reduktase durch Einbringen von einer oder mehrer Nukleinsäuren codierend eine Δ24-Reduktase in den Organismus.

Dazu kann prinzipiell jedes Δ24-Reduktase-Gen, also jede Nukleinsäure die eine Δ24-Reduktase codiert, verwendet werden.

Bei genomischen Δ24-Reduktase-Nukleinsäure-Sequenzen aus euka- ryontischen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall daß der Wirtsorganismus nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechenden Δ24-Reduktase zu expri- mieren, bevorzugt bereits prozessierte Nukleinsäuresequenzen, wie die entsprechenden cDNAs zu verwenden.

Beispiele für Δ24-Reduktase-Gene sind Nukleinsäuren, codierend eine murine Δ24—Reduktase (Nukleinsäure: Seq. ID. No. 13, Protein: Seq. ID. No. 14 oder eine humane Δ24-Reduktase (Nukleinsäure: Seq. ID. No. 15, Protein: Seq. ID. No. 16), (Waterham,HR et al.: Mutations in the 3beta-Hydroxysterol Delta24-Reductase Gene Cause Desmosterolosis, an Autosomal Recessive Disorder of Cholesterol Biosynthesis, Am. J. Hum. Genet. 69 (4), 685-694 (2001) ) , aber auch Nukleinsäuren die Proteine codieren, die beispielsweise aufgrund einer breiten Substratspezifität die Aktivi- tat einer Δ24-Reduktase aufweisen, wie beispielsweise Nukleinsäuren, codierend eine Δ24-Reduktase aus Saccharomyces cerevisiae (ERG4), (Nukleinsäure: Seq. ID. No. 17, Protein: Seq. ID. No. 18), (Lai, MH et al.,(1994): The identification of a gene family in the Saccharomyces cerevisiae ergosterol biosynthesis pathway. Gene.Marll; 140 (1) :41-9.) .

In den erfindungsgemäßen transgenen Organismen liegt also in dieser bevorzugten Ausführungsform gegenüber dem Wildtyp mindestens ein weiteres Δ24-Reduktase-Gen vor.

Die Anzahl der Δ24-Reduktase-Gene in den erfindungsgemäßen transgenen Organismen beträgt mindestens zwei, vorzugsweise mehr als zwei, besonders bevorzugt mehr als drei, ganz besonders bevorzugt mehr als fünf. Bevorzugte Δ24-Reduktase-Gene sind Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, die eine hohe Substratspezifität für Choles- sta-5, 7, 24-trienol aufweisen. Demnach sind insbesondere Δ24-Re- duktase-Gene und die entsprechenden Δ24-Reduktasen aus Säugetie- ren und deren funktioneilen Äquivalente bevorzugt.

Dementsprechend bevorzugt verwendet man im vorstehend beschriebenen Verfahren Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 14 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50%, bevorzugter mindestens 70%, noch bevorzugter mindestens 90%, am bevorzugtesten mindestens 95% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 14, und die die enzymatische Eigenschaft einer Δ24-Reduktase aufweisen.

Die Sequenz SEQ. ID. NO. 14 stellt die Aminosäuresequenz der Δ24-Reduktase aus Mus musculus dar.

Weitere Beispiele für Δ24-Reduktasen und Δ24-Reduktase-Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz bekannt ist durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäurese- quenzen aus Datenbanken mit der SeQ ID. NO. 14 leicht auffinden.

Die Δ24-Reduktase aus Homo sapiens (Seq. ID. No. 16) weist beispielsweise mit der Δ24-Reduktase aus Mus musculus (Seq. ID. No. 14) eine Identität von 96% auf.

Weitere Beispiele für Δ24-Reduktasen und Δ24-Reduktase-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ. ID. No . 13 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungs- und PCR-Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.

Unter einem Protein, das eine Identität von mindestens 30 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 14 aufweist, wird dementsprechend ein Protein verstanden, das bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 14, insbeson- dere nach obigen Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Identität von mindestens 30 % aufweist.

In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform werden zur Erhöhung der Δ24-Reduktase-Aktivität Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der Δ24-Reduktase aus Mus musculus (SEQ. ID. NO. 14) . Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.

Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der organismusspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.

10

Soll das Protein beispielsweise in Hefe exprimiert werden, so ist es häufig vorteilhaft, die codon usage der Hefe bei der Rückübersetzung zu verwenden.

15 In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ. ID. NO. 13 in den Organismus ein.

Die Sequenz SEQ. ID. NO. 13 stellt die genomische DNA aus Mus 20 musculus dar, die die Δ24-Reduktase der Sequenz SEQ ID NO. 14 codiert .

Alle vorstehend erwähnten Δ24-Reduktase-Gene sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotid-

25 bausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Dop- pelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamidit- methode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite

30 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithälfe des Klenow-Fragmentes der DNA- Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungs- verfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrie-

35 ben.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahren werden Organismen kultiviert, die gegenüber dem Wildtyp zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen genetischen Verände- 0 rungen eine reduzierte Aktivität mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe C24-Methyltransferase-Aktivität und Δ22-Desaturase-Aktivität aufweisen.

In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform werden Or- 5 ganismen kultiviert, die gegenüber dem Wildtyp zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen genetischen Veränderungen eine redu- zierte C24-Methyltransferase-Aktivität und eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität aufweisen.

Unter einer reduzierten Aktivität wird sowohl die reduzierte als auch das komplette Ausschalten der Aktivität verstanden. Eine Reduzierung einer Aktivität umfasst demnach auch eine mengenmäs- sige Verringerung des entsprechenden Proteins in dem Organismus bis hin zu einem vollständigen Fehlen des entsprechenden Proteins, beispielsweise zu testen durch eine fehlende Nachweisbar- keit der entsprechenden Enzymaktivität oder eine fehlende immunologische Nachweisbarkeit der entsprechenden Proteine.

Unter C24-Methyltransferase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer C24-Methyltransferase verstanden.

Unter einer C24-Methyltransferase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Zymosterol in Fecosterol (Ergosta-8,24 (28) dienol umzuwandeln.

Dementsprechend wird unter C24-Methyltransferase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein C24-Methyltransferase umgesetzte Menge Zymosterol bzw. gebildete Menge Fecosterol verstanden.

Bei einer reduzierten C24-Methyltransferase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein C24-Methyltransferase die umgesetzte Menge Zymosterol bzw. die gebildete Menge Fecosterol reduziert.

Vorzugsweise erfolgt diese Reduzierung der C24-Methyltransferase- Aktivität auf mindestens 90%, weiter bevorzugt auf mindestens 70%, weiter bevorzugt auf mindestens 50%, weiter bevorzugt auf mindestens 30%, bevorzugter auf mindestens 10%, noch bevorzugter auf mindestens 5%, insbesondere auf 0% der C24-Methyltransferase- Aktivität des Wildtyps. Besonders bevorzugt ist demnach ein Ausschalten der C24-Methyltransferase-Aktivität im Organismus.

Unter Δ22-Desaturase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer Δ22-Desaturase verstanden.

Unter einer Δ22-Desaturase wird ein Protein verstanden, das- die enzymatische Aktivität aufweist, Ergosta-5, 7-dienol in Ergo- sta-5 ,7,22, 24-tetraen-3ß-ol umzuwandeln. Dementsprechend wird unter Δ22-Desaturase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Δ22-Desaturase umgesetzte Menge Ergosta-5, 7-dienol bzw. gebildete Menge Ergosta-5, 7, 22,24-te- traen-3ß-ol verstanden. 5

Bei einer reduzierten Δ22-Desaturase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Δ22-Desaturase die umgesetzte Menge Ergo- sta-5, 7-dienol bzw. die gebildete Menge Ergosta-5, 7, 22,24-te- 10 traen-3ß-ol reduziert.

Vorzugsweise erfolgt diese Reduzierung der Δ22-Desaturase-Aktivi- tät auf mindestens 90%, weiter bevorzugt auf mindestens 70%, weiter bevorzugt auf mindestens 50%, weiter bevorzugt auf mindestens 15 30%, bevorzugter auf mindestens 10%, noch bevorzugter auf mindestens 5%, insbesondere auf 0% der Δ22-Desaturase-Aktivität des Wildtyps. Besonders bevorzugt ist demnach ein Ausschalten der D22-Desaturase-Aktivität im Organismus.

20 Die Reduzierung der C24-Methyltransferase-Aktivität und/oder

Δ22-Desaturase-Aktivität kann unabhängig voneinander durch unterschiedliche zellbiologische Mechanismen erfolgen, beispielsweise durch Inhibition der entsprechenden Aktivität auf Proteinebene, beispielsweise durch Zugabe von Inhibitoren der entsprechenden 5 Enzyme oder durch Reduzierung der Genexpression der entsprechenden Nukleinsäuren, codierend eine C24-Methyltransferase oder Δ22-Desaturase, gegenüber dem Wildtyp.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ver- 0 fahrens erfolgt die Reduzierung der C24-Methyltransferase- und/ oder Δ22-Desaturase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp durch eine Reduzierung der Genexpression der entsprechenden Nukleinsäuren, > codierend eine C24-Methyltransferase oder Δ22-Desaturase.

5 Die Reduzierung der Genexpression der Nukleinsäuren, codierend eine C24-Methyltransferase oder Δ22-Desaturase, gegenüber dem Wildtyp kann ebenfalls durch verschiedene Wege erfolgen, beispielsweise durch

0 a) Einbringen von Nukleinsäuresequenzen, welche zu einer anti- sense-Nukleinsäuresequenz transkribierbar sind, die zur Inhibition der C24-Methyltransferase-Aktivität und/oder Δ22-Desaturase- Aktivität befähigt ist, beispielsweise indem sie die Expression von endogener C24-Methyltransferase und/oder Δ22-Desaturase-Akti- 5 vität inhibiert, b) die zu Kosuppression führende Überexpression homologer C24-Me- thyltransferase- und/oder Δ22-Desaturase-Nukleinsäuresequenzen,

c) die Einführung von Nonsense-Mutationen in das Endogen mittels Einführung von RNA/DNA-Oligonukleotiden in den Organismus,

d) durch das Einbringen von spezifischen DNA-bindenden Faktoren, beispielsweise Faktoren vom Typus der Zinkfingertranskriptions- faktoren, die eine Reduzierung der Genexpression bewirken oder

e) die Generierung von Knockout-Mutanten, beispielsweise mit Hilfe von T-DNA-Mutagenese oder homologer Rekombination.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ver- fahrens erfolgt die Reduzierung der Genexpression der Nukleinsäuren, codierend eine C24-Methyltransferase oder Δ22-Desaturase durch Generierung von Knockout-Mut nten, besonders bevorzugt durch homologe Rekombination.

Demnach wird bevorzugt ein Organismus verwendet, der kein funk- tionelles C24-Methyltransferase- und/oder Δ22-Desaturase-Gen aufweist.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Generierung von Knockout-Mutanten, also die Deletion des Ziellocus C24-Methyl- transferase- und/oder Δ22-Desaturase-Gen bei gleichzeitiger Integration einer Expressionskasette, enthaltend mindestens eine der vorstehend oder nachstehend beschriebenen Nukleinsäuren, codierend ein Protein dessen Aktivität im Vergleich zum Wildtyp erhöht wird, durch homologe Rekombination.

Dazu können Nukleinsäurekonstrukte verwendet werden, die neben den nachstehend beschriebenen Expressionskasetten, enthaltend Promotor, kodierende Sequenz und gegebenenfalls Terminator und neben einem nachstehend beschriebenen Selektionsmarker am 3 ' - und 5 '-Ende Nukleinsäuresequenzen enthalten, die mit Nukleinsäurese- quenzen am Anfang und am Ende des zu deletierenden Gens identisch sind.

Vorzugsweise kann der Selektionsmarker nach der Selektion durch Rekombinase-Systeme wieder entfernt werden, beispielsweise durch loxP-Signale am 3'- und 5 '-Ende des Selektionsmarkers unter Verwendung einer Cre-Rekombinase (Cre-LoxP-System) .

Im bevorzugten Organismus Saccharomyces cerevisiae bedeutet das C24-Methyltransferase-Gen das Gen ERG6 (SEQ. ID. NO. 19) . SEQ. ID. NO. 20 stellt die entsprechende C24-Methyltransferase aus Saccharomyces cerevisiae dar (Hardwick, KG et al.,:SED6.is identical to ERG6 , and encodes a putative methyltransferasere quired for ergosterol synthesis.Yeast .Feb;10 (2) :265-9) .

Im bevorzugten Organismus Saccharomyces cerevisiae bedeutet das Δ22-Desaturase-Gen das Gen ERG5 (SEQ. ID. NO. 21) . SEQ. ID. NO. 22 stellt die entsprechende Δ22-Desaturase aus Saccharomyces cerevisiae dar (Skaggs, BA et al, : Cloning and characterization of the Saccharomyces cerevisiae C-22 sterol desaturase gene,enco- ding a second cytochrome P-450 involved in ergosterol biosynthesis, Gene.1996 Feb22, ^• 169 (1) : 105-9. ) .

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Organismen kultiviert, die zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Veränderungen gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte Aktivität mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, Lanosterol-Cl4-De- methylase-Aktivität, Squalenepoxidase-Aktivität, Squalensynthe- tase-Aktivität und Sterol-Acyltransferase-Aktivität aufweisen.

Unter HMG-CoA-Reduktase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer HMG-CoA-Reduktase (3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-Coenzym-A-Reduk- tase) verstanden.

Unter einer HMG-CoA-Reduktase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl- Coenzym-A in Mevalonat umzuwandeln.

Dementsprechend wird unter HMG-CoA-Reduktase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein HMG-CoA-Reduktase umgesetzte Menge 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-Coenzym-A bzw. gebildete Menge Mevalonat verstanden.

Bei einer erhöhten HMG-CoA-Reduktase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein HMG-CoA-Reduktase die umgesetzte Menge 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-Coenzym-A bzw. die gebildete Menge Mevalonat erhöht.

Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität mindestens 5%, weiter bevorzugt mindestens 20%, weiter bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 100%, bevorzugter mindestens 300%, noch bevorzugter mindestens 500%, insbesondere mindestens 600% der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität des Wild- typs . Unter Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer Lanosterol-C14-Demethylase verstanden.

Unter einer Lanosterol-C14-Demethylase wird ein Protein verstan- den, das die enzymatische Aktivität aufweist, Lanosterol in 4, 4-Dimethylcholesta-8, 14, 24-trienol umzuwandeln.

Dementsprechend wird unter Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Lanosterol-C14-De- ethylase umgesetzte Menge Lanosterol bzw. gebildete Menge 4, 4-Dimethylcholesta-8, 14, 24-trienol verstanden.

Bei einer erhöhten Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimm- ten Zeit durch das Protein Lanosterol-C14-Demethylase die umgesetzte Menge Lanosterol bzw. die gebildete Menge 4, 4-Dimethylcho- lesta-S, 14,24-trienol erhöht.

Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der Lanosterol-C14-Demethy- lase-Aktivität mindestens 5%, weiter bevorzugt mindestens 20%, weiter bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens

100%, bevorzugter mindestens 300%, noch bevorzugter mindestens

500%, insbesondere mindestens 600% der Lanosterol-C14-Demethy- lase-Aktivität des Wildtyps.

Unter Squalenepoxidase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer

Squalenepoxidase verstanden.

Unter einer Squalenepoxidase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Squalen in Squalenepoxid umzuwandeln.

Dementsprechend wird unter Squalenepoxidase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Squalenepoxidase umgesetzte Menge Squalen bzw. gebildete Menge Squalenepoxid verstanden.

Bei einer erhöhten Squalenepoxidase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Squalenepoxidase die umgesetzte Menge Squalen bzw. die gebildete Menge Squalenepoxid erhöht.

Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der Squalenepoxidase-Aktivität mindestens 5%, weiter bevorzugt mindestens 20%, weiter bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 100%, bevorzug- ter mindestens 300%, noch bevorzugter mindestens 500%, insbesondere mindestens 600% der Squalenepoxidase-Aktivität des Wildtyps. Unter Squalensynthetase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer Squalensynthetase verstanden.

Unter einer Squalensynthetase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Farnesylpyrophosphat in Squalen umzuwandeln.

Dementsprechend wird unter Squalensynthetase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Squalensynthetase umge- setzte Menge Farnesylpyrophosphat bzw. gebildete Menge Squalen verstanden.

Bei einer erhöhten Squalensynthetase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Squalensynthetase die umgesetzte Menge Farnesylpyrophosphat bzw. die gebildete Menge Squalen erhöht.

Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der Squalensynthetase-Aktivität mindestens 5%, weiter bevorzugt mindestens 20%, weiter bevor- zugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 100%, bevorzugter mindestens 300%, noch bevorzugter mindestens 500%, insbesondere mindestens 600% der Squalensynthetase-Aktivität des Wildtyps.

Unter Sterol-Acyltransferase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer Sterol-Acyltransferase verstanden.

Unter einer Sterol-Acyltransferase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, 7-Dehydrocholesterol in in entsprechendes acetyliertes 7-Dehydrocholesterol umzuwandeln.

Dementsprechend wird unter Sterol-Acyltransferase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Sterol-Acyltransferase umgesetzte Menge 7-Dehydrocholesterol bzw. gebildete Menge acety- liertes 7-Dehydrocholesterol verstanden.

Bei einer erhöhten Sterol-Acyltransferase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Sterol-Acyltransferase die umgesetzte Menge 7-Dehydrocholesterol bzw. die gebildete Menge acetyliertes 7-Dehydrocholesterol erhöht.

Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der Sterol-Acyltransferase- Aktivität mindestens 5%, weiter bevorzugt mindestens 20%, weiter bevorzugt mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 100%, bevorzugter mindestens 300%, noch bevorzugter mindestens 500%, ins- besondere mindestens 600% der Sterol-Acyltransferase-Aktivität des Wildtyps .

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der HMG-CoA-Reduktase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp durch eine Er- ^• höhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine HMG- CoA-Reduktase.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsge- mäßen Verfahrens erfolgt die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase indem man ein Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend eine Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase in den Organismus einbringt, deren Expression in dem Organismus, verglichen mit dem Wildtyp, einer redu- zierten Regulation unterliegt.

Unter einer reduzierten Regulation verglichen mit dem Wildtyp, wird eine im Vergleich zum vorstehend definierten Wildtyp verringerte, vorzugsweise keine Regulation auf Expressions- oder Pro- teinebene verstanden.

Die reduzierte Regulation kann vorzugsweise durch einen im Nukleinsäurekonstrukt mit der kodierenden Sequenz funktioneil verknüpften Promotor erreicht werden, der in dem Organismus, verglichen mit dem Wildtyp-Promoter einer reduzierten Regulation unterliegt .

Beispielsweise unterliegt der mittlere ADH-Promotor in Hefe nur eine reduzierten Regulation und ist daher insbesondere als Promo- tor im vorstehend beschriebenen Nukleinsäurekonstrukt bevorzugt.

Dieses Promotorfragment des ADH12s Promotors, im folgenden auch ADHl bezeichnet, zeigt eine annähernd konstitutive Expression (Ruohonen L, Penttila M, Keranen S. (1991) Optimization of Bacil- lus alpha-amylase production by Saccharomyces cerevisiae. Yeast. May-Jun;7 (4) : 337-462; Lang C, Looman AC. (1995) Efficient expression and secretion of Aspergillus niger RH5344 polygalacturo- nase in Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol . Dec; 44 (1-2) .-147-56. ) , so daß die transkriptioneile Regulation nicht mehr über Intermediate der Ergosterolbiosynthese abläuft.

Weitere bevorzugte Promotoren mit reduzierter Regulation sind konstitutive Promotoren wie beispielsweise der TEFl-Promotor aus Hefe, der GPD-Promotor aus Hefe oder der PGK- romotor aus Hefe (Mumberg D, Muller R, Funk M. (1995) Yeast vectors for the con- trolled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 1995 Apr 14;156 (1) :119-22; Chen CY, Opper ann H, Hitzeman RA. (1984) Homologous versus heterologous gene expression in the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. Dec 11; 12 (23) : 8951-70. ) .

Die reduzierte Regulation kann in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dadurch erreicht werden, daß man als Nukleinsäure codierend eine HMG-CoA-Reduktase eine Nukleinsäure verwendet, deren Expression in dem Organismus, verglichen mit der Organismus eigenen, orthologen Nukleinsäure, einer reduzierten Regulation unterliegt.

Besonders bevorzugt ist die Verwendung einer Nukleinsäure, die nur den katalytischen Bereich der HMG-CoA-Reduktase kodiert (trunkierte (t-)HMG-CoA-Reduktase) als Nukleinsäure, codierend eine HMG-CoA-Reduktase. Diese in EP 486 290 und WO 99/16886 beschriebene Nukleinsäure (t-HMG) kodiert nur den katalytisch aktiven Teil der HMG-CoA-Reduktase, die für die Regulation auf Proteinebene verantwortliche Membran-Domäne fehlt. Diese Nukleinsäure unterliegt somit, insbesondere in Hefe, einer reduzierten Regulation und führt zu einer Erhöhung der Genexpression der HMG- CoA-Reduktase.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man Nukleinsäuren, vorzugsweise via vorstehend beschriebenes Nuklein- säurekonstrukt, ein, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 24 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 24, und die die enzymatische Eigenschaft einer HMG-CoA-Reduktase aufweisen.

Die Sequenz SEQ. ID. NO. 24 stellt die Aminosäuresequenz der- trunkierten HMG-CoA-Reduktase (t-HMG) dar.

Weitere Beispiele für HMG-CoA-Reduktasen und damit auch für die auf den katalytischen Bereich reduzierten t-HMG-CoA-Reduktasen bzw. die kodierenden Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz bekannt ist durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechen- den rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SeQ ID. NO. 24 leicht auffinden.

Weitere Beispiele für HMG-CoA-Reduktasen und damit auch für die auf den katalytischen Bereich reduzierten t-HMG-CoA-Reduktasen bzw. die kodierenden Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ. ID. No. 23 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridi- sierungs- und PCR-Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.

Besonders bevorzugt verwendet man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ. ID. NO. 23 als Nukleinsäure, kodierend eine trunkierte HMG-CoA-Reduktase .

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die reduzierte Regulation dadurch erreicht, daß man als Nukleinsäure co- dierend eine HMG-CoA-Reduktase eine Nukleinsäure verwendet, deren Expression in dem Organismus, verglichen mit der Organismus eigenen, orthologen Nukleinsäure, einer reduzierten Regulation unterliegt und einen Promotor verwendet, der in dem Organismus, verglichen mit dem Wildtyp-Promoter einer reduzierten Regulation unterliegt.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp durch eine Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine Lanosterol-C14-Demethylase .

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine Lanosterol- C14-Demethylase durch Einbringen von einer oder mehrer Nuklein- säuren codierend eine Lanosterol-C14-Demethylase in den Organismus .

Dazu kann prinzipiell jedes Lanosterol-Cl4-Demethylase-Gen (ERG11) , also jede Nukleinsäuren die eine Lanosterol-C14-Demethy- läse codiert, verwendet werden. Bei genomischen Lanosterol-

C14-Demethylase-Nukleinsäure-Sequenzen aus eukaryontischen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall daß der Wirtsorganismus nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechenden Lanosterol-C14-Demethylase zu expri- mieren, bevorzugt bereits prozessierte Nukleinsäuresequenzen, wie die entsprechenden cDNAs zu verwenden.

Beispiele für Lanosterol-C14-Demethylase-Gene sind Nukleinsäuren, codierend eine Lanosterol-C14-Demethylase aus Saccharomyces cerevisiae (Kalb VF, Loper JC, Dey CR, Woods CW, Sutter TR (1986) Isolation of a cytochrome P-450 structural gene from Saccharomyces cerevisiae. Gene 45 (3) : 237-45) , Candida albicans (Lamb DC , Kelly DE, Baldwin BC, Gozzo F, Boscott P, Richards WG, Kelly SL (1997) Differential Inhibition of Candida albicans CYP51 with azole antifungal stereoiso ers . FEMS Microbiol Lett

149 (1) -.25-30) , Homo sapiens (Stromstedt M, Rozman D, Waterman MR. (1996) The ubiquitously expressed human CYP51 encodes lanosterol 14 alpha-demethylase, a cytochrome P450 whose expression is regu- lated by oxysterols. Arch Biochem Biophys 1996 May 1;329 (1) : 73-81c) oder Rattus norvegicus, Aoyama Y, Funae Y, Noshiro M, Horiuchi T, Yoshida Y. (1994) Occurrence of a P450 showing high homology to yeast lanosterol 14-demethylase

(P450(14DM)) in the rat liver. Biochem Biophys Res Commun. Jun 30;201(3) : 1320-6)

In den erfindungsgemäßen transgenen Organismen liegt also in die- ser bevorzugten Ausführungsform gegenüber dem Wildtyp mindestens ein weiteres Lanosterol-C14-Demethylase-Gen vor.

Die Anzahl der Lanosterol-C14-Demethylase-Gene in den erfindungs- gemäßen transgenen Organismen beträgt mindestens zwei, vorzugs- weise mehr als zwei, besonders bevorzugt mehr als drei, ganz besonders bevorzugt mehr als fünf.

Bevorzugt verwendet man im vorstehend beschriebenen Verfahren Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäure- sequenz SEQ. ID. NO. 26 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50%, bevorzugter mindestens 70%, noch bevorzugter mindestens 90%, am bevorzugtesten mindestens 95% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 26, und die die enzymatische Eigenschaft einer Lanosterol-Cl4-Demethylase aufweisen.

Die Sequenz SEQ. ID. NO. 26 stellt die Aminosäuresequenz der Lanosterol-C14-Demethylase aus Saccharomyces cerevisiae dar.

Weitere Beispiele für Lanosterol-Cl4-Demethylasen und Lanosterol- Cl4-Demethylase-Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz bekannt ist durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rück- übersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SeQ ID. NO. 26 leicht auffinden.

Weitere Beispiele für Lanosterol-Cl4-Demethylasen und Lanosterol- Cl4-Demethylase-gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausge- hend von der Sequenz SEQ. ID. No. 25 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisie- rungs- und PCR-Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.

Unter einem Protein, das eine Identität von mindestens 30 % auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 26 aufweist, wird dementsprechend ein Protein verstanden, das bei einem Ver- gleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 26, insbesondere nach obigen Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Identität von mindestens 30 % aufweist.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform werden Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der Lanosterol-C14-Demethylase aus Saccharomyces cerevisiae (SEQ. ID. NO. 26) .

Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.

Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der organismusspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer., bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.

Soll das Protein beispielsweise in Hefe exprimiert werden, so ist es häufig vorteilhaft, die codon usage der Hefe bei der Rückübersetzung zu verwenden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ. ID. NO. 25 in den Organismus ein.

Die Sequenz SEQ. ID. NO. 25 stellt die genomische DNA aus Saccharomyces cerevisiae (ORF S0001049) dar, die die Lanosterol- C14-Demethylase der Sequenz SEQ ID NO. 26 codiert.

Alle vorstehend erwähnten Lanosterol-Cl4-Demethylase-Gene sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkonden- sation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebau- steine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow- Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Squalenepoxidase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp durch eine Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine Squalenepoxidase.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine Squalenepoxidase durch Einbringen von einer oder mehrer Nukleinsäuren codierend eine Squalenepoxidase in den Organismus .

Dazu kann prinzipiell edes Squalenepoxidase-Gen (ERGl) , also jede Nukleinsäuren die eine Squalenepoxidase codiert, verwendet werden. Bei genomischen Squalenepoxidase-Nukleinsäure-Sequenzen aus eukaryontisehen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall daß der Wirtsorganismus nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechenden Squalenepoxidase zu exprimieren, bevorzugt bereits prozessierte Nukleinsäuresequenzen, wie die entsprechenden cDNAs zu verwenden.

Beispiele für Nukleinsäuren kodierend eine Squalenepoxidase sind Nukleinsäuren, codierend eine Squalenepoxidase aus Saccharomyces cerevisiae (Jandrositz, A. , et al (1991) The gene encoding squalene epoxidase from Saccharomyces cerevisiae: cloning and characterization. Gene 107:155-160, aus Mus musculus (Kosuga K, Hata S, Osumi T, Sakakibara J, Ono T. (1995) Nucleotide sequence of a cDNA for ouse squalene epoxidase, Biochim Biophys Acta, Feb 21; 1260 (3) :345-8b) , aus Rattus norvegicus (Sakakibara J, Watanabe R, Kanai Y, Ono T. (1995) Molecular cloning and expression of rat squalene epoxidase. J Biol Chem Jan 6;270 (1) :17-20c) oder aus Homo sapiens (Nakamura Y, Sakakibara J, Izumi T, Shibata A, Ono T. (1996) Transcriptional regulation of squalene epoxidase by sterols and inhibitors in HeLa cells., J. Biol. Chem. 1996, Apr 5;271(14) :8053-6) .

In den erfindungsgemäßen transgenen Organismen liegt also in dieser bevorzugten Ausführungsform gegenüber dem Wildtyp mindestens ein weiteres Squalenepoxidase vor.

Die Anzahl der Squalenepoxidase-Gene in den erfindungsgemäßen transgenen Organismen beträgt mindestens zwei, vorzugsweise mehr als zwei, besonders bevorzugt mehr als drei, ganz besonders bevorzugt mehr als fünf.

Bevorzugt verwendet man im vorstehend beschriebenen Verfahren Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 28 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50%, bevorzugter mindestens 70%, noch bevorzugter mindestens 90%, am bevorzugtesten mindestens 95% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 28, und die die enzymatische Eigen- schaft einer Squalenepoxidase aufweisen.

Die Sequenz SEQ. ID. NO. 28 stellt die Aminosäuresequenz der Squalenepoxidase aus Saccharomyces cerevisiae dar.

Weitere Beispiele für Squalenepoxidasen und Squalenepoxidase-Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz bekannt ist durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SeQ ID. NO. 28 leicht auf- finden.

Weitere Beispiele für Squalenepoxidase und Squalenepoxidase-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ. ID. No. 27 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungs- und PCR-Techni- ken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform werden Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der Squalenepoxidase aus Saccharomyces cerevisiae) (SEQ. ID. NO. 28) .

Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code er- hältlich.

Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der organismusspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.

Soll das Protein beispielsweise in Hefe exprimiert werden, so ist es häufig vorteilhaft, die codon usage der Hefe bei der Rücküber- setzung zu verwenden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ. ID. NO. 27 in den Organismus ein. Die Sequenz SEQ. ID. NO. 27 stellt die genomische DNA aus Saccharomyces cerevisiae (ORF YGR175C) dar, die die Squalenepoxidase der Sequenz SEQ. ID. NO. 28 codiert.

Alle vorstehend erwähnten Squalenepoxidase-Gene sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleo- tidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligo- nukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2 . Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow- Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Squalensynthetase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp durch eine Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine Squalensynthetase .

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine Squalensynthetase durch Einbringen von einer oder mehrer Nukleinsäuren codierend eine Squalensynthetase in den Organismus.

Dazu kann prinzipiell jedes Squalensynthetase-Gen (ERG9) , also jede Nukleinsäuren die eine Squalensynthetase codiert, verwendet werden. Bei genomischen Squalensynthetase-Nukleinsäure-Sequenzen aus eukaryontisehen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall daß der Wirtsorganismus nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechenden Squalensynthe- tase zu exprimieren, bevorzugt bereits prozessierte Nukleinsäuresequenzen, wie die entsprechenden cDNAs zu verwenden.

Beispiele für Nukleinsäuren kodierend eine Squalensynthetase sind Nukleinsäuren, codierend eine Squalensynthetase aus Saccharomyces cerevisiae (ERG9) , (Jennings, SM , (1991): Molecular cloning and characterization of the yeast gene for squalene synthetase. Proc Natl Acad Sei USA. Juli5 ; 88 (14) .-6038-42) , Nukleinsäuren, codierend eine Squalensynthetase aus Botryocoecus brauniiOkada (Deva- renne, TP et al.: Molecular characterization of squalene syn- thase from the green microalga Botryocoecus braunii, raceB, Arch. Biochem. Biophys. 2000, Janl5, 373 (2) :307-17) , Nukleinsäuren, codierend eine Squalensynthetase aus Potato tuber (Yoshioka H. et al.: cDNA cloning of sesquiter penecyclase and squalene synthase, and expression of the genes in potato tuber infected with Phy- tophthora infestans, Plant. Cell. Physiol.1999, Sep;40 (9) :993-8) oder Nukleinsäuren, codierend eine Squalensynthetase aus Glycyrr- hiza glabra (Hayashi, H. et al.: Molecular cloning and characterization of two cDNAs for Glycyrrhiza glabra squalene synthase, Biol. Phar . Bull. 1999, Sep,-22 (9) :947-50.

In den erfindungsgemäßen transgenen Organismen liegt also in die- ser bevorzugten Ausführungsform gegenüber dem Wildtyp mindestens ein weiteres Squalensynthetase-Gen vor.

Die Anzahl der Squalensynthetase-Gene in den erfindungsgemäßen transgenen Organismen beträgt mindestens zwei, vorzugsweise mehr als zwei, besonders bevorzugt mehr als drei, ganz besonders bevorzugt mehr als fünf.

Bevorzugt verwendet man im vorstehend beschriebenen Verfahren Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäure- sequenz SEQ. ID. NO. 30 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50%, bevorzugter mindestens 70%, noch bevorzugter mindestens 90%, am bevorzugtesten mindestens 95% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 30, und die die enzymatische Eigenschaft einer Squalensynthetase aufweisen.

Die Sequenz SEQ. ID. NO. 30 stellt die Aminosäuresequenz der Squalensynthetase (ERG9) aus Saccharomyces cerevisiae dar.

Weitere Beispiele für Squalensynthetasen und Squalensynthetase- Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz bekannt ist durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SeQ ID. NO. 30 leicht auffinden.

Weitere Beispiele für Squalensynthetase und Squalensynthetase- Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Se- quenz SEQ. ID. No. 29 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungs- und PCR- Techniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform werden Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der Squalensynthetase aus Saccharomyces cerevisiae) (SEQ. ID. NO. 30) .

Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.

Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der organismusspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.

Soll das Protein beispielsweise in Hefe exprimiert werden, so ist es häufig vorteilhaft, die codon usage der Hefe bei der Rückübersetzung zu verwenden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ. ID. NO. 29 in den Organismus ein.

Die Sequenz SEQ. ID. NO. 29 stellt die genomische DNA aus Sac- charomyces cerevisiae (ORF YHR190W) dar, die die Squalensynthetase der Sequenz SEQ. ID. NO. 30 codiert.

Alle vorstehend erwähnten Squalensynthetase-Gene sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow- Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Sterol-Acyltransferase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp durch eine Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine Ste- rol-Acyltransferase. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend eine Sterol-Acyltransferase durch Einbringen von einer oder mehrer Nukleinsäuren codierend eine Sterol-Acyltransferase in den Organismus.

Dazu kann prinzipiell jedes Sterol-Acyltransferase-Gen (SAT1 oder SAT2), also jede Nukleinsäuren die eine Sterol-Acyltransferase codiert, verwendet werden. Bei genomischen Sterol-Acyltransfe- rase-Nukleinsäure-Sequenzen aus eukaryontischen Quellen, die In- trons enthalten, sind für den Fall daß der Wirtsorganismus nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechenden Sterol-Acyltransferase zu exprimieren, bevorzugt bereits prozessierte Nukleinsäuresequenzen, wie die entsprechenden cDNAs zu verwenden.

Beispiele für Nukleinsäuren kodierend eine Sterol-Acyltransferase sind Nukleinsäuren, codierend eine Sterol-Acyltransferase aus Saccharomyces cerevisiae (SATl) oder (SAT2) , (Yang, H. : Sterol esterification in yeast: a two-gene process. Science. 1996 May 31;272 (5266) :1353-6. ) , eine weitere Nukleinsäure, codierend eine weitere Sterol-Acyltransferase aus Saccharomyces cerevisiae (J. Biol. Chem. 1996, Sep 27;271 (39) :24157-63) , Nukleinsäuren kodierend eine humane Sterol-Acyltransferase (Chang, CC et al.,Molecular cloning and functional expression of human acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase cDNA in mutant Chinese hamster ovary cells, J. Biol. Chem. 1993, Oct 5;268 (28) :20747-55) und Nukleinsäuren kodierend eine murine Sterol-Acyltransferase (Uel- men, PJ : Tissue-specific expression and cholesterol regulation of acylcoenzyme A:cholesterol acyltransferase (ACAT) in mice. Mo- lecular cloning of mouse ACAT cDNA, chromosomal localization, and regulation of ACAT in vivo and in vitro, J. Biol. Chem. 1995 Nov 3;270(44) :26192-201) .

In den erfindungsgemäßen transgenen Organismen liegt also in die- ser bevorzugten Ausführungsform gegenüber dem Wildtyp mindestens ein weiteres Sterol-Acyltransferase vor.

Die Anzahl der Sterol-Acyltransferase-Gene in den erfindungsgemäßen transgenen Organismen beträgt mindestens zwei, vorzugsweise mehr als zwei, besonders bevorzugt mehr als drei, ganz besonders bevorzugt mehr als fünf.

Bevorzugt verwendet man im vorstehend beschriebenen Verfahren Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäurese- quenz SEQ. ID. NO. 32 oder SEQ. ID. NO. 50 oder eine von diesen Sequenzen durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30%, vorzugsweise mindestens 50%, bevorzugter mindestens 70%, noch bevorzugter mindestens 90%, am bevorzugtesten mindestens 95% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 32 oder SEQ. ID. NO. 50, und die die enzymatische Eigenschaft einer Sterol-Acyl- transferase aufweisen.

Die Sequenz SEQ. ID. NO. 32 stellt die Aminosäuresequenz der Sterol-Acyltransferase SATl aus Saccharomyces cerevisiae dar.

Die Sequenz SEQ. ID. NO. 50 stellt die Aminosäuresequenz der Sterol-Acyltransferase SAT2 aus Saccharomyces cerevisiae dar.

SATl und SAT2 unterscheiden sich durch eine unterschiedliche Substratspezifität .

Weitere Beispiele für Sterol-Acyltransferasen und Sterol-Acyl- transferase-Gene lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz bekannt ist durch Homologievergleiche der Aminosäuresequenzen oder der entsprechenden rücküber- setzten Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der SeQ ID. NO. 32 oder 50 leicht auffinden.

Weitere Beispiele für Sterol-Acyltransferase und Sterol-Acyl- transferase-Gene lassen sich weiterhin beispielsweise ausgehend von der Sequenz SEQ. ID. No. 31 oder 49 aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungs- und PCR-Techniken in an sich bekannter. Weise leicht auffinden.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform werden Nukleinsäuren in Organismen eingebracht, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der Sterol-Acyltransferase SATl aus Saccharomyces cerevisiae) (SEQ. ID. NO. 32) oder SAT2 aus Saccharomyces cerevisiae) (SEQ. ID. NO. 50). .

Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.

Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der organismusspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln. Soll das Protein beispielsweise in Hefe exprimiert werden, so ist es häufig vorteilhaft, die codon usage der Hefe bei der Rückübersetzung zu verwenden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bringt man eine Nukleinsäure, enthaltend die Sequenz SEQ. ID. NO. 31 oder 49 in den Organismus ein.

Die Sequenz SEQ. ID. NO. 31 stellt die genomische DNA aus Sac- charomyces cerevisiae (ORF YNR019W) dar, die die Sterol-Acyltransferase SATl der Sequenz SEQ ID NO. 32 codiert.

Die Sequenz SEQ. ID. NO. 49 stellt die genomische DNA aus Saccharomyces cerevisiae (ORF YCR048W) dar, die die Sterol-Acyl- transferase SAT2 der Sequenz SEQ ID NO. 50 codiert.

Alle vorstehend erwähnten Sterol-Acyltransferase-Gene sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkonden- sation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebau- steine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithälfe des Klenow- Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.

Unter Organismen werden erfindungsgemäß beispielsweise Bakterien, insbesondere Bakterien der Gattung Bacillus, Escherichia coli, Lactobacillus spec. oder Streptomyces spec ,

beispielsweise Hefen, insbesondere Hefen der Gattung Saccharomyces cerecisiae, Pichia pastoris oder Klyveromyces spec.

beispielsweise Pilze, insbesondere Pilze der Gattung Aspergillus spec , Penicillium spec. oder Dictyostelium spec.

sowie beispielsweise auch Insektenzellinien verstanden, die in der Lage sind, als Wildtyp oder durch vorherige genetische Veränderung Zymosterol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/ oder Folgeprodukten herzustellen. Besonders bevorzugte Organismen sind Hefen, insbesondere der Spezies Saccharomyces cerevisiae, insbesondere die Hefestämme Saccharomyces cerevisiae AH22, Saccharomyces cerevisiae GRF, Saccharomyces cerevisiae DBY747 und Saccharomyces cerevisiae BY4741.

Bei Hefen als Organismen oder genetisch veränderten Organismen können zur Erhöhung mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, Δ5-Desaturase-Aktivität und Δ24-Reduktase-Aktivität, wie vortsehend erwähnt, die entspre- chenden Nukleinsäuren übexprimiert werden.

Die Überexpression kann sowohl homolog durch Einbringen von hefeeigenen Nukleinsäuren als auch heterolog durch Einbringen von Nukleinsäuren aus anderen Organismen, insbesondere Säugern, oder davon abgeleitete natürliche oder künstliche Varianten in die Hefe erfolgen. Vorzugsweise werden in Hefen Säugergene verwendet, da diese eine bessere Substratspezifität in Richtung 7-Dehydro- cholesterol aufweisen.

Die Bestimmung der Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, Δ5-Desaturase-Akti- vität, Δ24-Reduktase-Aktivität, C24-Methyltransferase-Aktivität, Δ22-Desaturase-Aktivität, HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, Lanoste- rol-C14-Demethylase-Aktivität, Squalenepoxidase-Aktivität, Squalensynthetase-Aktivität und Sterol-Acyltransferase-Aktivität des erfindungsgemäßen genetisch veränderten Organismus sowie des Referenzorganismus erfolgt unter folgenden Bedingungen:

Die Bestimmung der Aktivität der HMG-CoA-Reduktase erfolgt wie in Th. Polakowski, Molekularbiologische Beeinflussung des Ergoste- rolstoffwechsels der Hefe Saccharomyces cerevisiae, Shaker-Ver- lag, Aachen 1999, ISBN 3-8265-6211-9, beschrieben.

Demgemäß werden 10 ⁹ Hefe-Zellen einer 48 h alten Kultur durch Zen- trifugation (3500xg, 5 min) geerntet und in 2 ml Puffer I (100 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH7,0) gewaschen. Das Zellpellet wird in 500 μl Puffer 1 (cytosolische Proteine) oder 2 (100 mM Kaliumphosphat-Puffer pH7,0; 1% Triton X-100) (Gesamtproteine) aufgenommen, und es wird 1 μl 500 mM PMSF in Isopropanol zugegegeben. Zu den Zellen kommen 500 μl Glasperlen (d= 0,5 mm), und die Zel- len werden durch 5x eine Minute Vortexen aufgeschlossen. Die

Flüssigkeit zwischen den Glasperlen wird in ein neues Eppi überführt. Zellreste bzw. Membranbestandteile werden durch 15 min Zentrifugieren (14000xg) abgetrennt. Der Überstand wird in ein neues Eppi überführt und stellt die Proteinfraktion dar. Die Aktivität der HMG-CoA Aktivität wird durch Messung des Verbrauchs von NADPH+H ⁺ bei der Reduktion von 3-Hydroxy-3-methylglu- taryl-CoA, das als Substrat zugesetzt wird, bestimmt.

5 In einem Testansatz von 1000 μl werden 20 μl Hefeproteinisolat mit 910 μl Puffer I; 50 μl 0,1 M DTT und 10 μl 16 mM NADPH+H+ gegeben. Der Ansatz ist auf 30°C temperiert und wird für 7,5 min bei 340 nm im Photometer gemessen. Die Abnahme an NADPH, die in diesem Zeitraum gemessen wird, ist die Abbaurate ohne Substratzugabe und 10 wird als Hintergrund berücksichtigt.

Danach erfolgt die Zugabe von Substrat (10 μl 30 mM HMG-CoA) , und es werden weitere 7,5 min gemessen. Die Berechnung der HMG-CoA- Reduktase Aktivität erfolgt durch die Bestimmung der spezifischen 15 NADPH-Abbaurate .

Die Bestimmung der Aktivität der Lanosterol-C14-Demethylase-Akti- vität erfolgt wie in Omura, T and Sato, R. (1964) The carbon mo- noxide binding pigment in liver microsomes. J.Biol.Chem. 239,

20 2370-2378, beschrieben. Bei diesem Test ist die Menge an P450-En- zym als Holoenzym mit gebundenem Häm semi-quantifizierbar. Das (aktive) Holoenzym (mit Häm) kann durch CO reduziert werden und nur das CO-reduzierte Enzym weist ein Absorbtionsmaximum bei 450 nm auf. So ist das Absorbtionsmaximum bei 450 nm ein Maß für

25 die Aktivität der Lanosterol-C14-Demethylase .

Zur Durchführung der Aktivitätsbestimmung wird eine Microsomen- Fraktion (4-10 mg/ml Protein in 100 mM Kaliumphosphat Puffer) 1:4 verdünnt, so dass die für den Test eingesetzte Protein Konzentra- 30 tion 2 mg/ml beträgt. Der Test wird direkt in einer Küvette durchgeführt .

Zu den Microsomen wird eine Spatelspitze Dithionite (S0 ₄ Na ) zugeben. Mit einem Spektralphotometer wird die Baselinie aufgeno - 5 men im Bereich von 380-500 nm.

Anschliessend werden ca. 20-30 Blasen von CO durch die Probe gesprudelt. Die Absorbtion wird nun im selben Bereich gemessen. Die Höhe der Absorbtion bei 450 nm entspricht dem Abteil an P450 0 Enzym im Testansatz .

Die Bestimmung der Aktivität der Squalen Epoxidase erfolgt wie in Leber R, Landl K, Zinser E, Ahorn H, Spok A, Kohlwein SD, Tur- nowsky F, Daum G. (1998) Dual localization of squalene epoxidase, 5 Erglp, in yeast reflects a relationship between the endoplasmic reticulum and lipid particles, Mol. Biol. Cell. 1998, Feb;9(2) :375-86, beschrieben.

Diese Methode enthält 0,35 bis 0,7 mg microsomales Protein oder 3,5 bis 75 μg Lipidpartikel Protein in lOOmM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 mM FAD, 3 mM NADPH, 0,1 mM squalene 2, 3-epoxidase cyclase inhibitor U18666A, 32 μM [ ³ H]Squalen dispergiert in 0,005% Tween 80 in einem Gesamtvolumen von 500 μl.

Der Test wird bei 30°C durchgeführt. Nach einer Vorbehandlung für 10 min, wird die Reaktion durch Zugabe von Squalen gestartet und nach 15, 30 oder 45 min durch Lipid Extraktion mit 3 ml Chloroform/Methanol (2:1 vol/vol) und 750 μl 0,035 % MgCl ₂ beendet.

Die Lipide werden unter Stickstoff getrocknet und in 0,5 ml Chloroform/Methanol (2:1 vol/vol) rückgelöst. Für eine Dünnschicht Chromatographie werden Teile auf, eine Silica Gel 60 Platte (0,2 mm) gegeben und mit Chloroform als Laufmittel aufgetrennt. Die Positionen, die [ ³ H]2, 3-oxidosqualen und [ ³ H] Squalene enthalten wurden ausgekratzt und mit einem Szintilationzähler quantifiziert.

Die Bestimmung der Aktivität der Δ8-Δ7-Isomerase erfolgt in leichter Abwandlung wie in Silve S . et al . : Emopamil-binding Pro- tein, a Mammalian Protein That Binds a Series of Structurally

Diverse Neuroprotective Agents, Exhibits 8-7 Sterol Isomerase Activity in Yeast. J Biol Chem 1996 Sep 13 ;271 (37) :22434-40 beschrieben:

Aus 10 ml Kulturvolumen aufgearbeitete Microsomen werden für 3 h in der Anwesenheit von 75 μM Cholesta-8-en-3-ol bei 30 °C inkubiert. Die Sterole werden anschliessend mit 4 mal 5 ml Hexan extrahiert und aufgereinigt. Aliquots werden mittels GC/MS analysiert

Die Bestimmung der Aktivität der Δ5-Desaturase erfolgt in leichter Abwandlung wie in Nishi,S. et al. (2000) :cDNA cloning of the mammalian sterol C5-desaturase and the expression in yeast u- tant. Biochi .Biophys.Actal490 (1-2) ,106-108, beschrieben:

Aus 10 ml Kulturvolumen aufgearbeitete Microsomen werden für 3 h in der Anwesenheit von 75 μM Lathosterol und 2 mM NADH bei 30 °C inkubiert. Die Sterole werden anschliessend mit 4 mal 5 ml Hexan extrahiert und aufgereinigt . Aliquots werden mittels GC/MS analy- siert Die Bestimmung der Aktivität der Δ24-Reduktase kann wie im folgenden beschrieben durchgeführt werden:

Aus 10 ml Kulturvolumen aufgearbeitete Microsomen werden für 3 h in der Anwesenheit von 75 μM Cholesta-5, 7,24-trienol bei 30 °C inkubiert. Sterole werden anschliessend mit 4 mal 5 ml Hexan extrahiert und aufgereinigt . Aliquots werden mittels GC/MS analysiert.

Die Bestimmung der Aktivität der C24-Methyltransferase kann wie im folgenden beschrieben durchgeführt werden:

Das Protein Erg6p (C24-Methyltransferase) ist zu 80% in Lipidpar- tikel in der Hefe nachweisbar (Athenstaedt K, Zweytick D, Jandro- sitz A, Kohlwein SD, Daum G: Identification and characterization of ajor lipid particle proteins of the yeast Saccharomyces cerevisiae.J Bacteriol. 1999 Oct; 181 (20) : 6441-8) . Zur Bestimmung der Enzymaktivität werden Lipidpartikel aus einem Kulturvolumen (48h) von 100 ml aufgearbeitet (nach einer Methode beschrieben bei Athenstaedt K, Zweytick D, Jandrositz A, Kohlwein SD, Daum G: Identification and characterization of major lipid particle proteins of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 1999 Oct;181(20) : 6441-8) .

Der Proteingehalt wird durch einen Biorad Enzymtest)bestimmt und für jeden Testansatz werden 3 mg Protein eingesetzt in einem Volumen von 500 μl. Dem Testansatz werden 50 μM [methyl- ³ H ₃ ] -S-Ade- nosyl-Methionin und 50 μM Zymosterol zugesetzt und der Ansatz wird 10 min bei 35°C inkubiert. Anschliessend wird das gleiche Volumen (500 μl) Chloroform/Methanol (4:1) zugesetzt und anschlie- ßend die Sterole extrahiert.

Mittels Szintillationsmessung kann der Anteil an Zymosterol mit eingebautem [methyl- ³ H ₃ ]-S-Adenosyl-Methionin bestimmt werden, da durch die Chloroform/Methanol Extraktion nur lipidlösliche Sub- stanzen extrahiert werden. Zur Quantifizierung werden die radioaktiven Zerfälle ebenfalls für 50 μM [methyl- ³ H ₃ ] -S-Adenosyl- Methionin mittels Szintillationsmessung bestimmt.

Dieses Verfahren ist eine Abwandlung des in Nes WD, Guo D, Zhou W..-Substrate-based inhibitors of the (S) -adenosyl-L-methio- nine:delta24 (25)- to delta24 (28) -sterol methyl transferase from Saccharomyces cerevisiae, Arch. Biochem. Biophys. 1997 Jun 1; 342 (1) : 68-81. beschriebenen Verfahrens .

Die Bestimmung der Aktivität der Δ22-Desaturase (ERG5p) kann wie im folgenden beschrieben durchgeführt werden: Verschiedene Konzentrationen von Ergosta-5, 7-dienol, aufgereinigt aus erg5 Mutantnen von 5. cerevisiae (Parks et al, 1985. Yeast sterols.yeast mutants as tools for the study of sterol metab- olism. Methods Enzymol. 111:333-346) und 50 μg dilauroylphospha- tidylcholin werden gemischt und mit Ultraschall behandelt, bis eine weisse Suspension entsteht. Aufgearbeitete Mikrosomen werden hinzugegeben (1 ml) (3 mg/ml Protein) . NADPH (Endkonzentration, 1 mM) wird dem Testansatz zum Start der Enzymreaktion hinzugegeben. Der Ansatz wird 20 min bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 3 ml Methanol gestoppt und Sterole werden verseift durch Zugabe von 2 ml 60% (wt/vol) KOH in Wasser. Der Ansatz wird bei 90°C for 2 h inkubiert. Der Ansatz wird nach dem Abkühlen dreimal mit 5 ml Hexan extrahiert und durch Rotationsverdampfung eingeengt. Anschliessend werden die Sterole lh bei 60°C mit bis(Trimethylsilyl) trifluoroacetamid (50 μl in 50 μl Toluol) silyliert. Die Sterole werden durch Gas Chromatographie-Massen Spektroskopie (GC-MS) ( beispielsweise Model VG 12-250 gas chro- matograph-mass spectrometer; VG Biotech, Manchester, United Kingdom) analysiert. Das entstandene Δ22-desaturierte Intermediat kann abhängig von der eingesetzten Menge an Substrat identifiziert werden. Als Referenz dienen Mikrosomen, die nicht mit Substrat inkubiert werden.

Dieses Verfahren ist eine Abwandlung des in Lamb et al: Purifica- tion, reconstitution, and inhibition of cytoehrome P-450 sterol delta22-desaturase from the pathogenic fungus Candida glabrata. Antimicrob Agents Chemother. 1999 Jul;43 (7) .-1725-8. , beschriebenen Verfahrens.

Die Bestimmung der Aktivität der Squalensynthetase kann wie im folgenden beschrieben durchgeführt werden:

Die Tests enthalten 50 mM Mops, pH 7.2, 10 mM MgCl ₂ , 1% (v/v) Tween-80, 10% (v/v) 2-propanol, 1 mM DTT, 1 mg/mL BSA, NADPH, FPP (or PSPP) und Mikrosomen (3mg Proteingehalt) in einem Gesamtvolumen von 200 μl in Glassröhrchen. Reaktionen mit radioaktivem Substrat [1- ³ H]FPP (15-30 mCi/μmol) werden bei 30 °C für 30 min inkubiert und der Suspensionsansatz mit einem Volumen von 1:1 (v/v) 40% wässriges KOH.-Methanol aufgefüllt. Flüssiges NaCl wird zur Sättigung der Lösung hinzugegeben und 2 ml Ligroin enthaltend 0.5% (v/v) Squalen werden ebenfalls zugefügt.

Die Suspension wirde für 30 s gevortext. Je 1 ml der Ligroin Schicht wird in einer Pasteur Pipette auf eine gepackte 0.5 x 6 cm Aluminium Säule (80-200 mesh, Fisher) gegeben. Die Säule ist mit 2 ml Ligroin mit 0.5% (v/v) Squalen präequlibriert. Anschliesend wird die Säule mit 5 x 1 ml Toluol enthaltend 0.5% (v/v) Squalen eluiert. Die Radioaktivität von Squalen wird in Cytoscint (ICN) Szintillations Cocktail mit einem Szintilationszähler (Beckman) gemessen.

Dieses Verfahren ist eine Abwandlung der in Radisky et al . , Bio- chemistry. 2000 Feb 22;39 (7) : 1748-60, Zhang et al. (1993) Arch. Biochem. Biophys . 304, 133-143 und Poulter, CD et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111, 3734-3739, beschriebenen Verfahren.

Die Bestimmung der Aktivität der Sterol-Acyltransferase kann wie im folgenden beschrieben durchgeführt werden:

Aus einer 20 ml Vorkultur, die zwei Tage inkubiert wird, wird eine 200 ml Hauptkultur l%ig angeimpft und über Nacht in Voll- medium bebrütet . Die Zellen werden geerntet und anschliessend in doppeltem Volumen HP-Puffer (100 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4; 0,5 mM EDTA; 1 mM Glutathion; 20 μM Leupeptin; 64 μM Benzamidin; 2 mM PMSF) gewaschen und in HP Puffer resuspendiert.

Nach Zugabe von 1 g Glasperlen werden die Zellen 8 mal eine Minute durch vortexen aufgeschlossen. Der Überstand wird bei 105000 xg ultrazentrifugiert . Das Pellet wird in 1 ml ACAT-Puffer (100 mM Kalium-Phophatpuffer pH7,4; 1 mM Glutathion) aufgenommen.

Der Enzymtest erfolgt in einem Volumen von 500 μl. Das Substrat Ergosterol wird in 62,5 ml 0,5 x ACAT-Puffer aufgenommen unter heftigem Vortexen. 250 μl dieser Lösung werden als Substrat für den Test eingesetzt. Dazu kommen 20 μl Proteinextrakt, 50 μl Wasser und 130 μl 0,5 x ACAT-Puffer.

Der Ansatz wird für 15 min bei 37°C inkubiert. Danach werden 50 μl 14C-0leoyl-CoA (600000 dpm) zugegeben und die Reaktion wird nach einer Minute durch Zugabe von 4 ml Chloroform/Methanol (2:1) gestoppt. Dazu kommen 500 μl H ₂ 0. Zur Phasentrennung wird die Sus- pension kurz bei 2000 xg zentrifugiert. Die untere Phase wird in einem Spitzkolben bis zur Trockne eingeengt und in 100 μl Chloroform/Methanol (4:1) rückgelöst und auf eine DC-Platte (Kieselgel 60 F254) aufgetragen. Die DC wird mit Petroether/Diethylether/Es- sigsäure 90:10:1 als Laufmittel durchgeführt. Die Flecken der Sterylesterfraktion werden ausgeschnitten und in einem Szintilationszähler die Anzahl der radioaktiven Zerfälle bestimmt. Über die Menge der in Sterylester gebundene 14C-01eoyl-CoA Moleküle ist die Enzymaktivität bestimmbar.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Herstellung von 7-Dehydrocholesterol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten durch Kultivierung von Organismen, insbeondere von Hefen, die gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte Aktivität mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, Δ5-De- saturase-Aktivität und Δ24-Reduktase-Aktivität aufweisen, zusätz- lieh eine reduzierte Aktivität mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe C24-Methyltransferase-Aktivität und Δ22-Desaturase-Aktivität aufweisen und zusätzlich eine eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol- C14-Demethylase-Aktivität und eine erhöhte Squalenepoxidase-Akti- vität aufweisen.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Herstellung von 7-Dehydrocholesterol und/ oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten durch Kultivierung von Organismen, insbeondere von Hefen, die gegenüber dem Wildtyp

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität und eine erhöhte Δ5-Desa- turase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität und eine erhöhte Δ24-Re- duktase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität und eine erhöhte Δ24-Reduk- tase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eäne erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität und eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität aufwei- sen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität und eine reduzierte C24-Me- thyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität und eine reduzierte C24-Me- thyltransferase-Aktivität aufweisen, eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivi- tät aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduk- tase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivi- tät aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase- Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität und eine re- duzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität und eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität und eine reduzierte Δ22-De- saturase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität und eäne reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität und eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduk- tase-Aktivität und eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase- Aktivität und eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität und eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desa- turase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Akti- vität aufweisen, eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desatu- rase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivi- tät aufweisen,

eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desatu- rase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivi- tät aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduk- tase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase- Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyl- transferase-Aktävität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität und eine erhöhte HMG-CoA- Reduktase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität und eine erhöhte HMG-CoA-Re- duktase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität und eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität und eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Re- duktase-Aktivität und eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität und eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität aufwei- sen, eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität und eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Akti- vität aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduk- tase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivi- tät aufweisen,

eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivi- tat aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduk- tase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase- Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyl- transferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Re- duktase-Aktivität und eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität und eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität auf- weisen,

eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität und eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität aufweisen, eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität und eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduk- tase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität und eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase- Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität und eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität , eine er- höhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität und eine reduzierte Δ22-Desatu- rase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desa- turase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität und eine reduzierte C24-Me- thyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine. erhöhte Δ24-Reduk- tase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität und eine reduzierte C24-Me- thyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase- Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltrans- ferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase- Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität und eine erhöhte Lanoste- rol-Cl4-Demethylase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität und eine erhöhte Lanosterol- C14-Demethylase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität und eine erhöhte Lanosterol- C14-Demethylase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol- C14-Demethylase-Aktivität und eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivi- tat aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol- C14-Demethylase-Aktivität und eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivi- tät aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol- C14-Demethylase-Aktivität und eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivi- tät aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol- C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransfe- rase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität und eine reduzierte C24-Me- thyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol- C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltrans- ferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduk- tase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen, eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase- Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol- C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte Δ22-Desaturase-Ak- tivität aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol- Cl4-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte Δ22-Desaturase-Ak- tävität aufweisen,

eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol- C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte Δ22-Desaturase-Ak- tivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduk- tase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase- Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desa- turase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivi- tät und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen, eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduk- tase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase- Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-Cl4-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte C24-Me- thyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-De- methylase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Ak- tivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol- C14-Demethylase-Aktivität und eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol- C14-Demethylase-Aktivität und eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol- C14-Demethylase-Aktivität und eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-Cl4-Demethylase-Akti- vität und eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Akti- vität und eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität aufweisen, eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-Cl4-Demethylase-Aktivität und eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-Cl4-Demethylase-Aktivität und eine erhöhte Δ2 -Reduktase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Akti- vität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduk- tase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduk- tase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase- Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-Cl4-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol- C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransfe- rase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-Cl4-Demethylase-Akti- vität und eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität aufweisen, eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivi ät aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduk- tase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase- Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität und eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine er- höhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol- C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte Δ22-Desaturase- Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desa- turase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol- C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransfe- rase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduk- tase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol- C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransfe- rase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase- Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethy- lase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivi- tät aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase- Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase- Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine redu- zierte Δ22-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase- Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität, eine erhöhte Squalenepoxidase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen oder

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase- Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität, eine erhöhte Squalenepoxidase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen.

In weiteren besonders bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Herstellung von 7-Dehydro- cholesterol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten durch Kultivierung von Organismen, insbesondere von Hefen, die gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte Δ8-Δ7-Isome- rase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desaturase-Aktivität, eine er- höhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desaturase-Ak- tivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-Cl4-Demethylase-Aktivität und eine erhöhte Squalenepoxidase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivätät, eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, eine erhöhte Lanosterol- C14-Demethylase-Aktivität, eine erhöhte Squalenepoxidase-Akti- vität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine redu- zierte Δ22-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase- Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität, eine erhöhte Squalenepoxidase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufweisen,

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase- Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität, eine erhöhte Squalenepoxidase-Aktivität, eine erhöhte S ualen- synthetase-Aktivität und eine reduzierte C24-Methyltransferase- Aktivität aufweisen.

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine redu- zierte Δ22-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase- Aktivität, eine erhöhte' Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität, eine erhöhte Squalenepoxidase-Aktivität, eine erhöhte Sterol- Acyltransferase-Aktävität und eine reduzierte C24-Methyltrans- ferase-Aktivität aufweisen.

eine erhöhte Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, eine erhöhte Δ5-Desatu- rase-Aktivität, eine erhöhte Δ24-Reduktase-Aktivität, eine reduzierte Δ22-Desaturase-Aktivität, eine erhöhte HMG-CoA-Reduktase- Aktivität, eine erhöhte Lanosterol-Cl4-Demethylase-Aktivität, eine erhöhte Squalenepoxidase-Aktivität, eine erhöhte Squalensynthetase-Aktivität, eine erhöhte Sterol-Acyltransferase-Akti- vität und eine reduzierte C24-Methyltransferase-Aktivität aufwei- sen.

Unter den biosynthetischen Zwischenprodukten des 7-Dehydrochole- sterol, werden alle Verbindungen verstanden, die im verwendeten Organismus bei der Biosynthese von 7-Dehydrocholesterol als Zwi- schenprodukte auftreten, vorzugsweise die Verbindungen Mevalonat, Farnesylpyrophosphat, Geraniolpyrophosphat, Squalenepoxid, 4-Di- methylcholesta-8 , 14 , 24-trienol , 4,4 Dimethylzymosterol, Squalen, Farnesol, Geraniol, Lanosterol, Zymosterol, Lathosterol, Chole- sta-7,24-dienol und Cholesta-5, 7,24-trienol.

Unter den biosynthetischen Folgeprodukten des Zymosterols, werden alle Verbindungen verstanden, die sich im verwendeten Organismus biosynthetisch von 7-Dehydrocholesterol ableiten, daß heißt bei denen 7-Dehydrocholesterol als Zwischenprodukt auftritt. Dies können Verbindungen sein, die der verwendete Organismus natürlicherweise aus 7-Dehydrocholesterol herstellt, wie beispielsweise Cholesterol oder Vitamin D3 in Säugern. Es werden aber auch Verbindungen verstanden, die erst durch Einbringen von Genen und En- zymaktivitäten aus anderen Organismen, zu denen der Ausgangsorganismus kein orthologes Gen aufweist, im Organismus aus 7-Dehydro- cholesterol hergestellt werden können.

Beispielsweise können durch Einbringen von Säugergenen in Hefe, Folgeprodukte aus 7-Dehydrocholesterol hergestellt werden, die natürlich nur in Säugern vorkommen:

Durch Einbringen einer humanen oder murinen Nukleinsäure, kodierend eine humane oder murine Δ-7-Reduktase wird die Hefe in die Lage versetzt Cholesterol zu produzieren.

Unter UV-Bestrahlung entsteht aus 7-Dehydrocholesterol über Provitamin D ₃ unter Umlagerung Vitamin D ₃ (Cholecalciferol) .

Unter den biosynthetischen Folgeprodukten des 7-Dehydrocholeste- rols werden daher insbesondere Provitamin D3 , Vitamin D ₃ (Cholecalciferol) und/oder Cholesterol verstanden.

Bevorzugte biosynthetische Folgeprodukte sind Provitamin D ₃ und insbesondere Vitamin D ₃ .

Die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Verbindungen können in Biotransformationen, chemischen Reaktionen und zu therapeutischen Zwecken verwendet werden, beispielsweise zur Gewin- nung von Vitamin D ₃ aus 7-Dehydrocholesterol über UV-Bestrahlung, oder zur Gewinnung von Steroidhormonen über Biotransformation ausgehend von Cholesta-7,24-dienol oder Cholesta-5, 7,24-trienol.

Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von 7-Dehydrocho- lesterol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten wird vorzugsweise dem Kultivierungsschritt der genetisch veränderten Organismen, im folgenden auch transgene Orga- nismen bezeichnet, ein Ernten der Organismen und ein Isolieren von 7-Dehydrocholesterol und/ oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten aus den Organismen angeschlossen.

Das Ernten der Organismen erfolgt in an sich bekannter Weise dem jeweiligen Organismus entsprechend. Mikroorganismen, wie Bakterien, Moose, Hefen und Pilze oder Pflanzenzellen, die durch Fermentation in flüssigen Nährmedien kultiviert werden, können beispielsweise durch Zentrifugieren, Dekantieren oder Filtrieren abgetrennt werden.

Die Isolierung von 7-Dehydrocholesterol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten aus der geernteten Biomasse erfolgt gemeinsam oder jede Verbindung für sich in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Extraktion und gegebenenfalls weiterer chemische oder physikalischer Reinigungsprozesse, wie beispielsweise Fällungsmethoden, Kristallographie, thermische Trennverfahren, wie Rektifizierverfahren oder physikalische Trennverfahren, wie beispielsweise Chromatographie.

Die Herstellung der transgenen Organismen, insbesondere Hefen kann vorzugsweise durch Transformation der Ausgangsorganismen, insbesondere Hefen, entweder mit einem Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend mindestens eine Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe Nukleinsäuren codierend eine Δ8-Δ7-Isomerase, Nukleinsäuren codierend eine Δ5-Desaturase und Nukleinsäuren codierend eine Δ24-Reduktase die mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktioneil verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Organismen gewährleisten, erfolgen. Die Herstellung der trans- genen Organismen erfolgt in dieser Ausführungsform mit einem Nukleinsäurekonstrukt .

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das vorstehend beschriebene Nukleinsäurekonstrukt zusätzlich mindestens eine Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe Nukleinsäuren codierend eine HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, Nukleinsäuren codierend eine Lanosterol-C14-Demethylase, Nukleinsäuren codierend eine Squalenepoxidase, Nukleinsäuren codierend eine Squalensynthetase und Nukleinsäuren codierend eine Sterol-Acyltransferase, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktioneil verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Organismen gewährleisten.

Die Herstellung der transgenen Organismen kann aber auch vorzugs- weise durch Transformation der Ausgangsorganismen, insbesondere Hefen, mit mindestens einem Nukleinsäurekonstrukt, ausgewählt aus der Gruppe Nukleinsäurekonstrukt enthaltend Nukleinsäuren codie- rend eine Δ8-Δ7-Isomerase, Nukleinsäurekonstrukt enthaltend Nukleinsäuren codierend eine Δ5-Desaturase und Nukleinsäurekonstrukt enthaltend Nukleinsäuren codierend eine Δ24-Reduktase und diese jeweils mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktioneil verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Organismen gewährleisten, erfolgen. Die Herstellung der transgenen Organismen erfolgt in dieser Ausführungsform mit einzelnen Nukleinsäurekonstrukten oder einer Kombination von Nukleinsäurekonstrukten.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die vorstehend beschriebene Kombination von Nukleinsäurekonstrukten zusätzlich mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt, ausgewählt aus der Gruppe Nukleinsäurekonstrukt enthaltend Nukleinsäuren codierend eine HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, Nukleinsäurekonstrukt enthaltend Nukleinsäuren codierend eine Lanosterol-Cl4-Demethylase, Nukleinsäurekonstrukt enthaltend Nukleinsäuren codierend eine Squalenepoxidase, Nukleinsäurekonstrukt enthaltend Nukleinsäuren codierend eine Squalensynthetase und Nukleinsäurekonstrukt enthal- tend Nukleinsäuren codierend eine Sterol-Acyltransferase, die jeweils mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktioneil verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Organismen gewährleisten.

Nukleinsäurekonstrukte, in denen die kodierende Nukleinsäure- sequenz mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Organismen, insbesondere in Hefen gewährleisten, werden im folgenden auch Expressionskasetten genannt.

Nukleinsäurekonstrukte enthaltend diese Expressionskasette sind beispielsweise Vektoren oder Plasmide.

Dementsprechend betrifft die Erfindung ferner Nukleinsäurekon- strukte, insbesondere als Expressionskasette fungierende Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend mindestens eine Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe Nukleinsäuren codierend eine Δ8-Δ7-Isomera- se, Nukleinsäuren codierend eine Δ5-Desaturase und Nukleinsäuren codierend eine Δ24-Reduktase, die mit einem oder mehreren Regula- tionssignalen funktionell verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Organismen gewährleisten.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst dieses Nukleinsäurekonstrukt zusätzlich mindestens eine Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe Nukleinsäuren codierend eine HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, Nukleinsäuren codierend eine Lanosterol-Cl4-Demethylase, Nukleinsäuren codierend eine Squalenepoxidase, Nukleinsäuren co- dierend eine Squalensynthetase und Nukleinsäuren codierend eine Sterol-Acyltransferase, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Organismen gewährleisten.

Alternativ können die erfindungsgemäßen transgenen Organismen auch durch Transformation mit einzelnen Nukleinsäurekkonstrukten oder einer Kombination aus Nukleinsäurekonstrukten hergestellt werden, wobei die Kombination

mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt, ausgewählt aus der Gruppe A bis C

A Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend Nukleinsäuren codierend eine Δ8-Δ7-Isomerase, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Organismen gewährleisten,

B Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend Nukleinsäuren codierend eine Δ5-Desaturase, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Organismen gewährleisten und

C Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend Nukleinsäuren codierend eine Δ24-Reduktase, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Organismen gewährlei- sten,

und mindestens ein Nukleinsäurekonstrukte, ausgewählt aus der Gruppe D bis H

D Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend Nukleinsäuren codierend eine HMG-CoA-Reduktase, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Organismen gewährleisten,

E Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend Nukleinsäuren codierend eine Lanosterol-C14-Demethylase, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Organismen gewähr- leisten, F Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend Nukleinsäuren codierend eine Squalenepoxidase, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Organismen gewährlei- sten,

G Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend Nukleinsäuren codierend eine Squalensynthetase, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Organismen gewährleisten,

H Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend Nukleinsäuren codierend eine Sterol-Acyltransferase, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft sind, die die

Transkription und Translation in Organismen gewährleisten

umfasst .

Vorzugsweise enthalten die Regulationssignale einen oder mehrere Promotoren, die die Transkription und Translation in Organismen, insbesondere in Hefen gewährleisten.

Die Expressionskassetten beinhalten Regulationssignale, also regulative Nukleinsäuresequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine Expressionskassette stromaufwärts, dh am 5 '-Ende der kodierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, dh am 3 '-Ende einen Terminator und gegebenen- falls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden .kodierenden Sequenz für mindestens eines der vorstehend beschriebenen Gene operativ verknüpft sind.

Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, gegebenenfalls Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, daß jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.

Im folgenden werden beispielhaft die bevorzugten Nukleinsäurekonstrukte, Expressionskassetten und Plasmide für Hefen und Pilze und Verfahren zur Herstellung von transgenen Hefen, sowie die transgenen Hefen selbst beschrieben. Als Promotoren der Expressionskassette ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Fremdgenen in Organismen, insbesondere in Hefen steuern kann.

Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen Promotor, der in der Hefe einer reduzierten Regulation unterliegt, wie beispielsweise der mittlere ADH-Promotor.

Dieses Promotorfragment des ADHl2s Promotors, im folgenden auch ADH1 bezeichnet, zeigt eine annähernd konstitutive Expression

(Ruohonen L, Penttila M, Keranen S. (1991) Optimization of Bacil- lus alpha-amylase production hy Saccharomyces cerevisiae. Yeast. May-Jun,-7(4) :337-462; Lang C, Loo an AC. (1995) Efficient expression and secretion of Aspergillus niger RH5344 polygalacturo- nase in Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol. Dec; 44 (1-2) -.147-56. ) , so daß die transkriptioneile Regulation nicht mehr über Intermediate der Ergosterolbiosynthese abläuft.

Weitere bevorzugte Promotoren mit reduzierter Regulation sind konstitutive Promotoren wie beispielsweise der TEFl-Promotor aus Hefe, der GPD-Promotor aus Hefe oder der PGK-Promotor aus Hefe (Mumberg D, Muller R, Funk M. (1995) Yeast vectors for the con- trolled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 1995 Apr 14;156 (1) -.119-22; Chen CY, Oppermann H, Hitzeman RA. (1984) Homologous versus heterologous gene expression in the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. Dec 11; 12 (23) : 8951-70. ) .

Die Expressionskassette kann auch induzierbare Promotoren, insbe- sondere chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression der Nukleinsäuren kodierend eine Δ8-Δ7-Isomerase, Δ5-Desaturase, Δ24-Reduktase, HMG-CoA-Reduktase, Lanosterol- C14-Demethylase, Squalenepoxidase, Squalensynthetase oder Sterol- Acyltransferase im Organismus zu einem bestimmten Zeitpunkt ge- steuert werden kann.

Derartige Promotoren wie beispielsweise der Cupl-Promotor aus Hefe (Etcheverry T. (1990) Induced expression using yeast copper metallothionein promoter. Methode Enzymol. 1990;185:319-29.), der Gall-10-Promotor aus Hefe (Ronicke V, Graulich W, Mumberg D, Muller R, Funk M. (1997) Use of conditional Promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae, Methods Enzymol.283: 313-22) oder der Pho5-Promotor aus Hefe (Bajwa W, Rudolph H, Hinnen A. (1987) PH05 upstream sequences confer phos- phate control on the constitutive PH03 gene. Yeast. 1987 Mar;3 (1) :33-42) können beispielsweise benutzt werden. Als Terminator der Expressionskassette ist grundsätzlich jeder Terminator geeignet, der die Expression von Fremdgenen in Organismen, insbesondere in Hefen steuern kann.

Bevorzugt ist der Tryptophan-Terminator aus Hefe (TRPl-Termina- tor) .

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt vorzugsweise durch Fusion eines geeigneten Promotors mit den vorstehend be- schriebenen Nukleinsäuren kodierend eine Δ8-Δ7-Isomerase, Δ5-De- saturase, Δ24-Reduktase, HMG-CoA-Reduktase, Lanosterol-C14-Deme- thylase, Squalenepoxidase, Squalensynthetase oder Sterol-Acyltransferase und gegebenenfalls einem Terminator nach gängigen Re- ko binations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, EF Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cpld Spring Harbor .Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in TJ Silhavy, ML Berman und LW Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben sind.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus syn- thetischen und natürlichen Nukleinsäure-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen.

Bevorzugt sind, wie vorstehend beschrieben, synthetische Nukleo- tid-Sequenzen mit Kodons, die von Hefen bevorzugt werden. Diese von Hefen bevorzugten Kodons können aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Hefespezies exprimiert werden.

Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.

Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator- Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Inser- tion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im. allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zum Wirtsorganismus sein. Die Expressionskassette beinhaltet vor- zugsweise in der 5 ' -3 ' -Transkriptionsrichtung den Promotor, eine kodierende Nukleinsäuresequenz oder ein Nukleinsäurekonstrukt und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.

Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie zB Transitionen und Transversionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primerrepair" , Restriktion oder Ligation verwendet werden.

Bei geeigneten Manipulationen, wie zB Restriktion, "chewing- back" oder Auffüllen von Überhängen für "bluntends", können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.

Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren, der vorstehend beschriebenen Nukleinsäurekonstrukte oder der vorstehend besschriebenen Pro- teine zur Herstellung von transgenen Organismen, insbesondere Hefen.

Vorzugsweise weisen diese transgenen Organismen, insbesondere Hefen gegenüber dem Wildtyp einen erhöhten Gehalt an 7-Dehydro- cholesterol und /oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten auf .

Daher betrifft die Erfindung ferner die Verwendung der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren oder der erfindungsgemäßen Nuklein- säurekonstrukte zur Erhöhung des Gehalts an 7-Dehydrocholesterol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten in Organismen.

Die vorstehend beschriebenen Proteine und Nukleinsäuren können zur Herstellung von 7-Dehydrocholesterol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten in transgenen Organsi en verwendet werden.

Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom eines Organismus, insbesondere von Hefe wird als Transformation bezeichnet. Dazu können insbesondere bei Hefen an sich bekannte Methoden zur Transformation genutzt werden.

Geeignete Methoden zur Transformation von Hefen sind beispiels- weise die LiAC-Methode, wie in Schiestl RH, Gietz RD. (1989) High efficiency transformation of intact yeast cells using Single stranded nucleic acids as a carrier, Curr Genet. Dec; 16 (5-6) : 339-46, beschrieben, die Elektroporation wie in Manivasakam P, Schiestl RH. (1993) High efficiency transformation of Saccha- romyces cerevisiae by electroporation. Nucleic Acids Res. Sep 11;21 (18) .-4414-5, beschrieben oder die Protoplasierung, wie in Morgan AJ. (1983) Yeast strain improve ent by protoplast fusion and transformation, Experientia Suppl. 46:155-66 beschrieben.

Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor, insbesondere in Plasmide kloniert, die geeignet sind, Hefen zu transformieren, wie beispielsweise die Vektorsysteme Yep24 (Nau- movski L, Friedberg EC (1982) Molecular cloning of eucaryotic genes required for excision repair of UV-irradiated DNA: isola- tion and partial characterization of the RAD3 gene of Saccharomyces cerevisiae. Bacteriol Oct;152 (1) :323-31) , Yepl3 (Broach JR, Strathern JN, Hicks JB. (1979) Transformation in yeast: develop- ment of a hybrid cloning vector and Isolation of the CANl gene. Gene. 1979 Dec; 8 (1) :121-33) , die pRS-Serie von Vektoren (Centro- mer und Episo al) (Sikorski RS, Hieter P. (1989) A System of

Shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient ma- nipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. May; 122 (1) : 19-27) sowie die Vektorsysteme YCpl9 oder pYEXBX.

Dementsprechend betrifft die Erfindung weiterhin Vektoren, insbesondere Plasmide enthaltend die vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren, Nukleinsäurekonstrukte oder Expressionskasetten.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von genetisch veränderten Organismen, indem man eine vorstehend beschriebene Nukleinsäure oder ein vorstehend beschriebenes Nukleinsäurekonstrukt in den Ausgangsorganismus funktionell einführt .

Die Erfindung betrifft ferner die genetisch veränderten Organismen, wobei die genetische Veränderung mindestens eine der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Δ8-Δ7-Isomerase-Aktivität, Δ5-Desaturase-Aktivität und Δ24-Reduktase-Aktivität gegenüber einem Wildtyp erhöht. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung mindestens einer der Aktivitäten durch eine Erhöhung der Genexpression mindestens einer Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe Nukleinsäuren codierend eine Δ8-Δ7-Isomerase, Nukleinsäuren codierend eine Δ5-Desaturase und Nukleinsäuren codierend eine Δ24-Reduktase.

Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung der Genexpression der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren durch Erhöhung der Kopienzahl der Nukleinsäuren codierend eine Δ8-Δ7-Isomerase, codierend eine Δ5-Desaturase und/oder codierend eine Δ24-Reduktase im Organismus.

Dementsprechend betrifft die Erfindung bevorzugt einen vorstehend beschriebenen genetisch verändertem Organismus der zwei oder mehr Nukleinsäuren codierend eine Δ8-Δ7-Isomerase und/oder zwei oder mehr Nukleinsäuren codierend eine Δ5-Desaturase und/oder zwei oder mehr Nukleinsäuren codierend eine Δ24-Reduktase enthält.

In einer bevorzugten Ausführungsform weist der genetisch veränderte Organismus gegenüber dem Wildtyp zusäzlich zu den vorstehend beschriebenen genetischen Veränderungen eine reduzierte Aktivität mindestens eine der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe C24-Methyltransferase-Aktivität und Delta22-Desaturase- Aktivität auf.

Die Reduzierung mindestens einer der Aktivitäten wird vorzugsweise durch eine Reduzierung der Genexpression mindestens einer Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe Nukleinsäuren codierend eine C24-Methyltransferase und Nukleinsäuren codierend eine Delta22-Desaturase, gegenüber dem Wildtyp bewirkt.

Ein besonders bevorzugter genetisch veränderter Organismus weist zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen genetischen Verände- rungen kein funktionelles C24-Methyltransferase-Gen und/oder Delta22-Desaturase-Gen auf.

Besonders bevorzugt sind vorstehend erwähnte, genetisch veränderte Organismen bei denen die genetische Veränderung zusätzlich mindestens eine der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe HMG- CoA-Reduktase-Aktivität, Lanosterol-C14-Demethylase-Aktivität, Squalenepoxidase-Aktivität, Squalensynthetase-Aktivität und Ste- rol-Acyltransferase-Aktivität, gegenüber einem Wildtyp erhöht.

Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung mindestens einer dieser Aktivitäten, wie vorstehend erwähnt, durch eine Erhöhung der Genexpression mindestens einer Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe Nukleinsäuren codierend eine HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, Nukleinsäuren codierend eine Lanosterol-C14-Demethylase, Nukleinsäuren codierend eine Squalenepoxidase, Nukleinsäuren codierend eine Squalensynthetase und Nukleinsäuren codierend eine Sterol- Acyltransferase, gegenüber dem Wildtyp.

Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung der Genexpression mindestens einer Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe Nukleinsäuren codierend eine HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, Nukleinsäuren codierend eine Lanosterol-C14-Demethylase, Nukleinsäuren codierend eine Squalenepoxidase, Nukleinsäuren codierend eine Squalensynthetase und Nukleinsäuren codierend eine Sterol-Acyltransferase gegenüber dem Wildtyp durch Erhöhung der Kopienzahl mindestens einer Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe Nukleinsäuren codierend eine HMG-CoA-Reduktase-Aktivität, Nukleinsäuren codierend eine Lanosterol-C14-Demethylase, Nukleinsäuren codierend eine Squalenepoxidase, Nukleinsäuren codierend eine Squalensynthetase und Nukleinsäuren codierend eine Sterol-Acyltransferase im Organismus.

Dementsprechend betrifft die Erfindung bevorzugt einen vorstehend beschriebenen genetisch verändertem Organismus der zwei oder mehr Nukleinsäuren mindestens einer Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe Nukleinsäuren codierend eine HMG-CoA-Reduktase-Aktivi- tat, Nukleinsäuren codierend eine Lanosterol-C14-Demethylase, Nukleinsäuren codierend eine Squalenepoxidase, Nukleinsäuren codierend eine Squalensynthetase und Nukleinsäuren codierend eine Sterol-Acyltransferase enthält.

Insbesondere betrifft die Erfindung bevorzugt einen genetisch veränderten Organismus, der zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen genetischen Veränderungen zwei oder mehr Nukleinsäuren codierend eine HMG-CoA-Reduktase und/oder zwei oder mehr Nukleinsäuren codierend eine Lanosterol-Cl4-Demethylase und/oder zwei oder mehr Nukleinsäuren codierend eine Squalenepoxidase und/ oder zwei oder mehr Nukleinsäuren codierend eine Squalensynthetase und/oder zwei oder mehr Nukleinsäuren codierend eine Sterol- Acyltransferase enthält.

Die vorstehend beschriebenen genetisch veränderten Organismen weisen gegenüber dem Wildtyp einen erhöhten Gehalt an 7-Dehydro- cholesterol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten auf.

Dementsprechend betrifft die Erfindung einen vorstehend beschriebenen genetisch veränderten Organismus, dadurch gekennzeichnet, daß der genetisch veränderte Organismus gegenüber dem Wildtyp ei- nen erhöhten Gehalt an 7-Dehydrocholesterol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen- und/oder Folgeprodukten aufweist.

Bevorzugte, genetisch veränderte Organismen sind erfindungsgemäß genetisch veränderte Hefen oder Pilze, insbesondere erfindungsgemäß genetisch veränderte Hefen, insbesondere die erfindungsgemäß genetisch veränderte Hefespezies Saccharomyces cerevisiae, insbesondere die genetisch veränderten Hefestämme Saccharomyces cerevisiae AH22, Saccharomyces cerevisiae GRF, Saccharomyces cerevisiae DBY747 und Saccharomyces cerevisiae BY4741.

Erhöhung des Gehaltes an 7-Dehydrocholesterol und/oder dessen biosynthetischen Zwischen und/oder Folgeprodukten bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorzugsweise die künstlich er- worbene Fähigkeit einer erhöhten Biosyntheseleistung mindestens einer dieser, vorstehend erwähnten Verbindungen in dem genetisch veränderten Organsimus gegenüber dem nicht genetisch veränderten Organismus .

Unter Wildtyp wird dementsprechend, wie eingangs erwähnt, vorzugsweise der genetisch nicht veränderte Organismus, insbesondere aber der vorstehend erwähnte Referenzorganismus verstanden.

Unter einem erhöhten Gehalt an 7-Dehydrocholesterol und/oder des- sen biosynthetischen Zwischen und/oder Folgeprodukten im Vergleich zum Wildtyp wird insbesondere die Erhöhung des Gehaltes mindestens einer der vorstehend erwähnten Verbindungen im Organismus um mindestens 50%, vorzugsweise 100%, bevorzugter 200%, besonders bevorzugt 400% im Vergleich zum Wildtyp verstanden.

Die Bestimmung des Gehalts an mindestens einer der erwähnten Verbindungen erfolgt vorzugsweise nach an sich bekannten analytischen Methoden und bezieht sich vorzugsweise auf die Komparti- mente des Organismus in denen Sterole produziert werden.

Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt:

I . Allgemeine experimentelle Bedingungen

1.Restriktion

Die Restriktion der Plasmide (1 bis 10 μg) wurde in 30 μl Ansätzen durchgeführt. Dazu wurde die DNA in 24 μl H0 aufgenommen, mit

3 μl des entsprechenden Puffers, 1 ml RSA (Rinderserumalbumin) und 2 μl Enzym versetzt. Die Enzymkonzentration betrug 1 Unit/μl oder 5 Units/μl je nach DNA Menge. In einigen Fällen wurde dem Ansatz noch 1 μl RNase zugegeben, um die tRNA abzubauen. Der Restrik- tionsansatz wurde für zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Konrolliert wurde die Restriktion mit einem Minigel .

2.Gelelektrophoresen Die Gelelektrophoresen wurden in Minigel- oder Wide-Minigelappa- raturen durchgeführt. Die Minigele (ca. 20 ml, 8 Taschen) und die Wide-Minigele (50 ml, 15 oder 30 Taschen) bestanden aus l%iger Agarose in TAE. Als Laufpuffer wurde 1 x TAE verwendet. Die Proben (10 μl) wurden mit 3 μl Stopperlosung versetzt und aufgetra- gen. Als Standard diente I-DNA geschnitten mit Hindlll (Banden bei: 23,1 kb; 9,4 kb; 6,6 kb; 4,4 kb; 2,3 kb; 2,0 kb; 0,6 kb) . Zur Auftrennung wurde eine Spannung von 80 V für 45 bis 60 min angelegt . Danach wurde das Gel in Ethidiumbromidlosung angefärbt und unter UV-Licht mit dem Video-Dokumentationssystem INTAS fest- gehalten oder mit einem Orange-Filter fotografiert.

3.Gelelution

Mittels Gelelution wurden die gewünschten Fragmente isoliert . Der

Restriktionsansatz wurde auf mehrere Taschen eines Minigels auf- getragen und aufgetrennt. Nur λ-Jϊindlll und eine "Opferspur" wurden in Ethidiumbromidlosung angefärbt, unter UV-Licht betrachtet und das gewünschte Fragment markiert. Dadurch wurde verhindert, daß die DNA der restlichen Taschen durch das Ethidiumbromid und das UV-Licht geschädigt wird. Durch Aneinanderlegen des gefärbten und ungefärbten Gelstücks konnte anhand der Markierung das gewünschte Fragment aus dem ungefärbten Gelstück herausgeschnitten werden. Das Agarosestück mit dem zu isolierenden Fragment wurde in einen Dialyseschlauch gegeben, mit wenig TAE-Puffer luftblasenfrei verschlossen und in die BioRad-Minigelapparatur gelegt. Der Laufpuffer bestand aus 1 x TAE und die Spannung betrug 100 V für 40 min. Danach wurde für 2 min die Strompolaritat gewechselt, um am Dialyseschlauch klebende DNA wieder zu lösen. Der die DNA- Fragmente enthaltende Puffer des Dialyseschlauches wurde in Reaktionsgefäße überführt und damit eine Ethanol Fallung durchge- fuhrt. Dazu wurde der DNA-Losung 1/10 Volumen an 3 M Natriumace- tat, tRNA (1 μl pro 50 μl Lösung) und dem 2,5 fächern Volumen an eiskaltem 96%igem Ethanol zugegeben. Der Ansatz wurde 30 min bei -20°C inkubiert und dann bei 12000 rpm, 30 min, 4°C abzentrifu- giert. Das DNA-Pellet wurde getrocknet und in 10 bis 50 μl H0 (je nach DNA-Menge) aufgenommen.

4. Klenow-Behandlung

Durch die Klenow-Behandlung werden überstehende Enden von DNA Fragmenten aufgefüllt, so daß "blunt-ends" entstehen. Pro 1 μg DNA wurde folgender Ansatz zusammenpipettiert: DNA-Pellet + 11 μl H20

+ 1 , 5 μl 10 x Klenow Puffer

+ 1 μl 0 , 1 M DTT

+ 1 μl Nucleotide (dNTP 2 mM)

25 + 1 μl Klenow-Polymerase (1 Unit/μl )

Die DNA sollte dabei aus einer Ethanolfällung stammen, um zu verhindern, daß Verunreinigungen die Klenow-Polymerase hemmen. Die Inkubation erfolgte für 30 min bei 37 °C, durch weitere 5 min bei 10 70 °C wurde die Reaktion abgestoppt. Die DNA wurde aus dem Ansatz durch eine Ethanolfällung gewonnen und in 10 μl H ₂ 0 aufgenommen.

5. Ligation

Die zu ligierenden DNA-Fragmente wurden vereinigt. Das Endvolumen

15 von 13,1 μl enhielt ca. 0,5 μl DNA mit einem Vektor-Insert Verhältnis von 1:5. Die Probe wurde 45 Sekunden bei 70 °C inkubiert, auf Raumtemperatur abgekühlt (ca. 3 min) und dann 10 min auf Eis inkubiert. Danach wurden die Ligationspuffer zugegeben: 2,6 μl 500 mM TrisHCl pH 7,5 und 1,3 μl 100 mM MgCl ₂ und weitere 10 min 0 auf Eis inkubiert. Nach der Zugabe von 1 μl 500 mM DTT und 1 μl 10 mM ATP und nochmaligen 10 min auf Eis wurde 1 μl Ligase (1 Unit/pl) zugegeben. Die ganze Behandlung sollte möglichst erschütterungsfrei erfolgen, um aneinanderliegende DNA-Enden nicht wieder zu trennen. Die Ligation erfolgte über Nacht bei 14 °C. 5

6.E. coli-Transformation

Kompetente Escherichia coli (E. coli) NM522 Zellen wurden mit der DNA des Ligationsansatzes transformiert. Als Positiv-Kontrolle lief ein Ansatz mit 50 μg des pScL3 Plasmids und als Null-Kon- 0 trolle ein Ansatz ohne DNA mit. Für jeden Transformationsansatz wurden 100 μl 8% PEG-Losung, 10 μl DNA und 200 μl kompetente Zellen (E. coli NM522) in ein Tischzentrifugenröhrchen pipettiert. Die Ansätze wurden für 30 min in Eis gestellt und gelegentlich geschüttelt . 5

Danach erfolgte der Hitzeschock: 1 min bei 42 °C. Für die Regeneration wurde den Zellen 1 ml LB-Medium zugegeben und für 90 min bei 37 °C auf einem Schüttler inkubiert. Je 100 μl der unverdünnten Ansätze, einer 1:10 Verdünnung und einer 1:100 Verdünnung 0 wurden auf LB + Ampicillin-Platten ausplattiert und über Nacht bei 37 °C bebrütet.

7. Plasmid-Isolation aus E. coli (Minipräp)

E. coli-Kolonien wurden über Nacht in 1,5 ml LB + Ampicillin- 5 Medium in Tischzentrifugenröhrchen bei 37 °C und 120 rpm angezogen. Am nächsten Tag wurden die Zellen 5 min bei 5000 rpm und 4 °C abzentrifugiert und das Pellet in 50 μl TE-Puffer aufgenommen. Jeder Ansatz wurde mit 100 μl 0,2 N NaOH, 1 % SDS-Lösung versetzt, gemischt und für 5 min auf Eis gestellt (Lyse der Zellen) . Danach wurden 400 μl Na-Acetat/NaCl-Losung (230 μl H ₂ 0, 130 μl 3 M Natriumacetat, 40 μl 5M NaCl) zugegeben, der Ansatz gemischt und für weitere 15 min auf Eis gestellt (Proteinfällung) . Nach 15 minütiger Zentrifugation bei 11000 rpm wurde der Überstand, der die Plasmid-DNA enthalt, in ein Eppendorfgefäß überführt. War der Überstand nicht vollständig klar, wurde nochmal zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 360 μl eisgekühltem Isopropanol versetzt und für 30 min bei -20 °C inkubiert (DNA-Fällung) . Die DNA wurde abzentrifugiert (15 min, 12000 rpm, 4 °C) , der überstand verworfen, das Pellet in 100 μl eisgekühltem 96%igem Ethanol gewaschen, 15 min bei -20 °C inkubiert und erneut abzentrifugiert (15 min, 12000 rpm, 4 °C) . Das Pellet wurde im Speed Vac getrocknet und dann in 100 μl H ₂ 0 aufgenommen. Die Plasmid DNA wurde durch Restriktionsanalyse charakterisiert. Dazu wurden 10 μl jedes Ansatzes restringiert und in einem Wide-Minigel gelelektrophoretisch aufgetrennt (siehe oben) .

8. Plasmid-Aufarbeitung aus E. coli (Maxipräp)

Um größere Mengen an Plasmid-DNA zu isolieren, wurde die Maxipräp Methode durchgeführt. Zwei Kolben mit 100 ml LB + Ampicillin-Me- dium wurden mit einer Kolonie bzw. mit 100 μl einer Gefrierkultur, die das zu isolierende Plasmid trägt, angeimpft und über Nacht bei 37 °C und 120 rpm bebrütet. Die Anzucht (200 ml) wurde am nächsten Tag in einen GSA-Becher überführt und bei 4000 rpm (2600 xg) 10 min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 6 ml TE- Puffer aufgenommen. Zum Abdau der Zellwand wurden 1,2 ml Lysozym- losung (20 mg/ml TE-Puffer) zugegeben und 10 min bei Raumtempera- tur inkubiert. Anschließend erfolgte die Lyse der Zellen mit 12 ml 0,2 N NaOH, 1 % SDS Lösung und weiteren 5 min Inkubation bei Raumtemperatur. Die Proteine wurden durch die Zugabe von 9 ml gekühlter 3 M Natriumacetat-Losung (pH 4,8) und einer 15 minutigen Inkubation auf Eis gefallt. Nach der Zentrifugation (GSA: 13000 rpm (27500 xg) , 20 min, 4 °C) wurde der Überstand, der die DNA enthielt, in einen neuen GSA-Becher überführt und die DNA mit 15 ml eiskaltem Isopropanol und einer Inkubation von 30 min bei -20 °C gefällt. Das DNA-Pellet wurde in 5 ml eisgekühltem Ethanol gewaschen und an der Luft getrocknet (ca. 30 - 60 min) . Danach wurde es in 1 ml H20 aufgenommen. Es fand eine Überprüfung des Plasmids durch Restriktionsanalyse statt. Die Konzentration wurde durch Auftragen von Verdünnungen auf einem Minigel bestimmt. Zur Verringerung des Salzgehaltes erfolgte eine 30 - 60 minutige Mi- krodialyse (Porengröße 0,025 μm) . 9. Hefe-Transformation

Für die Hefe-Transformation wurde eine Voranzucht des Stammes Saccharomyces cerevisiae AH22 angesetzt. Ein Kolben mit 20 ml YE- Medium wurde mit 100 μl der Gefrierkultur angeimpft und über 5 Nacht bei 28 °C und 120 rpm bebrütet. Die Hauptanzucht erfolgte unter gleichen Bedingungen in Kolben mit 100 ml YE-Medium, die mit 10 μl, 20 μl oder 50 μl der Voranzucht angeimpft wurden.

9.1 Erstellen kompetenter Zellen

10 Am nächsten Tag wurden die Kolben mittels Thomakammer ausgezählt und es wurde mit dem Kolben, der eine Zellzahl von 3 - 5 x 10 ⁷ Zellen/ml besaß weitergearbeitet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (GSA: 5000 rpm (4000 xg) 10 min) geerntet. Das Zellpellet wurde in 10 ml TE-Puffer aufgenommen und auf zwei Tischzen-

15 trifugenröhrchen aufgeteilt (je 5 ml) . Die Zellen wurden 3 min bei 6000 rpm abzentrifugiert und noch zweimal mit je 5 ml TE-Puffer gewaschen. Anschließend wurde das Zellpellet in 330 μl Li- thiumacetat-Puffer pro 10 ⁹ Zellen aufgenommen, in einen sterilen 50 ml Erlenmeyerkolben überführt und eine Stunde bei 28 °C ge-

20 schüttelt. Dadurch waren die Zellen kompetent für die Transformation.

9.2 Transformation

Für jeden Transformationsansatz wurden 15 μl Heringssperma DNA 25 (10 mg/ml), 10 μl zu transformierende DNA (ca. 0,5 μg) und 330 μl kompetente Zellen in ein Tischzentrifugenröhrchen pipettiert und 30 min bei 28 °C (ohne Schütteln) inkubiert. Danach wurden 700 μl 50% PEG 6000 zugegeben und für eine weitere Stunde bei 28 °C, ohne Schütteln, inkubiert. Es folgte ein Hitzeschock von 5 min bei 30 42 °C.

100 μl der Suspension wurden auf Selektionsmedium (YNB, Difco) ausplattiert, m auf Leucinprototrophie zu selektionieren. Im Falle der Selektion auf G418 Resistenz wird nach dem Hitzeschock eine Regeneration der Zellen durchgeführt (s. unter 9.3 Regenera- 35 tion sphase)

9.3 Regenerationsphase

Da der Selektionsmarker die Resistenz gegen G418 ist, brauchten die Zellen Zeit für die Expression des Resistenz-Gens . Die Trans-

40 for ationsansätze wurden mit 4 ml YE-Medium versetzt und über

Nacht bei 28 °C auf dem Schüttler (120 rpm) bebrütet. Am nächsten Tag wurden die Zellen abzentrifugiert (6000 rpm, 3 min) in 1 ml YE-Medium aufgenommen und davon 100 μl bzw. 200 μl auf YE + G418-Platten ausplattiert. Die Platten wurden mehrere Tage bei 28 5 °C bebrütet. 10. Reaktionsbedingungen für die PCR

Die Reaktionsbedingungen für die Polymerase Chain Reaction müssen für den Einzelfall optimiert werden und sind nicht uneingeschränkt für jeden Ansatz gültig. So kann unter anderem die ein- 5 gesetzte Menge an DNA, die Salzkonzentrationen und die Schmelztemperatur variiert werden. Für unsere Problemstellung erwies es sich als günstig, in einem Eppendorfhütchen, das für den Einsatz im Thermocycler geeignet war, folgende Substanzen zu vereinigen: Zu 2 μl (= 0,1 U) Super Taq Polymerase wurden 5 μl Super Buffer, 10 8μl dNTP's (je 0,625 μM) , 5'-Primer, 3'-Primer und 0,2 μg Matrit- zen DNA, gelost in soviel Wasser, daß sich ein Gesamtvolumen von 50 μl für den PCR Ansatz ergibt, zugegeben. Der Ansatz wurde kurz abzentrifugiert und mit einem Tropfen Öl überschichtet. Es wurden zwischen 37 und 40 Zyklen zur Amplifizierung gewählt.

15

II . Beispiele

Beispiel 1

Expression und Überexpression einer trunkierten HMG-CoA-Reduk- 20 tase, einer Squalenepoxidase (ERGl) und/oder einer Lanosterol- C14-Demethylase (ERG11) teilweise unter Deletion von ERG5 und ERG6 in S.cerevisiae GRF18 bzw. GRFura.3

1.1 Herstellung der Plasmide pFlatl und pFlat3 und pFlat4

25

Zur Herstellung des Expressionsvektors pFlat3 wurde das Plasmid YEp24 (Naumovski L, Friedberg EC (1982) Molecular cloning of eucaryotic genes required for excision repair of UV-irradiated DNA: Isolation and partial characterization of the RAD3 gene of

30 Saccharomyces cerevisiae.J Bacteriol Oct;152 (1) :323-31) lineari- siert durch Restriktion mit SphI und ein 900 bp SphI Fragment aus dem Vektor pPT2B (Lang C, Looman AC. (1995) Efficient expression and secretion of Aspergillus niger RH5344 polygalacturonase in Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol. Dec;

35 44(1-2): 147-56), welches den ADHl Promotor und den TRPl Terminator der Hefe Saccharomyces cerevisiae und eine Multiple-cloning- site aus dem Vektor pUC19 (Yanisch-Perron C, Vieira J, Messing J. (1985) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the Ml3mpl8 and pUC19 vectors. Gene.

40 1985,-33(1): 103-19.) enthält, integriert.

Die Multiple-cloning-site wurde durch einen Polylinker erweitert, der die Restriktionsstellen iVbtl und Zol enthält. Der Polylinker wurde über die Salϊ Schnittstelle des Vektors integriert. Das re- 45 sultierende Plasmid heißt pFlatl. Zur Herstellung des Vektors pFlat3 wurde der Vektor pFlatl durch das Enzym iVeol linearisiert und mittels Klenow-Behandlung blund end gemacht. Anschliessend wurde aus dem Plasmid YDpL (Berben, G. , Dumont, J., Gilliquet, V., Bolle, PA and Hilger F. (1991) The YDp Plasmids: a Uniform Set of Vectors Bearing Versatile Disruption Cassettes for Saccharomyces cerevisiae. Yeast 7: 475-477.) ein mittels Klenow-Polymerase-Behandlung blund end gemachtes jBamHI-Fragment, welches das LEU2 Gen der Hefe enthält, integriert.

Zur Herstellung des Vektors pFlat4 wurde der Vektor pFlatl durch das Enzym Ncol linearisiert und mittels Klenow-Behandlung blund end gemacht. Anschliessend wurde aus dem Plasmid YDpH (Berben et al., 1991) ein mittels Klenow-Polymerase-Behandlung blund end ge- machtes Ba HI-Fragment, welches das HIS3 Gen der Hefe enthält, integriert .

1.2 Integration von ERGl, ERG11, ERG4, ERG2 oder ERG3 oder dem Gen der Δ24-Reduktase in die Vektoren pFLatl, pFlat3 und pFlat4

Zunächst wurde mittels PCR auf der 5 ' codierenden Seite der Gene ERGl, ERG11, ERG4, Delta24-Reduktase, ERG2 oder ERG3 eine iVotl Restriktionsschnittstelle und auf der 3 ' codierenden Seite der Gene eine Xol Restriktionsschnittstelle eingefügt und die ent- sprechenden codierenden Bereiche amplifiziert. Anschliessend wurden die Amplifikate mit den Restriktionsenzymen JVofcl und Xhol behandelt. Parallel wurden die Plasmide pFlatl, pFlat3 und pFlat4 mit den Enzymen

Primer-Sequenzen für die Klonierung von ERGl, ERG11, ERG2, ERG3, ERG4, Delta24-Reduktase:

Primer ERG1-5' (SEQ. ID. No. 51): CTGCGGCCGC ATCATGTCTG CTGTTAACGT TGC

Primer ERG1-3 ' (SEQ. ID. No. 52): TTCTCGAGTT AACCAATCAA CTCACCAAAC

Primer ERG11-5' (SEQ. ID. No. 53): CTGCGGCCGCAGGATGTCTGCTACCAAGTCAATCG

Primer ERGll-3 ' (SEQ. ID. No. 54): ATCTCGAGCTTAGATCTTTTGTTCTGGATTTCTC Primer ERG2-5'(SEQ. ID. No. 55): CTGCGGCCGCACCATGAAGTTTTTCCCACT CC

Primer ERG2-3'(SEQ. ID. No. 56): TTCTCGAGTTAGAACTTTTTGTTTTGCAACAAG

Primer ERG3-5'(SEQ. ID. No. 57): CTGCGGCCGCAATATGGATTTGGTCTTAGAAGTCG

Primer ERG3-3'(SEQ. ID. No. 58): AACTCGAGTCAGTTGTTCTTCTTGGTATTTG

Primer ERG4-5'(SEQ. ID. No. 59): CTGCGGCCGCACTATGGCAAAGGATAATAGTGAG

Primer ERG4-3'(SEQ. ID. No. 60): TTCTCGAGCTAGAAAACATAAGGAATAAAGAC

Primer Δ24R-5'(SEQ. ID. No. 47): CTGCGGCCGCAAGATGGAGCCCGCCGTGTCGC

Primer Δ24R-3'(SEQ. ID. No. 48): AACTCGAGTCAGTGCCTTGCCGCCTTGC

1.3 Herstellung der Integrationsvektoren pUG6-tHMG, pUG6-EKG2, PÜG6-ERG21

1.3.1 pUG6-tHMG

Die DNA-Sequenz für die Exprssionskassette aus ADiϊl-Promotor- tHMG-Trypophan-Terminator wurde aus dem Vektor YepH2 (Polakowski, T. , Stahl, U. , Lang, C. (1998): Overexpression of a cytosolic HMG-CoA reductase in yeast leads to squalene accumulation. Appl. Microbiol. Biotechnol.49 : 66-71.) durch Restriktion mit den Enzymen EcoBSf und Bsp68l (I7rul) unter Verwendung von Standardmethoden isoliert. Das erhaltene DNA-Fragment wurde in den Vekor pUG6

(Güldener, U et al. (1996) : A new efficient gene disruption cas- sette for repeated use in budding yeast, Nucleic Acids Res. Jul 1;24(13) :2519-24) in die EccRV-Schnittstelle Blunt-end einklo- niert und ergab den Vektor mit der Bezeichnung pUG6-t#MG (Abbil- dungl) .

1.3.2 pUG6-£Gl

Die DNA-Sequenz für die Expressionskassette aus ADHI-Promotor- ERG2-Trypophan-Terminator wurde aus dem Vektor pFlat3 -ERGl durch Restriktion mit den Enzymen Miel und Bsp68I (iVruI) unter Verwendung von Standardmethoden isoliert. Das erhaltene DNA-Fragment wurde nach einer Klenow-Behandlung in den Vekor pUG6 (Güldener, U et al. (1996): A new efficient gene disruption cassette for re- peated use in budding yeast, Nucleic Acids Res. Jul 1,-24(13) :2519-24) in die BcoiW-Schnittstelle Blunt-end einklo- niert und ergab den Vektor mit der Bezeichnung püGβ-ERGl (Abbil- dung2) .

1.3.3 PUG6-EKG22

Die DNA-Sequenz für die Expressionskassette aus AΩH2-Promotor-

E G22-Trypophan-Terminator wurde aus dem Vektor pFlat3-EG22 durch Restriktion mit den Enzymen EcoRV und Bsp68l (iVruI) unter Verwendung von Standardmethoden isoliert. Das erhaltene DNA-Fragment wurde in den Vekor pUG6 (Güldener, U et al. (1996) : A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast, Nucleic Acids Res. Jul 1;24 (13) :2519-24) in die EcoRST- Schnittstelle Blunt-end einkloniert und ergab den Vektor mit der Bezeichnung pUG6-EKG22 (Abbildung 3).

1.4. Integrative Transformation der Expressionskassetten in die Hefestämme GRF oder GRFura3

Nach Plasmidisolation wurden Fragmente aus den Vektoren pUG6- tHMG, püGβ-ERGl und pUG6-EKG22 mittels PCR so amplifiziert, dass die resultierenden Fragmente aus folgenden Komponenten bestehen: loxP-kanMK-loxP-ADHl-Promotor -Zi igen-Tryptophan-Terminator, wo- bei unter Zielgen tHMG, ERGl bzw. ERGll und unter kanMX ein Kana- mycin-Resistenz-Gen verstanden wird.

Als Primer wurden Oligonukleotid-Sequenzen ausgewählt, die im an- nealenden Bereich die Sequenzen jenseits der zu amplifizierenden Kassetten des Vektors püG6- Zielgen enthalten und an den 5' und 3' Überhängend je 40 Basenpaare der 5' oder der 3' Sequenz des In- tegrationslocus enthalten. So ist gewährleistet, dass einerseits das gesamte Fragment inklusive KanMX und Zielgen amplifiziert wird und anderseits dieses Fragment anschließend in Hefe trans- formiert werden kann und durch homologe Rekombination in den

Ziel-Genlocus der Hefe integriert. Dabei wurden je nach Ziel-Gen- locus der Hefe die folgenden Oligonucleotid-Sequenzen als Primer verwendet :

Zur Integration an den URA3 Genlocus:

URA3-Crelox-5' (SEQ. ID. No. 33):

5 ' -ATGTCGAAAG CTACATATAA GGAACGTGCT GCATCTCATC CCAGCTGAAG

CTTCGTACGC-3 '

URA3-Crelox-3' (SEQ. ID. No. 34) 5 ' -TTAGTTTTGC TGGCCGCATC TTCTCAAATA TGCTTCCCAG GCATAGGCCA CTAGTG- GATC TG-3'

Zur Integration an den LEU2 Genlocus :

LEU2-Crelox-5' (SEQ. ID. No. 35):

5 ' -GAATACTCAG GTATCGTAAG ATGCAAGAGT TCGAATCTCT CCAGCTGAAG

CTTCGTACGC-3 '

LEU2-Crelox-3' (SEQ. ID. No. 36):

5 ' -TCTACCCTAT GAACATATTC CATTTTGTAA TTTCGTGTCG GCATAGGCCA CTAGTG- GATC TG-3'

Zur Integration an den HIS3 Genlocus :

HIS3-Crelox-5' (SEQ. ID. No. 37):

5 ' -ATGACAGAGC AGAAAGCCCT AGTAAAGCGT ATTACAAATG CCAGCTGAAG

CTTCGTACGC-3 '

HIS3-Crelox-3' (SEQ. ID. No. 38):

5 ' -CTACATAAGA ACACCTTTGG TGGAGGGAAC ATCGTTGGTA GCATAGGCCA CTAGTG- GATC TG-3'

Zur Integration an den ERG6 Genlocus :

ERG6-Crelox-5 ' (SEQ. ID. No. 39):

5 '-ATGAGTGAAA CAGAATTGAG AAAAAGACAG GCCCAATTCA CCAGCTGAAG

CTTCGTACGC-3 '

ERG6-Crelox-3 ' (SEQ. ID. No. 40):

5 ' -TTATTGAGTT GCTTCTTGGG AAGTTTGGGA GGGGGTTTCG GCATAGGCCA CTAGTG- GATC TG-3'

Zur Integration an den ERG5 Genlocus :

ERG5-Crelox-5' (SEQ. ID. No. 41):

5 ' -ATGAGTTCTG TCGCAGAAAA TATAATACAA CATGCCACTC CCAGCTGAAG

CTTCGTACGC-3 '

ERG5-Crelox-3 ' (SEQ. ID. No. 42):

5 ' -TTATTCGAAG ACTTCTCCAG TAATTGGGTC TCTCTTTTTG GCATAGGCCA CTAGTG- GATC TG-3'

Als Selektionsmarker diente die Resistenz gegen Geneticin (G418) . Die resultierenden Stämme enthielten eine Kopie des jeweiligen Zielgens ( tHMG, ERGl oder ERGll) unter der Kontrolle des ADH-Pro- motors und des Tryptophan-Terminators . Gleichzeitig war es mög- lieh, durch die Integration der Expressionskassette das jeweilige Gen des Ziellocus zu deletieren. Um das Gen für die Resistenz gegen G418 anschliessend wieder zu entfernen wurde der entstandene Hefestamm mit dem cre Rekombinase enthaltenden Vektor pSH47 (Gul- dener U, Heck S, Fielder T, Beinhauer J, Hegemann JH. (1996) A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Res. Jul 1;24 (13) :2519-24. ) transformiert. Durch diesen Vektor wurde die cre Rekombinase in der Hefe exprimiert, was zur Folge hatte, das der Sequenz-Bereich inner- halb der beiden loxP-Sequenzen heraus rekombinierte, was wiederum zur Folge hatte, das lediglich eine der beiden loxP-Sequenzen und die ADM-Promotor-ZielGen-Tryptophan-Terminator-Experssionskas- setten in dem Ziel-Genlocus enthalten blieb.

Die Folge ist, dass der Hefestamm seine G418-Resistenz wieder verliert und damit geeignet ist, weitere Gene mittels dieses "cre-lox" Systems in den Hefestamm zu integrieren bzw. zu entfernen. Der Vektor pSH47 kann daraufhin durch Anzucht auf FOA-Medium selektiv entfernt werden.

Somit ist es möglich nacheinander mehrere Zielgene in den Hefestamm unter der Kontrolle des ADHl-Promotors und Tryptophan-Ter- minators an verschiedene Zielloci zu integrieren.

Zunächst wird ein Zielgen an den URA3 Locus integriert bzw. wird ein ura3-Stamm verwendet, damit der Hefestamm Uracil auxotroph ist, da der Vektor pSH47 ein URA3 Gen zur Selektion Uracil-proto- tropher Stämme enthält . Abbildung 4 zeigt ein methodisches Beispiel.

Durch diese Methode wurden die in Tabelle 1 aufgelisteten Hefe- Integrations- bzw. Deletionsstämme hergestellt, wobei, in an sich bekannter Weise, das Gen in Kleinbuchstaben für eine Deletion, das Gen in Großbuchstaben für eine Integration steht.

Tabelle 1

Die Sterole und Squalen wurden nach 3 Tagen extrahiert (Parks LW, Bottema CD, Rodriguez RJ, Lewis TA. (1985) Yeast sterols: yeast mutants as tools for the study of sterol metabolism. Methods 0 Enzymol. 1985;111:333-46.) und mittels Gaschromatographie analysiert. Es ergaben sich folgende Werte (siehe Tabelle 2) .

Tabelle 2

1 = Squalen

2 = Lanosterol

3 = Dimethyl-Zymosterol

4 = Zymosterol

5 = Fecosterol

6 = Episterol

7 = Cholesta-7,24-dienol

8 = Cholesta-8-enol

9 = Cholesta-5,7,24 trienol

10 = 7-Dehydrocholesterol

11 = Ergosterol

Beispiel 2

Expression des heterologen Gens kodierend eine Δ8-Δ7-Isomerase

(Ebp) aus der Maus (Mus musculus) in Hefe

Die cDNA-Sequenz der Δ8-Δ7-Isomerase aus Mus musculus (Moebius, FF, Soellner, KEM, Fiechter, B., Huck, CW, Bonn, G. , Glossmann, H. (1999): Histidine77, Glutamic Acidl23, Threo- ninel26, Asparaginel94, and Tryptophanl97 of Human Emopamil Protein Are Required for in Vivo Sterol Δ8-Δ7 Ismerisation. Biochem. 38, 1119-1127.) wurde durch PCR aus dem cDNA-Klon IMAGp998A22757 (Host: E. coli DH10B) des Deutschen Resourcenzentrums für Genom- forschung GmbH (Berlin) amplifiziert.

Die hierbei verwendeten Primer sind die DNA-Oligo ere Ebp-5 ' (SEQ. ID. No. 43) und Ebp-3 ' (SEQ. ID. No . 44). Das erhaltene DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen Notl und Xhol be- handelt und anschliessend in den Vektor pFlat3 und pFlatl (Abbildung 4) , die zuvor ebenfalls mit den Enzymen Notl und XoJ behandelt wurden, mittels einer Ligase-Reaktion integriert. Die resultierenden Vektoren pFlatl-EBP und pFlat3-KBP (Abbildung 5a) enthalten das SBP-Gen unter der Kontrolle des ADH-Promotors und des Tryptophan-Terminators .

Der Expressionsvektor pFlat3-EBP wurde anschließend in die Hefestämme I bis VI der Tabelle 1 aus Beispiel 1 sowie in den Stamm GRFura3 transformiert. Die so gewonnenen Hefestämme wurden an- schliessend 48 Stunden lang in WMVIII- Medium bei 28°C und 160 rpm in einem 20 ml Kulturvolumen kultiviert. Anschliessend wurden 500 μl dieser Vorkultur in eine 50 ml Hauptkultur des gleichen Mediums überführt und für 3 Tage bei 28°C und 160 rpm in einem Schikanekolben kultiviert.

Die Sterole wurden wie in Beispiel 1 beschrieben nach 3 Tagen extrahiert und mittels Gaschromatographie analysiert. Der Einfluss der Expression einer Δ8-Δ7-Isomerase aus Mus musculus in Kombination mit der Expression der transkriptioneil deregulierten hefe- eigenen Gene tHMG und/oder ERGl und/oder ERGll und/oder der Deletion der hefeeigenen Gene ERG6 und ERG5 ist in Tabelle 3 aufgelistet. Die Abkürzungen bedeuten: - = Abnahme; 0 = keine Veränderung; / = nicht vorhanden; +, ++, +++, ++++ = angereichert bis stark angereichert.

Tabelle 3

20

1 = Squalen

2 = Lanosterol

3 = Dimethyl-Zymosterol

4 = Zymosterol 25 5 = Fecosterol

6 = Episterol

7 = Cholesta-7,24-dienol

8 = Cholesta-8-enol

9 = Cholesta-5,7,24 trienol 30 10 = 7-Dehydrocholesterol

11 = Ergosterol

Beispiel 3

Expression des heterologen Gens kodierend eine Δ5-Desaturase 35 (Sc5d) aus der Maus (Mus musculus) in Hefe

Die cDNA-Sequenz der Δ5-Desaturase aus Mus musculus (Nishi, S., Hideaki, N. , Ishibashi, T. (2000): cDNA cloning of the mammalian sterol C5-desaturase and the expression in yeast mutant. Biochim. 0 Biophys.A 1490, 106-108.) wurde durch PCR aus dem cDNA-Klon

IMAGp998Kl44618 (Host: E. coli DH10B) des Deutschen Resourcenzen- trums für Genomforschung GmbH (Berlin) amplifiziert. Die hierbei verwendeten Primer sind die DNA-Oligomere Sc5d-5' (SEQ. ID. No. 45) und Sc5d-3 ' (SEQ. ID. No. 46). Das erhaltene DNA-Fragment 5 wurde mit den Restriktionsenzymen iVotl und XhoJ behandelt und anschliessend in den Vektor pFlat3 (Abbildung 4) , der zuvor ebenfalls mit den Enzymen Notl und XhoJ behandelt wurde, mittels ei- ner Ligase-Reaktion integriert . Der resultierende Vektor pFlat3-_?C5D (Abbildung 5b) enthält das SC5r-Gen unter der Kontrolle des ADH-Promotors und des Tryptophan-Terminators .

5 Der Expressionsvektor pFlat3 -SC5D wurde anschliessend in die Hefestämme I bis VI der Tabelle 1 aus Beispiel 1 sowie in den Stamm GRFura3 transformiert . Die so gewonnenen Hefestämme wurden anschliessend 48 Stunden lang in WMVIII- Medium bei 28°C und 160 rpm in einem 20 ml Kulturvolumen kultiviert. Anschliessend wurden 10 500 μl dieser Vorkultur in eine 50 ml Hauptkultur des gleichen Mediums überführt und für 3 Tage bei 28°C und 160 rpm in einem Schikanekolben kultiviert .

Die Sterole wurden wie in Beispiel 1 beschrieben nach 3 Tagen ex- 15 trahiert und mittels Gaschromatographie analysiert. Der Einfluss der Expression einer Δ5-Desaturase aus Mus musculus in Kombination mit der Expression der transkriptioneil deregulierten hefeeigenen Gene tHMG und/oder ERGl und/oder ERGll und/oder der Deletion der hefeeigenen Gene ERG6 und ERG5 ist in Tabelle 4 aufgeli- 0 stet. Die Abkürzungen bedeuten: - = Abnahme; 0 = keine Veränderung; / = nicht vorhanden; +, ++, +++, ++++ = angereichert bis stark angereichert.

Tabelle 4

1 = Squalen 5 2 = Lanosterol

3 = Dimethyl-Zymosterol

4 = Zymosterol 5 = Fecosterol

6 = Episterol

7 = Cholesta-7,24-dienol

8 = Cholesta-8-enol

5 9 = Cholesta-5,7,24 trienol

10 = 7-Dehydrocholesterol

11 = Ergosterol

Beispiel 4 ^ Expression des heterologen Gens kodierend eine Δ24-Reduktase (D24R) aus der Maus (Mus musculus) in Hefe

Die cDNA-Sequenz der Δ24-Reduktase aus Mus musculus (Water- ham,HR, Koster, J., Romeijn,GJ , Hennekam,RC , Vreken, P. ,An-

¹⁵ dersson,HC , FitzPatrick,DR , Kelley,RI and Wanders,RJ ,

Mutations in the 3beta-Hydroxysterol Delta24-Reductase Gene Cause Desmosterolosis, an Autosomal Recessive Oisorder of Cholesterol Biosynthesis, Am. J. Hum. Genet. 69 (4), 685-694 (2001)) wurde durch PCR aus dem cDNA-Klon IMAGp998K179532 (Host: E. coli DH10B) des Deutschen Resourcenzentrums für Genomforschung GmbH (Berlin) amplifiziert .

Die hierbei verwendeten Primer sind die DNA-Oligomere D24R-5' (SEQ. ID. No. 47) und D24R-3 ' (SEQ. ID. No. 48). Das erhaltene

^ ⁵ DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen iVotJ und XhoJ behandelt und anschliessend in den Vektor pFlat4 (Abbildung 6) , der zuvor ebenfalls mit den Enzymen iVotl und XhoJ behandelt wurde, mittels einer Ligase-Reaktion integriert. Der resultierende Vektor pFlat4-Jλ24i? (Abbildung 5d) enthält das D24R-Gen unter der

³⁰ Kontrolle des AOHl-Promotors und des Tryptophan-Terminators .

Der Expressionsvektor pFlat4-D24R wurde anschliessend in die Hefestämme I bis VI der Tabelle 1 aus Beispiel 1 sowie in den Stamm GRFura3 transformiert. Die so gewonnenen Hefestämme wurden an-

³⁵ schliessend 48 Stunden lang in WMVIII- Medium bei 28°C und 160 rpm in einem 20 ml Kulturvolumen kultiviert. Anschliessend wurden 500 μl dieser Vorkultur in eine 50 ml Hauptkultur des gleichen Mediums überführt und für.3 Tage bei 28°C und 160 rpm in einem Schikanekolben kultiviert.

40

Die Sterole wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, nach 3 Tagen extrahiert und mittels Gaschromatographie analysiert. Der Ein- fluss der Expression einer Δ24-Reduktase aus Mus musculus in Kombination mit der Expression der transkriptionell deregulierten ⁵ hefeeigenen Gene tHMG und/oder ERGl und/oder ERGll und/oder der Deletion der hefeeigenen Gene ERG6 und ERG5 ist in Tabelle 5 aufgelistet. Die Abkürzungen bedeuten: - = Abnahme; 0 = keine Verän- derung; / = nicht vorhanden; +, ++, +++, ++++ = angereichert bis stark angereichert.

Tabelle 5

1 = Squalen

2 = Lanosterol

3 = Dimethyl-Zymosterol

4 = Zymosterol

5 = Fecosterol

6 = Episterol

7 = Cholesta-7 , 24-dienol

8 = Cholesta-8-enol

9 = Cholesta-5,7,24 trienol

10 = 7-Dehydrocholesterol

11 = Ergosterol

Beispiel 5

Gemeinsame Expression der heterologen Gene kodierend eine Δ8-Δ7 Isomerase (Ebp) aus der Maus (Mus musculus) und eine C5-Desatu- rase (Sc5d) aus der Maus (Mus musculus) in Hefe

Die Expressionsvektoren pFlatl-EBP (aus Beispiel 2) und pFlat3-.£7C5D (aus Beispiel 3) wurden in die Hefestämme I bis VI der Tabelle 1 aus Beispiel 1 sowie in den Stamm GRFura3 transformiert. Die so gewonnenen Hefestämme wurden anschliessend 48 Stun- den lang in WMVIII- Medium bei 28°C und 160 rpm in einem 20 ml Kulturvolumen kultiviert. Anschliessend wurden 500 μl dieser Vorkultur in eine 50 ml Hauptkultur des gleichen Mediums überführt und für 3 Tage bei 28°C und 160 rpm in einem Schikanekolben kultiviert .

Die Sterole wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, nach 3 Tagen 5 extrahiert und mittels Gaschromatographie analysiert. Der Ein- fluss der Expression einer Δ8-Δ7 Isomerase und einer C5-Desatu- rase aus Mus musculus in Kombination mit der Expression der transkriptionell deregulierten hefeeigenen Gene tHMG und/oder ERGl und/oder ERGll und/oder der Deletion der hefeeigenen Gene 10 ERG6 und ERGS ist in Tabelle 6 aufgelistet. Die Abkürzungen bedeuten: - = Abnahme; 0 = keine Veränderung; / = nicht vorhanden; +, ++, +++, ++++ = angereichert bis stark angereichert.

Tabelle 6

1 = Squalen 0 2 = Lanosterol

3 = Dimethyl-Zymosterol

4 = Zymosterol

5 = Fecosterol

6 = Episterol 5 7 = Cholesta-7,24-dienol

8 = Cholesta-8-enol

9 = Cholesta-5,7,24 trienol 10 = 7-Dehydrocholesterol

11 = Ergosterol

Beispiel 6 ⁵ Gemeinsame Expression der heterologen Gene kodierend eine Δ8-Δ7 Isomerase (Ebp) aus der Maus (Mus musculus) , kodierend eine C5-Desaturase (Sc5d) aus der Maus (Mus musculus) und eine Δ24-Re- duktase aus der Maus (Mus musculus) in Hefe

**' Die ExpressionsVektoren pFlatl-EBP (aus Beispiel 2) und pFlat3-.SC5£> (aus Beispiel 3) und pFlat4-D24R (aus Beispiel 4) wurden in die Hefestämme I bis VI der Tabelle 1 aus Beispiel 1 sowie in den Stamm GRFura3 transformiert. Die so gewonnenen Hefestämme wurden anschliessend 48 Stunden lang in WMVIII- Medium bei

15 28°C und 160 rpm in einem 20 ml Kulturvolumen kultiviert. Anschliessend wurden 500 μl dieser Vorkultur in eine 50 ml Hauptkultur des gleichen Mediums überführt und für 3 Tage bei 28°C und 160 rpm in einem Schikanekolben kultiviert.

20 Die Sterole wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, nach 3 Tagen extrahiert und mittels Gaschromatographie analysiert. Der Ein- fluss der Expression einer Δ8-Δ7 Isomerase, einer C5-Desaturase und einer Δ24-Reduktase aus Mus musculus in Kombination mit der Expression der transkriptioneil deregulierten hefeeigenen Gene

25 tHMG und/oder ERGl und/oder ERGll und/oder der Deletion der he- feeigenen Gene ERG6 und ERG5 ist in Tabelle 7 aufgelistet. Die Abkürzungen bedeuten: - = Abnahme; 0 = keine Veränderung; / = nicht vorhanden; +, ++, +++, ++++ = angereichert bis stark angereichert . 0

Tabelle 7

5