gene

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は遺伝子に関し、詳しくはベンゼンまたはその誘導体からカテコール類を生産しうる微生物の保持する遺伝子に関する。

［従来の技術とその問題点］ 本発明者らは、カテコールの製造に関する研究過程において、カテコール生産菌、たとえばシュードモナス・エスピー136R-3(FERM P-6970）よりベンゼンオキシゲナーゼおよびベンゼングリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を少なくとも含む遺伝子領域を組換え体DNAにより単離した（特願昭59-270653）。 しかし、該遺伝子の詳細な構造などは不明であった。

そこで、さらに研究を重ねた結果、その遺伝子領域のDN
A配列の詳細な構造を特定することに成功したのである。

［問題点を解決するための手段］ すなわち本発明は、少なくとも下記の酵素蛋白のアミノ酸配列をコードする領域Ｉ，II，IIIおよびIVを含む遺伝子に関する。

このDNAは、そのDNA鎖中に制限酵素EcoRI，SalI，Pst
I，HindIIIで切断される個所があり、たとえばSalIによる切断部位は1829番目のＧと1830番目のＴの間であり、
PstIによる切断部位は2133番目のＣと2134番目のＴの間、4025番目のＣと4026番目のＴの間および5269番目のＣと5270番目のＴとの間である。 また、HindIIIによる切断部位は2172番目のＡと2173番目のＡの間である。

本発明の遺伝子は、次のようにして調製することができる。 ベンゼンオキシゲナーゼおよびベンゼングリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を有するカテコール類生産菌、
たとえばシュードモナス属に属し、カテコール類の分解酵素が欠失もしくは低活性化した変異株（たとえばシュードモナス・エスピー136R-3、FERM P-6970）から上記両遺伝子を含む遺伝子領域を常法（たとえばＪ．Bacter
iol. 89 ,1065(1965など）により取出し、制限酵素Sau 3A
で部分的に切断して必要なDNA断片（分子量約30Kb）を得る。 一方、広宿主域プラスミドRSF1010由来のコスミドpMMB 33(Gene 24 ,299(1983））等をプラスミドベクターとして用い、これを制限酵素SmaI,HpaIで別々に切断し、混合後、BamHIで切断し、前記DNA断片と混合してT4
DNAリガーゼで連結する。 次いで、これを大腸菌（エシェリヒア・コリ）に感染するウィルス、ラムダ・ファージの殻に包み込み（in vitro packaging）、大腸菌に感染させ、染色体DNAを組込んだコスミドをもつ大腸菌クローンを取得する（たとえば大腸菌SI-300、FERM p-135
8）。

この大腸菌が保持するコスミドpGR 300を制限酵素EcoRI
で切断して得たDNA断片を、制限酵素EcoRIで切断したプラスミドPUC 8(Gene 19 ,259(1982））に連結し、大腸菌
JM83株に形質転換し、カテコール類生産能を保持する大腸菌を選択する。

この大腸菌形質転換体よりプラスミドを抽出し、種々の制限酵素による切断解析を行ない、制限酵素地図を作成する。 次いで、これに基づき制限酵素による切断およびエキソヌクレアーゼBal-31を用いて欠失誘導体を作成し、各欠失プラスミドを保持する大腸菌JM83株を用いて目的とする遺伝子を含む領域を求める。

このようにして得た遺伝子領域の塩基配列をM13ファージ・ジデオキシ法により決定した。

この塩基配列から蛋白質をコードする領域を検索して４
または５の領域の存在を確認した。

領域Ｉ 第617〜619番目のATG配列から第1961〜1963番目のTGA配列までの配列ベースを有する分子量50,208（448アミノ酸）の領域 領域II 第2070〜2072番目のATG配列から第2631〜2633番目のTAG
配列までの配列ベースを有する分子量22,103（187アミノ酸）の領域 領域III 第2963〜2965番目のATG配列から第4190〜4192番目のTGA
配列までの配列ベースを有する分子量42,819（409アミノ酸）の領域 領域IV 第4519〜4521番目のATG配列から第5014〜5016番目のTGA
配列までの配列ベースを有する分子量17,221（165アミノ酸）の領域 領域Ｖ 第2688〜2690番目のATG配列から第2961〜2963番目のTGA
配列までの配列ベースを有する91アミノ酸）の領域 ［発明の効果］ 上記酵素蛋白のアミノ酸配列をコードする領域Ｉ，II，
IIIおよびIVを少なくとも含む遺伝子は、該遺伝子を担ったプラスミドを保持する原核生物細胞（たとえば大腸菌）の造成に用いられ、該細胞を使用してベンゼン類（ベンゼンのほかアルキル基，置換アルキル基，カルボキシル基、アルデヒド基、ハロゲン原子などが導入された置換ベンゼン）からカテコールまたはその誘導体を製造することができる。 このカテコール類は合成中間体としての利用のほか酸化防止剤，殺菌剤，消毒剤，香料，
現像剤，分析用試薬などとして有用である。

［実施例］ 次に、本発明を実施例により説明する。

実施例 （１）ベンゼンオキシゲナーゼおよびベンゼングリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子をコードする遺伝子領域の特定 ベンゼンオキシゲナーゼおよびベンゼングリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を担ったコスミドpGR 300（大腸菌S
I-300、FERM p-1358が保持している）を制限酵素EcoRI
で切断した。 得られたDNA断片を、制限酵素EcoRIで切断したプラスミドpUC 8(Gene 19 ,259(1982））に連結し、
大腸菌JM83株に形質転換し、カテコール類生産能を保持する大腸菌を選択した。 なお、上記制限酵素切断条件，
連結反応条件，形質転換等の組換えDNA技術は常法（たとえばT.Maniatis,EFFitsh,J.Sambrook,Molecular Cl
oning,Cold Spring Harber Laboratory 刊、1982年）
にしたがった。

上記の如くして得られた大腸菌形質転換体よりプラスミドを抽出し、種々の制限酵素よる切断解析を行ない、制限酵素地図を作成した。 この地図に基いて制限酵素による切断およびエキソヌクレアーゼBal-31を使用するこによって欠失誘導体を作成した（第２図）。

各欠失プラスミドを保持する大腸菌JM83株を100μｇ／m
lのアンピシリンを含むLB培地10ml中で37℃にて12時間培養した。 しかる後、集菌し、50mMリン酸緩衝液（pH7.
3）１mlに懸濁し、ベンゼン０．５％を加え、30℃で12
時間休止菌体反応を行ない、蓄積したカテコールをアミノアンチピリン法（Biochem.J., 73 ,16(1959））により定量した。 結果を下表に示す。

保持プラスミド 蓄積カテコール量（mg／） pGR １０２ ２１５ pGR １１５ ３５０ pGR １０６ ＜１ pGR １０５ ＜１ 上記の結果よりカテコール生産遺伝子はpGR 115上の約５．３Kbに含まれると推定した。

（２）カテコール生産遺伝子の構造解析 前記（１）において特定した遺伝子領域の塩基配列をM1
3ファージ・ジデオキシ法（宝酒造（株）製キット使用）により決定した。 その結果を第１図に示す。

この塩基配列に基づいて酵素蛋白質をコードする遺伝子領域を検索したところ、少なくとも下記の４つの領域の存在を確認した。

領域Ｉ 第617〜619番目のATG配列から第1961〜1963番目のTGA配列までの配列ベースを有する分子量50,208（448アミノ酸）の領域 領域II 第2070〜2072番目のATG配列から第2631〜2633番目のTAG
配列までの配列ベースを有する分子量22,103（187アミノ酸）の領域 領域III 第2963〜2965番目のATG配列から第4190〜4192番目のTGA
配列までの配列ベースを有する分子量42,819（409アミノ酸）の領域 領域IV 第4519〜4521番目のATG配列から第5014〜5016番目のTGA
配列までの配列ベースを有する分子量17,221（165アミノ酸）の領域 （３）カテコール生産遺伝子のコードする蛋白質の同定 上記遺伝子を含むプラスミドおよび制限酵素を利用した欠失誘導体を用いてプラスミドDNAからin vitro翻訳系（Amersham社製キット）により蛋白質を合成させ、SDS
ポリアクリルアミド電気泳動し、分子量測定およびそのマッピングを行なった。 その結果、下記の如く、塩基配列から推定される蛋白質コード領域とほぼ一致した。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の遺伝子の塩基配列であり、第２図は欠失誘導体の制限酵素地図である。

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