세포투과성 수송도메인 융합단백질과 그 용도

세포투과성 수송도메인 융합단백질과 그 용도{Cell-transducing transport domain fusion protein and use thereof}

본 발명은 수송도메인 융합단백질에 관한 것으로서, 좀더 자세히는 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성된 수송 도메인이 공유결합된 세포투과성 수송도메인을 세포 또는 핵 내로 운반시키고자 하는 이형 단백질과 공유결합시킨 형태의 융합단백질을 화학적 방법으로 또는 유전자 차원에서 제조하여 세포 또는 핵 내로 도입시키는 방법에 관한 것이다.

최근, PEP-1 펩타이드가 Tat 단백질처럼 이형 단백질을 자연상태 그대로 세포 내로 이동시키는데 운반체로서 이용될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 아직까지 PEP-1 펩타이드를 이용한 실험은 거의 전무한 실정이다. 따라서, 본 발명자들은 이러한 PEP-1 펩타이드가 생체 방어기전에 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려진 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈(Superoxide dismutase;SOD)와 카탈라제 (catalase; CAT)를 세포 내로 운반시킬 수 있는지, 운반된 PEP-SOD와 PEP-CAT가 세포 내에서 단백질의 기능을 나타내는지를 알아보고자 연구를 수행하였다.

최근 다양한 인체의 질환이 세포 단백질의 비정상적 활성에 기인한다는 사실이 알려짐에 따라 이들 단백질의 활성을 조절함으로써 치명적인 인체질환을 치료할수 있는 약제의 개발이 전세계적으로 관심의 대상이 되고 있다. 또한 생체질환의 치료제 개발은 세포내 특정 생리활성을 매우 특이적으로 조절할 수 있는 효소 및 단백질-단백질 상호작용의 구조에 기초하여 펩타이드성 혹은 단백질 형태의 조절 물질이 빠르게 개발되고 있다. 그러나 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질은 다른 화합물에 비하여 특정 생리작용에 대한 선택성 및 효능성이 탁월함에도 불구하고 그 크기나 여러 생화학적 성질로 인하여 세포막을 통과하기가 매우 힘들어 세포 내부로 직접 전달될 수 없는 약점 때문에 효과적인 치료제 및 기초 연구 수단으로서의 실용화가 현실적으로 어려운 실정이다. 일반적으로 분자량 600 이상의 물질은 세포막을 통과하기가 거의 불가능한 것으로 알려져 있다(Schwartze et al., 1999; Van de Waterbeemd et al., 1998).

단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드를 세포내로 전달하기 위하여 많은 방법이 시도되어 왔다. 이들 방법에는 다음과 같은 방법이 포함된다. 물리적인 처리 방법 (즉, 마이크로인젝션(microinjection), 스크레이프 로딩(scrape loading), 전기천공(electroporation)과 바이오리스틱(biolistics)), 화학적이나 생물학적으로 세포에 포어(pore)를 형성시키는 방법 (디지토닌(digitonin), 포어 형성 단백질(pore-forming proteins)과 ATP 처리), 변형된 단백질이나 단백질 운반체(carriers)를 이용한 방법(지방이 결합된 단백질(lipidated proteins)과 이뮤노톡신 및 관련 바이오콘쥬게이트(immunotoxins/related bioconjugates)) 그리고 입자 흡입이나 융합 방법(리포조옴(liposomes), 세포-세포 융합(cell-cell fusion), 바이러스 유사체(virus mimics)와 유도된 피노사이토시스(induced pinocytosis)) 등이 포함된다(Fernandez and Bayley, 1998). 위에서 언급한 방법들은 다음의 문제점들이 있다. 예를 들어 마이크로인젝션(microinjection)은 하나의 세포나 소수의 세포를 연구할 때에만 효율적이고, 이뮤노톡신(immunotoxins)은 보통 단백질을 높은 농도로 세포에 전달하지 못할 뿐만 아니라, 치명적인 활성을 가진 단백질이 이용될 때 목표세포를 죽이기도 한다. 또한 이 방법들은 단백질의 세포내 전달 효율, 세포의 손상 여부, 목표 단백질의 도달 여부, 재현성의 여부 등의 문제점을 안고 있다.

또한, 유전자 치료는 유전자의 운반방법이 용이하지 않고, 표적세포에서의 발현이 낮고, 세포에서 단백질이 발현되는 기간이 짧고, 표적세포에서 발현되는 단백질의 양을 인위적으로 조절하기가 매우 어려운 점 등 여러 문제점을 갖고 있다(Verma, IM and Somia, N. (1997) Nature 389, 239-242).

사람 면역결핍 바이러스 단백질의 일종인 Tat 단백질의 형질도입 부위 (PTD; protein transduction domain)의 특성으로 효율적으로 세포막을 통과하는 것이 밝혀지면서, 최근 많은 이형단백질을 Tat 단백질과 융합시켜 세포 내로 운반되는 것을 보여주었다(Fawell, S. et al.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 664-668., Schwartze,SR et al.(1999) Science. 285, 1569-1572, Watson, K. and Edward, RJ(1999) Biochem. Pharmacol. 58, 1521-1528). 또한, 본 연구실에서도 Tat 단백질과 융합시킨 구리,아연-슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈와 카탈레이즈가 생물학적인 활성을 지니며 효율적으로 세포 내로 운반되는 것을 보여주었다(Kwon, HYet al. (2000) FEBS Letter. 485, 163-167, Eum, WS et al.(2002) Mol.Cells. 13, 334-340, Jin, LH et al.(2001) Free Radic. Biol. Med. 31, 1509-1519).

그러나, Tat-융합단백질은 자연상태에서는 세포 내로 운반이 되지 않고, 변성상태에서 세포 내로 운반된 다음 세포 내에서 단백질의 재폴딩(refolding)이 일어나 활성을 갖는 것으로 이해되고 있다. 따라서, 이러한 Tat 융합단백질의 안정성 및 세포 내에서의 지속성이 자연상태보다는 효율적으로 나타나지 않는 것으로 사료된다(Schwartze, SR et al. (2000) trends in CELL BIOLOGY. 10, 290-295).

최근, 단백질의 운반 방법 중 하나로 Tat 단백질보다 더욱 효과적인 방법인 PEP-1 펩타이드를 이용하여 자연상태의 이형단백질을 세포 내로 운반하는 방법이 밝혀졌다(Morris, MC et al.(2001) Nat. Biotech. 19, 1173-1176). PEP-1 펩타이드는 21개의 아미노산(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV)(서열번호 1)으로 이루어졌고, 3개의 도메인 (hydrophobic, spacer, hydrophilic domain)을 갖고 있다. 지금까지, PEP-1 펩타이드를 이용한 연구에서는 PEP-1 펩타이드와 외부 단백질을 공유결합시키지 않고 동시에 세포에 투여하였을 경우 자연상태로 단백질을 세포 내로 운반할 수 있다는 것만 밝혀졌다. 또한, PEP-1 펩타이드는 Tat 단백질에 비해 단백질 치료제로서의 여러 가지 장점 즉, 매우 효율적으로 단백질을 세포 내로 투과시키고, 생리학적인 완충액에서 안정하며, 독성이 결여되어 있으며, 혈청에 대한 민감성이 결여되어 있다는 등의 장점을 가지고 있다. 그러나, PEP-1 펩타이드는 외부 단백질 예컨대 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP) 베타 갈락토시데이즈(β-galactosidase, β-Gal) 등과 일정한 비율(대략 PEP-1과 단백질≒30:1)로 맞추어투여해야만 세포 내에 효과적으로 단백질이 운반되므로 고가의 PEP-1 펩타이드를 과량 가해주어야 하는 단점이 있었다.

따라서, 본 발명에서는 단백질을 세포 내로 도입시키는 데 있어서 상기 문제점들을 해결하려는 것으로서, 단백질을 변성상태가 아닌 자연상태로 세포 내로 효율적으로 도입하려는 것을 그 목표로 한다.

또한, 본 발명은 PEP-1 펩타이드 등의 친수성 도메인, 스페이서, 비친수성 도메인으로 이루어진 15∼30 아미노산 잔기로 구성된 수송 도메인을 과량 가하지 않고도 효율적으로 단백질을 세포 내로 투과시킬 수 있도록 하는 것을 그 목표로 한다.

도 1은 PEP-SOD 발현벡터 (pPEP-SOD)의 개략도이다. 합성한 PEP 펩타이드 올리고머를 pET-15b 벡터의 제한효소 NdeⅠ, Xho Ⅰ 절단부위에 삽입하고, 사람 Cu,Zn-SOD cDNA를 pET-15b 벡터의 제한효소 Xho Ⅰ, BamH Ⅰ 절단부위에 삽입한다. 벡터의 발현은 T7 프로모터와 lacO-오퍼레이터의 조절 하에 있으며 배지에 IPTG를 최종농도가 0.5 mM되게 첨가함으로써 발현을 유도한다.

도 2는 대장균( E. Coli )에서 PEP-SOD의 발현과 정제를 웨스턴블랏팅한 결과이다. 대장균세포에서 PEP-SOD를 과대발현시킨 것과 정제한 융합단백질을 15% SDS-PAGE(A)와 사람 Cu,Zn-SOD 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅(Western blotting)으로 분석하였다(B).

A와 B의 레인(lane) 1: pET 벡터만 들어있는 세포의 파쇄액,

레인 2: PEP-SOD 벡터가 들어있는 세포의 파쇄액,

레인 3: 정제한 PEP-SOD.

도 3은 PEP-SOD의 HeLa 세포 내로의 투과 정도를 나타내는 웨스턴블랏팅 결과이다 .

A: 0.5∼3μM PEP-SOD를 1시간동안 배지에 투여했을 때,

B: 3μM PEP-SOD를 10분∼1시간동안 배지에 투여했을 때 세포 내로 투과된 단백질의 양.

도 4는 PEP-SOD를 HeLa 세포에 투여했을 때 세포 내의 SOD 활성도 변화를 나타낸 그래프이다 . SOD 활성은 5번 측정하여 평균치로 나타내었다.

A: 0.5∼3μM PEP-SOD를 1시간 동안 배지에 투여했을 때,

B: 3μM PEP-SOD를 10분∼1시간동안 배지에 투여했을 때.

도 5는 HeLa 세포 내로 투과된 PEP-SOD를 형광면역염색한 결과이다. HeLa 세포 내로 PEP-SOD를 투과시킨 후, HeLa 세포를 고정하고 SOD 항체와 Cy3-결합된 2차 항체로 염색하였다.

도 6은 HeLa 세포 내로 투과된 PEP-SOD의 양과 활성도를 나타낸 사진이다. 3μM PEP-SOD를 HeLa 세포 내로 투과시킨 후, 투과된 단백질의 양과 활성을 1∼60시간까지 웨스턴 블랏팅과 SOD 활성측정으로 분석하였다.

도 7은 마우스 피부조직으로 투과된 PEP-SOD을 면역조직염색한 사진이다. PEP-SOD를 마우스의 피부에 1시간 바른 후 피부 조직으로 투과된 SOD는 래빗 안티-마우스 히스티딘 항체(rabbit anti-mouse histidine antibody)와 바이오틴 결합된 래빗 안티-마우스 IgG 항체(biotinylated rabbit anti-mouse IgG antibody)를 이용하여 염색하였다. 피부 조직으로 투과된 SOD 활성을 분석하였다.

도 8은 마우스 각 장기별로 투과 된 PEP-SOD를 면역조직염색한 결과이다. PEP-SOD를 마우스에 복강주사하고 4∼8시간 후, 각 장기별로 투과된 SOD를 래빗 안티-마우스 히스티딘 항체(rabbit anti-mouse histidine antibody)와 바이오틴 결합된 래빗 안티-마우스 IgG 항체(biotinylated rabbit anti-mouse IgG antibody)를 이용하여 염색하였다.

도 9는 마우스의 각 장기별로 투과된 PEP-SOD의 활성도 변화를 나타낸 것이다. PEP-SOD를 마우스에 복강주사하고 4∼8시간 후, 각 장기별로 투과된 SOD의 활성을 측정하였다.

도 10은 PEP-SOD 융합단백질을 제조하기 위한 올리고뉴클레오타이드 서열(서열번호 8)이다.

도 11은 PEP-CAT 발현벡터 (pPEP-CAT)의 개략도이다.

도 12는 대장균( E. Coli )에서 PEP-CAT의 발현과 정제를 웨스턴블랏팅한 결과이다.

도 13은 PEP-CAT의 HeLa 세포 내로의 투과 정도를 나타내는 웨스턴블랏팅 결과이다 .

도 14는 PEP-CAT를 HeLa 세포에 투여했을 때 세포 내의 CAT 활성도 변화를 나타낸 그래프이다 . CAT 활성은 5번 측정하여 평균치로 나타내었다.

도 15는 HeLa 세포 내로 투과된 PEP-CAT를 형광면역염색한 결과이다.

도 16은 HeLa 세포 내로 투과된 PEP-CAT의 양과 활성도를 나타낸 사진과 그래프이다.

도 17은 마우스 피부조직으로 투과된 PEP-CAT을 면역조직염색한 사진이다.

도 18은 PEP-CAT 융합단백질을 제조하기 위한 올리고뉴클레오타이드 서열(서열번호 10)이다.

상기 목표를 달성하기 위하여 본 발명자들은 자연상태의 단백질을 세포 내로 운반하는 PEP-1 펩타이드를 외부단백질인 사람 구리,아연-슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈와 카탈레이즈에 융합시켰고, 융합단백질을 대장균에서 과대발현시켰으며, 금속 킬레이팅 친화 크로마토그래피(metal-chelating affinity chromatography)로 쉽고 편리하게 정제하였다. 또한, 정제된 융합단백질이 효과적으로 생물학적인 활성을 지니고 세포 내로 운반되는 것을 배양된 HeLa 세포 및 동물실험을 통하여 확인하였다. 그리고, PEP-1 융합단백질이 Tat 융합단백질에 비해 더욱 효과적으로 세포 내로 운반되며 생물학적인 활성이 높다는 것을 세계 최초로 밝혀냈다. 또한, PEP-1 융합단백질의 제조 및 세포 내 투과에 대한 연구는 본 실험실에서 세계 최초로 규명한 것이다.

본 연구를 하기 위해 먼저, PEP-SOD, CAT 융합단백질을 과대발현 시키고 쉽게 정제할 수 있는 PEP-SOD, CAT 발현벡터를 개발하였다. 이 발현벡터는 인간 Cu,Zn-SOD cDNA 또는 catalse cDNA, PEP 펩타이드 (21 아미노산) 그리고 6개의 histidine이 연속적으로 연결되어 있다. 이 발현벡터를 이용하여 PEP-SOD, CAT 융합단백질을 대장균에서 과대발현 시켜 자연상태로 Ni2+-affininty column을 이용하여 정제하였다. PEP-SOD, CAT의 과대발현은 상당히 높게 나타났으며, 이런 결과로 정제된 단백질의 양도 높게 나타났다. Western blot으로 배양된 HeLa 세포에 정제된 PEP-SOD, CAT 융합단백질이 농도 및 시간 의존적으로 세포에 운반되는 것을 확인하였다. SOD, CAT 활성 또한, 농도 및 시간 의존적으로 증가됨을 관찰하였다. 세포 내로 투과된 PEP-SOD, CAT는 최소 세포 내에서 48시간 이상 60시간까지 활성을 가지고 지속적으로 유지되었다. 배양된 세포뿐 아니라, 마우스의 피부조직에도 PEP-SOD, CAT는 투과되었고 피부에서의 SOD, CAT 활성 역시 크게 증가되었다. 또한, 마우스에 복강주사한 PEP-SOD, CAT는 각 장기별로 고루 분포되며 투과가 일어나며 단백질의 활성을 유지하고 있었다.

이러한 결과는 PEP-SOD, CAT가 자연상태 그대로 세포 내로 투과가 잘 일어나고, 세포내 SOD, CAT 활성도 유의성 있게 증가시켰다. 따라서, 이러한 PEP-SOD 융합단백질이 효과적으로 세포 내로의 운반 기술 연구 및 SOD, CAT와 관련된 것으로 알려진 100 여종의 질환 치료 분야에 다양하게 응용될 가능성을 제시해 준다.

PEP-1 융합단백질을 포함하여 수송도메인 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 경구 또는 주사형태로 제형할 수 있다. 경구용 조성물로는, 예를 들면 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분 이외에도 희석제(예: 락토스, 텍스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제(예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고, 정제는 또한 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀루로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제(예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 항미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.

이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥내, 피하, 복강내 투여 또는 국소적용할 수 있으며, 용량은 일일 투여량이 0.001~100㎎/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

또한, 본 발명의 수송도메인 융합 단백질을 주요성분으로 하는 화장료 조성물은 크림, 연고, 젤, 로션, 화장수 등으로 제형화되어 사용될 수 있으며, 어떤 제형으로 제조하여 사용하는가는 본 발명의 속하는 기술분야의 당업자에 의해 극히 용이하게 결정될 수 있다.

또한, 본 발명의 PEP-SOD 등의 수송도메인 융합단백질을 유효성분으로 하는 로션, 젤, 에센스, 크림, 화장수 등은 각각 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있으며, 기초 화장품 등에 편리하게 첨가하여 피부노화방지, 개선제 등의 용도로서 사용될 수 있다.

일례로서 크림을 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수형(W/O)의 크림 베이스에 본 발명의 PEP-SOD 융합단백질을 함유시키고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다.

본 발명자들은 수송도메인 융합 단백질의 일례로서 PEP-SOD 융합 단백질을 마우스의 피부에 침투실험한 결과 표피, 진피, 피하지방층까지 원활하게 침투하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 수송도메인 융합 단백질을 약제 조성물 및/또는 화장료 조성물의 주요성분으로 이용할 수 있음을 밝혔다.

본 발명은 표적 세포 또는 세포 핵에 침투가 용이하지 않거나 또는 본래 유용한 속도로 표적 세포에 투입할 수 없는 생물학적으로 활성인 단백질, 펩타이드및 기타 분자를 세포 내 또는 세포핵 내로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 목표단백질 분자의 세포내 전달은 세포 또는 핵 내로 투과할 수 없는 목표단백질에 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성된 수송 도메인이 공유결합된 세포투과성 수송도메인이 공유결합된 형태의 융합단백질을 구성하여 수행된다. 본 발명의 상기 수송도메인의 일례로는 21개의 아미노산으로 구성되고, 서열번호 1과 같은 아미노산 서열로 이루어진 PEP-1 펩타이드를 들 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 PEP-1 융합단백질을 포함하는 수송도메인 융합단백질, 이 융합단백질을 제조하기 위한 재조합 뉴클레오타이드와 벡터, 융합단백질의 세포내 도입방법 및 융합단백질을 포함하는 치료, 예방 및 진단목적의 약학 조성물, 화장료 조성물 등에 관한 것이다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

"화물 분자"란 본래 표적 세포로 들어갈 수 없거나, 본래 유용한 속도로 표적 세포로 들어갈 수 없는, 수송 도메인 또는 이의 단편이 아닌 분자로서, 수송 도메인과 융합되기 전의 분자 그 자체이거나 수송 도메인-화물 분자 복합체의 화물 분자 부분을 의미한다. 화물 분자로서는 폴리펩티드, 단백질, 펩타이드, 기타 유기화합물 등을 포함한다. 본 발명의 용도 또는 응용에 있어서 "화물 분자"는 예컨대 약물 또는 수용체 등을 의미할 수 있다. 본 명세서에서 "화물 분자"는 "목표 단백질" 등과 동일, 유사한 의미로 사용되었다.

"PEP-1 융합단백질"이란 수송 도메인 및 1개 이상의 화물 분자 부분을 포함하며, 수송 도메인과 화물 분자의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 복합체를 의미한다.

또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.

또한, "표적 세포"란 수송 도메인에 의해 화물 분자가 전달되는 세포를 의미하는 것으로서 표적 세포는 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적 세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물 세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다.

본 명세서의 "수송 도메인"은 고분자 유기화합물, 예컨대 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 단백질, 올리고당 또는 다당류 등과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 유기화합물들을 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 말한다.

본 명세서의 "화물 단백질" 또는 "목표 단백질"은 PEP-1 수송 도메인과 공유결합을 이루어 세포 내로 도입되어 활성을 나타내는 치료 분자, 예방 분자 또는 진단 분자 등을 의미하며, 실제로는 순수한 단백질에만 한정되는 것이 아니라, 펩타이드, 폴리펩타이드, 당류와 결합된 당단백질, 펩티도글리칸 등을 통칭하는 표현으로 사용한다.

또한, 본 명세서에서는 단백질, 펩타이드, 유기화합물을 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.

본 발명은 세포 내에서 기능할 수 있는 다양한 고분자 및 저분자 유기화합물들을 포함하는 화물 분자를 표적세포 내로 운반하고 세포 내에서 활성을 가지도록 하기 위하여 PEP-1 펩타이드를 포함하는 수송 도메인 및 이를 포함하는 벡터, 이 벡터를 이용하여 생산한 수송도메인 융합단백질, 이를 세포 내로 도입시키는 방법 및 그 용도를 제공한다.

이하 발명의 상세한 설명에서는 화물 분자로서 임의의 "단백질"로서 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스와 카탈라제를 선택하여 세포 내로 투과되는 PEP 융합단백질 등에 관하여 설명한다. 그러나, 이것은 발명의 설명의 편의를 위한 것일 뿐 목표단백질이 상기 2종의 효소에만 한정되는 것은 아니며, 수송 도메인 또한 PEP-1 펩타이드에만 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 세포 또는 핵 내로 투과할 수 없는 목표단백질에 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인, 라이신을 다수 포함하는 친수성 도메인 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서로 구성된 수송 도메인이 공유결합된 세포투과성 수송도메인 융합단백질에 관한 것이다.

본 발명은 상기 수송도메인으로서 특히 21개의 아미노산으로 구성되고, 서열번호 1과 같은 아미노산 서열을 가진 PEP-1 펩타이드로 된 세포투과성 PEP-1 융합단백질에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 불투과성 목표단백질의 카복시 말단과 아미노 말단의 일측 또는 양측에 PEP-1 펩타이드 등의 수송도메인이 공유결합된 것을 특징으로 하는 세포투과성 수송도메인 융합단백질에 관한 것이다. 본 발명에 있어서 상기 목표단백질은 치료분자, 예방분자, 진단분자로 구성된 그룹에서 선택된 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서 상기 목표단백질은 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스, 카탈라제 또는 이들 단백질과 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 가지는 단백질인 것을 특징으로 한다. 이때 아미노산 서열에 있어서, '기능적으로 동등한' 이란 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스, 카탈라제 단백질의 아미노산 서열 중에서 Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; 및, Phe, Tyr 과 같은 조합으로 치환된 모든 단백질을 의미한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스, 그와 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 가지는 단백질, 카탈라제 또는 그와 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 가지는 단백질과 같은 목표단백질에 PEP-1 펩타이드 등의 수송도메인이 공유결합된 세포투과성 수송도메인 융합단백질을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

또한, 상기 화장료 조성물은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 수중유(O/W)형 또는 유중수(W/O)형인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스, 그와 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 가지는 단백질, 카탈라제 또는 그와 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 가지는 단백질과 같은 목표단백질에 PEP-1 펩타이드 등의 수송도메인이 공유결합된 세포투과성 수송도메인 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

뿐만 아니라, 본 발명은 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스 또는 카탈라제 등의 목표단백질 또는 그의 유도체 cDNA에 수송도메인 코딩 DNA 서열이 결합되어 상기 세포투과성 수송도메인 융합단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 제8번, 제10번 또는 그의 기능적 등가물을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 염기서열에 있어서 "기능적 등가물(functional equivalent)"이라 함은 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이스, 카탈라제 유전자의 염기 서열 중에서 전기 조합의 아미노산을 제공할 수 있는 염기 서열을 가지는 모든 유전자를 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 세포투과성 수송도메인 융합 단백질을 발현시키기 위하여 상기 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는, 세포투과성 수송도메인 융합 단백질을 발현시키는 벡터에 관한 것이다. 발현벡터로는 도 1 또는 도 11의 제한지도를 예로 들 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 세포투과성 수송도메인 융합 단백질을 발현시키는 벡터를 미생물에서 발현시키는 단계; 발현된 세포투과성 PEP-1 융합 단백질을 정제하는 단계; 정제된 세포투과성 PEP-1 융합 단백질을 세포에 가하는 단계;로 구성되는 세포투과성 PEP-1 융합 단백질을 인간세포 이외의 세포 내로 도입시키는 방법에 관한 것이다.

1. 재조합 수송도메인 융합단백질의 과대발현 및 정제

수송도메인 융합단백질의 일례로서 PEP-SOD 융합단백질을 과대발현시키기 위해 사람 Cu,Zn-SOD cDNA, PEP 펩타이드(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV; 21 아미노산)(서열번호 1) 및 6개의 히스티딘이 연속적으로 포함되어 있는 PEP-SOD 발현 벡터를 개발하였다(도 1).

IPTG로 융합단백질의 과대발현을 유도한 대장균( E. Coli ) 세포를 4℃에서 초음파 분쇄기로 파쇄한 다음 원심분리하여 상층액의 단백질을 15% SDS-PAGE로 분리하였다. 도 2는 PEP-SOD의 과대발현과 정제된 단백질을 Coomassie brilliant blue로 염색한 단백질 띠(도 2A)와 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다(도 2B). 도 2A의 레인 2는 0.5 mM IPTG를 처리하여 과대발현된 융합단백질을 나타내고 있으며, 대조군인 레인 1(pET-15b 벡터)과 비교하여 매우 높은 농도의 융합단백질이 과대발현 되었음을 잘 보여주고 있다. 대장균에서 SOD가 발현된 양은 전체 대장균 단백질의 40% 이상으로 나타났다. 다른 연구자들은 재조합 SOD 단백질을 대장균에서 5-10% 과대발현시킨 것에 비해(Hallewell, RA et al.(1985) Nucleic Acid Res. 13, 2017 , Hartman, JR, et al.(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 7147), 본 연구진에 의한 PEP-SOD 융합단백질의 과대발현이 월등히 높은 것을 확인하였다.

PEP-SOD 융합단백질은 N-말단에 6개의 히스티딘을 포함하고 있기 때문에 고정 금속-킬레이트 친화 크로마토그래피(immobilized metal-chelate affinity chromatography) 단일 단계로 융합단백질을 자연상태로 순수하게 (순도 95% 이상) 정제하였다(도 2A). 그림의 레인 3은 정제된 PEP-SOD 융합단백질을 Coomassie brilliant blue로 염색하여 확인한 결과이다. 자연상태로 정제된 PEP-SOD 융합단백질의 양은 100mg/l 이상으로 나타났다. 이는 변성상태로 정제된 Tat-SOD의 양에 비해서 2-3배 이상 많았다. 이런 결과는 PEP-SOD의 과대발현이 Tat-SOD보다 높기 때문인 것으로 사료된다.

과대발현 및 정제된 PEP-SOD 융합단백질을 웨스턴 블랏 분석으로 다시 한번 확인하였다. 도 2B에 나타낸 바와 같이 SOD 항체에 반응하는 PEP-SOD 띠는 도 2A의 단백질 띠와 동일한 위치에서 관찰되었다.

이와 동일한 방법으로 PEP-CAT의 발현벡터를 제조하였고(도 11), 대장균에서 PEP-CAT의 과대발현을 유도하였다. PEP-CAT도 PEP-SOD처럼 과대발현이 30% 이상으로 잘 나타났으며, 순수하게 정제하였다. 과대발현 및 정제된 PEP-CAT 융합단백질을 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다(도 12).

2. HeLa 세포에서 재조합 수송도메인 융합단백질의 투과 및 활성

자연상태에서 정제한 PEP-SOD 융합단백질의 HeLa 세포 내 투과가 시간 및 농도에 따라 어떻게 변화되는지를 관찰하였다. 도 3에 나타낸 것처럼 자연상태의 PEP-SOD는 시간 및 농도 의존적으로 HeLa 세포 내로 투과되는 것을 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다. 도 3A는 0.5∼5μM PEP-SOD를 1시간동안 세포배양액 내에 처리하였을 때, 도 3B는 3μM PEP-SOD를 10분∼1시간 동안 세포배양액 내에 처리하였을 때의 결과이다. 자연상태의 PEP-SOD의 세포 내 투과 정도를 농도별로 관찰했을 때, 농도 의존적으로 세포 내로 투과된 PEP-SOD의 양이 증가되는 것을 확인하였다. 또한, 시간별로 관찰하였을 경우 투여 10분 이내에 투과된 융합단백질을 확인할 수 있었고, 처리 시간에 비례하여 세포 내로 투과된 PEP-SOD의 양이 증가됨을 확인하였다. 이러한 결과는 변성상태로 정제한 Tat-SOD가 시간 및 농도 의존적으로 세포 내 투과가 일어나는 것과 비슷하였다.

세포 내로 투과된 융합단백질은 그 고유한 활성을 유지해야만 이를 단백질 치료(protein therapy)에 응용할 수 있다. 따라서, 세포 내로 투과된 융합단백질이 어느 정도 생물학적인 활성을 지니는지는 매우 중요한 문제이다. 그리하여, PEP-SOD 융합단백질을 HeLa 세포 투과 이후 세포질 내에서 SOD 활성을 관찰하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이 자연상태인 PEP-SOD를 처리한 HeLa 세포 내의 SOD 활성은 농도 및 시간 의존적으로 증가되었다. 이러한 PEP-SOD의 활성은 변성상태인 Tat-SOD의 세포 투과 후 활성을 비교했을 경우, Tat-SOD보다 3-4배 높은 것으로 나타났다. 이는 자연상태인 PEP-SOD가 세포 내로 투과된 후 바로 활성을 유지하고 있음을 알 수 있었다. 그러나, Tat-SOD는 세포 내로 투과 된 후 재폴딩(refolding)이 일어나난 후 활성을 나타내므로 세포 내에서 활성이 농도 및 시간에 따른 PEP-SOD보다 떨어지는 것으로 사료된다. 따라서, PEP-SOD는 Tat-SOD보다 세포 내로의 투과는 비슷하게 일어나지만 활성도는 유의성 있게 높게 증가되는 것을 알 수 있었다.

또한, 세포 내로 투과된 PEP-SOD 융합단백질을 형광면역염색으로 다시 한번 확인하였다. 3μM의 PEP-SOD를 1시간 동안 세포배양액 내에 처리하였을 때에 융합단백질이 세포 내 모든 영역으로 투과됨을 형광면역염색법을 이용한 형광 현미경으로 확인할 수 있었다(도 5). 그러나, 대조 단백질로 사용한 SOD를 투여하였을 때에는 세포 내의 형광을 확인할 수 없어 SOD 자체만으로는 HeLa 세포의 세포막을 투과하지 못함을 알 수 있었다.

PEP-CAT도 배양된 HeLa 세포에 농도 및 시간 의존적으로 투과되는지, 투과된 후 세포 내에서의 활성도 변화를 확인하였다. PEP-CAT 융합단백질도 HeLa 세포에 농도 및 시간 의존적으로 투과되었고(도 13), 투과 된 세포 내에서의 활성도 유의성 있게 크게 증가되었다(도 14). 이러한 결과로부터 SOD와 CAT 뿐만 아니라 다른 단백질들도 수송도메인 융합단백질의 형태로 세포 내로 투과되어 높은 활성을 나타낼 수 있음을 예상할 수 있다.

3. HeLa 세포로 투과된 PEP-융합단백질의 안정성

HeLa 세포 내로 투과된 PEP-SOD는 상당한 기간 동안 세포 내에서 안정성을 유지해야만 효과적으로 단백질 치료에 응용할 수 있다. 도 6에 나타낸 바와 같이 세포 내로 투과된 PEP-SOD는 시간에 따라 분해되어 단백질의 양이 점차 감소되었으나, 최소 24시간동안 세포 내에서 존재함을 알 수 있었다. SOD 활성 역시 시간에 따라 점차 감소하였으나 투여 24시간 후에도 대조군(4.5 U/mg protein)의 4배 이상(18.25 U/mg protein)의 효소의 활성을 유지하고 있었으며, 60시간에서는 대조군과(5.12 U/mg protein) 비슷한 효소 활성을 유지하고 있었다. 따라서, 세포 내로 투과된 PEP-SOD는 최소 24시간은 안정성을 유지하며, 60시간을 세포 내에서 효소의 활성을 나타내고 있기 때문에 유용하게 단백질치료에 응용할 수 있으리라 사료된다.

PEP-CAT도 같은 방법으로 세포 내에서의 안정성을 확인하였다. PEP-CAT는 세포 내로 투과된 후 48시간 이상 높은 활성을 유지하며 안정성을 유지하고 있었다. 때문에, PEP-SOD와 마찬가지로 PEP-CAT 융합단백질도 단백질치료에 유용하게 응용할 수 있을 것으로 사료된다(도 16).

4. PEP-융합단백질의 마우스 피부로 투과

마우스 피부에도 PEP-SOD가 효과적으로 투과가 일어나는지 알아보기 위해서 면역조직염색을 이용하여 확인하였다. 도 7은 마우스 피부 조직을 염색한 결과로 3 μM PEP-SOD를 1 시간 피부에 발라주고 염색하였을 경우 PEP-SOD가 피부 조직 안으로 투과된 모습을 잘 보여주고 있다. 투과된 PEP-SOD는 피부 조직의 상피세포 및 진피세포까지 PEP-SOD의 투과가 일어나고 있음을 확인하였다. 또한, 피부 투과 후 SOD 활성은 5.92U/mg protein에서 26.18U/mg protein과 46.22U/mg protein으로 시간에 따라 5-10배 이상 크게 증가하였다. 그러나, Tat-SOD의 경우도 마우스 피부 투과 후 시간에 따라 SOD 활성이 24.39 U/mg protein으로 5배 증가하였다. PEP-SOD와 Tat-SOD 모두 피부 조직으로 투과 후 단백질의 활성이 증가하지만, PEP-SOD 융합단백질이 Tat-SOD보다 더욱 빠르게 피부로 투과되며 단백질의 활성을 나타내는것으로 밝혀졌다.

PEP-CAT 융합단백질도 마우스 피부조직으로 투과됨을 관찰하였다. 도 17에서 PEP-CAT가 피부 조직으로 투과되는 정도를 잘 나타내고 있으며, 투과 된 후의 CAT 활성은 32.1 U/mg protein으로 대조군에 비해 15배 이상 증가되었고, Tat-CAT (8.6 U/mg protein)에 비해 4∼5배 이상 높게 나타나 상당한 유의성을 보이며 증가되었다.

이러한 결과로부터 배양된 세포뿐 아니라 동물의 조직으로도 PEP-융합단백질이 투과되고 투과된 후에 단백질의 활성을 높게 유지하고 있음을 알 수 있었다.

5. PEP-융합단백질의 마우스 각 장기별로의 투과

PEP-SOD 융합단백질을 마우스에 복강주사하고 4∼8 시간 후 각 장기(뇌, 간, 심장, 췌장, 비장, 폐, 신장)들을 면역조직염색으로 확인하였다. 도 8은 복강주사로 PEP-SOD 융합단백질이 각 장기별로 고루 분포되며 투과가 일어나고 있음을 알 수 있었다. 도 9는 장기별로 투과된 PEP-SOD 단백질의 활성을 나타내고 있다. 이 결과로 각 장기별로 투과된 PEP-SOD 융합단백질에 의해 각 장기에서의 SOD 활성이 크게 증가되는 것을 확인하였다. 따라서, PEP-SOD 융합단백질은 세포와 피부 그리고 각 장기에 효율적으로 투과가 잘 일어나고, 투과 후에도 SOD 활성을 유지하고 있음을 관찰하였다.

PEP-CAT도 마우스에 복강주사하고 8시간 후 각 장기들을 면역조직염색과 활성을 측정하였다. PEP-CAT도 마우스의 각 장기에 투과가 잘 일어나고 있으며, 카탈레이즈의 활성을 유지하고 있음을 확인하였다.

위의 결과들을 토대로, PEP-SOD와 PEP-CAT는 Tat-SOD, Tat-CAT보다 더욱 높은 활성을 가지고 각 세포 및 피부, 장기에 투과되는 것을 확인하였다. 따라서, PEP-SOD, CAT 융합단백질들은 활성산소종에 의한 각 세포의 손상과 SOD 및 카탈레이즈와 관련된 질환에 대한 단백질 치료제로서의 가능성을 한 층 더 보여주었다.

아래에서는 구체적인 실시예를 통하여 본 발명의 구성을 좀더 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재범위에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 재료

제한효소와 T4 DNA 리가아제(ligase)는 promega (USA)에서 구입하였고, PEP-1 올리고뉴클레오타이드는 Gibco BRL custom primer (USA)에서 합성하였다. IPTG는 Duchefa(Netherland)에서 구입하였다. pET-15b 벡터(vector)와 BL21 (DE3) 플라스미드는 Novagen(USA)에서 구입하였고, Ni ²⁺ -nitrilotriacetic acid sepharose superflow는 Qiagen (Germany)에서 구입하였다. 사람 구리,아연-슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈(Cu,Zn-superoxide dismutase) cDNA는 PCR 방법으로 사람 태반 cDNA library에서 분리하였다(Kang, JH et al.(1997) J. Biochem. Mol. Biol. 30, 60-65). 사람 카탈레이즈의 cDNA는 사람 간 cDNA library에서 분리하였다(Jin, LH et al.(2001) Free Radic. Biol. Med. 31, 1509-1519). 이외의 모든 시약은 특급제품을 이용하였다.

실시예 2. 재조합 PEP-SOD 융합단백질의 발현벡터 제조 및 형질변환

기능을 가진 단백질을 세포 내로 침투시키는 기술을 개발하기 위하여 세포 내로 목표단백질을 전달할 수 있는 융합 단백질 발현벡터를 제조하였고, PEP-1 펩타이드가 단백질을 세포 내로 전달하는 능력을 용이하게 분석하기 위하여 인간 구리,아연-슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈(Cu,Zn-superoxide dismutase; 이하 "SOD"라 약칭함)와 카탈레이스(catalase; 이하 "CAT"라 약칭함) 단백질을 선택하였다.

먼저, PEP-SOD 융합단백질을 생산하기 위해 PEP-1 펩타이드 (KETWWETWWTEWSQPKKKRKV; 21 amino acid)(서열번호 1)가 포함된 pET-PEP 발현벡터를 제조하였다. PEP-1 펩타이드에 해당하는 두 종류의 올리고뉴클레오타이드(윗쪽 사슬(top strand)(서열번호 2), 5'-TATGAAAGAAACCTGGTGGGAAACCTGGTGGACCGAATGGTCTCAGCCGAAAAAAAAACGTAAAGTGC-3'; 아랫쪽 사슬(bottom strand)(서열번호 3), 5'-TCGAGCACTTTACGTTTTTTTTTCGGCTGACACCATTCGGTCCACCAGGTTTCCCACCAGGTTTCTTTCC-3')를 NdeⅠ - XhoⅠ 제한효소로 자른 pET-15b에 결찰(ligation)하여 삽입하였다. 이어, 사람 SOD의 cDNA의 서열을 기본으로 하여 2 종류의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 정방향 프라이머(Forward primer)는 5'-CTCGAGGCGACGAAGGCCGTGTGCGTG-3'(서열번호 4)로 XhoⅠ 제한부위(restiction site)를 지니고 있으며, 역방향 프라이머(reverse primer)는 5'-GGATCCTTATTGGGCGATCCCAATTAC-3'(서열번호 5)로 BamHⅠ 제한부위를 갖고 있다.

중합효소 연쇄반응 (PCR)은 써말 사이클러(thermal cycler; Perkin-Elmer, model 9600)에서 수행하였다. 반응 혼합액을 50 ㎕ 실리콘 튜브에 넣고 94℃에서 5분간 가열하였다. PCR 반응은 94℃에서 40초간 30 cycle의 extension, 54℃에서 1분간 denaturation, 70℃에서 3분간 annealing, 그리고 72℃에서 10분, 20℃에서 5분간 final extension을 유도하였다. PCR 수행 후, 아가로즈 젤 전기이동(agarose gel electrophoresis)으로 반응물을 분리하고 이것을 TA 클로닝 벡터(Invitrogen, Sandiego, USA)에 결찰한 다음, competent cell에 형질변환 시키고 형질변환된 박테리아로부터 플라스미드(plasmid)를 알칼리 용균방법(alkaline lysis method)으로 분리하였다(Sambrook, J., Fritsch, FE, and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning, Cold spring harbor laboratory press, Cold spring harbor). 사람 SOD cDNA가 포함된 TA 벡터를 XhoⅠ 과 BamHⅠ 로 절단한 다음 PEP 발현벡터에 삽입하였다. PEP-SOD로 형질변환된 E. coli BL21 (DE3)를 선택한 다음, 콜로니를 100 ml LB medium에 접종하고 IPTG (0.5 mM)를 배지 내에 첨가하여 재조합된 PEP-SOD의 과대발현을 유도하였다. 과대발현된 PEP-SOD는 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏 분석방법으로 확인하였다.

위와 같은 방법으로, 사람 카탈레이즈의 PEP-CAT 융합단백질의 발현벡터를 제조하였다. 카탈레이즈의 정방향 프라이머는 5'-CTCGAGATGGCTGACAGCCGGGATCCCGCC-3'(서열번호 6), 역방향 프라이머는 5'-GGATCCTCACAGATTTGCCTTCTCCCTTGCC-3'(서열번호 7)으로 XhoⅠ 제한부위와 BamHⅠ 제한부위를 각각 갖고 있다.

실시예 3. 재조합 PEP-융합단백질들의 발현 및 정제

본 연구실에서 제조한 인간 Cu,Zn-슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈와 카탈레이즈 cDNA가 포함되어 있는 E. coli BL21 (DE3) 세포 (PEP-SOD)를 암피실린이 포함된 LB 배지에 넣고 37℃에서 200 rpm으로 교반하며 배양하였다. 배양액 내의 박테리아 농도가 O.D600 = 0.5∼1.0을 나타낼 때 IPTG를 배지 내에 첨가하여 최종농도가 0.5와 1 mM 되게 한 다음 30℃에서 12 시간을 더 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리 하여 모은 뒤 5 ml binding buffer (5 mM imidazole, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9)를 넣고 초음파 분쇄기로 분쇄 (sonication)하였다. 원심분리하여 상층액을 즉시 Ni2+-니트릴로 트리아세틱 액시드 세파로즈 슈퍼 플로우 (Ni ²⁺ -nitrilotriacetic acid sepharose super flow) 컬럼에 부하하고 10배 부피의 결합완충액과 6배 부피의 세척완충액(60 mM imidazole, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9)로 세척한 다음 용출완충액(1 M imidazole, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9)로 융합단백질을 용출하였다. 이어, 융합단백질이 포함된 분획들을 모아 PD-10 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분획 중에 포함된 염분을 제거하였다.

정제된 단백질 농도는 우혈청 알부민을 표준물질로 사용하여 Bradford 방법으로 측정하였다(Bradford, MA (1976) Anal. Biochem. 72, 248-254).

실시예 4. HeLa 세포배양 및 PEP-융합단백질들의 세포 내 투과

HeLa 세포는 37℃에서 95% 공기와 5% CO ₂ 를 공급해주며 20mM HEPES/NaOH(pH 7.4), 5mM NaHCO ₃ , 10% 우태혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 항생제(100㎍/ml streptomycin, 100U/ml penicillin)가 포함된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)에서 배양하였다.

PEP-융합 단백질의 세포 내 투과를 관찰하기 위하여 HeLa 세포를 6-웰 플레이트에서 4∼6시간 동안 키운 뒤 10% FBS가 포함된 신선한 DMEM 배양액으로 교체하고, 재조합 PEP-SOD(3μM)와 PEP-CAT(2μM)를 배양액 내에 처리하였다. 1시간 뒤, 세포를 trypsin-EDTA(Gibco BRL)로 처리하고 인산 완충액 생리식염수(phosphate buffered saline; PBS)로 충분히 세척하였다. 세포를 분쇄한 다음 세포 내로 투과된 SOD의 양과 활성도를 SOD 활성도 분석과 웨스턴 블랏 분석으로 측정하였다.

실시예 5. 웨스턴 블랏 분석

PEP-SOD와 PEP-CAT의 세포 내 투과를 확인하기 위하여 웨스턴 블랏 방법을 수행하였다. 먼저 단백질은 자연상태로 정제하였다. 준비된 HeLa 세포에 PEP-SOD (3μM)와 PEP-CAT(2μM)의 융합단백질을 처리한 다음 1시간 후, 세포들만 모아서 웨스턴 블랏을 수행하였다. 세포 분쇄액 내의 단백질을 15%와 10% SDS 폴리아크릴아마이드 젤(polyacrylamide gel) 전기이동방법으로 분리한 다음 젤에 있는 단백질을 단백질을 니트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane; Amersham, UK)으로 전기이동시켰다. 단백질이 이동된 니트로셀룰로스 멤브레인을 5% 탈지분유(non-dry milk)가 들어 있는 PBS로 블로킹하였다. 이어 멤브레인은 고트 항-SOD 폴리클론 항체(polyclonal antibody; Santacruze, USA, 1:1,000)로 1시간 처리하였다. 세척 후, 호스래디쉬 퍼옥시다아제-결합된 마우스 항-고우트 (mouse anti-goat) IgG 항체(Sigma, 1:10,000 희석)와 1시간 반응시켰다. 최종적으로 ECL kit(ECL; Amersham)을 이용하여 사람 SOD 단항체에 반응하는 단백질 띠를 확인하였다.

같은 방법으로 PEP-CAT은 사람 카탈레이즈에 대한 단항체(hCAT mAb-00)와 호스래디쉬 퍼옥시다아제-결합된 고우트 항-마우스(goat anti-mouse) IgG 항체 (Sigma, 1:10,000 희석)를 이용하여 사람 카탈레이즈 단항체에 반응하는 단백질 띠를 확인하였다.

실시예 6. SOD 효소활성도 측정

SOD의 활성도는 McCord와 Fridovich의 방법 (1969)에 따라 xanthine/xanthine oxidase 반응에 의한 ferricytochrome c 환원의 억제 정도를 분광광도계로 관찰함으로써 측정하였다(McCord, JM and Fridovidh, I. (1969) J. Biol. Chem. 244, 6049-6055).

표준분석방법은 25℃에서 2ml의 0.1 mM EDTA가 포함된 50mM 인산칼륨 완충용액(pH 7.8)에서 수행하였다. 반응혼합액에는 10μM ferricytochrome c, 50μM xanthine 및 충분한 양의 xanthine oxidase를 함유하고 있으며 550nm에서 ferricytochrome c의 환원정도를 측정하였다. 상기의 조건하에서 cytochrome c를 50% 감소시키는 슈퍼옥사이드 디스뮤테이스의 양을 1 unit으로 정의하였다.

실시예 7. 카탈레이즈 효소활성도 측정

CAT의 활성도는 Abei(1980)의 방법에 따라 과산화수소의 분해정도를 240 nm에서 1분간 분광광도계로 관찰함으로써 측정하였다(Abei, H. Methods of enzymatic analysis (Bergmeyer, H., Bergmeyer, J., Gral, M., eds.) 3rd ed, Verlag Chemie, 1980).

실시예 8. 면역형광염색 (Immunofluorescence)

PEP-융합단백질의 세포 내 투과를 관찰하기 위하여, 24-웰 플레이트에 멸균된 커버 글래스를 넣고 세포를 4∼6시간동안 키운 뒤 FBS가 포함되지 않은 1ml의 신선한 배양액으로 교체하고 재조합 PEP-SOD와 PEP-CAT 융합단백질을 배양액 내에 처리하였다. 1 시간 후 세포를 trypsin-EDTA와 PBS로 충분히 세척하였다. 이어 웰에 4% 파라포름알데히드를 0.5 ml씩 넣고 10분간 배양하여 세포를 고정시킨 후, 차가운 메탄올을 넣고 15초 정도 방치하였다. PBS로 3회 세척 한 후, SOD와 CAT의 항체를 커버 글래스위에 떨어뜨려 주고 1시간동안 상온에서 반응시켰다. PBS로 항체를 제거하고, Cy3-conjugated 항체를 PBS에 1:1000으로 희석하여 커버 글래스 위에 처리하여 상온에서 1시간 반응시켰다. 이어 PBS로 항체를 제거하고, 커버 글래스를 멸균된 3차 증류수에 세척한 후 공기 중에서 건조시켰다. 슬라이드 글래스 위에 mounting solution과 커버 글래스의 세포가 맞닿도록 덮어주고 커버 글래스를 움직이지 않도록 고정시킨 다음, 형광 현미경으로 세포 내로 투과된 PEP-SOD 및 PEP-CAT 융합단백질을 확인하였다.

실시예 9. HeLa 세포로 투과된 PEP-융합단백질의 안정성

세포 내로 투과된 PEP-융합단백질의 세포 내 안정성을 측정하기 위하여, HeLa 세포를 6-웰 플레이트에서 4∼6시간 동안 키운 뒤 FBS가 포함되지 않은 1ml의 신선한 배양액으로 교체하고 재조합 PEP-SOD와 PEP-CAT 융합단백질을 배양액 내에 처리하였다. 처리 1 시간 후 세포를 trypsin-EDTA로 처리하고 PBS로 충분히 세척하였다. 이어 FBS가 포함된 배지를 넣고 계속 배양하면서, 시간별(1∼60 시간)로 세포를 모아 세포 내의 남아 있는 융합단백질의 양과 활성을 웨스턴 블랏과 활성도 분석으로 측정하였다.

실시예 10. 면역조직염색 (Immunohistochemistry)

PEP-SOD 융합단백질의 피부 투과 및 각 장기별로 투과되는지를 확인하기 위해서 조직면역염색을 실시하였다. 실험동물은 수컷 ICR 마우스를 사용하였다. 실험동물은 질소와 산소 혼합가스에 들어있는 3% isoflurance로 마취시켰으며, 피부에 있는 털을 제거한 다음 PEP-SOD와 PEP-CAT를 피부에 1시간 발라주었다. 그런 다음, 피부 조직을 냉동조직절편으로 만들었다.

또한, 각 장기별로 PEP-융합단백질이 투과되는지를 확인하기 위해 융합단백질을 마우스에 복강 주사하고, 8시간 후 실험동물을 마취시킨 후 관류 세척하였다. 관류세척이 후 바로 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 함유한 0.1 M PBS (pH7.4)로 고정하였다. 고정이 끝난 조직은 조직을 떼어내어 4% 파라포름알데히드 용액에 담가 보존하였다. 조직을 embedding medium(Reichert-Jung, Germany)으로 포매하고 동결박절기(cryostat; Reichert-Jung, Germany)를 이용하여 잘라서 본 연구에 사용하였다.

면역조직화학 염색에 앞서 냉동조직절편을 상온에서 30분간 건조시킨 후 37℃ 에서 2시간 이상 완전히 말린 다음 실험을 시작하였다. 조직 절편은 0.01M PBS (PBS)로 10분간 완충시킨 후 다시 증류수로 10분간 세척하였다. 이후 7분씩 2회 PBS로 세척을 한 다음 조직 내의 내인성 과산화효소 (peroxidase)를 제거하기 위해서 0.5% 과산화수소가 함유된 PBS 용액에서 20분간 반응시켰다. 이후 PBS로 7분씩 2회 세척한 후 비-특이적 반응을 방지하기 위하여 조직을 PBS에 들어있는 5% 정상 염소 혈청에 30분간 반응시켰다. 이후 과정은 통상적인 streptavidin- biotin peroxidase 법을 이용한 면역조직화학반응을 실시하였다.

1차 항체는 rabbit anti-mouse histidine (Santa cruz, USA)를 사용하였다. 면역조직화학반응에 이용된 모든 항체는 2% 정상 염소 혈청 및 0.1% triton X-100이 함유된 0.1 M PBS (pH 7.4)에 희석하여 사용하였다. 피부 조직은 1차 항체를 1:500으로 희석하여 4℃에서 48 시간 동안 반응시켰다. 이 후 2차 항체로 biotinyl- ated rabbit anti-mouse IgG (Vector, USA)를 1:200으로 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 1:200으로 희석한 peroxidase-conjugated streptavidin (Vector, USA)에 상온에서 2시간 반응시켰다. 이상 각 단계의 반응 후에는 PBS 용액으로 4∼5차례 세척하였다.

항원항체반응이 끝난 조직은 0.03% 과산화수소와 0.05% DAB (3,3´- diaminobenzidine tetrachloride; Sigma, USA)가 함유된 Tris buffer(pH 7.4) 용액에서 1∼5분간 발색시켰다. 발색반응이 끝난 조직은 수세 후 수용성 봉입제인 crystal mount (Biomeda, USA)를 이용하여 봉입한 다음 현미경 관찰 후 사진촬영 (Axioscope microscope; Carl Zeiss, Germany)을 하였다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 단백질 등의 화물 분자와 공유결합하여 세포 내로 이들 화합물을 직접 도입시킬 수 있는 수송 도메인을 제공한다.

또한, 본 발명은 수송도메인-화물 분자 복합체 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 이 복합체의 발현 벡터를 제공하고 생리 활성 단백질을 포함하는 수송 도메인 융합 단백질 및 단백질을 세포 내로 도입하는 방법, 그리고 이를 이용한 치료 및/또는 예방용 약학 조성물 및/또는 치료 및 예방 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 SOD 등 활성물질을 수송 도메인과 융합시킨 수송 도메인 융합단백질을 유효성분으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 세포 내로 투과된 융합단백질들은 정상적인 3차 구조를 유지할 뿐만 아니라 투과된 단백질은 안정한 상태로 세포 내에 존재한다.

본 발명에서 기술한 수송 도메인 및 수송 도메인 융합 단백질, 그 발현 벡터 등은 수송 도메인 융합단백질이 세포 내로 효율적으로 전달되고 전달된 단백질 분자의 활성이 유지됨을 확인하였으므로, 효과적인 생리활성 물질의 세포내 전달체 및 도입방법으로 사용될 수 있을 것이다.

또한, 본 발명의 실시예에서 화물 분자로서 선택한 슈퍼옥사이드 디스뮤테이스와 카탈라제는 활성산소종 관련질환의 예방, 치료목적으로 수송 도메인 융합단백질의 형태로 사용 가능할 것으로 예상된다. 활성산소종은 산소를 이용하여 에너지를 얻는 모든 생명체에서 세포 내 대사과정의 부산물로 필연적으로 생성된다. 이러한 활성산소종은 세포 내의 생체고분자에 손상을 입혀 인체의 여러 질병과 깊게 관련되어 있다. 특히, 발암과정, 뇌졸중, 관절염, 동맥경화, 당뇨병 및 염증반응에 관여하며 정상적인 노화과정에서도 노화를 촉진시키는 중요한 요인으로 작용한다(Floyd, RA (1990) FASEB J. 4, 2587-2597, Halliwell, B. and Gutteridge, JMC (1999) Free radicals in biology and medicine, Oxford University Press, Oxford).

구리,아연-슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 (Cu,Zn-superoxide dismutase; SOD)와 카탈라제(catalase; CAT)는 이러한 자유라디칼의 해독과 산소의 손상으로부터 세포의 손상을 막아주는 세포 내 중요한 항산화 효소이다(Fridovich, I. (1995) Annu. Rev. Biochem. 64, 97-112). 모든 생체 내 고분자들은 이러한 자유라디칼의 해로운 작용에 항상 노출되어 있기 때문에 여러 질환에서 구리,아연-슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈와 카탈라제를 치료목적으로 이용하려는 관심이 매우 높아지고 있다.

PEP-SOD는 세포 내로 투과된 후 SOD, CAT 활성을 그대로 유지하고 있어서 단백질 치료에 PEP-SOD 및 PEP-CAT가 효율적으로 활용될 수 있음을 제시한다. 또한, PEP-SOD, CAT는 Tat-SOD, CAT보다 세포 내로 투과된 후, 단백질의 활성이 월등히 높고 구조적으로 안정하여 더욱 효과적일 것으로 사료된다.

활성산소종은 세포내의 생체고분자에 손상을 입히며, 보고된 바로는 100 여종의 인간 질병의 진행과정과 깊게 관련되어 있다(Yim, HS et al.(1997) J. Biol.Chem. 272, 8861-8863, Yim. MB et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 5709-5713, Choi, SY et al.(1999) Biochim. Biophys. Acta. 1472, 651-657). 따라서, 이러한 활성산소종을 제거하는데 있어서 주된 역할을 담당하는 SOD, CAT를 자연상태로 세포 내 투여함으로써 질환을 치료하는 단백질 치료에 PEP-SOD, CAT가 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

본 기술을 바탕으로 항산화효소의 일종인 SOD, CAT를 세포 내로 직접 전달하여 우리 인체에 해로운 활성산소종을 제거할 수 있기 때문에 활성산소종 관련 여러 질병 이외에도 화장품 및 건강식품산업 등 더욱 효과적으로 본 기술이 광범위하게 활용될 수 있다.

<110> CHOI, JIN HEE <120> Cell-transducing transport domain fusion protein and use thereof <130> WJTJ-SHK-PET-TP <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cell-transducing domain <300> <301> MC, Morris J, Depollier J, Mery F, Heitz G, Divita <302> A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells <304> 19 <305> 12 <306> 1173-1176 <307> 2001-12-31 <313> 1-21 <400> 1 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 2 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> top strand oligonucleotide coding PEP-1 <400> 2 tatgaaagaa acctggtggg aaacctggtg gaccgaatgg tctcagccga aaaaaaaacg 60 taaagtgc 68 <210> 3 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bottom strand oligonucleotide coding PEP-1 <400> 3 tcgagcactt tacgtttttt tttcggctga caccattcgg tccaccaggt ttcccaccag 60 gtttctttcc 70 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400 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