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细胞色素P450和细胞色素P450还原酶多肽、编码核酸分子及其用途
申请号 CN201380068127.0 申请日 2013-10-31 公开(公告)号 CN105121647A 公开(公告)日 2015-12-02
申请人 不列颠哥伦比亚大学; 西澳大利亚大学; 发明人 卡尔·约尔格·伯尔曼; 马里亚·路易莎·迪亚兹沙韦; 杰西·莫尼奥迪斯;
摘要 提供了细胞色素P450多肽，包括细胞色素P450檀香烯 氧 化酶 多肽、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽和细胞色素P450还原酶多肽。还提供了编码所述细胞色素P450多肽的核酸分子。提供了包含所述核酸和/或所述多肽的细胞，以及通过培养所述细胞来产生萜(例如檀香醇和香柠檬醇)的方法。
权利要求

1.宿主细胞，其包含编码细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性部分的核酸分子，其中：
所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性部分表现出与SEQ ID NO：50或其相应的催化活性部分至少65％的序列同一性；
所编码的细胞色素P450氧化酶或其催化活性片段催化檀香烯和/或香柠檬烯的羟基化或单加氧化；并且
所述核酸分子对于所述宿主细胞是异源的。
2.权利要求1所述的宿主细胞，其中所编码的全长细胞色素P450氧化酶多肽表现出与SEQ ID NO：50至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
3.权利要求1或权利要求2所述的宿主细胞，其中所编码的全长细胞色素P450氧化酶多肽表现出与SEQ ID NO：50至少90％的序列同一性。
4.权利要求1至3中任一项所述的宿主细胞，其中所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性部分是檀香属(Santalum)P450氧化酶多肽。
5.权利要求1至4中任一项所述的宿主细胞，其中所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性部分是檀香(Santalum album)P450氧化酶多肽。
6.权利要求1至5中任一项所述的宿主细胞，其中所述细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段是CYP76家族的成员。
7.权利要求1至6中任一项所述的宿主细胞，其中：
所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段包含SEQ ID NO：7、74、75、76或
77中所示氨基酸序列；或者
所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段包含表现出与SEQ ID NO：7、
74、75、76或77中所示细胞色素P450氧化酶多肽至少65％序列同一性的氨基酸序列；并且所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段催化檀香烯和/或香柠檬烯的羟基化或单加氧化。
8.权利要求7所述的宿主细胞，其中所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段表现出与SEQ ID NO：7、74、75、76或77中所示氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。
9.权利要求8所述的宿主细胞，其中所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段表现出与SEQ ID NO：7、74、75、76或77中所示氨基酸序列至少90％的氨基酸序列同一性。
10.权利要求1至9中任一项所述的宿主细胞，其中所述细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段包含SEQ ID NO：7、74、75、76或77中所示氨基酸序列。
11.权利要求1至10中任一项所述的宿主细胞，其中所述核酸分子包含选自以下的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：3、68、69、70或71中任意一个中所示核酸序列；
(b)与SEQ ID NO：3、68、69、70或71中任意一个中所示核酸序列具有至少65％序列同一性的核酸序列；以及
(c)(a)和(b)的简并序列。
12.权利要求1至11中任一项所述的宿主细胞，其中所述核酸分子包含与SEQ ID NO：
3、68、69、70或71中任意一个中所示核酸序列具有至少98％序列同一性的核苷酸序列。
13.权利要求11所述的宿主细胞，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO：3、68、69、70或
71中任意一个中所示核酸序列。
14.权利要求1至13中任一项所述的宿主细胞，其中所述细胞色素P450氧化酶多肽或催化活性片段催化檀香烯的羟基化或单加氧化。
15.权利要求1至14中任一项所述的宿主细胞，其中所述细胞色素P450氧化酶多肽或催化活性片段催化檀香烯和香柠檬烯的羟基化或单加氧化。
16.权利要求1至15中任一项所述的宿主细胞，其中所述细胞色素P450氧化酶多肽或催化活性片段催化从檀香烯形成檀香醇以及从香柠檬烯形成香柠檬醇。
17.权利要求1至16中任一项所述的宿主细胞，其中所述细胞色素P450氧化酶多
肽或催化活性片段催化从α-檀香烯形成α-檀香醇、从β-檀香烯形成β-檀香醇、从表-β-檀香烯形成表-β-檀香醇以及从α-反式-香柠檬烯形成α-反式-香柠檬醇。
18.权利要求17所述的宿主细胞，其中所述檀香醇是(E)-α-檀香醇、(Z)-α-檀香醇、(E)-β-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(E)-表-β-檀香醇或(Z)-表-β-檀香醇。
19.权利要求17所述的宿主细胞，其中所述香柠檬醇是(Z)-α-反式-香柠檬醇或
(E)-α-反式-香柠檬醇。
20.权利要求1至6中任一项所述的宿主细胞，其中：
所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段包含SEQ ID NO：6、8、9或73中所示氨基酸序列；或
所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段包含表现出与SEQ ID NO：6、8、
9或73中所示细胞色素P450氧化酶多肽至少65％序列同一性的氨基酸序列；并且
所述细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段催化香柠檬烯的羟基化或单加氧
化。
21.权利要求20所述的宿主细胞，其中所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段包含表现出与SEQ ID NO：6、8、9或73中所示氨基酸序列至少70％、75％、80％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
22.权利要求21所述的宿主细胞，其中所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段表现出与SEQ ID NO：6、8、9或73中所示氨基酸序列至少90％的氨基酸序列同一性。
23.权利要求1至6或20中任一项所述的宿主细胞，其中所述细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段包含SEQ ID NO：6、8、9或73中所示氨基酸序列。
24.权利要求1至6或20至23中任一项所述的宿主细胞，其中所述核酸分子包含选自以下的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：2、4、5或67中任意一个中所示核酸序列；
(b)与SEQ ID NO：2、4、5或67中任意一个中所示核酸序列具有至少65％序列同一性的核酸序列；以及
(c)(a)和(b)的简并序列。
25.权利要求24所述的宿主细胞，其中所述核酸序列与SEQ ID NO：2、4、5或67中任意一个中所示核酸序列具有至少98％的序列同一性。
26.权利要求24所述的宿主细胞，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO：2、4、5或67中任意一个中所示核酸序列。
27.权利要求1至6或20至26中任一项所述的宿主细胞，其中所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段催化香柠檬烯的羟基化或单加氧化。
28.权利要求1至6或20至27中任一项所述的宿主细胞，其中所编码的细胞色素
P450氧化酶或其催化活性片段催化从α-反式-香柠檬烯形成(Z)-α-反式-香柠檬醇或(E)-α-反式-香柠檬醇。
29.权利要求1至6或20至28中任一项所述的宿主细胞，其中所编码的P450氧化酶
或其催化活性片段不催化檀香烯的羟基化。
30.权利要求1至6或20至29中任一项所述的宿主细胞，其中所述细胞色素P450氧
化酶或其催化活性片段催化檀香烯的羟基化。
31.权利要求1至30中任一项所述的宿主细胞，其包含编码细胞色素P450还原酶或其催化活性部分的核酸分子，其中：
所编码的细胞色素P450还原酶或其催化活性部分表现出与SEQ ID NO：12或13中所示细胞色素P450还原酶多肽至少80％的序列同一性；
所编码的细胞色素P450还原酶多肽或其催化活性片段催化2个电子从NADPH转移至
电子受体；并且
所述核酸分子对于所述宿主细胞是异源的。
32.宿主细胞，其包含编码细胞色素P450还原酶或其催化活性部分的核酸分子，其中：
所编码的细胞色素P450还原酶或其催化活性部分表现出与SEQ ID NO：12或13中所示细胞色素P450还原酶多肽或其相应的催化活性部分至少80％的序列同一性；
所编码的细胞色素P450还原酶多肽或其催化活性片段催化2个电子从NADPH转移至
电子受体；并且
所述核酸分子对于所述宿主细胞是异源的。
33.权利要求31或权利要求32所述的宿主细胞，其中所编码的细胞色素P450还原酶多肽或其催化活性片段表现出与SEQ ID NO：12或13中所示氨基酸序列至少85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。
34.权利要求33所述的宿主细胞，其中所编码的细胞色素P450还原酶多肽或其催化活性片段表现出与SEQ ID NO：12或13中所示氨基酸序列至少90％的氨基酸序列同一性。
35.权利要求31至34中任一项所述的宿主细胞，其中所编码的细胞色素P450还原酶多肽或其催化活性部分是檀香属P450还原酶多肽。
36.权利要求31至35中任一项所述的宿主细胞，其中所编码的细胞色素P450还原酶多肽或其催化活性部分是檀香P450氧化酶多肽。
37.权利要求31至36中任一项所述的宿主细胞，其中所编码的细胞色素P450还原酶多肽或其催化活性片段包含与SEQ ID NO：12或13中所示细胞色素P450还原酶多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
38.权利要求31至37中任一项所述的宿主细胞，其中所编码的细胞色素P450还原酶多肽或其催化活性片段包含SEQ ID NO：12或13中所示氨基酸序列。
39.权利要求31至38中任一项所述的宿主细胞，其中所述编码细胞色素P450还原酶多肽或其催化活性片段的核酸分子选自包含以下的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：10或11中所示核酸序列；
(b)与SEQ ID NO：10或11中所示核酸序列具有至少85％序列同一性的核酸序列；以及
(c)(a)和(b)的简并序列。
40.权利要求39所述的宿主细胞，其中所述编码细胞色素P450还原酶多肽或其催化活性片段的核酸分子包含与SEQ ID NO：10或11中所示核酸序列具有至少95％序列同一性的核酸序列。
41.权利要求39所述的宿主细胞，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO：10或11中所示核酸序列。
42.权利要求31至36中任一项所述的宿主细胞，其中所编码的细胞色素P450还原酶多肽是包含以下序列的催化活性片段：SEQ ID NO：14或15中所示氨基酸序列，或者表现出与SEQ ID NO：14或15中所示氨基酸序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的序列。
43.权利要求31至36或42中任一项所述的宿主细胞，其中所述核酸分子编码选自包含以下的核苷酸序列的催化活性片段：
(a)SEQ ID NO：63或64中所示核酸序列；
(b)与SEQ ID NO：63或64中所示核酸序列具有至少95％序列同一性的核酸序列；以及
(c)(a)和(b)的简并序列。
44.权利要求31至43中任一项所述的宿主细胞，其中所述电子受体是细胞色素P450、血红素加氧酶、细胞色素b5或角鲨烯环氧酶。
45.权利要求44所述的宿主细胞，其中所述电子受体是细胞色素P450。
46.权利要求1至45中任一项所述的宿主细胞，其还包含编码产生细胞色素P450的萜底物的合酶的核酸，其中所述合酶对于所述宿主细胞是异源的。
47.权利要求46所述的宿主细胞，其中所编码的萜合酶是檀香烯合酶。
48.权利要求46或权利要求47所述的宿主细胞，其中所编码的萜合酶催化檀香烯和/或香柠檬烯的形成。
49.权利要求46至48中任一项所述的宿主细胞，其中所编码的萜合酶是包含以下氨基酸序列的檀香烯合酶：SEQ ID NO：17、52或53中任意一个中所示氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：17、52或53的任意一个具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，或者其催化活性片段。
50.权利要求46至49中任一项所述的宿主细胞，其中所编码的萜合酶是包含SEQ ID NO：17、52或53中任意一个中所示氨基酸序列的檀香烯合酶。
51.权利要求46至50中任一项所述的宿主细胞，其中所述核酸分子编码为檀香烯合酶的萜合酶并且所述核酸分子包含SEQ ID NO：58至60中任意一个中所示核苷酸序列。
52.权利要求1至51中任一项所述的宿主细胞，其包含：
(a)编码细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性部分的核酸分子，其中：
所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性部分表现出与SEQ ID NO：50至少
65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性；
所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段催化檀香烯和/或香柠檬烯的羟基化或单加氧化；并且
所述核酸分子对于所述宿主细胞是异源的；
(b)编码细胞色素P450还原酶或其催化活性部分的核酸分子，其中：
所述核酸分子对于所述宿主细胞是异源的；并且
所编码的细胞色素P450还原酶或其催化活性部分包含SEQ ID NO：12至15中所示氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：12至15中所示细胞色素P450还原酶多肽具有至少80％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；以及
(c)编码檀香烯合酶的核酸分子，其中：
所述核酸分子对于所述宿主细胞是异源的；并且
所编码的檀香烯合酶包含SEQ ID NO：17、52或53中任意一个中所示氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：17、52或53的任意一个具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，或者其催化活性片段。
53.宿主细胞，其包含：
(a)编码细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性部分的核酸分子，其中：
所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性部分表现出与SEQ ID NO：50至少
65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性；
所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段催化檀香烯和/或香柠檬烯的羟基化或单加氧化；
(b)编码细胞色素P450还原酶或其催化活性部分的核酸分子，其中所编码的细胞色素P450还原酶或其催化活性部分包含SEQ ID NO：12至15中所示氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：12至15中所示细胞色素P450还原酶多肽具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；以及
(c)编码檀香烯合酶的核酸分子，其中所编码的檀香烯合酶包含SEQ ID NO：17、52或
53中任意一个中所示氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：17、52或53的任意一个具有至少
80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％同一性的氨基酸序列，或者其催化活性片段，其中：
(a)或(b)中所示核酸分子中至少一种对于所述宿主细胞是异源的。
54.权利要求52或权利要求53所述的宿主细胞，其中所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性部分包含SEQ ID NO：6至9或73至77中所示氨基酸序列，或者表现出与SEQ ID NO：6至9或73至77中所示细胞色素P450氧化酶多肽至少65％、70％、75％、
80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％序列同一性的氨基酸序列。
55.权利要求52至54中任一项所述的宿主细胞，其中所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段包含SEQ ID NO：7、74、75、76或77中所示氨基酸序列，或者表现出与SEQ ID NO：7、74、75、76或77中所示细胞色素P450氧化酶多肽至少65％、70％、75％、
80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％序列同一性的氨基酸序列。
56.权利要求52至54中任一项所述的宿主细胞，其中所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段包含SEQ ID NO：6、8、9或73中所示氨基酸序列，或者表现出与SEQ ID NO：6、8、9或73中所示细胞色素P450氧化酶多肽至少65％、70％、75％、80％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
57.权利要求1至56中任一项所述的宿主细胞，其是原核细胞或真核细胞。
58.权利要求1至57中任一项所述的宿主细胞，其选自细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
59.权利要求1至58中任一项所述的宿主细胞，其是酵母细胞。
60.权利要求59所述的宿主细胞，其是酵母属(Saccharomyces)细胞或毕赤酵母属
(Pichia)细胞。
61.权利要求1至60中任一项所述的宿主细胞，其是酿酒酵母(Saccharomyces
cerevisiae)细胞。
62.权利要求1至58中任一项所述的宿主细胞，其是大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。
63.权利要求1至62中任一项所述的宿主细胞，其产生非环状焦磷酸酯萜前体。
64.权利要求63所述的宿主细胞，其中所述非环状焦磷酸酯萜前体是法尼二磷酸。
65.权利要求1至64中任一项所述的宿主细胞，其天然地产生法尼二磷酸或者被修饰成与未修饰细胞相比产生更多的法尼二磷酸。
66.分离的核酸分子，其编码细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性部分，其中：
所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性部分表现出与SEQ ID NO：50至少
65％的序列同一性；并且
所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段催化檀香烯和/或香柠檬烯的羟基化或单加氧化。
67.编码细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性部分的核酸分子，其中：
所述核酸分子是cDNA；
所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性部分表现出与SEQ ID NO：50或其相应的催化活性部分至少65％的序列同一性；并且
所编码的细胞色素P450氧化酶或其催化活性片段催化檀香烯和/或香柠檬烯的羟基化或单加氧化。
68.权利要求66或权利要求67所述的核酸分子，其中所编码的全长细胞色素P450
氧化酶多肽表现出与SEQ ID NO：50至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
69.权利要求68所述的核酸分子，其中所述所编码的全长细胞色素P450氧化酶多肽表现出与SEQ ID NO：50至少90％的序列同一性。
70.权利要求66至69中任一项所述的核酸分子，其中所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性部分是檀香属P450氧化酶多肽。
71.权利要求66至70中任一项所述的核酸分子，其中所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性部分是檀香P450氧化酶多肽。
72.权利要求66至71中任一项所述的核酸分子，其中所述P450氧化酶或其催化活性片段是CYP76家族的成员。
73.权利要求66至72中任一项所述的核酸分子，其中：
所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段包含SEQ ID NO：7、74、75、76或
77中所示氨基酸序列；或者
所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段包含表现出与SEQ ID NO：7、
74、75、76或77中所示细胞色素P450氧化酶多肽至少65％序列同一性的氨基酸序列；并且所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段催化檀香烯和/或香柠檬烯的羟基化或单加氧化。
74.权利要求73所述的核酸分子，其中所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段表现出与SEQ ID NO：7、74、75、76或77中所示氨基酸序列至少70％、75％、80％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。
75.权利要求74所述的核酸分子，其中所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段表现出与SEQ ID NO：7、74、75、76或77中所示氨基酸序列至少90％的序列同一性。
76.权利要求66至73中任一项所述的核酸分子，其中所述细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段包含SEQ ID NO：7、74、75、76或77中所示氨基酸序列。
77.权利要求66至76中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含选自以下的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：3、68、69、70或71中任意一个中所示核酸序列；
(b)与SEQ ID NO：3、68、69、70或71中任意一个中所示核酸序列具有至少65％序列同一性的核酸序列；以及
(c)(a)和(b)的简并序列。
78.权利要求77所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含与SEQ ID NO：3、68、69、70或
71中任意一个中所示核酸序列具有至少98％序列同一性的核酸序列。
79.权利要求77所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO：3、68、69、70或
71中任意一个中所示核酸序列。
80.权利要求66至79中任一项所述的核酸分子，其中所述细胞色素P450氧化酶多肽或催化活性片段催化檀香烯的羟基化或单加氧化。
81.权利要求65至78中任一项所述的核酸分子，其中所述细胞色素P450氧化酶多肽或催化活性片段催化檀香烯和香柠檬烯的羟基化或单加氧化。
82.权利要求66至81中任一项所述的核酸分子，其中所述细胞色素P450氧化酶多肽或催化活性片段催化从檀香烯形成檀香醇以及从香柠檬烯形成香柠檬醇。
83.权利要求66至82中任一项所述的核酸分子，其中所述细胞色素P450氧化酶多
肽或催化活性片段催化从α-檀香烯形成α-檀香醇、从β-檀香烯形成β-檀香醇、从表-β-檀香烯形成表-β-檀香醇以及从α-反式-香柠檬烯形成α-反式-香柠檬醇。
84.权利要求83所述的核酸分子，其中所述檀香醇是(E)-α-檀香醇、(Z)-α-檀香醇、(E)-β-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(E)-表-β-檀香醇或(Z)-表-β-檀香醇。
85.权利要求83所述的核酸分子，其中所述香柠檬醇是(Z)-α-反式-香柠檬醇或
(E)-α-反式-香柠檬醇。
86.权利要求66至72中任一项所述的核酸分子，其中：
所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段包含SEQ ID NO：6、8、9或73中所示氨基酸序列；或
所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段包含表现出与SEQ ID NO：6、8、
9或73中所示细胞色素P450氧化酶多肽至少65％序列同一性的氨基酸序列；并且
所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段催化香柠檬烯的羟基化或单加氧化。
87.权利要求86所述的核酸分子，其中所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段包含表现出与SEQ ID NO：6、8、9或73中所示氨基酸序列至少70％、75％、80％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
88.权利要求87所述的核酸分子，其中所编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段包含表现出与SEQ ID NO：6、8、9或73中所示氨基酸序列至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
89.权利要求66至72或86中任一项所述的核酸分子，其中所述细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段包含SEQ ID NO：6、8、9或73中所示氨基酸序列。
90.权利要求66至72或86至89中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含选自以下的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：2、4、5或67中任意一个中所示核酸序列；
(b)与SEQ ID NO：2、4、5或67中任意一个中所示核酸序列具有至少65％序列同一性的核酸序列；以及
(c)(a)和(b)的简并序列。
91.权利要求90所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含与SEQ ID NO：2、4、5或67中任意一个中所示核酸序列具有至少98％序列同一性的核酸序列。
92.权利要求90所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO：2、4、5或67中任意一个中所示核酸序列。
93.权利要求66至72或86至92中任一项所述的核酸分子，其中所编码的细胞色素
P450氧化酶多肽或其催化活性片段催化香柠檬烯的羟基化或单加氧化。
94.权利要求66至72或86至93中任一项所述的核酸分子，其中所编码的细胞色素
P450氧化酶或其催化活性片段催化从α-反式-香柠檬烯形成(Z)-α-反式-香柠檬醇或(E)-α-反式-香柠檬醇。
95.权利要求66至72或86至94中任一项所述的核酸分子，其中所编码的细胞色素
P450氧化酶或其催化活性片段不催化檀香烯的羟基化。
96.权利要求66至72或86至94中任一项所述的核酸分子，其中所述细胞色素P450
氧化酶或其催化活性片段催化檀香烯的羟基化。
97.由权利要求66至96中任一项所述的核酸分子编码的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性部分，其中所述细胞色素P450氧化酶或其催化活性片段催化檀香烯和/或香柠檬烯的羟基化或单加氧化。
98.权利要求97所述的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性部分，其包含SEQ ID NO：7、74、75、76或77中所示氨基酸序列，或者表现出与SEQ ID NO：7、74、75、76或77中所示细胞色素P450氧化酶多肽至少65％序列同一性的氨基酸序列，其中所述细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段催化檀香烯和/或香柠檬烯的羟基化或单加氧化。
99.权利要求97所述的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性部分，其包含SEQ ID NO：6、8、9或73中所示氨基酸序列，或者表现出与SEQ ID NO：6、8、9或73中所示细胞色素P450氧化酶多肽至少65％序列同一性的氨基酸序列，其中所述细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段催化香柠檬烯的羟基化或单加氧化。
100.分离的核酸分子，其编码细胞色素P450还原酶或其催化活性部分，其中：
所编码的细胞色素P450还原酶或其催化活性部分表现出与SEQ ID NO：12或13中所示细胞色素P450还原酶多肽至少80％的序列同一性；并且
所编码的细胞色素P450还原酶多肽或其催化活性片段催化2个电子从NADPH转移至
电子受体。
101.编码细胞色素P450还原酶或其催化活性部分的核酸分子，其中：
所述核酸分子是cDNA；
所编码的细胞色素P450还原酶或其催化活性部分表现出与SEQ ID NO：12或13中所示细胞色素P450还原酶多肽至少80％的序列同一性；并且
所编码的细胞色素P450还原酶多肽或其催化活性片段催化2个电子从NADPH转移至
电子受体。
102.权利要求100或权利要求102所述的核酸分子，其中所编码的细胞色素P450还原酶多肽或其催化活性片段表现出与SEQ ID NO：12或13中所示氨基酸序列至少85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。
103.权利要求100至102中任一项所述的核酸分子，其中所编码的细胞色素P450还原酶多肽或其催化活性部分是檀香属P450还原酶多肽。
104.权利要求100至103中任一项所述的核酸分子，其中所编码的细胞色素P450还原酶多肽或其催化活性部分是檀香P450氧化酶多肽。
105.权利要求100至104中任一项所述的核酸分子，其中所编码的细胞色素P450还原酶多肽或其催化活性片段包含与SEQ ID NO：12或13中所示细胞色素P450还原酶多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
106.权利要求100至105中任一项所述的核酸分子，其中所编码的细胞色素P450还原酶多肽或其催化活性片段包含SEQ ID NO：12或13中所示氨基酸序列。
107.权利要求100至106中任一项所述的核酸分子，其中所述编码所述细胞色素P450还原酶多肽或其催化活性片段的核酸分子选自包含以下的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：10或11中所示核酸序列；
(b)与SEQ ID NO：10或11中所示核酸序列具有至少95％序列同一性的核酸序列；以及
(c)(a)和(b)的简并序列。
108.权利要求107所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO：10或11中所示核酸序列。
109.权利要求100至104中任一项所述的核酸分子，其中所编码的细胞色素P450还原酶多肽是包含以下序列的催化活性片段：SEQ ID NO：14或15中所示氨基酸序列，或者表现出与SEQ ID NO：14或15中所示氨基酸序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的序列。
110.权利要求100至104或109中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子编码选自包含以下的核苷酸序列的催化活性片段：
(a)SEQ ID NO：63或64中所示核酸序列；
(b)与SEQ ID NO：63或64中所示核酸序列具有至少95％序列同一性的核酸序列；以及
(c)(a)和(b)的简并序列。
111.权利要求100至110中任一项所述的核酸分子，其中权利要求33所述的所编码的细胞色素P450还原酶或其催化活性片段，其中所述电子受体是细胞色素P450、血红素加氧酶、细胞色素b5或角鲨烯环氧酶。
112.权利要求111所述的核酸分子，其中所述电子受体是细胞色素P450。
113.由权利要求100至112中任一项所述的核酸分子编码的细胞色素P450还原酶多
肽或其催化活性部分。
114.融合蛋白的核酸分子，其包含编码至少两种多肽的核酸序列，所述核酸选自编码以下的核酸：
a)檀香细胞色素P450氧化酶或其催化活性片段，其中所述细胞色素P450氧化酶或其催化活性片段催化檀香烯和/或香柠檬烯的羟基化或单加氧化；
b)细胞色素P450还原酶或其催化活性片段，其中所述细胞色素P450还原酶催化2个电子从NADPH转移至所述细胞色素P450氧化酶电子受体；以及
c)檀香烯合酶或其催化活性片段，其中所述檀香烯合酶催化所述细胞色素P450的檀香烯和/或香柠檬烯萜底物的形成。
115.权利要求114所述的核酸分子，其包含编码细胞色素P450氧化酶或其催化活性片段的核酸以及编码檀香烯合酶或其催化活性片段的核酸，其中：
所编码的细胞色素P450氧化酶或其催化活性片段包含SEQ ID NO：6至9或73至77
中所示氨基酸序列，或者表现出与SEQ ID NO：6至9或73至77中所示细胞色素P450氧化酶多肽至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；并且所述檀香烯合酶或其催化活性片段包含SEQ ID NO：17、52或53中任意一个中所示氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：17、52或53中任意一个具有至少80％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，或者其催化活性片段。
116.权利要求114所述的核酸分子，其包含编码细胞色素P450氧化酶或其催化活性片段的核酸以及编码细胞色素P450还原酶或其催化活性片段的核酸，其中：
所编码的细胞色素P450氧化酶或其催化活性片段包含SEQ ID NO：6至9或73至77
中所示氨基酸序列，或者表现出与SEQ ID NO：6至9或73至77中所示细胞色素P450氧化酶多肽至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；并且所述细胞色素P450还原酶或其催化活性片段包含SEQ ID NO：12至15中所示氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：12至15中所示细胞色素P450还原酶多肽具有至少80％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
117.权利要求114至116中任一项所述的核酸分子，其中编码所述檀香烯合酶或其
催化活性片段的核酸和/或编码所述细胞色素P450氧化酶或其催化活性片段的核酸和/或编码所述细胞色素P450还原酶或其催化活性片段的核酸是直接连接或者通过接头连接的。
118.载体，其包含权利要求66至96中任一项所述的核酸分子。
119.载体，其包含权利要求100至112中任一项所述的核酸分子。
120.载体，其包含权利要求114至117中任一项所述的核酸分子。
121.权利要求118至120中任一项所述的载体，其中所述载体是原核载体、病毒载体或真核载体。
122.权利要求118至121中任一项所述的载体，其中所述载体是酵母载体。
123.宿主细胞，其包含权利要求66至96或100至112中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子或载体对于所述细胞是异源的。
124.宿主细胞，其包含权利要求118、119、121或122所述的载体。
125.宿主细胞，其包含权利要求114至117中任一项所述的核酸分子或权利要求120至122中任一项所述的载体。
126.权利要求123至125中任一项所述的宿主细胞，其是原核细胞或真核细胞。
127.权利要求123至126中任一项所述的宿主细胞，其选自细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞。
128.权利要求123至127中任一项所述的宿主细胞，其是酵母细胞并且是酵母属细胞或毕赤酵母属细胞。
129.权利要求123至128中任一项所述的宿主细胞，其是酿酒酵母细胞。
130.权利要求123至127中任一项所述的宿主细胞，其是大肠杆菌细胞。
131.转基因植物，其包含权利要求118至122中任一项所述的载体。
132.转基因植物，其包含权利要求66至96或100至112中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子对于所述植物是异源的。
133.权利要求131或权利要求132所述的转基因植物，其是烟草植物。
134.用于产生细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段的方法，其包括：
将权利要求66至96中任一项所述的核酸分子或者权利要求118、121或122所述的载体引入细胞中；
在适于表达由所述核酸或载体编码的细胞色素P450氧化酶多肽的条件下培养所述细胞；以及
任选地分离所述细胞色素P450氧化酶多肽。
135.用于产生细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段的方法，其包括：
在适于所述细胞色素P450氧化酶多肽表达的条件下培养权利要求1至30或123至
130中任一项所述的细胞；以及
任选地分离所述细胞色素P450氧化酶多肽。
136.通过权利要求134或权利要求135所述的方法产生的细胞色素P450氧化酶多肽。
137.用于产生细胞色素P450还原酶多肽或其催化活性片段的方法，其包括：
将权利要求100至112中任一项所述的核酸分子或者权利要求119、121或122所述的载体引入细胞中；
在适于表达由所述核酸或载体编码的细胞色素P450还原酶多肽的条件下培养所述细胞；以及
任选地分离所述细胞色素P450还原酶多肽。
138.用于产生细胞色素P450还原酶多肽或其催化活性片段的方法，其包括：
在适于所述细胞色素P450还原酶多肽表达的条件下培养权利要求31至45或123至
130中任一项所述的细胞；以及
任选地分离所述细胞色素P450还原酶多肽。
139.通过权利要求137或权利要求138所述的方法产生的细胞色素P450还原酶多肽
或其催化活性片段。
140.用于产生檀香醇、香柠檬醇和/或其混合物的方法，其包括：
(a)使檀香烯和/或香柠檬烯与权利要求97至99或136中任一项所述的细胞色素
P450氧化酶多肽相接触；以及
(b)任选地分离所述檀香醇、香柠檬醇和/或其混合物。
141.权利要求140所述的方法，其中：
所述檀香烯选自α-檀香烯、β-檀香烯和表-β-檀香烯；并且
所述香柠檬烯是α-反式-香柠檬烯。
142.权利要求140至141中任一项所述的方法，其中步骤(a)在P450还原酶存在下发生。
143.权利要求142所述的方法，其中所述P450还原酶是权利要求113或权利要求139中所示多肽。
144.权利要求140至143中任一项所述的方法，其中步骤(a)在体外或在体内进行。
145.权利要求140至144中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前，在适于檀香烯和/或香柠檬烯形成的条件下，使非环状焦磷酸酯萜前体与檀香烯合酶或其催化活性片段相接触。
146.权利要求145所述的方法，其中所述檀香烯合酶或其催化活性片段包含SEQ ID NO：17、52或53中任意一个中所示氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：17、52或53中任意一个具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，或者其催化活性片段。
147.权利要求145或权利要求146所述的方法，其中使非环状焦磷酸酯萜前体与檀香烯合酶或其催化活性片段相接触的步骤在体外或在体内进行。
148.用于产生檀香醇、香柠檬醇和/或其混合物的方法，其包括：
(a)在适于檀香烯和/或香柠檬烯形成的条件下，使非环状焦磷酸酯萜前体与檀香烯合酶或其催化活性片段相接触；
(b)使檀香烯和/或香柠檬烯与细胞色素P450氧化酶多肽相接触；以及
(c)任选地分离所述檀香醇、香柠檬醇和/或其混合物；并且
步骤(a)和(b)同时或先后进行。
149.权利要求148所述的方法，其中步骤(a)和(b)用权利要求114或115中所示核
酸分子来进行，所述核酸分子编码包含檀香烯合酶和P450细胞色素氧化酶的融合多肽。
150.权利要求148或权利要求149所述的方法，其中步骤(b)在P450还原酶存在下发生。
151.权利要求150所述的方法，其中所述P450还原酶是权利要求113或权利要求139中所示多肽。
152.权利要求148至151中任一项所述的方法，其中步骤(a)或(b)在体外或在体内
进行。
153.权利要求145至152中任一项所述的方法，其中所述非环状焦磷酸酯萜前体是法尼焦磷酸。
154.权利要求140至147中任一项所述的方法，其中：
(i)通过培养包含权利要求97至99或136中任一项所示或者由权利要求66至96中任
一项所述的核酸分子编码的细胞色素P450氧化酶多肽的宿主细胞而在体内进行步骤(a)；
或
(ii)通过培养包含以下的宿主细胞在体内进行步骤(a)：
权利要求97至99或136中任一项所示或者由权利要求66至96中任一项所述的核酸
分子编码的细胞色素P450氧化酶多肽；以及
权利要求113或权利要求139中所示或者由权利要求100至112中任一项所述的核酸
分子编码的细胞色素P450还原酶多肽；或
(iii)通过培养包含以下的宿主细胞在体内进行步骤(a)：
檀香烯合酶，其包含SEQ ID NO：17、52或53中任意一个中所示氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：17、52或53中任意一个具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，或者其催化活性片段；
权利要求97至99或136中所示或者由权利要求66至96中任一项所述的核酸分子编
码的细胞色素P450氧化酶；以及
权利要求113或139中所示或者由权利要求100至112中任一项所述的核酸分子编码
的细胞色素P450还原酶。
155.权利要求154所述的方法，其中所述细胞色素P450氧化酶、细胞色素P450还原酶和/或檀香烯合酶对于所述宿主细胞是异源的。
156.权利要求140至155中任一项所述的方法，其中：
所述檀香醇选自α-檀香醇、β-檀香醇和表-β-檀香醇；并且
所述香柠檬醇是α-反式-香柠檬醇。
157.权利要求140至156中任一项所述的方法，其中：
所述檀香醇是(E)-α-檀香醇、(Z)-α-檀香醇、(E)-β-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(E)-表-β-檀香醇或(Z)-表-β-檀香醇；并且
所述香柠檬醇是(Z)-α-反式-香柠檬醇或(E)-α-反式-香柠檬醇。
158.权利要求140至157中任一项所述的方法，其中：
所述细胞色素P450氧化酶包含SEQ ID NO：7、74、75、76或77中所示氨基酸序列，或者表现出与SEQ ID NO：7、74、75、76或77中所示细胞色素P450氧化酶多肽至少65％序列同一性的氨基酸序列，由此所述细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段催化檀香烯和/或香柠檬烯的羟基化或单加氧化；并且
所述方法产生(E)-α-檀香醇、(Z)-α-檀香醇、(E)-β-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(E)-表-β-檀香醇、(Z)-表-β-檀香醇、(Z)-α-反式-香柠檬醇或(E)-α-反式-香柠檬醇中的一种或更多种。
159.权利要求140至157中任一项所述的方法，其中：
所述细胞色素P450氧化酶包含SEQ ID NO：6、8、9或73中所示氨基酸序列，或者表现出与SEQ ID NO：6、8、9或73中所示细胞色素P450氧化酶多肽至少65％序列同一性的氨基酸序列，由此所述细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段催化香柠檬烯的羟基化或单加氧化；并且
所述方法产生(Z)-α-反式-香柠檬醇或(E)-α-反式-香柠檬醇中的一种或更多种。
160.用于产生檀香醇、香柠檬醇和/或其混合物的方法，其包括：
(a)在适于檀香醇、香柠檬醇和/或其混合物形成的条件下培养权利要求1至65或123至130中任一项所述的宿主细胞；以及
(b)任选地分离所述檀香醇、香柠檬醇和/或其混合物。
161.权利要求160所述的方法，其中所述方法包括培养权利要求31或33至65中任一项所述的宿主细胞，由此表达对于所述宿主细胞异源的细胞色素P450氧化酶和细胞色素P450还原酶。
162.权利要求160或权利要求161所述的方法，其中所述方法包括培养权利要求46
至65中任一项所述的宿主细胞，由此表达对于所述宿主细胞异源的檀香烯合酶、细胞色素P450氧化酶和细胞色素P450还原酶。
163.权利要求160至162中任一项所述的方法，其中所述方法产生(E)-α-檀香醇、(Z)-α-檀香醇、(E)-β-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(E)-表-β-檀香醇、(Z)-表-β-檀香醇、(Z)-α-反式-香柠檬醇或(E)-α-反式-香柠檬醇中的一种或更多种。
164.权利要求160至163中任一项所述的方法，其中：
所述方法包括培养权利要求55所述的宿主细胞，由此所述宿主细胞表达催化檀香烯和/或香柠檬烯的羟基化或单加氧化的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段；并且所述方法产生(E)-α-檀香醇、(Z)-α-檀香醇、(E)-β-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(E)-表-β-檀香醇、(Z)-表-β-檀香醇、(Z)-α-反式-香柠檬醇或(E)-α-反式-香柠檬醇中的一种或更多种。
165.权利要求160至163中任一项所述的方法，其中：
所述方法包括培养权利要求56所述的宿主细胞，由此所述宿主细胞表达催化香柠檬烯的羟基化或单加氧化的细胞色素P450氧化酶多肽或其催化活性片段；并且
所述方法产生(Z)-α-反式-香柠檬醇或(E)-α-反式-香柠檬醇。
166.权利要求154至165中任一项所述的方法，其中所述细胞是原核细胞或真核细胞，其选自细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
167.权利要求154至166中任一项所述的方法，其中所述细胞是酵母细胞，其是酵母属细胞或毕赤酵母属细胞。
168.权利要求154至167中任一项所述的方法，其中所述细胞是酿酒酵母细胞。
169.权利要求154至168中任一项所述的方法，其中所述细胞被修饰成与未修饰细胞相比产生更多的FPP。
170.权利要求154至169中任一项所述的方法，其中所述非环状焦磷酸酯萜前体是法尼焦磷酸。
171.权利要求140至170中任一项所述的方法，其中通过用有机溶剂提取和/或柱色谱来分离所述檀香醇、香柠檬醇或其混合物。
172.混合物，其包含通过权利要求140至171中任一项所述方法产生的檀香醇和香柠檬醇。
说明书全文

细胞色素P450和细胞色素P450还原酶多肽、编码核酸分子

及其用途

[0001] 相关申请
[0002] 要求于2012年11月1日提交的题为“CYTOCHROME P450 AND CYTOCHROME P450 REDUCTASE POLYPEPTIDES，ENCODING NUCLEIC ACID MOLECULES AND USES THEREOF”的美国临时申请序列号61/796,129和于2013年5月31日提交的题为“CYTOCHROME P450 AND CYTOCHROME P450 REDUCTASE POLYPEPTIDES，ENCODING NUCLEIC ACID MOLECULES AND USES THEREOF”的美国临时申请序列号61/956,086的优先权。以上引用的各申请的主题通过引用以其整体并入。
[0003] 以电子方式提供的序列表通过引用并入
[0004] 与此一起提交了序列表的电子版本，其内容通过引用以其整体并入。电子文件的大小为301千字节，并且标题为229SEQPC1.txt.。

技术领域

[0005] 提供了细胞色素P450檀香烯氧化酶、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶和细胞色素P450还原酶，编码P450檀香烯氧化酶、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶和细胞色素P450还原酶的核酸分子、以及用于产生产物的方法，所述产物的合成包括由细胞色素P450檀香烯和香柠檬烯氧化酶所催化的反应。所述产物中包括檀香醇和香柠檬醇及其前体和衍生物。

背景技术

[0006] 檀香(sandalwood，Santalum album)是具有巨大经济价值的生长缓慢的半寄生热带树木，其生长在印度南部、斯里兰卡、印度尼西亚东部以及澳大利亚北部。木材以其细粒度、高密度和优异的雕刻性能而备受追捧。檀香的心材具有由心材中的树脂和精油(包括檀香醇、檀香烯和其他倍半萜类化合物)所赋予的独特芳香。通常来说，檀香心材包含高达6％干重的倍半萜油。檀香油主要包含倍半萜醇α-檀香醇、β-檀香醇、Z-α-反式-香柠檬醇和表-β-檀香醇，并且还包含α-檀香烯、β-檀香烯、α-香柠檬烯、表-β-檀香烯、β-没药烯、α-姜黄烯、β-姜黄烯和γ-姜黄烯。檀香油具有由萜类化合物β-檀香醇所赋予的温和、甜木香和动物香脂气味并且是有很高价值的。檀香油通过对檀香属(Santalum)物种的心材进行蒸馏来获得并且将其用作香水(perfume)成分、用于熏香(incense)和传统医学以及用于农药中。
[0007] 近百年的过度开发已经导致檀香在天然林(natural stand)中的消亡。遍及澳大利亚北部正在建立大型种植园以满足需求和保护残存的保护地。此外，即使在几乎相同的生长条件下，由于遗传和环境因素(例如气候和当地条件)，所产生的心材油的量也有很大差异。通常来说，植物天然提取物的价格和可用性取决于植物的多度、油产率和地理来源。
[0008] 尽管已经尝试了产生檀香油中的檀香醇和其他倍半萜类化合物的化学方法，但是这些化合物的高度复杂结构使得用于其制备的经济上可行的合成方法难以大量实现。因此，需要赋予备受追捧的檀香香料之檀香醇和其他倍半萜类化合物的高效、成本效益好的合成以用于香料工业。
[0009] 因此，在本文中的目标中，提供了用于产生檀香醇和其他倍半萜类化合物的方法以及所述方法的所得产物。
[0010] 发明概述
[0011] 本文中提供了编码细胞色素P450多肽或其催化活性片段的核酸分子和所编码的多肽，以及包含这样的核酸分子或所编码的多肽的宿主细胞。例如，所编码的细胞色素P450多肽或其催化活性片段或部分表现出与SEQ ID NO：50至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％的序列同一性，例如，与SEQ ID NO：50至少90％的序列同一性。还提供了编码细胞色素P450还原酶多肽或其催化活性片段的核酸分子和所编码的多肽，以及包含这样的核酸分子和所编码的多肽的宿主细胞。例如，所编码的细胞色素还原酶多肽或其催化活性片段表现出与SEQ ID NO：12或13中所示细胞色素P450还原酶多肽至少80％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，例如，与SEQ ID NO：12或13中所示细胞色素P450还原酶至少90％的序列同一性。本文中提供的核酸分子的任意一种可以是cDNA或者可以是分离的或经纯化的核酸分子。在本文中提供的核酸分子和多肽中的是一组表现出檀香烯/香柠檬烯氧化酶活性的CYP450，其提供檀香油生物合成的代谢工程、檀香种植的改进和天然檀香林木的保护等。
[0012] 特别地，在本文中提供的宿主细胞中的是将其改造以包含编码本文中提供的任意一种细胞色素P450多肽的异源核酸的宿主细胞，由此所述宿主细胞能够产生来自α-檀香烯的α-檀香醇、来自β-檀香烯的β-檀香醇、来自表-β-檀香烯的表-β-檀香醇和来自α-反式-香柠檬烯的α-反式-香柠檬醇的一种或更多种，例如，(E)-α-檀香醇、(Z)-α-檀香醇、(E)-β-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(E)-表-β-檀香醇、(Z)-表-β-檀香醇、(Z)-α-反式-香柠檬醇或(E)-α-反式-香柠檬醇的一种或更多种。例如，还将所述宿主细胞改造以使其还包含如本文中所述的檀香烯合酶以产生所编码的细胞色素P450多肽的檀香烯和/或香柠檬烯萜底物。还可将所述宿主细胞改造以使其还包含编码细胞色素P450还原酶(例如，本文中提供的任意一种)的异源核酸。所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞，例如，细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。例如，所述宿主细胞是酵母属(Saccharomyces genus)细胞、毕赤酵母属(Pichia genus)细胞或大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。在本文中的一些特定实例中，所述宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。所述宿主细胞产生或将其修饰以产生或过表达非环状焦磷酸酯萜前体，例如法尼二磷酸。
[0013] 例如，本文中提供了分离的檀香细胞色素P450多肽或其催化活性片段，包括细胞色素P450檀香烯氧化酶或其催化活性片段和细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或其催化活性片段。本文中还提供了编码所述细胞色素P450檀香烯氧化酶和细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或其催化活性片段的核酸分子。还提供了其经修饰的形式。
[0014] 还提供了编码细胞色素P450还原酶多肽(包括经修饰的细胞色素P450还原酶多肽)的核酸分子。本文中提供了分离的檀香细胞色素P450还原酶多肽，以及包含所述多肽的宿主细胞，其中所述多肽对于所述宿主细胞是异源的。提供了编码包含细胞色素P450酶和第二部分(例如合酶或其催化活性部分)的融合蛋白的核酸分子。
[0015] 还提供了编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含檀香的檀香烯合酶和/或细胞色素P450檀香烯氧化酶或香柠檬烯氧化酶和/或细胞色素P450还原酶或任意一种所述酶的催化活性片段。编码融合蛋白的核酸分子的实例是编码包含以下的融合蛋白的核酸分子：檀香烯合酶和细胞色素P450檀香烯氧化酶；檀香烯合酶和香柠檬烯氧化酶；细胞色素P450檀香烯氧化酶和细胞色素P450还原酶；以及细胞色素P450香柠檬烯氧化酶和细胞色素P450还原酶或任意上述酶的催化活性片段。提供了所编码的蛋白质和包含所述核酸和/或蛋白质的宿主细胞。
[0016] 本文中还提供了用于产生任意一种所编码的细胞色素P450多肽或其催化活性片段的方法，包括用于产生细胞色素P450还原酶多肽的方法。本文中还提供了通过使所述细胞色素P450檀香烯氧化酶和/或细胞色素P450香柠檬烯氧化酶与从其中产生这些产物的底物相接触来产生檀香醇、香柠檬醇和/或其混合物的方法。所述方法可用分离的试剂或部分分离的试剂在体外进行或者在编码酶和任选的合酶和/或其他底物的宿主细胞体内进行。
[0017] 例如，本文中提供了分离的檀香细胞色素P450檀香烯氧化酶或其催化活性片段。所提供的分离的檀香细胞色素P450檀香烯氧化酶催化檀香烯和/或香柠檬烯的羟基化或单加氧化。在一个实例中，所提供的分离的檀香细胞色素P450檀香烯氧化酶催化从檀香烯形成檀香醇和/或从香柠檬烯形成香柠檬醇。例如，分离的檀香细胞色素P450檀香烯氧化酶催化从α-檀香烯形成α-檀香醇、从β-檀香烯形成β-檀香醇、从表-β-檀香烯形成表-β-檀香醇和/或从α-反式-香柠檬烯形成Z-α-反式-香柠檬醇。例如，分离的檀香细胞色素P450檀香烯氧化酶催化(E)-α-檀香醇、(Z)-α-檀香醇、(E)-β-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(E)-表-β-檀香醇、(Z)-表-β-檀香醇、(Z)-α-反式-香柠檬醇或(E)-α-反式-香柠檬醇的形成。本文中还提供了分离的细胞色素P450檀香烯氧化酶，其是CYP76家族的成员。
[0018] 本文中提供了分离的编码檀香细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽或其催化活性片段的核酸分子。例如，本文中提供了分离的核酸分子(和包含所述核酸分子的宿主细胞，所述核酸分子对于所述宿主细胞是异源的)，所述核酸分子编码具有SEQ ID NO：7、74、75、76或77中所示氨基酸序列的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽；或者编码与其序列在SEQ ID NO：7、74、75、76或77中所示细胞色素P450檀香烯氧化酶具有至少96％序列同一性的氨基酸序列之细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽。本文中提供的另一个实例是分离的编码细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽的核酸分子，所述多肽与SEQ ID NO：7、74、75、76或77中所示细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽具有至少50％序列同一性的氨基酸序列。所述细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽催化檀香烯和/或香柠檬烯的羟基化或单加氧化。例如，所编码的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽表现出与SEQ ID NO：7、74、75、76或77中所示氨基酸序列至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。
[0019] 本文中还提供了分离的编码细胞色素P450檀香烯氧化酶或其催化活性片段的核酸分子，所述核酸分子选自具有SEQ ID NO：3、68、69、70或71中所示核酸序列；与SEQ ID NO：3、68、69、70或71中所示核酸序列具有至少98％序列同一性的核酸序列；以及其简并序列的核酸分子。在一个特定的实例中，分离的核酸分子具有SEQ ID NO：3、68、69、70或71中所示核苷酸序列。在一些实例中，分离的核酸分子编码具有SEQ ID NO：7、74、75、76或77中所示氨基酸序列的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽。所提供的分离的核酸分子编码细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽，其催化从檀香烯(例如，α-檀香烯、β-檀香烯或表-β-檀香烯)形成檀香醇(例如，α-檀香醇、β-檀香醇或表-β-檀香醇)，和/或催化檀香烯的羟基化或单加氧化。在一些实例中，所编码的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽催化从α-反式-香柠檬烯形成Z-α-反式-香柠檬醇。本文中还提供了由任意一种本文中提供的分离的核酸分子编码的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽。
[0020] 例如，本文中提供了分离的檀香细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或其催化活性片段。所提供的分离的檀香细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或其催化活性片段催化香柠檬烯的羟基化或单加氧化和/或催化从香柠檬烯形成香柠檬醇。例如，分离的檀香细胞色素P450香柠檬烯氧化酶催化从α-反式-香柠檬烯形成Z-α-反式-香柠檬醇或(E)-α-反式-香柠檬醇。在一些实例中，分离的檀香细胞色素P450香柠檬烯氧化酶不催化檀香烯的羟基化。在另一些实例中，分离的檀香细胞色素P450香柠檬烯氧化酶催化檀香烯的羟基化。本文中还提供了分离的檀香细胞色素P450香柠檬烯氧化酶，其是CYP76家族的成员。
[0021] 本文中提供了编码檀香细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽或其催化活性片段的分离的核酸分子。例如，本文中提供了编码以下的分离的核酸分子：具有SEQ ID NO：6、8、9或73中所示氨基酸序列的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽；或者与SEQ ID NO：6、8、9或73中所示细胞色素P450多肽具有至少96％序列同一性的氨基酸序列的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽。在另一个实例中，本文中提供了分离的核酸分子，其编码与SEQ ID NO：6、8、9或73中所示细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽具有至少50％序列同一性的氨基酸序列的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽。细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽催化香柠檬烯的羟基化或单加氧化。例如，所编码的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽表现出与SEQ ID NO：6、8、9或73中所示氨基酸序列至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。
[0022] 本文中还提供了分离的编码细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽或其催化活性片段的核酸分子，所述核酸分子具有SEQ ID NO：2、4、5或67中任意一个中所示核酸序列；与SEQ ID NO：2、4、5或67中任意一个中所示核酸序列具有至少98％序列同一性的核酸序列；及其简并序列。在一个特定的实例中，分离的核酸分子具有SEQ ID NO：2、4、5或67中所示核酸序列。在一些实例中，分离的核酸分子编码具有SEQ ID NO：6、8、9或73中所示氨基酸序列的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽。所提供的分离的核酸分子编码细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽，所述多肽催化从香柠檬烯(例如α-反式-香柠檬烯)形成香柠檬醇(例如Z-α-反式-香柠檬醇)，和/或催化香柠檬烯(例如α-反式-香柠檬烯)的羟基化或单加氧化。在一些实例中，所编码的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶不催化檀香烯的羟基化。本文中还提供了由任意一个本文中提供的分离的核酸分子编码的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽。
[0023] 本文中还提供了编码檀香细胞色素P450多肽或其催化活性片段的分离的核酸分子，所述核酸分子具有SEQ ID NO：1或72中所示核酸序列；与SEQ ID NO：1或72中所示核酸序列具有至少99％序列同一性的核酸序列；及其简并序列。本文中还提供了编码细胞色素P450多肽的分离的核酸分子，所述多肽具有SEQ ID NO：50或78中所示氨基酸序列；或具有与SEQ ID NO：50或78中所示氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。本文中还提供了由任意一个本文中提供的分离的核酸分子编码的檀香细胞色素P450多肽。
[0024] 本文中还提供了编码具有来自一种或更多种细胞色素P450的一个或更多个其异源结构域或部分之细胞色素P450多肽或其催化活性片段的核酸分子。所述结构域选自螺旋A、β链1-1、β链1-2、螺旋B、β链1-5、螺旋B′、螺旋C、螺旋D、β链3-1、螺旋E、螺旋F、螺旋G、螺旋H、β链5-1、β链5-2、螺旋I、螺旋J、螺旋J′、螺旋K、β链1-4、β链2-1、β链2-2、β链1-3、血红素结构域、螺旋L、β链3-3、β链4-1、β链4-2和β链
3-2。在一些实例中，异源结构域或其连续部分(contiguous portion)置换不包含异源结构域的细胞色素P450多肽的相应天然结构域的全部或连续部分。例如，所编码的经修饰的细胞色素P450多肽包含不同细胞色素P450的所有异源结构域。在另一些实例中，所编码的经修饰的细胞色素P450多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的来自一种或更多种不同细胞色素P450的异源结构域的连续氨基酸。
[0025] 本文中提供了分离的檀香细胞色素P450还原酶或其催化活性片段。例如，本文中提供了分离的檀香细胞色素P450还原酶，其催化两个电子从NADPH转移到电子受体，所述电子受体是细胞色素P450、血红素加氧酶、细胞色素b5或角鲨烯环氧酶。在一些特定的实施例中，所述电子受体是细胞色素P450。
[0026] 本文中还提供了分离的编码檀香细胞色素P450还原酶多肽或其催化活性片段的核酸分子。例如，本文中提供了以下分离的核酸分子，其编码具有SEQ ID NO：12或13中所示氨基酸序列的细胞色素P450还原酶多肽；或者编码具有与SEQ ID NO：12或13中所示细胞色素P450还原酶具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的细胞色素P450还原酶多肽。在另一个实例中，本文中提供了编码表现出与SEQ ID NO：12或13中所示氨基酸序列至少
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的细胞色素P450还原酶的分离的核酸分子。
[0027] 本文中还提供了以下分离的核酸分子，其具有SEQ ID NO：10或11中所示核酸序列；与SEQ ID NO：10或11中所示核酸序列具有至少95％序列同一性的核酸序列；及其简并序列。例如，本文中提供了具有SEQ ID NO：10或11中所示核酸序列的分离的核酸分子。在一些实例中，分离的核酸分子编码具有与SEQ ID NO：12或13中所示细胞色素P450还原酶多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列之细胞色素P450还原酶多肽。在一个特定的实例中，分离的核酸分子编码具有SEQ ID NO：12或13中所示氨基酸序列的细胞色素P450还原酶多肽。所提供的核酸分子编码细胞色素P450还原酶多肽，其催化两个电子从NADPH转移到电子受体，例如，细胞色素P450、血红素加氧酶、细胞色素b5或角鲨烯环氧酶。
在一个特定的实例中，所述电子受体是细胞色素P450。本文中还提供了由所述核酸分子编码的细胞色素P450还原酶多肽。
[0028] 本文中还提供了编码经修饰的檀香细胞色素P450还原酶多肽或其催化活性片段的核酸分子。例如，本文中提供了编码经修饰的细胞色素P450还原酶多肽的核酸分子，与不含修饰的细胞色素P450还原酶多肽相比，所述经修饰的细胞色素P450还原酶多肽包含至少一个氨基酸置换、添加或缺失。在一些实例中，所编码的经修饰的细胞色素P450还原酶多肽是N端或C端截短的。例如，本文中提供了编码N端截短的经修饰的细胞色素P450还原酶多肽的核酸分子。例如，所述核酸分子编码经修饰的细胞色素P450还原酶多肽，其具有SEQ ID NO：14或15中所示氨基酸序列；或者具有与SEQ ID NO：14或15具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。本文中还提供了具有SEQ ID NO：63或64中所示核酸序列；与SEQ ID NO：63或64中所示核酸序列具有至少95％序列同一性的核酸序列；及其简并序列的核酸分子。所提供的核酸分子编码细胞色素P450还原酶多肽，其催化两个电子从NADPH转移到电子受体，例如细胞色素P450、血红素加氧酶、细胞色素b5或角鲨烯环氧酶。在一个特定的实例中，所述电子受体是细胞色素P450。本文中还提供了由所述核酸分子编码的细胞色素P450还原酶多肽。
[0029] 本文中提供了编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含檀香的檀香烯合酶或其催化活性片段和/或细胞色素P450檀香烯氧化酶或细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或其催化活性片段和/或细胞色素P450还原酶或其催化活性片段。
[0030] 本文中提供了编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含檀香烯合酶或细胞色素P450檀香烯氧化酶或其催化活性片段。全长的檀香烯合酶是由SEQ ID NO：58至60中任意一个中所示核苷酸序列编码的并且所述细胞色素P450檀香烯氧化酶是由本文中提供的编码细胞色素P450檀香烯氧化酶的任意核酸分子编码的。在另一个实例中，本文中提供了编码檀香烯合酶和细胞色素P450檀香烯氧化酶的核酸分子。所述檀香烯合酶具有SEQ ID NO：17、52和53中任意一个中所示氨基酸序列并且所述细胞色素P450檀香烯氧化酶具有SEQ ID NO：7、73、74、75和76中任意一个中所示氨基酸序列。
[0031] 本文中提供了编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含檀香烯合酶和细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或其催化活性片段。所述檀香烯合酶具有SEQ ID NO：58至60中任意一个中所示核苷酸序列并且所述细胞色素P450香柠檬烯氧化酶是本文中提供的编码细胞色素P450香柠檬烯氧化酶的任意核酸分子。在另一个实例中，本文中提供了编码檀香烯合酶和细胞色素P450香柠檬烯氧化酶的核酸分子。所述檀香烯合酶具有SEQ ID NO：17、52和53中任意一个中所示氨基酸序列并且所述细胞色素P450香柠檬烯氧化酶具有SEQ ID NO：6、8、9和73中任意一个中所示氨基酸序列。
[0032] 本文中提供了编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含细胞色素P450或其催化活性片段和细胞色素P450还原酶或其催化活性片段，其中所述细胞色素P450是本文中提供的编码细胞色素P450氧化酶的任意核酸分子并且所述细胞色素P450还原酶是本文中提供的编码细胞色素P450还原酶的任意核酸分子。例如，本文中提供了编码具有SEQ ID NO：6至9和73至78中任意一个中所示氨基酸序列的细胞色素P450和具有SEQ ID NO：12至15中任意一个中所示氨基酸序列的细胞色素P450还原酶的核酸分子。
[0033] 在一些实例中，在本文中提供的编码融合蛋白的核酸分子中，檀香烯合酶和/或细胞色素P450檀香烯氧化酶或细胞色素P450香柠檬烯氧化酶和/或细胞色素P450还原酶是直接连接的。在另一些实例中，在本文中提供的编码融合蛋白的核酸分子中，檀香烯合酶和/或细胞色素P450檀香烯氧化酶或细胞色素P450香柠檬烯氧化酶和/或细胞色素P450还原酶通过接头连接。
[0034] 本文中还提供了包含本文中提供的任意核酸分子的载体，所述核酸分子包括编码细胞色素P450(例如檀香烯氧化酶和香柠檬烯氧化酶)、细胞色素P450还原酶、经修饰的细胞色素P450还原酶和融合蛋白的核酸分子。在一些实例中，所述载体是原核载体、病毒载体或真核载体。例如，所述载体是酵母载体。本文中还提供了包含本文中提供的任意载体的细胞。本文中还提供了包含本文中提供的任意核酸分子的细胞，所述核酸分子包括编码细胞色素P450(例如檀香烯氧化酶和香柠檬烯氧化酶)、细胞色素P450还原酶、经修饰的细胞色素P450还原酶和融合蛋白的核酸分子。在一些实例中，所述细胞是原核细胞或真核细胞。在另一些实例中，所述细胞选自细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。在一个实例中，所述细胞是酵母细胞。在酵母细胞中包括酵母属细胞和毕赤酵母属细胞。例如，所述细胞是酿酒酵母细胞。在另一个实例中，所述细胞是大肠杆菌细胞。因此，提供了用于产生檀香醇和香柠檬醇的重组细胞，包括酵母细胞。所述细胞可包含编码合酶(例如檀香烯合酶，例如檀香合酶)的核酸以催化产生本文中提供的P450酶的底物。
[0035] 本文中还提供了表达细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽、细胞色素P450还原酶多肽和/或融合蛋白的细胞，所述融合蛋白包含檀香的檀香烯合酶和/或细胞色素P450檀香烯氧化酶或细胞色素P450檀香烯香柠檬烯合酶和/或细胞色素P450还原酶。本文中还提供了包含本文中提供的任意载体的转基因植物。在一些实例中，所述转基因植物是烟草植物。
[0036] 本文中提供了用于产生细胞色素P450多肽的方法，所述方法通过以下来进行：将本文中提供的编码细胞色素P450多肽的核酸分子或者本文中提供的编码细胞色素P450多肽的任意载体引入细胞内；在适于由所述核酸或载体编码的细胞色素P450多肽表达的条件下培养所述细胞；以及，任选地分离所述细胞色素P450多肽。
[0037] 本文中提供了用于产生细胞色素P450还原酶多肽的方法，所述方法通过以下来进行：将本文中提供的编码细胞色素P450还原酶多肽的核酸分子或本文中提供的编码细胞色素P450还原酶多肽的任意载体引入细胞内；在适于由所述核酸或载体编码的细胞色素P450还原酶多肽表达的条件下培养所述细胞；以及，任选地分离所述细胞色素P450还原酶多肽。
[0038] 本文中提供了用于产生檀香醇、香柠檬醇和/或其混合物的方法，所述方法通过以下来进行：(a)在适于檀香醇、香柠檬醇和/或其混合物形成的条件下，使檀香烯和/或香柠檬烯与细胞色素P450檀香烯氧化酶或香柠檬烯氧化酶相接触；以及(b)任选地分离所述檀香醇、香柠檬醇和/或其混合物。在一些实例中，在体外或体内进行步骤(a)。例如，在用编码细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽或细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽的核酸分子或载体转化的细胞体内进行步骤(a)，从而表达由所述核酸分子或载体编码的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽或细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽；以及所述细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽或细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽催化从檀香烯和/或香柠檬烯形成檀香醇和/或香柠檬醇。
[0039] 本文中提供了包含编码本文中提供的细胞色素P450或细胞色素P450多肽的核酸分子的宿主细胞。所述核酸分子和细胞色素P450多肽对于所述细胞是异源的。在一些实例中，所述宿主细胞还包含编码产生细胞色素P450的萜底物之合酶的核酸。在一些实例中，所述合酶对于所述宿主细胞是异源的。在一些特定的实例中，所述萜合酶是檀香烯合酶，例如，催化檀香烯和/或香柠檬烯形成的萜合酶。例如，所述萜合酶具有SEQ ID NO：17、52和53中任意一个中所示氨基酸序列或者与SEQ ID NO：17、52和53的任意一个具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％同一性的氨基酸序列。在一些实例中，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞，其选自细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。在一个特定的实例中，所述宿主细胞是酵母细胞，其是酵母属细胞或毕赤酵母属细胞。例如，所述宿主细胞是酿酒酵母细胞。
在另一些实例中，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。在一些实例中，所述宿主细胞产生非环状焦磷酸酯萜前体，例如法尼二磷酸。在一些特定的实例中，所述宿主细胞天然地产生法尼二磷酸或者将其修饰以产生与未修饰细胞相比更多的法尼二磷酸。本文中还提供了用于产生檀香醇、香柠檬醇和/或其混合物的方法，所述方法包括以下步骤：在适于檀香醇、香柠檬醇和/或其混合物形成的条件下培养本文中提供的任意一种宿主细胞；以及任选地分离所述檀香醇、香柠檬醇和/或其混合物。
[0040] 本文中提供了用于产生檀香醇、香柠檬醇和/或其混合物的方法，所述方法通过以下来进行：(a)在适于檀香烯和/或香柠檬烯形成的条件下，使非环状焦磷酸酯萜前体与檀香烯合酶相接触；(b)在适于檀香醇、香柠檬醇和/或其混合物形成的条件下使所得檀香烯和/或香柠檬烯与细胞色素P450檀香烯氧化酶或细胞色素P450香柠檬烯氧化酶相接触以产生檀香醇、香柠檬醇和/或其混合物；以及(c)任选地分离在步骤(a)中产生的檀香烯和香柠檬烯或者在步骤(b)中产生的檀香醇、香柠檬醇和/或其混合物。在一些实例中，在体外或在体内进行步骤(a)和/或步骤(b)。例如，在用编码檀香烯合酶的核酸分子转化的细胞中体内进行步骤(a)，从而表达由所述核酸分子编码的檀香烯合酶；以及所述檀香烯合酶催化从非环状焦磷酸酯萜前体形成檀香烯和香柠檬烯；和/或在用编码细胞色素P450檀香烯氧化酶或香柠檬烯氧化酶多肽的核酸分子或载体转化的细胞中体内进行步骤(b)，从而表达由所述核酸分子或载体编码的细胞色素P450檀香烯氧化酶或香柠檬烯氧化酶多肽；以及所述细胞色素P450檀香烯氧化酶或香柠檬烯氧化酶多肽催化从檀香烯和/或香柠檬烯形成檀香醇和/或香柠檬醇。在这样的一些实例中，所述非环状焦磷酸酯萜前体可以是法尼焦磷酸。
[0041] 在本文中提供的任意一种方法中，所述细胞可以是原核细胞或真核细胞，其选自细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。在一些实例中，所述细胞是酵母细胞，其是酵母属细胞或毕赤酵母属细胞，例如，酿酒酵母细胞。在一些实例中，修饰所述细胞以产生与未修饰细胞相比更多的FPP。在所述方法的一些实例中，修饰所述细胞以产生檀香烯合酶。例如，修饰所述细胞以产生具有SEQ ID NO：17、52或53中所示氨基酸序列的檀香烯合酶或者与其具有至少80％、85％、90％、95％序列同一性的合酶。
[0042] 在本文中提供的方法的一些实例中，所述檀香烯或香柠檬烯是α-檀香烯、β-檀香烯、表-β-檀香烯或α-反式-香柠檬烯。在一些实例中，所述檀香醇或香柠檬醇是α-檀香醇、β-檀香醇、表-β-檀香醇或α-反式-香柠檬醇。在一些实例中，所述檀香醇或香柠檬醇是(E)-α-檀香醇、(Z)-α-檀香醇、(E)-β-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(E)-表-β-檀香醇、(Z)-表-β-檀香醇、(Z)-α-反式-香柠檬醇或(E)-α-反式-香柠檬醇。在所提供的方法的另一些实例中，通过用有机溶剂萃取和/或柱色谱分离所述檀香烯、香柠檬烯、檀香醇、香柠檬醇或其混合物。
[0043] 在所提供的方法的一些实例中，使檀香烯和/或香柠檬烯与细胞色素P450檀香烯氧化酶相接触从而产生檀香醇和/或香柠檬醇，所述细胞色素P450檀香烯氧化酶即：本文中提供的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽；本文中提供的由本文中提供的任意核酸分子编码的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽；本文中提供的编码细胞色素P450檀香烯氧化酶的核酸分子；或者本文中提供的编码细胞色素P450檀香烯氧化酶的载体。
[0044] 在所提供的方法的一些实例中，使香柠檬烯与细胞色素P450香柠檬烯氧化酶相接触从而产生香柠檬醇，所述细胞色素P450香柠檬烯氧化酶即：本文中提供的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽；本文中提供的由本文中提供的任意核酸分子编码的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽；本文中提供的编码细胞色素P450香柠檬烯氧化酶的核酸分子；或者本文中提供的编码细胞色素P450香柠檬烯氧化酶的载体。
[0045] 本文中还提供了产生檀香醇、香柠檬醇和/或其混合物的方法。同时或相继地进行步骤(a)和(b)的每一个。在一个实例中，用编码包含檀香烯合酶和细胞色素P450檀香烯氧化酶或细胞色素P450香柠檬烯氧化酶之融合多肽的核酸分子；或者用包含檀香烯合酶和细胞色素P450檀香烯氧化酶或细胞色素P450香柠檬烯氧化酶的融合多肽同时进行步骤(a)和(b)。在一些特定的实例中，使檀香烯和/或香柠檬烯与本文中提供的编码融合多肽的核酸分子；或者与由本文中提供的核酸分子编码的融合多肽相接触。
[0046] 附图简述
[0047] 图1：图1描绘了(Z)-α-檀香醇(1)、(E)-α-檀香醇(9)、(Z)-β-檀香醇(2)、(E)-β-檀香醇(10)、(E)-表-β-檀香醇(3)、(Z)-表-β-檀香醇(11)、(Z)-α-反式-香柠檬醇(4)、(E)-α-反式-香柠檬醇(12)、α-檀香烯(5)、β-檀香烯(6)、表-β-檀香烯(7)和α-反式-香柠檬烯(8)的化学结构。
[0048] 图2A至2B：图2A至2B描绘了SEQ ID NO：7中所示檀香烯氧化酶与SEQ ID NO：6、8和9中所示香柠檬烯氧化酶的比对。“＊”意指所比对的残基是相同的，“：”意指所比对的残基是不相同的，但是是相似的并且在比对位置处包含保守的氨基酸残基，并且“.”意指所比对的残基是相似的并且在比对位置处包含半保守的氨基酸残基。
[0049] 图3A至3C：图3A至3C描绘了SEQ ID NO：12和13中所示檀香细胞色素P450还原酶与SEQ ID NO：46和58中所示拟南芥细胞色素P450还原酶的比对。“＊”意指所比对的残基是相同的，“：”意指所比对的残基是不相同的，但是是相似的并且在比对位置处包含保守的氨基酸残基，并且“.”意指所比对的残基是相似的并且在比对位置处包含半保守的氨基酸残基。
[0050] 图4：图4描绘了用于萜类化合物代谢的SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)、SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)、SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11) 和
SaCYP76F38v2(SaCYP76-G12)和细胞色素P450酶的预测蛋白质序列的邻接种系发生(neighbor-joining phylogeny)，如实施例4中所述。
[0051] 图5A至5B：图5A至5B描绘了SEQ ID NO：7中所示檀香烯氧化酶和SEQ ID NO：6中所示香柠檬烯氧化酶与SEQ ID NO：66中所示细胞色素P450BM-3之比对。“＊”意指所比对的残基是相同的，“：”意指所比对的残基是不相同的，但是是相似的并且在比对位置处包含保守的氨基酸残基，并且“.”意指所比对的残基是相似的并且在比对位置处包含半保守的氨基酸残基。
[0052] 图6A至6D：图6A至6D描绘了从使用SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)(图6A)、SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)(图6B)、SaCYP76F38v2(SaCYP76-G12)(图6C)和空载体(图
6D)的体内测定中提取的产物的GC-MS色谱图，如实施例10中所述。在表13中鉴定了峰。
[0053] 图7：图7描绘了檀香(S.album)油提取物的总离子色谱图。在表13中鉴定了峰。
[0054] 图8A至8C：图8A至8C描 绘 了 檀 香 天 然 油(图8A)和 从 使 用SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)(图8B)和空载体(图8C)的体内测定中提取的产物的GC-MS色谱图，如实施例10中所述。在表11中鉴定了峰。
[0055] 图9A至9B：图9A至9B描 绘 了 檀 香 天 然 油(图9A)和 从 使 用SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)(图9B)的体外测定中提取的产物的GC-MS色谱图，如实施例
11中所述。在表11中鉴定了峰。
[0056] 图10：图10描绘了檀香CYP76F和相关的萜修饰细胞色素P450的蛋白质序列的邻接种系发生，如实施例4中所述。突显的CYP76F表示在进化枝(clade)I(用I标记)和进化枝II(用II标记)中的那些。
[0057] 图 11A 至 11B：图 11A 至 11B 描 绘 了 在 表 达 SaSSY、SaCPR2 和SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)(图11A)以及空载体(图11B)的酵母细胞体内形成的产物的GC-MS分析(提取离子色谱图)。在表12中鉴定了峰。用符号(＊)标记的峰对应于在没有SaCYP76F的酵母细胞中也产生的法尼醇。在图11A中用符号(#)标记的峰表示檀香醇的酵母体内修饰(参见图12A和12B)。
[0058] 图12A至12B：图12A至12B描绘了在用不包含SaCYP76F基因的酵母细胞孵育过夜之前(图12A)和之后(图12B)的天然檀香油样品的倍半萜烯醇的GC-MS分析(提取离子色谱图)。在图12B中用符号(#)标记的峰表示不依赖于SaCYP76F的檀香醇的酵母体内修饰。在表12中鉴定了峰。
[0059] 图 13A 至 13D：图 13A 至 13D 描 绘 了 在 表 达 SaSSy、SaCPR2 和SaCYP76F39v2(SaCYP76-G15)( 图 13A)、SaCYP76F40(SaCYP76-G16)( 图 13B)、SaCYP76F41(SaCYP76-G17)(图13C)或SaCYP76F42(SaCYP76-G13)(图13D)的酵母细胞体内形成的化合物的GC-MS分析(提取离子色谱图)。在表12中鉴定了峰。用符号(＊)标记的峰对应于在没有SaCYP76F的酵母细胞中产生的法尼醇。用符号(#)标记的峰表示不依赖于SaCYP76F的檀香醇的酵母体内修饰。
[0060] 图 14A 至 14E：图 14A 至 14D 描 绘 了 在 表 达 SaSSy、SaCPR2 和SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)( 图 14A)、SaCYP76F38v2(SaCYP76-G12)( 图 14B)、SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)( 图 14C)、SaCYP76F37v2(SaCYP76-G14)( 图 14D) 或SaCYP76F43(SaCYP76-G18)(图14E)的酵母细胞体内形成的化合物的GC-MS分析(提取离子色谱图)。在表12中鉴定了峰。用符号(＊)标记的峰对应于在没有SaCYP76F的酵母细胞中产生的法尼醇。用符号(#)标记的峰表示不依赖于SaCYP76F的酵母体内修饰。
[0061] 图15A至15C：图15A描绘了使用SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)和α-檀香烯、β-檀香烯和表-β-檀香烯以及α-反式-香柠檬烯的倍半萜混合物在体外形成的产物的GC-MS分析(提取离子色谱图)(图15A)。图15B描绘了正宗的檀香油的GC-MS分析(提取离子色谱图)。图15C描绘了来自使用分离自用空载体转化的酵母细胞的微粒体进行的对照测定的GC-MS分析(提取离子色谱图)。在表12中鉴定了峰。
[0062] 图16A至16E：图16A至16E描绘了用α-檀香烯、β-檀香烯和表-β-檀香烯以及α-反式-香柠檬烯的倍半萜混合物作为底物和进化枝I SaCYP76F
cDNA SaCYP76F39v2(SaCYP76-G15)( 图 16A)；SaCYP76F40(SaCYP76-G16)( 图 16B)；
SaCYP76F41(SaCYP76-G17)(图16C)；SaCYP76F42(SaCYP76-G13)(图16D)；或空载体作为对照(图16E)在体外形成的产物的GC-MS分析(提取离子色谱图)。在表12中鉴定了峰。
[0063] 图17A至17E：图17A至17E描绘了用α-檀香烯、β-檀香烯和表-β-檀香烯以及α-反式-香柠檬烯的倍半萜混合物作为底物和进化枝II SaCYP76F
cDNA SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)( 图 17A)；SaCYP76F38v2(SaCYP76-G12)( 图 17B)；
SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)(图17C)；SaCYP76F37v2(SaCYP76-G14)(图17D)；或空载体作为对照(图17E)在体外形成的产物的GC-MS分析(提取离子色谱图)。在表12中鉴定了峰。
[0064] 图18：图18描绘了分离的包含檀香CYP76F蛋白的微粒体的还原CO差光谱。示出了来自包含细胞色素P450或空载体的酿酒酵母之微粒体级分的CO差光谱。基于-1 -1
91,000M cm 的消光系数给出了SaCYP76F蛋白的浓度。
[0065] 图19A至19D：图19A至19D描绘了用表达SaSSy的重组酵母菌株产生的倍半萜混合物(图19A)和由TLC分离的级分(图19B至19D)的GC-MS分析(提取离子色谱图)。如实施例9中所述制备了倍半萜混合物和级分。峰对应于：α-檀香烯，峰1；α-外-香柠檬烯，峰2；表-β-檀香烯，峰3；以及β-檀香烯，峰4。
[0066] 图 20A 至20G：图20A 至 20G 描绘了使用部分纯化的底物用SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)或SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)在体外形成的产物 的GC-MS分析(提取离子色谱图)。图20A至20C描绘了在使用α-檀香烯(图20A)、
α-外-香柠檬烯(图20B)或表-β-檀香烯以及β-檀香烯(图20C)作为底物使用
SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)的测定中的产物谱。图20D至20F描绘了在使用α-檀香烯(图20D)、α-外-香柠檬烯(图20E)或表-β-檀香烯以及β-檀香烯(图20F)作为底
物使用SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)的测定中的产物谱。图20G描绘了正宗的檀香油的提取离子色谱图。在表12中鉴定了峰。
[0067] 图21A至21C：图21A至21C描绘了SEQ ID NO：6至9和73至78中所示檀香细胞色素P450的比对。水平箭头表示脯氨酸区域(a)、氧结合模体(b)和血红素结合模体(c)。框表示最初由Gotoh(1992)J Biol Chem 267：83-90描述的底物识别位点(substrate recognition site，SRS)区域。“＊”意指所比对的残基是相同的，“：”意指所比对的残基是不相同的，但是是相似的并且在比对位置处包含保守的氨基酸残基，并且“.”意指所比对的残基是相似的并且在比对位置处包含半保守的氨基酸残基。
[0068] 发明详述
[0069] 大纲
[0070] A.定义
[0071] B.概述
[0072] 1.萜类化合物的生物合成
[0073] a.檀香醇
[0074] b.香柠檬醇
[0075] 2.细胞色素P450酶
[0076] a.结构
[0077] b.活性
[0078] 3.细胞色素P450还原酶
[0079] a.结构
[0080] b.活性
[0081] C.细胞色素P450多肽和编码核酸分子
[0082] 1.细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽
[0083] 经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽
[0084] 2.细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽
[0085] 经修饰的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽
[0086] 3.另外的修饰
[0087] a.截短的多肽
[0088] b.具有改变的活性和性质的多肽
[0089] c.结构域交换
[0090] d.融合蛋白
[0091] D.细胞色素P450还原酶多肽和编码核酸分子
[0092] 1.细胞色素P450还原酶多肽
[0093] 2.经修饰的细胞色素P450还原酶多肽
[0094] 3.另外的修饰
[0095] a.截短的多肽
[0096] b.具有改变的活性和性质的多肽
[0097] c.结构域交换
[0098] d.融合蛋白
[0099] E.用于产生经修饰的细胞色素P450和细胞色素P450还原酶多肽以及编码核酸分子的方法
[0100] F.细胞色素P450和细胞色素P450还原酶多肽以及编码核酸分子的表达
[0101] 1.编码檀香细胞色素P450和细胞色素P450还原酶多肽的核酸的分离
[0102] 2.经修饰的核酸的产生
[0103] 3.载体和细胞
[0104] 4.表达系统
[0105] a.原核细胞
[0106] b.酵母细胞
[0107] c.植物和植物细胞
[0108] d.昆虫和昆虫细胞
[0109] e.哺乳动物细胞
[0110] f.示例性宿主细胞
[0111] 5.纯化
[0112] 6.融合蛋白
[0113] G.用于产生萜类化合物的方法以及用于检测此类产物和检测细胞色素P450和细胞色素P450还原酶多肽的活性的方法
[0114] 1.檀香醇和香柠檬醇的合成
[0115] a.檀香烯和香柠檬烯的氧化
[0116] b.非环状焦磷酸酯萜前体的转化
[0117] 2.产生方法
[0118] a.示例性细胞
[0119] b.细胞的培养
[0120] c.分离以及用于检测和鉴定的测定
[0121] 3.檀香油的产生
[0122] 4.用于检测细胞色素P450和细胞色素P450还原酶多肽的酶活性的测定
[0123] a.用于测定细胞色素P450多肽的活性的方法
[0124] b.用于测定细胞色素P450还原酶多肽的活性的方法
[0125] H.实施例
[0126] A.定义
[0127] 除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有如本发明所属的技术领域的技术人员通常理解的相同含义。除非另外指出，否则贯穿本文中的全部公开内容所涉及的所有专利、专利申请、公布的申请和公布、Genbank序列、数据库、网站和其他公开材料均通过引用以其整体并入。在对于本文中的术语有多个定义的情况下，以该部分的那些为准。当参考URL或其他这样的标识符或地址时，应理解，这样的标识符可改变并且在因特网上特定信息可能会变化，但是可通过在因特网上进行搜索找到等同的信息。对这样的信息的引用证明其是可以获得和公开传播的。
[0128] 本文中使用的非环状焦磷酸酯萜前体是任意非环状焦磷酸酯化合物，其为产生至少一种萜的前体，包括但不限于法尼焦磷酸(farnesyl-pyrophosphate，FPP)、牻牛儿焦磷酸(geranyl-pyrophosphate，GPP)和牻牛儿基牻牛儿焦磷酸
(geranylgeranyl-pyrophosphate，GGPP)。因此，非环状焦磷酸酯萜前体是萜合酶的底物。
[0129] 本文中使用的萜是基于异戊二烯单元(C5H8)的不饱和烃，并且具有通式C5xH8x，例如C10H16。提及的萜包括非环萜、单环萜和多环萜。萜包括但不限于单萜，其包含10个碳原子；倍半萜，其包含15个碳原子；二萜，其包含20个碳原子；以及三萜，其包含30个碳原子。提及的萜还包括萜的立体异构体。
[0130] 本文中使用的萜类化合物是经化学修饰的萜。在一个实例中，萜类化合物是通过添加羟基而化学修饰的萜，例如檀香醇或香柠檬醇。提及的萜类化合物包括非环萜类化合物、单环萜类化合物和多环萜类化合物，包括单萜类化合物、倍半萜类化合物和二萜类化合物。提及的萜类化合物还包括萜类化合物的立体异构体。
[0131] 本文中使用的萜合酶是能够催化从焦磷酸酯萜前体形成一种或更多种萜的多肽。在一些实例中，萜合酶催化从非环状焦磷酸酯萜前体(例如，FPP、GPP或GGPP)形成一种或更多种萜，包括但不限于檀香烯合酶。在另一些实例中，萜合酶催化从非环状焦磷酸酯萜前体形成一种或更多种萜，包括但不限于檀香烯合酶。
[0132] 本文中使用的“细胞色素P450”、“细胞色素P450氧化酶”、“细胞色素P450多肽”、“细胞色素P450氧化酶多肽”或“CYP”是能够催化任意萜前体(包括单萜、倍半萜和二萜)的单加氧化的多肽。细胞色素P450可催化萜或萜混合物的单加氧化，导致产生一种或更多种萜类化合物。
[0133] 为了本文中的目的，本文中提供的细胞色素P450氧化酶是具有细胞色素P450氧化酶活性并且当与SEQ ID NO：50中所示细胞色素P450氧化酶序列进行比对时具有大于或大于约或50％、55％、60％、65％、70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％序列同一性的酶。提及的细胞色素P450氧化酶包括任何细胞色素P450氧化酶多肽，包括但不限于重组产生的多肽、合成产生的多肽和从细胞或植物物质中提取或分离的细胞色素P450氧化酶多肽，所述植物物质包括但不限于檀香树的心材。细胞色素P450氧化酶多肽的实例包括从檀香中分离的那些。提及的细胞色素P450氧化酶包括来自任何属或物种的细胞色素P450氧化酶并且包括其等位基因变体或物种变体、由剪接变体编码的变体以及其他变体，包括当与SEQ ID NO：50中所示细胞色素P450氧化酶进行比对时，与其具有至少或至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％、99％或更高的序列同一性的多肽。细胞色素P450氧化酶还包括保留细胞色素P450氧化酶活性的其催化活性片段。
[0134] 本文中使用的“细胞色素P450檀香烯氧化酶”或“细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽”是能够催化从檀香烯形成檀香醇(例如，能够催化檀香烯的单加氧化或羟基化)的多肽。细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽可从一种檀香烯或多种檀香烯的混合物产生一种檀香醇或多种檀香醇的混合物。细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽还能够催化从香柠檬烯形成香柠檬醇。例如，细胞色素P450檀香烯氧化酶催化从α-檀香烯形成α-檀香醇、从β-檀香烯形成β-檀香醇、从表-β-檀香烯形成表-β-檀香醇和/或从α-反式-香柠檬烯形成Z-α-反式-香柠檬醇或E-α-反式-香柠檬醇。
[0135] 为了本文中的目的，本文中提供的细胞色素P450檀香烯氧化酶是具有细胞色素P450檀香烯氧化酶活性并且当与SEQ ID NO：7、74、75、76或77中所示细胞色素P450檀香烯氧化酶序列进行比对时具有大于或大于约或50％、55％、60％、65％、70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的酶。提及的细胞色素P450檀香烯氧化酶包括任何细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽，包括但不限于重组产生的多肽、合成产生的多肽和从细胞或植物物质中提取或分离的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽，所述植物物质包括但不限于檀香树的心材。细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽的实例包括从檀香中分离的那些。提及的细胞色素P450檀香烯氧化酶包括来自任何属或物种的细胞色素P450檀香烯氧化酶并且包括其等位基因变体或物种变体、由剪接变体编码的变体以及其他变体，包括当与SEQ ID NO：7、74、75、76或77中所示细胞色素P450檀香烯氧化酶进行比对时，与其具有至少或至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的多肽。细胞色素P450檀香烯氧化酶还包括保留细胞色素P450檀香烯氧化酶活性的其催化活性片段。
[0136] 本文中使用的“细胞色素P450檀香烯氧化酶活性”或“檀香烯氧化酶活性”是指催化从一种或更多种檀香烯形成一种或更多种檀香醇的能力。即，细胞色素P450檀香烯氧化酶催化檀香烯的单加氧化或羟基化。细胞色素P450檀香烯氧化酶还催化香柠檬烯的羟基化。例如，细胞色素P450檀香烯氧化酶催化从α-檀香烯形成α-檀香醇、从β-檀香烯形成β-檀香醇、从表-β-檀香烯形成表-β-檀香醇和/或从α-反式-香柠檬烯形成Z-α-反式-香柠檬醇。评估从檀香烯或香柠檬烯的反应形成檀香醇或香柠檬醇的方法是本领域中公知的并且在本文中描述。可通过例如气相色谱-质谱法(GC-MS)的方法来评估檀香醇或香柠檬醇的产生(参见下文中的实施例)。如果从反应产生的檀香醇和香柠檬醇的量为反应中产生的萜类化合物的总量的至少或至少约0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，则细胞色素P450表现出细胞色素P450檀香烯氧化酶活性或者催化从檀香烯和香柠檬烯形成檀香醇或香柠檬醇的能力。
[0137] 本文中使用的“细胞色素P450香柠檬烯氧化酶”或“细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽”是能够催化香柠檬烯的单加氧化或羟基化的多肽。例如，细胞色素P450香柠檬烯氧化酶催化从α-反式-香柠檬烯形成Z-α-反式-香柠檬醇或E-α-反式-香柠檬醇。
[0138] 为了本文中的目的，本文中提供的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶是具有细胞色素P450香柠檬烯氧化酶活性并且当与SEQ ID NO：6、8、9或73中所示细胞色素P450香柠檬烯氧化酶序列进行比对时具有大于或大于约或50％、55％、60％、65％、70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的酶。提及的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶包括任何细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽，包括但不限于重组产生的多肽、合成产生的多肽和从细胞或植物物质中提取或分离的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽，所述植物物质包括但不限于檀香树的心材。细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽的实例包括从檀香中分离的那些。提及的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶包括来自任何属或物种的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶并且包括其等位基因变体或物种变体、由剪接变体编码的变体以及其他变体，包括当与SEQ ID NO：6、8、9或73中所示细胞色素P450香柠檬烯氧化酶进行比对时，与其具有至少或至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的多肽。细胞色素P450香柠檬烯氧化酶还包括保留细胞色素P450香柠檬烯氧化酶活性的其催化活性片段。
[0139] 本文中使用的“细胞色素P450香柠檬烯氧化酶活性”或“香柠檬烯氧化酶活性”是指催化从香柠檬烯形成香柠檬醇的能力。即，细胞色素P450香柠檬烯氧化酶催化香柠檬烯的单加氧化或羟基化。例如，细胞色素P450香柠檬烯氧化酶催化从α-反式-香柠檬烯形成Z-α-反式-香柠檬醇。评估从香柠檬烯反应形成香柠檬醇的方法是本领域中公知的并且在本文中描述。可通过例如气相色谱-质谱法(GC-MS)的方法来评估香柠檬醇的产生(参见下文中的实施例)。如果从反应产生香柠檬醇的量为反应中产生的萜类化合物的总量的至少或至少约0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，则细胞色素P450表现出细胞色素P450香柠檬烯氧化酶活性或者催化从香柠檬烯形成香柠檬醇的能力。
[0140] 本文中使用的α-檀香醇是具有以下结构的倍半萜类化合物或者其异构体或立体异构体：
[0141]
[0142] 本文中使用的β-檀香醇是具有以下结构的倍半萜类化合物或者其异构体或立体异构体：
[0143]
[0144] 本文中使用的表-β-檀香醇是具有以下结构的倍半萜类化合物或者其异构体或立体异构体：
[0145]
[0146] 本文中使用的Z-α-反式-香柠檬醇或Z-α-外-香柠檬醇是具有以下结构的倍半萜类化合物或者其异构体或立体异构体：
[0147]
[0148] 本文中使用的E-α-反式-香柠檬醇或E-α-外-香柠檬醇是具有以下结构的倍半萜类化合物或者其异构体或立体异构体：
[0149]
[0150] 本文中使用的α-檀香烯是具有以下结构的倍半萜或者其异构体或立体异构体：
[0151]
[0152] 本文中使用的β-檀香烯是具有以下结构的倍半萜或者其异构体或立体异构体：
[0153]
[0154] 本文中使用的表-β-檀香烯是具有以下结构的倍半萜或者其异构体或立体异构体：
[0155]
[0156] 本文中使用的α-反式-香柠檬烯或α-外-香柠檬烯是具有以下结构的倍半萜或者其异构体或立体异构体：
[0157]
[0158] 本文中使用的“细胞色素P450还原酶”或“CPR”是能够催化两个电子从NADPH转移到电子受体(例如细胞色素P450)的多肽。为了本文中的目的，本文中提供的细胞色素P450还原酶是具有细胞色素P450还原酶活性并且当与SEQ ID NO：12或13中所示细胞色素P450还原酶序列进行比对时具有大于或大于约或50％、55％、60％、65％、70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的酶。提及的细胞色素P450还原酶包括任何细胞色素P450还原酶多肽，包括但不限于重组产生的多肽、合成产生的多肽和从细胞或植物物质中提取或分离的细胞色素P450还原酶多肽，所述植物物质包括但不限于檀香树的心材。细胞色素P450还原酶多肽的实例包括从檀香中分离的那些。提及的细胞色素P450还原酶包括来自任何属或物种的细胞色素P450还原酶并且包括其等位基因变体或物种变体、由剪接变体编码的变体以及其他变体，包括当与SEQ ID NO：12或13中所示细胞色素P450还原酶进行比对时，与其具有至少或至少约50％、55％、60％、65％、
70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的多肽。细胞色素P450还原酶还包括保留细胞色素P450还原酶活性的其催化活性片段。
[0159] 如本文所使用的“细胞色素P450还原酶活性”是指催化两个电子从NADPH转移到电子受体(例如细胞色素P450)的能力。评估细胞色素P450还原酶活性的方法是本领域中公知的并且在本文中描述。例如，细胞色素P450还原酶活性可通过人工电子受体(例如细胞色素c)的还原进行测定。
[0160] 本文中使用的关于细胞色素P450或细胞色素P450还原酶的“野生型”或“天然的”是指由天然或天然存在的细胞色素P450基因或细胞色素P450还原酶基因编码的细胞色素P450多肽或细胞色素P450还原酶多肽，所述细胞色素P450基因或细胞色素P450还原酶基因包括等位基因变体，其天然存在于包括植物的生物体中。提及的未涉及种类的野生型细胞色素P450或细胞色素P450还原酶旨在涵盖野生型细胞色素P450或细胞色素P450还原酶的任何种类。
[0161] 本文中使用的物种变体是指在不同物种之间的多肽中的变体，所述不同物种包括不同的檀香物种，例如檀香(Santalum album)、新喀里多尼亚檀香(Santalum australocaledonicum)、大果澳洲檀香(Santalum spicatum)和钩叶澳洲檀香(Santalum murrayanum)。通常来说，物种变体共享至少或至少约40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或更高的序列同一性。在物种变体之间或物种变体之中的对应残基可通过通常与相同参考序列进行逐一比较并将各序列与参考序列进行比对以使匹配的核苷酸或氨基酸残基数量最大化来确定。然后给出目标位置在参考核酸分子或多肽中分配的数量。特别地，可手动或通过目视进行比对，其中序列同一性大于80％。为了确定多个变体之间的序列同一性，针对相同的参考多肽逐一进行比对。
[0162] 本文中使用的等位基因变体或等位基因变异是指占据相同染色体基因座的基因的两个或更多个替选形式的任意一个。等位基因变异通过突变天然产生并且可导致种群中的表型多态性。基因突变可以是沉默性的(在所编码的多肽中没有变化)或者可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。本文中还使用术语“等位基因变体”来表示由基因的等位基因变体编码的蛋白质。通常来说，基因的参考形式编码来自种群或物种的单个参考成员之多肽的野生型形式和/或主要形式。通常来说，等位基因变体(其通常包括物种之间或之中的变体)具有与来自相同物种的野生型和/或主要形式的至少80％、90％或更高的氨基酸同一性；同一性的程度取决于基因以及比较是在种间还是在种内进行。通常来说，种内等位基因变体与野生型和/或主要形式具有至少约80％、85％、90％或95％的同一性或更高，包括与多肽的野生型和/或主要形式具有96％、97％、98％、99％或更高的同一性。本文中提及的等位基因变体通常是指在相同物种的成员之间的蛋白质中的变体。
[0163] 本文中使用的剪接变体是指通过基因组DNA的初级转录物的分化加工(其产生多于一种类型的mRNA)所产生的变体。
[0164] 本文中使用的“经修饰的细胞色素P450”或“经修饰的细胞色素P450多肽”或“经修饰的CYP”是指与未修饰或野生型细胞色素P450多肽相比具有一个或更多个氨基酸差异的细胞色素P450多肽。一个或更多个氨基酸差异可以是氨基酸突变，例如一个或更多个氨基酸置换(替换)、插入或缺失，或者可以是其全部结构域或部分及其任意组合的插入或缺失或置换。修饰可通过任何突变方案(包括基因改组方法)来进行。通常来说，与未修饰细胞色素P450多肽相比，经修饰的细胞色素P450多肽具有在一级序列中的一个或更多个修饰。例如，与未修饰细胞色素P450多肽相比，本文中提供的经修饰的细胞色素P450多肽可具有至少1个、5个、10个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、
39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、
53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、
67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、
81个、82个、83个、84个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、120个、125个、
130个、135个或更多个氨基酸差异。通常来说，经修饰的细胞色素P450多肽将具有1个、
2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸置换，但是可包括更多个，特别是当交换其结构域或部分时。只要所得多肽具有与野生型细胞色素P450相关的至少一种细胞色素P450活性，例如，催化活性、单加氧酶活性和/或催化从萜形成萜类化合物的能力，就可考虑任何修饰。通常来说，所得细胞色素P450多肽将具有与本文中提供的野生型细胞色素P450多肽至少50％的序列同一性。
[0165] 本文中使用的“经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶”或“经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽”是指与未修饰或野生型细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽相比具有一个或更多个氨基酸差异的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽。一个或更多个氨基酸差异可以是氨基酸突变，例如一个或更多个氨基酸置换(替换)、插入或缺失，或者可以是其全部结构域或部分及其任意组合的插入或缺失或置换。修饰可通过任何突变方案(包括基因改组方法)来进行。通常来说，与未修饰细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽相比，经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽具有在一级序列中的一个或更多个修饰。例如，与未修饰细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽相比，本文中提供的经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽可具有至少1个、5个、10个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、
37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、
51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、
65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、
79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、120个、125个、130个、135个或更多个氨基酸差异。通常来说，经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽将具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、
14个或15个氨基酸置换，但是可包括更多个，特别是当交换其结构域或部分时。只要所得多肽具有与野生型细胞色素P450檀香烯氧化酶相关的至少一种细胞色素P450檀香烯氧化酶活性，例如，催化活性、催化从檀香烯或香柠檬烯形成檀香醇或香柠檬醇的能力，就可考虑任何修饰。通常来说，所得细胞色素P450多肽檀香烯氧化酶将具有与本文中提供的野生型细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽至少50％的序列同一性。
[0166] 本文中使用的“经修饰的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶”或“经修饰的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽”是指与未修饰或野生型细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽相比具有一个或更多个氨基酸差异的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽。一个或更多个氨基酸差异可以是氨基酸突变，例如一个或更多个氨基酸置换(替换)、插入或缺失，或者可以是其全部结构域或部分及其任意组合的插入或缺失或置换。修饰可通过任何突变方案(包括基因改组方法)来进行。通常来说，与未修饰细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽相比，经修饰的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽具有在一级序列中的一个或更多个修饰。例如，与未修饰细胞色素P450多肽相比，本文中提供的经修饰的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽可具有至少1个、5个、10个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、
23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、
37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、
51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、
65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、
79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、120个、125个、130个、135个或更多个氢基酸差异。通常来说，经修饰的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽将具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸置换，但是可包括更多个，特别是当交换其结构域或部分时。只要所得多肽具有与野生型细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽相关的至少一种细胞色素P450香柠檬烯氧化酶活性，例如，催化活性、催化从香柠檬烯形成香柠檬醇的能力，就可考虑任何修饰。通常来说，所得细胞色素P450多肽香柠檬烯氧化酶将具有与本文中提供的野生型细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽至少50％的序列同一性。
[0167] 本文中使用的“经修饰的细胞色素P450还原酶”或“经修饰的CPR”是指与未修饰或野生型细胞色素P450还原酶多肽相比具有一个或更多个氨基酸差异的细胞色素P450多肽。一个或更多个氨基酸差异可以是氨基酸突变，例如一个或更多个氨基酸置换(替换)、插入或缺失，或者可以是其全部结构域或部分及其任意组合的插入或缺失或置换。修饰可通过任何突变方案(包括基因改组方法)来进行。通常来说，与未修饰细胞色素P450还原酶多肽相比，经修饰的细胞色素P450还原酶多肽具有在一级序列中的一个或更多个修饰。例如，与未修饰细胞色素P450还原酶多肽相比，本文中提供的经修饰的细胞色素P450还原酶多肽可具有至少1个、5个、10个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、
23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、
37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、
51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、
65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、
79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、120个、125个、130个、135个或更多个氨基酸差异。通常来说，经修饰的细胞色素P450还原酶多肽将具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸置换，但是可包括更多个，特别是当交换其结构域或部分时。只要所得多肽具有与野生型细胞色素P450还原酶相关的至少一种细胞色素P450还原酶活性，例如，催化活性、将两个电子转移到电子受体(例如细胞色素P450)的能力，就可考虑任何修饰。通常来说，所得细胞色素P450还原酶多肽将具有与本文中提供的野生型细胞色素P450还原酶多肽至少50％的序列同一性。
[0168] 本文中使用的对应残基是指在比对位点出现的残基。相关的或变体多肽通过本领域技术人员已知的任何方法进行比对。这样的方法通常使匹配最大化，并且包括以下方法，例如，手动比对和通过多个可用的比对程序(例如，BLASTP)产生的那些以及本领域技术人员已知的其他方法。通过使用保守的和相同的氨基酸残基作为向导来比对多肽序列，本领域技术人员可鉴定对应残基。对应位置还可基于结构比对，例如，通过使用模拟蛋白质结构比对的计算机。例如，细胞色素P450檀香烯氧化酶合酶与细胞色素P450香柠檬烯氧化酶合酶之间的对应残基在图2A至2B和21A至21C中示出并且拟南芥细胞色素P450还原酶与檀香细胞色素P450还原酶之间的对应残基在图3A至3C中示出。
[0169] 本文中使用的结构域或区域(通常为至少3个或更多个，一般为5个或7个或更多个氨基酸的序列)是指分子的一部分(例如，蛋白质或编码核酸)，其在结构上和/或功能上不同于所述分子的其他部分并且是可鉴定的。蛋白质可具有一个或多于一个的不同结构域。例如，可通过其中的序列与相关家族成员(例如，其他萜合酶)的同源性来鉴定、定义或区分结构域。结构域可以是氨基酸的线性序列或氨基酸的非线性序列。许多多肽包含多个结构域。这样的结构域是已知的并且可由本领域技术人员鉴定。为了本文中的举例，提供了定义，但是应理解，本领域技术人员完全可通过名称识别特定的结构域。如有需要，可利用适当的软件来鉴定结构域。例如，如上文所讨论的，不同细胞色素P450或细胞色素P450还原酶中的对应结构域可通过序列比对，例如使用本领域中公知的工具和算法(例如，BLASTP)来鉴定。
[0170] 本文中使用的功能性结构域是指通过功能活性(例如，催化活性)所识别的多肽的那些部分。功能性结构域可通过其功能，例如通过催化活性或者与生物分子相互作用(例如，底物结合或金属结合)的能力来区分。在一些实例中，结构域可独立地表现出生物学功能或性质以使得结构域可独立地或可与另一个分子融合来实现活性，例如，催化活性或底物结合。
[0171] 本文中使用的结构性结构域是指可在构成一个或更多个结构模体的蛋白质中形成独立折叠结构的多肽链的那些部分。
[0172] 本文中使用的关于氨基酸或核酸序列的“异源”是指不存在于天然多肽中或者不由多核苷酸编码的序列部分。例如，如果这样的氨基酸不存在于天然或野生型细胞色素P450檀香烯氧化酶合酶(例如，如SEQ ID NO：7中所示)中或者不由编码它的多核苷酸编码，则细胞色素P450檀香烯氧化酶合酶的多肽的氨基酸的一部分(例如其结构域或区域或部分)对于其是异源的。包含这样的异源氨基酸的多肽或编码它的多核苷酸分别称为“嵌合多肽”或“嵌合多核苷酸”。
[0173] 本文中使用的短语“与第一细胞色素P450相比，改善了经修饰的细胞色素P450的性质”是指与不包含修饰的细胞色素P450相比在经修饰的细胞色素P450的性质上的期望改变。通常来说，改善一种性质或多种性质以使得与由底物与未修饰细胞色素P450合酶反应产生的期望的萜类化合物的量相比，由萜底物与经修饰的细胞色素P450合酶反应产生的期望的萜类化合物的量是提高的。可在经修饰的细胞色素P450合酶中改善的示例性性质包括，例如，萜类化合物产量、催化活性、产物分布、底物特异性、区域选择性和立体选择性。可使用本领域中公知的方法评估一种或更多种性质以确定性质是否已被改善(即，被改变以对期望的萜类化合物的产量更加理想)。
[0174] 本文中使用的萜类化合物产量(还称为萜类化合物产率)是指由萜与细胞色素P450反应产生的萜类化合物的量(以重量或重量/体积计)。提及的总萜类化合物产量是指由反应产生的所有萜类化合物的总量，而提及的特定萜类化合物产量是指由反应产生的特定萜类化合物(例如，β-檀香醇和α-檀香醇)的量。
[0175] 本文中使用的提高的萜类化合物产量是指，与由相同的萜与未经如此修饰的细胞色素P450反应产生的量相比，萜与经修饰的细胞色素P450反应所产生的萜类化合物总量的提高(即，提高的总萜类化合物产量)或者特定的萜类化合物的量的提高。与在相同的条件下由相同的萜与未经如此修饰的细胞色素P450反应产生的萜类化合物的量相比，由萜与细胞色素P450反应产生的萜类化合物(总的或特定的)量可提高至少或至少约1％、3％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
[0176] 本文中使用的底物特异性是指细胞色素P450对一个靶标底物比另一个优选，例如，对一种萜(例如，β-檀香烯、α-檀香烯、表-β-檀香烯或α-反式-香柠檬烯)比另一种萜优选。可使用本领域中公知的方法(例如计算kcat/Km的那些)来评估底物特异性。例如，可通过比较相对Kcat/Km来评估底物特异性，所述Kcat/Km是酶针对多种底物(例如，β-檀香烯、α-檀香烯、表-β-檀香烯或α-反式-香柠檬烯)的催化效率的量度。
[0177] 本文中使用的改变的底物特异性是指，与未经如此修饰的细胞色素P450(例如，野生型细胞色素P450檀香烯氧化酶或野生型细胞色素P450香柠檬烯氧化酶)相比，经修饰的细胞色素P450多肽(例如，经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽或经修饰的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽)的底物特异性的改变。与起始细胞色素P450对相同底物的特异性相比，经修饰的细胞色素P450多肽对底物(例如β-檀香烯、α-檀香烯、表-β-檀香烯或α-反式-香柠檬烯)的特异性(例如，Kcat/Km)可改变至少或至少约10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
[0178] 本文中使用的“改善的底物特异性”是指底物特异性变化或改变至更加期望的特异性。例如，改善的底物特异性可包括经修饰的细胞色素P450多肽对期望的底物(例如，β-檀香烯、α-檀香烯、表-β-檀香烯或α-反式-香柠檬烯)的底物特异性的提高。与未经如此修饰的细胞色素P450的特异性相比，经修饰的细胞色素P450多肽对底物(例如，β-檀香烯、α-檀香烯、表-β-檀香烯或α-反式-香柠檬烯)的特异性(例如，Kcat/Km)可提高至少或至少约1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
[0179] 本文中使用的“产物分布”是指由萜(例如，β-檀香烯)与细胞色素P450(包括本文中提供的细胞色素P450多肽)之间的反应产生的不同萜类化合物的相对量。所产生的萜类化合物的量可描述为通过细胞色素P450产生的总产物的百分比。例如，由β-檀香烯与细胞色素P450檀香烯氧化酶反应所得的产物分布可以是90％(重量/体积)的β-檀香醇和10％(重量/体积)的其他化合物。用于评估溶液中萜类化合物的类型和量的方法是本领域中公知的并且在本文中描述，并且包括，例如，气相色谱-质谱法(GC-MS)(参见下文中的实施例)。
[0180] 本文中使用的改变的产物分布是指由萜(例如，β-檀香烯)与细胞色素P450(例如，细胞色素P450檀香烯氧化酶)之间的反应产生的各个萜类化合物的相对量的变化。通常来说，所述变化通过测定由使用第一细胞色素P450(例如，野生型细胞色素P450)的萜产生的各个萜类化合物的相对量，然后将其与使用第二细胞色素P450(例如，经修饰的细胞色素P450)产生的各个萜类化合物的相对量相比较来评估。如果任意一个或更多个萜类化合物的相对量提高或降低至少或至少约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％或更多，则认为发生了改变的产物分布。
[0181] 本文中使用的改善的产物分布是指产物分布改变为更期望的产物分布，即，包含更期望的相对量的萜类化合物。例如，改善的产物分布可包含提高量的期望的萜类化合物和/或降低量的并非如此期望的萜类化合物。在改善的产物分布中的期望的萜类化合物的量可提高至少或至少约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。在改善的产物分布中的不期望的萜类化合物的量可降低至少或至少约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、
15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。
[0182] 本文中使用的核酸或核酸分子包括DNA、RNA及其类似物，包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可以是单链或双链的。当提及探针或引物时，其任选地例如用可检测标记(例如荧光标记或放射性标记)进行标记，考虑单链分子。这样的分子通常是使得其靶标是统计学上唯一的长度或者或者是低拷贝数(通常小于5，一般小于3)从而探测或引导文库。通常来说，探针或引物包含与目标基因互补或相同的序列的至少14个、16个或30个连续核苷酸。探针或引物可以是10个、20个、30个、50个、100个或更多个核酸长度。
[0183] 本文中使用的术语多核苷酸意指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基从5’端读到3’端的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，并且可从天然来源中分离、在体外合成或者由天然分子和合成分子的组合制备。本文中根据核苷酸(缩写为“nt”)或碱基对(缩写为“bp”)给出多核苷酸分子的长度。当上下文允许时，将术语核苷酸用于单链和双链分子。当将术语应用于双链分子时，其用于表示总长度并且应理解为等同于术语碱基对。
本领域技术人员应理解，双链多核苷酸的两个链可在长度上稍微不同并且其末端可以是交错的；因此在双链多核苷酸分子中的所有核苷酸均不能配对。通常来说，这样的未配对端在长度上不超过20个核苷酸。
[0184] 本文中使用的异源核酸是以下核酸：其不是由在其中表达核酸的细胞在体内正常产生的或者是由细胞产生的，但是其是处于不同的基因座或是不同地表达的或者其介导或编码介体(mediator)，所述介体通过影响转录、翻译或其他可调节的生物化学过程来改变内源核酸(例如，DNA)的表达。异源核酸通常对于将其引入的细胞不是内源的，而是从另一个细胞获得或通过合成制备的。异源核酸可以是内源的，但是为从不同基因座表达的或在其表达中改变的核酸。通常来说，虽然并非必需，但是这样的核酸编码RNA和蛋白质，所述RNA和蛋白质不是由细胞正常产生的或者不是在表达它的细胞中以相同方式正常产生的。异源核酸(例如，DNA)还可称为外源核酸(例如，DNA)。因此，异源核酸或外源核酸包括不以精确方向或位置存在的核酸分子，因为在基因组中发现对应核酸分子(例如，DNA)。其还可指来自其他生物体或物种(即，外源的)核酸分子。
[0185] 本领域技术人员可识别或认为，在本文中异源核酸涵盖对核酸在其中表达的细胞异源或外源的任何核酸(例如，DNA)；异源核酸包括外源添加的核酸，其也是内源表达的。异源核酸的实例包括但不限于编码可追踪的标记蛋白质(例如，赋予药物抗性的蛋白质)的核酸、编码治疗有效物质(例如，抗癌剂、酶和激素)的核酸、以及编码其他类型的蛋白质(例如，抗体)的核酸(例如，DNA)。由异源核酸编码的抗体可在将异源核酸引入其中的细胞的表面上分泌或表达。
[0186] 本文中使用的肽是指2个至40个氨基酸长度的多肽。
[0187] 本文中使用的在本文中提供的氨基酸的多个序列中出现的氨基酸是根据其已知的3个字母或1个字母的缩写进行鉴别的(表1)。在多个核酸片段中出现的核苷酸是用本领域常规使用的标准单个字母标记表示的。
[0188] 本文中使用的“氨基酸”是包含氨基和羧酸基的有机化合物。多肽包含两个或更多个氨基酸。为了本文中的目的，氨基酸包括20种天然氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物(即，其中α碳上具有侧链的氨基酸)。
[0189] 与 J.Biol.Chem.，243：3557-3559(1968) 中 描 述 的 和 采 用 37C.F.R.§§1.821-1.822的标准多肽命名法一致，在表1中示出了氨基酸残基的缩写：
[0190] 表1-对应表
[0191]
[0192] 在本文中由式表示的所有氨基酸残基序列具有以常规的氨基端到羧基端方向的从左到右方向。此外，短语“氨基酸残基”广泛地定义为包括对应表(表1)中所示氨基酸以及经修饰的和不常见的氨基酸，例如，在37C.F.R.§§1.821-1.822中提及的那些，并且其通过引用并入本文。此外，在氨基酸残基序列开始或末端的连接号表示肽结合到一个或更多个氨基酸残基的另一个序列上，结合到氨基端基团(例如NH2)上或结合到羧基端基团(例如COOH)上。
[0193] 本文中使用的“天然氨基酸”是指出现在多肽中的20种L-氨基酸。
[0194] 本文中使用的“非天然氨基酸”是指包含氨基和羧酸基的有机化合物，其不是表1中所列出的天然氨基酸之一。因此，非天然氨基酸包括例如除20种天然氨基酸之外的氨基酸或氨基酸类似物并且包括但不限于氨基酸的D-立体异构体。示例性非天然氨基酸是本领域技术人员已知的并且可包含在本文中提供的细胞色素P450多肽或细胞色素P450还原酶多肽中。
[0195] 本文中使用的修饰是关于多肽的氨基酸的一级序列的修饰或者核酸分子中核苷酸序列的修饰并且包括氨基酸和核苷酸的缺失、插入和置换以及重排。为了本文中的目的，可在本文中提供的细胞色素P450或细胞色素P450还原酶的任意一种中进行氨基酸置换(或替换)、缺失和/或插入。可通过在一级序列中的插入、结构域交换和其他这样的改变使保守的氨基酸置换以及使非保守的氨基酸替换来进行修饰。例如，可进行期望地或有利地改变细胞色素P450或细胞色素P450还原酶的性质的氨基酸置换。例如，可对细胞色素P450檀香烯氧化酶进行氨基酸置换以使得与未修饰细胞色素P450檀香烯氧化酶相比，所得的经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶可从檀香烯和香柠檬烯的混合物中产生更多的β-檀香醇。例如，可对细胞色素P450香柠檬烯氧化酶进行氨基酸置换以使得与未修饰细胞色素P450香柠檬烯氧化酶相比，所得的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶可从檀香烯和香柠檬烯的混合物中产生更多的香柠檬醇。修饰还可包括翻译后修饰或对分子的其他改变，所述其他改变可由于直接地或间接地缀合或连接到另一个部分而发生，但是当考虑这样的修饰时，将其称为翻译后修饰或缀合或适当的其他这样的术语。修饰多肽的方法是本领域常规的并且可通过标准方法(例如，位点定向突变、扩增方法和基因改组方法)进行。
[0196] 本文中使用的所考虑的氨基酸置换或替换包括但不限于保守替换，包括但不限于表2中所示那些。氨基酸的合适的保守替换是本领域技术人员已知的并且通常可进行所述替换而不改变多肽的构象或活性。通常来说，本领域技术人员应理解，在多肽的非关键区域中的单个氨基酸替换基本上不会改变生物活性(参见例如Watson等.Molecular Biology of the Gene，第4版，1987，The Beniamin/Cummings Pub.co.，第224页)。例如，根据如下表2中所示那些来进行保守的氨基酸替换：
[0197] 表2
[0198]原始残基 保守替换
Ala(A) Gly；Ser
Arg(R) Lys
Asn(N) Gln；His
Cys(C) Ser
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp
Gly(G) Ala；Pro
His(H) Asn；Gln
Ile(I) Leu；Val
Leu(L) Ile；Val
Lys(K) Arg；Gln；Glu
Met(M) Leu；Tyr；Ile
Phe(F) Met；Leu；Tyr
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe
Val(V) Ile；Leu；Met
[0199] 还考虑并可根据经验或根据已知的保守替换来确定其他的保守替换。
[0200] 本文中使用的DNA构建体是单链或双链、线性或环状DNA分子，其包含以自然界中不存在的方式组合和并置(juxtaposed)的DNA区段。DNA构建体作为人操作的结果而存在，并且包括所操作分子的克隆和其他拷贝。
[0201] 本文中使用的DNA区段是具有特定属性的较大DNA分子的一部分。例如，编码特定多肽的DNA区段是较长DNA分子的一部分，例如，质粒或质粒片段，当从5’读至3’方向时，其编码特定多肽的氨基酸序列。
[0202] 本文中使用的“一级序列”是指多肽中的氨基酸残基的序列。
[0203] 如本文中所使用的，两个蛋白质或核酸之间的“相似性”是指所述蛋白质的氨基酸序列或者所述核酸的核苷酸序列之间的相关性。相似性可基于包含在其中的残基序列和残基的同一性和/或同源性的程度。用于评估蛋白质或核酸之间的相似性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，在评估序列相似性的一种方法中，以产生序列之间的最大水平的同一性的方式来比对两个氨基酸序列或核苷酸序列。“同一性”是指氨基酸序列或核苷酸序列不变的程度。氨基酸序列以及某种程度上核苷酸序列的比对也可考虑氨基酸(或核苷酸)中的保守差异和/或频繁替换。保守差异是保持所包含的残基的物理化学性质的那些。比对可以是全部的(所比较的序列经过全长序列的比对并且包括所有残基)或局部的(一部分序列的比对，其仅包括最相似的区域)。
[0204] 本文中使用的“在对应于......的位置”或者核苷酸或氨基酸位置“对应于”所公开的序列(例如在序列表中所示)的核苷酸或氨基酸位置的描述是指使用标准比对算法(例如，GAP算法)通过与公开的序列进行比对确定核苷酸或氨基酸位置以使同一性最大化。为了本文中的目的，将细胞色素P450檀香烯氧化酶序列与SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列进行比对。为了本文中的目的，将细胞色素P450香柠檬烯氧化酶序列与SEQ ID NO：6、8或9的任意一个并且特别是SEQ ID NO：6中所示氨基酸序列进行比对。通过例如使用保守的和相同的氨基酸残基作为向导来比对序列，本领域技术人员可确定对应残基。通常来说，为了确定对应位置，将氨基酸序列进行比对以便获得最高级匹配(参见，例如：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，编辑，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.， 编辑，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.和 Griffin，H.G.，编 辑 .，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；以及Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑.M Stockton Press，New York，1991；Carillo等.(1988)SIAM J Applied Math 48：1073)。图2A至2B、3A至3C、5A至5B和21A至21C举例说明了用于置换的示例性对应残基的示例性比对和鉴定。
[0205] 本文中使用的“序列同一性”是指在测试多肽或多核苷酸与参考多肽或多核苷酸之间的比较中，相同或相似氨基酸或核苷酸碱基的数量。可通过核酸序列或蛋白质序列的序列比对来确定序列同一性以鉴定相似性或同一性的区域。为了本文中的目的，通常通过比对确定序列同一性以确定相同残基。对比可以是局部的或全部的。可在所比较的序列之间确定匹配、错配(mismatch)和缺口(gap)。缺口是在所比对序列的残基之间插入的空的氨基酸或核苷酸以使得相同或相似字符是对齐的。通常来说，存在内部缺口和端部缺口。通过将缺口计入相同残基数量/最短序列长度×100来确定序列同一性。当使用缺口罚分时，可使用端部缺口不罚分(例如，末端缺口不罚分)来确定序列同一性。或者，可不将缺口计入相同位置数量/总比对序列长度×100来确定序列同一性。
[0206] 本文中使用的“总体比对”是对两个序列从头到尾进行比对，每个序列中的每个字母仅比对一次的比对。无论序列之间是否存在相似性或同一性，都产生比对。例如，基于“总体比对”的50％的序列同一性意指在两个各100个核苷酸长度的所比较序列的全序列之比对中，50％的残基是相同的。应理解，即使当所比对序列的长度不相同时，总体比对也可用于确定序列同一性。除非选择“末端缺口不罚分”，否则考虑序列末端的差异以确定序列同一性。通常来说，将总体比对用在经过其大多数长度共享明显相似性的序列上。用于进行总体比对的示例性算法包括Needleman-Wunsch算法(Needleman等.(1970)J.Mol.Biol.48：443)。用于进行总体比对的示例性程序是可公共获得的并且包括可在国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)网站(ncbi.nlm.nih.gov/)上获得的总体序列比对工具(Global Sequence Alignment Tool)以及可在deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html获得的程序。
[0207] 本文中使用的“局部比对”是比对两个序列，但是仅比对共享相似性或同一性的序列的那些部分。因此，局部比对确定一个序列的子区段是否存在于另一个序列中。如果没有相似性，则没有比对返回。局部比对算法包括BLAST或Smith-Waterman算法(Adv.Appl.Math.2：482(1981))。例如，基于“局部比对”的50％的序列同一性意指在任意长度的两个所比较序列的全序列的比对中，100个核苷酸长度的相似性或同一性区域具有50％的在相似性或同一性区域中相同的残基。
[0208] 为了本文中的目的，可通过使用由各供应商或手动建立的默认缺口罚分的标准比对算法程序来确定序列同一性。GAP程序的默认参数可包括(1)一元比较矩阵(包含数值1表示同一性和数值0表示非同一性)和加权比较矩阵，见Gribskov等.(1986)Nucl.Acids Res.14：6745，描述于Schwartz和Dayhoff，编辑，Atlas of Protein Sequence and Structure，National Biomedical Research Foundation，第353至358页(1979)；(2)每个缺口罚3.0分，每个缺口的每个字符另外罚0.10分；以及(3)末端缺口不罚分。可使用已知的基于局部比对或总体比对的计算机算法(参见例如wikipedia.org/wiki/Sequence_alignment_software，其提供链接到数十个已知的或公共可获得的比对数据库和程序)来确定任意两个核酸分子是否具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“同一性”或记载同一性百分比的其他相似变体的核苷酸序列或者任意两个多肽是否具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“同一性”或描述同一性百分比的其他相似变体的氨基酸序列。通常来说，为了本文中的目的，使用基于总体比对的计算机算法来确定序列同一性，例如可获得自NCBI/BLAST(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？CMD＝Web&Page_TYPE＝BlastHome)的Needleman-Wunsch总体序列比对工具；LAlign(William Pearson implementing the Huang and Miller algorithm(Adv.Appl.Math.(1991)12：
337-357))；以及可在deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html上获得的来自Xiaoqui Huang 的程序。通常来说，当比较本文中的核苷酸序列时，使用具有末端缺口罚分的比对。当被比较的序列是基本上相同长度时，也可使用局部比对。
[0209] 本文中使用的术语“同一性”表示在测试多肽或多核苷酸与参考多肽或多核苷酸之间的比较。在一个非限制实例中，“至少90％的同一性”是指相对于参考多肽的90％至100％的同一性百分比。在90％或更高水平的同一性表示以下事实：假设为了举例说明的目的，比较100个氨基酸长度的测试多肽与参考多肽，在测试多肽中有不超过10％(即100分之10)的氨基酸不同于参考多肽中的氨基酸。在测试多核苷酸与参考多核苷酸之间可进行类似比较。将这样的差异表示为无规分布在氨基酸序列的全部长度上的点突变或者可将其集簇在高达最大许可值(例如，10/100的氨基酸差异(约90％的同一性))的变化长度的一个或更多个位置中。差异还可能出于氨基酸残基的缺失或截短。将差异定义为核酸或氨基酸替换、插入或缺失。根据所比较序列的长度，在大于约85％至90％的同源性或同一性水平下，结果合理地不依赖于程序以及所设置的缺口参数；可容易地评估这样的高水平同一性，经常不用依靠软件。
[0210] 本文中使用的术语“基本上相同的”或“相似的”随着上下文变化，正如相关领域技术人员理解的那样，但是技术人员可对其进行评估。
[0211] 本文中使用的经比对的序列是指是使用同源性(相似性和/或同一性)来比对在核苷酸或氨基酸的序列中的对应位置。通常来说，将约或50％或更高同一性相关的两个或更多个序列进行比对。序列比对组是指在对应位置比对并且可包括与基因组DNA序列进行比对的来源于RNA(例如，EST和其他cDNA)之比对序列的2个或更多个序列。
[0212] 本文中使用的基本上纯的意指足够均相以显示不含可容易检测的杂质，如通过本领域技术人员所使用的标准分析方法确定这样的纯度，所述标准分析方法例如薄层色谱(TLC)、凝胶电泳和高效液相色谱(HPLC)，或者足够纯以使得进一步的纯化不会可检测地改变物质的物理和化学性质，例如，酶活性和生物活性。用于纯化化合物以产生基本上化学纯的化合物的方法是本领域技术人员已知的。然而，基本上化学纯的化合物可以是立体异构体或异构体的混合物。在这种情况下，进一步纯化可提高化合物的比活性。
[0213] 本文中使用的分离的或经纯化的多肽或蛋白质或其生物活性部分基本上不含来自组织的细胞的细胞物质或其他污染蛋白质，所述蛋白质来源于所述组织，或者当化学合成时，其基本上不含化学前体或其他化学物质。如果其显示不合可容易检测的杂质，如通过本领域技术人员所使用的标准分析方法确定这样的纯度，所述标准分析方法例如薄层色谱(TLC)、凝胶电泳和高效液相色谱(HPLC)，或者足够纯以使得进一步的纯化不会可检测地改变物质的物理和化学性质，例如，蛋白水解和生物活性，则可确定制备物是基本上纯的。用于纯化化合物以产生基本上化学纯的化合物的方法是本领域技术人员已知的。然而，基本上化学纯的化合物可以是立体异构体的混合物。在这种情况下，进一步纯化可提高化合物的比活性。
[0214] 本文中使用的基本上不含的细胞物质包括细胞色素P450、细胞色素P450还原酶、萜或萜类化合物产物的制备物，其中细胞色素P450、细胞色素P450还原酶、萜或萜类化合物产物是从其分离或产生的细胞的细胞组分中分离的。在一个实施方案中，术语基本上不含细胞物质包括具有少于约或少于30％、20％、10％、5％或更少(按干重计)的非细胞色素P450、细胞色素P450还原酶、萜或萜类化合物产物包括细胞培养基的非细胞色素P450、细胞色素P450还原酶、萜或萜类化合物产物的制备物。当细胞色素P450或细胞色素P450还原酶是重组产生的时，其还基本上不含培养基，即，培养基占少于约或为细胞色素P450或细胞色素P450还原酶制备物体积的20％、10％或5％。
[0215] 本文中使用的术语基本上不含化学前体或其他化学物质包括细胞色素P450或细胞色素P450还原酶蛋白质的制备物，其中蛋白质是从化学前体或参与蛋白质合成的其他化学物质中分离的。术语包括具有少于约或少于30％(按干重计)、20％、10％、5％或更少的化学前体或非合酶化学物质或组分的细胞色素P450或细胞色素P450还原酶蛋白的制备物。
[0216] 如本文所使用的，提及合成的，例如合成的核酸分子或合成的基因或合成的肽，是指通过重组方法和/或通过化学合成方法产生的核酸分子或多肽分子。
[0217] 本文中使用的通过使用重组DNA方法的重组方法产生是指使用公知的分子生物学方法来表达由所克隆的DNA编码的蛋白质。
[0218] 本文中使用的载体(或质粒)是指用于将异源核酸引入细胞以进行其表达或复制的分立DNA元件。载体通常保持附加型(episomal)，但是可设计其以将基因或其一部分整合到基因组染色体中。还考虑以下载体，其为人工染色体，例如，细菌人工染色体、酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。这样的载剂的选择和使用是本领域技术人员公知的。
[0219] 本文中使用的表达是指核酸转录为mRNA并翻译为肽、多肽或蛋白质的过程。如果核酸来源于基因组DNA，则若选择适当的真核宿主细胞或生物体的话，表达可包括诸如mRNA剪接的过程。
[0220] 本文中使用的表达载体包括能够表达与调控序列(例如启动子区)有效连接的DNA的载体，其能够进行这样的DNA片段的表达。这样的另外区段可包括启动子和终止子序列，并且可任选地包括一个或更多个复制起始点、一个或更多个可选标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体通常来自质粒或病毒DNA，或者可包含两者的元件。因此，表达载体是指重组DNA或RNA构建体，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，其在引入适当宿主细胞时，导致所克隆DNA的表达。适当的表达载体是本领域技术人员公知的并且包括可在真核细胞和/或原核细胞中复制的那些和保留附加型的那些或整合到宿主细胞基因组中的那些。
[0221] 本文中使用的载体还包括“病毒载体(virus vector)”或“病毒的载体(viral vector)”。病毒的载体是有效地连接到外源基因以将外源基因转移(作为运载工具(vehicle)或穿梭(shuttle))到细胞中的经改造的病毒。病毒载体包括但不限于腺病毒载体、逆转录病毒载体和痘苗病毒载体。
[0222] 如本文所使用的，当提及DNA区段时，可操作地或有效地连接意指排列所述区段以使得其协同地行使其功能以达到其预期目的，例如，转录在启动子的下游和任何被转录序列的上游起始。启动子通常是转录机(transcriptional machinery)与其结合以起始转录并经过编码区段进行到终止子的区域。
[0223] 本文中使用的“嵌合蛋白”或“融合蛋白”是指有效地连接到不同多肽的多肽。例如，由包含来自一个核酸分子的编码序列和来自另一个核酸分子的编码序列的核酸序列编码的多肽，其中编码序列在同一个阅读框以使得当融合构建体在宿主细胞中转录和翻译时，产生包含两个蛋白质的蛋白质。两个分子在构建体中可以是相邻的或者由包含1个、2个、3个或更多个但是通常少于10个、9个、8个、7个或6个氨基酸的接头多肽分开。将由融合构建体编码的蛋白质产物称为融合多肽。本文中提供的嵌合蛋白或融合蛋白可包括一种或更多种檀香烯合酶多肽或其一部分和/或一种或更多种细胞色素P450多肽或其一部分和/或一种或更多种细胞色素P450还原酶多肽和/或一种或更多种其他多肽，其用于转录/翻译控制信号、信号序列、定位标签、纯化标签、用于鉴定的蛋白质、免疫球蛋白G的结构域的一部分和/或靶向剂的任意一种或更多种。嵌合细胞色素P450多肽或细胞色素P450还原酶多肽还包括具有其内源结构域或与另一种多肽交换的多肽的区域的那些。这些嵌合蛋白或融合蛋白包括通过重组方式产生的作为融合蛋白的那些、通过化学方式(例如通过例如偶联到巯基的化学偶联)产生的那些、以及由任何其他方法产生的那些，从而通过接头将至少一种多肽(即，细胞色素P450或细胞色素P450还原酶)或其一部分直接或间接地通过接头连接至另一种多肽。
[0224] 本文中使用的术语评估或确定包括在获得产物活性的绝对值以及在获得表示活性水平的指数、比值、百分比、可视值或其他值的意义上的定量确定和定性确定。评估可以是直接的或间接的。
[0225] 如本文所使用的，记载多肽“基本上由所列举氨基酸序列组成”意指仅存在全长多肽的所列举部分或其片段。多肽可任选地并且通常可包括来自其他来源的另外氨基酸或者可将其插入另一个多肽中。
[0226] 如本文所使用的，除非上下文另外清楚地说明，否则没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。因此，例如，提及包含“氨基酸置换”的多肽包括具有一个或多个氨基酸置换的多肽。
[0227] 本文中使用的，可将范围和量表达为“约”具体值或范围。约还包括精确的量。因此，“约5％”意指“约5％”以及“5％”。
[0228] 本文中使用的“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情形发生或不发生，并且该描述包括事件或情形发生的情况以及其不发生的情况。例如，任选的分离萜的步骤意指分离或不分离萜，或者，任选的分离萜类化合物的步骤意指分离或不分离萜类化合物。
[0229] 如本文所使用的，除非另外说明，否则用于任意保护基团、氨基酸和其他化合物的缩写均与其常规用法、公认缩写或IUPAC-IUB生物化学命名委员会(the Commission on Biochemical Nomenclature)相一致(参见，(1972)Biochem.11：1726)。
[0230] 为了公开内容的清楚起见，而不是进行限制，将发明详述分为以下小节。
[0231] B.概述
[0232] 本文中提供了用于产生檀香醇和其他倍半萜类化合物的来自檀香的细胞色素P450酶及其变体和修饰形式。这样的细胞色素P450催化从檀香烯和香柠檬烯生物合成产生檀香醇或香柠檬醇，所述檀香烯和香柠檬烯两者均可通过酶檀香烯合酶从法尼焦磷酸来生物合成地产生(参见，WO 2011/000026和Jones等.(2011)J Biol Chem 286：17445-17454)。本文中还提供了来自檀香的细胞色素P450还原酶及其变体和修饰形式。本文中还提供了从法尼二磷酸和/或檀香烯和香柠檬烯制备檀香醇和其他倍半萜类化合物的方法。所提供的细胞色素P450酶以商业上可用的量并以成本有效和能量高效的方式提供了这些有价值的产物(包括檀香醇和香柠檬醇)的产生。
[0233] 1.萜类化合物的生物合成
[0234] 萜是一大类多样的有机化合物，其是通过多种植物从非环状焦磷酸酯异戊二烯前体例如牻牛儿焦磷酸(GPP)、法尼焦磷酸(FPP)和牻牛儿基牻牛儿焦磷酸(GGPP)产生的。萜是基于其包含的异戊二烯(C5H8)单元的数量来命名的。例如，单萜来自GPP并且包含10个碳，倍半萜来自FPP并且包含15个碳，以及二萜来自GGPP并且包含20个碳。经化学修饰的萜称为萜类化合物或类异戊二烯。萜和萜类化合物是植物的精油的主要组成并且将其广泛地用作食物的风味添加剂、香料业以及传统和替代医疗的芳香剂。
[0235] 檀香醇和香柠檬醇是出现在植物中的倍半萜类化合物，包括檀香属的心材，包括檀香(印度檀香、白檀香(White Sandalwood、Chandana)、新喀里多尼亚檀香(澳大利亚檀香(Australian Sandalwood))和大果澳洲檀香。还可在植物例如兰花中发现香柠檬醇。檀香醇和香柠檬醇分别是檀香烯和香柠檬烯的氧化产物。在檀香中，约90％的精油由倍半萜醇(Z)-α-檀香醇、(Z)-β-檀香醇和(Z)-表-β-檀香醇以及(Z)-α-外-香柠檬醇构成。α-檀香醇和β-檀香醇是檀香油芳香剂的最主要贡献者。(Z)-α-檀香醇和(Z)-β-檀香醇是正宗檀香油的主要组分。
[0236] 本文中提供的P450酶可用于产生主要用于檀香油芳香剂的倍半萜醇。檀香烯和香柠檬烯是通过萜合酶檀香烯合酶从非环状焦磷酸酯前体FPP通过生物合成而合成的(参见，WO 2011/000026和Jones等.(2011)J Biol Chem 286：17445-17454)。已知檀香烯合酶产生檀香烯的混合物(即，α-檀香烯、β-檀香烯、表-β-檀香烯和α-外-香柠檬烯)。檀香烯合酶的实例是SEQ ID NO：16中所示的檀香的檀香烯合酶(SaSSY)和SEQ ID NO：17中所示编码氨基酸序列；SEQ ID NO：59中所示的新喀里多尼亚檀香的檀香烯合酶(SauSSY，Genbank登记号：HQ343277或AD087001)和SEQ ID NO：52中所示编码氨基酸序列；或者SEQ ID NO：60中所示的大果澳洲檀香的檀香烯合酶(SspiSSy，Genbank登记号：HQ343278或AD087002)和SEQ ID NO：53中所示编码氨基酸序列。
[0237] 发现本文中提供的细胞色素P450氧化酶多肽催化从α-檀香烯形成α-檀香醇、从β-檀香烯形成β-檀香醇、从表-β-檀香烯形成表-β-檀香醇和/或从α-反式-香柠檬烯形成α-反式-香柠檬醇的一种或更多种。通常在细胞色素还原酶的存在下进行通过细胞色素P450氧化酶之萜底物的羟基化或单加氧化。例如，在生物合成中包括本文中提供的檀香细胞色素还原酶(SaCPR)以将电子从NADPH供给细胞色素P450。因此，可通过转化与编码檀香烯合酶的核酸分子组合的编码本文中提供的细胞色素P450氧化酶和细胞色素P450还原酶的核酸来在宿主细胞中代谢改造包括檀香油组分的檀香醇和香柠檬醇的生物合成的途径。
[0238] a.檀香醇
[0239] 特别地，负责檀香油芳香剂的檀香醇包括α-檀香醇(1和9)、β-檀香醇(2和10)和表-β-檀香醇(3和11)(参见图1)。(Z)-α-檀香醇(Z-α-檀香醇；(Z)-5-(1R，
2，6
2S，6S)-2，3-二甲基三环[2.2.1.0 ]庚烷-3-基)-2-甲基戊-2-烯-1-醇；1)和
(E)-α-檀香醇((E)-5-((1R，2s，6S)-2，3-二甲基三环[2.2.1.02，6]庚烷-3-基)-2-甲基戊-2-烯-1-醇；9)是通过倍半萜α-檀香烯5的氧化经过生物合成而合成的(参见图
1)。(Z)-β-檀香醇(Z-β-檀香醇；(Z)-2-甲基-5-[(1S，2R，4R)-2-甲基-3-亚甲基-二环[2.2.1]庚烷-2-基]戊-2-烯-1-醇；2)和(E)-β-檀香醇((E)-2-甲基-5-((1S，
2R，4R)-2-甲基-3-亚甲基二环[2.2.1]庚烷-2-基)戊-2-烯-1-醇；10)是通过倍半萜β-檀香烯6的氧化经过生物合成而合成的(参见图1)。(E)-表-β-檀香醇((E)-2-甲基-5-[(1R，2R，4S)-2-甲基-3-亚甲基二环[2.2.1]庚烷-2-基)戊-2-烯-1-醇；3)和(Z)-表-β-檀香醇((Z)-2-甲基-5-((1R，2R，4S)-2-甲基-3-亚甲基二环[2.2.1]庚烷-2-基)戊-2-烯-1-醇；11)是通过倍半萜表-β-檀香烯7的氧化经过生物合成而合成的(参见图1)。
[0240]
[0241] b.香柠檬醇
[0242] (Z)-α-反式-香柠檬醇((Z)-α-外-香柠檬醇；顺式-α-反式-香柠檬醇；(2Z)-5-[(1S，5S，6R)-2，6-二甲基二环[3.3.1]庚-2-烯-6-基]-2-甲基-2-戊烯-1-醇；
4)和(E)-α-反式-香柠檬醇((E)-α-外-香柠檬醇；(E)-5-((1S，5S，6R)-2，6-二甲基二环[3.1.1]庚-2-烯-6-基)-2-甲基戊-2-烯-1-醇；12)是在檀香油中发现的倍半萜类化合物，其通过倍半萜α-反式-香柠檬烯8的氧化经过生物合成而合成(参见图1)。
[0243]
[0244] 2.细胞色素P450酶
[0245] 细胞色素P450(CYP)是血红素蛋白或血红素硫醇盐蛋白的超家族，其催化氧到多种范围的疏水底物的单个插入，常具有高区域选择性和立体选择性。细胞色素P450是参与代谢广泛化合物的普遍存在的蛋白质。因此，P450广泛存在于自然界并参与诸如生物异源物质(xenobiotic)的解毒、罕见碳源的分解代谢和次生代谢产物的生物合成的过程。指出了CYP的广泛底物特异性和氧的使用，而不需要腺苷二磷酸(ADP)的磷酸化。其可介导环氧化、脱卤、脱氨和脱烷基化、在氮和硫杂原子上的单加氧化、羟基化。由CYP催化的特定反应包括脱甲基化、羟基化、环氧化、N-氧化、硫氧化、N-脱烷基化、S-脱烷基化和O-脱烷基化、脱硫、脱氨，以及偶氮、硝基和N-氧化物基团的还原。
[0246] 通常来说，细胞色素P450是单加氧酶，将一个氧原子加入底物中。通常来说，单加氧化需要一个或两个另外的蛋白质来将电子从NAD(P)H转移到血红素铁并且将CYP置于基于其电子转移配偶体(partner)的组或类。I类CYP，通常在细菌和真核线粒体P450系统中，使用含FAD的还原酶和铁-硫氧还蛋白(redoxin)和铁氧还蛋白(ferrodoxin)。含FAD的还原酶将电子从NAD(P)H转移到铁氧还蛋白，其继而还原CYP。II类细胞色素P450是在真核生物和植物中最常见的CYP，并且还包括微粒体和细菌P450系统。II类CYP使用NADPH：细胞色素P450还原酶(或细胞色素P450还原酶)来将电子从NAD(P)H转移到细胞色素P450。存在利用其他电子转移链的许多其他类。
[0247] 使用系统命名法来命名细胞色素P450，其包括在根符号CYP之后的表示家族的数字、表示亚家族的字母和表示单个基因的数字，例如，CYP76-G5。家族共享大于40％的氨基酸序列同一性并且亚家族共享大于55％的氨基酸序列同一性。
[0248] 植物细胞色素P450基因家族是非常大的。例如，总基因组序列检查显示在拟南芥属中至少272个预测的细胞色素P450基因并且在水稻中至少455个独特的细胞色素P450基因(参见例如Nelson等.(2004)Plant Physiol.135(2)：756-772)。植物CYP可位于内质网(ER)和叶绿体。在植物中，CYP包括广泛范围的羟化酶、环氧酶、过氧化酶和很大程度上基于II类单加氧化的加氧酶。植物P450参与包括例如植物产物(例如，苯丙素类、生物碱、萜类化合物、脂、生氰糖苷、芥子油苷)的合成的生物化学途径(参见例如Chapple(1998)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.49：311-343)。
[0249] a.结构
[0250] 虽然细胞色素P450之中的序列保守性相对较低，但是其一般形态和结构折叠是高度保守的。在所有CYP之中只有3个完全保守的残基，即，ExxR模体(SEQ ID NO：54)的谷氨酸和精氨酸以及血红素结合半胱氨酸。保守的结构结(nodule)对于结构和功能是重要的，并且参与底物识别的可变区决定各自性质(参见例如Werck-Reichhart和Feyereisen(2000)Genome Biology 1(6)3000.1-3000.9，Sirim等.(2010)BMC Structural Biology 10：34和Baudry等.(2006)Prot Eng Design&Selection 19：343-353)。
[0251] 细胞色素P450通常含有包含在β结构域和α结构域中的α螺旋，表示A到L，以及β-折叠，表示1到5，所述β结构域与底物识别有关并且主要由β折叠构成，所述α结构域包含催化中心并且主要是α螺旋。结构性区域如下，从N-端至C-端：螺旋A、β链1-1、β链1-2、螺旋B、β链1-5、螺旋B’、螺旋C、螺旋C’、螺旋D、β链3-1、螺旋E、螺旋F、螺旋G、螺旋H、β链5-1、β链5-2、螺旋I、螺旋J、螺旋J’、螺旋K、β链1-4、β链2-1、β链2-2、β链1-3、螺旋K’、螺旋K”、血红素结构域、螺旋L、β链3-3、β链4-1、β链4-2和β链3-2(参见例如Werck-Reichhart和Feyereisen(2000)Genome Biology1(6)3000.1-3000.9)。
[0252] 细胞色素P450通过在蛋白质N-端附近的跨膜螺旋锚定到植物中的内质网(ER)或叶绿体中(Chapple(1998)Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 49：311-343)。跨膜螺旋通常在包含一系列碱性氨基酸残基的铰链区和包含共有序列(P/I)PGPx(G/P)xP(SEQ ID NO：55)的富含脯氨酸区之后。该铰链区允许与膜相关的酶的最佳定向。脯氨酸铰链区的缺失导致活性的完全丧失(Szczesna-Skorupa等.(1993)Arch Biochem Biophys 304：170-175)并且脯氨酸残基到丙氨酸的突变使结构断裂以便消除血红素并入(Yamazaki等.(1993)J Biochem 114：652-657)。
[0253] 保守的CYP核心区域由称为“回曲(meander)”的卷曲、四螺旋束(螺旋D、螺旋E、螺旋I和螺旋L)、螺旋J和螺旋K以及两组β-折叠构成(Werck-Reichhart和Feyereisen(2000)Genome Biology 1(6)3000.1-3000.9)。核心区域包含含有位于恰好在螺旋L之前的血红素近极面上的P450共有序列GRRxCP(A/G)(SEQ ID NO：56)的血红素结合环，具有充当血红素铁的第5配体之完全保守的半胱氨酸。催化的活性位点是具有保守的半胱氨酸残基的硫醇盐作为第5配体的铁原卟啉IX(血红素)；留下最终配位点以结合并活化分子氧(Groves等，1995 In Cytochrome P450：Structure，Mechanism，and Biochemistry(编辑：Ortiz de Montellano)Plenum Press，New York，NY，第3页至48页)。核心区域还包含螺旋I的中心部分，所述螺旋I包含含有苏氨酸的结合袋以用于催化所需的氧分子，其具有还对应于质子转移沟(groove)的共有序列(A/G)Gx(D/E)T(T/S)(SEQ ID NO：57)。最后，核心区域包含在血红素近极面上的螺旋K中之完全保守的ExxR模体(SEQ ID NO：54)(参见例如Werck-Reichhart和Feyereisen(2000)Genome Biology
1(6)3000.1-3000.9)。酶的近极面参与氧化还原配偶体识别和电子到活性位点的转移。质子流入远极面的活性位点通道。底物入口通道位于与F-G环、A螺旋以及β链1-1和1-2之间膜紧密接触。
[0254] 细胞色素P450底物识别位点(SRS)是不同的并且包括SRS1，B螺旋与C螺旋之间的环区域；SRS2，F螺旋的C末端；SRS3，G螺旋的FG环和N-末端的部分；SRS4，在活性位点经过吡咯环B延伸的包含SRS4的螺旋I；SRS5，K螺旋与β-折叠1的链4之间的环；以及SRS6，在β折叠4中的β-转角。
[0255] b.功能
[0256] 细胞色素P450在生理学温度下催化非活化烃的区域特异性和立体特异性氧化。细胞色素P450使用铁血红素中心来使分子氧活化并且使用氧化还原电子穿梭来支持氧化反应。通过细胞色素P450系统的羟基化的一般反应为，
[0257] RH+NADPH+H++O2→ROH+NADP++H2O，
[0258] 其中R表示底物化合物。通常来说，如上所述，细胞色素P450是单加氧酶，催化将分子氧的原子之一插入到底物中，并将第二个氧还原成水。催化包括1)底物结合；2)复合物的一个电子还原为二价铁态；3)结合分子氧以得到超氧化物复合物；以及4)导致短期活化的氧簇的第二次还原。活化的氧攻击底物通常导致底物的单加氧化。由CYP催化的其他反应包括脱烷基化、脱水、脱氢、异构化、二聚化、碳-碳键断裂和还原。
[0259] 3.细胞色素P450还原酶
[0260] 细胞色素P450还原酶(NADPH：细胞色素P450还原酶；NADPH-细胞色素P450氧化还原酶；NADPH：铁血红素蛋白氧化还原酶；NADPH：P450氧化还原酶；CPR；CYPOR；EC1.6.2.4)是电子从NAD(P)H转移到细胞色素P450、血红素加氧酶、细胞色素b5和角鲨烯环氧酶所需的二黄素(diflavin)还原酶家族的多域酶(Louerat-Orieu等(1998)Eur J Biochem 258：1040-1049)。已知植物包含细胞色素P450还原酶的多个同工型(参见，Ro等.(2002)Plant Physiology 130：1837-1851；Mizutani和Ohta(1998)Plant Physiology
116：357-367)。通常来说，至少一个CPR是组成型表达的并且另一些CPR由环境应力例如UV光和病原体感染来增强。此外，植物细胞色素P450还原酶可位于ER或叶绿体，其中位置由对应的偶配体细胞色素P450酶来确定。
[0261] a.结构
[0262] 细胞色素P450还原酶在不同物种包括如细菌、酵母、真菌、植物、鱼类、昆虫和哺乳动物之间共享氨基酸序列同源性(约30％高至约90％)(Louerat-Orieu等(1998)Eur J Biochem 258：1040-1049)。细胞色素P450还原酶包含两个功能性结构域，疏水N-端单个α-螺旋膜锚定结构域(SEQ ID NO：12的第1至95位氨基酸)和亲水C-端催化结构域(SEQ ID NO：12的96位至704位氨基酸)(Wang等.(1997)Proc Natl Acad Sci USA 94：8111-8416)。N-端结构域包含将蛋白质锚定到膜(例如到植物中的ER或叶绿体)的疏水膜锚定结构域(SEQ ID NO：12的40位至60位氨基酸)，从而确保CPR和CYP是空间上相关的以允许电子转移。N-端结构域对于活性而言不是必需的，因为只有C-端可溶结构域能够将电子转移到细胞色素c或其他电子受体。C-端可溶结构域包含两个结构性结构域，N-端黄素单核苷酸(FMN)结构域(SEQ ID NO：12的第101至244位氨基酸)和C-端黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结构域(SEQ ID NO：12的第301至704位氨基酸)(Dym和Eisenberg(2001)Protein Science 10：1712-1728)。FMN结构域是与允许与黄素辅因子FMN结合的黄素氧还蛋白同源的。包含黄素辅因子FAD和NADPH的结合结构域的FAD结构域还包含催化活性所必需的残基。FMN和FAD结构域通过连接结构域(SEQ ID NO：12的第245至300位氨基酸)进行连接，所述连接结构域负责FMN和FAD结构域的相对定向以确保高效电子转移所必需的两个黄素辅因子的适当对齐。
[0263] N-端FMN结构域具有反向平行的β-结构，同时C-端NAD(P)亚结构域具有吡啶二核苷酸结合折叠的典型类型。FMN结构域包含侧接5个α-螺旋的5个成链的β-折叠，其中FMN位于β-折叠的C-端侧。FAD结合结构域的核心是反向平行的扁平β-桶并且NADP(H)结合结构域是平行的侧接α-螺旋的5个成链β-折叠。连接结构域主要由α-螺旋构成。结构性区域如下，从N-端至C-端：α-螺旋A；β-链1；α-螺旋B；β-链2；α-螺旋C；β-链3；α-螺旋D；β-链4；α-螺旋E；β-链5；α-螺旋F；β-链6；
β-链7；β-链8；β-链9；β-链10；α-螺旋G；β-链11；β-链12；β-链12’；α-螺旋H；α-螺旋I；α-螺旋J；α-螺旋K；α-螺旋M；β-链13；β-链14；β-链15；α-螺旋N；β-链16；β-链16’；β-链17；α-螺旋O；β-链18；α-螺旋P；β-链10；α-螺旋Q；α-螺旋R；β-链20；α-螺旋S；α-螺旋T；以及β-链21。
[0264] 细胞色素P450还原酶包含保守的辅因子和底物结合结构域，包括FMN结合区域、FAD结合区域、NADPH结合区域以及细胞色素c结合位点和细胞色素P450结合位点。P450结合位点和细胞色素c结合位点包含SEQ ID NO 12的第232至240位氨基酸。FMN结构域包含FMN焦磷酸(SEQ ID NO：12的第98至119位氨基酸)和FMN异咯嗪环(SEQ ID NO：12的第161至214位氨基酸)的结合区域。FAD结构域包含FAD焦磷酸(SEQ ID NO：12的第317至353位氨基酸)和FAD异咯嗪环(SEQ ID NO：12的第482至505位氨基酸)的
结合区域。FAD结合袋包含SEQ ID NO：12的第344、482、484、485、500至502、516至519和704位氨基酸并且FAD结合模体包括SEQ ID NO：12的第482、484和485位氨基酸。FAD结构域还包含NADPH核糖和焦磷酸的结合区域(SEQ ID NO：12的第555至576位氨基酸)和NADPH烟酰胺(SEQ ID NO：12的第651至668位氨基酸)的结合区域。NADPH结合袋包含SEQ ID NO：12的第324、502、204、560、561、595、595、624、625、630、632、634、659、663和
666位氨基酸残基。SEQ ID NO：12的氨基酸残基Ser485、Cys657、Asp702和Trp704是参与氢化物转移的催化残基(Hubbard等.(2001)J Biol Chem 276：29163-29170)。SEQ ID NO：12的第516、519和522位氨基酸残基包含在磷酸结合模体中(Dym和Eisenberg(2001)Protein Science 10：1712-1728)。βαβ结构模体由SEQ ID NO：12的第557、560至563和565位氨基酸残基形成(Dym和Eisenberg(2001)Protein Science 10：1712-1728)。
[0265] b.功能
[0266] 细胞色素P450还原酶通过黄素辅因子FAD和FMN将两个电子从NAD(P)H穿梭到细胞色素P450。FAD从两个电子供体NAD(P)H接收氢化物阴离子并且将电子一次一个传给FMN。然后，FMN将电子供给细胞色素P450。如上所述，细胞色素P450使用电子来进行多种底物的羟基化。
[0267] C.细胞色素P450多肽和编码细胞色素P450多肽的核酸分子
[0268] 本文中提供了细胞色素P450多肽，包括细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽和细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽。本文中还提供了编码本文中提供的细胞色素P450多肽的任意一种的核酸分子。本文中提供的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽催化分别从α-檀香烯、β-檀香烯或表-β-檀香烯形成α-檀香醇、β-檀香醇或表-β-檀香醇，包括从β-檀香烯产生β-檀香醇。本文中提供的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽还能够催化从α-反式-香柠檬烯形成α-反式-香柠檬醇。在一些实例中，编码细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽的核酸分子是与檀香树檀香中分离的那些相同或基本上相同的那些。在另一些实例中，核酸分子和所编码的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽是从檀香树檀香中分离的那些的变体。本文中提供的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽催化从α-反式-香柠檬烯形成α-反式-香柠檬醇。在一些实例中，编码细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽的核酸分子是与从檀香树檀香中分离的那些相同的那些。在另一些实例中，核酸分子和所编码的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽是从檀香树檀香中分离的那些的变体。
[0269] 本文中还提供了经修饰的细胞色素P450多肽和编码本文中提供的任意经修饰的细胞色素P450多肽的任意一个的核酸分子。修饰可在细胞色素P450多肽(包括细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽或细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽)的任意区域进行，只要所得的经修饰的细胞色素P450多肽至少保留未修饰细胞色素P450多肽的催化活性即可。例如，可对细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽进行修饰，只要所得的经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽保留细胞色素P450檀香烯氧化酶活性(即，催化檀香烯(即α-檀香烯、β-檀香烯或表-β-檀香烯)的羟基化的能力)即可。在另一个实例中，可对细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽进行修饰，只要所得的经修饰的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽保留细胞色素P450香柠檬烯氧化酶活性(即，催化香柠檬烯(即，α-反式-香柠檬烯)的羟基化的能力)即可。
[0270] 修饰可包括但不限于：核酸的密码子优化和/或导致所编码的多肽的单个氨基酸修饰(例如单个或多个氨基酸置换(替换)、插入或缺失或者多个氨基酸修饰，例如多个氨基酸置换、插入或缺失，包括多肽的区域或结构域的交换)的改变。在一些实例中，将全部或部分结构域或区域，例如本文以下描述的任意结构域或区域，与来自另一个细胞色素P450多肽的其相应结构域或区域或部分交换。修饰的实例是氨基酸置换，包括单个或多个氨基酸置换。例如，与不包含修饰的细胞色素P450多肽相比，本文中提供的经修饰的细胞色素P450多肽可包含至少或1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、
26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、
40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、
54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、
68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、
82个、83个、84个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、120个或更多个经修饰的位置。
[0271] 本文中提供了来自CYP76家族的细胞色素P450多肽。本文中提供了具有SEQ ID NO：50中所示氨基酸序列的CYP76细胞色素P450多肽。本文中还提供了表现出与SEQ ID NO：50中所示细胞色素P450多肽至少60％氨基酸序列同一性的细胞色素P450多肽。例如，本文中提供的细胞色素P450多肽可表现出与SEQ ID NO：50中所示细胞色素P450多肽至少或至少约65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性，只要所得的细胞色素P450多肽至少保留细胞色素P450单加氧酶活性(即，催化萜的羟基化或单加氧化的能力)即可。本文中还提供了来自CYP76家族的经修饰的细胞色素P450多肽。特别地，本文中提供的经修饰的细胞色素P450多肽包含相对于具有SEQ ID NO：50中所示氨基酸序列的细胞色素P450多肽的氨基酸置换或替换、添加或缺失、截短或其组合。在细胞色素P450多肽或其任意变体中进行这样的修饰并测试本文中所述的各细胞色素P450活性(例如单加氧酶活性)是在本领域技术人员的知识范围内的。
[0272] 本文中还提供了编码具有SEQ ID NO：50中所示氨基酸序列的细胞色素P450多肽之具有SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列或其简并序列的CYP76核酸分子。可将SEQ ID NO：1中所示CYP76核酸分子用于设计引物，所述引物用于鉴定和/或克隆另外的CYP蛋白质。
本文中还提供了具有与SEQ ID NO：1中所示核苷酸序列至少85％序列同一性之编码细胞色素P450多肽的核酸分子。例如，本文中提供的核酸分子可表现出与SEQ ID NO：1中所示核苷酸序列至少或约至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％或更高序列同一性，只要所编码的细胞色素P450多肽至少保留细胞色素P450单加氧酶活性(即，催化萜的羟基化的能力)。本文中还提供了编码具有SEQ ID NO：50中所示氨基酸序列的细胞色素P450多肽之SEQ ID NO：1中所示序列的简并序列序列。同一性百分比可由本领域技术人员使用标准比对程序来确定。
[0273] 本 文 中 提 供 了 细 胞 色 素 P450 SaCYP76F39v1(CYP76-G10)、SaCYP76F42(CYP76-G13)、SaCYP76F39v2(CYP76-G15)、SaCYP76F40(CYP76-G16) 和SaCYP76F41(CYP76-G17)多肽。本文中提供了具有SEQ ID NO：7、74、75、76或77中所示氨基酸序列的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽。本文中还提供了表现出与SEQ ID NO：7、74、
75、76或77中任意一个中所示细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽至少60％氨基酸序列同一性的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽。例如，本文中提供的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽可表现出与SEQ ID NO：7、73、74、75或76中所示细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽至少或至少约65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性，只要所得的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽至少保留细胞色素P450檀香烯氧化酶活性(即，催化檀香烯(即，α-檀香烯、β-檀香烯或表-β-檀香烯)的羟基化的能力)即可。同一性百分比可由本领域技术人员使用标准比对程序来确定。
[0274] 本 文 中 提 供 了 细 胞 色 素 P450 SaCYP76F38v1(CYP76-G5)、SaCYP76F37v1(CYP76-G11)、SaCYP76F38v2(CYP76-G12) 和 SaCYP76F37v2(CYP76-G14) 多肽。本文中提供了具有SEQ ID NO：6、8、9或73中所示氨基酸序列的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽。本文中还提供了表现出与SEQ ID NO：6、8、9或73中所示细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽至少60％氨基酸序列同一性的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽。例如，本文中提供的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽可表现出与SEQ ID NO：6、8、9或73中所示细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽至少或至少约65％、70％、75％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或99％的氨基酸序列同一性，只要所得的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽至少保留细胞色素P450香柠檬烯氧化酶活性(即，催化香柠檬烯的羟基化的能力)即可。同一性百分比可由本领域技术人员使用标准比对程序来确定。
[0275] 本文中还提供了细胞色素P450 SaCYP76F43(CYP76-G18)多肽。本文中提供了具有SEQ ID NO：78中所示氨基酸序列的细胞色素P450多肽。本文中还提供了表现出与SEQ ID NO：78中所示细胞色素P450多肽至少60％氨基酸序列同一性的细胞色素P450多肽。例如，本文中提供的细胞色素P450多肽可表现出与SEQ ID NO：78中所示细胞色素P450多肽至少或至少约65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性，只要所得的细胞色素P450多肽至少保留细胞色素P450单加氧酶活性(即，催化萜的羟基化或单加氧化的能力)即可。特别地，本文中提供的经修饰的细胞色素P450多肽包含相对于具有SEQ ID NO：78中所示氨基酸序列的细胞色素P450多肽的氨基酸置换或替换、添加或缺失、截短或其组合。在细胞色素P450多肽或其任意变体中进行这样的修饰并测试本文中所述的各细胞色素P450活性(例如单加氧酶活性)是在本领域技术人员的知识范围内的。
[0276] 此外，在一些实例中，本文中提供了细胞色素P450多肽的催化活性片段。在一些实例中，如上所述进行修饰包括细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽或细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽的细胞色素P450多肽的活性片段。这样的片段保留全长细胞色素P450多肽(包括全长檀香烯氧化酶多肽或细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽)的一种或更多种性质。通常来说，活性片段表现出细胞色素P450檀香烯氧化酶或细胞色素P450香柠檬烯氧化酶活性(即，分别催化檀香醇和香柠檬醇的形成)。
[0277] 本文中提供的细胞色素P450，包括本文中提供的细胞色素P450檀香烯氧化酶或细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽，可包含其他修饰，例如，未在多肽的一级序列中的修饰，包括翻译后修饰。例如，本文中所述的修饰可以是为融合多肽或嵌合多肽的细胞色素P450檀香烯氧化酶或细胞色素P450香柠檬烯氧化酶，包括不同细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽或细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽或者不同细胞色素P450单加氧酶(例如，包含来自另一种细胞色素P450单加氧酶的一个或更多个结构域或区域)的杂交并且还包括通过本领域已知的其他方法基于已知的多肽序列重组地制备的或合成的或构建的合成细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽或细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽。
[0278] 可将本文中提供的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽或细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽分别用于催化檀香醇和香柠檬醇的产生。通常来说，本文中提供的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽催化从檀香烯形成檀香醇，例如，其催化檀香烯的羟基化。在一些实例中，细胞色素P450檀香烯氧化酶还催化从香柠檬烯形成香柠檬醇。通常来说，本文中提供的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽催化从香柠檬烯形成香柠檬醇，例如，其催化香柠檬烯的羟基化。反应可在体内进行，例如，在将核酸引入其中的宿主细胞中进行。多肽的至少一种对于宿主是异源的。反应还可在适当条件下，通过将酶与适当的底物相接触在体外进行。
[0279] 本文中提供了编码檀香烯合酶和细胞色素P450檀香烯氧化酶的核酸分子。本文中还提供了编码檀香烯合酶和细胞色素P450香柠檬烯氧化酶的核酸分子。在这样的一些实例中，核酸分子在合适宿主例如细菌细胞或酵母细胞中的表达导致檀香烯合酶和细胞色素P450氧化酶的表达。这样的细胞可用于产生檀香烯合酶和细胞色素P450氧化酶和/或用于在体内进行反应以产生檀香醇和香柠檬醇。例如，檀香醇和香柠檬醇可在宿主细胞中从法尼二磷酸(FPP)产生，特别是在过度地产生非环状萜前体FPP的酵母细胞中产生。在一些实例中，编码法尼二磷酸合酶例如檀香法尼二磷酸合酶的核酸分子还可在合适的宿主例如细菌细胞或酵母细胞中表达以导致FPP的过度表达。
[0280] 本文中还提供了编码檀香烯合酶、细胞色素P450多肽和细胞色素P450还原酶多肽的核酸分子。例如，本文中提供了编码檀香烯合酶、细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽和细胞色素P450还原酶多肽的核酸分子。在另一个实例中，本文中提供了编码檀香烯合酶、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽和细胞色素P450还原酶多肽的核酸分子。所述核酸分子可以在相同载体或质粒或者在不同载体或质粒中。在这样的一些实例中，核酸分子在合适的宿主(例如细菌细胞或酵母细胞)中的表达导致檀香烯合酶和细胞色素P450氧化酶的表达。这样的细胞可用于产生檀香烯合酶和细胞色素P450氧化酶和/或用于在体内进行反应以产生檀香醇和香柠檬醇。例如，檀香醇和香柠檬醇可在宿主细胞中从法尼二磷酸(FPP)产生，特别是在过度地产生非环状萜前体FPP的酵母细胞中产生。
[0281] 1.细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽
[0282] 本文中提供了细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽。本文中还提供了编码任意一种本文中提供的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽的核酸分子。本文中提供的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽催化在檀香油中发现的萜类化合物的形成，包括α-檀香醇、β-檀香醇、表-β-檀香醇和α-反式-香柠檬醇。本文中提供的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽催化从檀香烯形成檀香醇。在一些实例中，本文中提供的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽还催化从香柠檬烯形成香柠檬醇。例如，细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽催化从α-檀香烯形成α-檀香醇、从β-檀香烯形成β-檀香醇和/或从表-β-檀香烯形成表-β-檀香醇(例如，细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽催化α-檀香烯、β-檀香烯和/或表-β-檀香烯的羟基化)。在一个特定的实例中，细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽催化从α-檀香烯形成(E)-α-檀香醇、从α-檀香烯形成(Z)-α-檀香醇、从β-檀香烯形成(E)-β-檀香醇、从β-檀香烯形成(Z)-β-檀香醇、从表-β-檀香烯形成(E)-表-β-檀香醇和/或从表-β-檀香烯形成(Z)-表-β-檀香醇。在一些实例中，本文中提供的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽还催化从α-反式-香柠檬烯形成(Z)-α-反式-香柠檬醇和/或(E)-α-反式-香柠檬醇。在一个特定的实例中，本文中提供的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽催化(E)-α-檀香醇、(Z)-α-檀香醇、(E)-β-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(E)-表-β-檀香醇、(Z)-表-β-檀香醇、(Z)-α-反式-香柠檬醇和/或(E)-α-反式-香柠檬醇的形成。特别地，细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽分别以约1∶5和1∶4的比例来产生α-檀香醇和β-檀香醇的(Z)立体异构体和(E)立体异构体。细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽表现出窄的底物特异性，优选α-檀香烯或β-檀香烯。在一些实例中，细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽还转化底物α-没药醇。
[0283] 在一些实例中，本文中提供的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽催化从非环状前体法尼焦磷酸与檀香烯合酶的萜反应产物形成在檀香油中发现的萜类化合物，包括α-檀香醇、β-檀香醇、表-β-檀香醇和α-反式-香柠檬醇。例如，本文中提供的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽催化从非环状前体FPP与檀香烯合酶(例如，檀香檀香烯合酶(SaSSY；SEQ ID NO：16))的萜反应产物形成(E)-α-檀香醇、(Z)-α-檀香醇、(E)-β-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(E)-表-β-檀香醇、(Z)-表-β-檀香醇、(Z)-α-反式-香柠檬醇和/或(E)-α-反式-香柠檬醇。细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽催化从正宗檀香油中以不同比例形成(E)-α-檀香醇、(Z)-α-檀香醇、(E)-β-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(E)-表-β-檀香醇、(Z)-表-β-檀香醇、(Z)-α-反式-香柠檬醇和/或(E)-α-反式-香柠檬醇(参见，实施例11和图15A和15B)。例如，用SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)形成的主要产物是(E)-α-檀香醇和(E)-β-檀香醇，而檀香油的主要化合物是(Z)-α-檀香醇和(Z)-β-檀香醇(参见图15A和15B)。
[0284] 例如，本文中提供了具有SEQ ID NO：7、74、75、76和77中任意一个中所示氨基酸序列的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽。本文中还提供了表现出与具有SEQ ID NO：7、74、75、76和77中任意一个中所示氨基酸序列的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽至少60％氨基酸序列同一性的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽。例如，本文中提供的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽可表现出与SEQ ID NO：7、74、75、76和77中任意一个中所示细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽至少或约或65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性，只要细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽表现出细胞色素P450檀香烯氧化酶活性(即，催化从檀香烯形成檀香醇和/或从香柠檬烯形成香柠檬醇)即可。同一性百分比可由本领域技术人员使用标准比对程序来确定。
[0285] 本文中提供了细胞色素P450檀香烯氧化酶，其为具有SEQ ID NO：7、74、75、76和77中 所 示 氨 基 酸 序 列 之 分 别 指定 为 SaCYP76F39v1(CYP76-G10)、SaCYP76F39v2(CYP76-G15)、SaCYP76F40(CYP76-G16)、SaCYP76F41(CYP76-G17) 和SaCYP76F42(CYP76-G13)的细胞色素P450檀香烯氧化酶。本文中还提供了具有SEQ ID NO：
7、74、75、76和77中任意一个中所示氨基酸序列的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽的活性片段。这样的片段保留细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽的一种或更多种性质。通常来说，活性片段表现出细胞色素P450檀香烯氧化酶活性(即，催化从檀香烯形成檀香醇的能力)。
[0286] 本文中还提供了具有SEQ ID NO：3、68、69、70和71中任意一个中所示氨基酸序列或其简并序列的核酸分子，其分别编码具有SEQ ID NO：7、74、75、76和77中所示氨基酸序列的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽。本文中还提供了具有与SEQ ID NO：3、68、69、70和71中任意一个中所示核苷酸序列至少85％序列同一性之编码细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽的核酸分子。例如，本文中提供的核酸分子可表现出与SEQ ID NO：3、68、69、70和71中任意一个中所示核苷酸序列至少或约至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、95％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性，只要所编码的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽表现出细胞色素P450檀香烯氧化酶活性(即，催化从檀香烯形成檀香醇的能力)。本文中还提供了分别编码具有SEQ ID NO：7、74、75、76和77中所示氨基酸序列的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽之SEQ ID NO：3、68、69、70和71的任一个中所示序列的简并序列。同一性百分比由本领域技术人员使用标准比对程序来确定。
[0287] 在一些实例中，编码细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽的核酸分子是从檀香树檀香中分离的。在另一些实例中，核酸分子和所编码的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽是从檀香树檀香中分离的那些的变体。
[0288] 在一个特定的实例中，在表达檀香烯合酶的酵母体内测定中(参见，实施例10.B.2)和使用α-檀香烯、α-反式-香柠檬烯、表-β-檀香烯和β-檀香烯的混合物作为底物的体外测定中(参见，实施例11.B.2.a.ii)，具有SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列的SaCYP76F39v1(CYP76-G10)多肽催化(E)-α-檀香醇、(Z)-α-檀香醇、(E)-β-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(E)-表-β-檀香醇、(Z)-表-β-檀香醇、(Z)-α-反式-香柠檬醇和(E)-α-反式-香柠檬醇的形成。在体内测定中，(E)-β-檀香醇、(E)-α-檀香醇和(Z)-β-檀香醇是主要产物(参见，图11A)。在体外测定中，(E)-β-檀香醇和(E)-α-檀香醇是主要产物(参见，图15A)。在另一些实施例中，在使用α-檀香烯、α-反式-香柠檬烯或者表-β-檀香烯和β-檀香烯的体外测定中，SaCYP76F39v1(CYP76-G10)多肽分别催化(Z)-α-檀香醇和(E)-α-檀香醇、(Z)-α-反式-香柠檬醇和(E)-α-反式-香柠檬醇、(Z)-表-β-檀香醇和(E)-表-β-檀香醇以及(Z)-β-檀香醇和(E)-β-檀香醇的形成(参见，实施例11.C.和图20A至20C)。在以下实施例12中描述了以α-檀香烯和β-檀香烯作为底物的SaCYP76F39v1(CYP76-G10)多肽的动力学性质。
[0289] 在另一个实施例中，在表达檀香烯合酶的酵母体内测定中，具有SEQ ID NO：74中所示氨基酸序列的SaCYP76F39v2(CYP76-G15)多肽催化(E)-α-檀香醇、(Z)-α-檀香醇、(E)-β-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(E)-表-β-檀香醇、(Z)-表-β-檀香醇、(Z)-α-反式-香柠檬醇和(E)-α-反式-香柠檬醇的形成(参见，实施例10.B.3和图13A)。在使用α-檀香烯、α-反式-香柠檬烯、表-β-檀香烯和β-檀香烯的混合物作为底物的体外测定中，SaCYP76F39v2(CYP76-G15)多肽催化(E)-α-檀香醇、(Z)-α-檀香醇、(E)-β-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(E)-表-β-檀香醇、(Z)-表-β-檀香醇、(Z)-α-反式-香柠檬醇和(E)-α-反式-香柠檬醇的形成(参见实施例11.B.3.b和图16A)，其中(E)-α-檀香醇和(E)-β-檀香醇为主要产物。
[0290] 在另一个实例中，在表达檀香烯合酶的酵母体内测定中，具有SEQ ID NO：75中所示氨基酸序列的SaCYP76F40(CYP76-G16)多肽催化(E)-α-檀香醇、(Z)-α-檀香醇、(E)-β-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(E)-表-β-檀香醇、(Z)-α-反式-香柠檬醇和(E)-α-反式-香柠檬醇的形成(参见，实施例10.B.3和图13B)。在使用α-檀香烯、α-反式-香柠檬烯、表-β-檀香烯和β-檀香烯的混合物作为底物的体外测定中，SaCYP76F40(CYP76-G16)多肽催化(E)-α-檀香醇、(E)-β-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(Z)-α-反式-香柠檬醇和(E)-α-反式-香柠檬醇的形成(参见，实施例11.B.3.b和图
16B)，其中(E)-α-反式-香柠檬醇和(E)-β-檀香醇为主要产物。
[0291] 在另一个实例中，在表达檀香烯合酶的酵母体内测定中，具有SEQ ID NO：76中所示氨基酸序列的SaCYP76F41(CYP76-G17)多肽催化(E)-α-檀香醇、(Z)-α-檀香醇、(E)-β-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(E)-表-β-檀香醇、(Z)-表-β-檀香醇和(E)-α-反式-香柠檬醇的形成(参见，实施例10.B.3和图13C)。在使用α-檀香烯、α-反式-香柠檬烯、表-β-檀香烯和β-檀香烯的混合物作为底物的体外测定中，SaCYP76F41(CYP76-G17)多肽催化(E)-α-檀香醇、(Z)-α-檀香醇、(E)-β-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(E)-表-β-檀香醇、(Z)-表-β-檀香醇、(Z)-α-反式-香柠檬醇和(E)-α-反式-香柠檬醇的形成(参见，实施例11.B.3.b和图16C)，其中(E)-α-檀香醇为主要产物。
[0292] 在另一个实例中，在表达檀香烯合酶的酵母体内测定中，具有SEQ ID NO：77中所示氨基酸序列的SaCYP76F42(CYP76-G13)多肽催化(Z)-α-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(E)-表-β-檀香醇和(E)-α-反式-香柠檬醇的形成(参见实施例10.B.3和图13D)。在使用α-檀香烯、α-反式-香柠檬烯、表-β-檀香烯和β-檀香烯的混合物作为底物的体外测定中，SaCYP76F42(CYP76-G13)多肽催化(E)-α-檀香醇、(Z)-α-檀香醇、(E)-β-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(E)-表-β-檀香醇、(Z)-表-β-檀香醇、(Z)-α-反式-香柠檬醇和(E)-α-反式-香柠檬醇的形成(参见，实施例11.B.3.b和图16D)，其中(E)-α-反式-香柠檬醇为主要产物。
[0293] 经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽
[0294] 本文中还提供了经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽。所述修饰通常是氨基酸插入、缺失和/或替换，这些修饰可在细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽的任何区域中实现，只要得到的经修饰细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽至少保留细胞色素P450檀香烯氧化酶活性即可。例如，修饰可发生在细胞色素P450檀香烯氧化酶的任何区域中，只要得到的经修饰细胞色素P450檀香烯氧化酶至少保留细胞色素P450檀香烯氧化酶活性即可(即，能够催化由檀香烯形成檀香醇)。
[0295] 所述修饰可以是单氨基酸修饰，例如单氨基酸替换(取代)、插入或缺失；或多氨基酸修饰，例如多氨基酸替换、插入或缺失。在一些实例中，可将全部或部分结构域或区域(例如下文中所述的任何结构域或区域)与来自另一细胞色素P450多肽的对应结构域或区域或其一部分交换。示例性的修饰是氨基酸替换，包括单氨基酸替换或多氨基酸替换。例如，与不包含修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽相比，本文中提供的经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽可包含至少或1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、
39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、
53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、
67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、
81个、82个、83个、84个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、120个或更多个经修饰位置。例如，本文中所述的修饰可发生在具有SEQ ID NO：7、74、75、76和77中任一个所示的氨基酸序列的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽或其任何变体中，所述变体包括与SEQ ID NO：7、74、75、76和77中任一个所示的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的任何变体。基于该描述，本领域技术人员能够产生本文所述之包含任一种或更多种所述突变的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽，并对每一种的细胞色素P450檀香烯氧化酶活性进行测试。
[0296] 在一些实例中，本文中还提供了细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽的经修饰的活性片段，其包含本文中提供的任何修饰。这样的片段保留了细胞色素P450檀香烯氧化酶的一个或更多个特性。通常来说，细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽表现出檀香烯氧化酶活性(即，能够水解檀香烯和/或香柠檬烯)
[0297] 也可对还包含其他修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽进行细胞色素P450檀香烯氧化酶中的修饰，包括一级序列中的修饰和不在该多肽一级序列中的修饰。例如，本文中所述的修饰可发生在为融合多肽或嵌合多肽的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽中，包括不同细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽与不同细胞色素P450多肽的杂合体(例如包含一个或更多个来自其他细胞色素P450的结构域或区域)以及基于已知多肽的序列通过本领域中已知的其他方法重组制备或合成或构建的合成细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽。
[0298] 在一些实例中，所述修饰是氨基酸替换。在另一些实例中，本文中提供的经修饰细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽包含结构域中的一种或更多种修饰。如本文其他部分所述，结构域或结构性结构域中的修饰可通过替换来自另一细胞色素P450多肽的对应异源残基。
[0299] 一般不在细胞色素P450檀香烯氧化酶活性所必需的那些位置处(即在催化中心或保守残基中)进行修饰以保留细胞色素P450檀香烯氧化酶活性。例如，一般不在对应于参考SEQ ID NO：7、74、75、76或77中任一个所示的氨基酸序列的Glu367、Arg370、Gly445、Arg446、Arg447、Ile448、Cys449、Pro450或Gly451的位置进行修饰。
[0300] 经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽可包含两种或更多种修饰，包括氨基酸替换或取代、插入或缺失、截短或其组合。一般情况下，本领域技术人员可将本文中提供的多种修饰组合，只要经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽保留细胞色素P450檀香烯氧化酶活性即可。
[0301] 本文中还提供了编码本文中提供的经修饰细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽的核酸分子。在一些具体实例中，所述核酸序列可以是经密码子优化的，例如以提高所编码序列的表达水平。特定密码子的使用取决于在其中表达经修饰多肽的宿主生物体。本领域技术人员熟悉用于在细菌或酵母(包括例如大肠杆菌(E.coli)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))中表达的最优密码子。例如，密码子的使用信息可获自可在kazusa.or.jp.codon得到的密码子使用数据库(Codon Usage Database)(有关该数据库的描述参见Richmond(2000)Genome Biology，1：241)。还参见，Forsburg(2004)Yeast，10：1045-1047；Brown 等 (1991)Nucleic Acids Research，19：4298；Sharp 等 (1988)Nucleic Acids Research，12：8207-8211；Sharp等(1991)Yeast，657-78。在本文中的一些实例中，本文中提供的核酸序列是基于酿酒酵母中的密码子使用来进行密码子优化的。
[0302] 本文中提供的经修饰多肽和编码核酸分子可通过本领域技术人员已知的标准重组DNA技术产生。可采用本领域中已知的引起靶蛋白中的任一个或更多个氨基酸突变的任何方法。方法包括对编码核酸分子进行标准定点诱变或随机诱变，或固相多肽合成法。例如，如本文所述，可通过易错PCR、定点诱变、重叠PCR、基因改组或其他重组方法来对编码细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽的核酸分子进行诱变，例如对该编码核酸进行随机诱变。然后，可将这些多肽编码核酸导入宿主细胞中以被异源表达。因此，本文中还提供了编码本文中提供的任一种经修饰多肽的核酸分子。在一些实例中，经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽通过合成方式产生，例如使用固相或溶液相肽合成。
[0303] 2.细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽
[0304] 本文中提供了细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽。本文中还提供了编码本文中提供的任一种细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽的核酸分子。本文中提供的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽催化香柠檬烯形成香柠檬醇。通常来说，细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽催化α-反式-香柠檬烯形成(Z)-α-反式-香柠檬醇和(E)-α-反式-香柠檬醇(例如细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽催化α-反式-香柠檬烯的羟基化)。在一些具体实例中，细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽催化α-反式-香柠檬烯形成(E)-α-反式-香柠檬醇。在一些实例中，细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽另外催化形成少量的(E)-α-檀香醇和(E)-β-檀香醇。细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽表现出窄的底物特异性，优选α-檀香烯和β-檀香烯。在一些实例中，细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽还转化底物反式-橙花叔醇。
[0305] 例如，本文中提供了具有SEQ ID NO：6、8、9和73中任一个所示的氨基酸序列的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽。本文中还提供了表现出与具有SEQ ID NO：6、8、9和73中任一个所示的氨基酸序列的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽至少60％氨基酸序列同一性的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽。例如，本文中提供的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽可表现出与SEQ ID NO：6、8、9和73中任一个所示的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽至少或约或65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列同一性，只要这些细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽表现出细胞色素P450香柠檬烯氧化酶活性(即催化香柠檬烯形成香柠檬醇)即可。同一性百分比可通过本领域技术人员用标准比对程序确定。
[0306] 本文中提供了命名为SaCYP76F38v1(CYP76-G5)、SaCYP76F37v1(CYP76-G11)、SaCYP76F38v2(CYP76-G11)和SaCYP76F37v2(CYP76-G14)的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶，它们分别具有SEQ ID NO：6、8、9和73中所示的氨基酸序列。本文中还提供了具有SEQ ID NO：6、8、9和73中任一个所示的氨基酸序列的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽的活性片段。这样的片段保留了细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽的一个或更多个特性。通常来说，这些活性片段表现出细胞色素P450香柠檬烯氧化酶活性(即能够催化香柠檬烯从香柠檬醇的羟基化)。
[0307] 在一些具体实例中，在以α-檀香烯、α-反式-香柠檬烯、表-β-檀香烯和β-檀香烯的混合物作为底物的体外测定中，本文提供之具有SEQ ID NO：6、8、9和73中所示的氨基酸序列的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶催化形成(E)-α-反式-香柠檬醇、(E)-α-檀香醇和(E)-β-檀香醇。在这样的一些实例中，(E)-α-反式-香柠檬醇是主要产物，而(E)-α-檀香醇和(E)-β-檀香醇是次要产物(参见实施例11.B.3.b和图17A至17D)。在另一个实例中，在使用α-檀香烯、α-反式香柠檬烯或表-β-檀香烯和β-檀香烯的体外测定中，本文提供之具有SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶分别催化形成(E)-α-檀香醇、(E)-α-反式-香柠檬醇或(E)-β-檀香醇(参见实施例11.C和图20D至20F)。在又一些实施方案中，在表达檀香烯合酶的酵母中的体内测定中，本文提供之具有SEQ ID NO：6、8、9和73中所示的氨基酸序列的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶催化形成(E)-α-反式-香柠檬醇(参见实施例10.C.2和图14A至14D)。
SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)多肽以α-和β-檀香醇作为底物时的动力学特性在下文的实施例12中进行了描述。
[0308] 本文中还提供了具有SEQ ID NO：2、4、5和67中任一个所示的氨基酸序列或其简并序列的核酸分子，其分别编码具有SEQ ID NO：6、8、9和73中所示的氨基酸序列的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽。本文中还提供了编码细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽之与SEQ ID NO：2、4、5和67中任一个所示的核苷酸序列具有至少85％序列同一性的核酸分子。例如，本文中提供的核酸分子可表现出与SEQ ID NO：2、4、5和67中任一个所示的核苷酸序列至少或约至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、95％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性，只要所编码的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽表现出细胞色素P450香柠檬烯氧化酶活性(即能够催化香柠檬烯形成香柠檬醇)即可。本文中还提供了SEQ ID NO：2、4、5和67中任一个所示的序列的简并序列，其分别编码具有SEQ ID NO：6、8、9和73中所示的氨基酸序列的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽。同一性百分比可通过本领域技术人员用标准比对程序确定。
[0309] 在一些实例中，编码细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽的核酸分子分离自檀香树檀香。在另一些实例中，所述核酸分子和所编码的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽是分离自檀香树檀香的那些的变体。
[0310] 经修饰的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽
[0311] 本文中提供了经修饰的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽。所述修饰通常是氨基酸插入、缺失和/或替换，这些修饰可在细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽的任何区域中实现，只要得到的经修饰细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽至少保留细胞色素P450香柠檬烯氧化酶活性即可。例如，修饰可发生在细胞色素P450香柠檬烯氧化酶的任何区域中，只要得到的经修饰细胞色素P450香柠檬烯氧化酶至少保留细胞色素P450香柠檬烯氧化酶活性即可(即，能够催化香柠檬烯形成香柠檬醇)。
[0312] 所述修饰可以是单氨基酸修饰，例如单氨基酸替换(取代)、插入或缺失；或多氨基酸修饰，例如多氨基酸替换、插入或缺失。在一些实例中，可将全部或部分结构域或区域(例如下文中所述任何结构域或区域)与来自另一细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽的对应结构域或区域或其一部分交换。示例性的修饰是氨基酸替换，包括单氨基酸替换或多氨基酸替换。例如，与不包含修饰的细胞色素P450多肽相比，本文中提供的经修饰的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽可包含至少或1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、
24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、
38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、
52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、
66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、
80个、81个、82个、83个、84个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、120个或更多个经修饰位置。例如，本文中所述的修饰可发生在具有SEQ ID NO：6、8、9和73中任一个所示的氨基酸序列的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽或其任何变体中，所述任何变体包括与SEQ ID NO：6、8、9和73中任一个所示的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或99％序列同一性的任何变体。基于该描述，本领域技术人员能够产生本文中所述之包含任一种或更多种所述突变的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽，并对每一种的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶活性进行测试。
[0313] 在一些实例中，本文中还提供了细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽的经修饰的活性片段，其包含本文中提供的任何修饰。这样的片段保留了细胞色素P450香柠檬烯氧化酶的一个或更多个特性。通常来说，细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽表现出香柠檬烯氧化酶活性(即，能够水解香柠檬烯)。
[0314] 细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽中的修饰还包含其他修饰，包括一级序列中的修饰和不在该多肽一级序列中的修饰。例如，本文中所述的修饰可发生在为融合多肽或嵌合多肽的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽中，其包括不同细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽与不同细胞色素P450多肽的杂合体(例如包含一个或更多个来自另一细胞色素P450的结构域或区域)以及基于已知多肽的序列通过本领域中已知的其他方法重组制备或合成或构建的合成细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽。
[0315] 在一些实例中，所述修饰是氨基酸替换。在另一些实例中，本文中提供的经修饰细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽包含结构域中的一种或更多种修饰。如本文其他部分所述，结构域或结构性结构域中的修饰可通过替换来自另一细胞色素P450多肽的对应异源残基。
[0316] 一般不在细胞色素P450活性所必需的那些位置处(即在催化中心或保守残基中)进行修饰以保留细胞色素P450香柠檬烯氧化酶活性。例如，一般不在对应于参考SEQ ID NO：6、8、9或73中所示的氨基酸序列的Glu367、Arg370、Gly445、Arg446、Arg447、Ile448、Cys449、Pro450或Gly451的位置进行修饰。
[0317] 经修饰的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽可包含两种或更多种修饰，包括氨基酸替换或取代、插入或缺失、截短或其组合。一般情况下，本领域技术人员可将本文中提供的多种修饰组合，只要经修饰的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽保留细胞色素P450香柠檬烯氧化酶活性即可。
[0318] 本文中还提供了编码本文中提供的任何经修饰细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽的核酸分子。在一些具体实例中，所述核酸序列可以是经密码子优化的，例如以提高所编码序列的表达水平。特定密码子的使用取决于在其中表达经修饰多肽的宿主生物体。本领域技术人员熟悉用于在细菌或酵母(包括例如大肠杆菌或酿酒酵母)中表达的最优密码子。例如，密码子的使用信息可获自可在kazusa.or.jp.codon得到的密码子使用数据库(Codon Usage Database)(有关该数据库的描述参见Richmond(2000)Genome Biology，1：241)。还参见，Forsburg(2004)Yeast，10：1045-1047；Brown等(1991)Nucleic Acids Research，19：4298；Sharp 等 (1988)Nucleic Acids Research，12：8207-8211；Sharp 等(1991)Yeast，657-78。在本文中的一些实例中，本文中提供的核酸序列是基于酿酒酵母中的密码子使用来进行密码子优化的。
[0319] 本文中提供的经修饰多肽和编码核酸分子可通过本领域技术人员已知的标准重组DNA技术产生。可采用本领域中引起靶蛋白中的任一个或更多个氨基酸突变的任何已知方法。方法包括对编码核酸分子进行标准定点诱变或随机诱变，或固相多肽合成法。例如，如本文所述，可通过易错PCR、定点诱变、重叠PCR、基因改组或其他重组方法来对编码细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽的核酸分子进行诱变，例如对该编码核酸进行随机诱变。然后，可将这些多肽编码核酸导入宿主细胞中以被异源表达。因此，本文中还提供了编码本文中提供的任一种经修饰多肽的核酸分子。在一些实例中，经修饰的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽通过合成方式产生，例如使用固相或溶液相肽合成。
[0320] 3.另外的修饰
[0321] 本文中提供了包含另外修饰的细胞色素P450多肽，其包括细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽和细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽。例如，经修饰的细胞色素P450多肽包括，例如，截短的细胞色素P450多肽、具有改变的活性或特性的细胞色素P450多肽、嵌合细胞色素P450多肽、包含结构域交换的细胞色素P450多肽、细胞色素P450融合蛋白或具有本文其他部分所述的任何修饰的细胞色素P450多肽。
[0322] a.截短的多肽
[0323] 本文中还提供了截短的P450多肽。所述截短的细胞色素P450多肽可在N端或C端被截短，只要这些截短的细胞色素P450多肽保留细胞色素P450的催化活性(例如细胞色素P450檀香烯氧化酶活性或细胞色素P450香柠檬烯氧化酶活性)即可。通常来说，截短的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽表现出檀香烯氧化酶活性(即，能够催化檀香烯(即α-檀香烯、β-檀香烯或表-β-檀香烯)的羟基化)。通常来说，截短的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽表现出香柠檬烯氧化酶活性(即，能够催化香柠檬烯的羟基化)。在一些实例中，细胞色素P450多肽(包括细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽和细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽)在C端被截短。在另一些实例中，细胞色素P450多肽(包括细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽和细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽)在N端被截短。
[0324] 在一些实例中，细胞色素P450多肽(包括细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽和细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽)可在本文中提供的细胞色素P450多肽的N端、C端或两端被截短，例如截短SEQ ID NO：6至9中任一个所示的氨基酸序列。在另一些实例中，本文中提供的任何经修饰的细胞色素P450多肽均是被截短的。经修饰的细胞色素P450多肽可在N端、C端或两端被截短。例如，本文中提供的任何细胞色素P450多肽可在N端被截短约或至少或1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、1920个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、
43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、
57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、
71个、72个、73个、74个、75个或更多个氨基酸残基，只要该细胞色素P450多肽保留细胞色素P450活性即可。在另一些实例中，本文中提供的任何细胞色素P450多肽可在C端被截短约或至少或1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、1920个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、
29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、
43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、
57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、
71个、72个、73个、74个、75个或更多个氨基酸残基，只要该细胞色素P450多肽保留细胞色素P450活性即可。
[0325] b.具有改变的活性或特性的多肽
[0326] 本文中提供的经修饰的细胞色素P450多肽还可在活性和/或特性方面表现出变化。经修饰的细胞色素P450多肽可表现出，例如，改善的特性，例如催化活性提高、选择性提高、底物特异性提高、底物结合提高、稳定性提高和/或在宿主细胞中的表达提高；和改变的特性，例如产物分布改变和底物特异性改变。这些改善或改变的活性可引起檀香醇和/或香柠檬醇的产生提高。
[0327] 在一些实例中，经修饰的细胞色素P450多肽具有改变的底物特异性。例如，与未修饰细胞色素P450多肽相比，经修饰的细胞色素P450多肽的底物特异性可被改变至少或至少约10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。例如，经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽或细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽可催化不是檀香烯或香柠檬烯的萜底物的单氧合作用。在这样的一些实例中，经修饰的细胞色素P450多肽催化任何合适的萜底物形成不同于檀香醇或香柠檬醇的萜类化合物。例如，经修饰的细胞色素P450多肽可产生一种或更多种不同于檀香醇或香柠檬醇的不同单萜类化合物、倍半萜类化合物或二萜类化合物。
[0328] 在一些实例中，经修饰的细胞色素P450多肽具有改变的萜类化合物产物分布。在一些实例中，产物分布改变引起期望萜类化合物产物的量提高，因此与未修饰细胞色素P450相比，产物分布得到改善。在另一些实例中，产物分布改变引起期望萜类化合物产物的量降低，因此与未修饰细胞色素P450相比，经修饰的细胞色素P450的产物分布被降低。
在一个实例中，与未修饰细胞色素P450檀香烯氧化酶相比，经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶产生不同的萜类化合物产物比。例如，与由未修饰细胞色素P450产生的不同萜类化合物的量相比，由经修饰的细胞色素P450产生的萜类化合物的量提高或降低至少或至少约或0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、
40％、50％、60％、70％、80％或更多。例如，与由未修饰细胞色素P450檀香烯氧化酶产生的不同萜类化合物(例如α-檀香醇)的量相比，由经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶产生的萜类化合物(例如β-檀香醇)的量可提高至少或至少约0.5％、1％、2％、3％、4％、
5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。在一些实例中，与任何其他的萜类化合物相比，经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶产生更多的β-檀香醇。在另一个实例中，与未修饰细胞色素P450香柠檬烯氧化酶相比，经修饰的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶产生不同的萜类化合物产物比。例如，与由未修饰细胞色素P450香柠檬烯氧化酶产生的不同萜类化合物的量相比，由经修饰的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶产生的萜类化合物(例如，α-反式-香柠檬醇)的量可提高至少或至少约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、
35％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。
[0329] 在一些实例中，与未修饰细胞色素P450多肽相比，经修饰的细胞色素P450多肽表现出类似、提高和/或改善的活性。例如，与未修饰细胞色素P450多肽相比，经修饰的细胞色素P450多肽表现出提高的萜类化合物产生。萜类化合物产量提高可以是由经修饰的细胞色素P450多肽产生的萜类化合物的总量提高或者可以是由经修饰的细胞色素P450多肽产生的特定萜类化合物的量提高。例如，与未修饰细胞色素P450多肽相比，经修饰的细胞色素P450多肽的总萜类化合物产量可提高至少或至少约1％、3％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。在一些实例中，与未修饰细胞色素P450多肽相比，经修饰的细胞色素P450多肽的总萜类化合物产量是至少或约1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、
17倍、18倍、19倍、20倍或更多。在另一个实例中，与未修饰细胞色素P450多肽相比，经修饰的细胞色素P450多肽的特定萜类化合物的产量提高至少或至少约1％、3％、5％、10％、
15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。在一些实例中，与未修饰细胞色素P450多肽相比，经修饰的细胞色素P450多肽产生至少或约1.2倍、1.5倍、2倍、
3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍或更多的特定萜类化合物产物。
[0330] 在一些实例中，与未修饰细胞色素P450多肽相比，经修饰的细胞色素P450多肽表现出改善的底物特异性。与未经修饰细胞色素P450多肽的底物特异性相比，经修饰细胞色素P450多肽的底物特异性可提高至少或至少约1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。例如，相比较于诸如香柠檬烯的不同萜，经修饰的细胞色素P450多肽可对诸如檀香烯的萜表现出提高的底物特异性。在这样的一些实例中，对檀香烯的特异性提高引起檀香醇的产量提高而香柠檬醇的产量降低。
[0331] 在一些实例中，与未修饰细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽相比，经修饰的细胞色素P450多肽(例如经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽)表现出类似或提高或改善的檀香烯氧化酶活性。例如，与未修饰细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽相比，经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽可对α-檀香烯、β-檀香烯和/或表-β-檀香烯的氧化表现出提高的特异性或选择性。在这样的一些实例的一些例子中，与未修饰细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽相比，经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶选择性地单氧化β-檀香烯。在另一些实例中，与未修饰细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽相比，经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶对香柠檬烯的氧化表现出降低的选择性。例如，与未修饰细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽相比，经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶对香柠檬烯的氧化表现出至少或至少约10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多的活性降低。
[0332] 在一些实例中，与未修饰细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽相比，经修饰的细胞色素P450多肽(例如经修饰的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽)表现出类似或提高或改善的香柠檬烯氧化酶活性。例如，与未修饰细胞色素P450香柠檬烯氧化酶相比，经修饰的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽可对α-反式-香柠檬烯的氧化表现出提高的特异性或选择性。
[0333] c.结构域交换
[0334] 本文中提供了这样的经修饰的细胞色素P450多肽，其为包含通过缺失其中的多个结构域或区域之一或其一部分的氨基酸残基并插入异源氨基酸序列的交换(缺失并插入)的嵌合多肽。在一些实例中，所述异源序列是随机化的氨基酸序列。在另一些实例中，所述异源序列是来自另一细胞色素P450的对应结构域或区域或其一部分的连续氨基酸序列。被替换或插入的异源序列一般包括至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个或更多个氨基酸。在其中所述异源序列来自另一细胞色素P450的对应结构域或其一部分的实例中，所述异源序列一般包含该对应结构域或区域或部分的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的连续氨基酸。在这一实例中，本文中提供的经修饰的细胞色素P450多肽中还可包括紧接该异源对应结构域或区域或其一部分的残基。
[0335] 在本文中提供的交换突变体的一个实例中，细胞色素P450多肽的至少一个结构域或区域或其一部分被来自另一细胞色素P450多肽的对应结构域或区域或其一部分的连续氨基酸序列替换。在一些实例中，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个结构域或区域或其一部分被来自另一细胞色素P450多肽的对应结构域或区域或其一部分的连续氨基酸序列替换。
[0336] 细胞色素P450多肽的任何结构域或区域或其一部分均可被异源氨基酸序列替换，例如来自另一细胞色素P450多肽的对应结构域或区域的异源序列。结构域或区域可以是结构性结构域或功能性结构域。本领域技术人员熟悉细胞色素P450中的结构域或区域。功能性结构域包括例如催化结构域或其一部分。结构性结构域包括以下中的所有或一部分：螺旋A、β链1-1、β链1-2、螺旋B、β链1-5、螺旋B’、螺旋C、螺旋C’、螺旋D、β链
3-1、螺旋E、螺旋F、螺旋G、螺旋H、β链5-1、β链5-2、螺旋I、螺旋J、螺旋J’、螺旋K、β链1-4、β链2-1、β链2-2、β链1-3、螺旋K’、螺旋K”、血红素结构域、螺旋L、β链3-3、β链4-1、β链4-2和β链3-2。本领域技术人员熟悉多种细胞色素P450并可鉴定其对应结构域或区域或部分的氨基酸。
[0337] 通常来说，得到的经修饰细胞色素P450多肽表现出细胞色素P450单加氧酶活性并且能够从檀香烯和香柠檬烯产生檀香醇和/或香柠檬醇。例如，与不包含修饰(例如氨基酸替换或者结构域或区域中的氨基酸残基交换)的细胞色素P450檀香烯氧化酶和/或SEQ ID NO：7、74、75、76或77中所示的野生型细胞色素P450檀香烯氧化酶相比，经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽对檀香烯表现出50％至5000％，例如50％至120％、100％至500％或110％至250％的檀香醇产生。通常来说，与不包含修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶(例如与SEQ ID NO：7、74、75、76或77中所示的细胞色素P450檀香烯氧化酶)相比，经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽对檀香烯表现出提高的檀香醇产生。
例如，经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽可由檀香烯产生以下量的檀香醇：所述量是由檀香烯在相同条件下通过不包含修饰的野生型细胞色素P450檀香烯氧化酶合酶产生的檀香醇的量的至少或约101％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、
110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％、160％、170％、180％、
200％、250％、300％、350％、400％、500％、1500％、2000％、3000％、4000％、5000％。例如，檀香醇产量提高至少1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、
12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍或更多。
[0338] 在另一个实例中，与不包含修饰(例如氨基酸替换或者结构域或区域中的氨基酸残基交换)的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶和/或SEQ ID NO：6、8、9或73中所示的野生型细胞色素P450香柠檬烯氧化酶相比，经修饰的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽对香柠檬烯表现出50％至5000％，例如50％至120％、100％至500％或110％至250％的香柠檬醇产量。通常来说，与不包含修饰的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶，例如与SEQ ID NO：6、8、9或73中所示的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶相比，经修饰的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽对香柠檬烯表现出提高的香柠檬醇产生。例如，经修饰的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽可从香柠檬烯产生以下量的香柠檬醇：所述量是由香柠檬烯在相同条件下通过不包含修饰的野生型细胞色素P450香柠檬烯氧化酶合酶产生的香柠檬醇的量的至少或约101％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％、115％、120％、
125％、130％、135％、140％、145％、150％、160％、170％、180％、200％、250％、300％、
350％、400％、500％、1500％、2000％、3000％、4000％、5000％。例如，香柠檬醇产量提高至少1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、
15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍或更多。
[0339] 在本文中的一些具体实例中，本文中提供的经修饰细胞色素P450多肽是交换突变体，其中一个或更多个结构性结构域的全部或部分被另一细胞色素P450多肽的对应结构性结构域替换。下面的表3基于细胞色素P450多肽与细胞色素P450BM-3，一种II类微粒体P450(SEQ ID NO：66；登录号2HPD；Ravichandran等(1993)Science 261：731-736；还参见图5A至5B)的比对鉴定了细胞色素P450檀香烯氧化酶(SEQ ID NO：7)和细胞色素P450香柠檬烯氧化酶(SEQ ID NO：6)的结构性结构域。
[0340]
[0341]
[0342] 可使用本领域中已知的用于产生嵌合多肽的任何方法来用第二细胞色素P450之对应结构域的全部或连续部分替换细胞色素P450之结构域的全部或连续部分(参见，美国专利No.5,824,774、6,072,045、7,186,891和8,106,260以及美国专利公开No.20110081703)。还可采用基因改组方法来产生嵌合多肽或具有结构域或区域交换的多肽。
[0343] 例如，可使用本领域中已知的任何合适的重组方法或通过体外合成来交换任意两种细胞色素P450的对应结构域或区域。示例性的重组方法是两阶段重叠PCR法，例如本文中所述。在这样的方法中，可采用引物来在编码第一细胞色素P450中靶结构域或其一部分的核酸中的多个密码子位置引入突变。这些突变一起形成异源区域(即来自第二细胞色素P450的对应区域)。或者，例如，可使用随机化氨基酸来替换特定的结构域或区域。应当理解的是，克隆或重组方法中的引物错误、PCR错误和/或其他错误可导致这样的错误，其使得得到的交换或替换区域或结构域不表现出与来自第二细胞色素P450还原酶的对应区域相同的氨基酸序列。
[0344] 在一个示例性的基于PCR的方法中，第一阶段PCR使用(i)退火于正被诱变引物替换的区域下游的下游引物，其包括位于需被引入到靶基因中的区域侧翼之待进行交换或随机化的结构域或区域每侧的异源序列的约15个核苷酸(或有效引起退火的数目，例如5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、20个、25个核苷酸或更多)；和(ii)退火于正一起被反链诱变引物替换的区域上游的上游引物，其也包括位于需被引入到靶基因中的区域侧翼之待进行交换或随机化的结构域或区域每侧的异源序列的约15个核苷酸(或有效引起退火的数目，例如5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、20个、25个核苷酸或更多)。如果进行其中第一细胞色素P450基因的结构域或区域被来自第二细胞色素P450的对应结构域或区域替换的替换，则来自第一细胞色素P450的侧翼区之间的诱变引物中的核苷酸包含用于第二细胞色素P450之对应结构域的密码子。在其中结构域或区域中的氨基酸需被随机化的实例中，来自第一细胞色素P450的侧翼区之间的诱变引物的核苷酸包含随机核苷酸。然后，使用上游和下游寡核苷酸进行重叠PCR以将两个片段连接。随后，将得到的PCR产物克隆到适用于表达经修饰细胞色素P450的任何载体中。
[0345] 本文中包含交换突变的任何经修饰细胞色素P450多肽还可包含本文中上面所述的一个或更多个另外的氨基酸替换。
[0346] d.另外的变体
[0347] 可通过本领域技术人员已知的用于产生蛋白质变体的任何方法对本文中提供的细胞色素P450多肽进行修饰，包括但不限于：DNA或基因改组、易错PCR、重叠PCR或其他重组方法。在一个实例中，可通过基因改组对编码本文中提供的任何细胞色素P450多肽或变体细胞色素P450多肽的核酸分子进行修饰。基因改组涉及对至少两个核苷酸序列进行一轮或更多轮的随机片段化和重新装配，然后通过筛选来选择编码具有期望特性之多肽的核苷酸序列。重组可在体外(参见Stemmer等(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91：10747-10751；Stemmer 等(1994)Nature 370：389-391；Cramieri 等 (1998)Nature 391：
288-291；美国专利No.5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458)或体内(参见，国际专利公开No.WO199707205)进行。然后可将这些编码多肽的核酸分子导入宿主细胞中以被异源表达并通过下文部分G(section G)中所述的任何方法对其细胞色素P450活性进行测试。
[0348] e.融合或嵌合蛋白
[0349] 本文中提供的核酸分子包含含有檀香烯合酶和细胞色素P450多肽的融合核酸分子或嵌合核酸分子。例如，本文中提供了这样的核酸分子，其编码能够催化FPP形成檀香醇(例如α-檀香醇、β-檀香醇或表-β-檀香醇)并包含本文中提供的任何檀香烯合酶和细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽的融合多肽。例如，本文中提供了这样的核酸分子，其编码包含SEQ ID NO：17、52或53中任一个所示的檀香烯合酶和SEQ ID NO：7、74、75、76或77中所示的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽的融合多肽。本文中还提供了包含SEQ ID NO：17、52或53中任一个所示的檀香烯合酶和SEQ ID NO：7、74、75、76或77中所示的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽的融合多肽。本文中还提供了这样的核酸分子，其编码能够催化FPP形成香柠檬醇(例如α-反式-香柠檬醇)并包含本文中提供的任何檀香烯合酶和细胞色素P450檀香烯香柠檬烯多肽的融合多肽。例如，本文中提供了这样的核酸分子，其编码包含SEQ ID NO：17、52或53中任一个所示的檀香烯合酶和SEQ ID NO：6、8、9或73中任一个所示的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽的融合多肽。本文中还提供了包含SEQ ID NO：17、52或53中任一个所示的檀香烯合酶和SEQ ID NO：6、8、9或73中所示的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽的融合多肽。可将所述融合多肽直接连接或通过接头连接。
[0350] 本文中提供的核酸分子包含含有细胞色素P450多肽和细胞色素P450还原酶的融合核酸分子或嵌合核酸分子。例如，本文中提供了这样的核酸分子，其编码包含SEQ ID NO：7、74、75、76或77中任一个所示的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽和SEQ ID NO：12至15中任一个所示的细胞色素P450还原酶的融合多肽。本文中还提供了包含SEQ ID NO：7、74、
75、76或77中任一个所示的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽和SEQ ID NO：12至15中任一个所示的细胞色素P450还原酶的融合多肽。在另一个实例中，本文中提供了这样的核酸分子，其编码包含SEQ ID NO：6、8、9或73中任一个所示的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽和SEQ ID NO：12至15中任一个所示的细胞色素P450还原酶的融合多肽。本文中还提供了包含SEQ ID NO：6、8、9或73中任一个所示的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽和SEQ ID NO：12至15中任一个所示的细胞色素P450还原酶的融合多肽。可将所述融合多肽直接连接或通过接头连接。
[0351] 本文中提供的核酸分子包含含有檀香烯合酶、细胞色素P450多肽和细胞色素P450还原酶的融合或嵌合核酸分子。例如，本文中提供了这样的核酸分子，其编码包含SEQ ID NO：17、52或53中任一个所示的檀香烯合酶、SEQ ID NO：7、74、75、76或77中任一个所示的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽和SEQ ID NO：12至15中任一个所示的细胞色素P450还原酶的融合多肽。本文中还提供了包含SEQ ID NO：17、52或53中任一个所示的檀香烯合酶、SEQ ID NO：7、74、75、76或77中任一个所示的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽和SEQ ID NO：12至15中任一个所示的细胞色素P450还原酶的融合多肽。在另一个实例中，本文中提供了这样的核酸分子，其编码包含SEQ ID NO：17、52或53中任一个所示的檀香烯合酶、SEQ ID NO：6、8、9或73中任一个所示的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽和SEQ ID NO：12至15中任一个所示的细胞色素P450还原酶的融合多肽。本文中还提供了包含SEQ ID NO：17、52或53中任一个所示的檀香烯合酶、SEQ ID NO：6、8、9或73中任一个所示的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽和SEQ ID NO：12至15中任一个所示的细胞色素P450还原酶的融合多肽。可将所述融合多肽直接连接或通过接头连接。
[0352] 在另一个实例中，本文中提供了编码檀香烯合酶、细胞色素P450和/或细胞色素P450还原酶的核酸分子，使得在宿主细胞(细菌或酵母宿主细胞)中表达时，檀香烯合酶、细胞色素P450和/或细胞色素P450还原酶被表达。在一个实例中，本文中提供了编码檀香烯合酶和细胞色素P450檀香烯氧化酶的核酸分子。在另一个实例中，本文中提供了编码檀香烯合酶和细胞色素P450香柠檬烯氧化酶的核酸分子。在又一个实例中，本文中提供了编码檀香烯合酶、细胞色素P450檀香烯氧化酶和细胞色素P450还原酶的核酸分子。在另一个实例中，本文中提供了编码檀香烯合酶、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶和细胞色素P450还原酶的核酸分子。此外，当宿主细胞能够产生FPP时，所编码的多肽催化产生檀香醇和/或香柠檬醇。
[0353] 融合蛋白的另一些实例包括但不限于：信号序列(例如，用于定位的标签(例如his6标签或myc标签)或用于纯化的标签)的融合，例如GST融合、GFP融合或CBP融合；和用于指导蛋白质分泌和/或膜缔合的序列的融合。
[0354] D.细胞色素P450还原酶多肽和编码核酸分子
[0355] 本文中提供了细胞色素P450还原酶多肽。本文中还提供了编码本文中提供的任一种细胞色素P450还原酶多肽的核酸分子。本文中提供的细胞色素P450还原酶多肽将来自NADPH的两个电子转移至细胞色素P450。在一些实例中，编码细胞色素P450还原酶多肽的核酸分子与分离自檀香树檀香的那些核酸分子相同。在另一些实例中，所述核酸分子和所编码的细胞色素P450还原酶多肽是分离自檀香树檀香的那些的变体。
[0356] 本文中还提供了经修饰的细胞色素P450还原酶多肽和编码本文中提供的任一种经修饰细胞色素P450还原酶多肽的核酸分子。修饰可在细胞色素P450还原酶多肽的任何区域中实现，只要这些细胞色素P450还原酶多肽至少保留未修饰细胞色素P450还原酶多肽的CPR催化活性即可。例如，可对细胞色素P450还原酶多肽进行修饰，只要这些细胞色素P450还原酶多肽保留CPR活性(即，能够将来自NADPH的两个电子转移至细胞色素P450)即可。
[0357] 所述修饰可包括对核酸进行密码子优化和/或引起所编码的多肽中发生单氨基酸修饰(例如单氨基酸替换(取代)、插入或缺失)或多氨基酸修饰(例如多氨基酸替换、插入或缺失)的改变，包括交换该多肽的结构域或区域。在一些实例中，将全部或部分结构域或区域(例如本文中所述的任何结构域或区域)与来自另一细胞色素P450还原酶多肽的对应结构域或区域或其一部分交换。示例性的修饰是氨基酸替换，包括单氨基酸替换或多氨基酸替换。例如，与不包含修饰的细胞色素P450还原酶多肽相比，本文中提供的经修饰的细胞色素P450还原酶多肽可包含至少或1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、
24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、
38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、
52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、
66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、
80个、81个、82个、83个、84个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、120个或更多个经修饰位置。
[0358] 本文中提供了具有SEQ ID NO：12或13中所示的氨基酸序列的细胞色素P450还原酶多肽。本文中还提供了表现出与SEQ ID NO：12或13中所示的细胞色素P450还原酶多肽至少60％氨基酸序列同一性的细胞色素P450还原酶多肽。例如，本文中提供的细胞色素P450还原酶多肽可表现出与SEQ ID NO：12或13中所示的细胞色素P450还原酶多肽至少或至少约或65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性，只要得到的细胞色素P450还原酶多肽至少保留CPR活性(即，能够将来自NADPH的两个电子转移至细胞色素P450)即可。同一性百分比可通过本领域技术人员用标准比对程序确定。
[0359] 在一些实例中，本文中还提供了细胞色素P450还原酶多肽的催化活性片段。在一些实例中，细胞色素P450还原酶多肽的活性片段是经修饰的，如上文所述。这些片段保留全长细胞色素P450还原酶多肽的一个或更多个特性。通常来说，这些活性片段表现出CPR活性(即，能够将来自NADPH的两个电子转移至细胞色素P450)。
[0360] 本文中提供的细胞色素P450还原酶多肽可包含其他修饰，例如不在该多肽的一级序列中的修饰，包括翻译后修饰。例如，本文中所述的修饰可以是细胞色素P450还原酶多肽，其为融合多肽或嵌合多肽，包括不同细胞色素P450还原酶多肽的杂合体(例如包含一个或更多个来自另一细胞色素P450还原酶多肽的结构域或区域)以及基于已知多肽的序列通过本领域中已知的其他方法重组制备或合成或构建的合成细胞色素P450还原酶多肽。
[0361] 本文中提供的细胞色素P450还原酶多肽可用于将来自NADPH的两个电子转移至细胞色素P450。可在体内，例如在其中已导入有核酸的宿主细胞中进行反应。所述多肽中的至少一种将对于该宿主是异源的。还可在体外通过使合适的底物在合适条件下与酶接触来进行反应。
[0362] 本文中还提供了编码细胞色素P450多肽和细胞色素P450还原酶多肽的核酸分子。例如，本文中提供了编码细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽和细胞色素P450还原酶多肽的核酸分子。在另一个实例中，本文中提供了编码细胞色素P450香柠檬烯合酶多肽和细胞色素P450还原酶多肽的核酸分子。本文中还提供了编码檀香烯合酶、细胞色素P450多肽和细胞色素P450还原酶多肽的核酸分子。例如，本文中提供了编码檀香烯合酶、细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽和细胞色素P450还原酶多肽的核酸分子。在另一个实例中，本文中提供了编码檀香烯合酶、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽和细胞色素P450还原酶多肽的核酸分子。所述核酸分子可以在同一载体或质粒中或者在不同的载体或质粒上。在这样的一些实例中，核酸分子在合适宿主(例如，细菌或酵母细胞)中的表达引起细胞色素P450氧化酶和细胞色素P450还原酶的表达，或者引起檀香烯合酶、细胞色素P450氧化酶和细胞色素P450还原酶的表达，这取决于所包含的核酸分子。所述细胞可用于产生檀香烯合酶、细胞色素P450氧化酶和细胞色素P450还原酶，和/或用于进行体内反应以产生檀香醇和香柠檬醇。例如，檀香醇和香柠檬醇可在宿主细胞(特别是过量产生非环状萜前体FPP的酵母细胞)中由法尼二磷酸(FPP)产生。在一些实例中，还可在引起FPP过量表达的合适宿主(例如，细菌或酵母细胞)中表达编码法尼二磷酸合酶(例如檀香法尼二磷酸合酶)的核酸分子。
[0363] 1.细胞色素P450还原酶多肽
[0364] 本文中提供了细胞色素P450还原酶多肽。本文中还提供了编码本文中提供的任一种细胞色素P450还原酶多肽的核酸分子。本文中提供的细胞色素P450还原酶多肽表现出CPR活性。通常来说，本文中提供的细胞色素P450还原酶多肽能够将来自NADPH的两个电子转移至细胞色素P450。
[0365] 例如，本文中提供了具有SEQ ID NO：12或13中所示的氨基酸序列的细胞色素P450还原酶多肽。本文中还提供了表现出与具有SEQ ID NO：12或13中所示的氨基酸序列的细胞色素P450还原酶多肽有至少60％氨基酸序列同一性的细胞色素P450还原酶多肽。例如，本文中提供的细胞色素P450还原酶多肽可表现出与SEQ ID NO：12或13中所示的细胞色素P450还原酶多肽至少或约或65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列同一性，只要这些细胞色素P450还原酶多肽表现出细胞色素P450还原酶活性(即，将来自NADPH的两个电子转移至细胞色素P450)即可。同一性百分比可通过本领域技术人员用标准比对程序确定。
[0366] 本文中还提供了具有SEQ ID NO：14或15中所示氨基酸序列的细胞色素P450还原酶多肽的活性片段。例如，本文中提供了截短的细胞色素P450还原酶多肽，其具有SEQ ID NO：14或15中所示的氨基酸序列。这些片段保留细胞色素P450还原酶多肽的一个或更多个特性。通常来说，这些活性片段表现出细胞色素P450还原酶活性(即，将来自NADPH的两个电子转移至细胞色素P450)。
[0367] 本文中还提供了具有SEQ ID NO：10或11中所示的氨基酸序列或其简并序列的核酸分子，其分别编码具有SEQ ID NO：12或13中所示的氨基酸序列的细胞色素P450还原酶多肽。本文中还提供了编码与SEQ ID NO：10或11中所示的核苷酸序列具有至少85％序列同一性的细胞色素P450还原酶多肽。例如，本文中提供的核酸分子可表现出与SEQ ID NO：10或11中所示的核苷酸序列至少或约至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、95％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性，只要所编码的细胞色素P450还原酶多肽表现出细胞色素P450还原酶活性(即能够将来自NADPH的两个电子转移至细胞色素P450)即可。本文中还提供了SEQ ID NO：10或11中所示的序列的简并序列，其分别编码具有SEQ ID NO：12或13中所示的氨基酸序列的细胞色素P450还原酶多肽。同一性百分比可通过本领域技术人员用标准比对程序确定。
[0368] 在一些实例中，编码细胞色素P450还原酶多肽的核酸分子分离自檀香树檀香。在另一些实例中，所述核酸分子和所编码的细胞色素P450还原酶多肽是分离自檀香树檀香的那些的变体。
[0369] 2.经修饰的细胞色素P450还原酶多肽
[0370] 本文中提供了经修饰的细胞色素P450还原酶多肽。修饰可发生在细胞色素P450还原酶多肽的任何区域中，只要得到的细胞色素P450还原酶多肽至少保留细胞色素P450还原酶活性(例如能够将来自NADPH的两个电子转移至细胞色素P450)即可。
[0371] 修饰可以是单氨基酸修饰，例如单氨基酸替换(取代)、插入或缺失；或多氨基酸修饰，例如多氨基酸替换、插入或缺失。在一些实例中，可将全部或部分结构域或区域(例如本文下面所述的任何结构域或区域)与来自另一细胞色素P450还原酶多肽的对应结构域或区域或其一部分交换。示例性的修饰是氨基酸替换，包括单氨基酸替换或多氨基酸替换。例如，与不包含修饰的细胞色素P450还原酶多肽相比，本文中提供的经修饰的细胞色素P450还原酶多肽可包含至少或1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、120个或更多个经修饰位置。
[0372] 本文中所述的修饰可发生在任何细胞色素P450还原酶多肽中。例如，本文中所述的修饰可发生在具有SEQ ID NO：12至15中任一个所示的氨基酸序列的细胞色素P450还原酶或其变体中，所述变体包括与具有SEQ ID NO：12至15中任一个所示的氨基酸序列的细胞色素P450还原酶具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的任何变体。
[0373] 特别地，相对于具有SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列的细胞色素P450还原酶多肽，本文中提供的经修饰细胞色素P450还原酶多肽包含氨基酸替换或取代、添加或缺失、截短或其组合。本领域技术人员能够在细胞色素P450还原酶多肽中产生这些修饰，例如SEQ ID NO：12至15中所示的任何细胞色素P450还原酶多肽或其任何变体。基于该描述，本领域技术人员能够产生本文中所述的包含任一种或更多种所述突变的细胞色素P450还原酶多肽，并对每一种的细胞色素P450还原酶活性(例如将来自的NADPH的两个电子转移至细胞色素P450的能力)进行测试。
[0374] 在一些实例中，本文中还提供了细胞色素P450还原酶多肽的经修饰的活性片段，其包含本文中提供的任何修饰。这样的片段保留了细胞色素P450还原酶的一个或更多个特性，例如将来自NADPH的两个电子转移至细胞色素P450的能力。也可对还包含其他修饰的细胞色素P450还原酶多肽进行细胞色素P450还原酶多肽中的修饰，包括一级序列中的修饰和不在该多肽一级序列中的修饰。例如，本文中所述的修饰可发生在细胞色素P450还原酶多肽中，其为与不同细胞色素P450还原酶多肽的融合多肽或嵌合多肽(例如包含一个或更多个来自另一细胞色素P450的结构域或区域)以及基于已知多肽的序列通过本领域中已知的其他方法重组制备或合成或构建的合成细胞色素P450还原酶多肽。
[0375] 在一些实例中，所述修饰是氨基酸替换。在另一些实例中，本文中提供的经修饰细胞色素P450还原酶多肽包含结构域中的一种或更多种修饰。例如，结构域或结构性结构域中的修饰可通过替换来自另一细胞色素P450还原酶多肽的对应异源残基。
[0376] 一般不在细胞色素P450还原酶活性所必需的那些位置处(即，在催化中心或保守残基中)进行修饰以保留细胞色素P450还原酶的活性。例如，一般不在对应于参考SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列的Ser485、Cys657、Asp702和Trp704的位置进行修饰。
[0377] 本文中提供的经修饰的细胞色素P450还原酶多肽可包含两种或更多种修饰，包括氨基酸替换或取代、插入或缺失、截短或其组合。一般情况下，本领域技术人员可将本文中提供的多种修饰组合，只要经修饰的细胞色素P450还原酶多肽保留细胞色素P450还原酶活性即可。
[0378] 本文中还提供了编码本文中提供的任一种经修饰细胞色素P450还原酶多肽的核酸分子。在一些特别实例中，所述核酸序列可以是经密码子优化的，例如以提高所编码序列的表达水平。特定密码子的使用取决于经修饰多肽在其中被表达的宿主生物体。本领域技术人员熟悉用于在细菌或酵母(包括例如大肠杆菌或酿酒酵母)中表达的最优密码子。例如，密码子的使用信息可获自可在kazusa.or.jp.codon得到的密码子使用数据库(Codon Usage Database)(有关该数据库的描述参见Richmond(2000)Genome Biology，1：241)。还参见，Forsburg(2004)Yeast，10：1045-1047；Brown等(1991)Nucleic Acids Research，19：4298；Sharp 等 (1988)Nucleic Acids Research，12：8207-8211；Sharp 等(1991)Yeast，657-78。在本文中的一些实例中，本文中提供的核酸序列是基于酿酒酵母中的密码子使用来进行密码子优化的。
[0379] 本文中提供的经修饰多肽和编码核酸分子可通过本领域技术人员已知的标准重组DNA技术产生。可采用本领域中已知的引起靶蛋白中的任一个或更多个氨基酸突变的任何方法。方法包括对编码核酸分子进行标准定点诱变或随机诱变，或固相多肽合成法。例如，如本文所述，可通过易错PCR、定点诱变、重叠PCR、基因改组或其他重组方法对编码细胞色素P450还原酶多肽的核酸分子进行诱变，例如对该编码核酸进行随机诱变。然后，可将这些多肽编码核酸导入宿主细胞中以被异源表达。因此，本文中还提供了编码本文中提供的任一种经修饰多肽的核酸分子。在一些实例中，经修饰的细胞色素P450还原酶多肽通过合成方式产生，例如使用固相或溶液相肽合成。
[0380] 3.另外的修饰
[0381] 本文中提供了包含另外修饰的细胞色素P450还原酶多肽。例如，经修饰的细胞色素P450还原酶多肽包括，例如，截短的细胞色素P450还原酶多肽、具有改变活性或特性的细胞色素P450还原酶多肽、嵌合细胞色素P450还原酶多肽、包含结构域交换的细胞色素P450还原酶多肽、细胞色素P450还原酶融合蛋白或具有本文其他部分所述的任何修饰的细胞色素P450还原酶多肽。
[0382] a.截短的多肽
[0383] 本文中还提供了截短的细胞色素P450还原酶多肽。截短的细胞色素P450还原酶多肽可在N端或C端被截短，只要这些截短的细胞色素P450还原酶多肽保留细胞色素P450还原酶的催化活性(例如细胞色素P450还原酶活性)即可。通常来说，截短的细胞色素P450还原酶多肽表现出细胞色素P450还原酶活性(即，能够将来自NADPH的两个电子转移至细胞色素P450)。在一些实例中，细胞色素P450还原酶多肽在C端被截短。在另一些实例中，细胞色素P450还原酶多肽在N端被截短。
[0384] 在一些实例中，细胞色素P450还原酶多肽可在本文中提供的细胞色素P450还原酶多肽的N端、C端或两端被截短，例如截短SEQ ID NO：12或13中任一个所示的氨基酸序列。在另一些实例中，本文中提供的任何经修饰的细胞色素P450还原酶多肽均是被截短的。经修饰的细胞色素P450还原酶多肽可在其N端、C端或两端被截短。例如，本文中提供的任何细胞色素P450还原酶多肽可在N端被截短约或至少或1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19 20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个或更多个氨基酸残基，只要这些细胞色素P450还原酶多肽保留细胞色素P450还原酶活性即可。在另一些实例中，本文中提供的任何细胞色素P450还原酶多肽可在C端被截短约或至少或1个、
2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19 20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、
32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、
46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、
60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、
74个、75个或更多个氨基酸残基，只要这些细胞色素P450还原酶多肽保留细胞色素P450还原酶活性即可。在一些实例中，可通过用释放N端疏水性锚的胰的胰脂酶或胰蛋白酶消化来截短细胞色素P450还原酶。
[0385] 例如，本文中提供了具有SEQ ID NO：14或15中所示的氨基酸序列的截短细胞色素P450还原酶多肽。本文中还提供了这样的截短细胞色素P450还原酶多肽，其氨基酸序列与具有SEQ ID NO：14或15中所示的氨基酸序列的截短细胞色素P450还原酶具有至少或至少约65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性，只要得到的细胞色素P450还原酶多肽至少保留细胞色素P450还原酶活性(即，能够将来自NADPH的两个电子转移至细胞色素P450)即可。本文中还提供了具有SEQ ID NO：63或64中所示的核苷酸序列的核酸分子，其分别编码具有SEQ ID NO：14或15中所示的氨基酸序列的截短细胞色素P450还原酶多肽。
[0386] b.具有改变的活性或特性的多肽
[0387] 本文中提供的经修饰的细胞色素P450还原酶多肽还可在活性和/或特性方面表现出变化。经修饰的细胞色素P450还原酶多肽可表现出，例如，改善的特性，例如催化活性提高、稳定性提高和/或在宿主细胞中的表达提高。在另一些实例中，与未修饰细胞色素P450还原酶多肽相比，经修饰的细胞色素P450还原酶多肽表现出类似的、提高的和/或改善的活性。
[0388] c.结构域交换
[0389] 本文中提供了这样的经修饰细胞色素P450还原酶多肽，其为包含通过缺失其中的多个结构域或区域之一或其一部分的氨基酸残基并插入异源氨基酸序列的交换(缺失并插入)的嵌合多肽。在一些实例中，所述异源序列是随机化的氨基酸序列。在另一些实例中，所述异源序列是来自另一细胞色素P450还原酶的对应结构域或区域或其一部分的连续氨基酸序列。被替换或插入的异源序列一般包括至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个或更多个氨基酸。在其中所述异源序列来自另一细胞色素P450还原酶的对应结构域或其一部分的实例中，所述异源序列一般包括该对应结构域或区域或部分的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的连续氨基酸。在这一实例中，本文中提供的经修饰的细胞色素P450还原酶多肽中还可包括紧接该异源对应结构域或区域或其一部分的残基。
[0390] 在本文中提供的交换突变体的一个实例中，细胞色素P450还原酶多肽的至少一个结构域或区域或其一部分被来自另一细胞色素P450还原酶多肽的对应结构域或区域或其一部分的连续氨基酸序列替换。在一些实例中，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个结构域或区域或其一部分被来自另一细胞色素P450还原酶多肽的对应结构域或区域或其一部分的连续氨基酸序列替换。
[0391] 细胞色素P450还原酶多肽的任何结构域或区域或其一部分均可被异源氨基酸序列替换，例如来自另一细胞色素P450还原酶多肽的对应结构域或区域的异源序列。结构域或区域可以是结构性结构域或功能性结构域。本领域技术人员熟悉细胞色素P450还原酶中的结构域或区域。功能性结构域包括例如催化结构域或其一部分。结构性结构域包括以下中的所有或一部分：α-螺旋A；β链1；α-螺旋B；β链2；α-螺旋C；β链3；α-螺旋D；β链4；α-螺旋E；β链5；α-螺旋F；β链6；β链7；β链8、β链9；β链10；α-螺旋G；β链11；β链12；β链12’；α-螺旋H；α-螺旋I；α-螺旋J；α-螺旋K；
α-螺旋M；β链13；β链14；β链15；α-螺旋N；β链16；β链16’；β链17；α-螺旋O；β链18；α-螺旋P；β链10；α-螺旋Q；α-螺旋R；β链20；α-螺旋S；α-螺旋T；
和β链21。本领域技术人员熟悉多种细胞色素P450并可鉴定对应的结构域或区域或其一部分氨基酸。通常来说，得到的经修饰的细胞色素P450还原酶多肽表现出细胞色素P450还原酶活性。
[0392] 可使用本领域中已知的用于产生嵌合多肽的任何方法来用第二细胞色素P450还原酶之对应结构域的全部或连续部分替换细胞色素P450还原酶之结构域的全部或连续部分(参见，美国专利No.5,824,774、6,072,045、7,186,891和8,106,260以及美国专利公开No.20110081703)。还可采用基因改组方法来产生嵌合多肽和/或具有结构域或区域交换的多肽。
[0393] 例如，可使用本领域中已知的任何合适的重组方法或通过体外合成来交换任意两种细胞色素P450还原酶的对应结构域或区域。示例性的重组方法是两阶段重叠PCR法，如本文所述。在这样的方法中，可采用引物来在编码第一细胞色素P450还原酶中靶结构域或其一部分的核酸中的多个密码子位置引入突变；这些突变一起形成异源区域(即来自第二细胞色素P450还原酶的对应区域)。或者，例如，可使用随机化氨基酸来替换特定的结构域或区域。应当理解的是，克隆或重组方法中的引物错误、PCR错误和/或其他错误可导致这样的错误，其使得得到的交换或替换区域或结构域不表现出氨基酸序列与来自第二细胞色素P450还原酶合酶的对应区域相同。
[0394] 在一个示例性的基于PCR的方法中，第一阶段PCR使用(i)退火于正被诱变引物替换的区域下游的下游引物，其包括位于需被引入到靶基因中的区域侧翼之待进行交换或随机化的结构域或区域每侧的异源序列的约15个核苷酸(或有效引起退火的数目，例如5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、20个、25个核苷酸或更多)；和(ii)退火于正一起被反链诱变引物替换的区域上游的上游引物，其也包括位于需被引入到靶基因中的区域侧翼之待进行交换或随机化的结构域或区域每侧的异源序列的约15个核苷酸(或有效引起退火的数目，例如5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、20个、25个核苷酸或更多)。如果进行其中第一细胞色素P450还原酶基因的结构域或区域被来自第二细胞色素P450还原酶的对应结构域或区域替换的替换，则来自第一细胞色素P450还原酶的侧翼区之间的诱变引物中的核苷酸包含用于第二细胞色素P450还原酶之对应结构域的密码子。在其中结构域或区域中的氨基酸需被随机化的实例中，来自第一细胞色素P450还原酶的侧翼区之间的诱变引物的核苷酸包含随机核苷酸。然后，使用上游和下游寡核苷酸进行重叠PCR以将两个片段连接。随后，将得到的PCR产物克隆到适用于表达经修饰细胞色素P450还原酶的任何载体中。
[0395] 本文中包含交换突变的任何经修饰细胞色素P450还原酶多肽还可包含上文中所述的一个或更多个另外的氨基酸替换。
[0396] d.另外的变体
[0397] 可通过本领域技术人员已知的用于产生蛋白质变体的任何方法对本文中提供的细胞色素P450还原酶多肽进行修饰，包括但不限于DNA或基因改组、易错PCR、重叠PCR或其他重组方法。在一个实例中，可通过基因改组对编码本文中提供的任何细胞色素P450还原酶多肽或变体细胞色素P450还原酶多肽的核酸分子进行修饰。基因改组涉及对至少两个核苷酸序列进行一轮或更多轮的随机片段化和重新组装，然后通过筛选来选择编码具有期望特性之多肽的核苷酸序列。重组可在体外(参见Stemmer等(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91：10747-10751；Stemmer等(1994)Nature 370：389-391；Cramieri等(1998)Nature391：288-291；美国专利No.5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458)或体内(参见，国际专利公开No.WO199707205)进行。然后可将这些编码多肽的核酸分子导入宿主细胞中以被异源表达并通过下文部分G中所述的任何方法对其细胞色素P450还原酶活性进行测试。
[0398] e.融合或嵌合蛋白
[0399] 本文中提供的核酸分子包含含有细胞色素P450多肽和细胞色素P450还原酶多肽的融合或嵌合核酸分子。例如，本文中提供了这样的核酸分子，其编码能够催化檀香烯或香柠檬烯形成檀香醇或香柠檬醇(例如α-檀香醇、β-檀香醇、表-β-檀香醇或Z-α-反式-香柠檬醇)并包含本文中提供的任何细胞色素P450多肽和任何细胞色素P450还原酶多肽的融合多肽。例如，本文中提供了这样的核酸分子，其编码包含SEQ ID NO：6至9中任一个所示的细胞色素P450多肽和SEQ ID NO：12至15中所示的细胞色素P450还原酶多肽的融合多肽。本文中还提供了包含SEQ ID NO：6至9中任一个所示的细胞色素P450多肽和SEQ ID NO：12至15中所示的细胞色素P450还原酶多肽的融合多肽。可将所述融合多肽直接连接或通过接头连接。
[0400] 本文中提供的核酸分子包含含有檀香烯合酶、细胞色素P450多肽和细胞色素P450还原酶的融合或嵌合核酸分子。例如，本文中提供了这样的核酸分子，其编码包含SEQ ID NO：17、52或53中任一个所示的檀香烯合酶、SEQ ID NO：7中所示的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽和SEQ ID NO：12至15中任一个所示的细胞色素P450还原酶的融合多肽。本文中还提供了包含SEQ ID NO：17、52或53中任一个所示的檀香烯合酶、SEQ ID NO：7中所示的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽和SEQ ID NO：12至15中任一个所示的细胞色素P450还原酶的融合多肽。在另一个实例中，本文中提供了这样的核酸分子，其编码包含SEQ ID NO：17、52或53中任一个所示的檀香烯合酶、SEQ ID NO：6、8或9中任一个所示的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽和SEQ ID NO：12至15中任一个所示的细胞色素P450还原酶的融合多肽。本文中还提供了包含SEQ ID NO：17、52或53中任一个所示的檀香烯合酶、SEQ ID NO：6、8或9中任一个所示的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽和SEQ ID NO：12至15中任一个所示的细胞色素P450还原酶的融合多肽。可将所述融合多肽直接连接或通过接头连接。
[0401] 在另一个实例中，本文中提供了编码檀香烯合酶、细胞色素P450和/或细胞色素P450还原酶的核酸分子，使得在宿主细胞(细菌或酵母宿主细胞)中表达时，檀香烯合酶、细胞色素P450和/或细胞色素P450还原酶被表达。在又一个实例中，本文中提供了编码檀香烯合酶、细胞色素P450檀香烯氧化酶和细胞色素P450还原酶的核酸分子。在另一个实例中，本文中提供了编码檀香烯合酶、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶和细胞色素P450还原酶的核酸分子。此外，当宿主细胞能够产生FPP时，所编码的多肽催化产生檀香醇和/或香柠檬醇。
[0402] 融合蛋白的另一些实例包括但不限于：信号序列(例如，用于定位的标签(例如his6标签或myc标签)或用于纯化的标签)的融合，例如GST融合、GFP融合或CBP融合；和用于指导蛋白质分泌和/或膜缔合的序列的融合。
[0403] E.用于产生经修饰的细胞色素P450和细胞色素P450还原酶多肽以及编码核酸分子的方法
[0404] 本文中提供了用于产生经修饰的细胞色素P450和细胞色素P450还原酶多肽(包括檀香烯氧化酶和香柠檬烯氧化酶多肽)的方法。所述方法可用于产生具有期望特性的细胞色素P450和细胞色素P450还原酶，所述期望特性包括但不限于：催化活性提高、选择性提高、底物特异性提高、底物结合提高、稳定性提高、在宿主细胞中的表达提高、产物分布改变和/或底物特异性改变。可使用本领域中已知的方法来产生经修饰的细胞色素P450和细胞色素P450还原酶，并任选地对其进行筛选以获得期望的特性。在一些具体实例中，根据本文中所示例的方法通过突变来产生具有期望特性的经修饰细胞色素P450和细胞色素P450还原酶。因此，本文中提供了使用本文中所述的方法产生的经修饰的细胞色素P450和细胞色素P450还原酶以及编码所述经修饰的细胞色素P450和细胞色素P450还原酶的核酸分子。
[0405] 本文中提供的示例性方法是这样的那些方法，其中经修饰的细胞色素P450和细胞色素P450还原酶通过用来自第二细胞色素P450或细胞色素P450还原酶的一个或更多个对应结构域或区域(即异源结构域或区域)替换第一细胞色素P450或细胞色素P450还原酶的一个或更多个内源结构域或区域产生。在另一些实例中，第一细胞色素P450或细胞色素P450还原酶的两个或更多个内源结构域或区域被来自两个或更多个其他细胞色素P450或细胞色素P450还原酶(例如第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十细胞色素P450或细胞色素P450还原酶)的对应结构域或区域替换。因此，得到的经修饰的细胞色素P450或细胞色素P450还原酶可包含来自1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个不同细胞色素P450或细胞色素P450还原酶的异源结构域或区域。在另一些实例中，所述方法还包含或者作为替代地包含用随机化的氨基酸残基来替换第一细胞色素P450或细胞色素P450还原酶合酶的一个或更多个结构域或区域。
[0406] 任何细胞色素P450或细胞色素P450还原酶均可用于本文中提供的方法中。第一细胞色素P450或细胞色素P450还原酶(即待被修饰的细胞色素P450或细胞色素P450还原酶)可与第二(或第三、第四、第五等)细胞色素P450或细胞色素P450还原酶(即异源结构域或区域所来源于的细胞色素P450或细胞色素P450还原酶)属于相同或不同的种类。
[0407] 在实践本文中提供的方法时，可将第一细胞色素P450或细胞色素P450还原酶之内源结构域的所有或连续部分用来自第二细胞色素P450或细胞色素P450还原酶之对应异源结构域的所有或连续部分替换。例如，来自第一细胞色素P450或细胞色素P450还原酶之结构域或区域的3、4、5、6、7、8、9、10或更多个连续氨基酸可被来自第二细胞色素P450或细胞色素P450还原酶之对应结构域或区域的3、4、5、6、7、8、9、10或更多个连续氨基酸替换。在一些实例中，邻近第一细胞色素P450或细胞色素P450还原酶之内源结构域的一个或更多个氨基酸残基也被替换，和/或在该替换中同样使用邻近异源结构域的一个或更多个氨基酸残基。此外，本文中提供的方法还包括这样的方法，其中第一结构域的所有或连续部分和第二临近结构域的所有或连续部分被来自另一细胞色素P450或细胞色素P450还原酶的对应结构域(或其一部分)替换。
[0408] 可被替换的结构域或区域包括功能性结构域或结构性结构域。细胞色素P450中可用本文中所述的方法替换的示例性结构域或区域包括但不限于对应于以下的结构性结构域或区域：螺旋A、β链1-1、β链1-2、螺旋B、β链1-5、螺旋B’、螺旋C、螺旋C’、螺旋D、β链3-1、螺旋E、螺旋F、螺旋G、螺旋H、β链5-1、β链5-2、螺旋I、螺旋J、螺旋J’、螺旋K、β链1-4、β链2-1、β链2-2、β链1-3、螺旋K’、螺旋K”、血红素结构域、螺旋L、β链3-3、β链4-1、β链4-2和β链3-2。可使用本文中所述的方法来将这些结构域或区域中的任一个或更多个或其一部分被来自另一的细胞色素P450的对应结构域替换。这些结构域是可使用本领域中公知的方法在任何细胞色素P450中鉴定到的区域，例如通过使用本领域技术人员已知的方法进行比对来鉴定(参见例如图5A至5B)。此类方法通常使匹配最大化，并且包括例如以下方法：使用人工比对和通过使用很多可获得的比对程序(例如，BLASTP)以及本领域技术人员已知的其他方法。通过比对SEQ ID NO：50中所示的细胞色素P450和任何其他细胞色素P450的序列，可在任何细胞色素P450中鉴定出上述任何结构域或区域。
[0409] 细胞色素P450还原酶中可用本文中所述的方法替换的示例性结构域或区域包括但不限于对应于以下的结构性结构域或区域：α-螺旋A；β链1；α-螺旋B；β链2；α-螺旋C；β链3；α-螺旋D；β链4；α-螺旋E；β链5；α-螺旋F；β链6；β链7；
β链8、β链9；β链10；α-螺旋G；β链11；β链12；β链12’；α-螺旋H；α-螺旋I；α-螺旋J；α-螺旋K；α-螺旋M；β链13；β链14；β链15；α-螺旋N；β链16；β链16’；β链17；α-螺旋O；β链18；α-螺旋P；β链10；α-螺旋Q；α-螺旋R；β链
20；α-螺旋S；α-螺旋T；和β链21。这些结构域是可使用本领域中公知的方法在任何细胞色素P450还原酶中鉴定到的区域，例如通过使用本领域技术人员已知的方法进行比对来鉴定(参见例如图3A至3B)。此类方法通常使匹配最大化，并且包括例如以下方法：
使用人工比对和通过使用很多可获得的比对程序(例如，BLASTP)以及本领域技术人员已知的其他方法。通过比对SEQ ID NO：12中所示的细胞色素P450还原酶和任何其他细胞色素P450还原酶的序列，可在任何细胞色素P450还原酶中鉴定到上述任何结构域或区域。
[0410] 在本文中提供的方法中，可使用上文部分C.4.c.和D.3.c.中所讨论的本领域中合适重组方法来将第一细胞色素P450或细胞色素P450还原酶之内源结构域的全部或连续部分用来自第二细胞色素P450或细胞色素P450还原酶之对应异源结构域的全部或连续部分替换。
[0411] F.细胞色素P450和细胞色素P450还原酶多肽以及编码核酸分子的表达
[0412] 细胞色素P450和细胞色素P450还原酶多肽及其活性片段(包括细胞色素P450檀香烯氧化酶和细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽)可通过本领域中公知的用于产生和表达重组蛋白的方法获得。此类细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽可用于在表达这些细胞色素P450檀香烯氧化酶的宿主细胞中从檀香烯产生檀香醇，或者可用于在体外在对这些细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽进行纯化后从檀香烯产生檀香醇。此类细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽可用于在表达这些细胞色素P450香柠檬烯氧化酶的宿主细胞中从香柠檬烯产生香柠檬醇，或者可用于在体外在对这些细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽进行纯化后从香柠檬烯产生香柠檬醇。此类细胞色素P450檀香烯氧化酶和细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽可用于在表达檀香烯合酶和细胞色素P450的宿主细胞中从合适的非环状焦磷酸酯前体(例如FPP)产生檀香醇或香柠檬醇。可使用本领域技术人员已知的用于鉴定编码预期基因的核酸的任何方法来获得编码细胞色素P450(例如细胞色素P450檀香烯氧化酶或细胞色素P450香柠檬烯氧化酶)或细胞色素P450还原酶的核酸。例如，编码未经修饰或野生型细胞色素P450多肽或细胞色素P450还原酶多肽的核酸可通过使用公知的方法从植物来源(例如檀香)获得。然后，经修饰的细胞色素P450多肽或细胞色素P450还原酶多肽可通过使用本领域已知的用于将突变导入未经修饰或野生细胞色素P450多肽或细胞色素P450还原酶多肽中的任何方法改造而成，所述方法包括本文中所述的任何方法，例如通过易错PCR、定点诱变、重叠PCR或其他重组方法对编码核酸进行随机诱变。然后，可将编码所述多肽的核酸导入宿主细胞中以被异源表达。
[0413] 在一些实例中，本文中提供的细胞色素P450多肽或细胞色素P450还原酶多肽(包括细胞色素P450檀香烯氧化酶和细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽)通过合成方法产生，例如使用固相或溶液相合成。
[0414] 1.编码檀香细胞色素P450和细胞色素P450还原酶多肽的核酸的分离
[0415] 编码细胞色素P450或细胞色素P450还原酶(例如细胞色素P450檀香烯氧化酶和细胞色素P450香柠檬烯氧化酶)的核酸可使用本领域中已知的用于克隆和分离核酸分子的任何可用方法来克隆或分离。此类方法包括PCR扩增核酸和文库筛选，包括核酸杂交筛选。在一些实例中，可使用用于扩增核酸的方法来分离编码细胞色素P450或细胞色素P450还原酶多肽的核酸分子，包括例如聚合酶链式反应(PCR)方法。可使用包含核酸的材料作为可从其分离编码细胞色素P450或细胞色素P450还原酶的核酸分子的起始材料。例如，可使用来自檀香属(包括但不限于檀香)的DNA和mRNA制备物来获得细胞色素P450或细胞色素P450还原酶基因。还可使用核酸文库作为起始材料的来源。可设计引物来扩增编码细胞色素P450或细胞色素P450还原酶的分子，例如编码细胞色素P450檀香烯氧化酶、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或细胞色素P450还原酶的分子。例如，可基于已知的编码细胞色素P450的核酸序列(例如SEQ ID NO：22至25中所示的那些)设计引物。在另一个实例中，可基于已知的编码细胞色素P450还原酶的核酸序列(例如SEQ ID NO：40至41中所示的那些)设计引物。可对通过扩增产生的核酸分子进行测序并确认其编码细胞色素P450或细胞色素P450还原酶多肽。可使用本文中提供的核酸分子来鉴定其他物种中的相关核酸分子。
[0416] 可将编码细胞色素P450或细胞色素P450还原酶的核酸分子与另外的核苷酸序列连接，包含含有限制性内切核酸酶位点的接头序列，目的是将合成基因克隆到载体中，例如蛋白质表达载体或被设计用于扩增编码核心蛋白的DNA序列的载体。此外，可将细胞色素P450或细胞色素P450还原酶编码核酸分子与指定功能性DNA元件的另外核苷酸序列有效地连接。再者，还可包含编码其他部分或结构域的核酸，使得所得合酶是融合蛋白。例如，编码其他酶(例如FPP合酶或檀香烯合酶)或蛋白质纯化标签(例如His标签或Flag标签)的核酸。
[0417] 2.经修饰核酸的产生
[0418] 编码细胞色素P450或细胞色素P450还原酶(例如经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽、经修饰的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽或经修饰的细胞色素P450还原酶多肽)的核酸可通过本领域中已知的引起突变的任何方法制备或产生。用于修饰的方法包括对编码核酸分子进行标准的合理诱变和/或随机诱变(使用例如易错PCR、随机定点饱和诱变、DNA改组或合理定点诱变，例如诱变试剂盒(例如可获自Stratagene的QuikChange))。另外，可使用常规的重组DNA技术来产生编码包含异源氨基酸之多肽的核酸。例如，可使用两步PCR方法(如上文所述)和/或使用用于常规亚克隆期望嵌合多肽组分的限制性酶和克隆方法来产生编码嵌合多肽或包含异源氨基酸序列之多肽的核酸。
[0419] 一旦产生，就可使用本领域中已知的任何方法来将这些核酸分子在细胞中表达以产生经修饰的胞色素P450或细胞色素P450还原酶多肽。然后，可通过筛选期望特性或活性(例如由萜底物产生萜类化合物的能力)来对经修饰的细胞色素P450或细胞色素P450还原酶多肽(例如经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽、经修饰的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽或经修饰的细胞色素P450还原酶多肽)进行评价。在一些具体实例中，通过突变并根据本文中所例示的实例针对一定特性进行筛选来产生具有期望特性的经修饰细胞色素P450或细胞色素P450还原酶多肽。通常来说，在产生经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽的实例中，这些经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽从檀香烯产生檀香醇。通常来说，在产生经修饰的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽的实例中，这些经修饰的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽由香柠檬烯产生香柠檬醇。
[0420] 3.载体和细胞
[0421] 对于本文中提供的一种或更多种细胞色素P450或细胞色素P450还原酶多肽(包括细胞色素P450檀香烯氧化酶、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或细胞色素P450还原酶多肽)的重组表达，可将包含编码这些合酶之核苷酸序列的全部或部分的核酸插入到合适的表达载体中，即包含用于转录和翻译所插入的蛋白质编码序列的必需元件的载体。基于所使用的表达系统，必需的转录和翻译信号还可由用于细胞色素P450或细胞色素P450还原酶基因和/或其侧翼区的天然启动子提供。因此，本文中还提供了这样的载体，其包含编码本文中提供的任何细胞色素P450或细胞色素P450还原酶多肽的核酸。示例性的载体包括但不限于pESC-LEU、pESC-LEU2d和pYEDP60。
[0422] 还提供了包含载体的细胞，包括原核细胞和真核细胞。还提供了包含编码本文中提供的细胞色素P450多肽(包括细胞色素P450檀香烯氧化酶、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶和细胞色素P450还原酶)的核酸分子的宿主细胞。这样的细胞和宿主细胞包括细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、古细菌(Archea)、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞。在一些具体实例中，所述细胞或宿主细胞是酵母细胞，例如酿酒酵母细胞或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。在一些具体实例中，所述细胞或宿主细胞是表达非环状焦磷酸酯萜前体(例如法尼二磷酸(FPP))的酿酒酵母细胞。在一些实例中，可将包含本文中提供的细胞色素P450的细胞或宿主细胞改造成比未经改造的细胞产生更多的FPP。
[0423] 通过将上述细胞在所编码的细胞色素P450或细胞色素P450还原酶被这些细胞表达的条件下生长来使用这些细胞产生细胞色素P450或细胞色素P450还原酶多肽，例如细胞色素P450檀香烯氧化酶、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或细胞色素P450还原酶多肽。在一些实例中，细胞色素P450多肽(例如细胞色素P450檀香烯氧化酶、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或细胞色素P450还原酶多肽)对于所述细胞是异源的。在一些实例中，对表达的细胞色素P450和/或细胞色素P450还原酶进行纯化。在另一些实例中，表达的细胞色素P450和细胞色素P450还原酶在宿主细胞中将一种或更多种檀香烯或香柠檬烯转化成一种或更多种檀香醇或香柠檬醇。在一些实例中，通过表达檀香烯合酶、细胞色素P450檀香烯氧化酶和细胞色素P450还原酶来将非环状焦磷酸酯前体FPP转化成檀香醇。在另一些实例中，通过表达檀香烯合酶、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶和细胞色素P450还原酶来将非环状焦磷酸酯前体FPP转化成香柠檬醇。
[0424] 可使用本领域技术人员已知的用于将DNA片段插入到载体中的任何方法来构建包含嵌合基因的表达载体，所述嵌合基因包含合适的转录/翻译控制信号和蛋白质编码序列。这些方法可包括体外重组DNA和合成技术以及体内重组(遗传重组)。可通过第二核酸序列来调控编码细胞色素P450或细胞色素P450还原酶多肽或者经修饰的细胞色素P450或细胞色素P450还原酶多肽，或其结构域、衍生物、片段或同源物的表达，使得这些基因或其片段在转化有重组DNA分子的宿主中被表达。例如，可通过本领域中已知的任何启动子/增强子来控制这些蛋白质的表达。在一个实施方案中，启动子针对细胞色素P450或细胞色素P450还原酶蛋白的基因不是天然的。可使用的启动子包括但不限于原核启动子、酵母启动子、哺乳动物启动子和植物启动子。如下文更详细描述的，启动子的类型取决于所使用的表达系统。
[0425] 在一个实施方案中，使用这样的载体，其包含与编码细胞色素P450或细胞色素P450还原酶多肽或者经修饰的细胞色素P450或细胞色素P450还原酶多肽，或其结构域、片段、衍生物或同源物的核酸、一个或更多个复制起点和任选的一个或更多个选择标记(例如，抗生素抗性基因)可操作地连接的启动子。还对用于表达细胞色素P450或细胞色素P450还原酶多肽的载体和系统进行了描述。
[0426] 4.表达系统
[0427] 细胞色素P450或细胞色素P450还原酶多肽(包括细胞色素P450檀香烯氧化酶、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或细胞色素P450还原酶多肽)(修饰的和未修饰)可通过本领域中已知的用于产生蛋白质的任何方法来产生，包括体外和体内方法，例如将编码细胞色素P450或细胞色素P450还原酶(例如细胞色素P450檀香烯氧化酶、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或细胞色素P450还原酶)的核酸分子导入用于体内产生的宿主细胞或宿主植物中，或者在体外由编码细胞色素P450或细胞色素P450还原酶(例如细胞色素P450檀香烯氧化酶、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或细胞色素P450还原酶)的核酸分子表达而来。细胞色素P450或细胞色素P450还原酶多肽例如细胞色素P450檀香烯氧化酶、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或细胞色素P450还原酶和经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或细胞色素P450还原酶多肽可在任何适于产生所需量和形式的合酶多肽的任何生物体中表达。表达宿主包括原核生物和真核生物，例如大肠杆菌(E.coli)、酵母、植物、昆虫细胞、哺乳动物细胞，包括人细胞系和转基因动物。表达宿主可在其蛋白质产生水平以及被表达蛋白质上所呈现的翻译后修饰类型方面有所不同。可基于这些以及其他因素来选择表达宿主，例如调控和安全考虑、生产成本以及纯化需求和方法。
[0428] 真核宿主中的表达可包括在以下中的表达：酵母例如来自酵母属(Saccharomyces genus)(例如酿酒酵母)和毕赤酵母属(Pichia genus)(例如巴斯德毕赤酵母)的那些；昆虫细胞例如果蝇(Drosophila)细胞和鳞翅目(lepidopteran)细胞；植物和植物细胞例如柑橘、烟草、玉米、稻、藻类和浮萍。用于表达的真核细胞还包括哺乳动物细胞系，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和幼仓鼠肾(BHK)细胞。真核表达宿主还包括转基因动物中产生，例如包括在血清、乳和卵中产生。
[0429] 用于表达细胞色素P450或细胞色素P450还原酶(例如细胞色素P450檀香烯氧化酶、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或细胞色素P450还原酶)的很多表达载体是可获得的并且是本领域技术人员所知道的。示例性的表达载体是编码檀香烯合酶和FPP合酶的那些，包括实施例7中所述的载体。表达载体的选择受所选择的宿主表达系统的影响。这样的选择完全在本领域技术人员的技术水平之内。通常来说，表达载体可包括转录启动子和任选的增强子、翻译信号以及转录和翻译终止信号。用于稳定转化的表达载体通常具有允许选择和维持被转化细胞的选择性标记。在一些情况下，可使用复制起点来在细胞中扩增载体的拷贝数。
[0430] 还可将细胞色素P450或细胞色素P450还原酶多肽(包括细胞色素P450檀香烯氧化酶、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或细胞色素P450还原酶多肽和经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或细胞色素P450还原酶多肽)以蛋白质融合形式使用或表达。例如，可产生融合以向多肽添加另外的功能。融合蛋白的实例包括但不限于信号序列(例如，用于定位的标签(例如his6标签或myc标签)或用于纯化的标签)的融合，例如GST融合、GFP融合或CBP融合；和用于指导蛋白质分泌和/或膜缔合的序列的融合。
[0431] 产生细胞色素P450和细胞色素P450还原酶多肽(包括细胞色素P450檀香烯氧化酶、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或细胞色素P450还原酶多肽)的方法可包括在宿主细胞中共表达非环状焦磷酸酯萜前体(例如，FPP)。在一些实例中，宿主细胞天然地表达FPP。可将这样的细胞改造成表达更大量的FPP(参见例如美国专利No.6,531,303、6,689,593、
7,838,279和7,842,497)。在另一些实例中，将不天然地产生FPP的宿主细胞从基因方面改造成产生FPP。
[0432] a.原核细胞
[0433] 原核生物(尤其是大肠杆菌)提供了用于大量产生本文中提供的细胞色素P450和细胞色素P450还原酶多肽的系统。大肠杆菌转化是本领域技术人员公知的一种简单且迅速的技术。用于转化大肠杆菌细胞的示例性表达载体包括例如pGEM表达载体、pQE表达载体和pET表达载体(参见，美国专利No.4,952,496；获自Novagen，Madison，WI；还参见由Novagen公开之描述该系统的文献)。这样的质粒包括pET 11a，其包含T7lac启动子、T7终止子、诱导型大肠杆菌lac操纵子和lac阻遏基因；pET 12a-c，其包含T7启动子、T7终止子和大肠杆菌ompT分泌信号；pET 15b和pET19b(Novagen，Madison，WI)，其包含用于TM经His柱进行纯化的His-Tag 前导序列以及允许在经该柱纯化后进行切割的凝血酶切割位点、T7-lac启动子区和T7终止子；pACYC-Duet(Novagen，Madison，WI；SEQ ID NO：45)。
[0434] 用于大肠杆菌的表达载体可包含诱导型启动子，这些诱导型启动子可用于诱导高水平蛋白质表达和用于表达对宿主细胞表现出一些毒性的蛋白质。示例性的原核启动子包括例如β-内酰胺酶启动子(Jay等，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：5543)和tac启动子(DeBoer等，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21-25)；还参见Scientific American 242：79-94(1980)中的“Useful Proteins from Recombinant Bacteria”)。诱导型启动子的实例包括lac启动子、trp启动子、杂合tac启动子、T7和SP6 RNA启动子以及温度调控型λPL启动子。
[0435] 可在大肠杆菌的细胞质环境中表达细胞色素P450和细胞色素P450还原酶，包括细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽和细胞色素P450还原酶多肽。细胞质是一种还原性环境，并且对一些分子而言，这可导致形成不溶性包涵体。可使用还原剂(例如二硫苏糖醇和β-巯基乙醇)和变性剂(例如盐酸胍和尿素)来使这些蛋白质重新溶解。一种替代方法是在细菌的周质空间中表达细胞色素P450和细胞色素P450还原酶，细菌的周质空间提供了一种氧化性环境并提供了导致产生可溶性蛋白质的伴侣蛋白样异构酶和二硫化物异构酶。通常将待表达的蛋白质与前导序列融合，因为其指导该蛋白质到周质。然后，前导序列通过周质内的信号肽酶而被去除。周质靶向的前导序列的实例包括来自来自果胶酸裂解酶基因的pelB前导序列和来自碱性磷酸酶基因的前导序列。在一些情况下，周质表达允许表达的蛋白质渗漏到培养基中。分泌的蛋白质能够从培养物上清液中快速且简单地纯化出。不被分泌的蛋白质可通过渗透性裂解从周质获得。与细胞质表达类似，在一些情况下，蛋白质可变得不可溶，但可使用变性剂和还原剂来促进溶解和再折叠。诱导温度和生长温度也可影响表达水平和溶解性。通常来说，使用25℃至37℃的温度。还可使用突变来提高所表达蛋白质的溶解性，通常来说，细菌产生无糖基化的蛋白质。
[0436] b.酵母细胞
[0437] 还可使用酵母系统来表达本文中提供的细胞色素P450和细胞色素P450还原酶，例如细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽和细胞色素P450还原酶多肽以及经修饰的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽和细胞色素P450还原酶多肽，所述酵母系统例如但不限于酵母属(例如酿酒酵母)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。酵母系统还可用于产生其反应是由合酶催化的萜。可使用附加型复制载体或借助于通过同源重组的稳定染色体整合来转化酵母。在一些实例中，使用诱导型启动子来调控基因表达。用于在酵母中表达细胞色素P450和细胞色素P450还原酶多肽的示例性启动子序列特别包括用于以下的启动子：金属硫蛋白；3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等(1980)J.Biol.Chem.255：2073)；或其他糖酵解酶(Hess等(1968)J.Adv.Enzyme Reg.7：149；和Holland等(1978)Biochem.17：4900)，例如烯醇化酶、甘油醛磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、磷酸葡糖异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。
[0438] 适用于酵母表达中的其他载体和启动子在Hitzeman，EPA-73，657中或在Fleer等(1991)Gene，107：285-195；和van den Berg等(1990)Bio/Technology，8：135-139中进行了进一步描述。另一个替代选择包括但不限于Russell等(J.Biol.Chem.258：2674，1982)和Beier等(Nature300：724，1982)所述的葡萄糖阻遏型ADH2启动子或经改良的ADH1启r动子。可通过例如将来自用于在大肠杆菌中选择和复制的pBR322的DNA序列(Amp基因和复制起点)插入到上述酵母载体中来构建在酵母和大肠杆菌中可复制的穿梭载体。
[0439] 酵母表达载体可包括用于选择和维持转化的DNA的选择性标记，例如LEU2、TRP1、HIS3和URA3。示例性的载体包括pESC-Leu、pESC-Leu2D、pESC-His和pYEDP60。酵母中表达的蛋白质通常是可溶的并且与伴侣蛋白(例如Bip和蛋白质二硫化物异构酶)共表达可提高表达水平和溶解性。另外，酵母中表达的蛋白质可使用分泌信号肽融合(例如来自啤酒酵母的酵母交配型α-因子分泌信号)和与酵母细胞表面蛋白(例如Aga2p交配型黏着受体或Arxula adeninivorans葡糖淀粉酶)的融合来指导分泌。可改造蛋白酶切割位点(例如，Kex-2蛋白酶)以在多肽离开分泌途径时从其中去除融合序列。
[0440] 酵母天然地表达用于甲羟戊酸依赖型类异戊二烯生物合成途径的所需蛋白质，包括FPP合酶(ERG20；其可产生FPP)。因此，在酵母细胞中表达本文中提供的细胞色素P450和细胞色素P450还原酶(包括细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽和细胞色素P450还原酶多肽)可引起倍半萜的产生，例如来自FPP的檀香烯和香柠檬烯以及檀香醇和香柠檬醇。用于表达细胞色素P450和细胞色素P450还原酶(包括细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽和细胞色素P450还原酶多肽)的示例性酵母细胞包括被改造成表达提高水平的FPP的酵母。例如，可将酵母细胞改造成产生较少的角鲨烯合酶或较少的活性角鲨烯合酶(例如erg9突变体；参见例如美国专利No.6,531,303和6,689,593)。与野生型酵母细胞相比，这样引起FPP在宿主细胞中以更高的水平累积，其继而可引起倍半萜和倍半萜类化合物(例如檀香烯、香柠檬烯、檀香醇和香柠檬醇)的产率提高。在另一个实例中，可通过引入FPP合酶基因来将酵母细胞改造成产生更多的FPP合酶，例如来自檀香的SaFPPS(SEQ ID NO：18)。在一些实例中，可将这些酵母中的天然FPP基因缺失。能够提高酵母中的FPP产量的其他改造包括例如但不限于以下改造：提高乙酰辅酶A的产生、失活编码使用FPP和GPP作为底物之酶的基因和过量表达HMG-CoA还原酶，如美国专利No.7,842,497中所述。
示例性的经改造的酵母细胞包括但不限于：YPH499(MATa、ura3-52、lys2-801、ade2-101、trp1-Δ63、his3-Δ200、leu2-Δ1)、WAT11(MATa、ade2-1、his3-11、-15；leu2-3、-112、+
ura3-1、canR、cyr；包含经染色体整合的拟南芥NADPH-依赖性P450还原酶ATR1；参见Pompon等(1995)Toxicol Lett 82-83：815-822；Ro等(2005)Proc Natl Acad Sci USA
102：8060-8065)；和BY4741(MATa、his3Δ1、leu2Δ0、met15Δ0、ura3Δ0；ATCC#201388)、经改造的酿酒酵母菌株CALI5-1(ura3、leu2、his3、trp1、Δerg9：：HIS3、HMG2cat/TRP1：：
rDNA、dpp1、sue)、ALX7-95(ura3、his3、trp1、Δerg9：：HIS3、HMG2cat/TRP1：：rDNA、dpp1 def
sue)、ALX11-30(ura3、trp1、erg9 25、HMG2cat/TRP1：：rDNA、dpp1、sue)，它们都是已知的并且在美国专利No.6,531,303、6,689,593、7,838,279、7,842,497以及美国专利公开No.20040249219和20110189717中的一个或更多个中进行了描述。
[0441] c.植物及植物细胞
[0442] 可使用转基因植物细胞和植物来表达本文中提供的细胞色素P450和细胞色素P450还原酶，包括细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽和细胞色素P450还原酶多肽。通常使用直接DNA转移(例如微粒轰击)和PEG介导的原生质体转移以及使用农杆菌介导的转化来将表达构建体转移至植物。表达载体可包含启动子和增强子序列、转录终止元件以及翻译控制元件。表达载体和转化技术在双子叶植物宿主(例如拟南芥和烟草)和单子叶植物宿主(例如玉米和稻)之间通常是分开的。用于表达的植物启动子的实例包括花椰菜花叶病毒启动子、胭脂碱合酶启动子、核糖二磷酸羧化酶启动子以及泛素启动子和UBQ3启动子。通常使用选择性标记(例如潮霉素、磷酸甘露糖异构酶和新霉素磷酸转移酶)来促进转化细胞的选择和维持。可将转化的植物细胞以细胞、聚集体(愈伤组织)形式维持在培养物中或者再生成完整植物。转基因植物细胞还可包括被改造成产生蛋白质的藻类(参见例如Mayfield等(2003)Proc Natl Acad Sci USA 100：438-442)。转化植物包括例如选自以下属的植物：烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、拟南芥属(Arabidopsis)、苜蓿属(Medicago)(苜蓿)、棉属(Gossypium)(棉花)和芸苔属(Brassica)(油菜)。在一些实例中，所述植物属于烟草(Nicotiana tabacum)物种并且是已被过量表达细胞色素P450和/或细胞色素P450还原酶的载体转化的，例如美国专利公开No.20090123984和美国专利No.7,906,710中所述的。
[0443] d.昆虫及昆虫细胞
[0444] 可使用昆虫及昆虫细胞(特别是杆状病毒表达系统)来表达本文中提供的细胞色素P450和细胞色素P450还原酶，包括细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽和细胞色素P450还原酶多肽(参见，例如Muneta等(2003)J.Vet.Med.Sci.65(2)：219-223)。昆虫和昆虫幼虫(包括血淋巴中的表达)表达高水平的蛋白质并且能够进行高等真核生物所使用的大多数翻译后修饰。杆状病毒具有限制性的宿主范围以提高真核表达的安全性并降低调控问题。通常来说，表达载体使用诸如杆状病毒的多角体蛋白启动子的启动子来进行高水平表达。常用的杆状病毒系统包括例如以下的杆状病毒：苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)和家蚕(Bombyx mori)核型多角体病毒(BmNPV)；和昆虫细胞系，例如来自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf9( 参 见 例 如Mizutani 和 Ohta(1998)Plant Physiology116：357-367)、黏 虫(Pseudaletia unipuncta)(A7S)和黑脉金斑蝶(Danaus plexippus)(DpN1)。对于高水平表达，可将被表达分子的核苷酸序列融合到紧接所述病毒之多角体蛋白起始密码子的下游。哺乳动物分泌信号在昆虫细胞中被准确加工，并且可用于使被表达的蛋白质分泌到培养基中，另外，细胞系黏虫(Pseudaletia unipuncta)(A7S)和黑脉金斑蝶(Danaus plexippus)(DpN1)产生具有与哺乳动物细胞系统类似的糖基化模式的蛋白质。
[0445] 昆虫细胞中的一种替代表达系统是使用稳定转化的细胞。可使用细胞系例如Schnieder 2(S2)和Kc细胞(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))以及C7细胞(白纹伊蚊(Aedes albopictus))来进行表达。果蝇金属硫蛋白启动子可用于在存在经镉或铜的重金属诱导的情况下诱导高水平表达。表达载体通常通过使用选择性标记例如新霉素和潮霉素来维持。
[0446] e.哺乳动物表达
[0447] 可使用哺乳动物表达系统来表达本文中提供的细胞色素P450和细胞色素P450还原酶，包括细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽和细胞色素P450还原酶多肽，并且其还可用于产生其反应是由这些合酶催化的萜。可通过病毒感染(例如腺病毒)或通过直接DNA转移(例如脂质体、磷酸钙、DEAE-葡聚糖)和通过物理方式(例如电穿孔和微注射)来将表达构建体转移至哺乳动物细胞。用于哺乳动物细胞的表达载体通常包括mRNA帽位点、TATA框、翻译起始序列(Kozak共有序列)和多腺苷酸化元件。这样的载体通常包括用于高水平表达的翻译启动子-增强子，例如SV40启动子-增强子、人巨细胞病毒(CMV)启动子和劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)的长末端重复。这些启动子-增强子在很多细胞类型中具有活性。还可使用组织型和细胞型启动子和增强子区用于表达。示例性的启动子/增强子区包括但不限于来自例如以下基因的那些：弹性蛋白酶I、胰岛素、免疫球蛋白、小鼠乳腺肿瘤病毒、白蛋白、α-胎蛋白、α1-抗胰蛋白酶、β-球蛋白、髓鞘碱性蛋白、肌球蛋白轻链-2和促性腺释放激素基因控制。可使用选择性标记来选择和维持具有表达构建体的细胞。选择性标记基因的实例包括但不限于：潮霉素B磷酸转移酶、腺苷脱氨酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶和胸苷激酶。与细胞表面信号传导分子(例如TCR-ζ和FcεRI-γ)的融合可指导处于活性状态的蛋白质在细胞表面上表达。
[0448] 用于哺乳动物表达的很多细胞系是可用的，包括小鼠、大鼠、人、猴和鸡以及仓鼠细胞。示例性的细胞系包括但不限于：BHK(即BHK-21细胞)、293-F、CHO、CHO Express(CHOX；Excellgene)、Balb/3T3、HeLa、MT2、小鼠NS0(非分泌型)以及其他骨髓瘤细胞系、杂交瘤和异杂交瘤细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、293T、2B8和HKB细胞。适应于无血清培养基的细胞系也是可用的，从而有利于从细胞培养基中纯化分泌的蛋白质。一个这样的实例是无血清EBNA-1细胞系(Pham等(2003)Biotechnol.Bioeng.84：332-42)。
[0449] f.示例性宿主细胞
[0450] 用于表达本文中提供的细胞色素p450多肽(例如细胞色素P450檀香烯氧化酶、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或细胞色素P450还原酶)的示例性宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。通常来说，所述宿主细胞产生非环状焦磷酸酯萜前体。例如，所述宿主细胞可以产生法尼二磷酸。在一些实例中，所述宿主细胞可以是产生FPP作为甲羟戊酸依赖型类异戊二烯生物合成途径(例如真菌(包括酵母细胞)和动物细胞)或甲羟戊酸非依赖型类异戊二烯生物合成途径(例如细菌和高等植物)的一部分的细胞系。在一些实例中，所述宿主细胞天然地产生法尼二磷酸。在另一些实例中，所述宿主细胞被改造成比未经改造的细胞产生更多的法尼二磷酸。示例性的宿主细胞包括细菌、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞。在一些具体实例中，所述宿主细胞是酵母细胞。例如，所述酵母细胞是酵母属细胞，例如酿酒酵母细胞。在另一个实例中，所述酵母细胞是毕赤酵母属细胞，例如巴斯德毕赤酵母细胞。在另一些具体实例中，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。
[0451] 在一些具体实例中，所述宿主细胞已被改造成过量产生FPP。示例性的这样的细胞是经改造的酵母细胞。例如，在本文中提供的方法中可使用已被改造成产生较少角鲨烯合酶或较少活性角鲨烯合酶(例如erg9突变体；参见例如美国专利No.6,531,303和6,689,593)的酵母细胞来产生赖百当烯二醇二磷酸(labdenediol diphosphate)。与野生型酵母细胞相比，角鲨烯合酶活性降低引起FPP在宿主细胞中以更高的水平累积。示例性的经改造的酵母细胞包括但不限于：经改造的酿酒酵母菌株YPH499(MATa、ura3-52、lys2-801、ade2-101、trp1-Δ63、his3-Δ200、leu2-Δ1)、WAT11(MATa、ade2-1、+
his3-11、-15；leu2-3、-112、ura3-1、canR、cyr；包含经染色体整合的拟南芥NADPH-依赖性P450还原酶ATR1；参见Pompon等(1995)Toxicol Lett 82-83：815-822；Ro等(2005)Proc Natl Acad Sci USA 102：8060-8065)；和BY4741(MATa、his3Δ1、leu2Δ0、met15Δ0、ura3Δ0；ATCC#201388)。使用这样的宿主细胞来表达本文中提供的细胞色素P450多肽允许提高前体FPP的产率并由此允许提高檀香烯和香柠檬烯的产率。
[0452] 本文中提供了包含本文中提供的任何细胞色素P450多肽或其催化活性片段的宿主细胞。本文中提供了包含细胞色素P450多肽或其催化活性片段的宿主细胞。在一些实例中，所述宿主细胞包含具有SEQ ID NO：1至5和67至72中任一个所示的核苷酸序列的细胞色素P450多肽或其催化活性片段。在另一些实例中，所述宿主细胞包含这样的细胞色素P450多肽或其催化活性片段，其核酸序列与SEQ ID NO：1至5和67至72中任一个所示核苷酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性百分比。在另一些实例中，所述宿主细胞包含编码具有SEQ ID NO：6至9、50和73至78中任一个所示的氨基酸序列的细胞色素P450多肽或其催化活性片段的核酸。在又一些实例中，所述宿主细胞包含编码这样的细胞色素P450多肽或其催化活性片段的核酸，其与SEQ ID NO：6至9、50和73至78中任一个所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％或99％的序列同一性百分比。
[0453] 本文中提供了包含细胞色素P450檀香烯氧化酶或其催化活性片段的宿主细胞。在一些实例中，所述宿主细胞包含具有SEQ ID NO：3、68、69、70或71中任一个所示的核苷酸序列的细胞色素P450檀香烯氧化酶或其催化活性片段。在另一些实例中，所述宿主细胞包含这样的细胞色素P450檀香烯氧化酶或其催化活性片段，其核酸序列与SEQ ID NO：
3、68、69、70或71中任一个所示核苷酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性百分比。在另一些实例中，所述宿主细胞包含编码具有SEQ ID NO：7、74、75、76或77中任一个所示的氨基酸序列的细胞色素P450檀香烯氧化酶或其催化活性片段的核酸。在又一些实例中，所述宿主细胞包含编码这样的细胞色素P450檀香烯氧化酶或其催化活性片段的核酸，其与SEQ ID NO：7、74、75、76或77中任一个所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、
85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性百分比。
[0454] 本文中提供了包含细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或其催化活性片段的宿主细胞。在一些实例中，所述宿主细胞包含具有SEQ ID NO：2、4、5或67中任一个所示的核苷酸序列的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或其催化活性片段。在另一些实例中，所述宿主细胞包含这样的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或其催化活性片段，其核酸序列与SEQ ID NO：2、4、5或67中任一个所示核苷酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性百分比。在另一些实例中，所述宿主细胞包含编码具有SEQ ID NO：6、8、9或73中任一个所示的氨基酸序列的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或其催化活性片段的核酸。在又一些实例中，所述宿主细胞包含编码这样的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或其催化活性片段的核酸，其与SEQ ID NO：
6、8、9或73中任一个所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性百分比。
[0455] 在一些实例中，本文中提供的包含细胞色素P450或其催化活性片段的任何宿主细胞还可包含萜合酶。本文中提供了包含细胞色素P450或其催化活性片段和萜合酶的宿主细胞。在这样的一些实例中，所述萜合酶可以是檀香烯合酶。例如，所述萜合酶是具有SEQ ID NO：17、52或53中任一个所示的氨基酸序列的檀香烯合酶，或与SEQ ID NO：17、52或53中任一个所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的檀香烯合酶，或编码檀香烯合酶的核酸分子。所述编码核酸分子具有SEQ ID NO：16、59或60中任一个所示的核苷酸序列或编码檀香烯合酶的核酸分子。所述核酸分子与SEQ ID NO：16、59或60中任一个所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％的同一性百分比。
[0456] 本文中提供了包含细胞色素P450或其催化活性片段和檀香烯合酶或编码檀香烯合酶的核酸分子的宿主细胞，所述檀香烯合酶具有SEQ ID NO：17、52或53中任一个所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：17、52或53中任一个所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。所述核酸分子具有SEQ ID NO：16、59或60中任一个所示的核苷酸序列或编码檀香烯合酶的核酸分子。所述核酸分子与SEQ ID NO：16、59或60中任一个所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％的同一性百分比。在这样的一些实例中，所述细胞色素P450或其催化活性片段是具有SEQ ID NO：1至5和67至72中任一个所示的核苷酸序列的细胞色素P450多肽或其催化活性片段；或具有与SEQ ID NO：1至5和67至72中任一个所示的核苷酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性百分比的核酸序列的细胞色素P450多肽或其催化活性片段；或编码具有SEQ ID NO：6至9、50和73至78中任一个所示的氨基酸序列的细胞色素P450多肽或其催化活性片段的核酸分子；或编码与SEQ ID NO：6至9、50和73至78中任一个所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％的序列同一性百分比的细胞色素P450多肽或其催化活性片段的核酸分子。
[0457] 在一个实例中，本文中提供了包含细胞色素P450多肽或其催化活性片段和檀香烯合酶的宿主细胞。在另一个实例中，本文中提供了包含细胞色素P450檀香烯氧化酶或其催化活性片段和檀香烯合酶的宿主细胞。在又一个实例中，本文中提供了包含细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或其催化活性片段和檀香烯合酶的宿主细胞。
[0458] 本文中还提供了包含细胞色素P450或其催化活性片段和萜合酶的宿主细胞，其还可包含细胞色素P450还原酶或其催化活性片段。在这样的一些实例中，所述萜合酶可以是檀香烯合酶。例如，所述萜合酶是具有SEQ ID NO：17、52或53中任一个所示的氨基酸序列的檀香烯合酶，或与SEQ ID NO：17、52或53中任一个所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的檀香烯合酶，或编码檀香烯合酶的核酸分子。所述核酸分子具有SEQ ID NO：
16、59或60中任一个所示的核苷酸序列或编码檀香烯合酶的核酸分子。所述核酸分子与SEQ ID NO：16、59或60中任一个所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性百分比。在这样的一些实例中，所述细胞色素P450还原酶或其催化活性片段是具有SEQ ID NO：10或11中任一个所示的核苷酸序列的细胞色素P450还原酶或其催化活性片段；或与SEQ ID NO：10或11中任一个所示的核苷酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性百分比的细胞色素P450还原酶或其催化活性片段；或编码具有SEQ ID NO：12至15中任一个所示的氨基酸序列的细胞色素P450还原酶或其催化活性片段的核酸分子；或编码与SEQ ID NO：12至15中任一个所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性百分比的细胞色素P450还原酶或其催化活性片段的核酸分子。在这样的一些实例中，所述细胞色素P450或其催化活性片段是具有SEQ ID NO：1至5和67至72中任一个所示的核苷酸序列的细胞色素P450或其催化活性片段；
或核酸序列与SEQ ID NO：1至5和67至72中任一个所示的核苷酸序列具有至少60％、
65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性百分比的细胞色素P450多肽或其催化活性片段；或编码具有SEQ ID NO：6至9、50和73至78中任一个所示的氨基酸序列的细胞色素P450多肽或其催化活性片段的核酸分子；或编码与SEQ ID NO：6至9、50和73至78中任一个所示的氨基酸序列具有至少60％、
65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性百分比的细胞色素P450多肽或其催化活性片段的核酸分子。
[0459] 在一个实例中，本文中提供了包含细胞色素P450多肽或其催化活性片段、檀香烯合酶和细胞色素P450还原酶或其催化活性片段的宿主细胞。在另一个实例中，本文中提供了包含细胞色素P450檀香烯氧化酶或其催化活性片段、檀香烯合酶和细胞色素P450还原酶或其催化活性片段的宿主细胞。在又一个实例中，本文中提供了包含细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或其催化活性片段、檀香烯合酶和细胞色素P450还原酶或其催化活性片段的宿主细胞。
[0460] 本文中提供了包含细胞色素P450还原酶或其催化活性片段的宿主细胞。在一些实例中，所述宿主细胞包含具有SEQ ID NO：10或11中任一个所示的核苷酸序列的细胞色素P450还原酶或其催化活性片段。在另一些实例中，所述宿主细胞包含核酸序列与SEQ ID NO：10或11中任一个所示的核苷酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性百分比的细胞色素P450还原酶或其催化活性片段。在另一些实例中，所述宿主细胞包含编码具有SEQ ID NO：12至15中任一个所示的氨基酸序列的细胞色素P450还原酶或其催化活性片段的核酸。在又一些实例中，所述宿主细胞包含编码与SEQ ID NO：12至15中任一个所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或99％序列同一性百分比的细胞色素P450还原酶或其催化活性片段的核酸。
[0461] 在一些实例中，包含细胞色素P450还原酶或其催化活性片段的宿主细胞还包含细胞色素P450或其催化活性片段。例如，本文中提供了包含细胞色素P450还原酶或其催化活性片段和细胞色素P450或其催化活性片段的宿主细胞。在这样的一些实例中，所述细胞色素P450或其催化活性片段是具有SEQ ID NO：1至5和67至72中任一个所示的核苷酸序列的细胞色素P450多肽或其催化活性片段；或核酸序列与SEQ ID NO：1至5和67至72中任一个所示的核苷酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性百分比的细胞色素P450多肽或其催化活性片段；或编码具有SEQ ID NO：6至9、50和73至78中任一个所示的氨基酸序列的细胞色素P450多肽或其催化活性片段的核酸分子；或编码与SEQ ID NO：6至9、50和73至78中任一个所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性百分比的细胞色素P450多肽或其催化活性片段的核酸分子。
[0462] 在一个实例中，本文中提供了包含细胞色素P450多肽或其催化活性片段和细胞色素P450还原酶或其催化活性片段的宿主细胞。在另一个实例中，本文中提供了包含细胞色素P450檀香烯氧化酶或其催化活性片段和细胞色素P450还原酶或其催化活性片段的宿主细胞。在又一个实例中，本文中提供了包含细胞色素P450香柠檬烯氧化酶或其催化活性片段和细胞色素P450还原酶或其催化活性片段的宿主细胞。
[0463] 5.纯化
[0464] 用于从宿主细胞中纯化细胞色素P450和细胞色素P450还原酶(例如细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽和胞色素P450还原酶多肽)的方法取决于所选择的宿主细胞和表达系统。对于分泌型分子，通常在移除细胞后从培养基中纯化蛋白质。对于细胞内表达，可将细胞裂解并从提取物中纯化蛋白质。当使用转基因生物(例如转基因植物和动物)进行表达时，可将组织或器官用作制备裂解的细胞提取物的起始材料。另外，转基因动物的产生可包括乳或卵中的多肽的产生，可将这些多肽收集，并且如有需要的话可提取这些蛋白质并用本领域中的标准方法进行进一步纯化。
[0465] 可使用本领域中已知的标准蛋白质纯化技术来纯化细胞色素P450和细胞色素P450还原酶，包括细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽和细胞色素P450还原酶多肽，所述技术包括但不限于：SDS-PAGE、尺寸分级和尺寸排阻色谱、硫酸铵沉淀、螯合色谱和离子交换色谱。还可将表达构建体改造成添加有亲和标签例如myc表位、GST融合物或His6，并分别用myc抗体、谷胱甘肽树脂和Ni树脂对蛋白质进化亲和纯化。可通过本领域中已知的任何方法对纯度进行评价，包括凝胶电泳和染色以及分光光度技术。
[0466] 6.融合蛋白
[0467] 还提供了包含细胞色素P450和细胞色素P450还原酶(包括细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽和细胞色素P450还原酶多肽)以及一种或更多种其他多肽的融合蛋白。细胞色素P450或细胞色素P450还原酶多肽与另一多肽的连接可直接实现或通过接头间接实现。在一个实例中，连接可将通过化学连接，例如通过异双官能剂或硫醇连接或其他这样的连接。还可通过重组方式来实现融合。细胞色素P450或细胞色素P450还原酶(例如细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽和细胞色素P450还原酶多肽)与另一多肽的融合可发生在该细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽和细胞色素P450还原酶多肽的N端或C端。
[0468] 融合蛋白可通过标准的重组技术产生。例如，可根据常规技术将编码不同多肽序列的DNA片段在框内连接在一起，例如，通过采用平末端或黏末端连接、限制性酶消化以提供合适的末端、根据需要补平黏末端、碱性磷酸酶处理以避免不期望的连接和酶法连接。在另一个实例中，可通过常规技术合成融合基因，包括自动DNA合成仪。或者，可使用在两个连续基因片段之间产生互补突出部分的锚定引物来进行基因片段的PCR扩增，随后可将其退火并再次扩增从而产生嵌合基因序列(参见例如Ausubel等(编辑)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons，1992)。此外，已编码有融合部分(例如，GST多肽)的很多表达载体是市售可得的。可将编码细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽的核酸克隆到这样的表达载体中，使得融合部分与细胞色素P450檀香烯氧化酶蛋白在框内连接。可将编码细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽的核酸克隆到这样的表达载体中，使得融合部分与细胞色素P450香柠檬烯氧化酶蛋白在框内连接。在一些实例中，可将编码细胞色素P450多肽的核酸克隆到这样的表达载体中，使得细胞色素P450与檀香烯合酶多肽编码核酸在框内连接。例如，可将编码细胞色素P450檀香烯氧化酶或香柠檬烯氧化酶多肽的核酸克隆到这样的表达载体中，使得细胞色素P450檀香烯氧化酶或香柠檬烯氧化酶与檀香烯合酶多肽编码核酸在框内连接。细胞色素P450和檀香烯合酶可无需接头直接连接，或者作为替代地，用接头在框内间接连接。
[0469] G.用于产生萜类化合物的方法以及用于检测此类产物和检测细胞色素P450和细胞色素P450还原酶多肽的活性的方法
[0470] 本文中提供的细胞色素P450多肽可用于从任何合适的萜底物(包括单萜、倍半萜和二萜)产生萜类化合物，并对其产生萜类化合物的能力进行评价，所述萜类化合物包括单萜类化合物、倍半萜类化合物和二萜类化合物。通常来说，本文中提供的细胞色素P450檀香烯氧化酶从檀香烯产生檀香醇，而本文中提供的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶从香柠檬烯产生香柠檬醇。可使用本领域技术人员已知的任何方法由本文中提供的细胞色素P450多肽催化来产生萜类化合物。可使用这些方法对本文中提供的细胞色素P450多肽催化萜底物形成萜类化合物的能力进行评价。通过GC-MS分析萜类化合物产物，并基于MS片段化模式与NIST和Wiley库中条目的匹配对其进行鉴定(例如，如下文的实施例6中所述)。
[0471] 本文中提供的细胞色素P450还原酶多肽可用于将来自NADPH的两个电子转移至任何合适的电子受体，并对其将来自NADPH的两个电子转移至任何合适的电子受体的能力进行评价，所述合适的电子受体包括细胞色素P450、细胞色素c、血红素加氧酶、细胞色素b5和角鲨烯环氧酶。
[0472] 还可使用本领域中公知的方法和测定来对本文中提供的细胞色素P450和细胞色素P450还原酶多肽(例如细胞色素P450檀香烯氧化酶、细胞色素P450香柠檬烯氧化酶和细胞色素P450还原酶)的其他活性和特性进行评价。除评价细胞色素P450和细胞色素P450还原酶多肽的活性以及其催化形成萜类化合物的能力之外，还可使用本领域中公知的方法来对反应动力学、底物特异性提高、底物利用改变和/或产物分布改变(当与另一细胞色素P450和细胞色素P450还原酶多肽比较时)进行评价。例如，可通过气相色谱方法(例如GC-MS)(例如实施例6中所述的那些)并将MS片段化模式与NIST和Wiley库中的条目进行比较(参见实施例6)来评价檀香烯和香柠檬烯通过檀香烯氧化酶和香柠檬烯氧化酶多肽产生的萜类化合物的量和类型。还可通过与正宗檀香油中的化合物进行比较来鉴定产物。
[0473] 下文提供了用于产生檀香醇以及(E)-α-反式-香柠檬醇和(Z)-α-反式-香柠檬醇的方法，所述檀香醇包括(Z)-α-檀香醇、(E)-α-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(E)-β-檀香醇、(Z)-表-β-檀香醇和(E)-表-β-檀香醇，其中这些檀香醇和香柠檬醇的产生由本文中提供的细胞色素P450和细胞色素P450还原酶多肽催化。本文中还提供了用于评价本文中提供的细胞色素P450和细胞色素P450还原酶多肽的活性的方法。
[0474] 1.檀香醇和香柠檬醇的合成
[0475] 本文中提供的细胞色素P450檀香烯氧化酶和细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽可用于催化萜底物檀香烯和香柠檬烯形成檀香醇和香柠檬醇。在一些实例中，将细胞色素P450檀香烯氧化酶在产生或过量表达檀香烯合酶和FPP的细胞中表达，从而使檀香醇以本文中其他部分所述的方式产生。在另一些实例中，将细胞色素P450香柠檬烯氧化酶在过量表达产生檀香烯合酶的细胞中表达，从而使香柠檬醇以本文中其他部分所述的方式产生。在另一些实例中，将本文中提供的细胞色素P450檀香烯氧化酶和细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽表达并从任何合适的宿主细胞(例如部分E中所示的任何宿主细胞)中纯化出。然后，将纯化的细胞色素P450檀香烯氧化酶和细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽与檀香烯和香柠檬烯在体外合并从而产生檀香醇和香柠檬醇。
[0476] a.檀香烯和香柠檬烯的氧化
[0477] 在一些实例中，将本文中提供的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽按照上文的部分E中所述过量表达并纯化。然后，将细胞色素P450檀香烯氧化酶与一种或更多种萜底物(包括α-檀香烯、β-檀香烯、表-β-檀香烯和/或α-反式-香柠檬烯)孵育，并产生α-檀香醇、β-檀香醇和表-β-檀香醇以及α-反式-香柠檬醇中的一种或更多种，例如(E)-α-檀香醇、(Z)-α-檀香醇、(E)-β-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(E)-表-β-檀香醇、(Z)-表-β-檀香醇、(Z)-α-反式-香柠檬醇和(E)-α-反式-香柠檬醇。或者，将本文中提供的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽在还产生萜底物(包括α-檀香烯、β-檀香烯、表-β-檀香烯和/或α-反式-香柠檬烯)的宿主细胞中表达，并导致产生α-檀香醇、β-檀香醇和表-β-檀香醇以及α-反式-香柠檬醇中的一种或更多种，例如(E)-α-檀香醇、(Z)-α-檀香醇、(E)-β-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(E)-表-β-檀香醇、(Z)-表-β-檀香醇、(Z)-α-反式-香柠檬醇和(E)-α-反式-香柠檬醇。然后，使用本文中提供的任何方法来确定檀香醇和香柠檬醇的产生和产物量的数量，所述方法例如气相色谱-质谱(例如GC-MS)、气相色谱-火焰离子化检测(GC-FID)和液相色谱-质谱(LC-MS)。可将质谱模式与MS片段化模式以及NIST和Wiley库中的条目进行比较，例如实施例6中所述，或者通过与檀香油中的已知萜类化合物进行比较。
[0478] 在另一些实例中，将本文中提供的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽按照上文的部分E中所述过量表达并纯化。然后，将细胞色素P450香柠檬烯氧化酶与一种或更多种萜底物(包括α-檀香烯、β-檀香烯、表-β-檀香烯和/或α-反式-香柠檬烯)孵育，并产生(Z)-α-反式-香柠檬醇或(E)-α-反式-香柠檬醇的一种或更多种。在一些实例中，还产生少量的α-檀香醇、β-檀香醇和/或表-β-檀香醇。或者，将本文中提供的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽在还产生萜底物(包括α-檀香烯、β-檀香烯、表-β-檀香烯和/或α-反式-香柠檬烯)的宿主细胞中表达，导致产生(Z)-α-反式-香柠檬醇或(E)-α-反式-香柠檬醇。在一些实例中，还产生少量的α-檀香醇、β-檀香醇和/或表-β-檀香醇。然后，使用本文中提供的任何方法来确定香柠檬醇的产生和产物量的数量，所述方法例如气相色谱-质谱(例如GC-MS)、气相色谱-火焰离子化检测(GC-FID)和液相色谱-质谱(LC-MS)。可将质谱模式与MS片段化模式以及NIST和Wiley库中的条目进行比较，例如实施例6中所述，或者通过与檀香油中的已知萜类化合物进行比较。
[0479] b.非环状焦磷酸酯萜前体的转化
[0480] 在一些实例中，萜类化合物通过在产生非环状焦磷酸酯萜前体和萜合酶的宿主细胞中表达细胞色素P450单加氧酶来由非环状焦磷酸酯前体(例如牻牛儿焦磷酸、法尼焦磷酸和牻牛儿基牻牛儿焦磷酸)生物合成产生。合适的宿主细胞在上文的E部分中进行了描述。在一个实例中，通过在产生FPP和檀香烯合酶的宿主细胞中表达细胞色素P450檀香烯氧化酶来生物合成产生檀香醇和香柠檬醇(参见实施例10)。另一个实例中，通过在产生FPP和檀香烯合酶的宿主细胞中表达细胞色素P450香柠檬烯氧化酶来生物合成产生香柠檬醇(参见实施例10)。然后，使用本文中提供的任何方法来确定檀香醇和香柠檬醇的产生和产物量的数量，所述方法例如气相色谱-质谱(例如GC-MS)、气相色谱-火焰离子化检测(GC-FID)和液相色谱-质谱(LC-MS)。可将质谱模式与MS片段化模式以及NIST和Wiley库中的条目进行比较，例如实施例6中所述，或者通过与檀香油中的已知萜类化合物进行比较。
[0481] 在另一个实例中，萜类化合物可通过以下由非环状焦磷酸酯萜前体产生：1)将非环状焦磷酸酯萜前体与萜合酶孵育和2)将反应产物与细胞色素P450单加氧酶孵育。在一些实例中，将非环状焦磷酸酯萜前体与萜合酶的反应产物分离。在另一些实例中，向第一反应混合物直接添加细胞色素P450单加氧酶，而无需事先进行纯化。这两个步骤可同时进行或先后进行。通过本文中提供的任何方法对反应产生的萜类化合物进行鉴定和定量，例如气相色谱-质谱(例如GC-MS)、气相色谱-火焰离子化检测(GC-FID)和液相色谱-质谱(LC-MS)。可将质谱模式与MS片段化模式以及NIST和Wiley库中的条目进行比较，例如实施例6中所述，或者通过与檀香油中的已知萜类化合物进行比较。
[0482] 2.产生方法
[0483] a.示例性的细胞
[0484] 可通过在产生作为甲羟戊酸依赖型类异戊二烯生物合成途径(例如真菌(包括酵母)和动物细胞)或甲羟戊酸非依赖型类异戊二烯生物合成途径(例如细菌和高等植物)之一部分的FPP的细胞系中表达本文中提供的细胞色素P450合酶多肽和/或细胞色素450还原酶多肽来产生檀香醇和香柠檬醇。在一些具体实例中，通过在已被改造成过量表达FPP的细胞系中表达本文中提供的细胞色素P450檀香烯氧化酶多肽和檀香烯合酶多肽来产生檀香醇。在另一些实例中，通过在已被改造成过量表达FPP的细胞系中表达本文中提供的细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽和檀香烯合酶多肽来产生香柠檬醇。示例性的这样的细胞是经改造的酵母细胞。例如，本文中提供的方法中可使用已被改造成产生较少角鲨烯合酶或较少活性角鲨烯合酶(例如erg9突变体；参见例如美国专利No.6,531,303和6,689,593)的酵母细胞来产生赖百当烯二醇二磷酸。与野生型酵母细胞相比，角鲨烯合酶活性降低引起FPP在宿主细胞中以更高的水平累积，从而允许提高檀香烯和香柠檬烯的产生。示例性的经改造的酵母细胞包括但不限于经改造的酿酒酵母菌株YPH499(MATa、ura3-52、lys2-801、ade2-101、trp1-Δ63、his3-Δ200、leu2-Δ1)、WAT11(MATa、ade2-1、+
his3-11、-15；leu2-3、-112、ura3-1、canR、cyr；包含经染色体整合的拟南芥NADPH-依赖性P450还原酶ATR1；参见Pompon等(1995)Toxicol Lett 82-83：815-822；Ro等(2005)Proc Natl Acad Sci USA 102：8060-8065)；和BY4741(MATa、his3Δ1、leu2Δ0、met15Δ0、ura3Δ0；ATCC #201388)。
[0485] b.细胞培养
[0486] 在一些示例性的方法中，将本文中提供的细胞色素P450在已被改造成过量表达法尼二磷酸和檀香烯合酶的宿主细胞系中表达，从而在细胞色素P450被表达时，法尼二磷酸被转化成檀香醇和香柠檬醇。在另一些示例性的方法中，将本文中提供的细胞色素P450和檀香烯合酶在已被改造成过量表达法尼二磷酸的宿主细胞系中表达，从而在这两种蛋白质被表达时，法尼二磷酸被转化成檀香醇或香柠檬醇。可将细胞色素P450和檀香烯合酶分开表达，或者以本文其他部分所述的融合蛋白形式一起表达。细胞色素P450和檀香烯合酶可同时被表达或先后被表达。将宿主细胞用本领域中已知的任何合适的方法进行培养。在一些实例中，例如为了对表达不同细胞色素P450的细胞进行高通量筛选，将表达细胞色素P450的细胞在96-孔板的单独孔中进行培养。在其中宿主细胞是酵母细胞的另一些实例中，将表达细胞色素P450多肽、檀香烯合酶和FPP的细胞用发酵方法(例如下文中所描述的那些)进行培养。
[0487] 多种发酵方法可用于从表达本文中提供的细胞色素P450多肽的酵母细胞中产生檀香醇和香柠檬醇。例如，可通过分批或连续发酵来实现大规模生产。经典的分批发酵是一种在发酵开始时设定培养基组成，而在发酵期间不进行人为改变的封闭系统。因此，在发酵开始时，用期望的微生物接种培养基，并允许发酵发生而无需进一步添加营养物质。通常来说，限制分批式发酵中的碳源浓度并控制诸如pH和氧浓度的因素。在分批式系统中，该系统的代谢物和生物质组成不断变化，直至发酵结束。在分批式培养中，细胞通常从静止的停滞期调整到高速生长的对数期，最终到达生长速度降低或停止的静止期。如果不进行处理，处于静止期的细胞最终将死亡。
[0488] 标准分批系统的一个变化形式是补料-分批系统(Fed-Batch system)，其与典型的分批式系统类似，除在发酵进行时添加营养物质之外。当代谢物阻遏趋向于抑制细胞代谢时和在期望培养基中具有有限量的底物的情况下，补料-分批式系统是有用的。此外，与分批发酵方法相比，能够供给营养物质通常将导致补料-分批发酵方法中具有更高的细胞密度。在补料-分批发酵中，一般对以下因素进行测量和控制，例如pH、溶解氧、营养物质浓度和废气(例如CO)的分压。
[0489] 还可用连续发酵来实现檀香醇或香柠檬醇的产生。连续发酵是一种开放系统，其中向生物反应器不断添加限定的发酵培养基并同时移除等量的条件培养基以进行处理。这种系统一般使培养物维持在恒定的高浓度，其中细胞主要处于其对数生长期。连续发酵允许调节影响细胞生长或终产物浓度的任何数量的因素。例如，一种方法将使限制性营养物质(例如碳源或氮水平)维持在固定速率，并允许其他所有参数被调节。在另一些系统中，可不断改变影响生长的多个因素，同时使通过培养基浊度测量的细胞浓度保持恒定。连续系统目的是维持稳态生长条件，因此必须使由移除培养基而引起的细胞损失与发酵过程中的细胞生长速率保持平衡。调节用于连续发酵过程的营养物质和生长因子的方法以及用于使产物形成速率最大化的技术是本领域中公知的。
[0490] 在培养细胞后，可随后收获细胞培养基以获得所产生的檀香醇和香柠檬醇。
[0491] c.分离以及用于检测和鉴定的测定
[0492] 可将使用上述方法通过本文中提供的细胞色素P450多肽产生的檀香醇和香柠檬醇通过本领域中已知的任何方法分离并评价。在一个实例中，用有机溶剂萃取细胞培养基以将所产生的任何萜或萜类化合物分配到有机层中。可评价檀香醇和/或香柠檬醇的产生和/或使用本领域中已知的任何方法(例如，气相色谱或柱色谱)将檀香醇和/或香柠檬醇与其他产物分离。例如，可通过GC-MS对有机层进行分析。
[0493] 可通过用于分离和分析有机化合物的任何标准色谱技术来确定所产生的檀香醇和/或香柠檬醇的量。例如，可通过用于检测和量化碳氢化合物(例如檀香醇和/或香柠檬醇以及其他萜类化合物)的任何已知的色谱技术来测定檀香醇和/或香柠檬醇的产生，包括但不限于：气相色谱质谱(GC-MS)、使用火焰离子化检测器的气相色谱(GC-FID)、毛细管GC-MS、高效液相色谱(HPLC)和柱色谱。通常来说，在存在用于量化所产生的萜类化合物的量之已知内标物的情况下进行这些技术。例如，在使用质谱检测的气相色谱中，可通过将保留时间和质谱与正宗标准物的保留时间和质谱进行比较来鉴定萜类化合物，包括倍半萜类化合物，例如檀香醇和/或香柠檬醇。典型的标准物包括但不限于檀香醇和/或香柠檬醇。在另一些实例中，可通过使用火焰离子化检测的气相色谱来实现量化，其以与已知量正宗标准物的校准曲线和相对于内标物峰面积的归一化为基础。这些色谱技术允许鉴定有机层中存在的任何萜，包括例如细胞色素P450所产生的其他萜类化合物。
[0494] 在一些实例中，可通过合酶测定来确定檀香醇和/或香柠檬醇之产生的动力学，3 14
其中将放射性类异戊二烯底物(例如，H FPP或 C FPP)与不同浓度的合酶一起使用。将产物提取到有机层中并使用液体闪烁计数器测量放射性。由Michaelis-Menton方程与数据的直接拟合确定动力学常数。
[0495] 3.檀香油的产生
[0496] 可使用本文中提供的细胞色素P450檀香烯氧化酶和细胞色素P450香柠檬烯氧化酶多肽来产生檀香油。例如，可将细胞色素P450檀香烯氧化酶在产生或过量表达檀香烯合酶的细胞中表达，从而如本文其他部分所述产生檀香醇和香柠檬醇，例如檀香醇和香柠檬醇，包括α-檀香醇、β-檀香醇和表-β-檀香醇、以及Z-α-反式-香柠檬醇。可通过GC-MS分析将萜类化合物产物与见于来自檀香的正宗檀香油中的那些进行比较，例如，如实施例8中所述。
[0497] 4.用于检测细胞色素P450和细胞色素P450还原酶多肽的酶活性的测定
[0498] a.用于确定细胞色素P450多肽的活性的方法
[0499] 本领域技术人员熟悉用于检测细胞色素P450多肽之酶活性的方法和测定。细胞色素P450多肽可以是在酵母中表达的或者是从微粒体膜级分中纯化的。可通过将细胞色素P450多肽与不同的单萜、倍半萜和二萜底物孵育来在体外确定细胞色素P450单加氧酶活性，如实施例11中所述。反应产物(包括产物比例)可通过本领域技术人员已知的任何方法来确定，包括GC-MS、GC-FID、LC-MS、与已知标准物进行比较、以及质子和碳核磁共振(NMR)。或者，可通过向细胞色素P450的酵母培养物添加萜底物并按照上文所述对产物进行鉴定来在体内确定活性。微粒体中的总P450含量可通过CO差别吸收光谱来量化(参见Guengerich等(2009)Nat Protoc 4：1245-1251和实施例8)。
[0500] 酶动力学可在存在NADPH和CPR的情况下在体外进行确定。在这样的测定中，CPR以有限量包括在内，例如0.1U，以用于确定酶活性；和5毫单位，以用于确定相对活性和动力学参数。可在一定的底物浓度范围内进行测定并可通过GC-MS确定产物形成。向酵母培养物直接添加萜。
[0501] b.用于确定细胞色素P450还原酶多肽的活性的方法
[0502] 本领域技术人员熟悉用于检测细胞色素P450还原酶多肽之酶活性的方法和测定。在一个实例中，可使用检测C4H(肉桂酸4-羟化酶)活性的测定来确定CPR活性，例如，如Ro等(2001)Plant Physiology 126：317-329中所述。C4H是一种血红素-硫醇盐蛋白质，其催化肉桂酸形成对香豆酸。这种测定可通过将细胞色素P450还原酶在存在C4H的情况下在酵母细胞中表达来在体内使用(还参见，Ro等(2002)Plant Physiology 130：1837-1851)。CH4活性借助于通过HPLC检测对香豆酸形成来确定(Mizutani等(1993)Plant Cell Physiology 34：481-488)。
[0503] CPR可以是从酵母微粒体级分中纯化的以在体外评价CPR活性，例如Pompon等((1996)Methods Enzymol 272：51-64)和下文的实施例8中所述。微粒体中的总P450含量可通过CO差异吸收光谱来量化(Omura和Sato(1964)J Biol Chem 239：2370-2378；Mizutani和Ohta(1998)Plant Physiology 116：357-367)。FAD和FMN含量可按照Faeder和Siegel(1973)Anal Biochem 53：332-336中所述进行确定。可通过本领域技术人员已知的多种测定来对体外CPR活性进行评价。例如，可使用上文中所述的C4H测定来确定活性。
在另一个实例中，通过测量人工电子受体(例如细胞色素c和氧化的铁氰化物)的降低来确定活性(Xia等(2011)J Biol Chem 286：16246-16260；Hamdane等(2009)J Biol Chem
284：11374-11384；Shen等(1989)J Biol Chem 264：7584-7589)。如下测量还原性细胞色-1 -1
素c的形成：使用分光光度计并使用消光系数(∑＝21mM cm )计算来自A550变化的降低率(Imai(1976)J Biochem 80：267-276)。用于检测CPR的另一种测定是P450 2B4重建系统中的乙氧基香豆素O-去乙基酶活性报道子测定(Louerat-Orieu等(1998)Eur J Biochem
258：1040-1049)。
[0504] 可通过在拟南芥中在花椰菜花叶病毒35S启动子的控制之下表达其C端融合有GFP的CPR来确定细胞色素P450还原酶多肽的亚细胞膜定位位点，例如，不论CPR位于ER中还是位于叶绿体中(参见，Ro等(2002)Plant Physiology 130：1837-1851)。然后，可针对GFP的存在通过荧光显微镜和共聚焦显微镜(参见Ro等(2002)Plant Physiology 130：1837-1851)或通过对幼苗中的微粒体蛋白质进行免疫印迹分析来筛选独立转化的T1和T2幼苗。CPR在GFP-CPR融化物中的功能可使用C4H测定来验证。
[0505] G.实施例
[0506] 以下实施例仅出于举例说明目的而包括在内，并非意在限制本发明的范围。
[0507] 实施例1
[0508] 檀香cDNA的克隆和测序
[0509] 在这一实施例中，从檀香树的木材样品中提取RNA，之后产生cDNA并测序。
[0510] A.分离和提取檀香RNA
[0511] 在生长在由Forest Products Commission of Western Australia管理之陆地上的成熟檀香树的下部茎中钻数个25mm的孔。从心材-边材过渡区收集木材样品，并将其立即冷冻在液氮中。使用由Kolosova等，(2004)BioTechniques 36：821-824改进的方案从10g组织中提取RNA。在用LiCl沉淀之后，将RNA储存在-80℃直至进行cDNA合成。
[0512] B.产生檀香cDNA文库
[0513] 使用具有pDNR-LIB载体的SMART-Creator试剂盒(Clontech；SEQ ID NO：20)来将檀香木质部的总RNA(1.4μg)用SuperScript III逆转录酶(Invitrogen)在42℃下逆转录1小时。将连接混合物通过电穿孔转化到25μL抗噬菌体的电感受态大肠杆菌细胞中，并在Genome Sciences Centre，Vancouver，Canada进行Sanger测序。
[0514] C.454 Pyr测序和Sanger测序
[0515] 制备来自檀香心的两个cDNA文库，并用Sanger技术进行测序，产生11,520个配对末端序列。在这两个cDNA文库上进行一板的454Titanium测序并产生902,111个读序(read)。用454和Sanger序列用Newbler组装软件v2.6(454 Life Sciences，Roche Diagnostics)在默认参数下进行组装。这产生31,461个重叠群(孤立序列，isotig)。
[0516] 实施例2
[0517] 鉴定编码檀香细胞色素P450多肽的核酸
[0518] 通过使用BLASTx检索(blast.ncbi.nlm.nih.gov；Altschul等(1990)J Mol Biol215：403-410)将组装序列(来自实施例1)与来自CYP76家族P450蛋白质的一组已知植物P450编码基因进行比较来鉴定细胞色素P450编码基因。
[0519] 下表4提供了在BLASTx检索(blast.ncbi.nlm.nih.gov；Altschul等(1990)J Mol Biol 215：403-410)中鉴定出的7个孤立序列的总结，包括孤立序列、最低E值、P450数据库中的匹配基因ID、CYP450家族和读序数目。E值(预期值)以给定得分描述了预期随机发生的匹配数目。一般情况下，E值越小，匹配显著的可能性越大。
[0520]
[0521] 来自该家族的转录物在EST数据库中最丰富并且群聚成四个不同的组。组1由3个孤立序列(表4中的1至3号)代表，其具有总共2,143个读序，包括1,107个唯一序列，这1,107个唯一序列产生具有1917个碱基对(bp)的最终组装序列，其中开放阅读框(ORF)为1530bp。组2由2个孤立序列(表4中的4至5号)代表，其具有228个读序，其中有140个唯一读序，这140个唯一读序产生1776bp的组装序列和1530bp的ORF。组3(表7中的6号)由11个读序代表，这11个读序产生1200bp的部分序列。组4(表7中的7号)是277bp的单要素序列(singleton)，其沿该序列具有数个终止密码子。
[0522] 实施例3
[0523] 分离编码细胞色素P450的cDNA
[0524] 选择实施例2中鉴定的CYP76家族的组1和组2 cDNA分子(上表中的1至5号)用于进行cDNA分离。
[0525] A.克隆CYP76家族成员
[0526] 通过聚合酶链式反应(PCR)使用根据组1和组2的ORF设计的基因特异性引物(下文的表5中所示)并使用Phusion热启动II DNA聚合酶(Thermo Scientific)来扩增按照实施例1中所述制备的檀香cDNA(SEQ ID NO：1中所示)的全长cDNA分子。PCR条件如下：
[0527] 98℃3分钟；
[0528] 2个循环：98℃10秒，Tm-2℃20秒，72℃30秒；
[0529] 30个循环：98℃10秒，Tm 20秒，72℃30秒；
[0530] 最后延伸：72℃7分钟。
[0531] 其中孤立序列组1的Tm为55℃，而孤立序列组(isogroup)2的Tm为52℃。将PCR产物凝胶纯化并根据生产商的使用说明克隆到pJET1.2载体中(Fermentas，SEQ ID NO：21)。使用大肠杆菌α-Select化学感受态细胞(Bioline)来进行克隆和质粒增殖。通过DNA测序来验证所有的构建体。
[0532]
[0533] 用针对孤立序列组1的引物进行扩增得到单一的唯一cDNA克隆，将其命名为SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)。用针对孤立序列组2的引物进行扩增得到3个不同的cDNA克隆，将其命名为SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)、SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)和SaCYP76F38v2(SaCYP76-G12)。用来自孤立序列组2的引物进行第二次扩增得到6个另外的不同cDNA克隆，将其命名为SaCYP76F37v2(SaCYP76-G14)、SaCYP76F39v2(SaCYP76-G15)、SaCYP76F40(SaCYP76-G16)、SaCYP76F41(SaCYP76-G17)、SaCYP76F42(SaCYP76-G13) 和SaCYP76F43(SaCYP76-G18)。这些核酸序列的SEQ ID NO以及所编码的氨基酸示于下文的表6中。这10个分离的cDNA分子编码的翻译氨基酸序列共有93％至99％的同一性(参见下文的表7)和1.0％至6.6％的差异性。用ClustalW得到匹配距离(慢/精确，Gonnet权重矩阵)(ebi.ac.uk/clustalw；European Bioinformatics Institute)。
[0534]
[0535]
[0536]
[0537] 实施例4
[0538] SaCYP76蛋白质的序列和系统发生分析
[0539] 针对GenBank非冗余蛋白质数据库对推导的氨基酸序列进行BLASTx检索(blast.ncbi.nlm.nih.gov；Altschul等(1990)J Mol Biol 215：403-410)鉴定出来自葡萄(Vitis vinifera)的推定细胞色素P450(GenBank登记号XP_002281735；SEQ ID NO：26)，其与檀香CYP和来自长春花(Catharanthus roseus)的CYP76B6牻牛儿醇羟化酶(GenBank登记号CAC80883；Collu等(2001)FEBS Lett 308：215-220；SEQ ID NO：27)具有62％至64％的序列同一性，而CYP76B6牻牛儿醇羟化酶与檀香CYP具有54％至55％的序列同一性。用ClustalW进行全长蛋白质序列的蛋白质比对(ebi.ac.uk/clustalw；European Bioinformatics Institute)。
[0540] 用MEGA版本4采用邻接(neighbor-joining，NJ)方法在默认参数下构建系统发生树(Centre for Evolutionary Medicine and Informatics；Tamura等，2007 Mol Biol Evol 24：1596-1599)。50％以上的自举(bootstrap)(500次复制)置信值展示在分支点处。初始的四个檀香CYP克隆SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)、SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)、SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)SaCYP76F38v2(SaCYP76-G12)和其他物种中用于萜类化合物代谢的细胞色素P450之预测蛋白质序列的邻接系统发生示于图4中。SaCYP76基因在该系统发生中形成一个单独的集群，并且与CYP76B集群最紧密相关，而CYP76B集群包括来自不同物种的牻牛儿醇/橙花醇羟化酶。除本文中提供的檀香CYP76 P450克隆SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)。SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)、SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)SaCYP76F38v2(SaCYP76-G12)之外，图4的系统发生中包括的氨基酸序列登记号还包 括：菊 芋 (Helianthus tuberosus)CYP76B1(CAA71178；SEQ ID NO：28)；长 春 花CYP76B6(CAC80883；SEQ ID NO：27)；川西獐牙菜(Swertia mussotii)CYP76B6(ACZ48680；
SEQ ID NO：29)；鳄梨(Persea Americana)CYP71A1(P24465；SEQ ID NO：30)；胡椒薄荷(Mentha x piperita)CYP71A32(Q947B7；SEQ ID NO：31)；黄 花蒿 (Artemisia annua)CYP71AV1(ABB82944；SEQ ID NO：32)；菊苣(Cichorium intybus)CYP71AV8(ADM86719；SEQ ID NO：33)；莴苣(Lactuca sativa)CYP71BL1(AEI59780；SEQ ID NO：34)；烟草(Nicotiana tabacum)CYP71D20(Q94FM7；SEQ ID NO：35)；胡椒薄荷CYP71D13(Q9XHE7；SEQ ID NO：36)；
留兰香(Mentha spicata)CYP71D18(Q6WKZ1；SEQ ID NO：37)；长春花CYP72A1(Q05047；SEQ ID NO：38)；以及稻(Oryza sativa)CYP76M7(AK105913；SEQ ID NO：39)。
[0541] 用全部10种檀香CYP76F蛋白质和CYP71集群(clan)中的相关萜修饰细胞色素P450成员构建第二邻接系统发生树，并使用北美云杉(Picea sitchensis)
PsCYP720B4(ADR78276；SEQ ID NO：79)作为外群。该系统发生树示于图10中。檀香CYP76F蛋白分成两个独立的进化枝，并且与其他物种的CYP76B集群最接近。进化枝I檀香烯/香柠檬烯氧化酶包括SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)、SaCYP76F39v2(SaCYP76-G15)、SaCYP76F40(SaCYP76-G16)、SaCYP76F41(SaCYP76-G17)和SaCYP76F42(SaCYP76-G13)。进化枝II香柠檬烯氧化酶包括SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)、SaCYP76F37v2(SaCYP76-G14)、SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)和SaCYP76F38v2(SaCYP76-G12)。除檀香CYP76P450克隆之外，图10的系统发生树中包括的其他萜修饰CYP的氨基酸序列登记号包括CaCYP76B4喜树(Camptotheca acuminate)推定牻牛儿醇-10-羟化酶(AES93118；SEQ ID NO：80)；
CrCYP76B6长春花牻牛儿醇10-羟化酶(Q8VWZ7；SEQ ID NO：81)；SmCYP76B4川西獐牙菜牻牛儿醇10-羟化酶(D1MI46；SEQ ID NO：82)；OsCYP76M7稻内咖萨二烯(ent-cassadiene)C11a-羟化酶(NP_001047185；SEQ ID NO：83)；MpCYP71A32胡椒薄荷薄荷呋喃合酶(Q947B7；SEQ ID NO：84)；PaCYP71A1鳄梨(P24465；SEQ ID NO：85)；CiCYP71AV8菊苣朱栾倍半萜氧化酶(valencene oxidase)(ADM86719；SEQ ID NO：86)；MpCYP71D13姜薄荷(Mentha x gracilis)(-)-柠檬烯-3-羟化酶(AY281027；SEQ ID NO：87)；NtCYP71D20烟草5-表-马兜铃烯(aristocholene)-1，3-二羟化酶(AF368376；SEQ ID NO：88)；和GaCYP706B1树棉(Gossypium arboretum)(+)-δ-杜松烯-8-羟化酶(AAK60517；SEQ ID NO：89)。
[0542] 实施例5
[0543] 细胞色素P450还原酶
[0544] 通过将组装序列与来自拟南芥的一组已知植物细胞色素P450还原酶(CAB58575.1(SEQ ID NO：58)和CAB58576.1(SEQ ID NO：46))进行比较来鉴定细胞色素P450还原酶编码基因。通过聚合酶链式反应(PCR)使用根据细胞色素P450还原酶的ORF设计的基因特异性引物(表8中所示)并使用Phusion热启动II DNA聚合酶(Thermo
Scientific)来扩增按照实施例1中所述制备的檀香cDNA的基因SaCPR1和SaCPR2的全长cDNA。
[0545]
[0546] PCR条件如下：
[0547] 98℃ 3分钟；
[0548] 2个循环：98℃ 10秒，Tm-2℃ 20秒，72℃ 30秒；
[0549] 30个循环：98℃ 10秒，Tm 20秒，72℃ 30秒；
[0550] 最后延伸：72℃ 7分钟。
[0551] 将PCR产物凝胶纯化并直接克隆到pET28b(+)载体(SEQ ID NO：51)中，或者首先克隆到pJET载体中，然后再亚克隆到表达载体中。使用大肠杆菌α-Select化学感受态细胞(Bioline)来进行克隆和质粒增殖。通过DNA测序来验证所有的构建体。PCR扩增产生两个檀香细胞色P450还原酶(CPR)克隆，将其命名为CPR1和CPR2，它们分别具有SEQ ID NO：10和11中所示的核酸序列，并编码SEQ ID NO：12和13中所示的蛋白质。这两个CPR核酸序列共有70％的序列同一性，而这两个CPR蛋白质共有82％的序列同一性。
[0552] 然后，使用基于网页的BlastX程序(Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)来将鉴定的序列与GenBank数据库中的序列进行比较。这些CPR序列与葡萄预测的细胞色素P450还原酶样蛋白质(Genbank登记号XP_002270732；SEQ ID NO：42)共有
79％的序列同源性，与陆地棉(Gossypium hirsutum)细胞色素P450还原酶(Genbank登记号ACN54324；SEQ ID NO：43)共有78％的序列同源性并与黄花蒿细胞色素P450还原酶(Genbank登记号ABI98819；SEQ ID NO：44)共有75％的序列同源性。
[0553] 产生以下截短的CPR，其包含SEQ ID NO：12的第44至692位氨基酸(SEQ ID NO：14中所示的截短蛋白质序列；SEQ ID NO：63中所示的核酸序列)和SEQ ID NO：13的第61至704位氨基酸(SEQ ID NO：15中所示的截短蛋白质序列；SEQ ID NO：64中所示的核酸序列)。
[0554] 使用细胞色素C还原酶(NADPH)测定试剂盒(Sigma)来测定重组SaCPR的活性。
[0555] 实施例6
[0556] 气相色谱-质谱分析
[0557] 使用气相色谱-质谱(GC-MS)分析来对檀香细胞色素P450的氧化产物和檀香油进行分析。
[0558] A.SGE Solgel-Wax毛细管柱
[0559] 在包含SGE Solgel-Wax毛细管柱(30m x 0.25mm ID x 0.25μm厚度)的Agilent6890A/5973N GC-MS系统上以SIM-扫描模式(扫描：m/z 40-400；SIM：m/z 93、94、119、
136、122、202和204[停留时间50]进行GC-MS分析。在250℃下，在1mL/分钟的氦气柱流和50psi脉冲压力下以脉冲不分流模式在0.5分钟内进样2μL体积样品，程序如下：40℃2分钟，以8℃/分钟上升至100℃，以15℃/分钟上升至250℃，保持5分钟。
[0560] 或者，还使用以下程序来分析檀香SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)和檀香油的产物：在250℃下，在0.8mL/分钟的氦气柱流和10psi脉冲压力下以脉冲不分流模式在0.05分钟内进样2μL体积样品，程序如下：40℃3分钟，以10℃/分钟上升至100℃，以2℃/分钟上升至250℃，保持10分钟。
[0561] 产物鉴定以MS片段化模式与NIST和Wiley库(Wiley 第9版/NIST2011；Fred W.McLafferty，John Wiley&Sons，Inc.)中条目的最佳匹配为基础，并通过与正宗檀香油中的化合物和Kovats指数值进行比较。
[0562] B.HP5和DB-Wax熔融二氧化硅柱
[0563] 在Agilent 7890A/5975C GC-MS系统上以电子离子化选择离子监测(SIM)扫描模式操作来进行GC-MS分析。用HP5(非极性；30m x 0.25mm ID x 0.25μm厚度)和DB-Wax熔融二氧化硅柱(极性；30m x 0.25mm ID x 0.25μm厚度)分析样品。在两种情况下，进样器均以脉冲无分流模式进行操作，同时使进样器温度维持在250℃。使用流量为0.8mL/分钟的氦气作为载气，并将脉冲压力设置为25psi，持续0.5分钟。扫描范围：m/z40-500；SIM：m/z93、94、105、107、119、122和202[停留时间50毫秒]。
[0564] 用于HP5柱的炉程序是：
[0565] 40℃3分钟，以10℃/分钟上升至130℃，以2℃/分钟上升至180℃，以50℃/分钟上升至300℃，保持300℃10分钟。
[0566] 用于DB-wax柱的炉程序是：
[0567] 40℃3分钟，以10℃/分钟上升至130℃，以2℃/分钟上升至200℃，以50℃/分钟上升至250℃，保持250℃15分钟。
[0568] 使用Chemstation软件来进行数据获取和处理。如下鉴定化合物：比较正宗样品的质谱和NIST/EPA/NIH质谱库v2.0，并比较Valder等(2003)J Essent Oil Res 15：178-186和Sciarrone等(2011)J Chromatogr A1218：5374中出现的那些的保留指数。
[0569] 实施例7
[0570] 在细菌和酵母中的表达
[0571] 将檀香FPP合酶、檀香烯合酶、细胞色素P450SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)和细胞色素P450还原酶基因克隆到pCDF-Duet(Novagen)和pACYC-Duet(Novagen)细菌表达载体中。将编码全长檀香细胞色素CYP76F P450、细胞色素P450还原酶、檀香烯合酶和法尼二磷酸合酶的基因克隆到多种酵母表达载体中，以允许在酿酒酵母的酵母菌株BY4741(MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0；ATCC#201388)中进行表达。
[0572] A.细菌表达载体
[0573] 将编码先前从檀香中表征的FPP合酶(SEQ ID NO：18)和檀香烯合酶(SEQ ID NO：16)的基因(参见，国际PCT申请No.WO2011000026和Jones等(2011)
J Biol Chem 286：17445-17454)克隆到细菌表达载体pCDF-Duet(Novagen，SEQ ID NO：65)中，并产生pCDF-Duet：SaFPPS：SaSSy。将 编码SaCPR的基 因(SEQ ID NO：
11)和 SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)基 因(SEQ ID NO：2)克 隆 到 细 菌 表 达 载 体pACYC-Duet(Novagen，SEQ ID NO：45)中，并产生pACYC-Duet：SaCPR：SaCYP76F38v1。这些表达载体均是双元表达载体，其允许两个靶基因通过两个多克隆位点共表达。
[0574] pCDF-Duet：SaFPPS：SaSSy具有链霉素选择性标记，将其转化到化学感受态C41(DE3)大肠杆菌细胞(Avidis)中。将这些细胞培养，并使用氯化钙使其再次呈化学感受态，之后用具有氯霉素选择性标记的pACYC-Duet：SaCPR：SaCYP76F38v1转化。这两种抗生素均用于选择包含两个双元载体的菌落。将这些菌落在16℃下在丰富培养基(极品肉汤)中培养过夜，并通过添加IPTG来起始蛋白质表达。向细胞色素P450蛋白质表达补充5-氨基-乙酰丙酸有助于合成卟啉，这可通过细胞沉淀变红来证明。
[0575] B.产生酵母表达载体
[0576] 1.檀香细胞色素P450
[0577] 按照Hamann和Moller(2007)Protein Expr Purif 56：121-127的尿嘧啶-切割(USER)克隆技术，将上文表6中鉴定的檀香CYP76F全长cDNA亚克隆到酵母表达载体pYeDP60(Cullin 和 Pompon(1988)Gene 65：203-217；Pompon 等 (1996)Methods Enzymol272：51-64；Abecassis等(2003)Methods Mol Biol 231：165-173)中。pYeDP60载体含有URA标记。得到的构建体示于下文的表9中。
[0578] 2.檀香的檀香烯合酶和法尼二磷酸合酶
[0579] 将编码檀香烯合酶的cDNA(SaSSY，SEQ ID NO：16)和编码法尼二磷酸合酶的cDNA(SaFPPS，SEQ ID NO：18)通过in-Fusion克隆(Clontech)按照生厂商的使用说明分别克隆到半乳糖诱导型表达载体pESC-LEU(Stratagene，SEQ ID NO：47)或pESC-LEU2d(参见，Ro等(2008)BMC Biotechnology 8：83)的NotI-Bgl II和BamHI-XhoI位点中。另外，产生只包含SaSSy基因(SEQ ID NO：16)的载体。pESC-LEU和pESC-LEU2d载体包含LEU标记，并且pESC-LEU2d载体是一种在Leu2启动子中包含缺失的高拷贝数载体。得到的构建体示于下文的表9中。
[0580] 3.细胞色素P450还原酶
[0581] 将实施例3中鉴定的编码细胞色素P450还原酶的cDNA(SaCPR，SEQ ID NO：11)通过in-Fusion克隆(Clontech)按照生厂商的使用说明克隆到pESC-HIS载体(Stratagene，SEQ ID NO：49)的EcoRi-NotI位点中。得到的构建体示于下文的表9中。
[0582]
[0583] C.酵母转化和表达
[0584] 用LiCl方法将所有的构建体转化到酿酒酵母的酵母菌株BY4741(MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0；ATCC#201388)中，如Gietz等(1992)Nucleic Acids Res 20：1425中所述。在含有合适的合成漏失选择性培养基的平板上对转化的酵母进行选择并将其在30℃下培养48小时。
[0585] 1.檀香烯合酶的表达
[0586] 使用编码檀香的檀香烯合酶的构建体来评价檀香烯和香柠檬烯的产生。与表达pESC-LEU：SaSSY构建体的酵母细胞相比，表达高拷贝数构建体pESC-LEU2d：SaSSY的酵母细胞产生约两倍量的檀香烯和香柠檬烯，如通过GC-MS所确定的(如实施例6A中所述)。在存在或不存在法尼二磷酸合酶的情况下，在表达檀香烯合酶的细胞间均未观察到差异，表明檀香的檀香烯合酶可利用通过酵母酶产生的FPP来产生檀香烯和香柠檬烯。将高拷贝数构建体pESC-LEU2d：SaSSY用于进一步的实验。
[0587] 2.檀香烯合酶和细胞色素P450还原酶的表达
[0588] 将编码檀香烯合酶的pESC-LEU2d：SaSSY构建体和编码檀香细胞色素P450还原酶(SaCPR)的pESC-His：SaCPR构建体共转化到酵母菌株BY4741中。包括SaCPR目的是将NADPH的电子提供给CYP450。
[0589] 实施例8
[0590] 微粒体制备
[0591] 制备微粒体以纯化用于进行体外测定的檀香细胞色素P450酶。微粒体包含含有细胞色素P450的碎片化内质网(ER)。因此，对微粒体进行纯化产生浓缩且分离的细胞色素P450。根据Guengerich等(2009)Nat Protoc 4：1245-1251测量由檀香CYP76F P450编码的重组P450的CO谱。
[0592] 根据Pompom等(1996)Methods Enzymol 2(71)：51-64由250mL酵母培养物制备微粒体膜。简言之，用5mL过夜培养物接种50mL起始OD600为0.2的SD选择性培养基，并将其在30℃、170rpm下培养24小时。用50mL培养物接种200mL体积的YPDE培养基(1％酵母提取物，2％细菌蛋白胨，5％乙醇，2％葡萄糖)并将其在30℃、170rpm下孵育24小时。通过在1,000x g下离心10分钟收集细胞，并在30℃、170rpm下用250mL YP培养基中的
2％半乳糖诱导12至16小时。对于微粒体分离，将酵母细胞通过在2,000x g下离心10分钟沉淀、用5mL TEK(50mM Tris-HCl pH 7.5、1mM EDTA、100mM KCl)洗涤一次，并重悬于TES2缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.5、1mM EDTA、600mM山梨醇、5mM DTT和0.25mM PMSF)中。所有的后续步骤均在4℃下进行。将酵母细胞壁通过机械方式用经酸洗涤的玻璃珠(425-600μm，Sigma)并人工剧烈振荡3x 30秒破坏。将细胞匀浆在10,000x g下离心15分钟，之后将上清液在100,000x g下超速离心1小时以收集膜。将微粒体重悬于包含50mM Tris-HCl缓冲液pH 7.5、1mM EDTA和30％(v/v)甘油的缓冲液中，并均质化，之后将其直接用于进行酶测定或储存在-80℃。
[0593] 除SaCYP76F43(SaCYP76-G18)之外，所有10种檀香CYP76F的微粒体制备物均显示出特征性的P450CO差异光谱(参见图18)。微粒体制备物中的P450含量为0.2μM至1.6μM。按照下文的实施例11中所述针对P450活性筛选微粒体制备物。
[0594] 实施例9
[0595] 产生和分离倍半萜烯烃
[0596] 倍半萜烯烃α-檀香烯、β-檀香烯、表-β-檀香烯和α-反式-香柠檬烯不是市售的，但是可通过在酵母中表达檀香的檀香烯合酶(SaSSY；SEQ ID NO：16)产生，如Jones等(2011)JBiol Chem 286：17445-17454中所述。
[0597] 工业规模发酵中产生包含α-檀香烯、β-檀香烯、表-β-檀香烯和α-反式-香柠檬烯的倍半萜油。使用硝酸银浸渍的TLC板根据Daramwar等(Analyst 137：4564-4570(2012))分离该混合物。从TLC板上刮下级分并用戊烷洗脱倍半萜，之后通过GC-MS分析纯度。针对该包含α-檀香烯、β-檀香烯、表-β-檀香烯和α-反式-香柠檬烯(图19A)的油的提取的离子色谱图示于图19A至19D，α-檀香烯(峰1，图19B)，α-反式-香柠檬烯(峰2，图19C)，以及表-β-檀香烯和β-檀香烯(峰3和峰4，图19D)。将分离的倍半萜用于下文实施例11中的体外测定中。
[0598] 实施例10
[0599] 檀香细胞色素P450活性在酿酒酵母中的功能表征
[0600] 使用实施例7.C.2中所述的包含活性檀香烯合酶和细胞色素P450还原酶的酿酒酵母宿主菌株来表达上文实施例2中鉴定的檀香细胞色素CYP76F P450。通过测量体内形成的氧化产物来评价活性，如下文的部分A中所述。将pYeDP60载体中的每种檀香CYP76F单独转化到表达檀香烯合酶和CPR的酵母宿主细胞中。产生包含空pYeDP60载体的对照菌株。
[0601] A.酵母中的体内P450测定
[0602] 对于体内测定，将酵母在30℃下在5mL的2％葡萄糖和基本选择性培养基(minimal selective medium)中培养。次日，将50mL培养物以0.2的起始OD600开始并在
30℃下在170rpm的振荡下培养，直至培养物达到0.6至0.8的OD600。通过转移到含有2％半乳糖的基本选择性培养基来起始蛋白质表达，并培养约14至16小时。将酵母细胞通过在
1,000x g下离心10分钟收集并用5mL无菌ddH2O洗涤一次。通过使用约250μL经酸洗涤的玻璃珠(425-600μm，Sigma))并涡旋1分钟来将细胞用2mL乙烷∶乙酸乙酯(85∶15)萃取两次。将合并的萃取液转移至包含无水Na2SO4的干净测试管并在温和的N2气流下蒸发至约200μL。将样品转移至GC玻璃小瓶以用于进行GC-MS分析(如实施例6中所述)或储存在-80℃。
[0603] B.进化枝I檀香P450
[0604] 按照实施例 6A 或 6B 中所述，用 GC-MS 分析确定进化枝 I 檀香 P450SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)、SaCYP76F39v2(SaCYP76-G15)、
SaCYP76F40(SaCYP76-G16)、SaCYP76F41(aCYP76-G17)和SaCYP76F42(SCYP76-G13)的体内活性。
[0605] 1.按照实施例6A中所述，对SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)进行GC-MS分析
[0606] 共表达檀香烯合酶和SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)导致检测到11个产物峰，并被鉴定为α-、β-和表-β-檀香醇以及α-反式-香柠檬醇(参见图8A至8B和下文的表11)。11种产物中有9种在檀香油中也被检测到，只不过比例有所不同，如图8A和8B中所示。以MS片段化模式与NIST和Wiley库(Wiley 第9版/NIST 2011；Fred W.McLafferty，John Wiley&Sons，Inc)中条目的匹配为基础并与正宗檀香油中的化合物和Kovats指数值进行比较来鉴定产物(参见图8A和表11)。檀香油的主要成分是α-檀香醇、Z-α-反式-香柠檬醇、E-顺式，表-β-檀香醇和反式-β-檀香醇，而来自SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)的主要产物是顺式-α-檀香醇、α-檀香醇和反式-β-檀香醇。这些差异可能归因于不同的生理条件(例如pH)，SaSSy和SaP450酶在酵母细胞和檀香树中在不同的生理条件下具有活性，或者它们可归因于产物比例随时间发生变化。在酵母中，所监测产物形成并累积数小时的时间，而从檀香树中提取的油则可能是数年累积的产物。还观察到法尼醇(标记为#)和十二烷酸(标记为＊)(参见图8B和8C)，法尼醇由酵母独立于檀香烯合酶的表达产生，而十二烷酸提取自酵母。
[0607]
[0608]
[0609] ＊十二烷酸，提取自酵母；#法尼醇，酵母中的产物。
[0610] 1在SGE Solgel-Wax柱上测量的线性保留指数(LRI)。
[0611] 2.按照实施例6B中所述对SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)进行GC-MS分析
[0612] 共表达檀香烯合酶和SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)导致检测到八种产物，这八种产物被鉴定为(Z)-和(E)-α-檀香醇(峰5和峰7)、(Z)-和(E)-β-檀香醇(峰6和峰8)、(Z)-和(E)-表-β-檀香醇(峰9和峰11)以及(Z)-和(E)-α-反式-香柠檬醇(峰
10和峰12)(参见图11A)。下文的表12示出了用于DBwax柱和HP5柱的峰编号、化合物和线性保留指数。产物鉴定以MS片段化模式与NIST和Wiley库(Wiley 第9
版/NIST 2011；Fred W.McLafferty，John Wiley&Sons，Inc)中条目的最佳匹配为基础并通过与正宗檀香油中的化合物和Kovats指数值进行比较。如图中所示，针对(Z)-α-反式-香柠檬醇的产物峰与对应于(E，E)-法尼醇的峰重叠，(E，E)-法尼醇在酵母中独立于SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)而产生(参见图11B)。
[0613] 对未被鉴定的化合物(在图11A中用井号标签(#)标识)而言，所产生的一部分倍半萜烯醇是经修饰的。当将未转化的酵母细胞与正宗檀香油孵育时，鉴定到相同的未知化合物，这表明这些未被鉴定的化合物不是SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)的直接产物，而是由酵母转化檀香木倍半萜烯醇的内源活性产生(参见图12A至12B)。
[0614]
[0615] 1在DBwax柱上测量的线性保留指数(LRI)
[0616] 2在HP5柱上测量的线性保留指数(LRI)
[0617] 3.SaCYP76F39v2(SaCYP76-G15)、SaCYP76F40(SaCYP76-G16)、SaCYP76F41(SaCYP76-G17)和SaCYP76F42(SaCYP76-G13)
[0618] 使用上述体内测定通过实施例6B 中所述的 GC-MS分析确定SaCYP76F39v2(SaCYP76-G15)、SaCYP76F40(SaCYP76-G16)、SaCYP76F41(SaCYP76-G17) 和SaCYP76F42(SaCYP76-G13)氧化倍半萜的能力。相对于针对SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)所 观 察 到 的 那 些，共 表 达 檀 香 烯 合 酶 和 SaCYP76F39v2(SaCYP76-G15)、SaCYP76F40(SaCYP76-G16)、SaCYP76F41(SaCYP76-G17)或SaCYP76F42(SaCYP76-G13)得到比例几乎相同的产物分布(参见表12和图13A至13D)。
[0619] C.进化枝II檀香P450
[0620] 按照实施例6A 或6B 中所述，通过GC-MS 分析确定进化枝II 檀香 P450SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)、SaCYP76F38v2(SaCYP76-G12)、
SaCYP76F37v2(SaCYP76-G14)和SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)的体内活性。
[0621] 1. 按 照 实 施 例 6A 中 所 述， 对 SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)、SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)和SaCYP76F38v2(SaCYP76-G12)进行GC-MS分析
[0622] 在重组酵母系统中共表达檀香烯合酶与SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)、SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)或SaCYP76F38v2(SaCYP76-G12)产生几乎相同的产物(参见图6A、6B和6C以及下文的表13)。以MS片段化模式与NIST和Wiley库(Wiley
第9版/NIST 2011；Fred W.McLafferty，John Wiley&Sons，Inc)中条目的匹配为基础并通过与正宗檀香油中的化合物进行比较来鉴定产物(参见图7和表13)。针对
SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)、SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)和SaCYP76F38v2(SaCYP76-G12)观察到的峰1和峰7对应于α-反式香柠檬醇，可能表示不同的异构体。对檀香油也观察到峰1和峰7(参见图7和表13)。保留时间为约18分钟的第三个峰(标记为#)被鉴定为法尼醇，其由酵母独立于檀香烯合酶和SaCYP76的表达产生，如其在包含空载体的对照细胞中的表达中所观察到的一样(图6D)。
[0623]
[0624] #法尼醇，酵母中的产物。
[0625] 1在SGE Solgel-Wax柱上测量的线性保留指数(LRI)
[0626] 2.SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)、SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11) 或SaCYP76F38v2(SaCYP76-G12)或SaCYP76F37v2(SaCYP76-G14)
[0627] 利用上述体内测定通过实施例6B 中所述的 GC-MS分析确定SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)、aCYP76F37v1(SaCYP76-G11)或SaCYP76F38v2(SaCYP76-G12)或SaCYP76F37v2(SaCYP76-G14)氧化倍半萜的能力。在重组酵母系统中共表
达 檀 香 烯 合 酶 与 SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)、aCYP76F37v1(SaCYP76-G11) 或SaCYP76F38v2(SaCYP76-G12)或SaCYP76F37v2(SaCYP76-G14)产生大部分的E-α-反式-香柠檬烯(表12中的峰8)与仅痕量的(E)-α-檀香醇和(E)-β-檀香醇(表12中
的峰7和峰12)(参见表12和图14A至14D)。
[0628] D.SaCYP76F43(SaCYP76-G18)
[0629] 利用上述体内测定通过实施例6B 中所述的GC-MS 分析确定SaCYP76F43(SaCYP76-G18) 氧 化 倍 半 萜 的 能 力。 在 将 檀 香 烯 合 酶 与SaCYP76F43(SaCYP76-G18)共表达后，没有观察到活性(参见表14E)。
[0630] E.SaCPR1和SaCPR2
[0631] 为了测试在蛋白质水平具有70％同一性的SaCPR1和SaCPR2是否可引起产物谱的改变，按照实施例6B中所述，用代表性I类和II类SaCYP76Fs SaCYP76F39v1和SaCYP76F38v1测试这两种CPR。与上文的部分B.2.和C.2.中所述那些相比，在产物和相对丰度方面没有观察到差异。
[0632] 实施例11
[0633] 体外酶测定
[0634] 如下测定实施例8中产生之包含檀香细胞色素P450和细胞色素P450还原酶的酵母微粒体氧化檀香烯和香柠檬烯的能力：A)使用与SaSSy和FPP的体外反应产物偶联的酶测定；B)使用檀香烯和香柠檬烯的分离的混合物作为底物；或C)使用单独的檀香烯或香柠檬烯作为底物。
[0635] A.使用偶联酶测定的檀香烯和香柠檬烯的氧化
[0636] 在450μL体积的TPS缓冲液(25mM HEPES pH 7.5、5mM MgCl2、1mM DTT)中，用50μg经His6-标签纯化的SaSSy和70μM法尼焦磷酸(FPP)起始与细菌中表达的檀香的檀香烯合酶(SaSSy)的偶联酶测定(Jones等(2011)J Biol Chem 286：17445-17454)。将测定在30℃下孵育30分钟，之后添加50μL包含檀香细胞色素P450和细胞色素P450还原酶以及0.8mM NADPH的微粒体制备物。再将反应在30℃下孵育1小时并通过用500μL己烷/乙酸乙酯(85∶15)萃取来终止。将有机层在温和的N2气流下浓缩至约100μL并通过GC-MS分析进行分析(如上文的6A中所述)或储存在-80℃。
[0637] 1.SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)
[0638] 用SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)在体外进行偶联酶测定，并与体内结果进行比较以验证该测定的实用性。对来自该偶联测定之反应产物的GC-MS分析显示出在实施例8的体内测定中鉴定到的相同的两个峰。在这两种测定中，SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)均催化香柠檬烯被羟基化成Z-α-反式-香柠檬醇但不催化任何檀香烯的氧化。
[0639] B.檀香烯和香柠檬烯的混合物的氧化
[0640] 使用檀香烯和香柠檬烯的混合物作为底物来测定檀香P450的倍半萜氧化酶活性。
[0641] 1.测定
[0642] 使用两种不同的体外测定针对倍半萜氧化酶活性来筛选檀香CYP76F。
[0643] a.体外测定1
[0644] 在包含以下的400μL反应体积中进行测定：150μL磷酸钾缓冲液100mM(pH7.5)、20μL20mM NADPH、1μL25mM檀香烯/香柠檬烯混合物[包含α-檀香烯、表-β-檀香烯、β-檀香烯、α-香柠檬烯]和80pmol微粒体制备物(按照实施例8中所述制备)。
将反应在30℃下孵育1小时，之后通过添加500μL己烷/乙酸乙酯(85∶15)并随后涡旋30秒来终止。将有机层在温和的N2气流下浓缩至约100μL并通过GC-MS分析进行分析(如上文的实施例6A中所述)或储存在-80℃。
[0645] b.体外测定2
[0646] 在包含50mM磷酸钾pH 7.5、0.8mM NADPH和40μM底物的400μL反应体积中进行测定。将酶反应通过添加50μL微粒体制备物(实施例8中制备的)起始，在30℃下孵育2小时同时进行振荡，之后通过添加500μL己烷终止。将有机层转移至新的GC小瓶并在温和的N2气流下浓缩至约100μL，之后通过GC-MS分析进行分析(如上文的实施例6B中所述)。
[0647] 2.进化枝I檀香P450
[0648] 利用上述测定并使用檀香烯和香柠檬烯的混合物作为底物来测定包含进 化 枝 I 檀 香 P450 SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)、SaCYP76F39v2(SaCYP76-G15)、SaCYP76F40(SaCYP76-G16)、SaCYP76F41(SaCYP76-G17)和SaCYP76F42(SaCYP76-G13)的微粒体的倍半萜氧化活性。
[0649] a.SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)
[0650] 使用上文所述的两种测定来评价进化枝 I 檀香 P450SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)的体外倍半萜氧化酶活性。
[0651] i.使用体外测定1的初始实验
[0652] 使用上文部分B.1.a.中所述的测定来测定包含SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)的微粒体的活性。GC-MS分析揭示了八个不同的产物峰，经鉴定，它们为檀香醇(参见图9B，这些峰对应于上文表11中的那些)。产物鉴定以MS片段化模式与NIST和Wiley库(Wiley 第9版/NIST 2011；Fred W.McLafferty，John Wiley&Sons，Inc)中
条目的最佳匹配为基础并通过与正宗檀香油中的化合物(图9A)和Kovats指数值进行比较。
[0653] ii.使用体外测定2的测定
[0654] 使用上文部分B.1.b.中所述的测定来测定包含SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)的微粒体的活性。对反应产物进行GC-MS分析揭示：SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)催化α-檀香烯、β-檀香烯、表-β-檀香烯和α-反式-香柠檬烯的羟基化，并导致8种不同的化合物，经鉴定，它们为(Z)-和(E)-α-檀香醇、(Z)-和(E)-β-檀香醇、(Z)-和(E)-表-β-檀香醇以及(Z)-和(E)-α-反式-香柠檬醇(参见图15A和表12)。将产物谱与正宗檀香油样品进行比较(参见表12和图15B)，针对所有的8种化合物其表现出相同的保留时间和质谱，但以不同的比例。SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)产生的(E)-α-檀香醇和(Z)-α-檀香醇的比例为约5∶1，而产生的(E)-β-檀香醇和(Z)-β-檀香醇的比例为约4∶1。用SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)形成的主要产物是(E)-α-檀香醇和(E)-β-檀香醇，而檀香油中的主要化合物是(Z)-α-檀香醇和(Z)-β-檀香醇。在不存在NADPH或使用来自携带空载体之酵母的微粒体的情况下，无产物形成(参见图15C)。
[0655] b.SaCYP76F39v2(SaCYP76-G15)、SaCYP76F40(SaCYP76-G16)、SaCYP76F41(SaCYP76-G17)和SaCYP76F42(SaCYP76-G13)
[0656] 使用上文部分B.1.b.中所述的测定来测定包含SaCYP76F39v2(SaCYP76-G15)、SaCYP76F40(SaCYP76-G16)、SaCYP76F41(SaCYP76-G17)和SaCYP76F42(SaCYP76-G13)的微粒体的活性。对反应产物进行GC-MS分析揭示：相对于针对SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)所 观 察 到 的 那 些，SaCYP76F39v2(SaCYP76-G15)、SaCYP76F40(SaCYP76-G16)、SaCYP76F41(SaCYP76-G17)和SaCYP76F42(SaCYP76-G13)产生类似的产物谱(参见表12和图16A至16D)。对SaCYP76F40(SaCYP76-G16)和SaCYP76F42(SaCYP76-G13)所观察到的主要产物是(E)-α-反式-香柠檬醇(或(E)-α-外-香柠檬醇)和(E)-β-檀香醇。
[0657] 3.进化枝II檀香P450
[0658] 使用上文所述的测定并使用檀香烯和香柠檬烯的混合物作为底物来测定包含 进 化 枝 II檀 香 P450 SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)、SaCYP76F38v2(SaCYP76-G12)、SaCYP76F37v2(SaCYP76-G14)和SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)的微粒体的倍半萜氧化活性。
[0659] a.SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)和SaCYP76F38v2(SaCYP76-G12)
[0660] 使用上文部分B.1.a.中所述的测定来测定包含SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)和SaCYP76F38v2(SaCYP76-G12)的微粒体的活性。对反应产物进行GC-MS分析揭示了一个在对照反应(只包含载体对照的微粒体)中不存在的产物峰。经如下鉴定，该产物峰为Z-α-反式-香柠檬醇：以其MS片段化模式与NIST和Wiley库(Wiley 第9版/NIST 2011；Fred W.McLafferty，John Wiley&Sons，Inc)中条目的最佳匹配为基础并通过与正宗檀香油中的化合物进行比较。
[0661] b.SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)、SaCYP76F38v2(SaCYP76-G12)、SaCYP76F37v2(SaCYP76-G14)和SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)
[0662] 使用上文部分B.1.b.中所述的测定来测定包含SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)、SaCYP76F38v2(SaCYP76-G12)、SaCYP76F37v2(SaCYP76-G14)和SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)的微粒体的活性。对反应产物进行GC-MS分析揭示：SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)、SaCYP76F38v2(SaCYP76-G12)、SaCYP76F37v2(SaCYP76-G14)和SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)产生三种化合物，它们为主要产物(E)-α-反式-香柠檬醇(或(E)-α-外-香柠檬醇)以及次要产物(E)-α-檀香醇和(E)-β-檀香醇(参见表12和图17A至17D)。
[0663] 4.SaCYP76F43(SaCYP76-G18)
[0664] 使用上文部分B.1.b.中所述的测定并使用檀香烯和香柠檬烯的混合物作为底物来测定包含SaCYP76F43(SaCYP76-G18)的微粒体的活性。观察到无活性(参见图17E)，这可能归因于在酵母中的低表达，如通过相应的CO差异光谱所证明的(参见图18)。
[0665] C.单独倍半萜的氧化
[0666] 测定包含候选P450的微粒体制备物氧化单独倍半萜的能力。按照上文的实施例9中所述分离倍半萜。在包含进化枝I P450 SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)或进化枝II P450 SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)的测定中，使用主要包含α-檀香烯、α-反式-香柠檬烯或表-β-檀香烯和β-檀香烯的三个级分作为单独底物。按照上文的部分B.1.b.中所述进行确定并通过与正宗标准物进行比较来鉴定产物(参见表12和图20G)。
[0667] 在α-檀香烯的情况下，SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)的反应产生(Z)-和(E)-α-檀香醇，而SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)仅产生(E)-α-檀香醇(参见图20A相对于图20D)。在α-反式-香柠檬烯的情况下，SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)产生(Z)-和(E)-α-反式-香柠檬醇，而对SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)只观察到(E)-α-反式-香柠檬醇形成(参见图20B相对于图20E)。在使用表-β-檀香烯和β-檀香烯的测定
中，SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)产生四种产物(Z)-和(E)-表-β-檀香醇以及(Z)-和(E)-β-檀香醇，而在SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)测定中只检测到(E)-β-檀香醇(参见图20C相对于图20F)。这些结果证明用檀香烯和香柠檬烯的混合物进行体外测定所观察到的微粒体活性(上文的部分B)。
[0668] 对实施例10和11的结果的总结
[0669] 进化枝I檀香P450檀香烯/香柠檬烯氧化酶
[0670] 进化枝I檀香P450 SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)、SaCYP76F39v2(SaCYP76-G15)、SaCYP76F40(SaCYP76-G16)、SaCYP76F41(SaCYP76-G17) 和 SaCYP76F42(SaCYP76-G13)催化檀香烯和香柠檬烯的氧化并产生α-、β-和表-β-檀香醇和香柠檬醇的(Z)和(E)立体异构体。α-和β-檀香醇的(Z)和(E)立体异构体的P450比例分别为约1∶5和1∶4。因此，将SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)、SaCYP76F39v2(SaCYP76-G15)、SaCYP76F40(SaCYP76-G16)、SaCYP76F41(SaCYP76-G17)和SaCYP76F42(SaCYP76-G13)鉴定为檀香烯/香柠檬烯氧化酶。
[0671] 进化枝II檀香P450香柠檬烯氧化酶
[0672] 进 化 枝 II 檀 香 P450 SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)、SaCYP76F38v2(SaCYP76-G12)、SaCYP76F37v2(SaCYP76-G14)和SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)主要催化香柠檬烯被氧化成香柠檬醇，其中观察到主要产物为(E)-α-反式-香柠檬醇，而次要产物为(E)-α-檀香醇和(E)-β-檀香醇。将SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)、SaCYP76F38v2(SaCYP76-G12)、SaCYP76F37v2(SaCYP76-G14)和SaCYP76F38v1鉴定为香柠檬烯氧化酶。
[0673] 实施例12
[0674] 动力学特性
[0675] 以α-檀香烯或β-檀香烯作为底物，用SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)和SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)进行动力学测定以测试进化枝I和进化枝II SaCYP76F酶的动力学。在包含50mM磷酸钾pH 7.5、0.8mM NADPH和底物浓度为12μM至138μM的α-檀香烯或β-檀香烯的400μL反应体积中进行测定。将酶反应通过添加17pmol SaCYP7639v1或35pmol SaCYP7637v1起始、在30℃下孵育20分钟并通过添加500μL己烷终止。将有机层转移至新的GC小瓶并在温和的N2气流下浓缩至约100μL，之后通过GC-MS分析进行分析(如上文的实施例6B中所述)。使用Hernandez和Ruiz((1998)Bioinformatics.14：
227-228)中描述的工具来评价动力学数据。
[0676] 在α-檀 香 烯 和β- 檀 香烯 的 情 况 下，SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10) 和SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)的表观Km值、kcat值和kcat/Km值示于下文的表14中。
[0677]
[0678] 实施例13
[0679] 底物特异性
[0680] A.进化枝I和进化枝II SaCYP76F酶的底物特异性
[0681] 对包含SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)和SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)的酵母微粒体转化多种倍半萜的能力进行测定以测试进化枝I和进化枝II SaCYP76F酶所使用底物的范围，所述倍半萜包括底物α-檀香烯和β-檀香烯以及另外7种在非环状异戊二烯基侧链方面与檀香烯类似的倍半萜，包括α-姜黄烯、姜碱、β-红没药烯、β-倍半菲兰烯、α-没药醇、反式-β-法尼烯和反式-橙花叔醇。使用上文实施例11.B.1.b中所述的体外测定来对每种底物进行测试。
[0682] 结果示于下文的表15中，表15示出了底物(包括其结构)和相对活性，在β-檀香烯的情况下，相对活性表示相对于通过SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)的产物形成的产物形成率。如下表中所示，SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)和SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)表现出窄的底物选择性，其中两者均优选檀香烯(包括α-檀香烯或β-檀香烯)作为底物。SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)仅有效转化两种檀香烯并对α-没药醇具有低活性。SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)不利用α-姜黄烯、姜碱、β-红没药烯、β-倍半菲兰烯、反式-β-法尼烯和反式-橙花叔醇作为底物。类似地，SaCYP76F37v1(SaCYP76-G11)也对两种檀香烯和反式-橙花叔醇具有选择性活性。
[0683]
[0684]＊
[0685] 在β-檀香烯的情况下，相对活性表示相对于通过SaCYP76F39v1的产物形成的产物形成率。
[0686] B.不同单萜和倍半萜底物的氧化
[0687] 直接测定包含檀香细胞色素P450 SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)和细胞色素P450还原酶的酵母微粒体氧化不同单萜和倍半萜底物的能力，包括芳樟醇、牻牛儿醇、橙花醇、橙花叔醇和没药醇。350μL总体积的反应混合物包含50mM磷酸钾、0.8mM NADPH和60至80μM萜底物。将酶反应通过添加50μL微粒体制备物起始、在30℃下孵育1小时同时进行振荡，之后通过添加500μL己烷/乙酸乙酯(85∶15)终止。将有机层在温和的N2气流下浓缩至约100μL，并通过GC-MS分析进行分析，如实施例6中所述。将结果与载体对照进行比较。以MS片段化模式与NIST和Wiley库(Wiley 第9版/NIST 2011；
Fred W.McLafferty，John Wiley&Sons，Inc)中条目的匹配为基础鉴定反应产物。
[0688] 1.SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)
[0689] SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)与芳樟醇反应产生两种产物：峰1：保留时间约为17.5分钟；和峰2，保留时间约为18.5分钟。芳樟醇的保留时间为约10.5。峰1和峰2的MS片段化模式的最佳匹配分别对应于3，8-二甲基-1，7-辛二烯-6-醇和8-羟基芳樟醇。
SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)与牻牛儿醇反应产生一种产物，其保留时间为约21分钟。牻牛儿醇的保留时间约为14分钟。该峰的MS片段化模式的最佳匹配对应于反式，反式-2，
6-二甲基-2，6-辛二烯-1，8二醇。SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)与橙花醇反应产生一种产物，其保留时间为约20.8分钟，而橙花醇的保留时间约为13.4分钟。该峰的MS片段化模式的最佳匹配对应于2，6-二甲基-2，6-辛二烯-1，8二醇。SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)与橙花叔醇反应产生两种产物，其保留时间为约21.3分钟和22.3分钟，而橙花叔醇的保留时间约为16.1分钟。SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)与没药醇反应产生一种产物，其保留时间约为25.2分钟，其中没药醇的保留时间为约17.6。通过SaCYP76F38v1(SaCYP76-G5)与橙花叔醇和没药醇反应形成的产物的MS片段化模式与MS片段化数据库中的已知物质不匹配。
[0690] 2.SaCYP76F39v1(SaCYP76-G10)
[0691] CYP76-G10还催化牻牛儿醇、橙花醇和没药醇的体外羟基化。在每种情况下，产物形成与上文所述的通过CYP76-G5催化的产物形成相同。
[0692] 由于对本技术领域的技术人员来说，修改是显而易见的，因此本发明仅受限于所附权利要求书的范围。
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