Herbicide resistance gene

発明の背景
雑草は、作物および他の望ましい植物によって必要とされる価値のある土壌中の栄養素を急速に枯渇させうる。 雑草の制御のために現在使用されている多くの異なる型の除草剤が存在している。 1つの極めて評判のよい除草剤がグリホセートである。

グリホセートに抵抗性である、トウモロコシ、ダイズ、アブラナ、ワタ、テンサイ、コムギ、芝草、およびイネのような作物が開発されてきた。 従って、例えば、活発に生育するグリホセート抵抗性ダイズを有する圃場は、トウモロコシ植物に有意に損害を与えることなく雑草を制御するために散布することができる。

1990年の半ばにおける遺伝子操作されたグリホセート耐性作物（GTC）の導入によって、栽培者は、単純な、簡便で、柔軟性があり、かつ安価なツールを用いて、農業において比類のない、広い範囲の広葉およびイネ科雑草を制御することを可能にした。 結果として、生産者は、急速にGTCを採用し、多くの例において、輪作、除草剤の作用様式のローテーション、容器での混合、化学的および栽培的な雑草制御を伴う機械の取り込みなどの受容された最良の農学的な実務の多くを放棄した。 現在、グリホセート耐性のダイズ、ワタ、トウモロコシ、およびアブラナが米国内および西半球のどこかで市販されている。 アルファルファは最初の多年生のGTCであり、何年かにわたって繰り返す、同じ作物および圃場へのグリホセートの連続使用の機会を拡大した。 より多くのGTC（例えば、コムギ、イネ、テンサイ、芝草など）が、保留中の世界的な市場の受け入れの導入のために準備されている。 多くの他のグリホセート抵抗性種が、開発段階のために実験中である（例えば、アルファルファ、サトウキビ、ヒマワリ、ビート、エンドウマメ、ニンジン、キュウリ、レタス、タマネギ、イチゴ、トマト、およびタバコ；ポプラおよびスイートガムのような林業種；ならびにマリゴールド、ペチュニア、およびベゴニアのような園芸種；「isb.vt.edu/cfdocs/fieldtestsl.cfm , 2005」ウェブサイトを参照されたい）。 加えて、グリホセートのコストは、近年、従来的な雑草制御プログラムが、グリホセートGTC系と価格および性能の点で有効に競合できることがほとんどできない点にまで劇的に低下している。

グリホセートは、15年間よりも長い間、全体的な植物の生育の制御のために、全焼（burndown）領域および他の非農作物領域において首尾よく使用されてきた。 多くの例において、GTCを用いる場合と同様に、グリホセートは、連続して、3年間、5年間、10年間、15年間までの間、年間あたり1〜3回使用されてきた。 これらの状況は、グリホセートおよびGTC技術に対する過剰な依存性をもたらし、天然にグリホセートに対してより耐性であるか、またはグリホセートの除草剤活性に抵抗するメカニズムを発達させた植物のために、ネイティブな雑草種に対する重い選択圧を配置してきた。

グリホセートのみの雑草制御プログラムの広範な使用は、グリホセート抵抗性雑草の選択を生じており、大部分の標的種よりもグリホセートに対して固有により耐性である雑草種の増殖を選択している（すなわち、雑草の変化）（Powles and Preston, 2006, Ng et al., 2003; Simarmata et al., 2003; Lorraine-Colwill et al., 2003; Sfiligoj, 2004; Miller et al., 2003; Heap, 2005; Murphy et al., 2002; Martin et al., 2002）。 グリホセートは15年間よりも長くの間、世界的に広範に使用されてきたが、ほんの一握りの雑草のみが、グリホセートに対して抵抗性を発達させたと報告されてきた（Heap, 2005）；しかし、これらの大部分は、過去5年間で同定された。 抵抗性の雑草には、イネ科雑草種と広葉種の両方-ロリウム リジダム（Lolium rigidum）、ロリウム ムルチフロラム（Lolium multiflorum）、エロイシン インディカ（Eleusine indica）、セイバンモロコシ（Sorghum halepense）、アムブロシア アーテミシイフォリア（Ambrosia artemisiifolia）、コニザ カナデンシス（Conyza canadensis）、コニザ ボナリエンシス（Conyza bonariensis）、プランターゴ ランセオラータ（Plantago lanceolata）、オオホナガアオゲイトウ（Amaranthus palmerii）、およびホソバイヌビユ（Amaranthus rudis）が含まれる。 加えて、GTCの広範な使用の前に、以前には農学的な問題ではなかった雑草が、現在、より優勢となりつつあり、米国のワタおよびダイズのエーカーの>80%、ならびに米国のトウモロコシのエーカーの>20%を含む、GTCの状況において制御することが困難になりつつある（Gianessi, 2005）。 これらの雑草の変化は、制御することが困難である広葉雑草で優勢になりつつある（しかし独占的ではない）。 いくつかの例には、イポミア（Ipomoea）、アマランサス（Amaranthus）、チェノポジウム（Chenopodium）、タラキサカム（Taraxacum）、およびコメリナ（Commelina）の種が含まれる。

栽培者が、グリホセート抵抗性雑草または制御することがより困難な雑草種への変化に直面している領域において、栽培者らは、見逃された雑草を制御する他の除草剤を容器で混合するか、またはそれと代替することによって、グリホセートの弱さを補うことができる。 多くの例において、広葉が逃れることを制御するための1つの評判がよく、かつ有効である容器で混合したパートナーは、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）であった。 2,4-Dは、農業的に、および非作物的な状況において、広い範囲の広葉雑草制御のために、60年よりも長く使用されてきている。 より耐性である種の個々の例は報告されてきたが、2,4-Dは、依然として世界的に最も広範に使用される除草剤の1つである。 2,4-Dのさらなる使用の限界は、ダイズまたはワタのような双子葉植物作物におけるその選択性が非常に乏しいことであり、それゆえに、2,4-Dは、典型的には、感受性の高い双子葉植物に対しては（および一般的にその近くでは）使用されない。 加えて、草作物における2,4-Dの使用は、いくぶん、起こり得る作物の損傷の性質によって制限される。 グリホセートと組み合わせた2,4-Dは、ダイズおよびワタの不耕起植え込みの前により強固な全焼処理を提供するために使用されてきた。 しかし、2,4-Dに対するこれらの双子葉植物種の感受性に起因して、これらの全焼処理は、植え込みの前少なくとも14〜30日間に行われなくてはならない（Agriliance, 2005）。

2,4-Dは、MCPAと同様に、フェノキシ酸クラスの除草剤である。 2,4-Dは、所望の農作物植物を深刻に損傷することのない広葉雑草の選択的制御のために、多くの単子葉植物作物（トウモロコシ、コムギ、およびイネなど）において使用されてきた。 2,4-Dは、正常な細胞-ホルモン恒常性を調節解除し、およびバランスのとれた、制御された成長を妨害するように作用する合成オーキシン誘導体である。 しかし、作用の正確な様式はなお不明である。 トリクロピルおよびフルロキシピルは、作用様式がまた合成オーキシンと同様であるピリジルオキシ酢酸除草剤である。

これらの除草剤は、特定の植物に対して、異なるレベルの選択性を有する（例えば、双子葉植物は、イネ科雑草より感受性である）。 異なる植物による差次的な代謝は、変動する選択性のレベルについての1つの説明である。 一般的に、植物は、2,4-Dをゆっくりと代謝し、それゆえに、2,4-Dに対する変動する植物の応答は、標的部位における異なる活性によって説明される可能性がより高い場合がある（WSSA、2002）。 2,4-Dの植物代謝は、典型的には、二相性メカニズム、典型的には、ヒドロキシル化、続いてアミノ酸またはグルコースとの結合体化を介して起こる（WSSA、2002）。

時間の経過とともに、微生物集団は、2,4-Dの完全な無機化を生じる、この特定の生体異物の分解のための代替的かつ効率的な経路を発生してきた。 除草剤の連続的適用は、成長のための炭素源として除草剤を使用することができる微生物を選択し、これらに土壌における競合的な利点を与える。 この理由のために、現在、比較的短い土壌半減期を有するように製剤化された2,4-Dは、引き続く作物への有意な持ち越し（carryover）の影響に直面しない。 これは、2,4-Dの除草性有用性に加えられる。

2,4-Dを分解するその能力について広範に調査されてきた1つの生物は、ラルストニア ユートロファ (Ralstonia eutropha)（Streber et al., 1987）である。 無機化経路における第1の酵素的段階をコードする遺伝子はtfdAである。 米国特許第6,153,401号およびGENBANKアクセッション番号M16730を参照されたい。 TfdAは、α-ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ反応を介して、2,4-D酸のジクロロフェノール（DCP）への転換を触媒する（Smejkal et al., 2001）。 DCPは、2,4-Dと比較して、除草剤活性をほとんど有さない。 TfdAは、通常は2,4-Dに対して感受性である双子葉植物（例えば、ワタおよびタバコ）において2,4-D抵抗性を付与するためにトランスジェニック植物において使用されてきた（Streber et al. (1989)、Lyon et al. (1989)、Lyon (1993)、および米国特許第5,608,147号）。

2,4-Dを分解することが可能であるタンパク質をコードする多数のtfdA-型遺伝子が自然環境から同定されており、Genbankデータベースに寄託されている。 多くのホモログがtfdAに類似しており（>85%アミノ酸同一性）、およびtfdAに対して類似の酵素的特性を有する。 しかし、tfdAに対して有意により低い同一性（25〜50%）を有するが、α-ケトグルタレートジオキシゲナーゼFe ²⁺ジオキシゲナーゼと関連する特徴的な残基をなお有する多数のホモログが存在している。 それゆえに、これらの多様なジオキシゲナーゼの基質特異性がどのようなものであるかは明らかではない。

tfdAに対して低い相同性（31%アミノ酸同一性）を有する1つの独特な例は、デルフティア アシドボランス（Delftia acidovorans）からのsdpAである（Kohler et al., 1999、Westendorf et al., 2002, Westendorf et al., 2003）。 この酵素は、(S)-ジクロルプロップ（および他の(S)-フェノキシプロピオン酸）ならびに2,4-D（フェノキシ酢酸）無機化における最初の段階を触媒することが示されてきた（Westendorf et al., 2003）。 この遺伝子の植物への形質転換は、それゆえに報告されていなかった。

新規な除草剤耐性作物（HTC）技術の開発は、GTCの効力、低コスト、および簡便さに多くが起因する成功に限られてきた。 結果として、非常に高い割合のGTCの採用が生産者の間で起こっている。 これは、新規なHTC技術を開発するための動機をほとんど作り出していない。

アリールオキシアルカノエート化学構造は、フェノキシ酢酸オーキシン（2,4-Dおよびジクロルプロップなど）、ピリジルオキシ酢酸オーキシン（フルロキシピルおよびトリクロピルなど）、アリールオキシフェノキシプロピオネート（AOPP）アセチル-コエンザイムAカルボキシラーゼ（ACCアーゼ）阻害剤（ハロキシホップ、キザロホップ、およびジクロホップなど）、および5-置換フェノキシ酢酸プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼIX阻害剤（ピラフルフェンおよびフルミクロラックなど）を含む、多くの市販の除草剤の共通の実体である。 しかし、これらの除草剤のクラスはすべてが完全に別個であり、これらの化学クラスの間で共通の分解経路についての証拠は現在の文献中には存在していない。 複数の作用様式を網羅する除草剤の分解についての多機能酵素は、近年説明されている（2005年5月2日に提出されたPCT US/2005/014737）。 他の独特な多機能酵素および潜在的な使用は以下において説明される。

発明の簡単な概要
本発明は、2,4-Dに対してのみならず、ピリジルオキシ酢酸除草剤にもまた抵抗性である新規な植物を提供する。 従来、これらの有利な特性の両方を有する植物が、単一の遺伝子の導入によって産生することができるという予測または示唆は存在しなかった。 本発明はまた、より広くかつより強固な雑草の制御、および除草剤抵抗性管理の選択肢と適合できる除草剤耐性植物を提供するために、グリホセート抵抗性遺伝子、ALS（イミダゾリノン、スルホニルウレア）抵抗性遺伝子、アリールオキシアルカノエート抵抗遺伝子、HPPD抵抗性遺伝子、PPO抵抗性遺伝子、およびグルホシネート抵抗性遺伝子を含むがこれらに限定されない、1種または複数の他の除草剤抵抗性遺伝子とともに「重ね合わせた（stack）」本発明の1種または複数の酵素を産生する植物を含む。 本発明はさらに、本明細書に例示される遺伝子およびタンパク質のホモログを使用する方法および組成物を含む。

ある態様において、本発明は、2,4-D、MCPA、トリクロピル、フルロキシピル、および1種または複数の市販の除草剤（例えば、グリホセート、グルホシネート、パラコート、ALS阻害剤（例えば、スルホニルウレア、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド）、HPPD阻害剤（例えば、メソトリオン、イソキサフルトール）、ジカンバ、ブロモキシニル、アリールオキシフェノキシプロピオネートなど）に対して耐性である単子葉植物および双子葉植物を提供する。 このような除草剤耐性の原因である核酸配列を含むベクターもまた、雑草制御および雑草集団の変化の妨害のために、このような耐性植物および除草剤の組み合わせを使用する方法が開示されるのと同様に開示される。 本発明は、新規なやり方で使用される、新規な除草剤の組み合わせを可能にする。 さらに、本発明は、グリホセートなどの1種または複数の除草剤に対して抵抗性である雑草の株の発生を予防し、およびそれを制御する新規な方法を提供する。 本発明は、除草剤および作物の新規な組み合わせの新規な使用を可能にし、これは、さもなくばその除草剤（2,4-Dなど）に感受性である植物の種子を植える直前に、植えられる領域への播種前適用を含む。

本発明は、2,4-Dを分解することが可能であるのみならず、驚くべきことに、例えば、以前に知られていたtfdAタンパク質から本発明の酵素を区別する新規な特性を有する酵素の同定に部分的に関する。 より詳細には、本発明は、2,4-D除草剤とピリジルオキシ酢酸除草剤の両方を分解することが可能である酵素の使用に関する。 α-ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ酵素は、フェノキシ酢酸オーキシン除草剤とピリジルオキシ酢酸オーキシン除草剤の両方の除草剤を分解する能力を有することが以前に報告されてきた。 本発明による使用のための好ましい酵素および遺伝子は、本明細書では、AAD-12（アリールオキシアルカノエート ジオキシゲナーゼ( A ryloxy A lkanoate D ioxygenase)）と呼ばれる。 この高度に新規な発見は、有意な除草剤耐性作物（HTC）形質および選択可能なマーカーの可能性に基づいている。 本発明の植物は、それらの生活環全体を通して抵抗性であり得る。

以前には、AAD-12遺伝子（好ましくは、本明細書で例示されるような、1つまたは複数の型の植物における発現のために最適化された配列を有するAAD-12ポリヌクレオチド）を含む植物を生産するための動機付けが存在せず、このような植物が、フェノキシ酢酸除草剤（2,4-Dなど）ならびに/またはトリクロピルおよびフルロキシピルなどの1種または複数のピリジルオキシ酢酸除草剤に対して、その植物を抵抗性にするAAD-12酵素を効率的に産生することができるという予測は存在しなかった。 従って、本発明は、当技術分野において従来は可能であると考えられていなかった多くの利点を提供する。

本発明はまた、フェノキシ酢酸オーキシン除草剤および/またはピリジルオキシ酢酸オーキシン除草剤を分解可能であるアリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子の同定および使用に部分的に関する。 これらの活性についてタンパク質をスクリーニングする方法は、本発明の範囲内にある。 従って、本発明は、組換え発現されたAAD-12酵素による、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸および他のアリールオキシアルカノエートオーキシン除草剤の分解を含む。 本発明はまた、雑草を制御する方法を含み、ここで、該方法は、1種または複数のピリジルオキシ酢酸オーキシン除草剤またはフェノキシ酢酸オーキシン除草剤を、AAD-12遺伝子を含む植物に適用する工程を含む。 本発明はまた、AAD-12で形質転換された植物細胞および全植物体を同定するための選択可能なマーカーとしてAAD-12遺伝子を使用する方法を提供し、これらの植物は、任意に、標的植物細胞に同時に挿入された1個、2個、またはそれ以上の外来性遺伝子を含む。 本発明の方法は、適切なレベルの除草剤に対して抵抗性である形質転換細胞を選択する工程を含む。 本発明は、本発明の植物および/または細胞を培養することによって、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼの生物学的活性を有するポリペプチドを調製する方法をさらに含む。

発明の詳細な説明
対象の2,4-D抵抗性遺伝子の開発および引き続く抵抗性作物は、作物適用における、広葉のグリホセート抵抗性（またはかなり耐性でありかつ転じた）雑草種の制御のための優秀な選択肢を提供する。 より多くの作物耐性が双子葉植物および単子葉植物において同様に提供され得る場合には、2,4-Dは、栽培者のための優秀な有用性を提供する、広い範囲の、比較的安価な、かつ強固な広葉除草剤である。 2,4-D耐性トランスジェニック双子葉植物作物はまた、適用のタイミングおよび割合においてより大きな柔軟性を有する。 2,4-Dについての対象となる除草剤耐性形質のさらなる有用性は、2,4-Dの漂流、揮発、反転（または場所から離れた他の移動現象）、適用の誤り、汚損などから、通常感受性である作物への損傷を予防するその有用性であると考えられる。 AAD-12遺伝子のさらなる利点は、現在まで特徴付けされているすべてのtfdAホモログと異なり、AAD-12は、アキラルフェノキシオーキシン（例えば、2,4-D、MCPA、4-クロロフェノキシ酢酸）に加えて、ピリジルオキシ酢酸オーキシン（例えば、トリクロピル、フルロキシピル）を分解可能であることである。 表1を参照されたい。 本発明のAAD-12酵素によって触媒される化学反応の一般的図式は図1に示される（O ₂の付加は立体特異的であり；フェノールおよびグリオキシレートへの中間体の分解は自発的である）。 図1における化学構造は分子骨格を図示すること、および種々のR基など（例えば、表1に示されるものなど）が含まれるが、これらは図1において必ずしも具体的に図示されないことが理解されるべきである。 異なるフェノキシオーキシンの組み合わせの複数の混合物が、特定の雑草の範囲および様々な地域の環境条件に取り組むために世界的に使用されてきた。 植物でのAAD-12遺伝子の使用は、はるかに広い範囲のオーキシン除草剤に対する保護を与え、それによって、制御され得る雑草の幅および範囲を増加させる。 本発明はまた、市販のフェノキシオーキシンの最大限の広がりによる、漂流（drift）または用地外の他の合成オーキシン除草剤損傷から保護するためにも使用することができる。 表1は、市販のピリジルオキシオーキシンおよびフェノキシオーキシンを定義し、関連する化学構造を提供する。

（表1）市販のフェノキシ酢酸オーキシンおよびピリジルオキシ酢酸オーキシン。 フェノキシオーキシン除草剤およびピリジルオキシオーキシン除草剤への言及は、一般的には活性酸に対してなされるが、いくつかは種々の対応する任意のエステル製剤として商業的に製剤化され、これらは同様に植物におけるAAD-12酵素のための基質と見なされる。 なぜなら、一般的な植物のエステラーゼは、これらのエステルを、植物で活性な酸に転換するからである。 同様に、対応する酸の対応する有機塩または無機塩についての参照もまたあり得る。 作物での使用および非作物での使用の両方における可能な使用割合の範囲は、単独型の処理として、または他の除草剤との組み合わせにおいてであり得る。

ここで、単一の遺伝子（AAD-12）が同定されており、これは、植物における発現のために遺伝子操作された場合に、固有の耐性が全く存在しないかまたはフェノキシオーキシン除草剤の使用を可能にするのに十分なほど高くはなかった植物でのフェノキシオーキシン除草剤の使用を可能にするための特性を有する。 加えて、AAD-12は、天然の耐性もまた選択性を許容するのに十分ではなかったピリジルオキシ酢酸除草剤に対する、植物体への保護を提供することができ、これらの除草剤の潜在的な有用性を拡張する。 ここで、AAD-12を単独で含む植物は、1種、2種、または数種のフェノキシオーキシン除草剤の組み合わせを用いて、連続して、または容器で混合して処理されてもよい。 各フェノキシオーキシン除草剤についての割合は、双子葉雑草の広い範囲の制御のために、25〜4000g ae/ha、およびより典型的には100〜2000g ae/haの範囲であってもよい。 同様に、1種、2種、または数種のピリジルオキシ酢酸オーキシン化合物の混合物が、該除草剤からの損傷のリスクの減少を伴って、AAD-12を発現する植物に適用されてもよい。 各ピリジルオキシ酢酸除草剤についての割合は、さらなる双子葉雑草の制御のために、25〜2000g ae/ha、およびより典型的には、35〜840g ae/haの範囲であってもよい。

グリホセートは、非常に広い範囲の広葉種およびイネ科雑草種を制御するので、広範囲にわたって使用される。 しかし、GTCおよび非作物適用におけるグリホセートの反復使用は、天然により耐性である種またはグリホセート抵抗性生物型への雑草の変化を有するか、またはそれを選択することを継続する。 同じ種の制御を提供するが異なる作用の様式を有する、効率的な速度で使用される容器で混合した除草剤パートナーは、抵抗性雑草の出現を遅らせるための方法として、多くの除草剤抵抗性管理ストラテジーによって処方される。 グリホセート耐性形質（および/または他の除草剤耐性形質）とのAAD-12の重ね合わせは、同じ作物においてグリホセート、フェノキシオーキシン（例えば、2,4-D）およびピリジルオキシ酢酸オーキシン除草剤（例えば、トリクロピル）の使用を選択的に可能にすることによって、GTCでのグリホセート抵抗性双子葉植物雑草種の制御を可能にするためのメカニズムを提供することができる。 これらの除草剤の適用は、異なる作用の様式の2種以上の除草剤を含む容器での混合で連続的に；播種前、発芽前もしくは発芽後としての連続的適用における単独の除草剤組成物の個々の適用、および約2時間から約3ヶ月の範囲にわたる分割した適用のタイミングであり得；または代替として、各化学クラスを表す任意の数の除草剤の任意の組み合わせが、播種の約7ヶ月以内で作物の収穫まで（または個々の除草剤について収穫前の間隔、いずれか短い方）の任意のタイミングで適用することができる。

適用のタイミング、個々の除草剤の割合、および困難であるかまたは抵抗性であるイネ科雑草および広葉を制御する能力に関して、広い範囲のイネ科雑草および広葉雑草を制御する際に柔軟性を有することが重要である。 グリホセート抵抗性遺伝子/AAD-12重ね合わせを用いる、作物におけるグリホセート適用は約250〜2500g ae/haの範囲であり得；フェノキシオーキシン除草剤（1種または複数）は約25〜4000g ae/haで適用され得；およびピリジルオキシ酢酸オーキシン除草剤（1種または複数）は25〜2000g ae/haで適用され得る。 最適な組み合わせおよびこれらの適用のタイミングは、特定の状況、種、および環境に依存し、これは雑草制御の分野にあり、かつ本開示の恩典を有する当業者によって最も良好に決定される。

小植物は、典型的には、生長サイクル全体を通して抵抗性である。 形質転換植物は、典型的には、遺伝子が発現された任意の時点で新たな除草剤適用に対して抵抗性である。 耐性は、2,4-Dに対して、これまでに試験されてきた構成的プロモーター（主としてCsVMVおよびAtUbi 10）を使用して生活環にわたって本明細書で示される。 典型的には予測されうるが、これは、例えば、抵抗性の作用メカニズムの部位の発現の減少によって、耐性が有意に影響を受ける可能性がある他の非代謝活性に対する改善である。 1つの例はRoundup Readyワタであり、この場合、植物は、初期に噴霧した場合には耐性であったが、あまりに遅く噴霧した場合にはグリホセートが成長点に濃縮され（代謝されず、転流されるため）；使用されるウイルスプロモーターMonsantoは花において十分に発現されない。 本発明は、これらの点における改善を提供する。

除草剤製剤（例えば、エステル、酸、または塩製剤；または可溶性濃縮物、乳化可能濃縮物、または可溶性液体）および容器で混合した添加物（例えば、アジュバント、界面活性剤、漂流遅延剤、または適合性剤）は、所定の除草剤または1種もしくは複数の除草剤の組み合わせからの雑草制御に有意に影響を与えることができる。 上述の除草剤化学物質のいずれかとのこれらの任意の組み合わせは、本発明の範囲内にある。

当業者はまた、制御される雑草の範囲を増加させるため、および/または天然にはより耐性もしくは抵抗性である雑草種の制御のために2つ以上の作用の様式を組み合わせる利点を見出す。 これはまた、GTCを超えて人の関与を通して（遺伝子導入によりまたは非遺伝子導入により）作物における除草剤耐性が可能にする化学的作用にまで及ぶ。 確かに、グリホセート抵抗性（例えば、抵抗性の植物または細菌のEPSPS、グリホセート・オキシドレダクターゼ（GOX）、GAT）、グルホシネート抵抗性（例えば、Pat、bar）、アセト乳酸シンターゼ（ALS）阻害除草剤抵抗性（例えば、イミダゾリノン、スルホニルウレア、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド、ピリミジニルチオベンゾエート、および他の化学物質=AHAS、Csr1、SurAなど）、ブロモキシニル抵抗性（例えば、Bxn）、HPPDの阻害剤に対する抵抗性（4-ヒドロキシルフェニル-ピルビン酸-ジオキシゲナーゼ）酵素、フィトエンデサチュラーゼ（PDS）の阻害剤に対する抵抗性、光化学系II阻害除草剤に対する抵抗性（例えば、psbA）、光化学系I阻害除草剤に対する抵抗性、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼIX（PPO）阻害除草剤（例えば、PPO-1）に対する抵抗性、フェニルウレア除草剤（例えば、CYP76B1）に対する抵抗性、ジカンバ分解酵素（例えば、US 20030135879）などをコードする形質が、雑草の変化および/または上述のクラスの任意の除草剤に対する抵抗性を効果的に制御または妨害する能力を提供するために、単独でまたは複数の組み合わせで重ね合わされ得る。 インビボ修飾EPSPSは、ある好ましい態様において、ならびにクラスI、クラスII、およびクラスIIIグリホセート抵抗性遺伝子において、使用することができる。

さらなる除草剤に関して、いくつかのさらなる好ましいALS阻害剤には以下が含まれるがこれらに限定されない：スルホニルウレア（例えば、クロルスルフロン、ハロスルフロン、ニコスルフロン、スルホメツロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロン）、イミダゾロニノン（例えば、イマザモクス、イマゼタピル、イマザキン）、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド（例えば、クロランスラム-メチル、ジクロスラム、フロラスラム、フルメツラム、メトスラム、およびペノクススラム）、ピリミジニルチオベンゾエート（例えば、ビスピリバックおよびピリチオバック）、およびフルカルバゾン。 いくつかの好ましいHPPD阻害剤には、メソトリオン、イソキサフルトール、およびスルコトリオンが含まれるが、これに限定されない。 いくつかの好ましいPPO阻害剤には、フルミクロラック、フルミオキサジン、フルフェンピル、ピラフルテン、フルチアセット、ブタフェナシル、カルフェントラゾン、スルフェントラゾン、およびジフェニルエーテル（アシフルオルフェン、フォメサフェン、およびオキシフルオルフェン）が含まれるが、これに限定されない。

加えて、単独または1種もしくは複数の付加的なHTC形質と重ね合わせたAAD-12は、1種または複数の付加的なインプット（例えば、昆虫抵抗性、真菌抵抗性、またはストレス耐性など）またはアウトプット（例えば、収量の増加、オイルプロファイルの改善、繊維品質の改善など）の形質と重ね合わせることができる。 従って、本発明は、任意の数の農学的な有害生物を、柔軟にかつコスト効果が高く制御する能力を伴う、改善された作物品質の完全な農学的パッケージを提供するために使用することができる。

本発明は、2,4-Dを分解するのみならず、例えば、以前に公知であったtfdAタンパク質から、本発明の酵素を区別する新規な特性を、驚くべきことに有する酵素の同定に部分的に関する。 この酵素は、たとえtfdAに対して非常に低い相同性を有する場合であっても、本発明の酵素は、α-ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼの同じ全体のファミリー中でなお一般的に分類することができる。 このファミリーのタンパク質は、活性部位を含む「HX(D/E)X _23-26 (T/S)X _114-183 HX _10-13 R」モチーフ中の3つの保存性ヒスチジン残基によって特徴付けられる。 これらのヒスチジンは、触媒活性のために必須である活性部位中でFe ²⁺を配位する（Hogan et al., 2000）。 本明細書で議論される予備的なインビトロ発現実験は、新規な属性を選択することを補助するために合わせられた。 これらの実験は、AAD-12酵素が、以前に出願された特許出願（PCT US/2005/014737；2005年5月2日出願）において開示された、同じクラスの別の異種の酵素とは異なることもまた示す。 この出願のAAD-1酵素は、本発明のAAD-12タンパク質と約25%のみの配列同一性を共有する。

より詳細には、本発明は、2,4-Dのみならず、ピリジルオキシ酢酸除草剤もまた分解可能である酵素の使用に部分的に関する。 α-ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ酵素は、異なる化学クラスおよび作用の様式の除草剤を分解する能力を有することは以前に報告されていなかった。 本発明による使用のための好ましい酵素および遺伝子は、本明細書ではAAD-12（アリールオキシアルカノエート ジオキシゲナーゼ）遺伝子およびタンパク質と呼ばれる。

本発明はまた、フェノキシオーキシンおよびピリジルオキシ酢酸除草剤を分解可能であるアリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子の同定および使用に部分的に関する。 従って、本発明は、組換え発現されたAAD-12酵素による、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸、他のフェノキシ酢酸、およびピリジルオキシ酢酸除草剤の分解に部分的に関する。

本発明のタンパク質は、分析アッセイ法において、2,4-ジクロロフェノール（「DCP」；除草剤的に活性である）への2,4-Dの転換について陽性であると試験された。 部分精製された本発明のタンパク質は、インビトロで2,4-DをDCPに迅速に転換することができる。 AAD-12形質転換植物が提供するさらなる利点は、親の除草剤が不活性型に代謝され、それによって穀粒または飼い葉において収集される除草剤の残渣についての潜在性を減少することである。

本発明はまた、ピリジルオキシ酢酸除草剤および/またはフェノキシオーキシン除草剤を、AAD-12遺伝子を含む植物に適用する工程を含む、雑草を制御する方法を含む。

これらの発見に鑑みて、この型の酵素をコードするポリヌクレオチドを含む新規な植物がここで提供される。 以前には、このような植物を生産するための動機付けが存在せず、このような植物が、フェノキシ酸除草剤（2,4-Dなど）のみならず、ピリジルオキシ酢酸除草剤に対してもまた植物を抵抗性にするこの酵素を効率的に産生することができるという予測も存在しなかった。 従って、本発明は、当技術分野において可能であると以前には考えられていなかった多くの利点を提供する。

公的に使用可能である株（ATCCまたはDSMZのような培養物コレクションに寄託されている）が、本明細書に開示された技術を使用して、新規な遺伝子について、獲得およびスクリーニングすることができる。 本明細書に開示される配列は、本発明によるさらなるスクリーニングおよび試験のために、相同遺伝子を増幅し、およびこれを組換え発現系にクローニングするために使用することができる。

背景の節において上記に議論したように、2,4-Dを分解するその能力について、広範に調査されてきた1つの生物は、ラルストニア ユートロファ（Streber et al., 1987）である。 分解経路における第1の酵素をコードする遺伝子はtfdAである。 米国特許第6,153,401号およびGENBANKアクセッション番号M16730を参照されたい。 tfdAは、α-ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ反応を介して、2,4-D酸の除草剤的に不活性なDCPへの転換を触媒する（Smejkal et al., 2001）。 TfdAは、通常は2,4-Dに対して感受性である双子葉植物（例えば、ワタおよびタバコ）において2,4-D抵抗性を付与するためにトランスジェニック植物において使用されてきた（Streber et al. (1989)、Lyon et al. (1989)、Lyon et al. (1993)）。 2,4-Dを分解することが可能であるタンパク質をコードする多数のtfdA-型遺伝子が自然環境から同定されており、Genbankデータベースに寄託されている。 多くのホモログがtfdAに類似しており（>85%アミノ酸同一性）、およびtfdAに対して類似の酵素的特性を有する。 しかし、tfdAに対して有意により低いレベルの同一性を有するα-ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼホモログのわずかなコレクションが、現在同定されている。

本発明は、tfdAに対して低い相同性（31%アミノ酸同一性）を有する、デルフティア アシドボランス（Delftia acidivorans）からの関連性が遠い酵素であるsdpAの新規使用および機能の驚くべき発見（Westendorf et al, 2002, 2003）に部分的に関する。 そのネイティブ型で精製されたこのα-ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ酵素は、2,4-DおよびS-ジクロルプロップを分解することが以前に示されていた（Westendorf et al, 2002および2003）。 しかし、α-ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ酵素は、ピリジルオキシ酢酸化学物質クラスの除草剤を分解する能力を有することは以前には報告されていなかった。 SdpAは植物において発現されておらず、それを行う動機付けも、GTCの、効力、低コスト、および簡便さに大部分起因して新規なHTC技術の開発が限られていたことを部分的に原因として、存在しなかった（Devine, 2005）。

新規な活性に鑑みて、本発明のタンパク質および遺伝子は、本明細書では、AAD-12タンパク質および遺伝子と呼ばれる。 AAD-12は、現在、インビトロで種々のフェノキシ酢酸オーキシン除草剤を分解することが確認された。 しかし、この酵素は、本明細書で初めて報告されるように、驚くべきことに、アリールオキシアルカノエート分子のさらなる基質のクラスもまた分解可能であることが見い出された。 有意な農学的な重要性のある基質には、ピリジルオキシ酢酸オーキシン除草剤が含まれる。 この極めて新規な発見は、有意な除草剤耐性作物（HTC）および選択可能なマーカーの形質の可能性に基づいている。 この酵素は、広域スペクトルの範囲の広葉樹除草剤（フェノキシ酢酸オーキシンおよびピリジルオキシ酢酸オーキシン）に対する除草剤分解活性を送達するその能力において独特である。

従って、本発明は、組換え発現されたアリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ酵素（AAD-12）による、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸、他のフェノキシ酢酸オーキシン除草剤、およびピリジルオキシ酢酸除草剤の分解に部分的に関する。 本発明はまた、フェノキシオーキシン除草剤および/またはピリジルオキシオーキシン除草剤を分解可能であるアリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ分解酵素（AAD-12）をコードする遺伝子の同定および使用に部分的に関する。

対象の酵素は、ほぼすべての広葉雑草を制御する除草剤の組み合わせに対して耐性を生じるトランスジェニック発現を可能にする。 AAD-12は、例えば、他のHTC形質（例えば、グリホセート抵抗性、グルホシネート抵抗性、ALS阻害剤（イミダゾリノン、スルホニルウレア、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド）抵抗性、ブロモキシニル抵抗性、HPPD阻害剤抵抗性、PPO阻害剤抵抗性など）、および昆虫抵抗性形質（Cry1F、Cry1Ab、Cry 34/45、他のBt.タンパク質、または非バチルス起源の殺虫性タンパク質など）と重ね合わされて、卓越した除草剤耐性作物（HTC）形質として働くことができる。 加えて、AAD-12は、第2の遺伝子または遺伝子の群を用いて、遺伝子操作された植物の一次形質転換体の選択において補助するための選択マーカーとして働くことができる。

加えて、対象の微生物遺伝子は、タンパク質が、単子葉植物と双子葉植物の両方（ヘミコット（hemicot））の使用頻度に向けて偏りを有するコドンによってコードされるように再設計されている。 アラビドプシス（Arabidopsis）、トウモロコシ、タバコ、ワタ、ダイズ、アブラナ、およびイネがAAD-12含有構築物で形質転換され、フェノキシオーキシン除草剤およびピリジルオキシオーキシン除草剤の両方に対して高レベルの抵抗性を実証した。 従って、本発明はまた、本発明のタンパク質をコードする「植物に最適化された」遺伝子に関する。

オキシアルカノエート基は、安定な酸の官能基を除草剤に導入するために有用である。 酸性基は、除草剤作用のために望ましい属性である「酸トラッピング」によって師部に可動性を付与することができ、それゆえに、可動性の目的のために新規な除草剤に組み込むことができる。 本発明の局面はまた、HTCを作製するメカニズムを提供する。 AAD-12についての基質として働くことができる多くの潜在的な市販のおよび実験的な除草剤が存在する。 従って、対象の遺伝子はまた、同様に他の除草剤に対して耐性である除草剤を生じることができる。

本発明のHTC形質は、他のHTC形質（グリホセート耐性を含むがこれに限定されない）との新規な組み合わせにおいて使用することができる。 これらの形質の組み合わせは、除草剤（例えば、グリホセート）に対する、新規に獲得された抵抗性または固有の耐性に起因して、雑草（および同様のもの）種を制御する新規な方法を生じる。 従って、HTC形質に加えて、そのために除草剤耐性がトランスジェニック作物において該酵素によって作られた、除草剤を使用して雑草を制御するための新規な方法は、本発明の範囲内にある。

本発明は、例えば、ダイズにおける現在のグリホセート抵抗性形質と重ね合わされた2,4-D抵抗性を商業化することの状況において適用することができる。 従って、本発明は、広葉雑草種の変化および/または除草剤抵抗性広葉雑草の選択に取り組むツールを提供し、これは、種々の作物を用いる雑草制御のためのグリホセートに対する栽培者らによる極めて高い信頼性から頂点をなす。

対象のAAD-12遺伝子のトランスジェニック発現は、例えば、アラビドプシス、タバコ、ダイズ、ワタ、イネ、トウモロコシ、およびアブラナにおいて例示される。 ダイズは、本発明による形質転換のための好ましい作物である。 しかし、本発明は、多数の他の単子葉植物（牧草または芝草など）および双子葉植物（アルファルファ、クローバー、樹種など）に使用され得る。 同様に、2,4-D（または他のAAD-12-基質）は、草類作物においてより積極的に使用され得、ここで、耐性は中程度であり、この形質を介して増加された耐性は、栽培者に、より効率的な割合で、かつ作物の損傷のリスクなしでより広い適用のタイミングにわたって、これらの除草剤を使用する機会を提供する。

なおさらに、本発明は、広葉雑草を制御する除草剤に対する抵抗性を提供することができる単一の遺伝子を提供する。 この遺伝子は、広い範囲の除草剤の組み合わせの使用を可能にするために、複数の作物において使用されてもよい。 本発明はまた、現在の化学物質に対して抵抗性である雑草を制御することができ、現在の農業的実務から生じる雑草の範囲のシフトの制御において補助することができる。 対象のAAD-12は、さらなる除草剤基質を非除草剤型に効果的に解毒するための試みにおいて使用することができる。 従って、本発明は、さらなるHTC形質および/または選択マーカー技術の開発を提供する。

HTCを産生するための対象の遺伝子を使用することとは別に、またはそれに加えて、対象の遺伝子は、細胞培養、温室、および圃場内で首尾よく形質転換体を選択するための選択マーカーとして使用することができる。 生物技術プロジェクトのための選択マーカーとしての、対象の遺伝子についての高い固有の価値が単純に存在する。 他のアリールオキシアルカノエートオーキシン除草剤のためのAAD-12の雑多な使用は、HTCおよび/または選択マーカーの目的のためにこの遺伝子を使用する多くの機会を提供する。

本発明のタンパク質（および供給源の単離物）
本発明は機能的タンパク質を提供する。 「機能的活性」（または「活性な」）は、本明細書では、本発明による使用のためのタンパク質/酵素が、除草剤を分解するか、またはその活性を減少する能力を有する（単独でまたは他のタンパク質と組み合わせて）ことを意味する。 本発明のタンパク質を産生する植物は、植物が除草剤で処理される場合に、タンパク質発現のレベルが、植物を、除草剤に対して完全もしくは部分的に抵抗性に、または耐性にするための十分であるような、タンパク質の「有効量」を好ましく産生する（他に特定されない限り典型的な割合において；典型的な適用割合は、例えば、周知のHerbicide Handbook (Weed Science Society of America, Eighth Edition, 2002) において見い出され得る）。 除草剤は、通常の圃場使用割合および濃度において、正常に標的植物を死滅させる割合で適用され得る（本発明のために、レベルおよび/または濃度は、以前に使用されたものよりも任意により高くあり得る）。 好ましくは、本発明の植物細胞および植物は、除草剤処理によって引き起こされる生育阻害または損傷に対して保護される。 本発明の形質転換植物および植物細胞は、好ましくは、本明細書で議論されるように、除草剤に対して抵抗性または耐性にされ、このことは、形質転換植物および植物細胞が、本明細書で議論されるように、有効量の1種または複数の除草剤の存在下で生育することができることを意味する。 本発明の好ましいタンパク質は、1種または複数のアリールオキシアルカノエート化合物を代謝するための触媒活性を有する。

「抵抗性」という用語を容易に議論することはできないし、「耐性である」という動詞または「耐性の」という形容詞を容易に使用することはできない。 産業界は、除草剤抵抗性作物（HRC）対除草剤耐性作物（HTC）の議論に、膨大な時間を費やしてきた。 HTCは産業界において好まれる用語である。 しかし、米国雑草科学会（Weed Science Society of America）による公式の抵抗性の定義は、「野生型に対して通常は致死的である除草剤の用量への曝露後、植物の、遺伝性の、生存および再生する能力である。植物においては、抵抗性は、天然に存在するか、または組織培養もしくは変異誘発によって産生される変種の遺伝子操作または遺伝子選択のような技術によって誘導される可能性がある」というものである。 本明細書で使用される場合、他に示されない限り、除草剤「抵抗性」は、本開示の出願時における現行版のThe Herbicide Handbookによって示唆されるように、遺伝性であり、かつ所定の植物のための除草剤による、典型的な有効な除草性処理の存在下で、植物が生長および再生することを可能にする。 当業者によって認識されるように、たとえ除草剤曝露からのある程度の植物損傷が明白であっても、植物は、なお「抵抗性である」と見なされる可能性がある。 本明細書で使用される場合、「耐性」という用語は、「抵抗性」という用語よりも広く、本明細書で定義されるような「抵抗性」を含み、かつ同じ除草剤用量において同じ遺伝子型の野生型植物を典型的には生じる、除草剤によって誘導された種々の程度の損傷に対して特定の植物が耐える能力の改善を含む。

植物または細菌の系への機能的活性の移動は、ベクターが存在する宿主に対して適切であるタンパク質発現ベクターに組み込まれた、本発明のタンパク質についてのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むことができる。 機能的活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を得るための1つの方法は、本明細書で議論されるように、タンパク質のアミノ酸配列から推定される情報を使用して、関心対象のタンパク質を産生する細菌種からのネイティブな遺伝物質を単離することである。 このネイティブ配列は、例えば、以下でより詳細に議論されるように、植物での発現のために最適化することができる。 最適化されたポリヌクレオチドはまた、タンパク質配列に基づいて設計することもできる。

本発明は、本明細書で同定されるような新規な活性を有するタンパク質のクラスを提供する。 これらのタンパク質のクラスおよびこれらをコードするポリヌクレオチドを特徴付けするための1つの方法は、一連の特定化された条件下で、例示されたヌクレオチド配列（その相補体および/またはいずれかの鎖に由来するプローブ）とハイブリダイズするその能力によってポリヌクレオチドを定義することによるか、および/または例示された配列に由来するプライマーを使用するPCRによって増幅されるそれらの能力による。

本発明による使用のためのタンパク質を入手するための多数の方法が存在する。 例えば、本明細書に開示されるタンパク質に対する抗体が、タンパク質の混合物から他のタンパク質を同定および単離するために使用され得る。 詳細には、抗体は、他の関連するタンパク質を比較した場合に、最も保存されているか、または最も区別できるタンパク質の一部分に対して惹起されてもよい。 次いで、これらの抗体は、免疫沈殿、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ELISA）、またはイムノブロッティングによって、特徴的な活性を有する等価なタンパク質を特異的に同定するために使用することができる。 本明細書に開示されるタンパク質、または等価なタンパク質、またはこれらのタンパク質のフラグメントに対する抗体が、標準的な手順を使用して容易に調製され得る。 このような抗体は本発明の1つの局面である。 本発明の抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含み、好ましくは、例示または示唆されたタンパク質に応答して産生される。

当業者は、本発明のタンパク質（および遺伝子）が種々の供給源から入手可能であることを容易に認識する。 完全な除草剤分解オペロンは、プラスミドなどの転位可能なエレメント上にコードされることが知られており、ならびに、ゲノムに組み込まれた本発明のタンパク質は、例えば、組換えおよび/または野生型の細菌を含む、広範な種々の微生物から入手することができる。

細菌単離物の変異体は、当技術分野において周知である手法によって作製することができる。 例えば、胞子非形成変異体は、単離物のエチルメタンスルホネート（EMS）変異誘発を通して入手することができる。 これらの変異体株はまた、当技術分野において周知の手法によって、紫外光およびニトロソグアニジンを使用して作製することができる。

本明細書で言及または示唆される対象の単離物のいずれか「からの」またはそれ「から入手可能である」タンパク質は、そのタンパク質（または同様のタンパク質）が、別の細菌株または植物などの単離物またはある他の供給源から入手可能であることを意味する。 「から入手可能である」はまた、この暗示的意味を有し、例えば、植物での発現のために改変されている、所定の型の細菌から入手可能であるタンパク質を含む。 当業者は、細菌の遺伝子およびタンパク質の開示が与えられると、植物は、そのタンパク質を産生するために操作され得ることを容易に認識する。 抗体調製物、核酸プローブ（例えば、DNA、RNA、またはPNA）などは、本明細書に開示されるポリヌクレオチドおよび/またはアミノ酸配列を使用して調製され得、ならびに他の（天然の）供給源から他の関連する遺伝子をスクリーニングおよび回収するために使用され得る。

標準的な分子生物学技術は、本明細書に記載されるタンパク質および遺伝子をクローニングおよび配列決定するために使用されてもよい。 さらなる情報は、参照により本明細書に組み入れられる、Sambrook et al., 1989において見い出され得る。

ポリヌクレオチドおよびプローブ
本発明はさらに、本発明による使用のためのタンパク質をコードする核酸配列を提供する。 本発明はさらに、所望の除草剤活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を同定および特徴付けする方法を提供する。 1つの態様において、本発明は、ハイブリダイゼーションプローブおよび/またはPCR技術のためのプライマーとして有用である独特なヌクレオチド配列を提供する。 これらのプライマーは、関心対象の特定の遺伝子の同定、特徴付け、および/または単離において有用であり得る特徴的な遺伝子フラグメントを産生する。 本発明のヌクレオチド配列は、以前に記載されているタンパク質から区別できるタンパク質をコードする。

本発明のポリヌクレオチドは、所望の宿主細胞中でタンパク質またはペプチドをコードするために完全な「遺伝子」を形成するために使用することができる。 例えば、当業者が容易に認識するように、対象のポリヌクレオチドは、当技術分野において容易に公知であるように、関心対象の宿主中で、プロモーターの制御下に適切に配置され得る。 遺伝子発現および一過性/組織特異的発現のレベルは、本発明の有用性に非常に影響を与えることができる。 一般的に、分解可能な遺伝子のタンパク質発現のレベルがより大きいと、基質（この場合は標的除草剤）の完全な分解がより多くなる。 プロモーターは、高い発現が植物の健康に結果的に負の影響を有さない限り、高いレベルで標的遺伝子を発現することが所望される。 典型的には、すべての生育段階において植物の完全な保護のためにすべての組織中で構成的に発現されるAAD-12遺伝子を有することが望まれる。 しかし、代替として、植物的に発現される抵抗性遺伝子を使用してもよい。 これは、雑草制御のための作物における標的除草剤の使用を可能にし、開花段階の間に適用によって標的作物の有性生殖を引き続き制御する。 加えて、発現の所望のレベルおよび時点は、植物の型および所望の耐性のレベルにもまた依存し得る。 いくつかの好ましい態様は、転写エンハンサーなどと組み合わせた強力な構成的プロモーターを使用して、発現レベルを増加させ、かつ耐性を所望のレベルまで増強する。 このような適用のいくつかは、以下で実施例の節の前に、より詳細に議論される。

当業者が知っているように、DNAは、典型的には、二本鎖型で存在する。 この配列において、一方の鎖は他方の鎖に対して相補的であり、逆もまた同様である。 （例えば）DNAは植物中で複製されるので、DNAのさらなる相補鎖が産生される。 「コード鎖」は、しばしば、アンチセンス鎖と結合する鎖をいうために当技術分野において使用される。 mRNAは、DNAの「アンチセンス」鎖から転写される。 「センス」鎖または「コード」鎖は、オープンリーディングフレーム（ORF）として読み取られることができ、関心対象のタンパク質またはペプチドを形成する一連のコドン（コドンは、特定のアミノ酸を特定するための3残基単位として読まれ得る3つのヌクレオチドである）を有する。 インビボでタンパク質を産生するために、DNAの鎖は、典型的には、タンパク質のための鋳型として使用されるmRNAの相補鎖に転写される。 従って、本発明は、相補鎖を含む、添付の配列表および/または等価物に示される例示されるポリヌクレオチドの使用を含む。 例示されたDNA分子に対して機能的に等価であるRNAおよびPNA（ペプチド核酸）は本発明に含まれる。

本発明の1つの態様において、細菌単離物は、微生物の高い増殖を生じる条件下で培養され得る。 一本鎖ゲノム核酸を提供するために微生物を処理した後、DNAは、本発明のプライマーと接触され得、PCR増幅に供され得る。 関心対象の遺伝子の特徴的なフラグメントは、この手法によって増幅され、従って、関心対象の遺伝子の存在を同定する。

本発明のさらなる局面は、本明細書に開示される方法およびヌクレオチド配列を使用して同定された遺伝子および単離物を含む。 このように同定された遺伝子は、本発明の除草剤抵抗性タンパク質をコードすることができる。

本発明によるタンパク質および遺伝子は、例えば、オリゴヌクレオチドプローブを使用することによって同定および入手することができる。 これらのプローブは、適切な標識によって検出可能であり得るか、または国際出願番号WO 93/16094において記載されているように、固有に蛍光性に作製されてもよい、検出可能なヌクレオチド配列である。 これらのプローブ（および本発明のポリヌクレオチド）は、DNA、RNA、またはPNAであってもよい。 アデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）、チミン（T）、およびウラシル（U；RNA分子用）に加えて、本発明の合成プローブ（およびポリヌクレオチド）はまた、イノシン（4種すべての塩基と対合することが可能な中性塩基；時折、合成プローブ中で4種すべての塩基の混合物の代わりに使用される）および/または合成（非天然）塩基を有することができる。 従って、合成の、縮重オリゴヌクレオチドが本明細書で言及される場合、「N」または「n」が総称的に使用され、「N」または「n」は、G、A、T、C、またはイノシンであり得る。 曖昧なコードは、本明細書で使用されるように、本願の出願の時点の標準IUPAC命名法の慣例に従っている（例えば、RはAまたはGを意味し、YはCまたはTを意味する、など）。

当技術分野において周知であるように、プローブ分子が核酸試料にハイブリダイズする場合には、プローブおよび試料が実質的な相同性/類似性/同一性を有することが合理的に推測され得る。 好ましくは、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、例えば、Keller, GH, MM Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, NY, pp. 169-170によって記載されるような、当該分野において周知の技術によって、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションが最初に行われ、続いて、低ストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、または高ストリンジェンシーの条件下での洗浄が行われる。 例えば、そこに言及されているように、低ストリンジェンシー条件は、2×SSC（標準生理食塩水クエン酸）/0.1% SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を用いる、室温にて15分間の最初の洗浄によって達成され得る。 2回の洗浄が典型的には実行される。 次いで、より高いストリンジェンシーが、塩濃度を低下させることによって、および/または温度を上昇させることによって達成され得る。 例えば、上記に記載される洗浄は、各々、0.1×SSC/0.1% SDSを用いる室温における15分間の2回の洗浄が続き得、これには、各々、0.1×SSC/0.1% SDSを用いる55℃における30分間の洗浄が続く。 これらの温度は、本明細書に示され、かつ当業者に公知であるような他のハイブリダイゼーションおよび洗浄のプロトコールとともに使用することができる（例えば、SSPEは、SSCの代わりに塩として使用することができる）。 2×SSC/0.1% SDSは、445mlの水に、50mlの20×SSCおよび5mlの10% SDSを加えることによって調製することができる。 20×SSCは、NaCl（175.3g/0.150M）、クエン酸ナトリウム（88.2g/0.015M）、および水を合わせ、10N NaOHでpHを7.0に調整し、次いで、体積を1リットルに調整することによって調製することができる。 10% SDSは、オートクレーブした50mlの水中に10gのSDSを溶解すること、次いで100mlに希釈することによって調製することができる。

プローブの検出は、ハイブリダイゼーションが維持されたか否かを公知の様式で決定するための手段を提供する。 このようなプローブ分析は、本明細書の遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。 本発明によるプローブとして使用されるヌクレオチドセグメントは、DNAシンセサイザーおよび標準的な手法を使用して合成することができる。 これらのヌクレオチド配列はまた、本発明の遺伝子を増幅するためのPCRプライマーとして使用することができる。

分子のハイブリダイゼーション特性は、本発明のポリヌクレオチドを定義するために使用することができる。 従って、本発明は、本明細書で例示されるポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド（および/またはそれらの相補体、好ましくはそれらの完全な相補体）を含む。 すなわち、遺伝子（およびそれがコードするタンパク質）を定義するための1つの方法は、例えば、公知のまたは特に例示される遺伝子と（本明細書に具体的に開示されるいずれかの条件下で）ハイブリダイズするその能力による。

本明細書で使用されるように、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな」条件とは、現在の出願者によって使用される条件と同じかまたはほぼ同じである、ハイブリダイゼーションの特異性の程度を達成する条件をいう。 具体的には、 ³² P-標識された遺伝子特異的プローブとの、サザンブロット上に固定化されたDNAのハイブリダイゼーションは、標準的な方法によって実行することができる（例えば、Maniatis et al. 1982を参照されたい）。 一般的に、ハイブリダイゼーションおよび引き続く洗浄は、標的配列の検出を可能にする条件下で実行することができる。 二本鎖DNA遺伝子プローブについては、ハイブリダイゼーションは、6×SSPE、5×Denhardt's溶液、0.1% SDS、0.1mg/ml変性DNA中で、DNAハイブリッドの融解温度（Tm）よりも20〜25℃下で、一晩実行することができる。 融解温度は以下の数式によって記載される（Beltz et al. 1983）。
Tm = 81.5 C + 16.6 Log [Na+] + 0.41(%G+C) - 0.61(ホルムアルデヒド%) - 600/塩基対中の二重鎖の長さ。

洗浄は、典型的には、以下のように実行することができる。
（1）1×SSPE、0.1% SDS中での室温で15分間、2回（低ストリンジェンシー洗浄）。
（2）0.2×SSPE、0.1% SDS中でのTm-20℃で15分間、1回（中程度ストリンジェンシー洗浄）。

オリゴヌクレオチドプローブについては、ハイブリダイゼーションは、6×SSPE、5×Denhardt's溶液、0.1% SDS、0.1mg/ml変性DNA中で、ハイブリッドの融解温度（Tm）よりも10〜20℃下で、一晩実行することができる。 融解温度は以下の数式によって決定することができる。
Tm（℃）= 2（T/A塩基対の数）+ 4（G/C塩基対の数）（Suggs et al., 1981）。

洗浄は、典型的には、以下のように実行することができる。
（1）1×SSPE、0.1% SDS中での室温で15分間、2回（低ストリンジェンシー洗浄）。
（2）1×SSPE、0.1% SDS中でのハイブリダイゼーション温度で15分間、1回（中程度ストリンジェンシー洗浄）。

一般的に、塩および/または温度は、ストリンジェンシーを変化させるために変更することができる。 >70程度の塩基長の標識したDNAフラグメントを用いる場合、以下の条件が使用され得る。
低：1または2×SPPE、室温 低：1または2×SSPE、42℃
中程度：0.2×または1×SSPE、65℃
高：0.1×SSPE、65℃。

二重鎖の形成および安定性は、ハイブリッドの2本の鎖の間の実質的な相補性に依存し、上記に記述されるように、特定の程度のミスマッチが許容され得る。 それゆえに、本発明のプローブ配列は、記載された配列の変異（単一と複数の両方）、欠失、挿入、およびこれらの組み合わせを含み、ここで、該変異、挿入、および欠失は、関心対象の標的ポリヌクレオチドとの安定なハイブリッドの形成を許容する。 変異、挿入、および欠失は、多くの方法で所定のポリヌクレオチド配列中で産生され得るが、これらの方法は当業者に公知である。 他の方法は将来知られるようになる可能性がある。

PCR技術
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、反復性の、酵素的な、プライマーを用いる、核酸配列の合成である。 この手法は周知であり、当業者によって一般的に使用されている（Mullis, 米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号、および同第4,800,159号; Saiki et al., 1985を参照されたい）。 PCRは、標的配列の反対の鎖にハイブリダイズする2つのオリゴヌクレオチドプライマーによって隣接される関心対象のDNAフラグメントの酵素的増幅に基づく。 これらのプライマーは、好ましくは、3'末端が互いに対して向けられて配置される。 鋳型の熱変性、それらの相補的配列へのプライマーのアニーリング、およびDNAポリメラーゼを用いてのアニールされたプライマーの伸長は、PCRプライマーの5'末端によって規定されるセグメントの増幅を生じる。 各プライマーの伸長産物は、他のプライマーのための鋳型として働くことができ、従って、各サイクルは、以前のサイクルで産生されたDNAフラグメントの量を本質的に倍加させる。 これにより、特定の標的フラグメントの指数関数的な蓄積が、数時間以内に数百万倍にまでになる。 耐熱性細菌サーマス アクアティカス（Thermus aquaticus）から単離されたTaqポリメラーゼなどの耐熱性DNAポリメラーゼを使用することによって、この増幅プロセスは、完全に自動化することができる。 使用することができる他の酵素は、当業者に知られている。

例示されるDNA配列、またはそのセグメントは、PCR増幅のためのプライマーとして使用することができる。 PCR増幅を実行する際に、特定の程度のミスマッチが、プライマーと鋳型の間に許容され得る。 それゆえに、例示されたプライマーの変異、欠失、および挿入（とりわけ、5'末端へのヌクレオチドの付加）は、本発明の範囲内にある。 変異、欠失、および挿入は、当業者に公知である方法によって、所定のプライマー中で作製することができる。

遺伝子およびタンパク質の改変
対象の遺伝子およびタンパク質は、キメラタンパク質または融合タンパク質を産生するために、他の遺伝子およびタンパク質に融合され得る。 本発明に従って有用な遺伝子およびタンパク質は、特に例示された全長配列のみならず、これらの配列、これらの配列の変種、変異体、キメラ、ならびに融合物の一部分、セグメント、および/またはフラグメント（隣接するフラグメント、ならびに全長分子と比較して内部および/または末端の欠失を含む）。 本発明のタンパク質は、これらが所望の機能的活性を保持する限りは、置換されたアミノ酸を有することができる。 「変種」遺伝子は、例示されたタンパク質に対して等価であるかまたは類似している活性を有する、同じタンパク質または等価なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。

ネイティブaad-12ヌクレオチド配列とのBLAST検索の上端の2つの結果は、120塩基対の配列全体の合理的なレベルの相同性（約85%）を示す。 特定の条件下でのハイブリダイゼーションは、これら2つの配列を含むことを予測することができた。 GENBANKアクセッション番号DQ406818.1（89329742；ロドフェラックス（Rhodoferax）およびAJ6288601.1（44903451；スフィンゴモナス（Sphingomonas）を参照されたい。ロドフェラックスはデルフィチアと非常に類似しているが、スフィンゴモナスは系統学的に完全に異なるクラスである。

「変種タンパク質」および「等価なタンパク質」という用語は、標的基質に対して同じかまたは本質的に同じ生物学的/機能的活性、および例示されたタンパク質と等価な配列を有するタンパク質をいう。 本明細書で使用されるように、「等価な」配列との言及は、有意な程度にまで活性を改善し、または活性に有害な影響を与えない、アミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入を有する配列をいう。 活性を保持しているフラグメントもまた、この定義の中に含まれる。 例示されたタンパク質の対応するフラグメントと同じかまたは同様の機能または活性を保持するフラグメントおよび他の等価物は、本発明の範囲内にある。 アミノ酸の置換または付加などの変化は、例えば、（タンパク質の機能的活性を具体的に/実質的に減少することなく）タンパク質のプロテアーゼ安定性を増加すること（もしくは減少すること）、または制限部位の付加などの種々の目的のために作製することができる。 遺伝子のバリエーションは、例えば、点変異を作製するための標準的な技術を使用して容易に構築されてもよい。

加えて、例えば、米国特許第5,605,793号は、ランダムなまたは的を絞ったフラグメント化後にDNA再アセンブリーを使用することによって、さらなる分子の多様性を生成するための方法を記載している。 これは、「遺伝子シャッフリング」と呼ぶことができ、これは、典型的には、複数の異なるDNA分子のフラグメントを混合する工程、続いて、再生の反復ラウンドを含む。 これは、開始遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を改善することができる。 この結果は、改善された活性、変化した基質特異性、増加した酵素安定性、変化した立体特異性、または他の特徴を有するキメラタンパク質である。

「シャッフリング」は、関心対象タンパク質の原子3D（三次元）配位および結晶構造を入手および精査後に、設計および標的化され得る。 従って、「集中シャッフリング」は、表面に露出しているセグメントなどの、改変のために理想的であるタンパク質の特定のセグメントに向けることができ、好ましくは、タンパク質フォールディングおよび必須の3D構造の完全性と関連する内部セグメントではない。

酵素の「活性部位」への特定の変化は、活性または立体特異性に関して、固有の機能性に影響を与えるように作製することができる（図2のアラインメントを参照されたい）。 Muller et. al. (2006)。 既知のtauD結晶構造は、その固有の基質タウリンに結合しながら、活性部位残基を決定するためにモデルジオキシゲナーゼとして使用された。 Elkins et al. (2002)「X-ray crystal structure of Escerichia coli taurine/alpha-ketoglutarate dioxygenase complexed to ferrous iron and substrates」Biochemistry 41(16):5185-5192。 酵素活性部位の配列最適化および設計能力に関しては、Chakrabarti et al., PNAS, (Aug. 23, 2005), 102(34):12035-12040を参照されたい。

変種遺伝子は、変種タンパク質を産生するために使用することができる。 組換え宿主は、変種タンパク質を産生するために使用することができる。 これらの「遺伝子シャッフリング」技術を使用して、本発明に例示される任意の配列の任意の5個、10個、または20個連続する残基（アミノ酸またはヌクレオチド）を含む、等価な遺伝子およびタンパク質が構築され得る。 当業者が知っているように、例えば、遺伝子シャッフリング技術は、例示されたかまたは示唆された配列（またはその相補体（完全な相補体））のいずれかにおける（同じサイズの）セグメントに対応する、例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、または293個の連続する残基（アミノ酸またはヌクレオチド）を有する、等価物を得るために調整することができる。 同様のサイズのセグメント、とりわけ、保存領域についてのものもまた、プローブおよび/またはプライマーとして使用することができる。

全長遺伝子のフラグメントは、標準的な手法に従って、市販のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを使用して作製することができる。 例えば、Bal31などの酵素または部位特異的変異誘発が、これらの遺伝子の末端からヌクレオチドを体系的に切断するために使用することができる。 また、活性フラグメントをコードする遺伝子は、種々の制限酵素を使用して入手されてもよい。 プロテアーゼが、これらの活性フラグメントを直接的に入手するために使用されてもよい。

タンパク質が短縮され、なお機能的活性を保持し得ることは、本明細書に開示されるように、本発明の範囲内にある。 「短縮型タンパク質」は、残りの短縮されたタンパク質が、切断後に所望の活性を保持し、かつその活性を示しながら、タンパク質の一部分が切断可能であることを意味する。 切断は、種々のプロテアーゼによって達成することができる。 さらに、効率的に切断されたタンパク質は、分子生物学的技術を使用して産生することができ、ここで、該タンパク質をコードするDNA塩基は、制限エンドヌクレアーゼまたは当業者に使用可能である他の技術のいずれかを通して除去される。 短縮化後、該タンパク質は、大腸菌、バキュロウイルス、植物を用いるウイルス系、酵母などのような異種系において発現することができ、次いで、活性を測定するために本明細書に開示されるように昆虫アッセイ法に配置することができる。 短縮型タンパク質は、これらが完全な全長配列よりも短いものを有しながら、機能的活性を保持するように首尾よく産生され得ることは、当技術分野において周知である。 例えば、Btタンパク質は、短縮（コアタンパク質）型で使用することができる（例えば、Hofte et al. (1989)、およびAdang et al. (1985)を参照されたい）。 本明細書で使用されるように、「タンパク質」という用語は、機能的に活性な短縮型を含むことができる。

ある場合において、とりわけ、植物における発現のために、短縮型タンパク質を発現する短縮型遺伝子を使用することが有利であり得る。 好ましい短縮型遺伝子は、典型的には、全長タンパク質の40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99%をコードする。

本明細書の特定のタンパク質は、具体的に本明細書に例示されてきた。 これらのタンパク質は本発明のタンパク質のまれな例であるので、本発明が、例示されたタンパク質の同じかまたは同様の活性を有する変種または等価なタンパク質（およびその等価物をコードするヌクレオチド配列）を含むことは容易に明らかであるはずである。 等価なタンパク質は、例示されるタンパク質とアミノ酸類似性（および/または相同性）を有する。 アミノ酸同一性は、典型的には、少なくとも60%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%であり、および少なくとも95%であり得る。 好ましい本発明のタンパク質はまた、より特定には同一性および/または類似性の範囲によって定義することができる。 例えば、同一性および/または類似性は、本明細書で例示または示唆される配列と比較して、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99%であり得る。 上記に列挙した任意の数字が、上限および下限を定義するために使用され得る。

他に特定されない限り、本明細書で使用されるように、2つの核酸の配列同一性パーセントおよび/または配列類似性パーセントは、Karlin and Altschul 1993において改変された、Karlin and Altschul, 1990のアルゴリズムを使用して決定される。 このようなアルゴリズムは、Altschul et al., 1990のNBLASTプログラムおよびXBLASTプログラムに組み込まれている。 BLASTヌクレオチド検索は、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12を用いて実行される。 ギャップ付きBLASTは、Altschul et al., 1997において記載されるように使用され得る。 BLASTプログラムおよびギャップ付きBLASTプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（NBLASTおよびXBLAST）のデフォルトパラメーターが使用される。 NCBI/NIHウェブサイトを参照されたい。 比較目的のためにギャップ付きアラインメントを得るために、Vector NTI Suite 8（InforMax, Inc. , North Bethesda, MD, USA）のAlignX機能が、デフォルトパラメーターを用いて使用された。 これらは、15のギャップオープニングペナルティー、6.66のギャップ伸長ペナルティー、および8のギャップ分離ペナルティーであった。

タンパク質の種々の特性および三次元的な特徴もまた、タンパク質の活性/機能性に有害な影響を与えることなく、変化させることができる。 保存性アミノ酸置換は、分子の活性および/または三次元配置に有害な影響を与えないように、許容/作製することができる。 アミノ酸は、以下のクラスに入れることができる：非極性、非荷電極性、塩基性、および酸性。 それによって1つのクラスのアミノ酸が同じ型の別のアミノ酸で置換される保存性置換は、その置換が化合物の生物学的活性に有害でない限り、本発明の範囲内にある。 表2は、各クラスに属するアミノ酸の例の列挙を提供する。

（表２）

ある例において、非保存性置換もまた、作製することができる。 しかし、好ましい置換は、タンパク質の機能的/生物学的活性を有意に損なわない。

本明細書で使用されるように、「単離された」ポリヌクレオチドおよび/または「精製された」タンパク質との言及は、それらが天然に一緒に見い出される他の分子を伴っていない場合のこれらの分子をいう。 従って、「単離された」および/または「精製された」との言及は、本明細書に記載されるように、「人の手」の関与を意味する。 例えば、発現のために植物に配置された本発明の細菌の「遺伝子」は「単離されたポリヌクレオチド」である。 同様に、細菌タンパク質に由来し、かつ植物によって産生されるタンパク質は、「単離されたタンパク質」である。

遺伝コードの縮重/冗長性のために、種々の異なるDNA配列が、本明細書に開示されるアミノ酸配列をコードし得る。 同じ、または本質的に同じタンパク質をコードする代替的なDNA配列を作製することは、十分に当業者の技量の範囲内にある。 これらの変種DNA配列は本発明の範囲内にある。 これはまた、「植物における発現のための配列の最適化」という表題の節においてより詳細に議論される。

植物における発現のための配列の最適化
植物での異種遺伝子の高発現を得るために、遺伝子が植物細胞（の細胞質）においてより効率的に発現されるように、その遺伝子を再操作することが一般的に好ましい。 トウモロコシは、1つのこのような植物であり、ここでは、該植物で遺伝子の発現レベルを増加させるために、形質転換の前に異種遺伝子を再設計することが好ましい場合がある。 それゆえに、細菌タンパク質をコードする遺伝子の設計における追加の工程は、双子葉植物種または単子葉植物種に関わらず、標的植物配列とより密接に整列されるコドンの偏りを使用する、最適な発現のための異種遺伝子の再操作である。 配列はまた、本明細書の別の箇所で議論される、より特定な型の植物のいずれかにおける発現のために最適化することができる。

トランスジェニック宿主
本発明のタンパク質をコードする遺伝子は、広範な種々の微生物または植物の宿主に導入することができる。 本発明は、トランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物を含む。 好ましい植物（および植物細胞）は、トウモロコシ、アラビドプシス、タバコ、ダイズ、ワタ、アブラナ、イネ、コムギ、芝草、マメ科飼草（アルファルファおよびクローバー）、および牧草などである。 他の型のトランスジェニック植物、例えば、果物、野菜、観賞用植物、および木もまた、本発明に従って作製することができる。 より一般的には、双子葉植物および/または単子葉植物は、本発明の種々の局面において使用することができる。

好ましい態様において、遺伝子の発現は、直接的または間接的に、関心対象のタンパク質の細胞内産生（および維持）を生じる。 植物は、この様式で、除草剤抵抗性にされ得る。 このような宿主は、トランスジェニック、組換え、形質転換された、および/またはトランスフェクトされた、宿主および/または細胞と呼ばれ得る。 本発明のある局面において（例えば、関心対象の遺伝子をクローニングおよび調製する場合）、微生物（好ましくは、細菌）細胞が、本開示の恩典を伴って、標準的な技術に従って、産生および使用され得る。

本発明のポリヌクレオチドでトランスフェクトされた植物細胞は、全植物に再生することができる。 本発明は、組織細胞培養、液体培養、およびプレート培養を含む、細胞培養を含む。 本発明の植物を生成するために産生および/または使用される種子もまた、本発明の範囲内に含まれる。 他の植物組織および部分もまた、本発明に含まれる。 本発明は、同様に、本発明のポリヌクレオチドを含む植物または細胞を産生する方法を含む。 このような植物を産生する1つの好ましい方法は、本発明の種子を植えることによる。

植物が好ましくあり得るが、本発明は、例えば、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）（Pf）宿主株における高度に活性な組換えAAD-12の産生もまた含む。 本発明は、この宿主中での可溶性活性AAD-12を維持するための好ましい増殖温度；AAD-12が40%より多い全細胞タンパク質、または少なくとも10g/Lとして産生される場合の発酵条件；Pf宿主からの活性組換えAAD-12の高い回収率をもたらす精製プロセス；細胞のkgあたり少なくとも10 gの活性AAD-12を生じる精製スキーム；細胞のkgあたり20gの活性AAD-12を生じ得る精製スキーム；溶液中でAAD-12活性を保存および回復し得る製剤化プロセス；ならびに長期保存および有効期間の間AAD-12活性を保持し得る凍結乾燥プロセスを含む。

トランスジェニック宿主を形成するための遺伝子の挿入
本発明の種子の1つの局面は、本発明のタンパク質を発現する本発明のポリヌクレオチドを用いる、植物、植物種子、および他の宿主細胞の形質転換/トランスフェクションである。 この様式で形質転換された植物は、異なる作用の様式を有する種々の除草剤に対して抵抗性にされ得る。

広範な種々の方法が、遺伝子の安定な維持および発現を可能にする条件下で、標的宿主に、所望のタンパク質をコードする遺伝子を導入するために使用可能である。 これらの方法は当業者に周知であり、例えば、米国特許第5,135,867号において記載されている。

AAD-12ポリヌクレオチドを含むベクターは本発明の範囲に含まれる。 例えば、大腸菌における複製系および形質転換細胞の選択を可能にするマーカーを含む多数のクローニングベクターが、高等植物への外来性遺伝子の挿入の調製のために使用可能である。 これらのベクターには、例えば、pBR322、pUCシリーズ、M13mpシリーズ、pACYC184などが含まれる。 従って、タンパク質をコードする配列は、適切な制限部位でベクターに挿入することができる。 得られるプラスミドは、大腸菌への形質転換のために使用される。 大腸菌細胞は、適切な栄養培地中で培養され、次いで収集および溶解される。 プラスミドは、ゲノムDNAからの精製によって回収される。 配列分析、制限分析、電気泳動、および他の生化学的-分子生物学的方法が、分析の方法として一般的に実行される。 各操作の後、使用されるDNA配列は、制限消化し、および次のDNA配列に連結することができる。 各プラスミド配列は、同じかまたは他のプラスミドにクローニングすることができる。 植物に所望の遺伝子を挿入する方法に依存して、他のDNA配列が必要である可能性がある。 例えば、TiまたはRiプラスミドが植物細胞の形質転換のために使用される場合には、TiまたはRiプラスミドT-DNAの少なくともライトボーダー、しかししばしば、ライトボーダーおよびレフトボーダーが、挿入される遺伝子の隣接領域として連結されなければならない。 植物細胞の形質転換のためのT-DNAの使用は、EP 120 516; Hoekema (1985); Fraley et al. (1986); およびAn et al. (1985)において徹底的に調査および記載されてきた。

多数の技術が、植物宿主細胞にDNAを挿入するために使用可能である。 これらの技術には、形質転換因子としてのアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）使用するT-DNAを用いる形質転換、融合、注入、微粒子銃（微粒子射撃）、シリコンカーバイトウィスカー、エアロゾルビーム、PEG、またはエレクトロポレーション、ならびに他の可能な方法が含まれる。 アグロバクテリアが形質転換のために使用される場合、挿入されるDNAは、特別なプラスミド、すなわち、中間体ベクターまたはバイナリーベクターのいずれかにクローニングされなければならない。 この中間体ベクターは、T-DNA中の配列に対して相同である配列による相同組換えによって、TiまたはRiプラスミドに組み込まれ得る。 TiまたはRiプラスミドはまた、T-DNAの移入のために必要であるvir領域を含む。 中間体ベクターは、アグロバクテリア中でそれ自体複製することはできない。 中間体ベクターは、ヘルパープラスミド（接合）によって、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに移入され得る。 バイナリーベクターは、大腸菌とアグロバクテリアの両方の中でそれ自体複製することができる。 これらは、選択マーカー遺伝子、ならび右側および左側の、T-DNAボーダー領域によってフレーム形成される、リンカーまたはポリリンカーを含む。 これらは、アグロバクテリアに直接的に形質転換され得る（Holsters, 1978）。 宿主細胞として使用されるアグロバクテリウムは、vir領域を有するプラスミドを含む。 このvir領域は、植物細胞へのT-DNAの移入のために必要である。 さらなるT-DNAが含まれてもよい。 このように形質転換された細菌は、植物細胞の形質転換のために使用される。 植物移植片は、植物細胞へのDNAの移入のために、アグロバクテリウム・ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲネスとともに有利に培養することができる。 次いで、全植物は、選択のために抗生物質または殺生物剤を含んでもよい適切な培地中で、感染された植物材料（例えば、葉の小片、茎のセグメント、根であるが、しかしプロトプラストまたは懸濁培養細胞もまた）から再生され得る。 次いで、このように得られた植物は、挿入されたDNAの存在について試験することができる。 特別な要求は、注入およびエレクトロポレーションの場合にはなされない。 通常のプラスミド、例えば、pUC誘導体などを使用することが可能である。

形質転換細胞は、通常の様式で植物の内部で成長する。 これらは、胚細胞を形成し、子孫の植物に形質転換形質を伝達することができる。 このような植物は、通常の様式で生育させることができ、同じ形質転換された遺伝性因子または他の遺伝性因子を有する植物と交雑させることができる。 得られる雑種個体は、対応する表現型特性を有する。

本発明のある好ましい態様において、細菌タンパク質をコードする遺伝子は、植物ゲノムに挿入された転写単位から発現される。 好ましくは、該転写単位は、植物ゲノムへの安定な組み込みが可能である組換えベクターであり、タンパク質をコードするmRNAを発現する形質転換された植物系統の選択を可能にする。

一旦、挿入されたDNAがゲノムに組み込まれたら、それはそこで比較的安定である（かつそこから再び出ることはない）。 これは、殺生物剤または抗生物質、とりわけ、カナマイシン、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、またはクロラムフェニコールなどに対する抵抗性を、形質転換植物細胞に付与する選択マーカーを通常含む。 植物選択マーカーはまた、典型的には、グルホシネート、（例えば、PAT/bar）、グリホセート（EPSPS）、ALS阻害剤（例えば、イミダゾリノン、スルホニルウレア、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド）、ブロモキシニル、HPPD阻害剤耐性、PPO阻害剤、ACCアーゼ阻害剤などのような種々の除草剤に対する抵抗性を提供することができる。 個々に使用されるマーカーは、従って、挿入されたDNAを含まない細胞以外の形質転換細胞の選択を可能にするはずである。 関心対象の遺伝子は、植物細胞において、構成的または誘導性のいずれかのプロモーターによって好ましく発現される。 一旦発現されると、mRNAはタンパク質に翻訳され、それによって、関心対象のアミノ酸をタンパク質に組み込む。 植物細胞において発現されるタンパク質をコードする遺伝子は、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、または誘導性プロモーターの制御下にあり得る。

植物細胞に外来性の組換えベクターを導入するため、および導入された遺伝子を安定に維持および発現する植物を入手するためのいくつかの技術が存在している。 このような技術には、微粒子上にコートされた遺伝物質の細胞への直接的な導入が含まれる（Cornellに対する米国特許第4,945,050号、およびDowElanco、現在はDow AgroSciences, LLCに対する米国特許第5,141,131号）。 加えて、植物は、アグロバクテリウム技術、以下を参照されたい：University of Toledoに対する米国特許第5,177,010; Texas A&Mに対する米国特許第5,104,310号; 欧州特許出願第0131624B1号; Schilperootに対する欧州特許出願第120516号、同第159418Bl号および同第176,112号; Schilperootに対する米国特許第5,149,645、同第5,469,976号、同第5,464,763号および同第4,940,838号および同第4,693,976号; すべてMax Planckに対する欧州特許出願第116718号、同第290799号、同第320500号; 日本たばこ産業（Japan Tobacco）に対する欧州特許出願第604662号および同第627752号、ならびに米国特許第5,591,616号; Ciba Geigy、現在Syngentaに対する欧州特許出願第0267159号および同第0292435号、ならびに米国特許第5,231,019号; 両方ともCalgeneに対する米国特許第5,463,174号および同第4,762,785号; ならびに両方ともAgracetusに対する米国特許第5,004,863号および同第5,159,135号を使用して形質転換されてもよい。 他の形質転換技術には、ウィスカー技術が含まれる。 両方ともZeneca、現在Syngentaに対する米国特許第5,302,523号および同第5,464,765号を参照されたい。 他の直接DNA輸送形質転換技術には、エアロゾルビーム技術が含まれる。 米国特許第6,809,232を参照されたい。 エレクトロポレーション技術もまた、植物を形質転換するために使用されてきた。 Boyce Thompson Instituteに対するWO 87/06614; 両方ともDekalbに対する米国特許第5,472,869号および同第5,384,253号; ならびに両方ともPlant Genetic Systemsに対するWO 92/09696およびWO93/21335を参照されたい。 さらに、ウイルスベクターもまた、関心対象のタンパク質を発現するトランスジェニック植物を産生するために使用することができる。 例えば、単子葉植物は、Mycogen Plant ScienceおよびCiba-Geigy（現在はSyngenta）に対する米国特許第5,569,597号ならびに両方ともBiosource、現在Large Scale Biologyに対する米国特許第5,589,367号および同第5,316,931号に記載されている方法を使用して、ウイルスベクターで形質転換することができる。

以前に言及したように、DNA構築物が植物宿主に導入される様式は、本発明にとって決定的ではない。 効率的な形質転換を提供する任意の方法が使用されてもよい。 例えば、植物細胞形質転換のための種々の方法が本明細書に記載され、これには、TiまたはRi-プラスミド、およびアグロバクテリウム媒介形質転換を実行するための同様のものの使用が含まれる。 多くの場合において、T-DNAボーダー、より特定にはライトボーダーによって、一方または両方の側で境界を接する、形質転換のために使用される構築物を有することが所望される。 これは、構築物が、形質転換のための様式としてアグロバクテリウム・ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲネスを使用する場合に特に有用であるが、T-DNAボーダーは、形質転換の他の様式を用いる使用を見い出し得る。 アグロバクテリウムが植物細胞形質転換のために使用される場合、宿主中に存在するT-DNAまたはTiもしくはRiプラスミドとの相同組換えのために宿主に導入され得るベクターが使用され得る。 ベクターの導入は、エレクトロポレーション、3ペアレント接合、および当業者に公知であるグラム陰性細菌を形質転換するための他の技術を介して実行されてもよい。 アグロバクテリウム宿主へのベクター形質転換の様式は、本発明にとって決定的ではない。 組換えのためのT-DNAを含むTiまたはRiプラスミドは、こぶ形成を引き起こすことが可能であるか、または可能でなくてもよく、vir遺伝子が該宿主中に存在している限り、本発明には決定的ではない。

アグロバクテリウムが形質転換のために使用されるいくつかの場合において、T-DNAボーダー中にある発現構築物は、Ditta et al. (1980) およびEPO 0 120 515に記載されるようなpRK2またはその誘導体などの広い範囲のベクターに挿入される。 形質転換されたアグロバクテリウムおよび形質転換された植物細胞の選択を可能にする、本明細書に記載されるような1種または複数のマーカーが、発現構築物およびT-DNAに含まれる。 使用される特定のマーカーは、本発明にとって本質的ではなく、好ましいマーカーは、使用される宿主および構築物に依存する。

アグロバクテリウムを使用する植物細胞の形質転換のために、移植片は、その形質転換を可能にするために十分な時間の間、形質転換されたアグロバクテリウムと合わされ、かつインキュベートされてもよい。 形質転換後、アグロバクテリアは適切な抗生物質を用いる選択によって死滅され、植物細胞は適切な選択培地を用いて培養される。 一旦、カルスが形成されると、シュート形成は、植物組織培養および植物再生の分野で周知である方法に従って、適切な植物ホルモンを使用することによって促進され得る。 しかし、カルスの中間段階が常に必要であるわけではない。 シュート形成後、該植物細胞は、シュート形成を促進する培地に移すことができ、それによって、植物再生を完了する。 次いで、植物は、種子に生育され得、該種子は、将来の世代を樹立するために使用され得る。 形質転換技術に関わらず、細菌タンパク質をコードする遺伝子は、ベクター中に植物プロモーター調節エレメント、ならびにNosなどのような3'-非翻訳転写終結領域を含めることによって、植物細胞において該遺伝子を発現するように適合された遺伝子移入ベクターに好ましく組み込まれる。

植物を形質転換するための多数の技術に加えて、外来性遺伝子を接触される組織の型は、同様に変化してもよい。 このような組織には、胚形成組織、I、II、およびIII型カルス組織、胚軸、成長点、根組織、師部における発現のための組織などが含まれるがこれらに限定されない。 ほぼすべての植物組織が、本明細書に記載される適切な技術を使用して、脱分化の間に形質転換されてもよい。

上記に言及したように、所望される場合、種々の選択マーカーを使用することができる。 選択マーカーの優先度は当業者の方針であるが、以下の選択マーカーが、選択マーカーとして機能することができる、本明細書に列挙されていない任意の他の遺伝子とともに使用されてもよい。 このような選択マーカーには、抗生物質カナマイシン、ネオマイシンおよびG41に対する抵抗性をコードするトランスポゾンTn5（Aph II）のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子；ハイグロマイシン抵抗性；メトトレキセート抵抗性；ならびにグリホセートに対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子；ホスフィノトリシン（ビアラフォスまたはグルホシネート）；ALS阻害除草剤（イミダゾリノン、スルホニルウレア、およびトリアゾロピリミジン除草剤）、ACCアーゼ阻害剤（例えば、アリールオキシプロピオネートまたはシクロヘキサンジオン）など、例えば、ブロモキシニルおよびHPPD阻害剤（例えば、メソトリオン）などに対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子が含まれるがこれらに限定されない。

選択マーカーに加えて、レポーター遺伝子を加えることが望ましくあり得る。 いくつかの例において、レポーター遺伝子は、選択マーカーとともに、または選択マーカーなしで使用されてもよい。 レポーター遺伝子は、典型的には、レシピエントの生物または組織には存在せず、かつ典型的には、ある表現型の変化または酵素的特性を生じるタンパク質をコードする遺伝子である。 このような遺伝子の例は、Weising et al., 1988において提供される。 好ましいレポーター遺伝子には、大腸菌のuidA遺伝子座のβ-グルクロニダーゼ（GUS）、大腸菌のTn9からのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、生物発光クラゲ、エクオレア ビクトリア（Aequorea victoria）からの緑色蛍光タンパク質、およびホタル、フォチヌス ピラリス（Photinus pyralis）からのルシフェラーゼ遺伝子が含まれる。 次いで、レポーター遺伝子発現を検出するためのアッセイ法は、該遺伝子がレシピエント細胞に導入された後の適切な時点で実行され得る。 好ましいこのようなアッセイ法は、形質転換細胞を同定するために、Jefferson et al., (1987)によって記載されるような、大腸菌のuidA遺伝子座のβ-グルクロニダーゼ（GUS）をコードする遺伝子の使用を必要とする。

植物プロモーター調節エレメントに加えて、種々の供給源からのプロモーター調節エレメントが、外来性遺伝子を発現するために、植物細胞において効率的に使用され得る。 例えば、細菌起源のプロモーター調節エレメント、例えば、オクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、マンノピンシンターゼプロモーター；ウイルス起源のプロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（35Sおよび19S）、35T（これは、再操作された35Sプロモーターである、米国特許第6,166,302号、とりわけ実施例7Eを参照されたい）などが使用されてもよい。 植物プロモーター調節エレメントには、リブロース-1,6-ビスリン酸（RUBP）カルボキシラーゼスモールサブユニット（ssu）、β-コングリシニンプロモーター、β-ファセオニリンプロモーター、ADHプロモーター、熱ショックプロモーター、および組織特異的プロモーターが含まれるがこれらに限定されない。 他のエレメント、例えば、マトリックス結合領域、足場付着領域、イントロン、エンハンサー、ポリアデニル化配列などが存在してもよく、従って、転写効率またはDNA組み込みを改善してもよい。 このようなエレメントは、DNA機能のために必要であるかもしれないし、必要でないかもしれないが、これらは、転写、mRNA安定性などに影響を与えることによって、より良好な発現またはDNAの機能を提供することができる。 このようなエレメントは、植物での形質転換されたDNAの最適な性能を得るために、所望されるようにDNAに含まれてもよい。 典型的なエレメントには、Adh-イントロン1、Adh-イントロン6、アルファルファモザイクウイルスコートタンパク質リーダー配列、オスモチンUTR配列、トウモロコシストリークウイルスコートタンパク質リーダー配列、ならびに当業者に使用可能であるその他が含まれるがこれらに限定されない。 構成的プロモーター調節エレメントもまた使用され、すべての細胞型およびすべての時点での連続的な遺伝子発現を方向付けることができる（例えば、アクチン、ユビキチン、CaMV 35Sなど）。 組織特異的プロモーター調節エレメントは、特定の組織または組織型、例えば、葉または種子における遺伝子発現の原因であり（例えば、ゼイン、オレオシン、ナピン、ACP、グロブリンなど）、これらもまた使用されてもよい。

プロモーター調節エレメントはまた、植物の発生の特定の段階の間に活性であり（または不活性であり）、ならびに植物の組織および器官において活性であってもよい。 このような例には、花粉特異的、胚特異的、コーンシルク特異的、ワタ繊維特異的、根特異的、種子胚乳特異的、または植物相特異的なプロモーターエレメントなどが含まれるがこれらに限定されない。 特定の状況下で、特定のシグナルに応答する遺伝子、例えば：物理的刺激（熱ショック遺伝子）、光（RUBPカルボキシラーゼ）、ホルモン（Em）、代謝物、化学物質（テトラサイクリン応答性）、およびストレスに対して応答する遺伝子の発現の原因である誘導性プロモーター調節エレメントを使用することが所望されてもよい。 植物において機能する他の所望の転写および翻訳エレメントが使用されてもよい。 多数の植物特異的遺伝子移入ベクターが当技術分野で公知である。

植物RNAウイルスを用いる系もまた、細菌タンパク質を発現するために使用され得る。 そうすることにおいて、タンパク質を発現する遺伝子は、関心対象の宿主植物に感染する適切な植物ウイルスのコートプロモーター領域に挿入され得る。 次いで、このタンパク質が発現され得、従って、除草剤の損傷からの植物の保護を提供する。 植物RNAウイルスを用いる系は、Mycogen Plant Sciences, Inc. に対する米国特許第5,500,360号ならびにBiosource、現在はLarge Scale Biologyに対する米国特許第5,316,931号および同第5,589,367号に記載されている。

耐性または抵抗性のレベルをさらに増加させる手段
本発明の植物は、収量を含む表現型に対して観察可能な有害な効果を伴うことなく、新たな除草剤抵抗性形質を付与できることが本明細書で示される。 このような植物は本発明の範囲内にある。 本明細書に例示されかつ示唆される植物は、例えば、典型的な適用レベルの2×、3×、4×、および5×の少なくとも1種の対象となる除草剤に耐えることができる。 これらの耐性レベルの改善は本発明の範囲内にある。 例えば、種々の技術が当技術分野において知られており、所定の遺伝子の発現を増加させるために、予見可能に最適化でき、およびさらに開発できる。

1つのこのような方法には、対象のAAD-12遺伝子のコピー数を（発現カセットの中などで）増加させることが含まれる。 形質転換事象は、複数コピーの遺伝子を有するもののためにもまた選択することができる。

強力なプロモーターおよびエンハンサーは、発現を「過給する」ために使用することができる。 このようなプロモーターの例には、35Sエンハンサーを使用する好ましい35Tプロモーターが含まれる。 35S、トウモロコシユビキチン、アラビドプシスユビキチン、Atアクチン、およびCSMVプロモーターがこのような用途のために含まれる。 他の強力なウイルスプロモーターもまた好ましい。 エンハンサーには、4 OCSおよび35S二重エンハンサーが含まれる。 マトリックス結合領域（MAR）もまた、例えば、形質転換効率および導入遺伝子発現を増加するために使用させることができる。

シャッフリング（定向進化（directed evolution））および転写因子もまた、本発明の態様のために使用することができる。

配列レベルでは異なるが、しかし同じかまたは類似の全体的に本質的な三次元構造、表面電荷分布などを保持する変種タンパク質もまた、設計することができる。 例えば、以下をを参照されたい：米国特許第7,058,515号；Larson et al., Protein Sci. 2002 11: 2804-2813「Thoroughly sampling sequence space: Large-scale protein design of structural ensembles」; Crameri et al, Nature Biotechnology 15, 436 - 438 (1997)「Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling」; Stemmer, WPC1994. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751; Stemmer, WPC1994. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature 370: 389-391; Stemmer, WPC1995. Searching sequence space. Bio/Technology 13: 549-553; Crameri, A., Cwirla, S. and Stemmer, WPC1996. Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling. Nature Medicine 2: 100-103;およびCrameri, A., Whitehorn, EA, Tate, E. and Stemmer, WPC 1996. Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling. Nature Biotechnology 14: 315-319。

植物細胞に挿入された組換えポリヌクレオチドの活性は、挿入物に隣接する内因性植物DNAの影響に依存し得る。 従って、別の選択肢は、植物ゲノムにおいて挿入のための良好な位置であることが知られている事象を利用することである。 例えば、cry1Fおよびcry1Acワタ事象に関連するWO 2005/103266 A1を参照されたい；対象のAAD-12遺伝子は、cry1Fおよび/またはcry1Ac挿入物の代わりに、これらのゲノム遺伝子座において置換することができる。 従って、例えば、標的化された相同組換えも、本発明に従って使用することができる。 この型の技術は、例えば、標的化された組換えのためのジンクフィンガーの使用に関連するWO 03/080809 A2および対応する公開された米国特許（USPA 20030232410）の対象である。 リコンビナーゼ（例えば、cre-loxおよびflp-frt）の使用もまた当技術分野において公知である。

AAD-12の解毒は、細胞質において起こると考えられている。 従って、このタンパク質およびmRNAをさらに安定化するための手段（mRNA分解を遮断することを含む）は本発明の局面に含まれ、従って、当技術分野で公知の技術が適用できる。 対象のタンパク質は、プロテアーゼなどによる分解に抵抗するように設計することができる（プロテアーゼ切断部位は、タンパク質のアミノ酸配列を再操作することによって効率的に除去することができる）。 このような態様は、オスモチンからのUTRのような5'および3'ステムループ構造、ならびにper5（AUリッチ非翻訳5'配列）の使用を含む。 7-メチルまたは2'-O-メチル基、例えば、7-メチルグアニル酸残基のような5'キャップもまた使用することができる。 例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 74, No. 7, pp. 2734-2738 (July 1977 ) Importance of 5 '-terminal blocking structure to stabilize mRNA in eukaryotic protein synthesisを参照されたい。 タンパク質複合体またはリガンドブロッキング基（ligand bloking group）もまた使用することができる。

AAD-12に最も適切な5'または3'UTR（合成ヘアピン）のコンピュータ設計もまた、本発明の範囲内で実施することができる。 一般的なコンピュータモデリング、ならびに遺伝子シャッフリングおよび定向進化は、本明細書の他の箇所で議論される。 より具体的には、コンピュータモデリングおよびUTRに関しては、本発明の5'および3'UTR誘導体を予測/評価する際に使用されるコンピュータモデリング技術には以下が含まれるがこれらに限定されない：Genetics Corporation Group, Madison, WIから利用可能であるMFoId バージョン3.1（以下を参照されたい：Zucker et al., Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide. RNA Biochemistry and Biotechnology, 11-43, J. Barciszewski & BFC Clark, eds., NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, NL, (1999) 所収; Zucker et al., Expanded Sequence Dependence of Thermodynamic Parameters Improves Prediction of RNA Secondary Structure. J. Mol. Biol. 288, 911-940 (1999); Zucker et al., RNA Secondary Structure Prediction. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry S. Beaucage, DE Bergstrom, GD Glick, and RA Jones eds., John Wiley & Sons, New York, 11.2.1-11.2.10, (2000)所収）、ソースコードとして自由に配布されており、かつウェブサイトgenetics.wustl.edu/eddy/software/にアクセスすることによってダウンロード可能であるCOVE（共分散モデルを使用するRNA構造分析（確率論的文脈自由文法モデル））v.2.4.2（Eddy & Durbin, Nucl. Acids Res. 1994, 22: 2079-2088）、およびこれもまた自由に配布されており、かつウェブサイトbioinf.au.dk. FOLDALIGN/でダウンロードのために利用可能であるFOLDALIGN（Finding the most significant common sequence and structure motifs in a set of RNA sequences. J. Gorodkin, LJ Heyer and GD Stormo. Nucleic Acids Research, Vol. 25, no. 18 pp 3724-3732, 1997; Finding Common Sequence and Structure Motifs in a set of RNA Sequences.. J. Gorodkin, LJ Heyer, and GD Stormo. ISMB 5;120-123, 1997を参照されたい）。

本発明の態様は、天然に進化し、または化学的に誘導された変異体とともに使用することができる（変異体はスクリーニング技術によって選択することができ、次いで、AAD-12およびおそらく他の遺伝子で形質転換することができる）。 本発明の植物は、ALS抵抗性および/または進化したグリホセート抵抗性と組み合わせることができる。 例えば、アミノピラリド抵抗性もまた、AAD-12遺伝子と組み合わせるか、または「重ね合わせる」ことができる。

伝統的な育種技術もまた、所望の形質を、強力に組み合わせ、遺伝子移入し、および改善するために、本発明と組み合わせることができる。

さらなる改善は、植物をさらに保護するため、および/またはより多くの除草剤に対する交差抵抗性を付与するための適切な解毒剤を伴う使用もまた含む（解毒剤は、典型的には、cP450を活性化/発現することによって植物免疫系を増加するように作用する。解毒剤は、雑草制御効率を損なうことなく、生理学的または分子的なメカニズムによって、農作物植物に対する除草剤の植物毒性を減少する化学物質である）。

除草剤解毒剤には、ベノキサコール（benoxacor）、クロキントセット（cloquintocet）、シオメトリニル（cyometrinil）、ジクロルミド（dichlormid）、ジシクロノン（dicyclonon）、ジエトレート（dietholate）、フェンクロラゾール（fenchlorazole）、フェンクロリム（fenclorim）、フルラゾール（flurazole）、フルクソフェニム（fluxofenim）、フリラゾール（furilazole）、イソキサジフェン（isoxadifen）メフェンピル（mefenpyr）、メフェネート（mephenate）、ナフタル酸無水物（naphthalic anhydride）、およびオキサベトリニル（oxabetrinil）が含まれる。 植物活性化剤（植物の防御メカニズムを活性化することによって、植物を保護する新規なクラスの化合物）もまた、本発明の態様において使用することができる。 これらにはアシベンゾラー（acibenzolar）およびプロベナゾール（probenazole）が含まれる。

商品化された解毒剤は、播種前に組み込まれているかまたは発芽前に適用されるチオカルバメートファミリーおよびクロロアセトアニリドファミリーの除草剤に対して、種子の大きな草作物、例えば、トウモロコシ、グレインソルガム、および湿式播種イネの保護のために使用することができる。 解毒剤は、アリールオキシフェノキシピロピオン酸除草剤およびスルホニルウレア除草剤の発芽後適用に対して、コムギなどの冬作穀物を保護するためにもまた開発されてきた。 スルホニルウレア、イミダゾリノン、シクロヘキサンジオン、イソキサゾール、およびトリケトン除草剤に対するトウモロコシおよびイネの保護のための解毒剤の使用もまた、十分に確立されている。 解毒された植物における、解毒剤によって誘導される除草剤無毒化の増強は、解毒剤の作用に含まれる主要なメカニズムとして広く受け入れられている。 解毒剤は、グルタチオンなどの共因子、ならびにグルタチオンS-トランスフェラーゼ、シトクロムP450モノオキシゲナーゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼなどの除草剤無毒化酵素を誘導する。 Hatzios KK, Burgos N (2004)「Metabolism-based herbicide resistance: regulation by safeners」Weed Science: Vol. 52, No. 3 pp. 454-467。

AAD-12と重ね合わせたシトクロムp450モノオキシゲナーゼ遺伝子の使用は、1つの好ましい態様である。 除草剤代謝に関与するP450が存在する；例えば、cP450は哺乳動物または植物起源であり得る。 高等植物においては、シトクロムP450モノオキシゲナーゼ（P450）は、二次代謝を行うことが知られている。 これはまた、NADPH-シトクロムP450オキシドレダクターゼ（還元酵素）と連携して、生体異物の酸化的代謝において重要な役割を果たしている。 いくつかの除草剤に対する抵抗性は、グルタチオンS-トランスフェラーゼと同様に、P450による代謝の結果として報告されてきた。 哺乳動物において生体異物代謝に関与する多数のミクロソームP450種が、分子クローニングによって特徴付けられてきた。 これらのあるものは、数種の除草剤を効率的に代謝することが報告された。 従って、植物または哺乳動物のP450を有するトランスジェニック植物は、数種の除草剤に対して抵抗性を示すことができる。

前述の1つの好ましい態様は、アセトクロル（アセトクロルベースの製品には、Surpass（登録商標）、Keystone（登録商標）、Keystone LA、FulTime（登録商標）およびTopNotch（登録商標）除草剤が含まれる）および/またはトリフルラリン（例えば、Treflan（登録商標））に対する抵抗性のためのcP450の使用である。 ダイズおよび/またはトウモロコシにおけるこのような抵抗性は、いくつかの好ましい態様に含まれる。 このような態様に関連するさらなる手引きのために、例えば、以下を参照されたい：Inui et al.,「A selectable marker using cytochrome P450 monooxygenases for Arabidopsis transformation」 Plant Biotechnology 22, 281-286 (2005)（除草剤を代謝するヒトシトクロムP450モノオキシゲナーゼを使用する、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介するアラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）の形質転換のための選択系に関連する；除草剤耐性の苗は形質転換され、除草剤アセトクロル、アミプロフォス-メチル、クロロプロファム、クロロスルフロン、ノルフルラゾン、およびペンジメタリンを用いて選択した）；Siminszky et al.,「Expression of a soybean cytochrome P450 monooxygenase cDNA in yeast and tobacco enhances the metabolism of phenylurea herbicides」PNAS Vol. 96, Issue 4, 1750-1755, February 16, 1999; Sheldon et al, Weed Science: Vol. 48, No. 3, pp. 291-295,「A cytochrome P450 monooxygenase cDNA (CYP71A10) confers resistance to linuron in transgenic Nicotiana tabacum」; および「Phytoremediation of the herbicides atrazine and metolachlor by transgenic rice plants expressing human CYPlAl, CYP2B6, and CYP2C19」J Agric Food Chem. 2006 Apr 19;54(8):2985-91（イネ植物がクロロアセトミド（アセトクロル、アラクロル、メトアクロル、プレチラクロル、およびテニルクロル）、オキシアセトアミド（メフェナセット）、ピリダジノン（ノルフルラゾン）、2,6-ジニトロアナリン（トリフルラリンおよびペンジメタリン）、ホスファミデート（アミプロフォス-メチル、チオカルバメート（ピリブチカルブ）、および尿素（クロルトルロン））に対して高い耐性を示したことが報告されたイネにおけるヒトシトクロムP450モノオキシゲナーゼを試験することに関連する）。

対象のAAD-12遺伝子をより効率的にするために、異なる2,4-D化学物質を変化させ、またはそれを使用する可能性もまた存在する。 このような可能性のある変化には、より良好な基質およびより良好な脱離基（より高い電気陰性度）を作製することが含まれる。

オーキシン輸送阻害剤（例えば、ジフルフェンゾピル）もまた、除草剤活性を増加させるために2,4-Dとともに使用することができる。

具体的に示されない限り、または暗示されない限り、1つの（「a」「an」）およびその（「the」）という用語は、本明細書で使用される場合、「少なくとも1つの」を意味する。

本明細書で言及されるか、または引用されるすべての特許、特許出願、特許仮出願、および刊行物は、それらが本明細書の明示的な教示と一貫性がないことのない程度まで、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。

以下は、本発明を実施するための手法を例証する実施例である。 これらは、限定として解釈されるべきではない。 他に注記されない限り、すべてのパーセンテージは重量によっており、すべての溶媒混合物の割合は体積によっている。

実施例1-植物において2,4-Dに対する抵抗性を付与する遺伝子を同定するための方法
植物において除草剤分解活性を有する遺伝子を同定するための方法として、NCBI（National Center for Biotechnology Information）などの現在の公的なデータベースを調査することが可能である。 このプロセスを開始するために、所望の特性（すなわち、α-ケトグルタレートジオキシゲナーゼ活性）を有するタンパク質をコードする、すでに同定された機能的遺伝子配列を持っていることが必要である。 次いで、このタンパク質配列は、使用可能である寄託されたNCBIタンパク質配列に対して比較するために、BLAST（基礎局所的アラインメント検索ツール (Basic Local Alignment Search Tool)）(Altschul et al. , 1997）アルゴリズムのためのインプットとして使用する。 デフォルト設定を使用すると、この検索は、様々なレベルで100個までの相同タンパク質配列を回答する。 これらは、アミノ酸レベルが、高い同一性（85〜98%）から非常に低い同一性（23〜32%）までの範囲である。 伝統的には、高い相同性を有する配列のみが、インプット配列と同様の特性を保持していることが予測される。 この場合、≦50%相同性を有する配列のみが選択される。 本明細書において例示されるように、わずか31%のアミノ酸保存性（ラルストニア ユートロファ由来のtfdAと比較して）を有するホモログをクローニングおよび組換えにより発現することが、意図された除草剤に対してのみならず、これらの酵素を用いて以前に試験されなかった基質に対しても、商業的レベルの抵抗性を付与するために使用できることを続けて例示する。

単一の遺伝子（sdpA）を、tfdAに対して31%のみのアミノ酸同一性を有するホモログとしてNCBIデータベース（the ncbi.nlm.nih.gov ウェブサイト；アクセッション番号AF516752）から同定した。 同一性パーセントは、データベース中に寄託されたsdpAとtfdAの両方のDNA配列を最初にタンパク質に翻訳すること、次いで複数配列のアラインメントを実行するためのVectorNTIソフトウェアパッケージ中のClustalWを使用することによって決定した。

実施例2-植物および細菌における発現のための配列の最適化
2.1-背景
植物における異種遺伝子のより高いレベルの発現を得るために、これらが植物細胞でより効率的に発現されるように、タンパク質をコードする遺伝子を再操作することが好ましい場合がある。 トウモロコシは、1つのこのような植物であり、該植物でのその発現レベルおよびコード化タンパク質のレベルを増加させるために、形質転換の前に、異種のタンパク質コード領域を再設計することが好ましい場合がある。 それゆえに、細菌タンパク質をコードする遺伝子の設計におけるさらなる工程は、最適な発現のために異種遺伝子の再操作である。

トウモロコシにおける発現のための細菌タンパク質の再操作の1つの理由は、ネイティブ遺伝子の最適でないG+C含量に起因する。 例えば、多くのネイティブな細菌遺伝子の非常に低いG+C含量（および高いA+T含量に向かう結果としてのゆがみ）は、かなりA+Tリッチであることが知られている植物遺伝子制御配列を模倣または複製する配列の生成を生じる。 植物に導入される遺伝子のDNA中のあるA+Tリッチ配列（例えば、遺伝子プロモーター中に通常見い出されるTATAボックス領域）の存在は、遺伝子の異常な転写を生じる可能性がある。 他方、転写されたmRNAに存在する他の調節配列（例えば、ポリアデニル化シグナル配列（AAUAAA）またはプレmRNAスプライシングに関与する核内低分子RNAに相補的である配列）の存在は、RNAの不安定化をもたらす可能性がある。 それゆえに、植物に最適化された遺伝子とより好ましく呼ばれる、トウモロコシ発現のために細菌タンパク質をコードする遺伝子の設計における1つの目的は、より高いG+C含量を有するDNA配列、および好ましくは、代謝酵素をコードするトウモロコシ遺伝子の配列に近いものを生成することである。 細菌タンパク質をコードする植物に最適化された遺伝子の設計の別の目的は、配列の改変が翻訳を妨害しないDNA配列を生成することである。

表3は、どのように高G+C含量がトウモロコシにおいて存在するかを例証する。 表3におけるデータより、遺伝子のコード領域は、GenBank（リリース71）から抽出し、および塩基組成は、MacVector（商標）プログラムを使用して計算した（Accelerys, San Diego, California）。 イントロン配列は計算において無視した。

（表３）トウモロコシ遺伝子のタンパク質コード領域のG+C含量の編集

^a遺伝子の数を()内に示す

^b標準偏差を()内に示す

^c合わせた群の平均は平均の計算において無視した

遺伝コードの冗長性/縮重によって与えられる柔軟性に起因して（すなわち、あるアミノ酸は1つより多くのコドンによって特定される）、異なる生物または生物のクラスにおけるゲノムの進化は、重複するコドンの示差的な使用を生じてきた。 この「コドンの偏り」は、タンパク質コード領域の平均塩基組成を反映している。 例えば、比較的低いG+C含量を有する生物は、冗長性コドンの第3の位置においてAまたはTを有するコドンを使用するのに対して、より高いG+C含量を有するものは第3の位置においてGまたはCを有するコドンを使用する。 mRNA中の「マイナーな」コドンの存在は、とりわけ、そのマイナーなコドンに対応する荷電したtRNAの相対的な豊富さが低い場合に、そのmRNAの絶対的な翻訳速度を減少する可能性があると考えられている。 このことの拡張は、個々のマイナーなコドンによる翻訳速度の減少が、複数のマイナーなコドンについて少なくとも相加的であることである。 それゆえに、マイナーなコドンの高い相対含量を有するmRNAは、対応して低い翻訳速度を有する。 この速度は、引き続く低レベルのコードされるタンパク質によって反映される。

トウモロコシ（または他の植物、例えば、ワタまたはダイズ）発現のために細菌タンパク質をコードする遺伝子を操作する際に、植物のコドンの偏りが決定された。 トウモロコシについてのこのコドンの偏りは、そのタンパク質をコードするために植物が使用する、統計学的なコドンの分布であり、好ましいコドン使用頻度は表4に示す。 偏りを決定した後に、関心対象の遺伝子におけるコドンの頻度パーセントが決定される。 植物によって好まれる第1のコドンが、ならびに複数の選択が存在する場合には好ましいコドンの第2、第3、および第4の選択が、決定されるべきである。 次いで、細菌タンパク質のアミノ酸配列をコードする新規なDNA配列が設計され得るが、この新規な配列は、タンパク質のアミノ酸配列中の各位置におけるアミノ酸を特定するために、ネイティブなDNA配列（タンパク質をコードしている）とは、植物の（第1に好ましい、第2に好ましい、第3に好ましい、または第4に好ましい）コドンの置換によって異なっている。 次いで、この新規な配列は、改変によって作製されたかもしれない制限酵素部位について分析する。 同定された部位は、コドンを、第1の、第2の、第3の、または第4の選択の好ましいコドンで置き換えることによってさらに改変される。 関心対象の遺伝子の転写または翻訳に影響を与え得る配列中の他の部位は、エキソン:イントロン連結（5'または3'）、ポリA付加シグナル、またはRNAポリメラーゼ終結シグナルである。 配列はさらに、TAまたはGCダブレットの頻度を減少するように分析および改変される。 ダブレットに加えて、同じである約4個より多くの残基を有するGまたはC配列ブロックは、配列の転写に影響を与え得る。 それゆえに、これらのブロックもまた、第1または第2の選択などのコドンを、次に好ましい選択のコドンで置き換えることによって改変される。

（表４）トウモロコシにおいて発現されるタンパク質についての好ましいアミノ酸コドン

細菌タンパク質をコードする植物に最適化された遺伝子は、約63%の第1の選択のコドン、約22%〜約37%の間の第2の選択のコドン、および約15%〜約0%の間の第3または第4の選択のコドンを含み、全体のパーセンテージが100%であることが好ましい。 最も好ましい植物に最適化された遺伝子は、約63%の第1の選択のコドン、少なくとも約22%の第2の選択のコドン、約7.5%の第3の選択のコドン、および約7.5%の第4の選択のコドンを含み、全体のパーセンテージは100%である。 上記の方法は、遺伝子が植物で最適に発現されるように、特定の植物に対して外来性である遺伝子を改変することを当業者に可能にする。 この方法はさらに、PCT出願WO 97/13402において例証されている。

従って、細菌タンパク質をコードする植物に最適化された遺伝子を設計するために、DNA配列は、特定の植物のために遺伝子配列から編集されたコドンの偏りの表から確立された冗長な遺伝コードを使用して、該タンパク質のアミノ酸配列をコードするように設計される。 得られるDNA配列は、より高い程度のコドンの多様性、所望される塩基組成を有し、戦略的に配置された制限酵素認識部位を含むことができ、遺伝子の転写、または生成物mRNAの翻訳を妨害するかもしれない配列を欠いている。 従って、本発明のタンパク質/遺伝子に対して機能的に等価である合成遺伝子は、植物を含む宿主を形質転換するために使用することができる。 合成遺伝子の産生に関するさらなる手引きは、例えば、米国特許第5,380,831号において見い出すことができる。

2.2-AAD-12植物再構築分析
ネイティブAAD-12コード領域の876塩基対（bp）のDNA配列（SEQ ID NO:1）の広範な分析は、最適な植物発現に対して有害であると考えられているいくつかの配列モチーフの存在、ならびに最適でないコドン組成を明らかにした。 SEQ ID NO:1によってコードされるタンパク質（AAD-12）はSEQ ID NO:2として提示される。 単子葉植物ならびに双子葉植物における組換えタンパク質の産生を改善するために、1つのタンパク質（SEQ ID NO:4）をコードする「植物に最適化された」DNA配列AAD-12（v1）（SEQ ID NO:3）を開発した。 これは、2位のアラニン残基（SEQ ID NO:4において下線を付した）の付加以外は、ネイティブなSEQ ID NO:2と同じである。 付加的なアラニンコドン（GCT；SEQ ID NO:3において下線を付した）は、ATG翻訳開始コドンに及ぶNcoI制限酵素認識部位（CCATGG）の一部をコードしている。 従って、これは、翻訳の開始を最適化するためにATG開始コドンを取り囲む配列の状況を改善しながら、引き続くクローニング操作を容易にするという二重の目的に役立つ。 ネイティブのコード領域および植物に最適化されたコード領域（v1）によってコードされるタンパク質は99.3%同一であり、アミノ酸番号2においてのみ異なる。 対照的に、ネイティブのコード領域のDNA配列および植物に最適化されたコード領域（v1）のDNA配列は79.9%だけ同一である。 表5は、ネイティブ配列（カラムAおよびD）および植物に最適化された配列（カラムBおよびE）のコドン組成の違いを示し、ならびに理論的な植物に最適化された配列（カラムCおよびF）に対する比較を可能にする。

（表５）ネイティブAAD-12、植物に最適化されたバージョン（v1）、および理論的な植物最適化バージョンのコード領域のコドン組成の比較）

表5の検討から、ネイティブのコード領域および植物に最適化されたコード領域は、ほぼ同一のタンパク質をコードする一方で、実質的に互いに異なることが明白である。 植物に最適化されたバージョン（v1）は、AAD-12タンパク質をコードする理論的な植物に最適化されたコード領域のコドン組成を密接に模倣する。

2.3 大腸菌（E. coli）発現のための再構築
大腸菌（Escherichia coli）の特別に操作された株および関連するベクター系は、生化学的研究および分析的研究のために比較的大量のタンパク質を産生するためにしばしば利用されている。 所望のタンパク質をコードするネイティブ遺伝子は、その遺伝子の供給源生物が別の細菌属である場合があるにしても、大腸菌における高レベルの発現のためには十分に適してはいないことが時折見い出される。 このような場合において、その遺伝子のタンパク質コード領域を再操作して、大腸菌における発現のためにより適切にすることが可能でありかつ望ましい。 大腸菌クラスII遺伝子は、大腸菌細胞の対数増殖期の間に高度にかつ連続して発現されるものとして定義されている（Henaut, A. and Danchin, A. (1996) Escherichia coli and Salmonella typhimurium cellular and molecular biology, vol. 2, pp. 2047-2066. Neidhardt, F., Curtiss III, R., Ingraham, J., Lin, E., Low, B., Magasanik, B., Reznikoff, W., Riley, M., Schaechter, M. and Umbarger, H. (eds.) American Society for Microbiology, Washington, DC所収）。 大腸菌クラスII遺伝子のコード領域のコドン組成の検討を通して、これらの大腸菌クラスII遺伝子コード領域の平均コドン組成を工夫することができる。 クラスII遺伝子の平均コドン組成を模倣する平均コドン組成を有するタンパク質コード領域は、大腸菌の対数増殖期の間の発現のために好ましい。 これらの指針を使用して、上述のように2位にさらなるアラニンを含む、AAD-12タンパク質をコードする新規なDNA配列（SEQ ID NO:4）を、大腸菌クラスII遺伝子コード領域の平均コドン組成に従って設計した。 その設計がコドン組成にのみ基づいた初期の配列は、大腸菌発現ベクターへのクローニングのために適切である特定の制限酵素認識配列を含むようにさらに操作した。 高度に安定なステムループ構造のような有害な配列の特徴は、16SリボソームRNAの3'末端に相同な遺伝子内配列（すなわち、シャイン-ダルガーノ配列）と同様に回避した。 大腸菌に最適化された配列（v2）はSEQ ID NO:5として開示され、SEQ ID NO:4に開示されるタンパク質をコードする。

ネイティブなDNA配列および大腸菌に最適化された（v2）DNA配列は84.0%同一であるのに対して、植物に最適化された（v1）DNA配列および大腸菌に最適化された（v2）DNA配列は76.0%同一である。 表6は、ネイティブAAD-12コード領域のコドン組成（カラムAおよびD）、大腸菌における発現のために最適化されたAAD-12コード領域（v2；カラムBおよびE）、および大腸菌クラスII遺伝子の最適コドン組成を有するAAD-12の理論的コード領域のコドン組成（カラムCおよびF）を提示する。

（表６）ネイティブAAD-12、大腸菌に最適化されたバージョン（v2）、および理論的な大腸菌クラスII最適化バージョンのコード領域のコドン組成の比較）

表6の検討から、ネイティブのコード領域および大腸菌に最適化されたコード領域は、ほぼ同一のタンパク質をコードする一方で、実質的に互いに異なることが明白である。 大腸菌に最適化されたバージョン（v2）は、AAD-12タンパク質をコードする理論的な大腸菌に最適化されたコード領域のコドン組成を密接に模倣する。

2.4-グリホセート耐性を付与する変異を有するダイズEPSPSをコードする、ダイズのコドンに偏ったDNA配列の設計
本実施例は、変異を有するダイズ5-エノールピルボイルシキミ酸 3-リン酸シンターゼ（EPSPS）をコードするが、ダイズ細胞における発現のために最適化されている新規なDNA配列の設計を教示する。 三重変異を有するダイズEPSPSのアミノ酸配列は、WO 2004/009761のSEQ ID NO:5に開示されている。 このように開示された配列における変異したアミノ酸は、残基183（イソロイシンで置き換えられたネイティブタンパク質のスレオニン）、残基186（リジンで置き換えられたネイティブタンパク質のアルギニン）、および残基187（セリンで置き換えられたネイティブタンパク質のプロリン）においてである。 従って、WO 2004/009761のSEQ ID NO:5の置換されたアミノ酸を、適切な位置でネイティブなアミノ酸で置き換えることによって、ネイティブなダイズEPSPSタンパク質のアミノ酸配列を推定することができる。 このようなネイティブタンパク質配列は、（2005年5月2日に提出された）PCT/US2005/014737のSEQ ID NO:20として本明細書に開示される。 残基183（イソロイシンで置き換えられたネイティブタンパク質のスレオニン）、および残基187（セリンで置き換えられたネイティブタンパク質のプロリン）における変異を含む、二重変異を有するダイズEPSPSタンパク質配列は、PCT/US2005/014737のSEQ ID NO:21として本明細書に開示される。

362,096コドン（約870個のコード配列）から計算した、ダイズ（グリシン マックス（Glycine max））タンパク質コード配列についてのコドン使用頻度の表は、「kazusa.or.jp/codon」World Wide Webサイトから入手した。 これらのデータは、表7に示されるように再度形式を整えた。 表7のカラムDおよびHは、ダイズ遺伝子のタンパク質コード領域において見い出されるような、各アミノ酸についての同義語コドンの分布（そのアミノ酸のすべてのコドンについての使用頻度の%）を示す。 ことは明らかである。 いくつかのアミノ酸についてのいくつかの同義語コドン（アミノ酸は1、2、3、4、または6コドンによって特定することができる）が、ダイズタンパク質コード領域において比較的まれに存在する（例えば、アラニンを特定するためのGCGおよびGCTコドンの使用頻度を比較されたい）。 偏ったダイズコドン使用頻度の表を、表7におけるデータから計算した。 特定のアミノ酸について、ダイズ遺伝子において全体の出現の約10%未満が見い出されるコドンは無視した。 アミノ酸について残りのコドンの選択の分布のバランスを取るために、以下の数式：
C1の加重%=1/(%C1 + %C2 + %C3 + など) x %C1 x 100
を使用して、各コドンについての加重した平均表示を計算した。 ここで、C1は問題のコドンであり、C2、C3などは、残りの同義語コドンを表し、および関連するコドンについての%値は、表7のカラムDおよびHから取られる（太字フォントのまれなコドン値は無視する）。 各コドンについての加重した%値は、表7のカラムCおよびGに与えられる。 TGAは、翻訳ターミネーターとして任意に選択した。 次いで、偏ったコドン使用頻度を、OptGene（商標）遺伝子設計プログラム（Ocimum Biosolutions LLC, Indianapolis, Indiana）による使用のために特定化された遺伝コード表に入れた。

（表７）ダイズタンパク質コード配列における同義語コドン表示、およびダイズに最適化された合成遺伝子設計のための偏ったコドン表示セットの計算

^* DNU=使用せず

二重変異を有するEPSPSタンパク質をコードする、ダイズに最適化されたDNA配列を導き出すために、PCT/US2005/014737からのSEQ ID NO:21のタンパク質配列を、上記で導き出したダイズに偏った遺伝コードを使用してOptGene（商標）プログラムによって逆翻訳した。 次いで、隣接するコドンの間のCGおよびTAのダブレットの数を減少させ、隣接するコドン間のCTおよびTGのダブレットの数を増加させ、かなり安定な鎖内の二次構造を取り除き、制限酵素認識部位を除去または付加し、および操作された遺伝子の発現またはクローニングの取り扱いに対して有害である可能性がある他の配列を除去するために、このように導き出された最初のDNA配列を、コドンの変化を補うことによって（コドンについての全体的に加重を付けた平均表示を保持しながら）改変した。 配列のさらなる洗練は、潜在的な植物イントロンスプライス部位、A/TまたはC/G残基のロングラン、および植物細胞におけるコード領域のRNA安定化、転写、または翻訳と干渉する可能性がある他のモチーフを除去するように作製した。 他の変化は、長い内部のオープンリーディングフレーム（+1以外のフレーム）を除去するように作製した。 これらの変化は、すべて、上記のような、残りのダイズに偏ったコドン組成の制約内で、かつPCT/US2005/014737のSEQ ID NO:21に開示されるアミノ酸配列を保存しながら作製した。

SEQ ID NO:21のEPSPEタンパク質をコードするダイズに偏ったDNA配列は、PCT/US2005/014737のSEQ ID NO:22の塩基1〜1575として開示される。 PCT/US2005/014737のSEQ ID NO:22を含むDNAフラグメントの合成は、商業的な供給業者（PicoScript, Houston TX）によって実施された。

実施例3-発現ベクターおよび形質転換ベクターのクローニング
3.1-大腸菌pET発現ベクターの構築
さらなるクローニングリンカーを加えた部位に対応する制限酵素（Xba 1、Xho 1）を使用して、AAD-12（v2）をピコスクリプト（picoscript）ベクターから切断し、pET280ストレプトマイシン/スペクチノマイシン抵抗性ベクターにライゲーションした。 次いで、連結した生成物をTOP10F'大腸菌に形質転換し、ルリアブロス（Luria Broth）＋50μg/ml ストレプトマイシン（ S treptomycin）およびスペクチノマイシン（ S pectinomycin）（LB S/S）寒天プレートにプレートした。

AAD-12（v2）：pET280およびpCR2.1：pET280ライゲーションの間で区別するためにおよそ20個の単離したコロニーを、6mlのLB-S/Sに拾い上げ、攪拌しながら37℃で4時間増殖させた。 次いで、各培養物をLB＋カナマイシン50μg/mlプレートにスポットし、これを37℃で一晩インキュベートした。 LB-K上で増殖したコロニーは、ライゲーションされたpCR2.1を有すると想定され、廃棄した。 プラスミドは残りの培養物から以前と同様に単離し、XbaI/XhoIによる消化を用いて正確さについてチェックした。 最終的な発現構築物は、pDAB3222という名称を与えた。

3.2-シュードモナス（Pseudomonas）発現ベクターの構築
AAD-12（v2）オープンリーディングフレームは、XbaI-XhoIフラグメントとして、改変pET発現ベクター（Novagen）「pET280 S/S」に最初にクローニングした。 得られたプラスミドpDAB725は、制限酵素消化および配列決定反応を用いて確認した。 pDAB725からのAAD-12（v2）オープンリーディングフレームは、XbaI-XhoIフラグメントとして、シュードモナス発現ベクターpMYC1803に移入した。 陽性コロニーは制限酵素消化を介して確認した。 完成した構築物pDAB739は、MB217およびMB324シュードモナス発現株に形質転換した。

3.3-バイナリーベクターの完成
植物に最適化された遺伝子AAD-12（v1）を、Picoscriptから受容した（遺伝子再構築設計を完成し（上記を参照されたい）および構築のためにPicoscriptに外注し、内部の配列（SEQ ID NO:3）を検証し、予測された配列の変化が存在していないことを確認した）。 配列決定反応を、M13フォワードプライマー（SEQ ID NO:6）およびM13リバースプライマー（SEQ ID NO:7）を用いて、Beckman Coulter「Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit」試薬を使用して以前と同様に実行した。 配列データを分析し、結果は、植物に最適化されたAAD-12（v1）DNA配列に異常が存在しなかったことを示した。 AAD-12（v1）遺伝子を、NcoI-SacIフラグメントとして、pDAB726にクローニングした。 得られる構築物はpDAB723と称し、これは［AtUbi10プロモーター: Nt OSM 5'UTR: AAD-12 (v1): Nt OSM3'UTR: ORF1 ポリA 3'UTR］を含んだ（PvuIIおよびNotI制限消化物で確認）。 次いで、記載されたカセットを含むNot I-Not Iフラグメントを、バイナリーベクターpDAB3038のNotI部位にクローニングした。 以下のカセット［AtUbi10プロモーター: Nt OSM5'UTR: AAD-12 (v1): Nt OSM 3'UTR: ORF1 ポリA 3'UTR: CsVMVプロモーター: PAT: ORF25/26 3'UTR］を含む、得られるバイナリーベクターpDAB724を、正確な方向の確認のために制限消化した（Bam HI、Nco I、Not I、SacI、およびXmn Iを用いる）。 確認した完成した構築物（pDAB724）を、アグロバクテリウムへの形質転換のために使用した（7.2節を参照されたい）。

3.4-さらなる形質転換構築物のクローニング
適切な植物種への形質転換のために作製したすべての他の構築物は、本明細書で以前に記載したのと類似の手順、および他の標準的な分子クローニング方法（Maniatis et al., 1982）を使用して構築した。 表8は、適切なプロモーターおよび定義した特徴、ならびに形質転換した作物とともに使用したすべての形質転換構築物を列挙する。

（表８）種々の植物種の形質転換において使用されるバイナリー構築物

^＊ A=アラビドプシス

T=タバコ

S=ダイズ

Ct=ワタ

R=イネ

Cn=トウモロコシ

Ca=アブラナ

CsVMV=キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター

AtUbi10=アラビドプシス・サリアナ ユビキチン10プロモーター

AtUbi3=アラビドプシス・サリアナ ユビキチン3プロモーター

AtAct2=アラビドプシス・サリアナ アクチン2プロモーター

RB7 Mar v2=ニコチアナ タバカム（Nicotiana tabacum）マトリックス結合領域（MAR）

Nt Osm=ニコチアナ タバカム オスモチン5'非翻訳領域およびニコチアナ タバカム オスモチン3'非翻訳領域

ZmUbi1=ジー メイ（Zea mays）ユビキチン1プロモーター

Hptll=ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ

実施例4-蛍光菌における組換えAAD-12（v2）発現および精製
4.1-蛍光菌発酵
フラスコ実験のために、AAD-12（v2）構築物pDAB739（3.2節）を有する蛍光菌株MB324グリセロールストックの200μlを使用して、30μg/mlテトラサイクリン/HClを補充した50mlの新鮮なLB培地に接種した。 培養物（250mLのバッフル付きErlenmeyerフラスコ中）をシェーカー（New Brunswick Scientific モデルInnova 44）上で、300rpmにて、30℃で16時間インキュベートした。 20mlの種培養を、2.8Lのバッフル付きErlenmeyerフラスコ中で、20μg/mlテトラサイクリン/HClおよび250μlのPluronic L61（消泡剤）を補充した蛍光菌培養培地（酵母抽出物、5g/L; K ₂ HPO ₄ 、5g/L; (NH ₄ ) ₂ PO ₄ 、7.5g/L; (NH ₄ ) ₂ SO ₄ ; MgSO ₄ -7H ₂ O、1g/L; KCl、0.5g/L; CaCl ₂ -2H ₂ O、0.5g/L; クエン酸Na-2H ₂ O、15g/L; グリセロール、95g/L; 微量元素溶液、10ml/L; 微量元素溶液: FeCl ₃ -6H ₂ O、5.4g/L; MnCl ₂ -4H ₂ O、1g/L; ZnSO ₄ -7H ₂ O、1.45g/L; CuSO ₄ -5H ₂ O、0.25g/L; H ₃ BO ₃ 、0.1g/L; (NH ₄ ) ₆ MO ₇ O ₂₄ 、0.1g/L; 濃HCl、13ml/L）1Lに移した。 培養物を300rpmにて30℃で24時間インキュベーションした。 イソプロピルβ-D-1-チオガラクト-ピラノシド（IPTG）を培養物に最終1mMで加え、25℃で約48時間、インキュベートを継続した。 細胞を7krpmにて4℃で15分間の遠心分離によって収集し、細胞ペーストを-80℃で保存するか、または精製のためにすぐに処理した。

容器での実験のために、各1mlのグリセロールストックを、30μg/mlテトラサイクリン/HClを補充した200mlのLB培地を含む1Lバッフル付きフラスコに、300rpmにて32℃で16〜24時間接種した。 次いで、3つのフラスコ（600ml）からの合わせた培養物を、高細胞密度増殖を支援するように設計されたDowの製品として販売されている規定培地（Teknova, Hollister, CAを通じて）の10Lを含む20Lのファーメンター（B. Braun Bioreactor Systems）に無菌的に移した。 増殖温度は32℃に維持し、pHはアンモニア水溶液の付加を通して所望の設定点に制御した。 溶存酸素は、スパージ気流および攪拌速度を調節することによって液体培地中で正のレベルに維持した。 流加培養発酵プロセスは、細胞密度が170〜200 OD ₅₇₅に達するまで、約24時間実行した。 IPTGを1mMまで加えて組換えタンパク質発現を誘導し、冷水供給の循環を使用して温度は25℃まで低下させかつ維持した。 発酵の誘導相は、追加で24時間継続させた。 試料（30ml）は、誘導後6時間、12時間、および18時間の時点で、種々の分析のために収集して、細胞密度およびタンパク質発現レベルを決定した。 発酵の実行の最後に、細胞は、10krpmで30分間の遠心分離によって収集した。 細胞ペレットは、さらなる処理のために-80℃で凍結した。

4.2-生化学的特徴付けおよび抗体産生のためのAAD-12（v2）の精製
約100〜200gの凍結した（または新鮮な）シュードモナス細胞を融解し、20mM Tris-HCl、pH 8.5を含む1〜2Lの抽出緩衝液、および25mlのプロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigmaカタログ番号P8465）に再懸濁した。 細胞は、マイクロフルイダイザー（モデルM110Lまたは110Y）（Microfluidics, Newton, MA）を使用し、氷上にて11,000〜12,000psiで1回通して破壊した。 溶解物は24,000rpmで20分間遠心分離した。 上清を移し、10倍体積の20mM Tris-HCl、pH 8.5に対して4℃で一晩透析し、またはこの緩衝液でダイアフィルトレーションを行い、および0.45μmメンブレンを通して濾過し、その後カラム分離への適用を行った。 引き続くすべてのタンパク質分離はPharmacia AKTA Explorer 100を使用して実施し、4℃で操作した。 ローディングの前に、Q Sepharose Fast Flowカラム（Pharmacia XK 50/00、500mlベッドサイズ）を、20mM Tris-HCl、pH 8.5緩衝液で平衡化した。 試料を15ml/分でカラムに適用し、次いで、溶離液のOD ₂₈₀がベースラインに戻るまで、この緩衝液で洗浄した。 タンパク質は、2Lの0〜0.3M NaCl直線勾配で、15ml/分の流速で溶出し、一方45mlの画分を収集した。 比色定量的酵素アッセイによって決定され、AAD-12タンパク質の推定分子量（SDS-PAGE上で約32kDaバンド）にもまた対応するAAD-12活性を含む画分をプールした。 最終0.5Mまでの固体硫酸アンモニウムを試料に添加し、次いで、20mM Tris-HCl、pH 8.0中の0.5M硫酸アンモニウム中で平衡化したPhenyl HPカラム（Pharmacia XK 50/20、250mlベッドサイズ）に適用した。 このカラムは、溶離液のOD ₂₈₀がベースラインに戻るまで、10ml/分の結合緩衝液で洗浄し、タンパク質は、20mM Tris-HCl、pH 8.0中の0.5M〜0 硫酸アンモニウム直線勾配で、10ml/分の流速にて2カラム体積以内で溶出し、12.5mlの画分を収集した。 AAD-12を含む主ピーク画分をプールし、必要な場合、MWCO 10 kDaカットオフメンブレン遠心分離用フィルター装置（Millipore）を使用して濃縮した。 ある場合において、試料は、1ml/分の流速のPBS緩衝液を用いて、Superdex 75ゲル濾過カラム（Pharmacia XK 16/60、110mlベッドサイズ）にさらに適用した。 純粋なAAD-12を含むピーク画分をプールし、-80℃で保存した。 多くの場合において、AAD-12タンパク質の純度は、連続的なイオン交換カラムおよび疎水性相互作用カラムの2段階分離後に、99%に近づくかまたはそれ以上である。 精製AAD-12の典型的な収率は12〜18mg/湿細胞gである。 バルクタンパク質試料は、20mM Tris-HCl、pH 8.0、0.1M NaCl、2mM DTT、および1%トレハロース中でダイアフィルトレーションによって原液とし、長期保存のためにVirtis Freezemobileモデル25EL（Virtis, Gardiner, NY）上で凍結乾燥した。

タンパク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミンを用いて、Bio-Radタンパク質アッセイキット（カタログ番号500-0006）を使用するBradfordアッセイによって最初に測定した。 必要とされる場合、より正確なタンパク質濃度は、全アミノ酸加水分解を使用することによって決定した。 試料は、Agilentから購入したアミノ酸較正標準（カタログ番号PN5061-3330）を用いて、Agilent 1100 HPLCシステム（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）において分析した。

AAD-12活性は、以下の実施例5に記載されるように、各処理および操作による酵素活性の損失がないことを保証するために、処理の全体を通して決定した。 タンパク質の純度は、SDS-PAGEおよび分析用サイズ排除クロマトグラフィーを使用することによってモニターした。 精製したタンパク質試料は、N末端アミノ酸配列決定によってさらに確証および確認し、ならびにそのN末端が、予測されたAQTTLQITPT残基からなっていることを示した。 短期的および長期的なタンパク質安定性は、酵素活性によって、ならびに非還元条件下と還元条件下の両方でのネイティブPAGEおよびSDS-PAGEゲル分析によって試験した。 そして、AAD-12がジスルフィド結合形成を介してオリゴマー化する傾向があることが注目され、それゆえに、典型的には2mM DTTをタンパク質保存のために使用した。 リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）およびTris緩衝化生理食塩水（TBS）は1%トレハロースの存在下または非存在下で、タンパク質の凍結乾燥のために試験した。 加えて、精製試料からの内毒素およびDNA夾雑内容物をそれぞれ測定し、AAD-12タンパク質の完全性もまた、等電点電気泳動（IEF）分析によって評価した。

10ミリグラムの精製AAD-12（v2）を、ウサギポリクローナル抗体産生のために、Zymed Laboratories, Inc.（South San Francisco, CA）に送った。 ウサギは5週間の期間中に5回の注射を受け、各注射は、1mlの不完全フロイントアジュバントに懸濁した0.5mgの精製タンパク質を含んだ。 アフィニティー精製および西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合の前に、血清を、ELISAとウエスタンブロッティング実験の両方で試験して、特異性および親和性を確認した（Zymed Lab Inc）。

実施例5-AAD-12活性のインビトロアッセイ
5.1-比色定量的フェノール検出を介するアッセイ
酵素活性は、96ウェルマイクロプレート形式での配置を可能にするために、Fukumori and Hausinger (1993) (J. Biol. Chem. 268: 24311-24317) のプロトコールから改変したプロトコールを使用する、生成物フェノールの比色定量的検出によって測定した。 比色定量的アッセイは、2,4-Dおよびジクロルプロップを切断して生成物2,4-ジクロロフェノールを遊離するジオキシゲナーゼの活性を測定する際の使用について記載されてきた。 どのフェノール生成物が容易に検出可能であるかを確認するために以前に記載された検出方法を使用して、いくつかのフェノールからの色の産生を、2,4-ジクロロフェノールのそれと比較した。 フェノールおよびフェノールアナログを、200μM NH ₄ (FeSO ₄ ) ₂ 、200μM アスコルビン酸ナトリウムを含む、0.15mlの20mM MOPS pH 6.75中で、100μMの最終濃度で試験した。 フルロキシピルおよびトリクロピルに由来するピリジノールは、有意な色を生じなかった。 2,4-ジクロロフェノールの色の産生は直線状であり、〜500μMまでアッセイ中のフェノールの濃度に比例した。 標準アッセイ条件下（160μl最終アッセイ量）で実行した較正曲線は、510nmにおける0.1の吸光度が17.2μMフェノールから得られたことを示した。

酵素アッセイは、200μM NH ₄ FeSO ₄ 、200μM アスコルビン酸ナトリウム、1mM α-ケトグルタレート、適切な基質（DMSO中で作製された100mM保存液から加えた）、および酵素を含む、総量0.16mlの20mM MOPS pH 6.75中で実行した。 アッセイを、時間=0における、アリールオキシアルカノエート基質、酵素またはα-ケトグルタレートの添加によって開始した。 25℃で5分間のインキュベーション後、反応を、50mM EDTAナトリウム；pH 10緩衝液（3.09gホウ酸+3.73g KCl+44ml 1N KOH）および0.2% 4-アミノアンチピリンの1:1:1混合物30μlの添加によって終結させた。 次いで、10μl 0.8% フェリシアン化カリウムを添加し、5または10分後、510nmにおける吸光度を、分光光度マイクロプレートリーダー中で記録した。 ブランクは、少量のフェノールによるある程度の基質の偶然のわずかな夾雑を説明するために、酵素以外のすべての試薬を含んだ。

5.2-クロロピリジノールの検出を介するアッセイ
置換ピリジン（ベンゼン環でなく）を含む除草剤トリクロピルなどの潜在的な基質に対するAAD-12の作用は、アリールオキシアルカノエート結合の切断に際してピリジノールを遊離する。 ピリジノールは、先の節において記載されたアミノアンチプリン/フェリシアン化物フェノール検出を使用して検出されなかった。 しかし、生成物クロロピリジノールは、pH 7において325nmのλ _maxで、近紫外で強力な吸収を示す（吸光係数〜8,400M ^-1 .cm ^-1 ）ことが見い出された。 このことを、連続的なマイクロプレートベースの吸光光度法的アッセイを作製するために使用した。 アッセイは、200μM NH ₄ FeSO ₄ 、200μM アスコルビン酸ナトリウム、1mM α-ケトグルタレート、適切な基質（DMSO中で作製された100mM保存液から加えた）、および酵素を含む、総量0.2mlの20mM MOPS pH 6.75中で実行した。 アッセイを、時間=0における、アリールオキシアルカノエート基質、酵素またはα-ケトグルタレートの添加によって開始し、吸光度の増加を10分間、325nmでマイクロプレートリーダー中で追跡した。 反応の最初の2分間は初速度を決定するために使用した。 標準アッセイ条件下（200μl最終アッセイ量）で実行した較正曲線は、510nmにおける0.1の吸光度が11.9μMクロロピリジノールから得られたことを示した。

5.3-2-(2-クロロ,4-ニトロフェノキシ)プロピオン酸を使用する比色定量的アッセイ
AAD-12の簡便なアッセイは、2-(2-クロロ,4-ニトロフェノキシ)プロピオン酸（CNPP）を基質として使用して考案した。 AAD-12によるCNPPの切断は、2-クロロ,4-ニトロフェノールを遊離する。 このフェノールは、pH 7で410nmにおける明るい黄色の吸収を有し、反応が連続的にまたは終点分析によって追跡されることを可能にする。 AAD-12活性の存在は、さらなる試薬の添加の必要性を伴うことなく、視覚的にモニターすることが可能である。 マイクロプレートベースの分光測定的アッセイは、200μM NH ₄ FeSO ₄ 、200μM アスコルビン酸ナトリウム、1mM α-ケトグルタレート、適切な量のCNPP（DMSO中で作製された10mMストックから加えた）、および酵素を含む、総量0.2mlの20mM MOPS pH 6.75中で実行した。 アッセイを、時間=0における、CNPP、酵素、またはα-ケトグルタレートの添加によって開始し、吸光度の増加を10分間、410nmでマイクロプレートリーダー中で追跡した。 反応の最初の2分間は初速度を決定するために使用した。 標準アッセイ条件下（200μl最終アッセイ量）で実行した較正曲線は、410nmにおける0.1の吸光度が25.1μM 2-クロロ,4-ニトロフェノールから得られたことを示した。 このアッセイを使用して、基質としてのCNPPの反応速度論定数は、K _m =31±5.5μMおよびk _cat =16.2±0.79分^-1であると決定した。

実施例6-種々の基質に対するAAD-12のインビトロ活性
6.1-(R,S)-ジクロルプロップ、(R)-ジクロルプロップ、(S)-ジクロルプロップ、および2,4-Dに対するAAD-12（v2）活性
実施例5.1に記載されるフェノール検出アッセイを使用して、4種のフェノキシアルカノエートを、4.4μg精製AAD-12（v2）を含む反応混液中でアッセイした。 (R,S)-ジクロルプロップ（R,S-DP）は1mMで試験し、(R)-ジクロルプロップ、(S)-ジクロルプロップ、および2,4-Dは0.5mMで試験した。 結果を図3に示し、これは、2,4-Dおよびジクロルプロップのエナンチオマーに対するAAD-12（v2）の活性を図示する。 4.4μg AAD-12（v2）を0.5mM 基質（(R,S)-ジクロルプロップについては1mM）とともにインキュベートし、反応はα-ケトグルタレートの添加によって開始した。 5分後、反応を消失させ、比色分析用検出試薬の添加後に510nmにおける吸収を決定した。 酵素なしのバックグラウンド値を減算した。

AAD-12（v2）は、(R,S)-ジクロルプロップおよび(S)-ジクロルプロップに対して優秀な活性を有し、(R)-ジクロルプロップに対しては最小限の活性を有する。 このことは、AAD-12（v2）が明確な(S)-エナンチオマー優先度を有することを意味する。 2,4-Dに対するAAD-12（v2）の活性は、(S)-ジクロルプロップに対する活性と等価であり、この酵素がオキシプロピオン酸およびオキシ酢酸を効率的に処理可能であることを示す。

6.2-ピリジルオキシアルカノエートに対するAAD-12（v2）活性
実施例5.2に記載されるピリジノールアッセイを使用して、6.8μg精製AAD-12（v2）を含む反応混液中で、5種のピリジルオキシアルカノエートを1mMでアッセイした。 各反応の速度をモニターし、表9に提示する。 5種すべてのピリジルオキシアルカノエートはAAD-12（v2）によって切断され、ピリジノールを遊離した。 オキシプロピオン酸基質116844および91767の速度は、対応する酢酸（それぞれトリクロピルおよび93833）の速度よりもいくぶん速く、オキシ酢酸側鎖よりもオキシプロピオン酸側鎖へのAAD-12（v2）の優先度を示す。 これらのデータは、AAD-12（v2）が、トリクロピルなどのピリジルオキシアルカノエート除草剤を効率的に分解可能であることを示す。

（表9）AAD-12（v2）によるピリジルオキシアルカノエート切断の速度。 6.8μg AAD-12（v2）は1mM基質とともにインキュベートし、反応はα-ケトグルタレートの添加によって開始し、および引き続く吸光度の増加は325nmでモニターした。 α-ケトグルタレートなしでの1.4mAU/分のバックグラウンド速度は、基質ありの速度から減算した。

6.3-2,4-D、(R,S)-DCP、およびトリクロピルについてのAAD-12（v2）の反応速度論定数
除草剤2,4-D、(R,S)-ジクロロプロップ、およびトリクロピルについての精製AAD-12（v2）のK _m値およびk _cat値は、適切なアッセイ方法を使用して決定した。 高濃度（>1mM）の2,4-Dおよび(R,S)-DCPでは基質阻害が起こったので、これよりも低い濃度を使用して、Grafit 4.0（Erithacus Software, UK）を使用してミカエリス-メンテン式にデータをフィットさせた。 2mMまでではトリクロピルについて、基質阻害は認められなかった。 反応速度論定数を表10に要約する。 これらのデータから、トリクロピルのAAD-12（v2）切断の速度は、最大速度条件の下では、2,4-Dの速度の〜5%である。

（表10）3種の除草剤基質についてのAAD-12（v2）の反応速度論定数

^＊ AAD-12の(S)-エナンチオマーの優先度のため、50%のラセミ混合物が基質として利用可能であることを想定して、K

_m値を計算した。

実施例7-アラビドプシスへの形質転換および選択
7.1-アラビドプシス・サリアナ生育条件
野生型アラビドプシス種子を、0.1%アガロース（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）溶液中に懸濁した。 懸濁した種子を、4℃で2日間保存し、休止要件を完了し、かつ同調的な種子の発芽を確実にした（層形成）。

Sunshine Mix LP5（Sun Gro Horticulture, Bellevue, WA）を、微細なバーミキュライトで覆い、濡れるまで下側からHoagland溶液を与えた。 層形成された種子を播種し、湿気ドーム（KORD Products, Bramalea, Ontario, Canada）で7日間覆った。

種子を発芽させ、植物を、Conviron（モデルCMP4030およびCMP3244、Controlled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canada）中で、定常的な温度（22℃）および湿度（40〜50%）下で、長い日中条件（16時間光/8時間暗）下で、120〜150μmol/m ²秒の光強度で生育させた。 植物を、初期にはHoagland溶液で水をやり、次には脱イオン水で水をやり、土壌を示させるが濡れないように維持した。

7.2-アグロバクテリウム形質転換
画線したDH5αコロニーを含み、エリスロマイシン（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）(200mg/L）またはスペクチノマイシン（100mg/L）を含むLB+寒天を使用して、4mlミニプレップ培養（液体LB+エリスロマイシン）に接種するためにコロニーを提供した。 この培養物を、定常的に攪拌しながら、37℃で一晩インキュベートした。 製造業者の指示に従って実施するQiagen（Valencia, CA）Spin Mini Prepsを使用して、プラスミドDNAを精製した。

電気的に形質転換受容性であるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（株Z707、EHA101、およびLBA4404）細胞を、Weigel and Glazebrook (2002)のプロトコールを使用して調製した。 形質転換受容性アグロバクテリウム細胞を、Weigel and Glazebrook (2002)から適合したエレクトロポレーション法を使用して形質転換した。 50μlの形質転換受容性アグロ細胞を氷上で融解し、10〜25ngの所望のプラスミドを細胞に加えた。 DNAおよび細胞混合物を、あらかじめ冷やしたエレクトロポレーションキュベット（2mm）に加えた。 Eppendorf Electroporator 2510を、以下の条件：電圧: 2.4kV、パルス長: 5m秒を用いて形質転換のために使用した。

エレクトロポレーションの後、1mlのYEPブロス（1リットルあたり: 10g酵母抽出物、10gバクト-ペプトン、5g NaCl）をキュベットに加え、細胞-YEP懸濁物を15ml培養チューブに移した。 細胞を、定常的に攪拌しながら、ウォーターバス中で28℃にて4時間インキュベートした。 インキュベーション後、培養物を、エリスロマイシン（200mg/L）またはスペクチノマイシン（100mg/L）およびストレプトマイシン（Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO)（250mg/mL）を有するYEP+寒天上に蒔いた。 プレートを、2〜4日間、28℃にてインキュベートした。

コロニーを選択し、エリスロマイシン（200mg/L）またはスペクチノマイシン（100mg/L）およびストレプトマイシン（250mg/mL）を有する新鮮なYEP+寒天上に画線し、28℃で1〜3日間インキュベートした。 コロニーをPCR分析のために選択して、ベクター特異的プライマーを使用することにより、遺伝子インサートの存在を確認した。 以下を例外として、製造業者の指示に従って実施するQiagen Spin Mini Prepsを使用して、選択されたアグロバクテリウムコロニーからプラスミドDNAを精製した。 DNA精製のために、15mlの一晩ミニプレップ培養物（液体YEP+エリスロマイシン（200mg/L）またはスペクチノマイシン（100mg/L）およびストレプトマイシン（250mg/mL））の4mlアリコートを使用した。 Qiagen Spin Mini Prep DNAを使用することの代替として、10μlの水中に懸濁した、形質転換したアグロバクテリウム細胞を、100℃で5分間溶解することであった。 アグロバクテリウム形質転換において使用したバイナリーベクターからのプラスミドDNAを、対照として含めた。 PCR反応を、製造業者の指示に従って、0.5×濃度で、Takara Mirus Bio Inc.（Madison, Wisconsin）からのTaq DNAポリメラーゼを使用して完了した。 PCR反応を、以下の条件：1)94℃3分間、2)94℃45秒間、3)55℃30秒間、4)72℃1分間、29サイクル、次に72℃で10分間の1サイクルでプログラムされたMJ Research Peltier Thermal Cycler中で実行した。 反応物を、サイクリング後に4℃で維持した。 増幅を、1%アガロースゲル電気泳動によって分析し、臭化エチジウム染色によって可視化した。 そのPCR産物がプラスミド対照と同一であったコロニーを選択した。

7.3-アラビドプシス形質転換
アラビドプシスを、フローラルディップ法を使用して形質転換した。 選択したコロニーを、エリスロマイシン（200mg/L）またはスペクチノマイシン（100mg/L）およびストレプトマイシン（250mg/mL）を含むYEPブロスの1つまたは複数の15〜30mlのプレ培養物に接種するために使用した。 培養物を、220rpmで定常的に攪拌しながら、28℃で一晩インキュベートした。 各プレ培養を、エリスロマイシン（200mg/L）またはスペクチノマイシン（100mg/L）およびストレプトマイシン（250mg/mL）を含むYEPブロスの2つの500ml培養に接種するために使用し、培養物を、定常的に攪拌しながら、28℃で一晩インキュベートした。 次いで、細胞を、約8700×gで10分間、室温でペレット化し、得られる上清を廃棄した。 この細胞ペレットを、1/2×MurashigeおよびSkoog塩/GamborgのB5ビタミン、10% (w/v)スクロース、0.044μM ベンジルアミノプリン（DMSO中の1mg/ml保存液の10μl/リットル）および300μl/リットルSilwet L-77を含む500mlの浸透培地に穏やかに再懸濁した。 約1ヶ月齢の植物を15秒間、培地に浸し、最新の花序を確実に沈める。 次いで、植物を、それらの側面を下にして横たえ、24時間覆い（透明または不透明）、次いで水で洗浄し、および直立状態で配置した。 植物を22℃で、16時間明期/8時間暗期の光周期で生育させた。 浸漬の約4週間後、種子を収集した。

7.4-形質転換植物の選択
直前に収集したT ₁種子［AAD-1 (v3)］を、室温で7日間乾燥させた。 T ₁種子を、26.5×51cm発芽トレイ（TO Plastics Inc., Clearwater, MN）中に播種し、各々は、40mlの0.1%アガロース溶液に事前に懸濁された、層形成されたT ₁種子（〜10,000種子）の200mgアリコートを受容し、4℃で2日間保存し、休止要件を完了し、かつ同調的な種子の発芽を確実にした。

Sunshine Mix LP5（Sun Gro Horticulture Inc., Bellevue, WA）を、微細なバーミキュライトで覆い、濡れるまで下側からHoagland溶液を与え、次いで、重力で水抜きした。 各40mlのアリコートの層形成された種子を、ピペットを用いてバーミキュライト上に均一に播種し、湿気ドーム（KORD Products, Bramalea, Ontario, Canada）で4〜5日間覆った。 グルホシネート出芽後噴霧を使用する初期の形質転換体選択（同時形質転換PAT遺伝子の選択）の1日前にドームを取り外した。

播種後（DAP）7日、および11DPAで再度、T ₁植物（それぞれ子葉および2〜4-lf段階）に、Liberty除草剤（200g ai/L グルホシネート、Bayer Crop Sciences, Kansas City, MO）の0.2%溶液を、10ml/トレイの噴霧量で（703L/ha）、適用あたり280 g ai/haグルホシネートの有効割合を送達するために、DeVilbiss圧縮空気噴霧チップを使用して噴霧した。 生き残り（活動的に生育している植物）を、最後の噴霧の4〜7日後に同定し、ポット媒体（Metro Mix 360）で調製した3インチポットに個別に移植した。 移植した植物を、以前と同様に、湿気ドームで3〜4日覆い、22℃生育チャンバー中に配置した、または直接温室に移動した。 次に、ドームを取り外し、AAD-12（v1）（植物に最適化した遺伝子）がフェノキシオーキシン除草剤抵抗性を提供する能力について試験する少なくとも1日前に、植物を温室（22±5℃、50±30% RH、14時間明期:10時間暗期、最低で500μE/m ² s ¹の天然+追加の光）で栽培した。

次いで、T ₁植物を、様々な割合の2,4-Dにランダムに割り当てた。 アラビドプシスについては、50g ae/ha 2,4-Dが、意味のあるレベルの抵抗性を有する植物から、感受性の植物を区別するための有効用量である。 上昇した割合は、抵抗性の相対レベルを決定するためにも適用した（50、200、800、または3200g ae/ha）。 表10および11は、PCT/US2005/014737において以前に記載されたアリールオキシアルカノエート除草剤抵抗性遺伝子（AAD-1（v3））に及ぶ比較を示す。

すべてのオーキシン除草剤適用は、703L/ha噴霧量（0.4ml溶液/3インチポット）を適用するために上記のようにDeVilbiss噴霧器を使用して行ったか、または187L/ha噴霧量でトラック噴霧器によって適用した。 使用した2,4-Dは、DMSOに溶解し、かつ水で希釈した（<1% DMSO最終濃度）工業グレード（Sigma, St. Louis, MO）、または市販のジメチルアミン塩製剤（456g ae/L, NuFarm, St Joseph, MO）のいずれかであった。 使用したジクロルプロップは、R-ジクロルプロップ（600g ai/L、AH Marks）のカリウム塩として製剤化された市販品グレードであった。 除草剤の割合が800g ae/haを超えて増大するにつれて、噴霧溶液のpHが甚だしく酸性になり、若葉を枯らし、アラビドプシス植物を扱いにくくし、および除草剤の主要な効果の評価を複雑にした。 200mM HEPES緩衝液、pH 7.5中のこれらの高い割合の除草剤を適用することが標準的な実務となった。

いくつかのT ₁個体を、フェノキシオーキシンの代わりに代替の市販の除草剤に供した。 1つの関心対象の点は、ピリジルオキシ酢酸オーキシン除草剤であるトリクロピルおよびフルロキシピルが、植物において効果的に分解できるか否かを決定することであった。 除草剤は、187L/ha噴霧量でトラック噴霧器の使用を伴ってT ₁植物に適用した。 2,4-D DMAに対する耐性を示したT ₁植物は、T ₂世代においてさらに評価した。

7.5-形質転換植物の選択の結果
最初のアラビドプシス形質転換は、AAD-12（v1）（植物に最適化された遺伝子）を使用して行った。 T ₁形質転換体を、最初に、グルホシネート選択スキームを使用して、形質転換していない種子のバックグラウンドから選択した。 300,000個を超えるT ₁種子をスクリーニングし、316個のグルホシネート抵抗性植物を同定した（PAT遺伝子）。 これは、PAT+Libertyが選択のために使用される、構築物の選択頻度の正常範囲にある0.10%の形質転換/選択頻度と同等であった。 上記で選択したT ₁植物は、引き続き個々のポットに移植し、様々な割合の市販のアリールオキシアルカノエート除草剤を噴霧した。 表11は、アラビドプシスT ₁形質転換体に2,4-D抵抗性を付与するためのAAD-12（v1）遺伝子および対照遺伝子の応答を比較する。 応答は、視覚的損傷% 2WATによって提示する。 データは、ほとんど損傷なしもしくは損傷なし（<20%）、中程度の損傷（20〜40%）、または深刻な損傷（>40%）を示す個体のヒストグラムとして提示する。 各T ₁は独立した形質転換事象であるので、所定の割合の範囲内での個々のT ₁応答の有意な変動が予測可能である。 算術平均および標準偏差を各処理について提示する。 個々の応答の範囲もまた、各割合および形質転換について、最後のカラムにおいて示す。 PAT/Cry1F-形質転換アラビドプシスは、オーキシン感受性形質転換対照として働いた。 AAD-12（v1）遺伝子は、個々のT ₁アラビドプシス植物に除草剤抵抗性を付与した。 所定の処理の範囲内で、植物応答のレベルは大きく変化し、これは、各植物が独立した形質転換事象を表すという事実に起因する可能性がある。 重要な注目点として、試験した各2,4-Dの割合において、影響を受けなかった個体が存在し、一方、あるものは深刻に影響を受けた。 割合による全体的な集団の損傷平均は、単にAAD-12（v1）で形質転換した植物対野生型またはPAT/Cry1F-形質転換対照の間の有意な違いを実証するために、表11み提示する。 損傷レベルはより大きい傾向があり、損傷していない植物の頻度は、3,200g ae/ha（または6×圃場割合）まで上昇した割合でより低かった。 これらの高い割合においてもまた、噴霧溶液は、緩衝されない限り、高度に酸性になる。 生育チャンバー中で大部分生育されたアラビドプシスは、非常に薄いクチクラを有し、深刻な枯れ効果が、これらの上昇した割合において試験を複雑化する可能性がある。 それにも関わらず、多くの個体は、3,200g ae/haの2,4-Dで生き残り、ほとんど損傷がないか、全く損傷がなかった。

（表１１）AAD-1 v3（T ₄ ）ホモ接合性抵抗性集団、またはPat-Cry1Fで形質転換されたオーキシン感受性対照と比較した、発芽後に適用された一連の範囲の2,4-Dの割合に対するAAD-12（v1）で形質転換されたT ₁アラビドプシス応答

表12は、フェノキシプロピオン酸、ジクロルプロップに対するT ₁アラビドプシスの同様に実施した用量応答を示す。 データは、ジクロルプロップの除草剤的に活性な（R-）異性体がAAD-12（v1）のための適切な基質として働かないことを示す。 商業的に許容される耐性を付与するために、AAD-1がR-ジクロルプロップを十分良好に代謝するという事実は、2つの遺伝子を分ける1つの際立った特徴である（表12）。 AAD-1およびAAD-12は、それぞれ、R-およびS-特異的α-ケトグルタレートジオキシゲナーゼと見なされている。

（表１２）発芽後適用した一連の範囲のR-ジクロルプロップ割合に対するT ₁アラビドプシスの応答

7.6-選択マーカーとしてのAAD-12（v1）
選択剤として2,4-Dを使用して、選択マーカーとしてのAAD-12（v1）を使用する能力を、上記のように形質転換されたアラビドプシスを用いて最初に分析した。 約50個のT ₄世代アラビドプシス種子（AAD-12（v1）についてホモ接合性）を、約5,000個の野生型（感受性）種子に加えた（spiked）。 いくつかの処理を比較した。 植物の各トレイは、以下の処理スキーム：7 DAP、11 DAP、または7および続く11 DAPの1つで、1回または2回のいずれかの2,4-Dの適用のタイミングを受けた。 すべての個体は、同じ形質転換ベクター中にPAT遺伝子もまた含んだので、2,4-Dを用いて選択したAAD-12は、グルホシネートを用いて選択したPATと直接的に比較することができた。

処理は、以前に記載されたようなDeVilbiss噴霧チップを用いて適用した。 植物は、抵抗性または感受性の17 DAPとして同定した。 最適処理は、播種後7日および播種後11日（DAP）に適用した75 g ae/ha 2,4-Dであり、選択頻度が等しく有効であり、ならびにLiberty選択スキームよりも少ない、形質転換個体に対する除草剤損傷を生じた。 これらの結果は、AAD-12（v1）が、形質転換アラビドプシスの集団のための代替的な選択マーカーとして有効に使用可能であることを示す。

7.7-除草剤活性
種々のT ₁事象は、T ₂種子を産生するために自家受粉した。 これらの種子は、100個のランダムなT ₂同胞に2,4-D（200g ae/ha）を適用することによって、子孫を試験した。 各個々のT ₂植物を、噴霧適用（187L/ha適用割合のトラック噴霧器）の前に、7.5cm四方のポットに移植した。 T ₁ファミリー（T ₂植物）の75%が、χ二乗検定によって決定されるように（P>0.05）、メンデル遺伝に伴う優性遺伝する単一遺伝子座についての予測された3抵抗性：1感受性モデルに分離した。

種子を、12〜20個のT ₂個体（T ₃種子）から収集した。 8つのランダムに選択したT ₂ファミリーの各々からの25個のT ₃同胞を、以前に記載したように子孫について試験した。 ホモ接合性（非分離集団）であると予測されたT ₂ファミリーの約3分の1が、試験された各系統において同定された。 これらのデータは、AAD-12（v1）が安定に組み込まれ、メンデル様式で少なくとも3世代まで遺伝することを示す。

7.8-AAD-12アラビドプシスにおけるさらなる葉適用除草剤抵抗性
トランスジェニックアラビドプシスにおいて他のアリールオキシアルカノエートオーキシン除草剤に対する抵抗性を提供するAAD-12（v1）の能力を、種々の基質の葉適用によって決定した。 T ₂世代アラビドプシス種子を層形成し、アラビドプシスの選択トレイ（実施例6.4）と全く同様に選択トレイに播種した。 PATおよび昆虫抵抗性遺伝子Cry1Fを含む形質転換した対照系統を、同様の様式で植えた。 苗を、温室内の個別の3インチポットに移した。 すべての植物に、187L/haに設定したトラック噴霧器を使用して噴霧した。 これらの植物に、一定の範囲のピリジルオキシ酢酸除草剤：280〜2240g ae/ha トリクロピル（Garlon 3A, Dow AgroSciences）および280〜2240g ae/ha フルロキシピル（Starane, Dow AgroSciences）；およびAAD-12活性から生じる2,4-D代謝物、2,4-ジクロロフェノール（DCP、Sigma）（2,4-Dの280〜2240g ae/haに等価なモル濃度、工業グレードDCPを使用した）を噴霧した。 すべての適用は水中で製剤化した。 各処理は3〜4回反復した。 植物は、処理の3日後および14日後に評価した。

トランスジェニック非AAD-12対照アラビドプシス（Pat/Cry1F）に対する、2,4-D代謝物である2,4-ジクロロフェノール（DCP）の効果は存在しない。 AAD-12形質転換植物はまた、形質転換非抵抗性対照において見られたトリクロピルおよびフルロキシピル除草剤損傷から明確に保護された（表13を参照されたい）。 これらの結果は、アラビドプシス中のAAD-12（v）が、試験したピリジルオキシ酢酸オーキシンに対する抵抗性を提供することを確認した。 これは、ピリジルオキシ酢酸除草剤に対して有意な活性を有する酵素の最初の報告である。 他の2,4-D分解酵素は同様の活性を有することが報告されていない。

（表１３）種々の葉適用オーキシン除草剤に対する、T ₂ AAD-12（v1）および形質転換対照アラビドプシス植物の応答の比較

^*本実験における植物は、発育不良かつ深刻に上偏生長性であったが、緑色のままででありかつ>75%の損傷評価を受けなかった。

7.9-AAD-12（v1）アラビドプシスの分子分析
PAT遺伝子コピー数分析のためのインベーダーアッセイ（Third Wave Agbioキット手順の方法）を、Qiagen DNeasyキットから入手した全DNAを用いて、複数のAAD-12（v1）ホモ接合性系統に対して実施して、PATおよびAAD-12（v1）を含む植物形質転換単位の安定な組み込みを決定した。 分析は、これらの遺伝子の直接的な物理的連鎖を前提とした。 これらが同じプラスミド上に含まれたからである。

結果は、アッセイしたすべての2,4-D抵抗性植物がPAT（および従って、推測により、AAD-12（v1））を含んだことを示した。 コピー数分析は、1から5コピーまでの範囲の全体の挿入物を示した。 これもまた、酵素の存在が、すべての市販のフェノキシ酢酸およびピリジルオキシ酢酸に対して有意に高いレベルの抵抗性を生じることを示す、AAD-12（v1）タンパク質発現データと相関している。

7.10-AAD-12（v1）およびグリホセート抵抗性遺伝子の分子重ね合わせで形質転換されたアラビドプシス
推定のグリホセート抵抗性形質をコードするpDAB3759プラスミド（AAD-12（v1）+EPSPS）を含むT ₁アラビドプシス種子を、以前に記載したように産生した。 実施例7.6に記載したように、T ₁形質転換体を、選択マーカーとしてAAD-12（v1）を使用して選択した。 T ₁植物（個別の形質転換した事象）を、以前に記載したように、最初の選択試行から回収し、温室内の3インチポットに移した。 3つの異なる対照アラビドプシス系統：野生型Columbia-0、AAD-12 (v1) + PAT T ₄ホモ接合性系統（pDAB724-形質転換）、およびPAT + Cry1Fホモ接合性系統（形質転換対照）もまた試験した。 pDAB3759およびpDAB724形質転換植物を、2,4-D耐性のために苗の段階であらかじめ選択した。 移植の4日後、水中の0、26.25、105、420、または1680g ae/haグリホセート（Glyphomax Plus, Dow AgroSciences）を用いる、以前に記載したようなトラック噴霧器による葉処理のために、植物を均等に分けた。 すべての処理を、5〜20回複製した。 植物を、処理の7日後または14日後に評価した。

初期の抵抗性評価は、2,4-Dに対して耐性である植物が、これらの3つの対照系統の応答に対して比較した場合に、グリホセートに対して引き続き耐性であったことを示した。 これらの結果は、2,4-Dおよびグリホセート耐性を含む、異なる作用の様式を有する2種の除草剤に対する抵抗性を植物に付与でき、両方の除草剤の発芽後適用が可能であることを示す。 加えて、AAD-12 + 2,4-Dは、真の抵抗性選択のために選択マーカーとして有効に使用した。

（表１４）発芽後に（14 DAT）適用した一定の範囲のグリホセートの割合に対する、T ₁アラビドプシス応答

7.11-より広い範囲の除草剤抵抗性を与えるためにAAD-1と遺伝的に重ね合わせしたAAD-12アラビドプシス
AAD-12（v1）（pDAB724）およびAAD-1（v3）（pDAB721）植物は、逆交雑し、F ₁種子を収集した。 8個のF ₁種子を植え、種子を産生するために生育させた。 組織試料を8個のF ₁植物から採取し、ウエスタン分析に供して、両方の遺伝子の存在を確認した。 試験した8個すべての植物がAAD-1とAAD-12の両方のタンパク質を発現したことが結論付けられた。 種子は一緒にし、播種の前1週間、乾燥させた。

100個のF ₂種子をまき、280 g ai/haグルホシネートを適用した。 96個のF ₂植物が、グルホシネート抵抗性のための2つの独立して類別される遺伝子座についての予想分離比（15R：1S）に適合するグルホシネート選択で生存した。 次いで、グルホシネート抵抗性植物は、他の試験のために使用したのと同じ噴霧レジメン下で植物に適用した、560g ae/ha R-ジクロルプロップ+560g ae/ha トリクロピルで処理した。 植物は、3および14 DATに等級付けした。 グルホシネート選択で生存した96個の植物の中の63個は、除草剤適用でもまた生存した。 これらのデータは、各遺伝子がオーキシン除草剤の一方のみ（R-ジクロルプロップまたはトリクロピルのいずれか）に抵抗性を与える場合の2つの独立して類別される優性形質の予想分離パターン（9R：6S）と一貫している。 結果は、AAD-12（pDAB724）がAAD-1（pDAB721）と首尾よく重ね合わせ可能であることを示し、従って、関心対象の作物に適用されてもよい除草剤の範囲［それぞれ、(2,4-D+R-ジクロルプロップ)および（2,4-D+フルロキシピル+トリクロピル）］を増加させる。 このことは、2つの別々の2,4-D抵抗性遺伝子の従来的な重ね合わせを通して、非常に感受性である種に2,4-D耐性をもたらすために有用であり得る。 加えて、どちらかの遺伝子を、独立した形質転換活性を通して関心対象の第3および第4の遺伝子のための選択マーカーとして使用するならば、各遺伝子対は、従来的な育種活動を通して一緒にされ、引き続いてAAD-1酵素とAAD-12酵素の間で独占的である除草剤を用いる対の噴霧を通してF ₁世代で選択することができる（上記でAAD-1とAAD-12についてそれぞれR-ジクロロプロップおよびトリクロピルを用いて示されるのと同様に）。

他のAAD重ね合わせもまた本発明の範囲内にある。 例えば、本明細書の他の箇所で議論されているTfdAタンパク質（Streber et al）は、本発明のトランスジェニック植物において除草剤抵抗性のより新規な（nover）範囲を付与するために、対象のAAD-12遺伝子と一緒に使用することができる。

実施例8-イマゼタピル選択を使用する、トウモロコシのウィスカー媒介形質転換
8.1-AAD-12（v1）のクローニング
AAD-12（v1）遺伝子は、NcoI/SacIフラグメントとして中間体ベクターpDAB3283から切断した。 これを、ZmUbi1単子葉プロモーターを含む同様に切断したpDAB3403ベクターに直接的にライゲーションした。 2つのフラグメントを、T4 DNAリガーゼを使用して一緒にライゲーションし、DH5α細胞に形質転換した。 ミニプレップを、QiagenのQIA Spinミニプレップキットを使用して、得られるコロニー上で実施し、これらのコロニーを消化して、方向について確認した。 この最初の中間体構築物（pDAB4100）は、ZmUbi1：AAD-12（v1）カセットを含む。 この構築物を、Not1およびPvu1で消化して遺伝子カセットを遊離させ、望ましくないバックボーンを消化した。 これを、イネアクチンプロモーターOsAct1によって駆動されるAHAS選択マーカーを含む、NotI切断したpDAB2212にライゲーションした。 最終構築物は、pDAB4101またはpDAS1863と名付け、ZmUbi/AAD-12（v1）/ZmPer5::OsAct1/AHAS/LZmLipを含む。

8.2-カルス/懸濁の開始
カルス培養の開始のために未成熟胚を得るために、温室で生長したHi-II親AおよびBの間のF ₁交雑を実施した（Armstrong et al. 1991）。 胚が1.0〜1.2mmのサイズになった場合（受粉後約9〜10日）、穂を収集し、表面を、Liqui-Nox（商標）で磨いて洗浄することによって表面殺菌し、70%エタノールに2〜3分間浸漬し、次いで20%の市販の漂白剤（0.1%次亜塩素酸ナトリウム）に30分間浸漬した。

穂を、滅菌した蒸留水ですすぎ、未成熟接合体胚を無菌的に切除し、15Ag10培地（N6培地 (Chu et al., 1975)、1.0mg/L 2,4-D、20 g/L スクロース、100mg/L カゼイン加水分解物（酵素消化）、25mM L-プロリン、10 mg/L AgN0 ₃ 、2.5 g/L Gelrite, pH 5.8）上で、胚盤を培地から離れるように向けて2〜3週間培養した。 適切な形態（Welter et al., 1995）を示す組織を、約6週間の間、週に2回の間隔で新鮮な15Ag10培地に選択的に移し、次いで、約2ヶ月間の間、週に2回の間隔で4培地（N6培地、1.0mg/L 2,4-D、20g/L スクロース、100mg/L カゼイン加水分解物（酵素消化）、6 mM L-プロリン、2.5 g/L Gelrite、 pH 5.8）に移した。

胚形成懸濁培養を開始するために、単一の胚から生じたカルス組織の約3mlの充填した細胞量（PCV）を、約30mlのH9CP+液体培地（MS基礎塩混合物（Murashige and Skoog, 1962)、10倍少ないニコチン酸および5倍多いチアミン-HCl、2.0mg/L 2,4-D、2.0mg/L α-ナフタレン酢酸 (NAA)、30g/Lスクロース、200mg/L カゼイン加水分解物（酸消化）、100mg/L ミオ-イノシトール、6mM L-プロリン、5% v/v ココナッツ水（サブ培養直前に加えた）、pH 6.0を含む改変MSビタミン）に加えた。 懸濁培養を、暗条件下で、125ml Erlenmeyerフラスコ中で、125rpmおよび28℃に設定した温度制御シェーカー中で維持した。 細胞系統は、典型的には、開始後2ヶ月から3ヶ月以内に樹立されるようになる。 樹立の間、ワイドボアピペットを使用して3ml PCVおよび7mlの馴化培地を20mlの新鮮なH9CP+液体培地に加えることによって、懸濁物を3.5日毎に継代培養した。 一旦、組織が成長で倍加を開始したら、懸濁物をスケールアップし、500mlフラスコに維持し、それによって、12ml PCVの細胞および28ml 馴化培地を80ml H9CP+培地に移した。 一旦懸濁物が完全に樹立されると、将来の使用のために凍結保存した。

8.3-凍結保存および懸濁物の融解
継代培養の2日後、4ml PCVの懸濁細胞および4mlの馴化培地を8mlの凍結防止剤（ココナッツ水を含まないH9CP+培地に、1Mグリセロール、1M DMSO、2Mスクロースを溶解、フィルター滅菌する）に加え、125mlフラスコ中、125rpmで、4℃、1時間振盪させた。 1時間後、4.5mlを冷やした5.0mlのCorning凍結バイアルに加えた。 一旦充填されると、個々のバイアルを、制御速度フリーザー中にて4℃で15分間保持し、次いで、-40℃の最終温度に達するまで、-0.5℃/分の速度で凍結させた。 最終温度に到達した後、バイアルを、液体窒素蒸気で満たしたCryoplus 4貯蔵ユニット（Forma Scientific）の内側のラック中の箱に移した。

融解するために、バイアルを、貯蔵ユニットから取り出し、密閉したドライアイス容器の中に配置し、次いで、40〜45℃に保持したウォーターバスに、「沸騰」がおさまるまで突っ込んだ。 融解した場合、内容物を、ふたがある100×25mmペトリ皿中の〜8枚の重ねた滅菌70 mm Whatman濾紙（No. 4）に注いだ。 液体を数分間濾紙に吸収させ、次いで、細胞を含む上端の濾紙をGN6培地（N6培地、2.0 mg/L 2,4-D、30g/Lスクロース、2.5 g/L Gelrite、pH 5.8）の上に1週間移した。 1週間後、見込みのある形態を有する組織のみを、濾紙から直接的に新鮮なGN6培地に移した。 この組織を、1〜3グラムが、125ml Erlenmeyerフラスコ中の約30mL H9CP+培地への懸濁の開始のために使用可能になるまで、7〜14日毎に継代培養した。 以前に記載されたようにその時点で継代培養が行われた、全体で12ml PCVが得られるまで、3mlのPCVを新鮮なH9CP+培地に3.5日毎に継代培養した。
8.4-安定的な形質転換
形質転換の約24時間前に、12ml PCVの以前に凍結した胚形成トウモロコシ懸濁細胞プラス28mlの馴化培地を、500 mlのErlenmeyerフラスコ中の80mlのGN6液体培地（Gelriteを欠くGN6培地）に継代培養し、125rpm、28℃のシェーカー上に配置した。 全体で36ml PCVが3つのフラスコに分布するように、同じ細胞系統を使用して、これを2回反復した。 24時間後、GN6液体培地を取り出し、細胞に原形質分離を起こさせるために、フラスコあたり72ml GN6 S/M振盪培地（N6培地、2.0 mg/L 2,4-D、30g/L スクロース、45.5g/L ソルビトール、45.5 g/L マンニトール、100mg/L ミオ-イノシトール、pH 6.0）で置き換えた。 フラスコを、暗所で125RPMで振動するシェーカー上に28℃で30〜35分間配置し、この時間の間、適切な量8.1mlのGN6 S/M液体培地を、〜405mgのあらかじめオートクレーブした無菌シリコンカーバイドウィスカー（Advanced Composite Materials, Inc.）に加えることによって、シリコンカーバイドウィスカーの50mg/ml懸濁液を調製した。

GN6 S/M中でのインキュベーション後、各フラスコの内容物を250ml遠心分子ボトルにプールした、一旦すべての細胞が底にたまると、〜14mlのGN6 S/Mを除いて引き出され、将来の使用のために滅菌1Lフラスコに収集した。 あらかじめ濡らしたウィスカーの懸濁物を、最大速度で60秒間ボルテックスにより激しく撹拌し、続いて8.1mlをボトルに加え、最終段階として170μg DNAをそこに加えた。 ボトルを、市販のペイントミキサー、改良Red Devil 5400に直に配置し、10秒間攪拌した。 攪拌後、浸透圧を減少するために、細胞のカクテル、培地、ウィスカー、およびDNAを、125mlの新鮮なGN6液体培地とともに、1Lフラスコの内容物に加えた。 細胞を、125RPMのシェーカー上で28℃で2時間回収し、その後、室内の真空ラインに接続したガラス細胞コレクターユニットを使用して、Whatman #4濾紙（5.5cm）上で濾過した。

約2mlの分散した懸濁液を、真空が引かれるに従って、フィルターにピペットにより移した。 フィルターは、GN6培地の60×20mmプレート上に配置した。 プレートは、個々のプレートの蒸発を最小化するために単一のプラスチックの層（<2ミル厚）でゆるくシールした暗箱中で、28℃で1週間培養した。

1週間後、濾紙をGN6（3P）培地（N6培地、2.0mg/L 2,4-D、30g/L スクロース、100mg/L myo-イノシトール、Pursuit（登録商標）DGからの3μM イマゼタピル、2.5g/L Gelrite、pH 5.8）の60×20mmプレートに移した。 プレートを箱の中に配置し、さらに1週間培養した。

形質転換の2週間後、Pursuit（登録商標）DGからの3μM イマゼタピルを含む、溶解した3.0mlのGN6アガロース培地（121℃で10分間だけオートクレーブした、N6培地、2.0mg/L 2,4-D,30g/L スクロース、100mg/L myo-イノシトール、7g/L Sea Plaqueアガロース、pH 5.8）に、プレート上のすべての細胞をこすり取ることによって、組織を包埋した。 この組織を破壊し、3mlのアガロースおよび組織を、GN6（3P）の100×15mmプレートの表面に均一に注いだ。 この操作を、残りのすべてのプレートで反復した。 一旦包埋すると、プレートはNescofilm（登録商標）またはParafilm M（登録商標）で個別にシールし、次いで、推定の単離物が出現するまで培養した。

8.4.1-単離物の回収および再生のためのプロトコール
推定の形質転換事象は、形質転換の約9週間後に、60×20mmプレート中の同じ濃度の新鮮な選択培地に移すことによって、Pursuit（登録商標）を含有する包埋プレートを単離した。 持続性の増殖が約2〜3週間後に明白であれば、その事象は抵抗性であると見なされ、分子分析に提出した。

再生は、Pursuit（登録商標）DGからの3μM イマゼタピル、MS塩およびビタミン、30.0g/L スクロース、5mg/L BAP、0.25mg/L 2,4-D、2.5g/L Gelrite;pH 5.7を含む、サイトカイニンベースの誘導培地、28（3P）にカルス細胞を移すことによって開始した。 細胞は、微小光（13μEm ^-2 s ^-1 ）中で1週間増殖させ、次いで、明光（40μEm ^-2 s ^-1 ）でもう一週間増殖させ、その後、植物増殖調節因子を欠いている以外は28（3P）と同一である再生培地36（3P）に移した。 小さな（3〜5cm）植物体を取り出し、選択なしのSHGA培地（SchenkおよびHildebrandtの基礎塩およびビタミン、1972；1g/L myo-イノシトール、10g/L スクロース、2.0g/L Gelrite,pH 5.8）を含む150×25mm培養チューブに配置した。 一旦植物体が十分な根およびシュート系を発達したら、これらは温室の中の土に移植した。

4つの実験から、シュートおよび根から構成される完全な植物体が、従来的なカルス段階になることなく、暗条件下で包埋した選択プレート上でインビトロで形成した。 これらの「初期再生」の中の9個からの葉組織は、それぞれ、AAD-12遺伝子および遺伝子カセットについてのコード領域PCRおよび植物転写単位（PTU）PCRのために提出した。 すべてが無傷のAAD-12コード領域を有しており、一方3つが全長PTUを有さなかった（表15）。 これらの「初期再生体」は、4101事象として同定され、これらを「1283」事象と同定された従来的に誘導された事象から区別した。 標準的な選択および再生を経由して得られた19個のさらなる事象からの植物は、T ₁種子を産生するために、温室に送り、成熟するまで生育させ、および製品として販売されている近交系と他花受粉させた。 事象のいくつかは、サザンブロット後の類似のバンドパターンのために、互いのクローンであるらしく、そこで、14個のみの独特な事象が提示された。 事象からのT ₀植物は、70g/ha イマゼタピルに耐性であった。 インベーダー分析（AHAS遺伝子）は、1から>10コピーまでの範囲の挿入完全性を示した。 13個の事象は、AAD-12についての完全なコード領域を含んだが；しかし、さらなる分析は、完全な植物形質転換単位が9個の事象では取り込まれていなかったこと示した。 損なわれた1863個の事象のいずれもが、T1段階を超えて進行せず、さらなる特徴付けは4101事象を利用した。

8.5-分子分析：トウモロコシ材料および方法
8.5.1-組織の収集、DNAの単離および定量
新鮮な組織をチューブに配置し、4℃で2日間凍結乾燥する。 組織を完全に乾燥させた後、タングステンビーズ（Valenite）をチューブ中に配置し、試料を、1分間、Kelcoビーズミルを使用する乾式粉砕に供する。 次いで、標準的なDNeasy DNA単離手法に従う（Qiagen, DNeasy 69109）。 次いで、抽出したDNAのアリコートをPico Green（Molecular Probes P7589）で染色し、濃度をng/μlで得るために既知の標準を用いてフルオロメーター（BioTek）で読み取る。

8.5.2-インベーダーアッセイ分析
DNA試料を20ng/μlに希釈し、次いで95℃で10分間、サーモサイクラー中のインキュベーションによって変性させる。 次いで、Signal Probeミックスを、提供されるオリゴミックスおよびMgCl ₂を使用して調製する（Third Wave Technologies）。 7.5μlのアリコートをインベーダーアッセイプレートの各ウェルに配置し、続いて対照、標準、および20ng/μlに希釈した未知の試料の7.5μlのアリコートを配置する。 各ウェルに15μlのミネラルオイル（Sigma）を重層する。 次いで、プレートを、63℃で1時間インキュベートし、フルオロメーター（Biotek）上で読み取る。 バックグラウンド内部対照プローブよりも上のシグナル%で除算した、標的プローブについてのバックグラウンドよりも上のシグナル%の計算は、比率を計算する。 サザンブロット分析を用いて開発されかつ確証された既知のコピー標準の比率を使用して、未知の事象の見積もったコピーを同定する。

8.5.3-ポリメラーゼ連鎖反応
全体で100ngの全DNAを鋳型として使用する。 20mMの各プライマーを、Takara Ex Taq PCR Polymeraseキット（Mirus TAKRR001A）とともに使用する。 AAD-12（v1）PTUのためのプライマーは、フォワード-

である。 PCR反応を、9700 Geneampサーモサイクラー（Applied Biosystems）において、試料を、94℃で3分間、ならびに94℃で30秒間、63℃で30秒間、および72℃で1分間と45秒間の35サイクル、続いて72℃で10分間に供することによって実行する。

AAD-12（v1）コード領域PCRのためのプライマーは、フォワード-

である。 PCR反応を、9700 Geneampサーモサイクラー（Applied Biosystems）において、試料を、94℃で3分間、ならびに94℃で30秒間、65℃で30秒間、および72℃で1分間と45秒間の35サイクル、続いて72℃で10分間に供することによって実行する。 PCR産物を、EtBrで染色した1%アガロースゲル上での電気泳動によって分析する。

8.5.4-サザンブロット分析
サザンブロット分析を、Qiagen DNeasyキットから得たゲノムDNAを用いて実施する。 全体で2μgの葉ゲノムDNA、または10μgのカルスゲノムDNAを、BSM IおよびSWA I制限酵素を使用する一晩消化に供し、PTUデータを得る。

一晩消化の後、〜100ngのアリコートを1%ゲル上で泳動し、完全な消化を保証する。 この保証後、試料を、大きな0.85%アガロースゲル上で、一晩40ボルトで泳動する。 次いで、このゲルを、0.2M NaOH、0.6M NaCl中で30分間変性させる。 次いで、このゲルを、pH 7.5の0.5M Tris HCl、1.5M NaCl中で30分間中和させる。 次いで、20×SSCを含むゲル装置を、ゲルからナイロンメンブレン（Millipore INYC00010）への重力による転写を得るために一晩設定する。 一晩の転写後、次いで、このメンブレンを、1200 X100マイクロジュールで、クロスリンカー（Stratagene UV stratalinker 1800）によりUV光に供する。 次いで、このメンブレンを、0.1% SDS、0.1 SSC中で45分間洗浄する。 45分間の洗浄後、このメンブレンを80℃で3時間焼き、次いでハイブリダイゼーションまで4℃に保存する。 ハイブリダイゼーション鋳型フラグメントは、プラスミドDNAを使用する上記のコード領域PCRを使用して調製する。 産物を1%アガロースゲル上で泳動し、切除し、および次いで、Qiagen（28706）ゲル抽出手法を使用してゲル抽出する。 次いで、このメンブレンを、Perfect Hyb緩衝液（Sigma H7033）中で1時間、60℃段階のプレハイブリダイゼーションに供する。 Prime it RmT dCTP-labeling rxn（Stratagene 300392）手法を使用して、p32に基づくプローブを開発する（Perkin Elmer）。 このプローブを、Probe Quant. G50 カラム（Amersham 27-5335-01）を使用して精製する。 200万カウントCPMを使用して、サザンブロットを一晩ハイブリダイズさせる。 一晩のハイブリダイゼーションの後、次いで、このブロットを、0.1% SDS、0.1 SSC中で65℃における2回の20分間の洗浄に供する。 次いで、このブロットを、-80℃でインキュベートしてフィルムに一晩露光させる。

8.6-AAD-12形質転換T ₀ トウモロコシにおける発芽後除草剤耐性
4つのT ₀事象を温室内で馴化させ、2〜4枚の新たな正常な外見の葉が輪生から現れるまで生育させた（すなわち、植物は、組織培養から温室生育条件に移行した）。 植物を、温室内で、16時間明期：8時間暗期条件で27℃で生育させた。 次いで、植物を、Pursuit（登録商標）（イマゼタピル）または2,4-D Amine 4のいずれかの市販の製剤で処理した。 Pursuit（登録商標）は、試験した事象の中に存在する選択マーカー遺伝子の機能を実証するために噴霧した。 除草剤適用は、トラック噴霧器を用いて、187L/haの噴霧量、50cm噴霧高さで行った。 植物に、致死用量のイマゼタピル（70g ae/ha）、または非形質転換トウモロコシ系統に有意な損傷を与えることが可能である割合の2,4-D DMA塩（2240g ae/ha）のいずれかを噴霧した。 致死用量は、Hi-II近交系に対する>95%損傷を引き起こす割合として定義される。 Hi-IIは、本発明の形質転換体の遺伝的バックグラウンドである。

いくつかの個体は、それぞれの遺伝子がそれに対する抵抗性を与えるために存在した除草剤から安全にされた。 しかし、事象「001」からの個別のクローン「001」（別名4101 (0)-001-001）は、わずかな損傷を受けたが、14 DATまでに回復した。 4つの事象の中の3つは前に進め、個体は5XH751と交配させ、次世代となった。 各除草剤耐性植物は、それぞれ、2,4-D耐性植物およびイマゼタピル耐性植物のAAD-12コード領域の存在について（PCRアッセイ）またはAHAS遺伝子の存在について（インベーダーアッセイ）、陽性であった。 AAD-12タンパク質は、無傷のコード領域を含むすべての2,4-D耐性T ₀植物事象において検出した。 導入遺伝子（AHAS、および推定のAAD-12による）のコピー数は、1コピーから15コピーまで有意に変化した。 個々のT ₀植物は成熟するまで生育させ、およびT ₁種子を産生するために、製品として販売されている近交系と他花受粉させた。

（表１５）AAD-12で形質転換したT ₀トウモロコシ植物の特徴付け

8.7-T ₁ トウモロコシにおける高い2,4-D耐性の確認
T ₁ AAD-12（v1）種子は、Metro Mix培地を含む3インチポットに植え、2葉段階で、ヌルを除去するために70g ae/haイマゼタピルを噴霧した。 生存している植物を、Metro Mix培地を含む1ガロンポットに移植し、前と同じ生育条件に配置した。 V3-V4段階において、植物に、560または2240g ae/ha 2,4-D DMAのいずれかで、187L/haに設定したトラック噴霧器で噴霧した。 植物は、3および14 DATで等級付けし、5XH751×Hi H対照植物と比較した。 0〜10の等級スケール（極度のオーキシン損傷までの損傷なし）は、支柱根損傷を区別するために開発した。 支柱根損傷の等級は14DATに取り、2,4-D耐性を示した。 2,4-Dは支柱根の奇形を引き起こし、トウモロコシでのオーキシン除草剤損傷の一貫した指標である。 支柱根データは（以下の表に見られるように）、試験した3つの事象の中の2つが、2240g ae/ha 2,4-D DMAに対して強固に耐性であったことを実証する。 事象「pDAB4101(0)001.001」は見かけ上不安定であった；しかし、他の2つの事象は2,4-Dおよび2,4-D+イマゼタピル、または2,-4D+グリホセートに対して強固に耐性であった（表16を参照されたい）。

（表１６）AAD-12（v1）形質転換T ₁植物および非形質転換対照トウモロコシ植物の支柱根損傷。 10を最高とする0〜10のスケールを使用して、2,4-D DMA損傷を等級付けした。 結果は、処理あたり4回の複製の見かけの平均である。

8.8-トウモロコシにおけるAAD-12（v1）遺伝性
子孫試験もまた、5XH751と交配させた7つのAAD-12（v1）T ₁ファミリーに対して実施した。 種子は、上記のように3インチポットに植えた。 3葉段階において、すべての植物に、以前に記載したようにトラック噴霧器で70g ae/haイマゼタピルを噴霧した。 14 DAT後、抵抗性植物および感受性植物を計数した。 χ二乗検定によって決定されるように、試験した6つの系統のうちの4つが、単一の遺伝子座である優性メンデル形質（1R:1S）として分離した。 生存している植物に、引き続いて2,4-Dを噴霧し、すべての植物は2,4-Dに対して耐性であると見なした（割合≧560g ae/ha）。 AAD-12は、市販の雑種に逆交配した場合に、複数の種において強固なアリールオキシアルカノエートオーキシン抵抗性遺伝子として遺伝性である。

8.9-除草剤の範囲を増加させるためのAAD-12（v1）の重ね合わせ
AAD-12（v1）（pDAB4101）および優良Roundup Ready同系繁殖体（BE1146RR）を逆交配し、F ₁種子を収集した。 2つのF ₁系統からの種子を植え、ヌルを除去するためにV2段階で70g ae/ha イマゼタピルで処理した。 生存している植物に対して、代表を分離し、1120g ae/ha 2,4-D DMA＋70g ae/haイマゼタピル（AHAS遺伝子の存在を確認するため）または1120g ae/ha 2,4-D DMA＋1680g ae/haグリホセート（Roundup Ready遺伝子の存在を確認するため）のいずれかで、187L/haに較正したトラック噴霧器中で処理した。 植物を3 DATおよび16 DATに等級付けした。 噴霧データは、AAD-12（v1）が、トウモロコシに安全に適用される可能性がある除草剤の増加した範囲を提供するために、グリホセート耐性遺伝子（例えば、Roundup CP4-EPSPS遺伝子）または他の除草剤耐性遺伝子と、簡便に重ね合わせ可能であることを示した。 同様に、イミダゾリノン+2,4-D+グリホセート耐性をF ₁植物において観察し、この耐性は、これらの複数の導入遺伝子の分子的または育種的な重ね合わせの組み合わせによって負の表現型を示さなかった。

（表１７）AAD-12（v1）およびBE1146RR（AFと略される優良グリホセート耐性同系繁殖体）のF ₁重ね合わせから得られる除草剤耐性範囲の増加を示すデータ

8.10-2,4-D、トリクロピル、およびフルロキシピル除草剤に対する、pDAB4101形質転換トウモロコシ植物の圃場耐性
圃場レベル耐性試験は、2つのAAD-12（v1）pDAB4101事象（4101(0)003.R.003.AFおよび4101(0)005.ROOl.AF）および1つのRoundup Ready（RR）対照雑種（2P782）に対して、インディアナ州ファウラー（Fowler, Indiana）およびミシシッピー州ウェイサイド（Wayside, Mississippi）において実施した。 種子は、トウモロコシ種まき機を用いて、ウェイサイドでは40インチの作条間隔で、およびファウラーでは30インチ間隔で植えた。 実験設計は、3つの複製を用いるランダム化された完全なブロック設計であった。 除草剤処理は、1120、2240、および4480g ae/haの2,4-D（ジメチルアミン塩）、840g ae/haのトリクロピル、280g ae/haのフルロキシピル、ならびに未処理対照であった。 AAD-12（v1）事象は、選択マーカーとしてAHAS遺伝子を含んだ。 F ₂トウモロコシ事象は分離であったので、AAD-12（v1）植物は、ヌル植物を除去するために70g ae/haのイマゼタピルで処理した。 除草剤処理は、トウモロコシがV6段階に到達したときに、130〜200kpa圧力で187L/haキャリア体積を送達する圧縮空気バックパック噴霧器を使用して適用した。 視覚的損傷評価は、処理の7日後、14日後、および21日後に取った。 支柱根損傷評価は、0〜1：わずかに支柱根融合である、1〜3：中程度の支柱根の膨張／遊走および根の増殖である、3〜5：中程度の支柱根融合である、5〜9：深刻な支柱根融合および奇形である、ならびに10：支柱根の全体的な阻害である、の0〜10のスケールで、28DATにおいて取った。

処理の14日後の2,4-D、トリクロピル、およびフルロキシピルに対するAAD-12（v1）事象応答を表18に示す。 作物損傷は14 DATにおいて最も深刻であった。 RR対照トウモロコシ（2P782）は、通常の（fnormal）圃場使用割合の8倍（8×）である、4480g ae/haの2,4-Dによって深刻に損傷した（14 DATにおいて44%）。 AAD-12（v1）事象はすべて、14 DATにおいて2,4-Dに対して優秀な耐性を実証し、1×、2×、および4×それぞれの割合において0%損傷であった。 対照トウモロコシ（2P782）は、2×割合のトリクロピル（840g ae/ha）において深刻に損傷した（14 DATにおいて31%）。 AAD-12（v1）事象は、2×割合のトリクロピルにおいて耐性を実証し、2つの事象間で14 DATにおいて平均3%損傷であった。 280g ae/haのフルロキシピルは、14 DATにおいて、野生型トウモロコシに対して11%の見かけの損傷を引き起こした。 AAD-12（v1）事象は耐性の増加を実証し、5 DATにおいて平均8%損傷であった。

V6生育段階におけるトウモロコシに対するオーキシン系除草剤の適用は、支柱根の奇形を引き起こし得る。 表18は、2,4-D、トリクロピル、およびフルロキシピルによって引き起こされる支柱根損傷の深刻さを示す。 840g ae/haのトリクロピルは、2P782対照型トウモロコシにおける7の平均支柱根損傷スコアを生じる、最も深刻な支柱根の融合および奇形を引き起こした。 両方のAAD-12（v1）トウモロコシ事象は、トリクロピル処理からの支柱根損傷を示さなかった。 2P782トウモロコシにおける支柱根損傷は、増加割合の2,4-Dとともに増加した。 4480g ae/haの2,4-Dにおいて、AAD-12事象は支柱根損傷を示さなかった；一方、深刻な支柱根の融合および奇形は、2P782雑種において見られた。 フルロキシピルは、野生型トウモロコシにおいて中程度の支柱根膨張および遊走のみを引き起こし、AAD-12（v1）事象は支柱根損傷を示さなかった。

このデータは、AAD-12（v1）が、商業的に使用されるものをはるかに超える割合で2,4-D、トリクロピル、およびフルロキシピルに対する高レベルの耐性をトウモロコシ中で伝達すること、ならびに非AAD-12（v1）トウモロコシに、深刻な視覚的および支柱根の損傷を引き起こすことを明確に示す。

（表１８）圃場条件下で2,4-D、トリクロピル、およびフルロキシピルの葉適用後のAAD-12事象および野生型トウモロコシの視覚的損傷

（表１９）圃場条件下で2,4-D、トリクロピル、およびフルロキシピルに応答するAAD-12および野生型トウモロコシ植物の支柱根損傷の割合

実施例9-形質転換植物からの抗体を介するタンパク質検出
9.1-植物葉からのAAD-12（v1）の抽出
約50〜100mgの葉組織を小片（または単一の穴をあけた4枚の葉ディスク）に切断し、2つのステンレス鋼BBビース（4.5 mm; Daisy Co., カタログ番号145462-000）を含む2mlクラスターチューブに入れた。 500μLの植物抽出緩衝液（0.05 % Tween 20および1% ウシ血清アルブミンを含むPBS）を各試料に加えた。 チューブにふたをして、Geno/Grinder（モデル2000-115、Certiprep, Metuchen, NJ）に固定し、1×500rpmの設定を用いて6分間振盪した。 チューブを5000×gで10分間遠心分離し、可溶性タンパク質を含む上清を、ウエスタンブロットおよびELISAを使用して、AAD-12（v1）について分析した。

9.2-酵素結合免疫吸着アッセイ法（ELISA）
他に言及しない限り、アッセイ法を室温で行った。 100μLの精製抗AAD-12抗体（0.5μg/mL）を、96ウェルマイクロタイタープレートウェル上にコートし、4℃で16時間インキュベートした。 このプレートを、洗浄緩衝液（0.05% Tween 20を含む100mM リン酸緩衝化生理食塩水 (PBS; pH 7.4)）を用いて、プレートウォッシャーを使用して4回洗浄し、続いてPBS中に溶解した4%スキムミルクを用いて1時間ブロッキングした。 洗浄後、100μLの既知の濃度のAAD-12標準または異なる試料由来の植物抽出物を、ウェル中でインキュベートした。 標準曲線のために、精製AAD-12を3回通り52〜0.813ng/mLの範囲で連続的に2倍希釈した。 植物抽出物を、PBS中で5倍、10倍、20倍、および40倍希釈し、2回通り分析した。 1時間のインキュベーション後、プレートを上記のように洗浄した。 100μLの抗AAD-12抗体-HRP結合体（0.5μg/mL）を、各ウェル中で1時間インキュベートし、その後洗浄した。 100μLのHRP基質、1-Step（商標）Ultra TMB-ELISA（Pierce, Rockford, IL）を、10分間各ウェル中でインキュベートし、その後反応を、100μL 0.4NH ₂ SO ₄を添加することによって停止した。 各ウェルのODを、マイクロプレートリーダーを使用して、450nmで測定した。 植物抽出物中のAAD-12（v1）の濃度を決定するために、2通りOD値を平均し、Softmax（商標）Pro ver. 4.0（Molecular Devices）を使用して標準曲線から外挿した。

比較のために、各試料をその生体重で標準化し、発現パーセントを計算した。

9.3-ウエスタンブロット分析
植物抽出物またはAAD-12標準（5および0.5μg/mL）を、Laemmli試料緩衝液とともに95℃で10分間インキュベートし、8〜16% Tris-グリシンプレキャストゲル中で電気泳動的に分離した。 次いで、タンパク質を、標準的なプロトコールを使用して、ニトロセルロースメンブレンに電気泳動的に転写した。 PBS中の4%スキムミルク中でのブロッキング後、AAD-12（v1）タンパク質を、抗AAD-12抗血清、続いてヤギ抗ウサギ/HRP結合体によって検出した。 検出したタンパク質を、化学発光異質ECLウエスタン分析試薬（Amersham, NJ）によって可視化した。

実施例10-タバコの形質転換
アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いるタバコの形質転換を、公開されている方法（Horsch et al., 1988）と類似しているが同一ではない方法によって実行した。 形質転換のための供給源組織を提供するために、タバコ種子（ニコチアナ タバカム(Nicotiana tabacum) cv. KY160）を表面殺菌し、寒天で固化したホルモンフリーのMurashigeとSkoogの培地（Murashige and Skoog, 1962）である、TOB培地の表面に植えた。 植物を6〜8週間、光照射インキュベータールームで、28〜30℃で生育させ、形質転換プロトコールにおける使用のために、葉を無菌的に収集した。 約1平方cmの小片をこれらの葉から無菌的に切断し、中肋を除去した。 250rpm、28℃に設定したシェーカー上のフラスコ中で一晩増殖させたアグロバクテリウム株（pDAB3278、別名pDAS1580、AAD-12 (v1)+PATを含むEHA101S）の培養物を、遠心分離でペレット化し、滅菌したMurashigeとSkoogの塩溶液中で再懸濁し、および600nmにおいて0.5の最終光学密度まで調整した。 葉の小片をこの細菌懸濁物中に約30秒間浸漬し、次いで、滅菌ペーパータオル上で吸い取って乾燥させ、およびTOB+培地（1mg/L インドール酢酸および2.5mg/L ベンジルアデニンを含むbenzyladenineMurashigeとSkoogの培地）上に表面を上にして配置し、暗所にて28℃でインキュベートした。 2日後、葉の小片を、250mg/Lセフォタキシム（Agri-Bio, North Miami, Florida）および5mg/Lグルホシネートアンモニウム（Basta, Bayer Crop Sciences中の活性成分）を含むTOB+培地に移動し、明所で28〜30℃でインキュベートした。 葉の小片を、最初の2週間は1週間に2回、その後は1週間に1回、セフォタキシムおよびBastaを含む新鮮なTOB+培地に移動した。 葉の小片を細菌で処理した4〜6週間後、形質転換した点から生じる小植物をこの組織調製物から取り出し、Phytatray（商標）IIベッセル（Sigma）中の250mg/L セフォタキシムおよび10mg/L Basta inを含むTOB培地に植えた。 これらの小植物を、光照射インキュベータールーム生育させた。 3週間後、茎の切除を取り、同じ培地で再発根させた。 植物は、次の2〜3週間後に温室に送ることができる状態にあった。

根から寒天を洗浄すること、13.75cm四方のポット中の土壌に移植すること、ポットをZiploc（商標）バッグ（SC Johnson & Son, Inc.）に配置すること、バッグの底面に水道水を配置すること、および1週間、間接光の中で、30℃の温室に配置することによって、植物を温室に移動した。 3〜7日後、バッグを開き、植物に肥料をやり、植物が温室に順応するまで開いたバッグ中で生育させ、その時点でバッグを除去した。 植物を、通常の暖かさの温室条件下で生育させた（30℃、16時間明期、8時間暗期、最小限の天然+補足の光=500μE/m ² s ¹ ）。

繁殖の前に、T ₀植物を、インサートのコピー数を決定するDNA分析のためにサンプリングした。 AAD-12 (v1) に分子的に連結されたPAT遺伝子を、便宜上アッセイした。 新鮮な組織をチューブ中に配置し、4℃で2日間凍結乾燥した。 組織が完全に乾燥した後、タングステンビーズ（Valenite）をチューブ中に配置し、試料を、1分間、Kelcoビーズミルを使用する乾式粉砕に供した。 次いで、標準的なDNeasy DNA単離手法に従った（Qiagen, DNeasy 69109）。 次いで、抽出したDNAのアリコートをPico Green（Molecular Probes P7589）で染色し、濃度をng/μlで得るために既知の標準を用いてフルオロメーター（BioTek）で読み取った。

DNA試料を9ng/μlに希釈し、次いで95℃で10分間、サーモサイクラー中のインキュベーションによって10分間変性させた。 次いで、Signal Probeミックスを、提供されるオリゴミックスおよびMgCl2を使用して調製した（Third Wave Technologies）。 7.5μlのアリコートをインベーダーアッセイプレートの各ウェルに配置し、続いて対照、標準の7.5μlのアリコート、および20ng/μlに希釈した未知の試料を配置した。 各ウェルに15μlのミネラルオイル（Sigma）を重層した。 次いで、プレートを、65℃で1.5時間インキュベートし、フルオロメーター（Biotek）上で読み取った。 バックグラウンド内部対照プローブよりも上のシグナル%で除算した、標的プローブについてのバックグラウンドよりも上のシグナル%の計算は、比率を計算した。 サザンブロット分析を用いて開発されかつ確証された既知のコピー標準の比率を使用して、未知の事象の見積もったコピーを同定した。

すべての事象はまた、同じ抽出したDNA試料を使用してPCRによってAAD-12（v1）遺伝子の存在についてもアッセイした。 全体で100ngの総DNAを鋳型として使用した。 20mMの各プライマーを、Takara Ex Taq PCR Polymeraseキットとともに使用した。 植物転写単位（Plant Transcription Unit）(PTU）PCR AAD-12のためのプライマーは、

であった。 PCR反応は、9700 Geneampサーモサイクラー（Applied Biosystems）において、試料を、94℃で3分間、ならびに94℃で30秒間、64℃で30秒間、および72℃で1分間と45秒間の35サイクル、続いて72℃で10分間に供することによって実行した。 PCR産物は、EtBrで染色した1%アガロースゲル上での電気泳動によって分析した。 PAT遺伝子の1〜3個コピー（およびおそらく、AAD-12（v1）、なぜなら、これらの遺伝子は物理的に連鎖しているから）を有する18個のPCR陽性事象の各々からの4〜12個のクローン系統を再生し、温室に移した。

10.1-AAD-12（v1）形質転換T ₀ タバコにおける発芽後除草剤耐性
19個の事象の各々からのT ₀植物を、3〜4インチの高さであった植物に噴霧した広い範囲の2,4-D、トリクロピル、またはフルロキシピルで攻撃した。 噴霧適用は、以前に記載されたように、トラック噴霧器を使用し、187L/haの噴霧量で行った。 2,4-Dジメチルアミン塩（Riverside Corp）を、脱イオン水中で混合した0、140、560、または2240g ae/haで、各事象からの典型的なクローンに適用した。 フルロキシピルは、同様に、35、140、または560g ae/haで適用した。 トリクロピルは、70、280、または1120g ae/haで適用した。 各処理は、1〜3回反復した。 損傷の割合は3および14DATで記録した。 試験したすべての事象は、2,4-Dに対して、非形質転換対照系統KY160よりも耐性であった。 いくつかの事象において、ある初期オーキシン性除草剤関連上偏生長は、560g ae/ha以下の2,4-Dの用量で起こった。 ある事象は、2240g ae/ha（4×圃場割合に等しい）で適用された2,4-Dで損傷されなかった。 全体的に見ると、AAD-12（v1）は、フルロキシピルに対してより感受性であり、次にトリクロピルに感受性であり、および2,4-Dによる影響が最も少なかった。 抵抗性の規模に関する事象の品質は、560g ae/ha フルロキシピルに対するT ₀植物応答を使用して識別した。 事象は、「低い」（>40%損傷 14DAT）、「中程度」（20〜40%損傷）、「高い」（<20%損傷）に分類した。 ある事象は、複製の間の応答において一貫しておらず、「変動性」と見なした。

（表２０）pDAS1580（AAD-12（v1）+PAT）で形質転換したタバコT0事象

^@事象の除草剤耐性の性能の区別は、耐性が事象にわたって変動性である場合に、560g ae/haフルロキシピルで処理したときに、相対的な耐性の評価を必要とした。

10.2-T ₁ タバコにおける高い2,4-D耐性の確認
高い割合の2,4-Dおよびフルロキシピルで生存している2〜4個のT ₀個体は、各事象から確保し、T ₁種子を生じるために温室の中で自家受精させた。 T ₁種子を層形成し、アラビドプシスの選択トレイ（実施例7.4）と全く同様に選択トレイにまき、続いて、560g ai/haグルホシネートを有する、この分離集団における非形質転換ヌルの選択的除去を行った（PAT遺伝子選択）。 生存個体は、温室中で個別の3インチポットに移した。 これらの系統は、T ₀世代において2,4-Dに対する高いレベルの抵抗性を提供した。 応答の一貫性の改善は、組織培養から直接的に得られたものではないT ₁植物において予期された。 これらの植物は、野生型KY160タバコに対して比較した。 すべての植物に、187L/haに設定したトラック噴霧器で噴霧した。 これらの植物に、140〜2240g ae/ha 2,4-Dジメチルアミン塩（DMA）、70〜1120g ae/ha トリクロピル、または35〜560g ae/haフルロキシピルの範囲から噴霧した。 すべての適用は、水中で製剤化した。 各処理は2〜4回反復した。 植物は、処理の3日後または14日後に評価した。 植物は、成長阻害、萎黄病、および壊死に関して、損傷割合を割り当てた。 T ₁世代は分離であるので、接合生殖性の違いに起因して、何らかの変動性の応答が予測される。

2,4-Dについて4倍圃場割合（2240g ae/ha）以下においては、損傷は観察されなかった。 1つの事象系統において、トリクロピル処理で何らかの損傷が観察されたが、最大損傷はフルロキシピルで観察された。 フルロキシピル損傷は長続きせず、1つの事象に対する新たな増殖は、14 DATによる未処理対照からほとんど区別できなかった（表21）。 非形質転換タバコがフルロキシピルに対して過度に感受性であることに注目することは重要である。 これらの結果は、商業的レベルの2,4-D耐性が、タバコのような非常にオーキシン感受性である双子葉作物においてでさえ、AAD-12（v1）によって提供可能であることを示した。 これらの結果は、抵抗性が、ピリジルオキシ酢酸除草剤である、トリクロピルおよびフルロキシピルに付与可能であることもまた示す。 様々な範囲の雑草制御を有する種々の活性成分とともに、除草剤耐性作物中でAAD-12によって保護される処理を処方する能力を有することは、栽培者にとって極めて有用である。

（表２１）種々のフェノキシオーキシン除草剤およびピリジルオキシオーキシン除草剤に対するAAD-12（v1）T ₁タバコ植物の交差耐性応答の評価

10.3-タバコにおけるAAD-12（v1）遺伝性
100個の植物子孫試験もまた、AAD-12（v1）系統の7個のT ₁系統に対して実施した。 ヌル植物をLiberty選択によって取り除かなかった以外は、種子は、上記の手法に従って、種子を層形成し、まき、および移植した。 次いで、すべての植物に、以前に記載したように、560g ae/ha 2,4-D DMAを噴霧した。 14 DAT後、抵抗性植物および感受性植物を計数した。 χ二乗検定によって決定されるように、試験した7つの系統のうちの5つが、単一遺伝子座の優性メンデル形質（3R:1S）として分離した。 AAD-12は、複数の種において、強固なアリールオキシアルカノエートオーキシン抵抗性遺伝子として遺伝性である。

10.4-2,4-D、ジクロプロップ、トリクロピル、およびフルロキシピル除草剤に対するpDAS1580タバコ植物の圃場耐性
圃場レベル耐性試験は、3つのAAD-12（v1）系統（事象pDAS1580-[1]-018.001、pDAS1580-[1]-004.001、およびpDAS1580-[1]-020.016）および1つの野生型系統（KY160）に対して、インディアナ州およびミシシッピー州の圃場農場で実施した。 タバコ移植は、上記に示した生育条件に従い、Metro 360培地を含む72ウェル移植フラット（Hummert International）の中にT ₁種子を植えることによって、温室内で生育させた。 ヌル植物は、以前に記載したように、Liberty選択によって選択的に除外した。 移植植物は圃場農場に移し、産業用植物プランターを使用して、14インチまたは24インチのいずれかで離して植えた。 ミシシッピーの現場において滴下注水、およびインディアナの現場においてはオーバーヘッド注水を使用して、植物を元気に保った。

実験設計は、4つの複製を有する分割区画設計であった。 主区画は除草剤処理であり、下位区画はタバコ系統であった。 除草剤処理は、280、560、1120、2240、および4480g ae/haの2,4-D（ジメチルアミン塩）、840g ae/haのトリクロピル、280g ae/haのフルロキシピル、および未処理対照であった。 プロットは、25〜30フィートで1列であった。 除草剤処理は、移植後3〜4週間に、130〜200kpa圧力で187L/haキャリア体積を送達する圧縮空気バックパック噴霧器を使用して適用した。 損傷、生長阻害、および上偏生長の視覚的評価は、処理の7日後、14日後、および21日後に取った。

2,4-D、トリクロピル、およびフルロキシピルに対するAAD-12（v1）事象応答を表22に示す。 非形質転換タバコ系統は、1×圃場適用割合と見なされている560g ae/haの2,4-Dによって深刻に損傷した（14 DATにおいて63%）。 AAD-12（v1）系統はすべて、14 DATで2,4-Dに対して優秀な耐性を実証し、1%、4%、および4%の平均損傷がそれぞれ2×、4×、および8×の割合で観察された。 非形質転換タバコ系統は、2×割合のトリクロピル（840g ae/ha）によって深刻に損傷したのに対し（14 DATで53%）；一方、AAD-12（v1）系統は耐性を実証し、3つの系統にわたって14 DATで平均5%損傷であった。 280g ae/haのフルロキシピルは、14 DATで非形質転換系統に対して深刻な損傷（99%）を引き起こした。 AAD-12（v1）系統は耐性の増加を実証し、14 DATで平均11%の損傷であった。

これらの結果は、AAD-12（v1）形質転換事象系統が、2,4-D、トリクロピル、およびフルロキシピルに対して、典型的な圃場条件下で非形質転換タバコに対して、致死的であったかまたは深刻な上偏生長奇形を引き起こした、複数の商業的使用の割合において高レベルの耐性を示したことを示す。

（表２２）圃場条件下での2,4-D、トリクロピル、およびフルロキシピルに対するAAD-12（v1）タバコ植物の応答

10.5-2,4-D割合の上昇に対するAAD-12（v1）保護
温室内での2,4-D DMAの割合の上昇に対するAAD-12（v1）保護を示す結果は表23に示す。 T ₁ AAD-12（v1）植物は、以前に記載したのと同じプロトコールを使用して、560g ai/ha Libertyで選択したときに、1つの事象である分離3R:1Sからであった。 T ₁ AAD-1（v3）種子もまた、形質転換タバコ対照のために植えた（PCT/US2005/014737を参照されたい）。 非形質転換KY160は感受性対照として働いた。 植物に、140、560、2240、8960、および35840g ae/ha 2,4-D DMAで187 L/haに設定したトラック噴霧器を使用して噴霧し、3および14 DATで評価した。

AAD-12（v1）およびAAD-1（v3）の両方が、4×商業的使用割合までの用量で、2,4-D損傷に対してタバコを効果的に保護した。 しかし、AAD-12（v1）は、64×標準圃場割合まで保護することによって、AAD-1（v3）を超えた有意な利点を明確に実証した。

（表２３）AAD-12（v1）およびAAD-1（v3）によって提供される、2,4-Dの割合の上昇に対する保護を実証する結果

10.6-除草剤範囲を増加させるためのAAD-12の重ね合わせ
ホモ接合性AAD-12（v1）（pDAS1580）植物およびAAD-1（v3）（pDAB721）植物（後者についてはPCT/US2005/014737を参照されたい）の両方を逆交配し、F ₁種子を収集した。 各遺伝子の2つの逆交配からのF ₁種子を層形成し、処理した各交配の4つの複製を、以下の処理の1つを用いる他の試験のために使用されるのと同じ噴霧レジメン下で処理した：70、140、280g ae/haフルロキシピル（AAD-12（vl）遺伝子に選択的）；280、560、112Og ae/ha R-ジクロロプロップ（AAD-1（v3）遺伝子に選択的）；または560、1120、2240g ae/ha 2,4-D DMA（2,4-D耐性を確認するため）。 各遺伝子のホモ接合性T ₂植物もまた、対照としての使用のために植えた。 植物は3および14 DATで等級付けした。 噴霧結果を表24に示す。

これらの結果は、AAD-12（v1）をAAD-1（v3）とともに首尾よく重ね合わせることができ、従って、関心対象の作物に適用してもよい除草剤の範囲を増加させることを確証する（AAD-1およびAAD-12のために、それぞれ、フェノキシ酢酸+フェノキシプロピオン酸 対 フェノキシ酢酸+ピリジルオキシ酢酸）。 除草剤交差抵抗性パターンの相補的性質は、相補的かつ重ね合わせ可能な圃場選択マーカーとしてのこれらの2つの遺伝子の簡便な使用を可能にする。 単一の遺伝子を用いる耐性が不十分な可能性がある作物において、当業者は、同じ除草剤のための第2の耐性遺伝子を重ね合わせることによって耐性を増加できることを認識する。 このようなことは、同じまたは異なるプロモーターとともに同じ遺伝子（htesame）を使用して行うことができる；しかし、ここで観察したように、2つの相補的形質を重ね合わせすることおよび追跡することは、フェノキシプロピオン酸に対する交差保護［AAD-1（v3）から］またはピリジルオキシ酢酸に対する交差保護［AAD-12（v1）］を区別することによって容易にすることができる。

（表２４）AAD-12×AAD-1 F1雑種および野生型と比較した、AAD-12（v1）（pDAS1580）およびAAD-1（v3）（pDAB721）T ₂植物のオーキシン除草剤交差耐性の比較

実施例11-ダイズ形質転換
遺伝子移入技術を介するダイズの改善は、除草剤耐性（Padgette et al., 1995）、アミノ酸改変（Falco et al., 1995）、および昆虫抵抗性（Parrott et al., 1994）などの形質について達成されてきた。 作物種への外来性形質の導入は、単純な挿入を含む選択マーカーを使用する、トランスジェニック系統の日常的な産生を可能にする方法を必要とする。 導入遺伝子は、育種を単純化するために単一の機能的遺伝子座として遺伝されるべきである。 接合胚軸または体細胞胚形成培養（Finer and McMullen, 1991）の微粒子銃ボンバードメント（McCabe et al., 1988）、および子葉移植片（Hinchee et al., 1988）または接合胚（Chee et al., 1989）のアグロバクテリウム媒介形質転換による、培養されたダイズへの外来性遺伝子の送達が報告されてきた。

アグロバクテリウム媒介形質転換に由来する形質転換体は、低コピー数を有する単純なインサートを有する傾向がある（Birch, 1991）。 ダイズの、接合胚軸（Chee et al., 1989; McCabe et al., 1988）、子葉（Hinchee et al., 1988）、および体細胞胚形成培養（Finer and McMullen, 1991）への遺伝子移入のために研究された3つの標的組織の各々に関連する、利点および欠点が存在している。 後者は、直接的遺伝子移入のための標的組織として広範に研究されてきた。 胚形成培養は、全く多産である傾向があり、長期の期間にわたって維持することができる。 しかし、一次形質転換体の不稔性および染色体異常が胚形成懸濁物の齢に関連しており（Singh et al., 1998）、従って、新たな培養の継続的開始が、この組織を使用するダイズ形質転換系のために必要であると思われる。 この系は、胚形成カルスを開始するために高レベルの2,4-D、40mg/L濃度を必要とし、これは、AAD-12 (v1) 遺伝子を使用する際の基本的な問題を提示する。 形質転換された遺伝子座は、培地中の2,4-Dを用いてさらに発生できないからである。 従って、形質転換に基づく成長点は、AAD-12 (v1) を使用する2,4-D抵抗性植物の発生のために理想的である。

11.1-バイナリー構築物のGatewayクローニング
AAD-12（v1）コード配列は、異なる植物プロモーターを含む5つの異なるGatewayドナーベクターにクローニングした。 得られたAAD-12（v1）植物発現カセットは、LR Clonase反応（Invitrogen Corporation, Carlsbad Ca、カタログ番号11791-019）を介して、Gateway Destinationバイナリーベクターに引き続いてクローニングした。

AAD-12（v1）コード配列を含むNcoI-SacIフラグメントをDASPICO12から消化し、以下のGatewayドナーベクターの中の対応するNcoI-SacI制限部位にライゲーションした：pDAB3912（attLl // CsVMVプロモーター // AtuORF23 3'UTR // attL2）；pDAB3916（attLl // AtUbi10プロモーター // AtuORF23 3'UTR // attL2）；pDAB4458（attL1 // AtUbi3プロモーター // AtuORF23 3'UTR // attL2）；pDAB4459（attL1 // ZmUbi1プロモーター // AtuORF23 3'UTR // attL2）；およびpDAB4460（attL1 // AtAct2プロモーター // AtuORF23 3'UTR // attL2）。 以下の植物発現カセットを含む得られる構築物を以下のように名付けた：pDAB4463（attL1 // CsVMVプロモーター // AAD-12 (v1) // AtuORF23 3'UTR // attL2）；pDAB4467（attL1 // AtUbi10プロモーター // AAD-12 (v1) // AtuORF23 3'UTR // attL2）；pDAB4471 (attL1 // AtUbi3プロモーター // AAD-12 (vl) // AtuORF23 3'UTR // attL2); pDAB4475（attLl // ZmUbi1プロモーター // AAD-12 (v1) // AtuORF23 3'UTR // attL2）；およびpDAB4479（attLl // AtAct2プロモーター // AAD-12 (v1) // AtuORF23 3'UTR // attL2)。 これらの構築物は、制限酵素消化および配列決定を介して確認した。

植物発現カセットは、Gateway LR Clonase反応を経由して、Gateway DestinationバイナリーベクターpDAB4484（RB7 MARv3 // attRl - ccdB - クロラムフェニコール抵抗性 - attR2 // CsVMVプロモーター // PATv6 // AtuORF1 3'UTR）に組換えた。 Gateway技術は、発現ベクターに関心対象の遺伝子を挿入するために、制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼの代わりに、ラムダファージに基づく部位特異的組換えを使用する。 Invitrogen Corporation, Gateway Technology: A Universal Technology to Clone DNA Sequences for Functional Analysis and Expression in multiple Systems, Technical Manual, Catalog #'s 12535-019 and 12535-027, Gateway Technology Version E, 9/22/2003, #25-022。 DNA組換え配列（attL, およびattR,）およびLR Clonase酵素混合物は、組換え部位に隣接する任意のDNAフラグメントが、対応する部位を含む任意のベクターに移入されることを可能にする。 ドナーベクターのattL1部位は、バイナリーベクターのattR1と連絡する。 同様に、ドナーベクターのattL2部位はバイナリーベクターのattR2と連絡する。 Gateway技術を使用して、attL部位に隣接する植物発現カセット（ドナーベクターから）は、バイナリーベクターのattR部位に組換えることができる。 以下の植物発現カセットを含む得られる構築物は次のように標示した：pDAB4464（RB7 MARv3 // CsVMVプロモーター // AAD-12 (vl) // AtuORF23 3'UTR // CsVMVプロモーター // PATv6 // AtuORF1 3'UTR）；pDAB4468（RB7 MARv3 // AtUbi10プロモーター // AAD-12 (vl) // AtuORF23 3'UTR // CsVMVプロモーター // PATv6 // AtuORF1 3'UTR）；pDAB4472（RB7 MARv3 // AtUbi3プロモーター // AAD-12 (v1) // AtuORF23 3'UTR // CsVMVプロモーター // PATv6 // AtuORF1 3'UTR）；pDAB4476（RB7 MARv3 // ZmUbi1プロモーター // AAD-12 (v1) // AtuORF23 3'UTR // CsVMVプロモーター // PATv6 // AtuORF1 3'UTR）；およびpDAB4480（RB7 MARv3 // AtAct2プロモーター // AAD-12 (v1) // AtuORF23 3'UTR // CsVMVプロモーター // PATv6 // AtuORF1 3'UTR）（表8を参照されたい）。 これらの構築物は、制限酵素消化および配列決定を介して確認した。

11.2-形質転換方法1：アグロバクテリウム・ツメファシエンスによって媒介されるダイズ子葉節形質転換
ダイズ形質転換の最初の報告は、ダイズ子葉節領域における成長点細胞（Hinchee et al., 1988）および頂端分裂組からのシュート増殖（McCabe et al., 1988）を標的とした。 A.チュメファシエンスを用いる子葉節方法において、移植片調製および培地組成は、節における補助成長点の増殖を刺激する（Hinchee et al., 1988）。 真に脱分化されたが、全能性であるカルス培養がこれらの処理によって開始されるか否かは依然として不明である。 単一の移植片からの形質転換事象の複数のクローンの回収、およびまれなキメラ植物の回収（Clemente et al., 2000; Olhoft et al., 2003）は、単一細胞起源、その後のトランスジェニック成長点培養、またはさらなるシュート増殖を受ける均一に形質転換されたシュートのいずれかを産生するためのトランスジェニック細胞の増殖を示す。 もともとは微粒子銃ボンバードメント（McCabe et al., 1988）に基づき、より最近では、アグロバクテリウム媒介形質転換のために適合された（Martinell et al., 2002）ダイズシュート増殖法は、明らかに、子葉節法と同じレベルまたは型の脱分化を受けない。 なぜなら、この系は、生殖系列キメラの首尾よい同定に基づくからである。 アグロバクテリウムに基づく子葉節法を介して形質転換された遺伝子型の範囲は、着実に増えている（Olhoft and Somers, 2001）。 このデノボでの成長点およびシュートの増殖は、特定の遺伝子型に限られることが少ない。 また、これは、2,4-D選択系のために理想的である、非2,4-Dを用いるプロトコールである。 従って、子葉節法は、2,4-D抵抗性ダイズ品種を発生するための選り抜きの方法であり得る。 この方法は、1988年という早い時期に記載されたが（Hinchee et al., 1988）、いくつかのダイズ遺伝子型の日常的な高頻度形質転換のために最適化されたのはほんのごく最近のことである（Zhang et al. , 1999; Zeng et al., 2004）。

11.2.1-AAD-12（v1）耐性表現型の植物形質転換産生
種子に誘導された「マーベリック（Marverick）」の移植物およびアグロバクテリウム媒介性の子葉節（cot-node）形質転換プロトコールを使用してAAD-12（v1）トランスジェニック植物を産生した。

11.2.2-アグロバクテリウムの調製および接種
5種の各々のバイナリーpDABベクター（表8）を有するアグロバクテリウム株EHA101（Hood et al. 1986）を使用して形質転換を開始した。 各バイナリーベクターは、T-DNA領域にAAD-12（v1）遺伝子および植物選択遺伝子（PAT）カセットを含む。 各遺伝子は表8に列挙されたプロモーターによって駆動され、これらのプラスミドはエレクトロポレーションによってアグロバクテリウムのEHA101株に動員された。 次いで、選択したコロニーは、ダイズ移植物のアグロバクテリウム処理の前に遺伝子の組み込みについて分析した。 マーベリック種子はすべての形質転換実験において使用し、種子はUniversity of Missouri, Columbia, MOから得た。

選択因子としての除草剤グルホシネートと共役した選択マーカーとしてのPAT遺伝子を使用する、ダイズ（グリシン マックス（Glycine max））のアグロバクテリウム媒介形質転換は、Zeng et al. (2004)の改変した手法に従って実行した。 種子は、3g/L Phytagel（Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.）を用いて固化したB5基礎培地（Gamborg et al. 1968）上で発芽させ；l-システインを400mg/Lで共培養培地に加え、かつ共培養は5日間続け（Olhoft and Somers 2001）；シュートの開始、シュートの伸長、および発根培地は、50 mg/L セフォタキシム、50mg/L チメンチン、50mg/L バンコマイシンを補充し、3g/L Phytagelで固化した。 次いで、選択したシュートは、発根培地に移した。 最適選択スキームは、培地中での第1のおよび第2のシュート開始段階にわたって8mg/L、培地中でのシュート伸長の間に3〜4mg/Lのグルホシネートの使用であった。

発根培地に伸長したシュート（3〜5cm）を移す前に、節間の切除した末端を、1mg/L インドール3-酪酸に1〜3分間浸漬し、発根を促進した（Khan et al. 1994）。 シュートは、発根培地を含む25×100mmガラス培養チューブに根を突き出し、次いでこれらは、Convironsのオープンマゼンタボックス中で、Metro-mix 200（Hummert International, Earth City, Mo.）中で植物体の馴化のために土壌ミックスに移した。 Liberty除草剤（Bayer Crop Science）の活性成分であるグルホシネートは、シュートの開始および伸長の間に選択のために使用した。 発根した植物体は、数週間の間、オープンマゼンタボックス中で馴化させ、その後、これらをスクリーニングし、ならびにさらなる馴化および樹立のために温室に移した。

11.2.3-推定の形質転換植物体のアッセイ、および温室内で樹立したT ₀ 植物の分析
結果を観察して推定の形質転換体をスクリーニングするために、これらの植物体の選択した葉の末端の小葉を、1週間の間隔で2回、50mg/Lのグルホシネートを葉に塗布した。 次いで、スクリーニングした植物体を温室に移し、馴化後、再度グルホシネートで染色し、温室内でのこれらの植物体の耐性状態を確認し、推定の形質転換であると見なした。

温室に移した植物は、グルホシネート溶液［0.05〜2% v/v Liberty除草剤、好ましくは、0.25〜1.0% (v/v),=500〜2000 ppmグルホシネート、Bayer Crop Science］を用いて、T ₀一次形質転換体、またはその子孫の葉の部分に塗布することによって、非破壊的な様式で、活性なPAT遺伝子の存在についてアッセイすることができる。 使用する濃度に依存して、グルホシネート損傷の評価は、処理後1〜7日後に行うことができる。 最も後から出てきた三小葉の1つ、2つ、好ましくは2つ下の節の、新たに広がっている三小葉の末端小葉に、水中の2,4-D溶液（0.25〜1% v/v 市販の2,4-Dジメチルアミン塩製剤、好ましくは0.5% v/v = 2280 ppm 2,4-D ae）の選択的適用によって、植物はまた、非破壊的様式で2,4-D耐性についても試験することができる。 このアッセイは、葉の反転または隣接する小葉の平面から>90度の回転の評価によって、適用の6時間から数日後に、2,4-D感受性植物の評価を可能にする。 2,4-Dに耐性である植物は、2,4-Dに応答しない。 T ₀植物は、温室内で自花受精し、T ₁種子を生じることが可能である。 T ₁植物に（十分なT ₀植物クローンが産生する程度まで）、一定の範囲の除草剤用量を噴霧し、トランスジェニックダイズ中でAAD-12（v1）およびPAT遺伝子によって与えられる除草剤保護のレベルを決定する。 T ₀植物に対して使用する2,4-Dの割合は、典型的には、以前に記載したようなトラック噴霧器を使用して、100〜1120g ae/haの範囲の1つまたは2つの選択的割合を含む。 T ₁植物は、50〜3200g ae/ha 2,4-Dからの範囲のより広い除草剤用量で処理する。 同様に、T ₀およびT ₁植物は、それぞれ200〜800および50〜3200g ae/haグルホシネートを用いる発芽後処理によって、グルホシネート抵抗性についてスクリーニングすることができる。 グリホセート抵抗性（EPSPSを含む構築物で形質転換した植物で）または別のグリホセート耐性遺伝子は、280〜2240g ae/haグリホセートの用量範囲を用いるグリホセートの発芽後適用によって、T ₁世代において評価することができる。 タンパク質発現の分析は、以下に記載されるように行う。 個々のT ₀植物は、関心対象の遺伝子（AAD-12（v1）またはPAT v6）のコード領域の存在およびコピー数について評価した。 AAD-12（v1）の遺伝的形質の決定は、以前の実施例に記載されたような除草剤耐性に関するT ₁およびT ₂子孫分離を使用して行う。

初期の形質転換体の一部分は、上記の方法に従ってT ₀世代において評価した。 遺伝子を駆動するプロモーターに関わりなく、AAD-12（v1）コード領域を有すると確認された任意の植物は、2,4-D葉塗布に応答しなかったのに対して、野生型マーベリックダイズは応答した（表、11.2.3節）。 PATのみ形質転換した植物は、2,4-Dの葉塗布適用に対して、野生型植物におけるのと同じに応答した。

2,4-Dは、560g aeまたは1120g aeのいずれかの2,4-Dで、野生型対照植物と同様のサイズであった植物の一部分に適用した。 すべてのAAD-12（v1）含有植物は、野生型マーベリックダイズと比較して、除草剤適用に対して明確に抵抗性であった。 わずかなレベルの損傷（2 DAT）が2つのAAD-12（v1）植物について観察されたが、7 DATでは損傷は観察されなかった。 野生型対照植物は、7〜14DATにおいて、560g ae/ha 2,4-Dによって深刻に損傷し、1120g ae/haでは枯死した。 これらのデータは、AAD-12（v1）が、ダイズのような感受性作物に高い耐性（>2×圃場割合）を付与できるという事実と一貫している。 次いで、スクリーニングした植物は、以下に記載され、表25に報告されるように、AAD12（v1）遺伝子組み込み、コピー数、およびそれらの遺伝子発現レベルの確認のために、分子的および生化学的分析のためにサンプリングした。

（表２５）2,4-D葉塗布および2,4-D噴霧適用に対するT ₀ダイズ応答

11.2.4-分子的分析：ダイズ
11.2.4.1-組織から収集したDNAの単離および定量
新鮮な組織をチューブ中に配置し、4℃で2日間凍結乾燥した。 組織を完全に乾燥させた後、タングステンビーズ（Valenite）をチューブ中に配置し、試料を、Kelcoビーズミルを使用する1分間の乾式粉砕に供する。 次いで、標準的なDNeasy DNA単離手法に従った（Qiagen, DNeasy 69109）。 次いで、抽出したDNAのアリコートを、Pico Green（Molecular Probes P7589）で染色し、既知の標準とともにフルオロメーター（BioTek）で読み取り、濃度をng/μLで得た。

11.2.4.2-ポリメラーゼ連鎖反応
全体で100ngの全DNAを鋳型として使用する。 20mMの各プライマーを、Takara Ex Taq PCR Polymeraseキット（Mirus TAKRR001A）とともに使用した。 AAD-12（v1）PTUのためのプライマーは、

である。 PCR反応を、9700 Geneampサーモサイクラー（Applied Biosystems）において、試料を、94℃で3分間、ならびに94℃で30秒間、63℃で30秒間、および72℃で1分間と45秒間の35サイクル、続いて72℃で10分間に供することによって実行する。 AAD-12（v1）コード領域PCRのためのプライマーは、

および

である。 PCR反応を、9700 Geneampサーモサイクラー（Applied Biosystems）において、試料を、94℃で3分間、ならびに94℃で30秒間、65℃で30秒間、および72℃で1分間と45秒間の35サイクル、続いて72℃で10分間に供することによって実行した。 PCR産物を、EtBrで染色した1%アガロースゲル上での電気泳動によって分析した。

11.2.4.3-サザンブロット分析
サザンブロット分析を、Qiagen DNeasyキットから得た全DNAを用いて実施する。 全体で10μgのゲノムDNAを一晩消化に供し、統合データを得る。 一晩消化の後、〜100ngのアリコートを1%ゲル上で泳動し、完全な消化を保証した。 この保証後、試料を、大きな0.85%アガロースゲル上で、一晩40ボルトで泳動する。 次いで、このゲルを、0.2M NaOH、0.6M NaCl中で30分間変性させる。 次いで、このゲルを、pH 7.5の0.5M Tris HCl、1.5M NaCl中で30分間中和した。 次いで、20×SSCを含むゲル装置を、ゲルからナイロンメンブレン（Millipore INYC00010）への重力による転写を得るために一晩設定する。 一晩の転写後、次いで、このメンブレンを、1200 X100マイクロジュールで、クロスリンカー（Stratagene UV stratalinker 1800）によりUV光に供する。 次いで、このメンブレンを、0.1% SDS、0.1 SSC中で45分間洗浄する。 45分間の洗浄後、このメンブレンを80℃で3時間焼き、次いでハイブリダイゼーションまで4℃に保存する。 ハイブリダイゼーション鋳型フラグメントは、プラスミドDNAを使用する上記のコード領域PCRを使用して調製する。 産物を1%アガロースゲル上で泳動し、切除し、および次いで、Qiagen（28706）ゲル抽出手法を使用してゲル抽出する。 次いで、このメンブレンを、Perfect Hyb緩衝液（Sigma H7033）中で1時間、60℃段階のプレハイブリダイゼーションに供する。 Prime it RmT dCTP-labeling rxn（Stratagene 300392）手法を使用して、p32に基づくプローブを開発する（Perkin Elmer）。 このプローブを、Probe Quant. G50 カラム（Amersham27-5335-01）を使用して精製する。 200万カウントCPMを使用して、サザンブロットを一晩ハイブリダイズさせる。 一晩のハイブリダイゼーションの後、次いで、このブロットを、0.1% SDS、0.1 SSC中で65℃における2回の20分間の洗浄に供する。 次いで、このブロットを、-80℃でインキュベートしてフィルムに一晩露光させる。

11.2.5-生化学的分析：ダイズ
11.2.5.1-組織サンプリングおよびダイズ葉からのAAD-12（v1）タンパク質の抽出
約50〜100mgの葉組織を、葉に2,4-Dを塗布したが、1DAT後であったN-2葉からサンプリングした。 末端N-2小葉を取り出し、小さな小葉または単一の穴をあけた2枚の葉ディスク（直径〜0.5cm）のいずれかに切断し、すぐにドライアイス上で凍結した。 さらなるタンパク質分析（ELISAおよびウエスタン分析）は、実施例9に記載される方法に従って完了した。

11.2.6-T ₁ 子孫評価
T ₀植物は、自花受精させてT ₁系統群を誘導する。 子孫試験（分離分析）は、V1〜V2生長段階で適用した選択剤として560g ai/haでグルホシネートを使用してアッセイする。 生き残っている植物は、V2〜V6の1つまたは複数の生長段階において2,4-D耐性についてさらにアッセイする。 種子は、自家受精を通して産生し、トランスジェニックダイズ上でのより広い除草剤試験を可能にする。

AAD-12（v1）トランスジェニックマーベリックダイズ植物は、アグロバクテリウム媒介子葉節形質転換系を通して生成されてきた。 得られたT ₀植物は、2倍レベルまでの2,4-D圃場適用に耐性であり、稔性種子を発生した。 稔性トランスジェニックダイズ植物の頻度は5.9%までであった。 ダイズゲノムへのAAD1-12（v1）遺伝子の組み込みは、サザンブロット分析によって確認した。 この分析は、トランスジェニック植物の大部分が低コピー数を含んだことを示した。 AAD-12（v1）抗体を用いてスクリーニングした植物は、ELISAについて陽性を示し、ウエスタン分析において適切なバンドを示した。

11.3-形質転換方法2：胚形成ダイズカルス組織のエアロゾルビーム媒介形質転換
胚形成ダイズカルス組織の培養および引き続くビームは、米国特許第6,809,232号（Held et al.）において記載されるように実施することができ、表8における1つまたは複数の構築物を使用して形質転換体を作製する。

11.4-形質転換方法3：ダイズの微粒子銃ボンバードメント
これは、成熟種子で誘導される胚軸分裂組織を使用して達成することができる（McCabe et al. (1988)）。 微粒子銃ボンバードメントの確立された方法に従って、形質転換ダイズ植物の回収を予測することが可能である。 一旦植物が再生されると、事象の評価は実施例11.2に記載されるように行うことができた。

11.5-形質転換方法4：ウィスカー媒介形質転換
ウィスカー調製およびウィスカー形質転換は、Terakawa et al. (2005)によって以前に記載された方法に従って予期することができる。 微粒子銃ボンバードメントの確立された方法に従って、形質転換ダイズ植物の回収を予測することができる。 一旦植物が再生されると、事象の評価は実施例11.2に記載されるように行うことができた。

マーベリック種子は、70%エタノール中で1分間、続いて1%次亜塩素酸ナトリウム中で20分間の浸漬で表面滅菌し、次いで、滅菌蒸留水で3回すすいだ。 これらの種子を蒸留水中で18〜20時間浸漬した。 胚軸を種子から切除し、頂端分裂組織を、初生葉を除去することによって露出させた。 胚軸を、ボンバードメント培地［BM: MS（Murashige and Skoog 1962）基礎塩培地、3%スクロース、および0.8% phytagel Sigma, pH 5.7］中に配置し、12ml培養培地を含む5cm培養ディッシュ中で、頂端を上向きにした。

11.6-形質転換方法5
胚形成カルス組織のための粒子ボンバードメント媒介形質転換は、以前の方法に従って最適化することができる（Khalafalla et al., 2005; El-Shemy et al., 2004, 2006）。 再生した植物もまた、実施例11.2に従って評価することができる。

実施例12-ワタにおけるAAD-12 (v1)
12.1-ワタの形質転換プロトコール
ワタ種子（Co310遺伝子型）を、95%エタノール中で1分間、表面殺菌し、すすぎ、50%漂白剤で20分間殺菌し、次いで滅菌蒸留水で3回すすぎ、その後、Magenta GA-7容器中のG培地（表26）に播種し、40〜60 μE/m2の高光強度下で、16時間明期および8時間暗期で28℃に設定した光周期で維持した。

子葉セグメント（〜5mm）四角を7〜10日齢の苗から、ペトリ皿（Nunc, 品番0875728）中の液体M液体培地（表26）に単離する。 切断したセグメントを、アグロバクテリウム溶液で処理し（30分間）、次いで半固体M培地（表26）に移し、2〜3日間、共培養に供した。 共培養後、セグメントをMG培地（表26）に移す。 カルベニシリンは、アグロバクテリウムを死滅させるために使用した抗生物質であり、グルホシネートアンモニウムは、移入された遺伝子を含む細胞のみの成長を可能にする選択剤である。

アグロバクテリウム調製
35mlのY培地（表26）（ストレプトマイシン（100mg/ml保存液）およびエリスロマイシン（100mg/ml保存液）を含む）に、1ループ（白金耳）の細菌を接種し、150rpmで振盪しながら、暗所にて28℃で一晩増殖させる。 翌日、滅菌オークリッジ（oakridge）チューブ（Nalge-Nunc, 3139-0050）にアグロバクテリウム溶液を注ぎ、およびBeckman J2-21で、8,000rpmにて5分間遠心分離する。 上清を捨て、ペレットを25mlのM液体（表26）に再懸濁し、およびボルテックスにより激しく撹拌する。 アリコートを、Klett読み取り（Klett-Summerson, モデル800-3）のためにガラス培養チューブ（Fisher, 14-961-27）に配置する。 M液体培地を使用して、新たな懸濁物を、40mlの全体量で、mLあたり10 ⁸コロニー形成単位のKlettメーター読み取りまで希釈する。

3週間後、子葉セグメントからのカルスを単離し、新鮮なMG培地に移す。 並列比較において、MG培地は、2,4-Dの分解のために補充するために、ジクロルプロップ（0.01および0.05mg/Lの濃度で培地に加える）で補充することができる。 なぜなら、ジクロルプロップは、AAD-12酵素のための基質ではないが、しかしジクロルプロップは、ワタに対しては2,4-Dよりも活性であるからである。 別々の比較において、標準的なMG培地と比較して、生長調節因子を含まないMG培地にプレートしたセグメントは、カルス形成の減少を示したが、なおカルス生長が存在している。 このカルスを、次の3週間MG培地上に移す。 次いで、カルスを、CG培地（表26）に移し、3週間後に、再度、新鮮な選択培地に移す。 次の3週間後、カルス組織を、胚形成カルス誘導のために、植物生長レギュレーターを欠くD培地（表26）に移す。 この培地上での4〜8時間後、胚形成カルスが形成し、その黄色がかった色および顆粒状細胞によって、非胚形成カルスから区別することができる。 胚はすぐに再生を開始し、色が識別できる緑色である。 ワタは再生しかつ胚を形成するための時間を取ることができ、このプロセスを速めるための1つの方法は組織にストレスを与えることである。 乾燥（dessication）は、組織およびプレートの微小環境における変化を介して、より少ない培養培地を使用すること、および／または種々の様式のプレートの囲い（テーピング対パラフィン）を採用することによって、このことを達成するための一般的な方法である。

より大きな、十分に発達した胚を単離し、胚発生のためにDK培地（表26）に移す。 3週間後（または胚が発生したとき）、発芽した胚を、シュートおよび根発生のために新鮮な培地に移す。 4〜8週間後、任意の十分に発達した植物を土壌に移し、成熟まで生長させる。 2ヶ月後、植物は、その植物が2,4-Dに対する抵抗性を有するか否かを決定するために噴霧可能である点まで生長した。

（表２６）ワタ形質転換のための培地

12.2-細胞形質転換
子葉セグメントがpDAB724を含有するアグロバクテリウムで処理された数種の実験を開始した。 得られたセグメントの2000個より多くが、pDAB724ワタカルスの増殖のために、種々のオーキシン選択肢：0.1または0.5mg/L R-ジクロルプロップのいずれか、標準2,4-D濃度、およびオーキシンなし処理を使用して処理した。 カルスは、構築物中にPAT遺伝子を含むことに起因して、グルホシネート-アンモニウム上で選択した。 PCRおよびインベーダーの型でのカルス系統分析は、遺伝子がカルス段階において存在したか否か、およびそのことが確実であることを決定するために使用し；次いで、胚形成性であるカルス系統は、とりわけ11.2.3節に記載されるように、ウエスタン分析に送る。 胚形成ワタカルスには、回収した組織の品質および量を改善するために、乾燥（dessication）技術を使用してストレスを加えた。

ほぼ200個のカルス事象を、AAD-12（v1）遺伝子についてのウエスタン分析を使用して、無傷PTUおよび発現についてスクリーニングした。 以下は試験したワタカルスのいくつかについてのデータの一部分である。

12.3-植物再生
上記のプロトコールに従って植物を生じたAAD-12（v1）ワタ系統は温室に送る。 AAD-12（v1）遺伝子がワタにおいて2,4-Dに対する抵抗性を提供することを実証するために、AAD-12（v1）ワタ植物と野生型ワタ植物の両方に、187L/haの噴霧体積で560g ae/ha 2,4-Dを送達するトラック噴霧器を用いて噴霧する。 植物を、処理の3日後および14日後に評価する。 2,4-Dの選択割合で生存している植物は、T ₁種子を作製するために自家受粉し、またはF ₁種子を産生するために優良ワタ系統と外部交配する。 引き続いて生じた種子を、以前に記載したように植え、除草剤抵抗性について評価する。 AAD-12（v1）事象は、実施例（experimens）18、19、22、および23に記載されるように、所望の他のHTまたはIR形質と組み合わせることができる。

実施例13-他の作物のアグロバクテリウム形質転換
本開示に鑑みて、さらなる作物を、本発明に従って、当技術分野において公知である技術を使用して形質転換することができる。 ライムギのアグロバクテリウム媒介形質転換については、例えば、Popelka and Altpeter (2003)を参照されたい。 ダイズのアグロバクテリウム媒介形質転換については、例えば、Hinchee et al., 1988を参照されたい。 ソルガムのアグロバクテリウム媒介形質転換については、例えば、Zhao et al., 2000を参照されたい。 オオムギのアグロバクテリウム媒介形質転換については、例えば、Tingay et al., 1997を参照されたい。 コムギのアグロバクテリウム媒介形質転換については、例えば、Cheng et al., 1997を参照されたい。 イネのアグロバクテリウム媒介形質転換については、例えば、Hiei et al., 1997を参照されたい。

これらおよび他の植物のラテン名については以下に与えられる。 これらおよび他の（非アグロバクテリウム）形質転換技術は、例えば、これらおよび他の植物にAAD-12（v1）を形質転換するために使用できることは明らかであるはずである。 これらおよび他の植物には以下が含まれるがこれらに限定されない：トウモロコシ（ジー メイ（Zea mays））、コムギ（トリチカム（Triticum）種)、イネ（オリザ（Oryza）種およびマコモ（Zizania）種）、オオムギ（ホルデウム（Hordeum）種）、ワタ（アブロマ オーガスタ（Abroma augusta）およびゴシピウム（Gossypium）種）、ダイズ（グリシン マックス（Glycine max））、テンサイおよびテーブルビート（ベータ（Beta）種）、サトウキビ（アレンガ ピナータ（Arenga pinnata））、トマト（リコパーシコン エスカレンタム（Lycopersicon esculentum）および他の種、フィザリス イコスカルパ（Physalis ixocarpa）、ソラナム インカナム（Solanum incanum）および他の種、ならびにサイフォマンドラ ベータセア（Cyphomandra betacea））、ジャガイモ（ソラヌム チュバソウム（Solanum tubersoum））、サツマイモ（イポモエア ベータタス（Ipomoea betatas））、ライムギ（セカレ（Secale）種）、コショウ（カプシカム アンナム（Capsicum annuum）、シメンセ（sinense）、およびフルテセンス（frutescens））、レタス（ラクチュカ サティバ（Lactuca sativa）、ペレニス（perennis）、およびパルチェラ（pulchella）、キャベツ（ブラシカ（Brassica）種）、セロリ（アピウム グラベオレンス（Apiuin graveolens）、ナス（ソラヌム メロンジナ（Solanum melongena）、ピーナッツ（アラキス ヒポジア（Arachis hypogea））、ソルガム（すべてのソルガム種）、アルファルファ（メジカーゴ サティヴュア（Medicago sativua））、ニンジン（ダンカス キャロータ（Daucus carota））、ビーン（ファセロラス（Phaseolus）種および他の属）、オートムギ（アベナ サティバ（Avena Sativa）およびストリゴーサ（Strigosa））、エンドウ豆（ピサム（Pisum）、ビグナ（Vigna）、およびテトラゴノロバス（Tetragonolobus）種）、ヒマワリ（ヘリアンサス アニュス（Helianthus annuus））、カボチャ（キュカービタ（Cucurbita）種）、キュウリ（ククミス サティバ（Cucumis sativa)）、タバコ（ニコチアナ（Nicotiana）種）、アラビドプシス（アラビドプシス・サリアナ)、芝草（ロリウム（Lolium）、アグロスチス（Agrostis）、ポア（Poa）、シナドン（Cynadon）、および他の属）、クローバー（チフォリウム（Tifolium））、ベッチ（ソラマメ(Vicia)）。 例えば、AAD-12（v1）を有するこのような植物は、本発明に含まれる。

AAD-12（v1）は、多くの落葉性および常緑樹作付系における季節にあった使用のための鍵となるオーキシン除草剤の適用性を増加させる潜在能力を有する。 トリクロピル、2,4-D、および/またはフルロキシピル抵抗性樹木種は、損傷の懸念なしで、これらの除草剤の上限を超えた使用の柔軟性を増加する。 これらの種には以下が含まれるがこれらに限定されない：ハンノキ（アルナス（Alnus）種）、トネリコ（フラキシヌス（Fraxinus）種）、アスペンおよびポプラ種（ポピュラス（Populus）種）、ブナノキ（ブナ（Fagus）種）、カバノキ（カバノキ（Betula）種）、サクラ（サクラ（Prunus）種）、ユーカリ（ユーカリ（Eucalyptus）種）、ヒッコリー（カリア（Carya）種）、カエデ（カエデ（Acer）種）、オーク（コナラ（Quercus）種）、およびマツ（マツ（Pinus）種）。 観賞用および果実を付ける種における選択的雑草制御のためのオーキシン抵抗性の使用もまた、本発明の範囲内にある。 例としては以下を含むことができるがこれらに限定されない：バラ（バラ（Rosa）種）、ホウキグサ（ニシキギ（Euonymus）種）、ペチュニア（ペチュニア（Petunia）種）、ベゴニア（ベゴニア（Begonia）種）、シャクナゲ（ツツジ（Rhododendron）種）、クラブアップルまたはリンゴ（リンゴ（Marus）種）、西洋ナシ（プルナス（Prunus）種）、モモ（プルナス（Prunus）種）、およびマリゴールド（マンジュギク（Tagetes）種）。

実施例14-驚くべき結果のさらなる証拠：AAD-12対AAD-2
14.1-AAD-2（v1）初期クローニング
別の遺伝子を、tfdAに対して44%のみのアミノ酸同一性を有するホモログとしてNCBIデータベース（ncbi.nlm.nih.gov ウェブサイト; アクセッション番号AP005940を参照されたい）から同定した。 この遺伝子は、一貫性のために、本明細書ではAAD-2（v1）と呼ばれる。 同一性パーセントは、AAD-2とtfdAの両方のDNA配列（それぞれ、PCT/US2005/014737のSEQ ID NO:12およびGENBANKアクセッション番号M16730）をタンパク質（それぞれ、PCT/US2005/014737のSEQ ID NO:13およびGENBANKアクセッション番号M16730）に最初に翻訳すること、次いで、VectorNTIソフトウェアパッケージ中のClustalWを使用して複数配列アラインメントを実施することによって決定した。

AAD-2 (vl) 遺伝子を含むブラディリゾビウム ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）の株を、Northern Regional Research Laboratory (NRRL、株番号B4450）から入手した。 凍結乾燥株をNRRLプロトコールに従って復活させ、ダウ細菌株（ D ow B acterial strain）DB 663としての内部使用のために20%グリセロール中で-80℃にて保存した。 次いで、このフリーザー保存液から、トリプシンダイズ寒天（Tryptic Soy Agar）のプレートに、単離のための細胞のループ状白金耳を用いて画線し、28℃で3日間インキュベートした。 単一コロニーを、500ml 3バッフルフラスコ中の100mlのトリプシンダイズブロスに接種するために使用し、これを、フロアシェーカー上で150rpmにて、28℃で一晩インキュベートした。 これから、全DNAを、QiagenのDNeasyキット（Qiagenカタログ番号69504）のグラム陰性プロトコールを用いて単離した。 以下のプライマーを、ゲノムDNAから標的遺伝子を増幅するために設計した：フォワード：

[(br jap 3'(xhol) PCT/US2005/014737のSEQ ID NO:15（XhoI部位を加えた）]。

50マイクロリットル反応を以下のように設定した：フェイルセーフ（Fail safe）緩衝液25μl、各プライマー1μl（50ng/μl）、gDNA 1μl（200ng/μl）、H ₂ O 21μl、Taqポリメラーゼ1μl（2.5単位/μl）。 3つのフェイルセーフ緩衝液-A、B、およびCを、3つの別々の反応において使用した。 次いで、PCRを以下の条件下で実行した。 95℃3.0分間熱変性サイクル；95℃1.0分間、50℃1.0分間、72℃1.5分間の30サイクル；続いて72℃5分間の最終サイクル、フェイルセーフPCRシステム（Epicenterカタログ番号FS99100）を使用。 ヌクレオチド配列の確認のために、〜1kbのPCR産物を、包含されるプロトコールに従って、宿主株として化学的に形質転換受容性であるTOP10F'大腸菌を用いて、pCR 2.1（Invitrogenカタログ番号K4550-40）にクローニングした。

得られる10個の白色コロニーを、3μl Luriaブロス+1000μg/mlアンピシリン（LB Amp）に拾い上げ、攪拌しながら37℃で一晩増殖させた。 プラスミドを、Nucleospin Plus Plasmid Miniprep Kit（BD Biosciencesカタログ番号K3063-2）を使用し、包含されるプロトコールに従って各培養から精製した。 単離したDNAの制限消化を、pCR2.1ベクター中のPCR産物の存在を確認するために完了した。 プラスミドDNAを、制限酵素EcoRI (New England Biolabsカタログ番号R0101S）で消化した。 配列決定を、Beckman CEQ Quick Startキット（Beckman Coulterカタログ番号608120）を用いて、M13フォワードプライマー

を使用して、製造業者の指示に従って実行した。 この遺伝子配列およびその対応するタンパク質に、内部整合性のための新たな一般的な名称、AAD-2（v1）を与えた。

14.2-AAD-2（v1）バイナリーベクターの完成
AAD-2（v1）遺伝子を、pDAB3202からPCR増幅した。 PCR反応の間、5'プライマーおよび3'プライマーにおいてそれぞれAflIIIおよびSacI制限部位を導入するために、プライマー中に変化を作製した。 PCT/US2005/014737を参照されたい。 プライマー「ブラディのNcoI」

を、フェイルセーフPCRシステム（Epicentre）を使用してDNAフラグメントを増幅するために使用した。 PCR産物を、pCR 2.1 TOPO TAクローニングベクター（Invitrogen）にクローニングし、および配列を、M13フォワードおよびM13リバースプライマーを用いて、Beckman Coulter「Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit」配列決定試薬を使用して確認した。 配列データは、正確な配列（pDAB716）を有するクローンを同定した。 次いで、AflIII/SacI AAD-2 (vl) 遺伝子フラグメントを、NcoI/SacI pDAB726ベクターにクローニングした。 得られる構築物(pDAB717); AtUbi10プロモーター: Nt OSM 5'UTR: AAD-2 (vl): Nt OSM3'UTR: ORF1 ポリA 3'UTRを、制限消化（NcoI/SacIを用いる）を用いて確認した。 この構築物を、NotI-NotI DNAフラグメントとして、バイナリーpDAB3038にクローニングした。 得られる構築物(pDAB767); AtUbi10プロモーター: Nt OSM5'UTR: AAD-2 (vl): Nt OSM 3'UTR: ORF1 ポリA 3'UTR: CsVMVプロモーター: PAT: ORF25/26 3'UTRを、正確な方向の確認のために制限消化した（NotI、EcoRI、HinDIII、NcoI、PvuII、およびSalIを用いた）。 次いで、完成した構築物（pDAB767）を、アグロバクテリウムへの形質転換のために使用した。

14.3-形質転換アラビドプシスの評価
植物に最適化したAAD-12（v1）またはネイティブAAD-2（v1）遺伝子で形質転換した、直前に収集したT ₁種子を、以前に記載されたように、植え、グルホシネートに対する抵抗性について選択した。 次いで、植物は、種々の割合の2,4-D（50〜3200g ae/ha）にランダムに割り当てた。 除草剤適用は、187L/ha噴霧体積で、トラック噴霧器によって適用した。 使用した2,4-Dは、市販のジメチルアミン塩製剤であり（456g ae/L、NuFarm, St Joseph, MO）、200mM Tris緩衝液（pH 9.0）または200mM HEPES緩衝液（pH 7.5）に混合した。

AAD-12（v1）およびAAD-2（v1）は、形質転換および非形質転換対照株に対する検出可能な2,4-D抵抗性を提供した；しかし、個々の構築物は、個々のT ₁アラビドプシス植物に対して2,4-D抵抗性を付与するそれらの濃度が広範に変動性であった。 驚くべきことに、高度に耐性である植物の頻度、ならびに全体の平均損傷の両方から、AAD-2（v1）およびAAD-2（v2）形質転換体は、AAD-12（v1）遺伝子よりも、2,4-Dに対してはるかに低かった。 200g ae/ha 2,4-Dを生き残った、AAD-2（v1）で形質転換した植物は、比較的損傷せず（<20%視覚的損傷）、全体の集団の損傷は約83%であった（PCT/US2005/014737を参照されたい）。 逆に、AAD-12（v1）は、3,200g ae/ha 2,4-Dで処理したときに、約6%の集団損傷平均を有した（表11）。 耐性は、ネイティブ遺伝子に対して、植物に最適化されたAAD-2（v2）についてわずかに改善し；しかし、AAD-12とAAD-2の両方の植物最適化遺伝子の比較は、植物におけるAAD-12（v1）の有意な利点を示す。

AAD-2（v1）（PCT/US2005/014737を参照されたい）およびAAD-12（v2）のインビトロ比較が、両方が2,4-Dを分解する際に高度に有効であり、かつ両方がキラルアリールオキシアルカノエート基質に関してS型特異性を共有していることを示したことを考えると、これらの結果は予測しないものであった。 AAD-2（v1）は様々なレベルまで個々のT ₁植物において発現されるが；しかし、2,4-D損傷からのわずかな保護がこの発現したタンパク質によって与えられる。 ネイティブなAAD-2遺伝子および植物に最適化されたAAD-2遺伝子で、タンパク質発現レベル（植物において）の実質的な差異は明白でなかった（PCT/US2005/014737を参照されたい）。 これらのデータは、植物でのAAD-12（v1）の機能的発現を行うより初期の知見を裏付け、予測されない、2,4-Dおよびピリジルオキシ酢酸除草剤に対する除草剤抵抗性を生じた。

実施例15-播種前全焼適用
本実施例および以下の実施例は、対象のAAD-12の発明によって可能にされた、新規な除草剤の特定の例である。

播種前全焼除草剤適用は、所定の作物を植える前に、冬または春先に出現した雑草を死滅させることを意図する。 典型的には、これらの適用は、播種の前に、雑草の物理的除去が完了していない場合に、不耕起または耕起の減少管理システムにおいて適用される。 それゆえに、除草剤プログラムは、播種の時点で存在している非常に広い範囲の広葉およびイネ科雑草を制御しなくてはならない。 グリホセート、グラモキソン、およびグルホシネートは、播種前全焼除草剤適用のために広く使用される非選択的、非残留性の除草剤の例である。 しかし、いくつかの雑草は、以下の1つまたは複数に起因して、この季節の時点で制御することが困難である：除草剤に対する雑草種または生物型の固有の非感受性、冬の期間の雑草の比較的大きなサイズ、ならびに除草剤の取り込みおよび活性を制限する冷涼な気候条件。 非選択性除草剤が弱い場合、雑草に対する範囲および活性を増大するためのいくつかの除草剤オプションが、これらの除草剤との容器での混合に使用可能である。 1つの例は、コニザ カナデンシス（Conyza canadensis）（クワモドキ）の制御を補助するための、グリホセートと2,4-Dの容器での混合物の適用である。 グリホセートは、420〜1680 g ae/ha、より典型的には560〜840 g ae/haで、存在する大部分の雑草の播種前全焼制御のために使用することができる。 2,4-Dは、非常に広範な広葉雑草に対して有効であり、これが低温においてさせ有効であり、かつ極度に安価であるので、選り抜きの除草剤である。 しかし、引き続く作物が感受性双子葉植物作物である場合には、土壌での2,4-Dの残留は（寿命は短いが）作物に負の影響を与えることができる。 ダイズは感受性作物であり、最低で7日間の期間（280 g ae/ha 2,4-D割合で）から少なくとも30日間（1120 g ae/haの2,4-D適用で）まで、全焼適用と播種の間が存在することを必要とする。 2,4-Dは、ワタの播種の前に全焼処理として禁止されている（連邦の表示を参照されたい、大部分は、CPR, 2005を通して、またはcdms.net/manuf/manuf.aspにてオンラインで使用可能である）。 AAD-12（v1）形質転換ワタまたはダイズを用いると、これらの作物は、作物の出現まえの播種まで、およびその後においてさえ、適用された全焼適用からの土壌中の2,4-D残渣を生き残ることが可能であるはずでる。 柔軟性の増大および容器での混合（または商業的なプレミックス）パートナーのコストの減少は、雑草制御オプションを改善し、重要な不耕起および耕起減少の状況における全焼適用の頑強さを増大する。 本実施例は、使用可能である多くのオプションの1つである。 雑草制御の分野における当業者は、種々の他の適用に気付いており、これには、例として、連邦除草剤表示（CPR, 2005）において記載されている製品を使用することによる、グラモキソン+2,4-Dまたはグルホシネート+2,4-D、およびAgriliance Crop Protection Guide (2005)において記載されている使用が含まれるが、これらに限定されない。 当業者はまた、上記の例は、安定に形質転換された場合には、AAD-12（v1）遺伝子によって保護される、任意の2,4-D（または他のフェノキシオーキシン除草剤）感受性作物に適用することができることを認識している。 同様に、トリクロピルおよびフルロキシピルの分解を可能にするAAD-12の独特な形質は、それぞれ、70〜1120または35〜350g ae/haのトリクロピルおよびフルロキシピルの置き換えまたは容器での混合を可能にすることによって、有用性を増加し、多年生またはつる植物の雑草種を制御する範囲を増加し、および／またはその能力を増加する。

実施例16-AAD-12（v1）のみで形質転換されたダイズ、ワタ、および他の双子葉植物作物における、フェノキシオーキシン除草剤の作物内使用
AAD-12（v1）は、通常2,4-Dに対して感受性である作物において直接的に、広い範囲の広葉雑草の直接的な制御のためにフェノキシオーキシン除草剤（例えば、2,4-DおよびMCPA）およびピリジルオキシオーキシン（トリクロピルおよびフルロキシピル）の使用を可能にすることができる。 280〜2240 g ae/haでの2,4-Dの適用は、農学的環境に存在する大部分の広葉雑草種を制御する。 最も典型的には、560〜1120 g ae/haが使用される。 トリクロピルについては、適用割合は、典型的には、70〜1120g ae/ha、より典型的には140〜420g ae/haの範囲である。 フルロキシピルについては、適用割合は、典型的には、35〜560g ae/ha、より典型的には70〜280g ae/haの範囲である。

この付加的なツールの利点は、より高い割合で使用する場合、より高い割合の2,4-D、トリクロピル、およびフルロキシピルによって提供される、極めて低コストの広葉除草剤成分、および潜在的に短命な残存する雑草制御であるのに対して、グリホセートのような非残存除草剤は、より後で発芽した雑草の制御を提供しない。 このツールはまた、組み込まれた除草剤抵抗性および雑草の変化管理ストラテジーとして、HTCの便利さと除草剤の作用の様式とを組み合わせるためのメカニズムを提供する。

このツールが提供するさらなる利点は、広い範囲の広葉雑草制御除草剤（例えば、2,4-D、トリクロピル、およびフルロキシピル）を、一般的に使用される残りの雑草制御除草剤とともに容器で混合する能力である。 これらの除草剤は、典型的には、播種前に、または播種の際に適用されるが、しばしば、播種の前に圃場に存在する可能性がある、出現し定着した雑草に対しては有効性がより低い。 これらのアリールオキシオーキシン除草剤の有用性を拡張して、播種、発芽前、または播種後の適用を含めることによって、残りの雑草制御プログラムの柔軟性が増加する。 当業者は、残りの除草剤プログラムが関心対象の作物に基づいて異なるが、典型的なプログラムがクロルアセトアミドおよびジニトロアニリン除草剤ファミリーの除草剤を含むが、クロマゾン、スルフェントラゾンなどの除草剤、ならびに種々のALS-阻害除草剤、PPO-阻害除草剤、およびHPPD-阻害除草剤もまた含むことを認識する。

さらなる利点には、アリールオキシ酢酸オーキシン除草剤の適用後の播種の前に必要とされる、2,4-D、トリクロピル、またはフルロキシピルに対する耐性；および2,4-D、トリクロピル、またはフルロキシピルを入れていた洗浄が不完全なバルクタンクから生じる、双子葉作物への汚染損傷からの問題が少ないことを含むことができる。 ジカンバ（および多くの他の除草剤）は、AAD-12（v1）形質転換双子葉植物作物の自生の引き続く制御のためになお使用することができる。

当業者はまた、上記の実施例が、安定に形質転換された場合に、AAD-12（v1）遺伝子によって保護される、任意の2,4-D（または他のアリールオキシオーキシン除草剤）感受性作物に適用することができることを認識している。 雑草制御の分野の当業者は、今や、単独で、または除草剤との組み合わせでの種々の市販のフェノキシオーキシン除草剤またはピリジルオキシオーキシン除草剤の使用が、AAD-12（v1）形質転換によって可能であることを認識している。 これらの化学物質の典型的な他の除草剤の特定の割合は、CPR（Crop Protection Reference）書籍または同様な編集物または任意の商業的もしくは学術的な作物保護の文献、例えば、Crop Protection Guide from Agriliance (2005)において編集されている、除草剤表示によって決定することができる。 単独で、容器での混合で、または連続して使用されるかに関わらず、AAD-12（v1）における使用のために可能にされる各々の代替的な除草剤は、本発明の範囲内にあると見なされる。

実施例17-AAD-12（v1）のみで形質転換されたトウモロコシ、イネ、および他の単子葉植物種におけるフェノキシオーキシン除草剤およびピリジルオキシオーキシン除草剤の作物内使用
類似の様式において、AAD-12（v1）を用いる草類種（例えば、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、または芝草および牧草であるがこれらに限定されない）の形質転換は、高い効力があるフェノキシオーキシンおよびピリジルオキシオーキシンの、選択性が通常明らかでない作物における使用を可能にする。 多くの草類種は、フェノキシオーキシン（すなわち、2,4-D）のようなオーキシン除草剤に対して天然の耐性を有する。 しかし、比較的低レベルの作物選択性が、適用のタイミングの短い期間または容認できない損傷のリスクに起因して、有用性の減少を生じてきた。 それゆえに、AAD-12（v1）形質転換単子葉植物作物は、多くの広葉雑草種を制御するための、双子葉植物について記載したのと同様の処理の組み合わせの使用、例えば、280〜2240 g ae/haの2,4-Dの適用を可能にする。 より典型的には、560〜1120 g ae/haが使用される。 トリクロピルについては、適用割合は、典型的には70〜1120g ae/ha、より典型的には140〜420g ae/haの範囲である。 フルロキシピルについては、適用割合は、典型的には35〜560g ae/ha、より典型的には70〜280g ae/haの範囲である。

この付加的なツールの利点は、より高い割合の2,4-D、トリクロピル、またはフルロキシピルによって提供される、極めて低コストの広葉除草剤成分、および潜在的に短命な残存する雑草の制御である。 対照的に、グリホセートのような非残存除草剤は、より後で発芽した雑草の制御を提供しない。 このツールはまた、グリホセート耐性作物/AAD-12（v1）HTC組み合わせストラテジーにおける、組み込まれた除草剤抵抗性および雑草の変化管理ストラテジーとしてのHTCの便利さを用いて、作物種を交代させるか否かに関わらず、除草剤の作用の様式を交代させるためのメカニズムを提供する。

このツールのさらなる利点は、広い範囲の広葉雑草制御除草剤（例えば、2,4-D、トリクロピル、およびフルロキシピル）を、一般的に使用される残存する雑草の制御除草剤とともに容器で混合する能力である。 これらの除草剤は、典型的には、播種前に、または播種の際に適用されるが、しばしば、播種の前に圃場に存在する可能性がある、出現し定着した雑草に対しては有効性がより低い。 これらのアリールオキシオーキシン除草剤の有用性を拡張して、播種、発芽前、または播種後の適用を含めることによって、残存する除草剤制御プログラムの柔軟性が増加する。 当業者は、残存する除草剤プログラムが関心対象の作物に基づいて異なるが、典型的なプログラムがクロルアセトアミドおよびジニトロアニリン除草剤ファミリーの除草剤を含むが、クロマゾン、スルフェントラゾンなどの除草剤、ならびに種々のALS-阻害除草剤、PPO-阻害除草剤、およびHPPD-阻害除草剤もまた含むことを認識する。

フェノキシオーキシンまたはピリジルオキシオーキシンに対するこのトウモロコシ、イネ、および他の単子葉植物の耐性の増大は、生長段階の制約、または作物の曲がり、「ラットテーリング」などの広がり現象、作物の曲がり、生長レギュレーター誘導性のトウモロコシにおける茎の脆性、または支柱根の変形についての潜在性なしで、作物でのこれらの除草剤の使用を可能にするはずである。 単独で、容器での混合で、または連続して使用されるかに関わらず、AAD-12（v1）によるHTCにおける使用のために可能にされる各々の代替的な除草剤は、本発明の範囲内にあると見なされる。

実施例18-任意の作物におけるグリホセート耐性形質と重ね合わされたAAD-12（v1）
北米において栽培されるワタ、アブラナ、トウモロコシ、およびダイズのエーカーの大部分がグリホセート耐性形質を含み、GTトウモロコシの採用は上昇している。 さらなるGT作物（例えば、例えば、コムギ、イネ、テンサイ、芝草など）が開発中であるが、現在まで商業的に発売されていない。 多くの他のグリホセート抵抗性種が、開発段階のために実験中である（例えば、アルファルファ、サトウキビ、ヒマワリ、ビート、エンドウマメ、ニンジン、キュウリ、レタス、タマネギ、イチゴ、トマト、およびタバコ；ポプラおよびスイートガムのような林業種；ならびにマリゴールド、ペチュニア、およびベゴニアなどの園芸種；World Wide Web上のisb.vt.edu/cfdocs/fieldtestsl.cfm , 2005）。 GTCは、この系によって提供される制御された雑草の完全な広がりおよび便利さおよびコスト効果のための価値のあるツールである。 しかし、現在標準であるベース処理としてのグリホセートの有用性は、グリホセート抵抗性雑草を選択することである。 さらに、グリホセートが固有に効力が弱い雑草は、グリホセートのみの化学物質プログラムが実施されている場合には、圃場で優勢な種に転じている。 従来的な育種を通して、または新規な形質転換事象として一緒にのいずれかで、GT形質とAAD-12（v1）を重ね合わせることによって、雑草制御の効力、柔軟性、ならびに雑草の変化および除草剤抵抗性の発生を管理する能力が改善できる。 以前の実施例において言及したように、AAD-12（v1）で作物を形質転換することによって、単子葉植物作物は、フェノキシオーキシンまたはピリジルオキシオーキシンの安全性のより高い限界を有し、かつフェノキシオーキシンは、双子葉植物作物に選択的に適用することができる。 雑草制御オプションの改善のためのいくつかのシナリオが想定でき、ここで、AAD-12（v1）およびGT形質は、任意の単子葉植物種または双子葉植物種において重ね合わせられる。
a）グリホセートは、大部分のイネ科雑草種および広葉雑草種の制御のために、標準的な発芽後適用割合（420〜2160g ae/ha、好ましくは560〜840g ae/ha）で適用することができる。 コニザ カンデンシス（Conyza canadensis）のような広葉雑草またはグリホセートを用いる制御に対して固有に困難である雑草（例えば、コメリナ（Commelina）種、イポメア（Ipomoea）種）の制御のために、280-2240g ae/ha（好ましくは560〜1120g ae/ha）2,4-Dが、効果的な制御を提供するために、連続して、容器で混合して、またはグリホセートとのプレミックスとして適用することができる。 トリクロピルについては、適用割合は、典型的には70〜1120g ae/ha、より典型的には140〜420g ae/haの範囲である。 フルロキシピルについては、適用割合は、典型的には35〜560g ae/ha、より典型的には70〜280 ae/haの範囲である。
b）現在、GTCにおいて適用されるグリホセートの割合は、一般的に、適用のタイミングあたり、560〜2240 g ae/haの範囲である。 グリホセートは、広葉雑草種よりも、イネ科植物雑草に対してはるかにより効力がある。 AAD-12（v1）+GTの重ね合わせた形質は、イネ科植物に有効な割合のグリホセート（105〜840g ae/ha、より好ましくは210〜420g ae/ha）を可能にする。 次いで、2,4-D（280〜2240g ae/ha、より好ましくは560〜1120g ae/ha）を、必要な広葉雑草の制御を提供するために、連続して、容器で混合して、またはイネ科雑草に有効な割合のグリホセートとのプレミックスとして適用することができる。 上述した割合のトリクロピルおよびフルロキシピルは、処置計画において容認できる成分である。 低い割合のグリホセートもまた、広葉雑草制御に対して何らかの利点を提供する。 しかし、主要な制御は2,4-D、トリクロピル、またはフルロキシピルからである。

雑草制御の分野の当業者は、単独または組み合わせ（連続的にもしくは独立して）での、1種または複数の市販のアリールオキシオーキシンの使用が、作物へのAAD-12（v1）形質転換によって可能であることを認識している。 これらの化学物質の典型的な他の除草剤の特定の割合は、CPR（Crop Protection Reference）書籍もしくは同様の編集物、オンラインで編集された表示（例えば、cdms.net/manuf/manuf.asp）、または任意の商業的もしくは学術的な作物保護の手引書、例えば、Crop Protection Guide from Agriliance (2005)において編集されている、除草剤表示によって決定することができる。 単独で、容器での混合で、または連続して使用されるかに関わらず、AAD-12（v1）形質転換によるHTCにおける使用のために可能にされる各々の代替的な除草剤は、本発明の範囲内にあると見なされる。

実施例19-任意の作物においてグルホシネート耐性形質と重ね合わされたAAD-12（v1）
グルホシネート耐性（PATまたはbar）は、昆虫抵抗性タンパク質のようなインプット形質のための選択マーカーとして、または特異的にHTC形質としてのいずれかで、現在、北米において栽培される多数の作物に存在している。 作物には、グルホシネート耐性のアブラナ、トウモロコシ、およびワタが含まれるがこれらに限定されない。 さらなるグルホシネート耐性作物（例えば、イネ、テンサイ、ダイズ、および芝草）が開発中であるが、現在まで商業的に発売されていない。 グルホシネートは、グリホセートのように、比較的選択性でなく、広い範囲のイネ科雑草および広葉雑草除草剤である。 これはより早く作用し、除草剤適用の24〜48時間後に、処理された葉の乾燥および「焼け」を生じる。 これは、迅速な雑草制御の出現のために有利である。 しかし、これはまた、標的植物の成長点領域へのグルホシネートの移行を制限し、多くの種において2つの化合物の相対的な雑草制御性能の評価によって証明されるように、乏しい雑草制御を生じる（Agriliance, 2005）。

従来的な育種を通して、または新規な形質転換事象として一緒にのいずれかで、グルホシネート耐性形質とAAD-12（v1）を重ね合わせることによって、雑草制御の効力、柔軟性、ならびに雑草の変化および除草剤抵抗性の発生を管理する能力が改善できる。 雑草制御オプションの改善のためのいくつかのシナリオが想定でき、ここで、AAD-12（v1）およびグルホシネート耐性形質は、任意の単子葉植物種または双子葉植物種において重ね合わせられる。
a）グルホシネートは、多くのイネ科雑草種および広葉雑草種の制御のために、標準的な発芽後適用割合（200〜1700g ae/ha、好ましくは350〜500g ae/ha）で適用することができる。 今日まで、グルホシネート抵抗性雑草は確認されていない。 しかし、グルホシネートは、グリホセートよりも、固有により耐性である非常に多くの雑草を有する。
i）固有に耐性である広葉雑草種（例えば、サオシウム アーベンシス（Cirsium arvensis）、アポシナム キャノビナム（Apocynum cannabinum）、およびコニザ カナデンシス）は、これらのより制御することが困難である多年生植物の効果的な制御のため、および一年生植物の広葉雑草種に対して制御の強固さを改善するために、280〜2240g ae/ha、より好ましくは560〜2240g ae/ha 2,4-Dを容器で混合することによって制御できる。 トリクロピルおよびフルロキシピルは、雑草制御レジメンにおいて考慮するための受け入れ可能な成分である。 トリクロピルについては、適用割合は、典型的には70〜1120g ae/ha、より典型的には140〜420g ae/haの範囲である。 フルロキシピルについては、適用割合は、典型的には35〜560g ae/ha、より典型的には70〜280 ae/haの範囲である。
b）グルホシネート（200〜500g ae/ha）+/- 2,4-D（280〜1120g ae/ha）+/- トリクロピルまたはフルロキシピル（上記の割合で）の複数の組み合わせは、例えば、より強固な、重複する雑草制御範囲を提供することができる。 加えて、重複する範囲は、除草剤抵抗性雑草の管理および遅延のためのさらなるメカニズムを提供する。

雑草制御の分野の当業者は、単独または組み合わせ（連続的にもしくは独立して）での、1種または複数の市販のアリールオキシ酢酸オーキシン除草剤の使用が、作物へのAAD-12（v1）形質転換によって可能であることを認識している。 これらの化学物質の典型的な他の除草剤の特定の割合は、CPR（Crop Protection Reference）書籍もしくは同様の編集物、オンラインで編集された表示（例えば、cdms.net/manuf/manuf.asp）、または任意の商業的もしくは学術的な作物保護の手引書、例えば、Crop Protection Guide from Agriliance (2005)において編集されている、除草剤表示によって決定することができる。 単独で、容器での混合で、または連続して使用されるかに関わらず、AAD-12（v1）によるHTCにおける使用のために可能にされる各々の代替的な除草剤は、本発明の範囲内にあると見なされる。

実施例20-任意の作物においてAHAS耐性形質と重ね合わされたAAD-12（v1）
イミダゾリノン除草剤耐性（AHASなど）は、トウモロコシ、イネ、およびコムギを含むがこれらに限定されない、現在、北米において栽培される多数の作物に存在している。 さらなるイミダゾリノン耐性作物（例えば、ワタおよびテンサイ）が開発中であるが、現在まで商業的に発売されていない。 多くのイミダゾリノン除草剤（例えば、イマザモクス、イマゼタピル、イマザキン、およびイマザピク）は、種々の従来的な作物において選択的に使用されている。 イマゼタピル、イマザモクス、および非選択性イマゼタピル（imazapyr）の使用は、AHASなどのようなイミダゾリノン耐性形質を通して可能にされてきた。 この化学クラスは、有意な土壌残留活性を有し、従って、グリホセートまたはグルホシネートに基づく系とは異なり、適用のタイミングを超えて広がる雑草制御を提供することが可能である。 しかし、イミダゾリノン除草剤によって制御される雑草の範囲は、グリホセートほどは広くない（Agriliance, 2005）。 加えて、イミダゾリノン除草剤は、多くの雑草が抵抗性を発生する作用の様式（アセトラクテートシンターゼ、ALSの阻害）を有する（Heap, 2005）。 従来的な育種を通して、または新規な形質転換事象として一緒にのいずれかで、イミダゾリノン耐性形質とAAD-12（v1）を重ね合わせることによって、雑草制御の効力、柔軟性、ならびに雑草の変化および除草剤抵抗性の発生を管理する能力が改善できる。 以前の実施例において言及したように、AAD-12（v1）で作物を形質転換することによって、単子葉植物作物は、フェノキシオーキシンまたはピリジルオキシオーキシンの安全性のより高い限界を有し、かつこれらのオーキシンは、双子葉植物作物に選択的に適用することができる。 雑草制御オプションの改善のためのいくつかのシナリオが想定でき、ここで、AAD-12（v1）およびイミダゾリノン耐性形質は、任意の単子葉植物種または双子葉植物種において重ね合わせられる。
a）イマゼタピルは、多くのイネ科雑草種および広葉雑草種の制御のために、標準的な発芽後適用割合（35〜280g ae/ha、好ましくは70〜140g ae/ha）で適用することができる。
i）アマランサス ルディス（Amaranthus rudis）、アンブロシア トリフィダ（Ambrosia trifida）、チェノポジウム アルブム（Chenopodium album）のようなALS阻害剤抵抗性広葉雑草（とりわけ、Heap, 2005）は、280〜2240g ae/ha、好ましくは560〜1120g ae/ha）2,4-Dを容器で混合することによって制御できる。 トリクロピルについては、適用割合は、典型的には70〜1120g ae/ha、より典型的には140〜420g ae/haの範囲である。 フルロキシピルについては、適用割合は、典型的には35〜560g ae/ha、より典型的には70〜280 ae/haの範囲である。
ii）イポモエア（Ipomoea）種のようなイミダゾリノン除草剤に対して固有により耐性である広葉雑草種は、280〜2240g ae/ha、より好ましくは560〜1120g ae/ha 2,4-Dを容器で混合することによってもまた制御できる。 トリクロピルまたはフルロキシピルについては上記の割合を参照されたい。
b）イマゼタピル（35〜280g ae/ha、好ましくは、70〜140g ae/ha）+/- 2,4-D（280〜1120g ae/ha）+/- トリクロピルまたはフルロキシピル（上記の割合で）の複数の組み合わせは、例えば、より強固な、重複する雑草制御範囲を提供することができる。 加えて、重複する範囲は、除草剤抵抗性雑草の管理および遅延のためのさらなるメカニズムを提供する。

雑草制御の分野の当業者は、単独で、または1種もしくは複数の組み合わせでの、種々の市販のイミダゾリノン除草剤、フェノキシ酢酸オーキシン除草剤、またはピリジルオキシ酢酸オーキシン除草剤のいずれかの使用が、従来的な育種または遺伝子操作のいずれかによる、AAD-12（v1）形質転換および任意のイミダゾリノン耐性との重ね合わせによって可能であることを認識している。 これらの化学物質の典型的な他の除草剤の特定の割合は、CPR（Crop Protection Reference）書籍もしくは同様の編集物、オンラインで編集された表示（例えば、cdms.net/manuf/manuf.asp）、または任意の商業的もしくは学術的な作物保護の手引書、例えば、Crop Protection Guide from Agriliance (2005)において編集されている、除草剤表示によって決定することができる。 単独で、容器での混合で、または連続して使用されるかに関わらず、AAD-12（v1）によるHTCにおける使用のために可能にされる各々の代替的な除草剤は、本発明の範囲内にあると見なされる。

実施例21-イネにおけるAAD-12（v1）
21.1-培地の説明
使用する培地を1M KOHでpH 5.8に調整し、2.5g/1 Phytagel（Sigma）で固化した。 胚形成カルスを、40ml半固形培地を含む100×20mm ペトリ皿中で培養した。 イネ小植物をMagentaボックス中の50ml培地上で生育させた。 細胞懸濁液を、35ml液体培地を含む125mlコニカルフラスコ中で維持し、125rpmで回転させた。 胚形成培養の誘導および維持は、暗所にて25〜26℃で行い、植物の再生および全植物培養は16時間光周期で行った（Zhang et al. 1996）。

胚形成カルスの誘導および維持は以前に記載されたようにNB基礎培地上で行ったが（Li et al. 1993）、500mg/lグルタミンを含むように適合させた。 懸濁培養を開始し、マルトースの代わりに30g/lを含めたSZ液体培地（Zhang et al. 1998）中で維持した。 浸透培地（NBO）は、各0.256Mのマンニトールおよびソルビトールの添加を伴うNB培地からなった。 ハイグロマイシンB耐性カルスを、50mg/lハイグロマイシンを補充したNB培地で3〜4週間選択した。 プレ再生を、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）を有さないが、2mg/l 6-ベンジルアミノプリン（BAP）、1mg/l α-ナフタレン酢酸（NAA）、5mg/lアブシジン酸（ABA）および50mg/l ハイグロマイシンBの添加を伴うNB培地からなる培地（PRH50）上で1週間行った。 続いて、2,4-Dを含まず、3mg/l BAP、0.5mg/l NAA、および50mg/lハイグロマイシンBを補充したNB培地を含む再生培地（RNH50）上での培養を通して、シュートが再生するまで、小植物を再生させた。 1%スクロースおよび50mg/lハイグロマイシンBを補充した半分の強度のMurashigeとSkoogの基礎塩およびGamborgのB5ビタミンを有する発根培地（1/2MSH50）に、シュートを移した。

21.2-組織培養物の発生
オリザ サティバ（Oryza sativa）L.ジャポニカ 栽培種タイペイ（L. japonica cv. Taipei）309の成熟乾燥種子を、Zhang et al. 1996において記載されるように殺菌した。 胚形成組織を、暗所でNB培地上で殺菌成熟イネ種子を培養することによって誘導した。 約1mm直径の一次カルスを胚盤から取り出し、SZ液体培地中で細胞懸濁を開始するために使用した。 次いで、懸濁物を、Zhang 1995に記載されるように維持した。 懸濁物に由来する胚発生組織を、以前の継代培養の3〜5日後に液体培養から取り出し、NBO浸透培地に移し、ペトリ皿中で約2.5cmの横方向の円を形成して、ボンバードメントの前4時間培養した。 ボンバードメントの16〜20時間後、組織を、NBO培地からNBH50ハイグロマイシンB選択培地に移し、ボンバードメント表面が上側を向くことを確実にし、および暗所で14〜17時間インキュベートした。 次いで、新たに形成されたカルスを、もともとのボンバードメント移植片から分離し、同じ培地のすぐ近くに配置した。 さらに8〜12時間後、比較的緻密な、不透明なカルスが目視的に同定され、および暗所で7日間、PRH50プレ再生培地に移した。 次いで、より緻密でかつ不透明になった生長しているカルスを、16時間光周期下で、14〜21日間の期間、RNH50再生培地に継代培養した。 再生しているシュートを、1/2MSH50培地を含むMagentaボックスに移した。 単一の移植片から再生された複数の植物は同胞と見なされ、1つの独立した植物系統として扱った。 植物を、それが厚い白色の根を生じ、1/2MSH50培地上で元気に生長した場合には、hph遺伝子について陽性と点数付けした。 一旦小植物がMagentaボックスの上端に達したら、これらは1週間、100%湿度下で、6cmポット中の土壌に移し、次いで、30℃の14時間明期、および21℃の暗期の生育チャンバーに移し、2〜3週間後、温室中の13cmポットに移植した。 種子を収集し、37℃で1週間乾燥させ、その後保存した。

21.3-微粒子銃ボンバードメント
すべてのボンバードメントは、Biolistic PDS-1000/He（商標）システム（Bio-Rad, Laboratories, Inc.）を用いて実施した。 3mgの1.0ミクロン直径の金粒子を1回、100％エタノールで、2回滅菌蒸留水で洗浄し、およびシリコン処理したEppendorfチューブ中の50μl水中に懸濁した。 1:6モル比のpDOW3303（Hpt含有ベクター）:pDAB4101（AAD-12(v1) + AHAS）を表す5μgプラスミドDNA、20μlスペルミジン（0.1M）および50μl 塩化カルシウム（2.5M）を金懸濁物に加えた。 この混合物を室温で10分間インキュベートし、10000rpmで10秒間ペレット化し、60μl冷100%エタノール中に再懸濁し、および8〜9μlを各マイクロキャリアに分配した。 組織試料を、Zhang et al. (1996)によって記載されるように、1100psiおよび27inのHg真空でボンバードメントした。

21.4-AAD-12（v1）形質転換T ₀ イネにおける発芽後除草剤耐性
3〜5葉段階のイネ小植物に、187L/haに較正したトラック噴霧器を使用して、1% Snit II（v/v）および1.25% UAN（v/v）を含むPursuitの0.16%（v/v）の致死用量（AHAS遺伝子の存在を確認するため）を噴霧した。 感受性または抵抗性のための割合は、処理後36日（DAT）に実施した。 温室に送った33個の事象のうちの10個はPursuitに対して強固に耐性であった；他の事象は様々なレベルの除草剤損傷を被った。 植物をサンプリングし（以下の21.7節に従う）、分子的特徴付けは、実施例8において以前に記載されたように実施し、これらの10個の事象のうちの7個をAAD-12（v1）PTUと完全なAHAコード領域の両方を含むと同定した。

21.5-T ₁ イネにおけるAAD-12（v1）の遺伝性
100個の植物子孫試験を、AAD-12（v1）PTUとAHASの両方のコード領域を含んだAAD-12（v1）の5つのT ₁系統に対して実施した。 種子は、上記の手法に関連して播種、以前に記載されたようにトラック噴霧器を使用して、140g ae/haイマゼタピルを噴霧した。 14DAT後、抵抗性および感受性植物を計数した。 試験した5つの系統のうちの2つは、χ二乗検定によって決定されるように、単一遺伝子座の、優性メンデル形質（3R：1S）として分離した。 AAD-12は、以下の2,4-D耐性試験によって決定されるように、AHAS選択マーカーとともに同時分離した。

21.6-T ₁ イネにおける高い2,4-D耐性の確認
以下のT ₁ AAD-12（v1）単一分離遺伝子座系統を、Metro Mix培地を含む3インチポットに植えた：pDAB4101(20)003およびpDAB4101(27)002。2〜3枚葉段階で、140g ae/haイマゼタピルを噴霧した。 ヌルは除外し、個体には、V3〜V4段階で、1120、2240、または4480g ae/ha 2,4-D DMA（それぞれ、2×、4×、および8×の典型的な商業的使用割合）で、187L/haに設定したトラック噴霧器で噴霧した。 植物は、7および14DATで等級付けし、陰性対照植物として、形質転換されていない商業的なイネ品種「Lamont」と比較した。

損傷データ（表27）は、AAD-12（v1）形質転換系統が、非翻訳対照よりも、高い割合の2,4-D DMAに対してより耐性であることを示す。 系統pDAB4101(20)003は、系統pDAB4101(27)002よりも高いレベルの2,4-Dに対してより耐性であった。 データは、2,4-Dの耐性が少なくとも2世代の間に安定であることもまた実証する。

（表２７）様々なレベルの2,4-D DMAに対するT ₁ AAD-12（v1）および非翻訳対照の応答

21.7-組織の収集、DNAの単離および定量
新鮮な組織をチューブに配置し、4℃で2日間凍結乾燥した。 組織を完全に乾燥させた後、タングステンビーズ（Valenite）をチューブ中に配置し、試料を、1分間、Kelcoビーズミルを使用する乾式粉砕に供した。 次いで、標準的なDNeasy DNA単離手法に従った（Qiagen, Dneasy 69109）。 次いで、抽出したDNAのアリコートをPico Green（Molecular Probes P7589）で染色し、濃度をng/μlで得るために既知の標準を用いてフルオロメーター（BioTek）で読み取った。

21.8-AAD-12（v1）発現
試料調製および分析条件は以前に記載したものと同様であった。 33個すべてのT ₀トランスジェニックイネ系統および1個の非トランスジェニック対照を、ELISAブロットを使用してAAD-12発現について分析した。 AAD-12は、20個の系統のクローンにおいて検出し、しかしタイパイ（Taipai）309対照植物においては検出しなかった。 イマゼタピルに対して耐性であったクローンのいくつかを有する20個の系統のうちの12個がAAD-12タンパク質を発現しており、AAD-12 PCR PTU陽性であり、そしてAHASコード領域陽性であった。 発現レベルは、全体の可溶性タンパク質の2.3から1092.4ppmまでの範囲であった。

21.9-2,4-Dおよびトリクロピル除草剤に対するpDAB4101イネ植物の圃場耐性
圃場レベル耐性試験は、AAD-12（v1）事象pDAB4101[20]および1つの野生型イネ（Clearfield 131）を用いて、ミシシッピー州ウェイサイド（Wayside, Mississippi）において実施した（非トランスジェニックイミダゾリノン抵抗性変種）。 実験設計は、単一の複製を有するランダム化された完全なブロック設計であった。 除草剤処理は、2240g ae/haである2×割合の2,4-D（ジメチルアミン塩）、および560g ae/haであるトリクロピル、加えて未処理対照であった。 各除草剤処理の中で、T ₁世代pDAB4101[20]の2つの作条およびClearfieldイネの2つの作条は、8インチ作条間隔で小さなプロットドリルを使用して植えた。 pDAB4101[20]イネはAAD-12（v1）の選択マーカーとしてAHAS遺伝子を含んだ。 イマゼタピルは、プロットからの任意のAAD-12（v1）ヌル植物を除去するための選択剤として、1枚葉段階で適用した。 除草剤処理は、130〜220 kpa圧力で187L/haキャリア体積を送達する圧縮空気バックパック噴霧器を使用して、イネが2枚葉段階に達したときに適用した。 損傷の目視的な割合は、適用の7日後、14日後、および21日後に取った。

2,4-Dおよびトリクロピルに対するAAD-12（v1）事象の応答は表28に示す。 非形質転換イネ系統（Clearfield）は、4×商業的使用割合と見なされる2240g ae/haの2,4-Dによって深刻に損傷した（7DATで30%および15DATで35%）。 AAD-12（v1）事象は2,4-Dに対して優秀な耐性を実証し、7または15DATにおいて損傷は観察されなかった。 非形質転換イネは、2×割合のトリクロピル（560g ae/ha）によって有意に損傷した（7DATで15%および15DATで25%）。 AAD-12（v1）事象は2×割合のトリクロピルに対して優秀な耐性を実証し、7DATまたは15DATのいずれかで損傷が観察されなかった。

これらの結果は、AAD-12（v1）形質転換イネが、Clearfieldイネに対して深刻な目視的な損傷を引き起こした割合の2,4-Dおよびトリクロピルに対して高レベルの抵抗性を示したことを示す。 これはまた、より広い範囲の有効な化学物質に対する抵抗性を提供するために、AAD-12 Iの複数の種と複数の除草剤耐性遺伝子を重ね合わせる能力もまた実証する。

（表２８）圃場条件下での2,4-Dおよびトリクロピルに対するAAD-12 T ₁世代イネ植物応答

実施例22-アブラナにおけるAAD-12（v1）
22.1-アブラナ形質転換
2,4-Dに対する抵抗性を付与するAAD-12（v1）遺伝子を、アグロバクテリウム媒介形質転換およびプラスミドpDAB3759を用いて、セイヨウアブラナ（Brassica napus）var.Nexera ^* 710を形質転換するために使用した。 構築物は、CsVMVプロモーターによって駆動されるAAD-12（v1）遺伝子、およびAtUbi10プロモーターによって駆動されるPat遺伝子、およびAtUbi10プロモーターによって駆動されるEPSPSグリホセート抵抗性形質を含んだ（2.4節を参照）。

種子を10分間、10%の市販の漂白剤で表面殺菌し、滅菌蒸留水で3回すすいだ。 次いで、種子を半分濃度のMS基礎培地（Murashige and Skoog, 1962）上に配置し、25℃および16時間明期/8時間暗期の光周期で設定した生育レジメ（regime）下で維持した。

胚軸セグメント（3〜5mm）を5〜7日齢の苗から切除し、前処理としてカルス誘導培地K1D1T（1mg/lカイネチンおよび1mg/l 2,4-Dを有するMS培地）上に配置した。 次いで、セグメントをペトリ皿に移し、pDAB3759を含むアグロバクテリウムZ707SまたはLBA4404株で処理した。 アグロバクテリウムは、暗所にて28℃で一晩、150rpmのシェーカー上で増殖させ、引き続いて培地に再懸濁した。

アグロバクテリウムを用いる胚軸セグメントの処理の30分後、これらをカルス誘導培地上に3日間再配置した。 共培養後、セグメントをK1D1TC（250mg/l カルベニシリンおよび300mg/l チメンチンを含むカルス誘導培地）上に、回収の1週間または2週間配置した。 代替として、セグメントを、選択培地K1D1H1（1mg/l ハービアス（Herbiace）を有する上記の培地）上に直接配置した。 カルベニシリンおよびチメンチンは、アグロバクテリウムを死滅させるための使用した抗生物質であった。 選択剤ハービアスは、形質転換細胞の成長を可能にした。

次いで、カルス化した胚軸セグメントを、B3Z1H1（MS培地、3mg/l ベンジルアミノプリン、1mg/l ゼアチン、0.5gm/l MES [2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸]、5mg/l 硝酸銀、1mg/l ハービアス、カルベニシリン、チメンチン）シュート再生培地上に配置した。 2〜3週間後、シュートが再生し始めた。 シュートに沿った胚軸セグメントをB3Z1H3培地（MS培地、3mg/1 ベンジルアミノプリン、1mg/l ゼアチン、0.5gm/l MES [2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸]、5mg/l 硝酸銀、3mg/l ハービアス、カルベニシリン、チメンチン）上に、次の2〜3週間移した。

シュートを胚軸セグメントから切除し、シュート伸長培地MESH5またはMES10（MS, 0.5gm/l MES、5または10mg/l ハービアス、カルベニシリン、チメンチン）に、2〜4週間移した。 伸長したシュートを、根誘導のために、MSI.1（0.1 mg/l インドール酢酸を有するMS）上で培養する。 一旦植物が十分に確立された根系を有したら、これらを土壌に移植した。 植物を、Conviron内の制御された環境条件下で1〜2週間馴化させ、その後温室に移した。

22.2-「分子分析」：アブラナの材料および方法
22.2.1-DNAを収集する組織の単離および定量
新鮮な組織をチューブに配置し、4℃で2日間凍結乾燥した。 組織を完全に乾燥させた後、タングステンビーズ（Valenite）をチューブ中に配置し、試料を、1分間、Kelcoビーズミルを使用する乾式粉砕に供した。 次いで、標準的なDNeasy DNA単離手法に従った（Qiagen, DNeasy 69109）。 次いで、抽出したDNAのアリコートをPico Green（Molecular Probes P7589）で染色し、濃度をng/μlで得るために既知の標準を用いてフルオロメーター（BioTek）で読み取った。

22.2.2-ポリメラーゼ連鎖反応
全体で100ngの全DNAを鋳型として使用した。 20mMの各プライマーを、Takara Ex Taq PCR Polymeraseキット（Mirus TAKRR001A）とともに使用した。 コード領域PCR AAD-12（v1）のためのプライマーは、（SEQ ID NO:10）（フォワード）および（SEQ ID NO:11）（リバース）であった。 PCR反応を、9700 Geneampサーモサイクラー（Applied Biosystems）において、試料を、94℃で3分間、ならびに94℃で30秒間、65℃で30秒間、および72℃で2分間の35サイクル、続いて72℃で10分間に供することによって実行した。 PCR産物を、EtBrで染色した1%アガロースゲル上での電気泳動によって分析した。 試験したAAD-12（v1）事象を有する35植物からの35個の試料が陽性と試験された。 3個の陰性対照は陰性と試験された。

22.2.3-ELISA
以前の節において確立されたELISAを使用して、AAD-12タンパク質を、5個の異なるアブラナ形質転換植物事象において検出した。 発現レベルは、全可溶性タンパク質（TSP）の14〜700ppm以上の範囲であった。 3つの異なる非形質転換植物試料を並行して試験し、これはシグナルを検出しなかった。 このことは、このアッセイ法において使用した抗体が、アブラナ細胞マトリックスに対して最小限の交差反応性を有することを示す。 これらの試料はまた、ウエスタン分析によって陽性であることが確認された。 結果の要約を表29に示す。

（表２９）アブラナ植物体におけるAAD-12（v1）の発現

22.4-AAD-12（v1）形質転換T ₀ アブラナにおける発芽後除草剤耐性
構築物pDAB3759で形質転換したものからの45個のT ₀事象を一定時間温室内に送り、温室内で馴化させた。 これらの植物を、2〜4枚の新たな正常な外見の葉が現れるまで生育させた（すなわち、植物は、組織培養から温室生育条件に移行した）。 次いで、植物を、2,4-D Amine 4の市販の製剤の致死用量である560g ae/haの割合で処理した。 除草剤適用は、トラック噴霧器を用いて、187L/haの噴霧量、50cm噴霧高さで行った。 致死用量は、非形質転換対照に対する>95%損傷を引き起こす割合として定義される。

24個の事象は、2,4-D DMA除草剤適用に対して耐性であった。 ある事象はわずかな損傷を被ったが、14 DATまでに回復した。 事象は、制御され、袋付けした条件下での自家受粉によって、T ₁ （およびT ₂世代）に進んだ。

22.5-アブラナにおけるAAD-12（v1）遺伝性
100個の植物の子孫試験もまた、AAD-12（v1）の11種のT ₁系統に対して実施した。 種子をまき、Metro Mix培地で満たした3インチポットに移植した。 次いで、すべての植物に、以前に記載したように560g ae/ha 2,4-D DMAを噴霧した。 14 DAT後、抵抗性植物および感受性植物を計数した。 χ二乗検定によって決定されるように、試験した11個の系統のうちの7つが、単一の遺伝子座である優性メンデル形質（3R:1S）として分離した。 AAD-12は、複数の種において強固なアリールオキシアルカノエートオーキシン抵抗性遺伝子として遺伝性であり、1つまたは複数のさらなる除草剤抵抗性遺伝子と重ねあわせることができる。

22.6-T ₁ アブラナにおける高い2,4-D耐性の確認
T ₁ AAD-12（v1）については、5〜6mgの種子を層形成し、まき、そしてSunshine Mix # 5培地の微細な層を土壌の上端に加えた。 現れる植物を、播種後7日後および13日後に、560g ae/ha 2,4-Dで選択した。

生き残っている植物を、Metro Mix培地を含む3インチポットに移植した。 560g ae/ha 2,4-Dで選択したT1子孫からの生き残っている植物もまた、Metro Mix土壌で満たした3インチポットに移植した。 2〜4枚葉段階で、植物は、280、560、1120、または2240g ae/ha 2,4-D DMAのいずれかを噴霧した。 植物は3および14 DATで等級付けし、非形質転換対照植物と比較した。 14 DATでのT ₁事象損傷データのサンプリングは、表30において見ることができる。 データは、複数の事象が、2240g ae/ha 2,4-Dに対して強固に抵抗性であるのに対して、他の事象は1120g ae/ha 2,4-Dまでより強固でない耐性を実証したことを示唆する。 生き残っている植物は、Metro Mix培地を含む5 1/4"ポットに移植し、以前と同じ生長条件に配置し、および自家受粉してホモ接合性種子のみを生じた。

（表３０）様々な割合の発芽後2,4-D DMA適用に対するT ₁ AAD-12（v1）および非形質転換対照応答

22.7-2,4-D、ジクロルプロップ、トリクロピル、およびフルロキシピル除草剤に対する、pDAB3759アブラナ植物の圃場耐性
圃場レベル耐性試験は、2つのAAD-12（v1）事象3759(20)018.001および3759(18)030.001および野生型アブラナ（Nex710）に対して、インディアナ州ファウラーにおいて実施した。 実験設計は、3つの複製を用いるランダム化された完全なブロック設計であった。 除草剤処理は、280、560、1120、2240、および4480g ae/haの2,4-D（ジメチルアミン塩）、840g ae/haのトリクロピル、280g ae/haのフルロキシピル、ならびに未処理対照であった。 各除草剤処理の中で、事象3759(18)030.0011、3759(18)018.001、および野生型系統（Nex710）のための単一の20フィート作条/事象を、8インチ作条間隔で4作条ドリルを使用して植えた。 除草剤処理は、130〜220 kpa圧力で187L/haキャリア体積を送達する圧縮空気バックパック噴霧器を使用して、アブラナが4〜6枚葉段階に達したときに適用した。 視覚的な損傷割合は、適用の7日後、14日後、および21日後に取った。

2,4-D、トリクロピル、およびフルロキシピルに対するアブラナ応答は表31に示す。 野生型アブラナ（Nex710）は、4×割合と見なされる2240g ae/haの2,4-Dによって深刻に損傷した（14DATで72%）。 AAD-12（v1）事象は、すべて、14DATにおいて2,4-Dに対して優秀な耐性を実証し、2、3、および2%の平均損傷が、1、2、および4×割合においてそれぞれ観察された。 野生型アブラナは、2×割合のトリクロピル（840g ae/ha）によって深刻に損傷した（14DATにおいて25%）。 AAD-12（v1）事象は、2×割合のトリクロピルにおける耐性を実証し、2つの事象にわたって14DATにおいて平均6%損傷であった。 280g ae/haにおけるフルロキシピルは、14DAAにおいて非形質転換系統に対して深刻な損傷（37%）を引き起こした。 AAD-12（v1）事象は耐性の増加を実証し、5DATで平均8%損傷であった。

これらの結果は、AAD-12（v1）形質転換事象が、非形質転換アブラナに致死的であったかまたは深刻な上偏生長奇形を引き起こした割合で、2,4-D、トリクロピル、およびフルロキシピルに対して高レベルの抵抗性を示したことを示す。 AAD-12は、2,4-D>トリクロピル>フルロキシピルの相対的効力を有することが示された。

（表３１）圃場条件下での2,4-D、トリクロピル、およびフルロキシピルに対するAAD-12（pDAB3759）アブラナ植物応答

実施例23-任意の作物において昆虫抵抗性（IR）または他の入力形質と重ね合わされたAAD-12（v1）
トランスジェニック形質によって供給される作物における昆虫抵抗性は、北米において、または世界中でのトウモロコシおよびワタの生産において普及している（prevelant）。 IRおよびHTの合わせた形質を有する市販の製品は、複数の種子企業によって開発されている。 これらには、Bt IR形質（例えば、lifesci.sussex.ac.ukウェブサイト, 2006に列挙されるBt毒素）および上述のHTC形質のいずれかまたはそのすべてが含まれる。 この提供物がもたらす価値は、単一の提供物中の遺伝的手段を通して、複数の厄介な問題を制御する能力である。 この提供物の便利さは、雑草制御および昆虫制御が互いと独立して達成されるならば、制限される。 単独の、または1つもしくは複数のさらなるHTC形質と重ね合わされたAAD-12（v1）は、従来的な育種を通して、または新たな形質転換事象として合同してのいずれかで、1つもしくは複数のインプット形質（例えば、昆虫抵抗性、真菌抵抗性、またはストレス耐性など）（isb.vt.edu/cfdocs/fieldtestsl. cfm, 2005）と重ね合わせることができる。 利点には、AAD-12および関連する除草剤耐性によって提供される雑草制御の改善に加えて、害虫および/または他の農学的なストレスを管理する能力ととともに、上記の実施例15〜20に記載される簡便さおよび柔軟性が含まれる。 従って、本発明は、任意の数の農学的な問題を柔軟かつ費用効率よく制御する能力を有する、作物品質の改善の完全な農学的パッケージを提供するために使用することができる。

IRおよびHTの合わせた形質は、大部分の農学的および園芸用/観賞用作物および林業における適用を有する。 AAD-12およびその釣り合った除草剤耐性ならびに任意の数のBtまたは非Bt IR遺伝子によって付与される昆虫抵抗性は、実施例13に列挙された（がこれらに限定されない）作物種に適用できる。 雑草制御の分野の当業者は、単独で、または複数の組み合わせでの、実施例18〜20に記載される種々の市販の除草剤のいずれか、フェノキシ酢酸またはピリジルオキシオーキシン除草剤の使用が、AAD-12（v1）形質転換、および従来的な育種または遺伝子操作のいずれかによる対応するHT形質またはIR形質との重ね合わせによって可能であることを認識している。 これらの化学物質の典型的な他の除草剤の特定の割合は、CPR（Crop Protection Reference）書籍もしくは同様の編集物、オンラインで編集された表示（例えば、cdms.net/manuf/manuf.asp）、または任意の商業的もしくは学術的な作物保護の手引書、例えば、Crop Protection Guide from Agriliance (2003)において編集されている、除草剤表示によって決定することができる。 単独で、容器での混合で、または連続して使用されるかに関わらず、AAD-12（v1）によるHTCにおける使用のために可能にされる各々の代替的な除草剤は、本発明の範囲内にあると見なされる。

実施例24-インビトロ双子葉植物選択マーカーとしてのAAD-12（v1）
植物細胞、組織、器官、および植物またはオルガネラ、例えば、プラスチドの遺伝子操作は、適切な送達方法を使用して、関心対象の遺伝子を植物細胞に挿入するプロセスで開始する。 しかし、遺伝子が植物細胞に送達される場合、極めて小さなパーセンテージの細胞のみが、異種遺伝子をそれらのゲノムに組み込む。 関心対象の遺伝子を取り込んだこれらのわずかな細胞を選択するために、研究者達は、ベクター中の関心対象の遺伝子（GOI）に、選択可能なまたはスクリーニング可能な「マーカー遺伝子」を連結する。 これらのマーカーを含む細胞は、DNAプラスミドベクターが送達された細胞/組織の全体の集団から同定される。 マーカー遺伝子を発現するこれらの細胞を選択することによって、研究者達は、細胞のゲノムにGOIを組み込んだ可能性があるこれらのわずかな細胞を同定することが可能である。

この選択プロセスを可能にしてトランスジェニック細胞、カルス、胚、シュート、および小植物を得るために利用可能である様々な選択マーカーが存在している。 Ag産業によって好まれる選択マーカーは、圃場状況において事象区分のプロセスの間に正しいトランスジェニック子孫を選択するために、圃場での化合物の噴霧の容易さを可能にする除草剤マーカーである。 AAD-12（v1）は、選択剤として2,4-Dを用いて温室および生育チャンバー中にて遺伝子で形質転換した全植物のための選択マーカーとして有効に働くことが示されてきた（実施例7）。 圃場選択は、AAD-12（v1）遺伝子と組み合わせた2,4-Dを使用して同様に可能であるが（実施例11、22）、細胞レベル選択のためのインビトロでの使用は、2,4-Dが、植物組織培養系において植物生長調節因子としてほぼ遍在的に使用されるという事実によって複雑にされる。 AAD-12（v1）によるこの重要なホルモンの分解は、インビトロ選択マーカーとしてのこの遺伝子を使用する能力に影響を与え得る。 マーカー遺伝子として2,4-Dを開発することの成功は、トランスジェニック細胞中で発現されたときに、それぞれの培養系において2,4-Dの効果を模倣することができ、および同時に安定でありかつAAD-12酵素によって分解されない能力を有することができる、正しい代替の植物生長調節因子を同定することに依存する。 R-ジクロルプロップは、AAD-12（v1）の基質ではない、2,4-Dに近いアナログであり、タバコ細胞培養における非代謝性オーキシン代用品として使用され、2,4-Dを高い割合で選択剤として使用することを可能にする。 この事実は、AAD-12（v1）がインビトロで選択マーカーとして使用できることを例示する際に使用される。

24.1-細胞培養-代替オーキシン
AAD-12（v1）は2,4-Dを分解するが、オーキシン生長調節因子の構造的要件を同時に有するR-2,4-ジクロロフェノキシプロピオン酸（R-ジクロルプロップ）を分解しない。 細胞培養において使用されてもよい他の非代謝性植物オーキシン模倣物には、NAA（ナフタレン酢酸）、IAA（インドール酢酸）、ジカンバ、ピクロラム、およびR-メコプロップが含まれる。 R-ジクロルプロップを置き換え、かつ2つの異なるタバコ培養物PHL（ペチト ハバナ（Petite Havanna））およびBY2懸濁物を首尾よく維持することが可能であったか否かを調べた。 逆に、ワタ移植物のために、R-ジクロルプロップ、ジカンバ、およびピクロラムは代替オーキシンとして試験し、標準生長調節因子、2,4-Dと比較した胚形成カルス誘導性応答を評価した。 ペチト ハバナタバコ（PHL）およびコーカー（Coker）ワタ子葉をこれらの実験において使用した。
24.1.1-タバコ細胞懸濁物-選択剤としての2,4-D
培養培地中でR-ジクロルプロップが2,4-Dの代わりに直接的に置き換えられた場合に、R-ジクロルプロップに慣れたPHL細胞と、R-ジクロルプロップに慣れたBY2細胞の両方を用いて、用量応答研究を実施した。 焦点はPHLに注がれていたが、用量応答はまた、可能な将来の研究の場合にはBY2を用いて、ならびにPHLについては用量応答を予測することを補助するためにも行った。 ジクロルプロップに慣れたPHL用量応答のために、使用した2,4-Dのレベル（R-ジクロルプロップを伴うLSBY2C上で）は0（対照）、1、2、3、5、8、10、12、15、18、20、40、60、80、10、110、120mg/L 2,4-Dであった。 濃度あたり4つの複製が存在した。 R-ジクロルプロップに慣れたBY2用量応答については、使用した2,4-Dのレベル（LSBY2C培地上で）は0（対照）、1、2、3、5、8、10、20、30、40、mg/L 2,4-Dであった。

用量応答を実行し、試験した2,4-Dのすべての濃度が、10mg/Lよりも上の濃度で致死的であったことを示した。 しかし、PHL懸濁物のわずかな増殖が観察されたときには、10mg/L 2,4-Dまでのすべての濃度で増殖が存在した。 1〜8mg/L 2,4-D濃度からの懸濁物コロニーの増殖は、対照処理における増殖と比較可能であった。 BY2懸濁物細胞において行われた観察は、10mg/Lの濃度が致死的であることが見い出され、致死以下の濃度が8mg/L濃度であったこと以外は同様であった。

24.1.2-AAD-12（v1）および2,4-D選択を用いるタバコ細胞形質転換
タバコ形質転換実験のために、全体で11通りの処理：LS-BY2C+ジクロルプロップ培地上にプレートした対照セット、およびLSBY2C+ジクロルプロップ+様々な濃度レベル（1、2、3、5、8、10、12、15、18、20mg/L）の2,4-Dの10セットが存在した。 処理あたり4つの複製が存在した。 使用したプラスミドDNAベクターはpDAB724であり、形質転換のために使用したベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのEHA101S株であった。 0.6 OD ⁶⁶⁰のPHL懸濁物の4mLを、滅菌ペトリプレート中で、1.0 OD ⁶⁶⁰のアグロバクテリウム（EHA101株またはLBA4404株のいずれか）懸濁物の100μlと混合し、徹底的に混合し、および非振盪条件下で、暗所生長チャンバーで、25℃にて3日間、一緒に同時培養した。 同時培養時間後、1.5mlのアグロ-タバコ懸濁混合物を、上記の11セットのプレートにプレートした。 実験を13通りの処理：LS-BY2C+ジクロルプロップ培地（2,4-Dなし）の対照、およびLS-BY2C+ジクロルプロップ+2.4-D（1、2、3、5、8、10、12、15、18、20mg/L）；LSBY2C+1mg/L 2,4-D+B10（ビアロフォス（Bialophos））；LSBY2C+10 2,4-D+B10+R-ジクロルプロップで反復した。 再度、処理あたり4つの複製、ならびに陽性および陰性対照が存在した。 すべての培地は、選択培地中のアグロバクテリウム増殖を含めるよう制御するために、500mg/L カルベニシリン（C）を含む。

これらの実験において使用したプラスミドはpDAB724であり、これは同様にPAT選択マーカーを有する。 従って、対照形質転換実験は、上記の標準的なプロトコールに従って、10mg/L ビアロフォスの存在下で、R-ジクロルプロップに慣れたPHLを使用して開始した。 処理は、これらの懸濁物中でのビアロフォス選択が正常であるか否かを見るために、4つの複製を用いて並列して行った。

試験した2,4Dの10mg/Lより上のすべての選択濃度では増殖がほとんど観察されなかった；しかし、いくつかの迅速に増殖しているコロニーは、2、5、および8mg/L 2,4-D濃度で見い出され、典型的な試料は、10mg/L選択で新鮮な選択に移し、カルスをまとめた。 また、いくつかの推定のコロニーは、12、15、18、および20mg/L 2,4-Dから選択されたが、10mg/Lと比較したときに、これらの選択プレート中ではわずかなコロニーのみが存在した。 ビアロフォス選択を用いて実施した対照処理は、通常のコロニー発生を示した。 10mg/L 2,4-Dは致死濃度以下であるらしく、この濃度より上の2,4-Dは非形質転換細胞に対して致死的であるらしい。 すべての同定したコロニーは、10mg/L選択で新鮮な培地に移し、実施例10に記載されるように、PCRによって導入遺伝子の存在について探索した。 選択し、まとめたコロニーは、PCR、およびウエスタン分析によって（実施例10において記載されるように）確立されるような遺伝子の発現によって決定されるように、導入遺伝子を有した。 いくつかのコロニーは、活性に増殖していると同定され、10mg/L 2,4-Dを有する新鮮な選択培地に移し、カルスをまとめた。

次いで、まとめたカルスは、より高いレベルの2,4-Dに移し、インビトロで耐性レベルを試験した。 使用した2,4-Dのレベルは、20、40、60、80、100、および120mg/L 2,4-Dであった。 しかし、カルスは、20mg/L 2,4-D濃度より上では増殖せず、20mg/Lより高い閾値濃度が存在し得ることを示した。

24.2.1-ワタ移植物-オーキシン代替物
用量応答研究は、ワタにおける生長調節因子としての2,4-Dの使用の代用品として複数のオーキシン代替物を試験するために開始した。 試験した代替オーキシンは、2,4-ジクロルプロップ、ジカンバ、およびピクロラムであった。 これらの化合物は、それぞれ、0.2、2.0、および20.0μM濃度で試験した。 2,4-Dは、0.02μM濃度の対照処理として使用した。 使用した培地は、ワタカルス誘導のための基礎培地である（実施例12）。 培養の初期相を超えると、オーキシンは、組織を再生プロセスに向けて促すために培地から除去する。

R-ジクロルプロップは、試験した最低濃度（0.02μM）では、子葉セグメントのカルス誘導において有効ではなく、ワタ細胞に対して毒性であるように見える。 ジカンバは、試験したすべての濃度（0.02〜20μM）においてカルス増殖を誘導し、この濃度範囲においては見かけの毒性効果を有さなかった。 ピクロラムを用いるカルス誘導は、移植片が0.2μM〜20μMで処理されたときに最大まで増加した。 カルスの品質は、2μMピクロラム濃度において、標準的な2,4-D処理と一致していた。 最高濃度（20μM）において、2,4-Dは、ワタカルス生成および増殖に対してもまた阻害的であった。

ワタは、培養中で、代替オーキシン（2,4-Dに対する）に効果的に応答する初期の能力を示した。 十分に高い濃度においては、2,4-Dは、ワタ子葉移植片に対して毒性である。 R-ジクロルプロップは、驚くべきことに、2,4-Dまたは他のオーキシンよりも、ワタに対して有意により毒性である。 2,4-Dは、選択剤として、および選択マーカー遺伝子としてAAD-12（v1）と組み合わせて使用してもよい。 他の代謝できないオーキシン代用物（例えば、ジカンバ、ピクロラム、R-メコプロップ、NAA、またはIAA）は、選択剤として2,4-Dを有する双子葉植物において、選択マーカーとしてのAAD-12の使用を可能にする。

参照

本発明のAAD-12酵素によって触媒される一般的な化学反応を図示する。

例示されるAAD-12タンパク質、TfdA、AAD-2、AAD-1、およびTauDのアミノ酸配列アラインメントである。

2,4-Dおよびジクロロプロップのエナンチオマーに対するAAD-12（v2）の活性を図示する。

配列の簡単な説明
SEQ ID NO:1は、デルフティア アシドボランス（Delftia acidovorans）からのAAD-12のヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO:2は、SEQ ID NO:1によってコードされている翻訳したタンパク質配列である。
SEQ ID NO:3は、植物に最適化されたAAD-12（v1）のヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO:4は、SEQ ID NO:3によってコードされている翻訳したタンパク質配列である。
SEQ ID NO:5は、大腸菌に最適化されたAAD-12（v2）のヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO:6は、M13フォワードプライマーの配列である。
SEQ ID NO:7は、M13リバースプライマーの配列である。
SEQ ID NO:8は、フォワードAAD-12（v1）PTUプライマーの配列である。
SEQ ID NO:9は、リバースAAD-12（v1）PTUプライマーの配列である。
SEQ ID NO:10は、フォワードAAD-12（v1）コーディングPCRプライマーの配列である。
SEQ ID NO:11は、リバースAAD-12（v1）コーディングPCRプライマーの配列である。
SEQ ID NO:12は、「sdpacodF」AAD-12（v1）プライマーの配列を示す。
SEQ ID NO:13は、「sdpacodR」AAD-12（v1）プライマーの配列を示す。
SEQ ID NO:14は、「BrandyのNcoI」プライマーの配列を示す。
SEQ ID NO:15は、「BrandyのSacI」プライマーの配列を示す。