생체 시료 중의 L-트립토판 분석 방법 및 그것에 이용하는 키트

생체 시료 중의 L-트립토판 분석 방법 및 그것에 이용하는 키트{METHOD OF ANALYZING L-TRYPTOPHAN IN BIOLOGICAL SAMPLES, AND KIT USED THEREIN}

[관련 출원의 상호 참조]

본 출원은, 2011년 3월 4일 출원의 일본 특허 출원 제2011-48101호의 우선권을 주장하고, 그 전체 내용은, 여기에 특히 개시로서 원용된다.

[기술분야]

본 발명은, 생체 시료 중의 L-트립토판을 정량 가능한 생성물로 변환하여, 그 생성물의 검출 또는 정량에 의해 L-트립토판의 함유량을 측정하기에 알맞은 L-트립토판옥시다아제를 이용하는 L-트립토판 분석 방법 및 그것에 이용하는 키트에 관한 것이다.

혈중을 비롯한 생체 시료 중의 아미노산 농도의 정량은 여러가지 질병 검출의 마커가 되어, 그 정량법의 개발은 의료적 견지에서 강하게 요구되고 있다. 아미노산 농도의 효소적 정량법은, 그 신속함·간편함 등 기기 분석보다 우수한 특징을 가져, 실제 의료 현장에서 각종 질병 검출을 하기에 알맞은 수법으로 여겨진다.

L-트립토판을 효소학적으로 정량하는 종래 기술로는, (i) L-트립토판모노옥시게나아제(비특허문헌 A, 비특허문헌 B), 및 (ii) L-아미노산옥시다아제를 이용하는 방법(특허문헌 A)이 알려져 있다.

상기한 (i) L-트립토판모노옥시게나아제를 이용하는 방법에서는, L-트립토판 산화에 따른 산소 감소량을 검출할 필요가 있다. 그 때문에, 원리적으로 복잡한 장치가 요구된다(비특허문헌 B). 또한 상기 L-트립토판모노옥시게나아제는, L-트립토판에 대한 활성을 100%로 했을 때, L-페닐알라닌에 대하여 83%, L-메티오닌에 대하여 42%라는 높은 상대 활성을 나타낸다(비특허문헌 A). 따라서 이 효소를 이용하는 방법은, 간편·저렴하고 또한 L-트립토판 특이성이 높은 검출을 행하기에는 부적합하다.

상기한 (ii) L-아미노산옥시다아제를 이용하는 방법에 관해서는, 공지된 L-아미노산옥시다아제는, 일반적으로 기질 특이성이 낮아, L-트립토판 이외의 L-아미노산 복수종도 반응 기질로 한다. 그 때문에, 협잡물 존재하에서 L-트립토판 특이적인 검출을 L-아미노산옥시다아제에 의해 행한 예는 알려져 있지 않다. 예컨대, L-아미노산옥시다아제로는, 뱀독 중의 효소가 복수 알려져 있다. 그러나, 어느 효소도 폭넓은 아미노산종에 대하여 활성을 갖고 있다(비특허문헌 E, F). 또한 그 이외에도, 연체 동물이나 세균 유래의 L-아미노산옥시다아제의 보고예도 있다. 그러나, 이들도 마찬가지로 기질 특이성은 넓은 것이 알려져 있어(비특허문헌 G, H, I, J), 이들 효소를 이용하여 L-트립토판을 정량하는 것은 원리적으로 불가능하다.

비교적 L-트립토판에 대한 기질 특이성이 높은 효소로는, 담자균 코프리누스종( Coprinus sp . ) 유래의 L-아미노산옥시다아제의 보고예가 있다(특허문헌 A). 다만 상기 효소는, L-페닐알라닌 등 다른 종류의 아미노산에도 7% 정도의 반응성을 나타낸다. 따라서, 여전히 협잡물이 많은 생체 시료의 측정에는 부적합하다. 또한 상기 효소는, L-트립토판에 대한 Km값이 650 μM이고, 혈중에서 수십 μM 오더의 농도로밖에 존재하지 않는 L-트립토판을 정확히 정량하기 위해서는 기질 친화성이 낮은 것도 문제가 된다. 실제로 L-아미노산옥시게나아제를 이용하여 시료 중의 L-트립토판을 정량한 예는 지금까지 알려져 있지 않다. 또한 상기 효소는 유전자 동정되어 있지 않아, 담자균의 장기간(약 1개월)에 걸친 배양 및 복잡한 정제 과정이 그 제조에는 필요해진다. 이상의 이유로부터, 상기 효소에 의한 생체 시료 중의 L-트립토판 정량, 및 대량의 효소를 필요로 하는 실용화는 곤란했다.

그래서 본 발명에서는, 다른 아미노산이 공존하는 생체 시료 중에 있더라도 L-트립토판 특이적인 정량에 응용 가능한 새로운 효소를 탐색하고, 이 효소를 이용하는, L-트립토판의 새로운 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은, 상기 효소적 분석법을 실시할 때에 이용할 수 있는 측정용 키트를 제공하는 것도 목적으로 한다. 게다가 본 발명은, 상기 효소적 분석법에 이용할 수 있는 효소 센서를 제공하는 것도 목적으로 한다.

본 발명자들은, 세균의 비스인돌계 항생 물질 생합성 경로 중의 유전자로부터, L-트립토판에 기질 특이성이 높은 L-트립토판옥시다아제를 발견했다. 이 효소를 생체 시료 중에 포함되는 L-트립토판과 반응시킴으로써 검출 가능한 화합물이 생성되는 것, 또한, 이 효소가 생체 시료 중에 혼재되는 다른 아미노산에 영향을 받지 않고 L-트립토판 특이적인 정량이 가능한 것을 발견하고, 본 발명을 완성했다.

본 발명은, 이하에 나타내는 바와 같다.

[1]

검체와 L-트립토판옥시다아제와 물을 혼합하는 공정(A),

상기 혼합에 의해 얻어진 반응액을 산소의 존재하에서 소정 시간 방치하는 공정(B),

방치 후의 반응액 중에 존재하는 상기 효소의 작용에 의한 반응 생성물의 적어도 1종의 존재를 확인하거나, 또는 상기 반응 생성물의 적어도 1종의 양을 계측하는 공정(C)

를 포함하는, 상기 검체 중의 L-트립토판의 분석 방법으로서,

상기 L-트립토판옥시다아제가,

(a1) 하기 (1)∼(3) 중 어느 아미노산 서열을 가지며, 또한 (a2) 산소 및 물의 존재하에, L-트립토판에 작용하여 과산화수소와 암모니아를 생성하는 옥시다아제 활성을 갖고, L-페닐알라닌에 대한 옥시다아제 활성은 L-트립토판에 대한 옥시다아제 활성의 0∼3%의 범위이고, L-트립토판 및 L-페닐알라닌 이외의 단백질 구성 아미노산에 대해서는 옥시다아제 활성을 갖지 않는, 상기 방법.

(1) 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열;

(2) 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1개 내지 50개의 아미노산의 결실, 치환 및/또는 부가를 갖는 아미노산 서열; 또는

(3) 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열.

[2]

상기 L-트립토판옥시다아제의 (a1)에서의 L-페닐알라닌에 대한 옥시다아제 활성은 L-트립토판에 대한 옥시다아제 활성의 0∼1%의 범위인, [1]에 기재된 방법.

[3]

공정(A)에 있어서 검체와의 혼합에 이용되는 상기 L-트립토판옥시다아제는, 상기 효소의 안정화제의 존재하에서 보존되어 있는 것인, [1] 또는 [2]에 기재된 방법.

[4]

상기 안정화제가, 글리세롤, 수크로오스, 소르비톨 및 트레할로오스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인, [3]에 기재된 방법.

[5]

상기 공정(C)에서 확인 또는 계측하는 반응 생성물이 과산화수소인 [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[6]

이하의 시약을 포함하는 L-트립토판의 정량용 키트:

(K1) L-트립토판옥시다아제

다만, 상기 L-트립토판옥시다아제는, (a1) 하기 (1)∼(3) 중 어느 아미노산 서열을 가지며, 또한 (a2) 산소 및 물의 존재하에, L-트립토판에 작용하여 과산화수소와 암모니아를 생성하는 옥시다아제 활성을 갖고, L-페닐알라닌에 대한 옥시다아제 활성은 L-트립토판에 대한 옥시다아제 활성의 0∼3%의 범위이고, L-트립토판 및 L-페닐알라닌 이외의 단백질 구성 아미노산에 대해서는 옥시다아제 활성을 갖지 않음.

(1) 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열;

(2) 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1개 내지 50개의 아미노산의 결실, 치환 및/또는 부가를 갖는 아미노산 서열; 또는

(3) 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열.

[7]

상기 (K1) L-트립토판옥시다아제의 (a1)에서의 L-페닐알라닌에 대한 옥시다아제 활성은 L-트립토판에 대한 옥시다아제 활성의 0∼1%의 범위인, [6]에 기재된 키트.

[8]

상기 (K1) L-트립토판옥시다아제는, 상기 효소의 안정화제와의 혼합물인, [6] 또는 [7]에 기재된 키트.

[9]

상기 안정화제가, 글리세롤, 수크로오스, 소르비톨 및 트레할로오스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인, [8]에 기재된 키트.

[10]

(K2) 반응용 완충액, (K3) 과산화수소 검출용 시약, (K4) 암모니아 검출약 및 (K5) 인돌피루브산 검출약 중 적어도 하나를 더 포함하는, [6]∼[9] 중 어느 하나에 기재된 키트.

[11]

L-트립토판옥시다아제를 포함하는 L-트립토판의 분석용 조성물로서,

상기 L-트립토판옥시다아제는, (a1) 하기 (1)∼(3) 중 어느 아미노산 서열을 가지며, 또한 (a2) 산소 및 물의 존재하에, L-트립토판에 작용하여 과산화수소와 암모니아를 생성하는 옥시다아제 활성을 갖고, L-페닐알라닌에 대한 옥시다아제 활성은 L-트립토판에 대한 옥시다아제 활성의 0∼3%의 범위이고, L-트립토판 및 L-페닐알라닌 이외의 단백질 구성 아미노산에 대해서는 옥시다아제 활성을 갖지 않는, 상기 조성물.

(1) 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열;

(2) 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1개 내지 50개의 아미노산의 결실, 치환 및/또는 부가를 갖는 아미노산 서열; 또는

(3) 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열.

[12]

상기 L-트립토판옥시다아제의 (a1)에서의 L-페닐알라닌에 대한 옥시다아제 활성은 L-트립토판에 대한 옥시다아제 활성의 0∼1%의 범위인, [11]에 기재된 조성물.

[13]

상기 효소의 안정화제를 함유하는, [11] 또는 [12]에 기재된 조성물.

[14]

상기 안정화제가, 글리세롤, 수크로오스, 소르비톨 및 트레할로오스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인, [13]에 기재된 조성물.

[15]

L-트립토판옥시다아제를 이용하는 L-트립토판의 검출 또는 정량용 효소 센서로서,

상기 검출용 전극은 과산화수소 검출용 전극이며, 또한

상기 L-트립토판옥시다아제는, (a1) 하기 (1)∼(3) 중 어느 아미노산 서열을 가지며, 또한 (a2) 산소 및 물의 존재하에, L-트립토판에 작용하여 과산화수소와 암모니아를 생성하는 옥시다아제 활성을 갖고, L-페닐알라닌에 대한 옥시다아제 활성은 L-트립토판에 대한 옥시다아제 활성의 0∼3%의 범위이고, L-트립토판 및 L-페닐알라닌 이외의 단백질 구성 아미노산에 대해서는 옥시다아제 활성을 갖지 않는, 상기 센서.

(1) 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열;

(2) 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1개 내지 50개의 아미노산의 결실, 치환 및/또는 부가를 갖는 아미노산 서열; 또는

(3) 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열.

[16]

상기 L-트립토판옥시다아제의 (a1)에서의 L-페닐알라닌에 대한 옥시다아제 활성은 L-트립토판에 대한 옥시다아제 활성의 0∼1%의 범위인, [15]에 기재된 효소 센서.

[17]

상기 L-트립토판옥시다아제는, 상기 효소의 안정화제와 함께 이용되는, [15] 또는 [16]에 기재된 효소 센서.

[18]

상기 안정화제가, 글리세롤, 수크로오스, 소르비톨 및 트레할로오스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인, [17]에 기재된 효소 센서.

[19]

과산화수소 검출용 전극은, 효소식 과산화수소 전극 또는 격막식 과산화수소 전극인 [15]∼[18] 중 어느 하나에 기재된 효소 센서.

본 발명에 의하면, L-트립토판에 대하여 특이적인 트립토판옥시다아제를 이용함으로써, 다른 아미노산 등 많은 협잡물을 포함하는 시료에 있어서도, L-트립토판 특이적으로 신속·간편한 검출을 행할 수 있다. 특히, 혈장, 혈청 또는 뇨와 같은 생체 시료에 대하여 본 발명은 유효하고, 퍼옥시다아제 등의 효소와 커플링시킴으로써 발색법이나 형광법으로 L-트립토판을 정량할 수 있을 뿐만 아니라, 전극형 효소 센서를 제공할 수도 있다.

도 1은 각 L-트립토판 농도에서의 StaO의 활성을 도시한다.
도 2는 StaO에 의한 L-트립토판 검량선 작성 샘플의 흡광도의 시간 경과적 변화를 도시한다.
도 3은 StaO 사용 샘플에 의해 작성한 L-트립토판 검량선을 도시한다.
도 4는 VioA에 의한 L-트립토판 검량선 작성 샘플의 흡광도의 시간 경과적 변화를 도시한다.
도 5는 VioA 사용 샘플에 의해 작성한 L-트립토판 검량선을 도시한다.
도 6은 기기 분석 혹은 L-트립토판옥시다아제에 의한 인간 혈장 시료 중 L-트립토판 정량 결과를 도시한다.
도 7은 각종 글리세롤 농도 존재하에서의 StaO 잔존 활성의 시간 경과적 변화를 도시한다.
도 8은 각종 글리세롤 농도 존재하에서의 VioA 잔존 활성의 시간 경과적 변화를 도시한다.
도 9는 10% 글리세롤 존재하 또는 비존재하에서의, 4℃ 또는 -80℃에서 하룻밤 VioA를 보존한 후의 잔존 활성을 도시한다.

<L-트립토판의 분석 방법>

본 발명의 L-트립토판의 분석 방법은,

검체와 L-트립토판옥시다아제와 물을 혼합하는 공정(A),

상기 혼합에 의해 얻어진 반응액을 산소의 존재하에서 소정 시간 방치하는 공정(B),

방치 후의 반응액 중에 존재하는 상기 효소의 작용에 의한 반응 생성물의 적어도 1종의 존재를 확인하거나, 또는 상기 반응 생성물의 적어도 1종의 양을 계측하는 공정(C)

를 포함하고, 이들 공정을 거침으로써, 검체 중의 L-트립토판의 존재를 확인하거나, 또는 정량하는 방법이다.

본 발명의 방법에서, 검체로서 이용되는 생체 시료는, L-트립토판을 포함할 가능성이 있는 시료이면, 어떠한 것이어도 좋다. 생체 시료에 L-트립토판옥시다아제를 작용시켜 생기는, 어떤 생성물을 확인 또는 정량함으로써 생체 시료 중의 L-트립토판을 확인 또는 그 농도를 측정하는 것인가에 따라, 생체 시료는 적절하게 선택할 수 있다. 예컨대, 발색제나 형광제를 이용하여 상기 생성물을 확인 또는 정량하는 경우에는 무색의 수용액인 것이 바람직하고, 혈청 및 혈장 등을 예로서 들 수 있다.

본 발명에 이용하는 상기 L-트립토판옥시다아제는,

(a1) 하기 (1)∼(3) 중 어느 아미노산 서열을 가지며, 또한 (a2) 산소 및 물의 존재하에, L-트립토판에 작용하여 과산화수소와 암모니아를 생성하는 옥시다아제 활성을 갖고, L-페닐알라닌에 대한 옥시다아제 활성은 L-트립토판에 대한 옥시다아제 활성의 0∼3%의 범위이고, L-트립토판 및 L-페닐알라닌 이외의 단백질 구성 아미노산에 대해서는 옥시다아제 활성을 갖지 않는 효소이다.

(1) 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열;

(2) 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1개 내지 50개의 아미노산의 결실, 치환 및/또는 부가를 갖는 아미노산 서열; 또는

(3) 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열

(1) 서열 목록의 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지며, 또한 (a2) 산소 및 물의 존재하에, L-트립토판에 작용하여 과산화수소와 암모니아를 생성하는 옥시다아제 활성을 갖고, L-페닐알라닌에 대한 옥시다아제 활성은 L-트립토판에 대한 옥시다아제 활성의 0∼3%의 범위이고, L-트립토판 및 L-페닐알라닌 이외의 단백질 구성 아미노산에 대해서는 옥시다아제 활성을 갖지 않는 효소는, 크로모박테리움 비올라세움( Chromobacterium violaceum ) 유래 효소인 VioA이다. VioA는, 동균이 생산하는 항생 물질 비올라세인(violacein)의 생합성 경로의 일부를 촉매하는 효소로서 동정되고, L-트립토판 산화 활성을 갖는 것이 보고되어 있던 효소이다(비특허문헌 C). 그러나, 본 효소의 기질 특이성을 비롯한 효소학적 성질에 관해서는, 지금까지 검토되지 않았고, 따라서, VioA가, 산소 및 물의 존재하에, L-트립토판에 작용하여 과산화수소와 암모니아를 생성하는 옥시다아제 활성을 갖고, L-페닐알라닌에 대한 옥시다아제 활성은 L-트립토판에 대한 옥시다아제 활성의 0∼3%의 범위이고, L-트립토판 및 L-페닐알라닌 이외의 아미노산에 대해서는 옥시다아제 활성을 갖지 않는 효소인 것은, 본 발명에 있어서 처음으로 밝혀진 것이다. 또한, VioA를 L-트립토판의 정량에 이용하는 것을 보고한 예는 지금까지 없었다.

(1) 서열 목록의 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가지며, 또한 (a2) 산소 및 물의 존재하에, L-트립토판에 작용하여 과산화수소와 암모니아를 생성하는 옥시다아제 활성을 갖고, L-페닐알라닌에 대한 옥시다아제 활성은 L-트립토판에 대한 옥시다아제 활성의 0∼3%의 범위이고, L-트립토판 및 L-페닐알라닌 이외의 단백질 구성 아미노산에 대해서는 옥시다아제 활성을 갖지 않는 효소는, 스트렙토마이세스 에스피( Streptomyces sp . ) TA-A0724 유래 효소인 StaO이다. StaO에 관해서는, 동균이 생산하는 항생 물질 스타우로스포린(staurosporine)의 생합성 유전자 클러스터 중에 그 유전자가 발견된 효소이다(비특허문헌 D). 본 유전자는 상기 VioA의 유전자와 유의적인 상동성을 갖고 있지 않고, 또한 유전자 산물을 생화학적으로 해석한 예는 없는 점에서, 그 유전자 산물의 성상에 관해서는 알려지지 않은 채였다. 따라서, StaO가, 산소 및 물의 존재하에, L-트립토판에 작용하여 과산화수소와 암모니아를 생성하는 옥시다아제 활성을 갖고, L-페닐알라닌에 대한 옥시다아제 활성은 L-트립토판에 대한 옥시다아제 활성의 0∼3%의 범위이고, L-트립토판 및 L-페닐알라닌 이외의 아미노산에 대해서는 옥시다아제 활성을 갖지 않는 효소인 것은, 본 발명에 있어서 처음으로 밝혀진 것이다.

또한, 본원 명세서에 있어서, 「L-페닐알라닌에 대한 옥시다아제 활성은 L-트립토판에 대한 옥시다아제 활성의 0∼3%의 범위이다」에서의 「L-페닐알라닌에 대한 옥시다아제 활성」 및 「L-트립토판에 대한 옥시다아제 활성」은, 실시예에서의 「4. L-트립토판옥시다아제의 아미노산에 대한 기질 특이성」의 시험 방법에 있어서 단백질 구성 아미노산으로서 L-페닐알라닌 및 L-트립토판을 각각 이용한 경우에 얻어지는 상대 활성을 의미한다. 상기 「4. L-트립토판옥시다아제의 아미노산에 대한 기질 특이성」의 시험 방법으로 얻어지는 활성치는, 모두 검출 한계가 0.5%이다. 또한, 본 발명에서 이용하는 L-트립토판옥시다아제는, 분석 정밀도가 높아진다는 관점에서, L-페닐알라닌에 대한 옥시다아제 활성이 L-트립토판에 대한 옥시다아제 활성의 0∼2%의 범위인 것이 바람직하고, 0∼1.5%의 범위인 것이 보다 바람직하고, 0∼1%의 범위인 것이 더욱 바람직하다.

또한 「L-트립토판 및 L-페닐알라닌 이외의 아미노산에 대해서는 옥시다아제 활성을 갖지 않는다」에서의 「L-트립토판 및 L-페닐알라닌 이외의 아미노산에 대한 옥시다아제 활성」은, 실시예에서의 「4. L-트립토판옥시다아제의 아미노산에 대한 기질 특이성」의 시험 방법에 있어서 단백질 구성 아미노산으로서 L-트립토판 및 L-페닐알라닌 이외의 아미노산을 각각 이용한 경우에 얻어지는 상대 활성을 의미한다. 또한, 「옥시다아제 활성을 갖지 않는다」는, 상대 활성이, 1% 이하인 것, 바람직하게는 검출 한계(0.5%)를 초과한 상대 활성을 나타내지 않는 것을 의미한다.

또한, L-트립토판에 작용하여 과산화수소와 암모니아를 생성하는 옥시다아제 활성을 갖는 것, L-페닐알라닌에 대한 옥시다아제 활성은 L-트립토판에 대한 옥시다아제 활성의 0∼3%의 범위이고, L-트립토판 및 L-페닐알라닌 이외의 단백질 구성 아미노산에 대해서는 옥시다아제 활성을 갖지 않는 것은, 각각 실시예에 기재된 분석 방법(정량 방법)을 이용함으로써 확인할 수 있다. 또한, 단백질 구성 아미노산이란, L-티로신, L-알라닌, L-시스테인, L-아스파라긴산, L-글루타민산, L-글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-리신, L-류신, L-메티오닌, L-아스파라긴, L-프롤린, L-글루타민, L-아르기닌, L-세린, L-트레오닌, L-발린, L-를 의미한다.

본 명세서에서 말하는 「1개 내지 50개의 아미노산의 결실, 치환 및/또는 부가를 갖는 아미노산 서열」에서의 「1개 내지 50개」의 범위는, 결실 등을 갖는 단백질이, 산소 및 물의 존재하에, L-트립토판에 작용하여 과산화수소와 암모니아를 생성하는 옥시다아제 활성을 갖고, L-페닐알라닌에 대한 옥시다아제 활성은 L-트립토판에 대한 옥시다아제 활성의 0∼3%의 범위이고, L-트립토판 및 L-페닐알라닌 이외의 아미노산에 대해서는 옥시다아제 활성을 갖지 않는 효소인 것을 의미한다. 상기 「1개 내지 50개」의 범위는, 상기 옥시다아제 활성을 갖는 단백질인 비율이 높다는 관점에서, 예컨대, 1개 내지 40개, 바람직하게는 1개 내지 30개, 보다 바람직하게는 1개 내지 20개, 더욱 바람직하게는 1개 내지 10개, 더욱더 바람직하게는 1개 내지 7개, 한층 더 바람직하게는 1개 내지 5개, 특히 바람직하게는 1개 내지 3개 정도일 수 있다.

본 명세서에서 말하는 「서열 목록의 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열」에서의 동일성은, 상기 아미노산 서열의 동일성을 갖는 단백질이, 산소 및 물의 존재하에, L-트립토판에 작용하여 과산화수소와 암모니아를 생성하는 옥시다아제 활성을 갖고, L-페닐알라닌에 대한 옥시다아제 활성은 L-트립토판에 대한 옥시다아제 활성의 0∼3%의 범위이고, L-트립토판 및 L-페닐알라닌 이외의 아미노산에 대해서는 옥시다아제 활성을 갖지 않는 효소인 한, 특별히 한정되지 않는다. 상기 아미노산 서열의 동일성은, 90% 이상이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 96% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상, 더욱 바람직하게는 98%, 특히 바람직하게는 99% 이상이다.

본 발명에서 이용하는 L-트립토판옥시다아제는, 특정한 종으로부터 생산되는 것에 한정되지 않고, 특이적으로 L-트립토판의 아미노기를 산화적 탈아미노화하는 것에 따라 과산화수소를 생산하는 효소를 의미한다.

또한, 본 발명에 이용하는 L-트립토판옥시다아제는, 동일한 활성을 갖는 것이면, 자연계로부터 분리된 생물에서 유래되는 것, 본 효소를 코드하는 유전자를 대장균이나 다른 생물을 숙주로 하여 발현시켜 얻어지는 효소 또는 단백질도 포함된다.

또한, 이종 발현에 의한 생산법으로는, 예컨대, 동일한 활성을 갖는 생물종으로부터 추출한 게놈 DNA로부터 해당하는 유전자를 PCR로 증폭시켜 pET 혹은 pUC 등에 삽입한 플라스미드 벡터를 구축한 후, BL21, JM109 등의 숙주 균주로 형질 전환하여, 배양하는 방법을 들 수 있다. 이들 이외의 공지된 방법도 적절하게 이용할 수 있다.

본 발명에서 이용하는 L-트립토판옥시다아제의 취득 방법은 특별히 제한되지 않고, 화학 합성에 의해 합성한 단백질이어도 좋고, 유전자 재조합 기술에 의해 제작한 재조합 단백질이어도 좋다. 재조합 단백질을 제작하는 경우에는, 후술하는 바와 같이 상기 단백질을 코드하는 유전자(DNA)를 취득한다. 이 DNA를 적당한 발현계에 도입함으로써, 상기 L-트립토판옥시다아제를 산생할 수 있다.

상기 L-트립토판옥시다아제는, 상기 L-트립토판옥시다아제를 코드하는 유전자를 벡터 상에 탑재하고, 이 벡터에 의해 숙주 세포를 형질 전환한 후, 형질 전환시킨 숙주 세포를 배양하여 배양물 중에 상기 유전자가 코드하는 단백질을 축적하고, 축적한 단백질을 수집하는 것을 포함하는, 생산 방법에 의해 조제할 수 있다.

상기 L-트립토판옥시다아제를 코드하는 유전자의 취득 방법은 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 L-트립토판옥시다아제를 코드하는 유전자는, 예컨대, 서열 번호 1 혹은 2에 기재된 아미노산 서열 또는 서열 번호 3 혹은 4에 기재된 염기 서열의 정보에 기초하여, 화학 합성, 유전자 공학적 수법 또는 돌연변이 유발 등의 당업자에게 이미 알려진 임의의 방법으로 제작할 수 있다.

예컨대, 서열 목록의 서열 번호 3 또는 4에 기재된 염기 서열을 갖는 DNA에 대하여, 변이원이 되는 약제와 접촉 작용시키는 방법, 자외선을 조사하는 방법, 유전자 공학적 수법 등을 이용하여 행할 수 있다. 유전자 공학적 수법의 하나인 부위 특이적 변이 유발법은 특정한 위치에 특정한 변이를 도입할 수 있는 수법인 점에서 유용하고, 공지된 방법을 이용하여 행할 수 있다.

본 명세서 중의 서열 목록의 서열 번호 1 혹은 2에 기재한 아미노산 서열 또는 서열 번호 3 혹은 4에 나타내는 염기 서열의 정보에 기초하여 적당한 프로브나 프라이머를 조제하고, 이들을 이용하여 크로모박테리움 비올라세움( Chromobacterium violaceum ) NBRC 12614 또는 스트렙토마이세스 에스피( Streptomyces sp . ) TA-A0724의 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 본 발명의 유전자를 단리할 수 있다. 게놈 라이브러리는, 크로모박테리움 비올라세움( Chromobacterium violaceum ) NBRC 12614 또는 스트렙토마이세스 에스피( Streptomyces sp . ) TA-A0724로부터 통상법에 의해 제작할 수 있다.

PCR법에 의해 본 발명의 L-트립토판옥시다아제를 코드하는 유전자를 취득할 수도 있다. 상기 크로모박테리움 비올라세움( Chromobacterium violaceum ) NBRC 12614 또는 스트렙토마이세스 에스피( Streptomyces sp . ) TA-A0724의 게놈 라이브러리를 주형으로서 사용하고, 서열 번호 3 혹은 4에 기재한 염기 서열을 증폭시킬 수 있도록 설계한 한쌍의 프라이머를 이용하여 PCR을 행한다. PCR의 반응 조건은 적절하게 설정할 수 있고, 예컨대, 94℃에서 30초간(변성), 55℃에서 30초∼1분간(어닐링), 72℃에서 2분간(신장)으로 이루어지는 반응 공정을 1 사이클로 하여, 예컨대 30 사이클 행한 후, 72℃에서 7분간 반응시키는 조건 등을 들 수 있다. 계속해서, 증폭된 DNA 단편을, 대장균( E. coli ) 등의 숙주에서 증폭 가능한 적절한 벡터 중에 클로닝할 수 있다.

상기한 프로브 또는 프라이머의 조제, 게놈 라이브러리의 구축, 게놈 라이브러리의 스크리닝, 및 목적 유전자의 클로닝 등의 조작은 당업자에게 이미 알려진 방법에 준하여 적절하게 행할 수 있다.

상기 L-트립토판옥시다아제의 유전자는 적당한 벡터 중에 삽입하여 사용할 수 있다. 본 발명에서 이용하는 벡터의 종류는 특별히 한정되지 않고, 예컨대, 자립적으로 복제하는 벡터(예컨대 플라스미드 등)여도 좋고, 혹은, 숙주 세포에 도입되었을 때에 숙주 세포의 게놈에 삽입되고, 삽입된 염색체와 함께 복제되는 것이어도 좋다. 바람직하게는, 벡터는 발현 벡터이다. 발현 벡터에 있어서 상기 유전자는, 전사에 필요한 요소(예컨대, 프로모터 등)가 기능적으로 연결되어 있다. 프로모터는 숙주 세포에 있어서 전사 활성을 나타내는 DNA 서열이고, 숙주의 종류에 따라 적절하게 선택할 수 있다.

세균 세포에서 작동 가능한 프로모터로는, 바실루스 스테아로서모필루스 말토게닉 아밀라아제 유전자( Geobacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene), 바실루스 리케니포르미스 α아밀라아제 유전자( Bacillus licheniformis alpha-amylase gene), 바실루스 아밀로리케파시엔스 BAN 아밀라아제 유전자( Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene), 바실루스 서브틸리스 알칼리프로테아제 유전자( Bacillus subtilis alkaline protease gene) 혹은 바실루스 푸밀루스 자일로시다아제 유전자( Bacillus pumilus xylosidase gene)의 프로모터, 또는 파지·람다의 P _R 혹은 P _L 프로모터, 대장균( E. coli )의 lac, trp 혹은 tac 프로모터 등을 들 수 있다.

포유 동물 세포에서 작동 가능한 프로모터의 예로는, SV40 프로모터, MT-1(메탈로티오네인 유전자) 프로모터, 또는 아데노바이러스 2주 후기 프로모터 등이 있다. 곤충 세포에서 작동 가능한 프로모터의 예로는, 폴리헤드린 프로모터, P10 프로모터, 오토그라파 캘리포니카 폴리헤드로시스 염기성 단백 프로모터, 바큘로바이러스 즉시형 초기 유전자 1 프로모터, 또는 바큘로바이러스 39K 지연형 초기 유전자 프로모터 등이 있다. 효모 숙주 세포에서 작동 가능한 프로모터의 예로는, 효모 해당계 유전자 유래의 프로모터, 알콜디히드로게나아제 유전자 프로모터, TPI1 프로모터, ADH2-4c 프로모터 등을 들 수 있다. 사상균 세포에서 작동 가능한 프로모터의 예로는, ADH3 프로모터 또는 tpiA 프로모터 등이 있다.

또한, 상기 L-트립토판옥시다아제의 유전자는 필요에 따라, 적절한 터미네이터에 기능적으로 결합되어도 좋다. L-트립토판옥시다아제의 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 또한, 폴리아데닐레이션 시그널(예컨대 SV40 또는 아데노바이러스 5E1b 영역 유래의 것), 전사 인핸서 서열(예컨대 SV40 인핸서) 등의 요소를 갖고 있어도 좋다. L-트립토판옥시다아제의 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 또한, 상기 벡터가 숙주 세포 내에서 복제하는 것을 가능하게 하는 DNA 서열을 구비해도 좋고, 그 일례로는 SV40 복제 기점(숙주 세포가 포유류 세포일 때)을 들 수 있다.

L-트립토판옥시다아제의 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 또한 선택 마커를 함유해도 좋다. 선택 마커로는, 예컨대, 디히드로엽산리덕타아제(DHFR) 또는 시조사카로마이세스 폼베 TPI 유전자 등과 같은 그 보체가 숙주 세포에 결여되어 있는 유전자, 또는 예컨대 암피실린, 카나마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 네오마이신 혹은 히그로마이신과 같은 약제 내성 유전자를 들 수 있다. L-트립토판옥시다아제의 유전자, 프로모터, 및 소망에 따라 터미네이터 및/또는 분비 시그널 서열을 각각 연결하고, 이들을 적절한 벡터에 삽입하는 방법은 당업자에게 주지되어 있다.

L-트립토판옥시다아제의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 적당한 숙주에 도입함으로써 형질 전환체를 제작할 수 있다. L-트립토판옥시다아제의 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 도입되는 숙주 세포는, L-트립토판옥시다아제의 유전자를 발현할 수 있으면 임의의 세포여도 좋고, 세균, 효모, 진균 및 고등 진핵 세포 등을 들 수 있다.

세균 세포의 예로는, 바실루스 또는 스트렙토마이세스 등의 그램 양성균 또는 대장균( E. coli ) 등의 그램 음성균을 들 수 있다. 이들 세균의 형질 전환은, 프로토플라스트법, 또는 공지된 방법으로 컴피턴트 세포를 이용함으로써 행하면 된다. 포유류 세포의 예로는, HEK293 세포, HeLa 세포, COS 세포, BHK 세포, CHL 세포 또는 CHO 세포 등을 들 수 있다. 포유류 세포를 형질 전환하여, 상기 세포에 도입된 DNA 서열을 발현시키는 방법도 공지되어 있고, 예컨대, 일렉트로포레이션법, 인산칼슘법, 리포펙션법 등을 이용할 수 있다.

효모 세포의 예로는, 사카로마이세스 또는 시조사카로마이세스에 속하는 세포를 들 수 있고, 예컨대, 사카로마이세스 세레비시에( Saccharomyces cerevisiae ) 또는 사카로마이세스 클루이베리( Saccharomyces kluyveri ) 등을 들 수 있다. 효모 숙주에 대한 재조합 벡터의 도입 방법으로는, 예컨대, 일렉트로포레이션법, 스페로플라스트법, 초산리튬법 등을 들 수 있다.

다른 진균 세포의 예는, 사상균, 예컨대 아스페르길루스, 뉴로스포라, 푸사리움, 또는 트리코데르마에 속하는 세포이다. 숙주 세포로서 사상균을 이용하는 경우, DNA 구축물을 숙주 염색체에 삽입하여 재조합 숙주 세포를 얻음으로써 형질 전환을 행할 수 있다. DNA 구축물의 숙주 염색체에 대한 도입은, 공지된 방법에 따라, 예컨대 상동 재조합 또는 이종 재조합에 의해 행할 수 있다.

곤충 세포를 숙주로서 이용하는 경우에는, 공지된 방법을 이용하여 재조합 유전자 도입 벡터 및 바큘로바이러스를 곤충 세포에 공도입하여 곤충 세포 배양 상청 중에 재조합 바이러스를 얻은 후, 또한 재조합 바이러스를 곤충 세포에 감염시켜, 단백질을 발현시킬 수 있다.

바큘로바이러스로는, 예컨대, 도둑나방과 곤충에 감염하는 바이러스인 오토그라파 캘리포니카 누클리어 폴리헤드로시스 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 등을 이용할 수 있다.

곤충 세포로는, 스포도프테라 프루기페르다( Spodoptera frugiperda )의 난소 세포인 Sf9, Sf21[바큘로바이러스 익스프레션 벡터즈, 어 래버러토리 매뉴얼, 더블유 에이치 프리맨 앤드 컴패니(WH Freeman and Company), 뉴욕(New York),(1992)], 트리코플루시아 니( Trichoplusia ni )의 난소 세포인 HiFive(인비트로젠사 제조) 등을 이용할 수 있다.

재조합 바이러스를 조제하기 위한, 곤충 세포에 대한 재조합 유전자 도입 벡터와 상기 바큘로바이러스의 공도입 방법으로는, 예컨대, 인산칼슘법 또는 리포펙션법 등을 들 수 있다.

상기한 형질 전환체는, 도입된 유전자의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 적절한 영양 배지 중에서 배양한다. 형질 전환체의 배양물로부터, 본 발명에서 이용하는 L-트립토판옥시다아제를 단리 정제하기 위해서는, 통상의 단백질의 단리, 정제법을 이용하면 된다. 예컨대, 본 발명에서 이용하는 L-트립토판옥시다아제가, 세포 내에 용해 상태로 발현된 경우에는, 배양 종료 후, 세포를 원심 분리에 의해 회수하여 수계 완충액에 현탁 후, 초음파 파쇄기 등에 의해 세포를 파쇄하고, 무세포 추출액을 얻는다. 상기 무세포 추출액을 원심 분리함으로써 얻어진 상청으로부터, 통상의 단백질의 단리 정제법, 즉, 용매 추출법, 황산암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기 용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸(DEAE)세파로오스 등의 레진을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-Sepharose FF(파마시아사 제조) 등의 레진을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸세파로오스, 페닐세파로오스 등의 레진을 이용한 소수성 크로마토그래피법, 분자체을 이용한 겔여과법, 어피니티 크로마토그래피법, 크로마토포커싱법, 등전점 전기 영동 등의 전기 영동법 등의 수법을 단독 혹은 조합하여 이용하여, 본 발명의 L-트립토판옥시다아제를 정제 표품으로서 얻을 수 있다.

L-트립토판옥시다아제에 의한 L-트립토판의 산화 반응을 이하의 반응식 A에 나타낸다.

본 발명에서 이용하는 L-트립토판옥시다아제란, 상기 식 A에 나타내는 반응을 촉매하는 효소를 의미하며, 따라서, 그 유래나 아미노산 서열의 차이에 의해 한정되는 경우는 없다.

공정(A)

공정(A)에서의 L-트립토판옥시다아제의 혼합량은, 10 mU/ml(트립토판 1 μmol을 1분간에 소비하는 활성을 1 U로 함) 이상으로 하는 것이 적당하고, 물의 혼합량은, 샘플 중의 Trp 농도 또는 반응계 중의 전질량에 따라 적절하게 결정할 수 있지만, 예컨대, 반응계 중의 전질량의 5∼95%의 범위로 할 수 있고, 몰비로는, 1몰의 Trp에 대하여, 예컨대, 1몰 이상의 물이 존재하면 된다. 효소 반응을 수용액 중에서 행하는 경우에는 과잉량의 물이 반응계 중에 존재하게 된다. L-트립토판옥시다아제의 혼합량의 상한은 특별히 없지만, 실용적으로는, 예컨대, 100 mU/ml 이하일 수 있다. 그러나, L-트립토판옥시다아제의 혼합량 및 물의 혼합량은, 이 범위로 한정하려는 의도는 아니며, 적절하게 조정할 수 있다.

또한, L-트립토판옥시다아제 및 물에 덧붙여, 바람직하게는, L-트립토판옥시다아제의 최적 pH를 고려한 pH를 나타내는 완충액을 포함할 수 있다. 완충액을 이용하는 경우에는, 물은 완충액으로서 공급할 수도 있다. 또한, L-트립토판옥시다아제의 안정화제를 또한 포함할 수도 있다. L-트립토판옥시다아제의 안정화제는, 예컨대, 글리세롤, 수크로오스, 소르비톨 및 트레할로오스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종일 수 있다.

공정(B)

공정(B)에서는, 상기 혼합에 의해 얻어진 반응액을 산소의 존재하에서 소정 시간 방치한다.

L-트립토판옥시다아제에 의한 L-트립토판 산화 반응에 있어서는, 반응식 A에 나타낸 바와 같이, L-트립토판 탈아미노화 생성물인 인돌-3-피루브산과 함께, 암모니아(NH ₃ )와 과산화수소(H ₂ O ₂ )가 생성물로서 얻어진다. 상기 반응을, 예컨대, 공기와 접촉하는 상태로 실시함으로써, 반응액 중의 용존 산소로서 상기 산소는 공급된다. 반응액 중에 산소를 공급할 목적으로 반응액에 공기 등의 산소 함유 기체를 강제적으로 공급할 필요는 통상은 없다. 효소 반응에 필요한 산소량이 미량이고, 용존 산소에 의해 충분히 조달할 수 있기 때문이다. 효소를 위한 방치 시간은, 예컨대, 사용하는 효소량에 따라서도 다르지만, 예컨대, 10분∼1시간의 범위로 할 수 있다. 그러나, 이 범위에 한정하려는 의도는 아니며, 적절하게 조정할 수 있다.

공정(C)

공정(C)에서는, 방치 후의 반응액 중에 존재하는 상기 효소의 작용에 의한 반응 생성물의 적어도 1종의 존재를 확인하거나, 또는 반응 생성물의 적어도 1종의 양을 계측한다.

존재 확인 또는 정량에 이용되는 생성물이 과산화수소인 경우, 예컨대 퍼옥시다아제 반응을 이용하여 측정하는 방법 등의 공지된 방법에 의해, 과산화수소의 존재 확인 또는 정량이 가능하다. 퍼옥시다아제 반응을 이용하여 측정하는 경우, 사용 가능한 퍼옥시다아제는 과산화수소의 존재 확인 또는 정량에 이용 가능한 효소이면 되고, 예컨대 서양 고추냉이 유래 퍼옥시다아제를 들 수 있다. 또한, 사용하는 퍼옥시다아제의 기질이 될 수 있는 것이면 발색제로서 사용 가능하고, 서양 고추냉이 유래 퍼옥시다아제를 이용하는 경우에는 4-아미노안티피린 : 페놀 등을 들 수 있다. 서양 고추냉이 유래 퍼옥시다아제를 이용하는 과산화수소의 존재 확인 또는 정량을 위한 반응은 이하에 나타내는 바와 같다.

2H ₂ O ₂ + 4-아미노안티피린 + 페놀 → 퀴논이민 색소 + 4H ₂ O

4-아미노안티피린 등의 발색제나 형광제는, 사용되는 퍼옥시다아제의 종류에 따라 적절하게 선택하는 것이 가능하다.

L-트립토판옥시다아제 반응의 생성물인 과산화수소는, 과산화수소 전극을 이용한 전류 검출형 센서를 이용하여 측정할 수도 있다. 이 측정에 의해, 과산화수소의 존재 확인 및 정량 모두 가능하다. 과산화수소 전극으로는, 예컨대, 퍼옥시다아제를 소혈청 알부민과 함께 글루타르알데히드에 고정화한 막과 페로센을 카본 페이스트에 함유시킨 것을 전극으로서 이용하는 센서를 들 수 있다.

존재 확인 또는 정량에 이용되는 생성물이 암모니아인 경우에는, 암모니아 검출약을 이용하여 측정할 수 있다. 암모니아 검출약으로는, 예컨대, 페놀과 차아염소산의 조합에 의한 인도페놀법을 들 수 있다. 구체적으로는, 샘플을 페놀·니트로프루시드 용액 및 과염소산 용액과 혼합하여 발색시킴으로써 존재 확인을 할 수 있고, 또한, 이 발색을 635 nm의 흡광도를 측정함으로써, 암모니아 정량이 가능하다.

존재 확인 또는 정량에 이용되는 생성물이 L-트립토판의 탈아미노화 생성물인 인돌피루브산인 경우에는, 2-옥소산 환원 효소를 이용하여, 인돌피루브산의 존재 확인 또는 정량을 행할 수 있다.

<L-트립토판의 분석용 키트>

본 발명은, 이하의 시약을 포함하는 L-트립토판의 분석용 키트를 포함한다.

(K1) L-트립토판옥시다아제

상기 L-트립토판옥시다아제는, 상기 L-트립토판의 정량 방법에서 설명한 L-트립토판옥시다아제와 동일한 것이다. L-트립토판의 분석에는, L-트립토판의 존재 확인 및 정량을 포함한다.

상기 L-트립토판옥시다아제는, 이 L-트립토판옥시다아제의 안정화제와의 혼합물일 수도 있다. 안정화제는, 글리세롤, 수크로오스, 소르비톨 및 트레할로오스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종일 수 있다. 안정화제는, 글리세롤인 것이, 효소에 대한 안정화 효과가 우수하기 때문에 바람직하다.

본 발명의 키트는, (K2) 반응용 완충액, (K3) 과산화수소 검출용 시약, (K4) 암모니아 검출약 및 (K5) 인돌피루브산 검출약의 적어도 하나를 또한 포함할 수 있다.

(K2) 반응용 완충액은, 반응액 안을 정량 등의 반응에 알맞은 pH로 유지하기 위해 이용된다. 후술하는 실시예에 나타내는 L-트립토판옥시다아제는, 최적 pH가 8∼9의 범위이기 때문에, 이 범위의 pH를 갖는 완충액인 것이 바람직하다.

(K3) 과산화수소 검출용 시약은, 과산화수소의 검출을, 예컨대, 발색 혹은 형광에 의해 행하는 경우에 이용한다. 과산화수소 검출용 시약으로는, 예컨대, 퍼옥시다아제와 그 기질이 될 수 있는 발색제의 조합일 수 있다. 구체적으로는, 서양 고추냉이 퍼옥시다아제와 2-아미노안티피린·페놀의 조합을 들 수 있다.

(K4) 암모니아 검출약으로는, 예컨대, 페놀과 차아염소산의 조합에 의한 인도페놀법을 들 수 있다.

(K5) 인돌피루브산 검출약으로는, 예컨대, 2-옥소산 환원 효소를 이용할 수 있다.

<L-트립토판의 분석용 조성물>

본 발명은, L-트립토판옥시다아제를 포함하는 L-트립토판의 분석용 조성물도 포함한다. 이 조성물에 포함되는 L-트립토판옥시다아제는, 상기 L-트립토판의 정량 방법에서 설명한 L-트립토판옥시다아제와 동일한 것이다. L-트립토판의 분석에는, L-트립토판의 존재 확인 및 정량을 포함한다. 본 발명의 분석용 조성물은, 상기 L-트립토판에 덧붙여, 예컨대, 상기 효소의 안정화제, 완충액 또는 완충제 등을 함유할 수 있다.

이 L-트립토판옥시다아제의 안정화제는, 글리세롤, 수크로오스, 소르비톨 및 트레할로오스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종일 수 있다. 안정화제는, 글리세롤인 것이, 효소에 대한 안정화 효과가 우수하기 때문에 바람직하다.

효소와 안정화제의 혼합비는, 예컨대, 효소 100 질량부에 대하여, 10∼70 질량부의 안정화제를 포함하는 것이, 효소를 장기간 안정적으로 보존할 수 있다는 관점에서 바람직하다. 안정화제의 양은, 바람직하게는, 효소 100 질량부에 대하여, 20∼60 질량부의 범위이고, 보다 바람직하게는 30∼50 질량부의 범위이다.

<효소 센서>

본 발명은, L-트립토판옥시다아제를 이용한 L-트립토판의 검출 또는 정량용 효소 센서를 포함한다. 이 효소 센서에 이용하는 L-트립토판옥시다아제는, 상기 L-트립토판의 정량 방법에서 설명한 L-트립토판옥시다아제와 동일한 것이다.

상기 검출용 전극은 과산화수소 검출용 전극이다. 과산화수소 검출용 전극은, 효소식 과산화수소 전극 또는 격막식 과산화수소 전극일 수 있다. L-트립토판옥시다아제가 L-트립토판과 반응함으로써, 과산화수소가 생성되기 때문에, 이 과산화수소를 과산화수소 검출용 전극으로 검출할 수 있다. 효소식 과산화수소 전극으로는, 예컨대, 퍼옥시다아제를 소혈청 알부민과 함께 글루타르알데히드에 고정화한 막과 페로센을 카본 페이스트에 함유시킨 것을 전극으로서 이용하는 센서를 들 수 있다. 격막식 과산화수소 전극은, 격막에 의해 과산화수소와 반응하는 전극이 격리된 타입의 전극이다.

상기 L-트립토판옥시다아제는, L-트립토판의 검출 또는 정량을 보다 고정밀도로 행한다는 관점에서, 검출용 전극의 표면 또는 검출용 전극의 근방에 배치되는 것이 바람직하고, 검출용 전극의 표면에 배치되는 경우에는, 검출용 전극의 표면에 고정화되어도 좋고 고정화되지 않아도 좋다. 검출용 전극의 표면에 고정화됨으로써, 본 발명의 센서를 반복 이용할 수 있는 이점은 있다. 또한, 상기 L-트립토판옥시다아제는, 상기 효소의 안정화제와 함께 검출용 전극의 표면 또는 검출용 전극의 근방에 배치될 수도 있다. 상기 안정화제는, 글리세롤, 수크로오스, 소르비톨 및 트레할로오스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종일 수 있다.

실시예

이하에 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하지만 본 발명은 이것에 한정되는 것은 아니다.

1. L-트립토판옥시다아제의 조제예

크로모박테리움 비올라세움( Chromobacterium violaceum ) NBRC 12614 게놈 DNA를 조제하고, 이것을 주형으로 하여 염기 서열 데이터베이스 상의 각 균의 서열(AF172851.1)을 바탕으로 설계한 서열 번호 5 및 6의 프라이머를 이용하여 PCR을 행하여, L-트립토판옥시다아제 유전자 vioA를 증폭시켰다. 증폭 산물을 pET-28a에 삽입하여, vioA 발현용 플라스미드로 했다. 또한, 스트렙토마이세스 에스피( Streptomyces sp.) TA-A0724의 게놈 단편을 포함하는 코스미드 pTYMCsta(비특허문헌 D)를 StuI 처리한 단편을, HincII로 처리한 벡터 pTYM19(비특허문헌 K)에 삽입하고, L-트립토판옥시다아제 유전자 staO를 서브클로닝했다. Stratagene사 제조의 QuikChange site-directed mutagenesis kit와 서열 번호 7∼10의 프라이머를 이용하여, 상기 서브클로닝 플라스미드의 서열을 개변했다. 이 플라스미드로부터 NdeI 및 HindIII 처리에 의해 staO 유전자를 잘라내고, 동제한 효소로 처리한 pET-26b에 삽입하여, staO 발현용 플라스미드로 했다. 또, 각 효소의 N 말단 또는 C 말단에 His-tag가 부가되도록 프라이머 설계를 행했다. 각 발현용 플라스미드로 대장균 BL21(DE3)주를 형질 전환하여, VioA 혹은 StaO 이종 발현주로 했다. 프라이머의 염기 서열은 이하와 같다.

VioA-F : ATTCTAGACATATGAAGCATTCTTCCGATATCTG(서열 번호 5)

VioA-R : AATAAGCTTCGCGGCGATGCGCTG(서열 번호 6)

StaO-N-sense : TACTGGAGGAAACATATGACGGCACCC(서열 번호 7)

StaO-N-anti : CAAGGGTGCCGTCATATGTTTCCTCCA(서열 번호 8)

StaO-C-sense : GACCGGTCGGCGAAGCTTTCTTCGACCTG(서열 번호 9)

StaO-C-anti : GCAGGTCGAAGAAAGCTTCGCCGACCGGT(서열 번호 10)

각 이종 발현주를 37℃의 진탕 배양으로 OD ₆₀₀ 이 0.6∼0.8에 도달할 때까지 배양하고, IPTG를 종농도 0.5 mM이 되도록 첨가함으로써 발현 유도를 가했다. 발현유도 후의 배양은 16℃에서 16시간 행하고, 가용성 분획에 목적 효소가 얻어졌다. 또한 StaO에 관해서는, Takara사 제조의 샤페론 플라스미드 pG-KJE8을 공발현시키자 수량이 더욱 향상되었다.

각 발현주 파쇄액 상청을 GE 헬스케어사 제조의 Ni Sepharose 컬럼에 로드하고, 20 mM Tris-HCl, 50 mM 이미다졸(pH 8.0) 용액으로 세정 후, 20 mM Tris-HCl, 500 mM 이미다졸(pH 8.0) 용액으로 용출시킴으로써 목적 효소를 정제·회수했다. 이들 효소의 염기 서열을 결정하여, 서열 번호 3 및 4에 나타낸다. 또한 효소의 아미노산 서열을 서열 번호 1 및 2에 나타낸다.

2. L-트립토판옥시다아제의 활성 측정 조건예

20 mM 트리스-염산 버퍼(pH 8.0), 5 mM L-트립토판, 1 mM 페놀, 1 mM 4-아미노안티피린, 15 U/ml 서양 고추냉이 유래 퍼옥시다아제, 및 임의의 양의 L-트립토판옥시다아제 효소액을 포함하는 반응액을 조제하고, 30℃에서의 505 nm의 흡광도 변화를 측정한다. 퀴논이민 색소의 몰 흡광 계수는 6.4 mM ^-1 ·cm ^-1 로 한다. 1분간에 1 μmol의 과산화수소를 생성하는 활성을 1 U로 정의한다. 본 법의 검출 한계는 0.5%이다.

3. 활성의 pH 의존성

인산칼륨 버퍼(pH 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5) 및 트리스-염산 버퍼(pH 8.0, 8.5, 9.0)를 버퍼로서 이용하여, 각 버퍼 사용시의 StaO의 활성 측정을 행했다. 20 mM의 상기 중 어느 버퍼, 5 mM L-트립토판, 1 mM 페놀, 1 mM 4-아미노안티피린, 15 U/ml 서양 고추냉이 유래 퍼옥시다아제, 및 StaO 효소액을 포함하는 반응액을 조제하고, 30℃에서의 505 nm의 흡광도 변화를 측정했다. 그 결과, StaO의 효소 활성은 pH 8.0-9.0에서 최대가 되는 것이 밝혀졌다. 또한, VioA의 최적 pH는 비특허문헌 C에 9.25인 것이 보고되어 있다.

4. L-트립토판옥시다아제의 아미노산에 대한 기질 특이성

20 mM 트리스-염산 버퍼(pH 8.0), 1 mM 페놀, 1 mM 4-아미노안티피린, 15 U/ml 서양 고추냉이 유래 퍼옥시다아제, 0.2∼20 mU/ml L-트립토판옥시다아제와 0.5 mM의 아미노산(20종류의 단백 구성 아미노산 중 어느 1종)을 포함하는 반응액을 조제하고, 30℃에서의 505 nm의 흡광도 변화를 측정했다. 얻어진 측정치로부터 각 아미노산과의 상대 활성을 산출하여, 표 1과 같은 결과가 되었다. 본 법의 검출 한계는 0.5%이다.

StaO는 L-트립토판 이외의 아미노산과는 반응성을 나타내지 않고(상대 활성은 검출 한계 이하였음), L-페닐알라닌에 대해서만, L-트립토판의 0.5%∼1%라는 극히 낮은 상대 활성이 검출되었다. 또한 VioA에 관해서는 L-트립토판 이외의 아미노산에 대한 반응성은 검출되지 않았다(상대 활성은 검출 한계 이하였음). 이상과 같이, StaO와 VioA 어느 것에 관해서도, L-트립토판에 대하여 매우 높은 기질 특이성을 갖고 있는 것이 밝혀졌다.

5. L-트립토판옥시다아제의 L-트립토판에 대한 Km값

20 mM 트리스-염산 버퍼(pH 8.0), 1 mM 페놀, 1 mM 4-아미노안티피린, 15 U/ml 서양 고추냉이 유래 퍼옥시다아제, 0.5 mU/ml L-트립토판옥시다아제와, 0, 6.3, 13, 25, 50, 100, 500 μM의 L-트립토판을 포함하는 반응액을 조제하고, 30℃에서의 505 nm의 흡광도 변화를 측정했다.

각 L-트립토판 농도에서 산출된 StaO의 활성을 도 1에 나타낸다. 이 결과로부터, StaO의 L-트립토판에 대한 Km값은 19 μM로 산출되었다. 또한 VioA의 Km값에 관해서는, 30 μM인 것으로 보고되어 있다(비특허문헌 C). 이들 값은, 코프리누스종( Coprinus sp.) 유래의 L-아미노산옥시다아제의 값(650 μM)과 비교하여 매우 낮고, 또한 일반적으로 아미노산 정량용으로 이용되고 있는 효소의 기질에 대한 Km값과 비교해도 동등 이하로 낮은 값이다. 이것은, StaO 및 VioA는 L-트립토판 농도가 낮은 샘플에 있어서도 정량용 효소로서 우수한 성질을 갖는 것을 나타내고 있다.

6. L-트립토판의 검량선의 작성

40 mM 트리스-염산 버퍼(pH 8.0), 2 mM 페놀, 2 mM 4-아미노안티피린, 30 U/ml 서양 고추냉이 유래 퍼옥시다아제, 20 mU/ml L-트립토판옥시다아제 효소액을 포함하는 반응액을 조제했다. 이것과 등량의 0, 20, 40, 60, 80, 100 μM의 L-트립토판 수용액을 표준 시료로서 혼합했다. 30℃에서 반응을 진행시키고, 30℃에서의 505 nm의 흡광도의 시간 경과적 변화를 측정하여, 반응의 진행을 모니터링했다.

상술한 바와 같이 제작한 샘플의 측정 결과를 도 2∼5에 도시한다. StaO, VioA 어느 것을 이용한 경우에도, 늦어도 반응 개시 20분 후 이후에는 L-트립토판 농도와 흡광도 사이에 양호한 직선 관계가 보이고, 본 반응계에서 검량선이 작성 가능한 것이 밝혀졌다. 또한 특히 StaO 샘플에 관해서는, 반응 시간을 지나치게 길게 한 경우에도 흡광도 상승은 거의 멈춘다는 변화를 나타냈다. 이러한 성질은, 가령 반응 시간이 변동되었다 하더라도 오차가 생기기 어려운, 정량용 효소로서 알맞은 성질이라고 할 수 있다.

7. 인간 혈장 샘플 중의 L-트립토판 정량

7-1. 인간 혈장 시료의 전처리

인간 혈장 시료는 코진바이오로부터 구입하여, -20℃에서 보관하고 있었던 3검체를 이용했다. 각각 사용 직전에 해동하고, 그대로, 혹은 Microcon YM-10으로 한외여과에 의한 제(除)단백 처리 후에, 하기의 L-트립토판 정량에 제공했다.

7-2. 기기 분석에 의한 인간 혈장 시료 중 L-트립토판의 정량

효소법에 의한 정량의 비교 대상으로서, 초고속 아미노산 분석 시스템을 이용한 프리컬럼 유도체화법에 의한 정량을 행했다. 상술한 바와 같이 인간 혈장 시료를 제단백질 처리한 것을 초고속 아미노산 분석 시스템 Waters UPLC Amino Acid Analysis Solution system에 제공했다. 샘플의 유도체화, 분석 조작 등은 상기 시스템 설명서의 순서에 따랐다. 0, 20, 40, 60, 80, 100 μM의 L-트립토판 수용액을 표준 시료로 하여 검량선을 제작하고, 혈장 시료 중 L-트립토판의 정량을 행했다.

7-3. L-트립토판옥시다아제에 의한 인간 혈장 시료 중 L-트립토판의 정량

40 mM 트리스-염산 버퍼(pH 8.0), 2 mM 페놀, 2 mM 4-아미노안티피린, 30 U/ml 서양 고추냉이 유래 퍼옥시다아제, 20 mU/ml L-트립토판옥시다아제 효소액을 포함하는 반응액을 조제했다. 이것과 등량의 0, 20, 40, 60, 80, 100 μM의 L-트립토판 수용액, 혹은 제단백 처리 전후의 인간 혈장 시료를 혼합했다. 30℃에서 반응을 진행시키고, 30분 후에 505 nm의 흡광도를 측정했다. L-트립토판 수용액 샘플의 측정치로부터 검량선을 제작하고, 혈장 시료 중 L-트립토판의 정량을 행했다.

7-4. 기기 분석 혹은 L-트립토판옥시다아제에 의한 인간 혈장 시료의 정량 결과의 비교

상기한 측정 결과를 도 6에 도시한다. StaO, VioA 어느 효소를 사용한 정량계에서도, 기기 분석에 의한 측정치에 가까운 값이 얻어졌다. 따라서 L-트립토판옥시다아제에 의한 정량법이 인간 혈장 시료에 있어서도 유효하다는 것이 뒷받침되었다.

일반적인 효소법에 의한 생체 시료의 분석에서는, 미리 제단백질 처리를 행하지 않으면 정량성이 저해된다는 예가 많다. 이 경우, 생체 시료의 전처리로서 제단백 처리가 필요해진다. 한편 StaO, VioA는 모두, 제단백질 처리 미처리의 시료라도 정량성에 영향은 보이지 않았다. 따라서, 상기 효소에 의한 정량법에는 시료의 전처리가 불필요하고, 효소법으로서도 특히 간편하고 또한 정확한 정량법인 것을 알 수 있었다.

8. 안정성

StaO, VioA 정제 효소액에 종농도 0∼50%(v/v)가 되도록 글리세롤을 첨가했다. 각 효소액을 4℃에서 보존하고, 시간 경과적으로 샘플링하여 활성 측정을 행했다. 각종 글리세롤 농도 존재하에서의 StaO 또는 VioA의 잔존 활성의 시간 경과적 변화를 도 7과 도 8에 도시한다. StaO에 관해서는, 버퍼만을 포함하는 용액 중에서는 불안정하지만, 30% 이상의 글리세롤 첨가 조건에서 높은 안정성을 나타냈다. VioA는 글리세롤 비첨가에서도 비교적 안정적이지만, 10% 이상의 글리세롤을 첨가하자 그 안정성은 더욱 높아졌다.

VioA 정제 효소액에 종농도 0 또는 10%(v/v)가 되도록 글리세롤을 첨가했다. 각 효소액을 4℃ 또는 -80℃에서 하룻밤 보존한 후, 활성 측정을 행했다. 10% 글리세롤 존재하 또는 비존재하에서의 VioA 효소액의 잔존 활성을 도 9에 도시한다. VioA의 동결 융해시에는 실활이 보였지만, 10% 글리세롤의 첨가에 의해 그와 같은 실활은 보이지 않게 되었다.

이상과 같이, StaO는 글리세롤 30% 첨가, VioA는 비첨가(동결 융해를 행할 때에는 10% 첨가)로 안정적인 효소액으로서 사용 가능한 것이 밝혀졌다.

9. 반응 온도 의존성

반응 온도 20, 30, 40, 50, 60℃에서의 StaO, VioA의 활성 측정을 행했다. 20 mM 트리스-염산 버퍼(pH 8.0), 1 mM L-트립토판, 1 mM 페놀, 1 mM 4-아미노안티피린, 15 U/ml 서양 고추냉이 유래 퍼옥시다아제, 및 L-트립토판옥시다아제 효소액을 조성으로 하는 활성 측정 반응액을 이용했다. 상기 반응액 중 퍼옥시다아제와 L-트립토판옥시다아제 효소액 이외를 혼합하고, 상기 각종 온도에서 10분간 프리인큐베이션을 행했다. 상기 반응액의 온도를 유지한 채로 퍼옥시다아제와 L-트립토판옥시다아제 효소액을 첨가하여 반응을 개시시키고, 신속하게 505 nm의 흡광도 변화를 측정했다. 측정 결과로부터 산출한, 각 온도에서의 StaO, VioA의 상대 활성치를 표 2에 나타낸다. 양효소 모두, 반응 온도의 상승과 함께 활성의 상승이 보였다. 또, StaO에서는 60℃, VioA에서는 50℃ 이상에서, 고온에 의한 실활의 영향이 현저해져 정확한 활성 측정이 곤란해졌다.

10. 열안정성

20% 글리세롤을 포함한 StaO 효소액, 및 10% 글리세롤을 포함한 VioA 효소액을 30, 40, 50, 60, 70℃에서 1시간 열처리한 후, 활성 측정을 행했다. 열처리 후의 각 효소액의 잔존 활성을 표 3에 나타낸다. 어느 효소도 40℃ 이상의 열처리에서는 현저한 열 실활이 보이고, 50℃ 이상의 열처리에서는 잔존 활성이 검출 한계 이하가 되었다.

L-트립토판은, 필수 아미노산으로, 극단적으로 부족한 경우, 나이아신 결핍 증상을 나타내는 것이 풍토병 펠라그라로서 알려져 있다. 또한, 지나치게 섭취한 경우, 호산구 증가나 근육통 증후군의 원인이 될 가능성이 지적되었다. 이 때문에, L-트립토판의 정량은, 식품 분석, 의약품·서플리먼트의 품질 관리, 과잉증·결핍증시의 혈액 검사 및 효소 센서로서 이용을 생각할 수 있다. 또한, 대사 경로상, 나이아신이나 NAD 등 생체 내에서 중요한 기능을 갖는 물질의 원재료가 되는 점에서, 아미노그램에 의한 질병 진단 「아미노 인덱스」에 있어서도 여러가지 질병의 바이오 마커를 구성하는 수치의 하나로서 활용할 수 있다. 이러한 이유로부터, 식품이나 생체 시료 등에 관해 L-트립토판량을 측정하는 것은, 산업적으로도 의학적으로도 중요한 기술이 될 것으로 생각되지만, 현상황에서는, 고속 액체 크로마토그래피를 비롯한 매우 고가의 기기 및 시약이 필요한 방법밖에 실용화되어 있지 않다. 따라서, 본 발명은, L-트립토판 정량용 키트나 효소 센서 등의 형태로 상품화가 가능하고, 저렴하며 또한 간편한 L-트립토판 정량법으로서 사업화할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Toyama Prefecture <120> Determination of L-Tryptophan in Biological Sample and Kit for use to the Same <130> 125045H <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 418 <212> PRT <213> Chromobacterium violaceum <400> 1 Met Lys His Ser Ser Asp Ile Cys Ile Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly 1 5 10 15 Leu Thr Cys Ala Ser His Leu Leu Asp Ser Pro Ala Cys Arg Gly Leu 20 25 30 Ser Leu Arg Ile Phe Asp Met Gln Gln Glu Ala Gly Gly Arg Ile Arg 35 40 45 Ser Lys Met Leu Asp Gly Lys Ala Ser Ile Glu Leu Gly Ala Gly Arg 50 55 60 Tyr Ser Pro Gln Leu His Pro His Phe Gln Ser Ala Met Gln His Tyr 65 70 75 80 Ser Gln Lys Ser Glu Val Tyr Pro Phe Thr Gln Leu Lys Phe Lys Ser 85 90 95 His Val Gln Gln Lys Leu Lys Arg Ala Met Asn Glu Leu Ser Pro Arg 100 105 110 Leu Lys Glu His Gly Lys Glu Ser Phe Leu Gln Phe Val Ser Arg Tyr 115 120 125 Gln Gly His Asp Ser Ala Val Gly Met Ile Arg Ser Met Gly Tyr Asp 130 135 140 Ala Leu Phe Leu Pro Asp Ile Ser Ala Glu Met Ala Tyr Asp Ile Val 145 150 155 160 Gly Ly s His Pro Glu Ile Gln Ser Val Thr Asp Asn Asp Ala Asn Gln 165 170 175 Trp Phe Ala Ala Glu Thr Gly Phe Ala Gly Leu Ile Gln Gly Ile Lys 180 185 190 Ala Lys Val Lys Ala Ala Gly Ala Arg Phe Ser Leu Gly Tyr Arg Leu 195 200 205 Leu Ser Val Arg Thr Asp Gly Asp Gly Tyr Leu Leu Gln Leu Ala Gly 210 215 220 Asp Asp Gly Trp Lys Leu Glu His Arg Thr Arg His Leu Ile Leu Ala 225 230 235 240 Ile Pro Pro Ser Ala Met Ala Gly Leu Asn Val Asp Phe Pro Glu Ala 245 250 255 Trp Ser Gly Ala Arg Tyr Gly Ser Leu Pro Leu Phe Lys Gly Phe Leu 260 265 270 Thr Tyr Gly Glu Pro Trp Trp Leu Asp Tyr Lys Leu Asp Asp Gln Val 275 280 285 Leu Ile Val Asp Asn Pro Leu Arg Lys Ile Tyr Phe Lys Gly Asp Lys 290 295 300 Tyr Leu Phe Phe Tyr Thr Asp Ser Glu Met Ala Asn Tyr Trp Arg Gly 305 310 315 320 Cys Val Ala Glu Gly Glu Asp Gly Tyr Leu Glu Gln Ile Arg Thr His 325 330 335 Leu Ala Ser Ala Leu Gly Ile Ala Arg Glu Arg Ile Pro Gln Pro Leu 340 345 350 Ala His Val His Lys Tyr Trp Ala His Gly Val Glu Phe Cys Arg Asp 355 360 365 Ser Asp Il e Asp His Pro Ser Ala Leu Ser His Arg Asp Ser Gly Ile 370 375 380 Ile Ala Cys Ser Asp Ala Tyr Thr Glu His Cys Gly Trp Met Glu Gly 385 390 395 400 Gly Leu Leu Ser Ala Arg Glu Ala Ser Arg Leu Leu Leu Gln Arg Ile 405 410 415 Ala Ala <210> 2 <211> 504 <212> PRT <213> Streptomyces sp. TP-A0274 <400> 2 Met Thr Ala Pro Leu Gln Asp Ser Asp Gly Pro Asp Asp Ala Ile Gly 1 5 10 15 Gly Pro Lys Gln Val Thr Val Ile Gly Ala Gly Ile Ala Gly Leu Val 20 25 30 Thr Ala Tyr Glu Leu Glu Arg Leu Gly His His Val Gln Ile Ile Glu 35 40 45 Gly Ser Asp Asp Ile Gly Gly Arg Ile His Thr His Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ala Gly Gly Pro Gly Pro Phe Ala Glu Met Gly Ala Met Arg Ile Pro 65 70 75 80 Ala Gly His Arg Leu Thr Met His Tyr Ile Ala Glu Leu Gly Leu Gln 85 90 95 Asn Gln Val Arg Glu Phe Arg Thr Leu Phe Ser Asp Asp Ala Ala Tyr 100 105 110 Leu Pro Ser Ser Ala Gly Tyr Leu Arg Val Arg Glu Ala His Asp Thr 115 120 125 Leu Val Asp Glu Phe Ala Thr Gly Leu Pro Ser Ala His Tyr Arg Gln 130 135 140 Asp Thr Leu Leu Phe Gly Ala Trp Leu Asp Ala Ser Ile Arg Ala Ile 145 150 155 160 Ala Pro Arg Gln Phe Tyr Asp Gly Leu His Asn Asp Ile Gly Val Glu 165 170 175 Leu Leu Asn Leu Val Asp Asp Ile Asp Leu Thr Pro Tyr Arg Cys Gly 180 185 190 Thr Ala Arg Asn Arg Ile Asp Leu His Ala Leu Phe Ala Asp His Pro 195 200 205 Arg V al Arg Ala Ser Cys Pro Pro Arg Leu Glu Arg Phe Leu Asp Asp 210 215 220 Val Leu Asp Glu Thr Ser Ser Ser Ile Val Arg Leu Lys Asp Gly Met 225 230 235 240 Asp Glu Leu Pro Arg Arg Leu Ala Ser Arg Ile Arg Gly Lys Ile Ser 245 250 255 Leu Gly Gln Glu Val Thr Gly Ile Asp Val His Asp Asp Thr Val Thr 260 265 270 Leu Thr Val Arg Gln Gly Leu Arg Thr Val Thr Arg Thr Cys Asp Tyr 275 280 285 Val Val Cys Thr Ile Pro Phe Thr Val Leu Arg Thr Leu Arg Leu Thr 290 295 300 Gly Phe Asp Gln Asp Lys Leu Asp Ile Val His Glu Thr Lys Tyr Trp 305 310 315 320 Pro Ala Thr Lys Ile Ala Phe His Cys Arg Glu Pro Phe Trp Glu Lys 325 330 335 Asp Gly Ile Ser Gly Gly Ala Ser Phe Thr Gly Gly His Val Arg Gln 340 345 350 Thr Tyr Tyr Pro Pro Ala Glu Gly Asp Pro Ala Leu Gly Ala Val Leu 355 360 365 Leu Ala Ser Tyr Thr Ile Gly Pro Asp Ala Glu Ala Leu Ala Arg Met 370 375 380 Asp Glu Ala Glu Arg Asp Ala Leu Val Ala Lys Glu Leu Ser Val Met 385 390 395 400 His Pro Glu Leu Arg Arg Pro Gly Met Val Leu Ala Val Ala Gly Arg 405 410 415 Asp T rp Gly Ala Arg Arg Trp Ser Arg Gly Ala Ala Thr Val Arg Trp 420 425 430 Gly Gln Glu Ala Ala Leu Arg Glu Ala Glu Arg Arg Glu Cys Ala Arg 435 440 445 Pro Gln Lys Gly Leu Phe Phe Ala Gly Glu His Cys Ser Ser Lys Pro 450 455 460 Ala Trp Ile Glu Gly Ala Ile Glu Ser Ala Ile Asp Ala Ala His Glu 465 470 475 480 Ile Glu Trp Tyr Glu Pro Arg Ala Ser Arg Val Phe Ala Ala Ser Arg 485 490 495 Leu Ser Arg Ser Asp Arg Ser Ala 500 <210> 3 <211> 1257 <212> DNA <213> Chromobacterium violaceum <400> 3 atgaagcatt cttccgatat ctgcattgtc ggcgccggca tcagcggcct gacctgcgcc 60 agccatctgc tcgattcgcc cgcttgccgc ggcctgtcgc tgcgcatctt cgacatgcag 120 caggaggcgg gcggccgcat ccgctcgaag atgctggatg gcaaggcttc gatagagctg 180 ggcgcggggc gatactcccc gcagctgcac ccgcatttcc agagcgcgat gcagcattac 240 agccagaaga gcgaggtgta tccgttcacc cagttgaaat tcaagagcca tgtccagcag 300 aagctgaagc gggcgatgaa cgagttgtcg cccaggctga aagagcatgg caaggaatcc 360 tttctccagt tcgtcagccg ctaccagggc catgacagcg cggtgggcat gatccgctcc 420 atgggctacg acgcgctgtt cctgc ccgac atctcggccg agatggccta cgacatcgtc 480 ggcaagcacc cggaaatcca gagcgtgacc gataacgacg ccaaccagtg gttcgcggcg 540 gaaacgggct ttgcgggcct gatccagggc atcaaggcca aggtcaaggc tgccggcgcg 600 cgcttcagcc tgggttaccg gctgctgtcg gtgaggacgg acggcgacgg ctacctgctg 660 caactggccg gcgacgacgg ctggaagctg gaacaccgga cccgccacct gatcctggcc 720 atccctccgt cggcgatggc cgggctcaat gtcgacttcc ccgaggcgtg gagcggcgcg 780 cgctacggct cgctgccgct gttcaagggt ttcctcacct acggcgagcc ctggtggctg 840 gactacaagc tggacgacca ggtgctgatc gtcgacaacc cgctgcgcaa gatctacttc 900 aagggcgaca agtacctgtt cttctacacc gacagcgaga tggccaatta ctggcgcggc 960 tgcgtggccg aaggcgagga cggctacctg gagcagatcc gcacccatct ggccagcgcg 1020 ctgggcatcg cccgcgagcg cattccccag cccctcgccc atgtgcacaa gtattgggcg 1080 catggcgtgg agttctgccg cgacagcgat atcgaccatc cgtccgcgct cagccaccgc 1140 gacagcggca tcatcgcctg ttcggacgcc tacaccgagc actgcggctg gatggagggc 1200 ggcctgctca gcgcccgcga agccagccgt ctgctgctgc agcgcatcgc cgcgtga 1257 <210> 4 <211> 1515 <212> DNA <213> Streptomyc es sp. TP-A0274 <400> 4 gtgacggcac ccttgcagga cagtgacggg ccggacgacg ccatcggtgg accgaagcag 60 gtcaccgtca tcggcgccgg tatcgccggc ctggtgacgg cctatgaact ggaacgcctc 120 ggacatcacg tgcagatcat cgaaggcagt gacgacatag gcggccgcat tcacacccac 180 cgcttctccg gtgccggtgg gcccggcccg ttcgccgaga tgggggccat gcggatcccc 240 gccggacacc ggctgaccat gcactacatc gccgaactcg gactgcagaa ccaggtacgg 300 gaattccgga cgctgttctc cgacgacgcc gcctatctgc cgagttccgc cggatatctc 360 cgggtgcgcg aggcgcacga cacgctggtc gacgaattcg ccaccggact gccgagcgcg 420 cactaccgcc aggacaccct gttgttcggt gcctggctgg atgccagcat ccgggccatc 480 gccccacgcc agttctacga cggactgcac aacgacatcg gtgtcgaact gctgaatctc 540 gtggacgaca tcgatctgac gccctatcgc tgcggcaccg cccgcaacag gatcgatctg 600 cacgccctgt tcgccgacca tccccgtgta cgggcgtcct gcccaccccg gctcgaacgc 660 ttcctcgacg acgtgctgga cgagaccagc tccagcatcg tgcggctcaa ggacggcatg 720 gacgaactgc cccgccggct cgcctcccgt atccggggga agatctccct gggccaggag 780 gtcaccggca tcgacgtgca cgacgacacc gtgaccctga ccgtccgaca gggcctcagg 840 acgg tcacca gaacgtgcga ctacgtggtg tgcaccatcc cgttcacggt cctgaggacg 900 ttgcggctca ccggcttcga ccaggacaag ctcgacatcg tccacgagac caagtactgg 960 ccggcgacga agatcgcctt ccactgccgg gagcccttct gggagaagga cggcatcagc 1020 gggggcgcct ccttcaccgg cggccatgtc cggcagacct actacccgcc cgccgagggc 1080 gaccccgccc tcggcgcggt cctcctcgcc agctacacca tcggcccgga cgccgaggcc 1140 ctggcccgga tggacgaggc cgagcgcgac gccctcgtgg ccaaggaact cagcgtgatg 1200 caccccgagt tgcgcaggcc cggcatggtc ctcgcagtcg cgggccggga ctggggcgcc 1260 cgccgatggt cccggggcgc cgccaccgtc cgctggggcc aggaggccgc cctccgggag 1320 gccgagcgcc gtgagtgcgc acgaccgcag aagggcctgt tcttcgccgg cgagcactgc 1380 tcgtccaagc cggcctggat cgagggggcc atcgagtccg cgatcgacgc cgcgcacgag 1440 atcgagtggt acgagccgcg cgccagccgc gtcttcgccg cctcccgcct cagccgctcg 1500 gaccggtcgg cgtga 1515 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VioA-F primer <400> 5 attctagaca tatgaagcat tcttccgata tctg 34 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VioA-R pri mer <400> 6 aataagcttc gcggcgatgc gctg 24 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> StaO-N-sense primer <400> 7 tactggagga aacatatgac ggcaccc 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> StaO-N-anti primer <400> 8 caagggtgcc gtcatatgtt tcctcca 27 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> StaO-C-sense primer <400> 9 gaccggtcgg cgaagctttc ttcgacctg 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> StaO-C-anti primer <400> 10 gcaggtcgaa gaaagcttcg ccgaccggt 29