프로토포르피리노겐 옥시다아제를 이용한 식물 및/또는 조류의 제초제 저항성 부여 또는 증진 방법 |
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| 申请号 | KR1020160169920 | 申请日 | 2016-12-13 | 公开(公告)号 | KR1020160146629A | 公开(公告)日 | 2016-12-21 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 申请人 | 주식회사 팜한농; | 发明人 | 성순기; 윤준선; 한윤정; | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 摘要 | 원핵생물에서유래한프로토포르피리노겐옥시다아제(Protoporphyrinogen oxidase)를이용하여식물및/또는조류(algae)의제초제에대한저항성을부여및/또는증진시키는발명이제공된다. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 权利要求 | 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 98% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 식물 또는 조류(algae)의 제초제에 대한 저항성 부여 또는 증진용 조성물. 제1항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열 또는 이와 98% 이상의 상동성을 가지는 염기서열로 이루어지는 유전자인 조성물. 제1항에 있어서, 상기 유전자는 식물 또는 조류 발현용 재조합 벡터 형태로 포함된 것인 조성물. 제1항에 있어서, 상기 제초제는 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제인 조성물. 제4항에 있어서, 상기 제초제는 피리미딘디온계(Pyrimidinediones), 디페닐에테르계(Diphenyl-ethers), 페닐피라졸계(Phenylpyrazoles), 페닐프탈이미드계(N-Phenylphthalimides), 티아디아졸계(Thiadiazoles), 옥사디아졸계(Oxadiazoles), 트리아졸리논계(Triazolinones), 옥사졸리딘디온계(Oxazolidinediones) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 조성물. 제4항에 있어서, 상기 제초제는 부타페나실(Butafenacil), 사플루페나실(Saflufenacil), 벤즈펜디존(Benzfendizone), 티아페나실(Tiafenacil), 포메사펜(Fomesafen), 옥시플루오르펜(Oxyfluorfen), 아클로니펜(Aclonifen), 아시플루오르펜 (Acifluorfen), 비페녹스(Bifenox), 에톡시펜(Ethoxyfen), 락토펜(Lactofen), 클로메톡시펜(Chlomethoxyfen), 클로인트로펜(Chlorintrofen), 플루오로글리코펜-에틸(Fluoroglycofen-ethyl), 할로사펜(Halosafen), 피라플루펜-에틸(Pyraflufen-ethyl), 플루아졸레이트(Fluazolate), 플루미옥사진 (Flumioxazin), 시니돈-에틸(Cinidon-ethyl), 플루미클로락-펜틸(Flumiclorac-pentyl), 플루티아셋(Fluthiacet), 티디아지민(Thidiazimin), 옥사디아길(Oxadiargyl), 옥사디아존(Oxadiazon), 카펜트라존(Carfentrazone), 설펜트라존(Sulfentrazone), 아자페니딘(Azafenidin), 펜톡사존(Pentoxazone), 피라클로닐(Pyraclonil), 플루펜피르-에틸(Flufenpy r-ethyl), 프로플루아졸(Profluazol) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 조성물. 제1항에 있어서, 상기 식물이 단자엽 식물, 쌍자엽 식물, 초본 또는 목본 식물인 조성물. 제1항에 있어서, 상기 식물 또는 조류는 제2의 제초제 저항성 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자를 더욱 포함하며 상기 제2의 제초제에 대한 저항성이 부여 또는 증진된 것인, 조성물. 제8항에 있어서, 상기 제2의 제초제는 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트(glufosinate), 디캄바(dicamba), 2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid), 이속사플루톨(Isoxaflutole), ALS(acetolactate synthase) 저해성 제초제, 제2광계(photosystem II) 저해성 제초제, 페닐우레아(phenylure)계 제초제, 브로모시닐(bromoxynil)계 제초제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 조성물. 제8항에 있어서, 상기 제2의 제초제 저항성 폴리펩티드는 글리포세이트(glyphosate) 제초제 저항성 EPSPS(glyphosate resistant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase), GOX(glyphosate oxidase), GAT (glyphosate-N-acetyltransferase) 또는 글리포세이트 디카복실레이즈(glyphosate decarboxylase); 글루포시네이트(glufosinate) 제초제 저항성 PAT(phosphinothricin-N-acetyltransferase); 디캄바(dicamba) 제초제 저항성 DMO(monooxygenase); 2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) 제초제 저항성 2,4-D 모노옥시게나아제 또는 AAD(Aryloxyalkanoate Dioxygenase); ALS(acetolactate synthase) 저해성 설포닐우레아계 제초제 저항성 AHAS(acetohydroxyacid synthase), AHAS(Acetohydroxyacid synthase) 또는 Atahasl(Acetohydroxyacid synthase large subnit); 제2광계(photosystem II) 저해성 제초제 저항성 광계 II(photosystem II) 단백질 D1; 페닐우레아(phenylurea) 제초제 저항성 시토크롬 P450(Cytochrome P450); 색소체 저해성 제초제 저항성 HPPD(Hydorxylphenylpyruvate dioxygenase); 브로모시닐(bromoxynil) 제초제 저항성 니트릴레이즈 (Nitrilase); 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 조성물. 제8항에 있어서, 상기 제2의 제초제 저항성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 글리포세이트(glyphosate) 제초제 저항성 cp4 epsps, mepsps, 2mepsps, goxv247, gat4601 또는 gat4621 유전자; 글루포시네이트(glufosinate) 제초제 저항성 BAR 또는 pat 유전자; 디캄바(dicamba) 제초제 저항성 dmo 유전자; 2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) 제초제 저항성 AAD-1 또는 AAD-12유전자; 이속사플루톨 제초제 저항성 HPPDPF W336 유전자; 설포닐 유레아 제초제 저항성 ALS, Csr1, Csr1-1, Csr1-2, GM-HRA, S4-HRA, Zm-HRA, SurA 또는 SurB; 제2광계(photosystem II) 저해성 제초제 저항성 psbA 유전자; 페닐우레아(phenylure) 제초제 저항성 CYP76B1 유전자; 브로모시닐(bromoxynil) 제초제 저항성 bxn 유전자; 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 조성물. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드 또는 유전자를 포함하는, 제초제에 대한 저항성을 가지는 형질전환체. 제12항에 있어서, 상기 형질전환체는 조류, 식물세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물인, 형질전환체. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드 또는 유전자를 조류,식물세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물에 형질전환하는 단계를 포함하는, 제초제에 대한 저항성을 가지는 식물 또는 조류를 제조하는 방법. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드 또는 유전자를 조류, 식물세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물에 형질전환하는 단계를 포함하는, 식물 또는 조류의 제초제에 대한 저항성을 부여 또는 증진시키는 방법. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드 또는 유전자를 포함하는 식물을 재배지에 제공하는 단계, 및 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는, 재배지에서 잡초를 방제하는 방법. 제16항에 있어서, 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계는, 2종 이상의 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 것인, 방법. 제16항에 있어서, 상기 식물은 제2의 제초제 저항성 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자를 더욱 포함하는 것이고, 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제 및 제2의 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 것인, 방법. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드 또는 유전자를 포함하는 조류를 배양 배지에 제공하는 단계, 및 상기 배양 배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는, 배양 배지에서 원하지 않는 수생 생물을 제거하는 방법. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 98% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 폴리펩티드 또는 유전자를 추가로 포함하는, 조성물. 제20항에 기재된 폴리펩티드 또는 유전자를 포함하는, 제초제에 대한 저항성을 가지는 형질전환체. |
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| 说明书全文 |
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| 균주 | 프라이머 | 서열 | 서열번호 |
| Oscillatoria nigro-viridis PCC 7112 | PCC7112_BmHIF | ccccggatccATGGAACTATTAGATACCTTGATTGTGGG | 18 |
| PCC7112_StuIR | cccaggcctGATCGATCGAGTATCTGATTG | 19 | |
| Halothece sp. PCC 7418 | PCC7418_BmHIF | ccccggatccATGATAGATACTTTAATTGTGGG | 20 |
| PCC7418_XhoIR | ccccctcgagACCCAAATAATCTAACACGG | 21 | |
| Lyngbya sp. PCC 8106 | PCC8106_BglIIF | ccccagatctATGACTCACGTACTCGATAG | 22 |
| PCC8106_XhoIR | ccccctcgagTTGACCCAAAAAACTGAGAATTTC | 23 | |
| Microcoleus vaginatus | CyPPO12_BamHIF | CCCCGGATCCATGGAACTCTTGGATACTCT | 24 |
| CyPPO12_XhoIR | CCCCCTCGAGGATTGACCTGGTATCAGATT | 25 |
실시예 2. 할로테세 속 PCC 7418 균주의 제초제 저항성 확인
할로테세 속 PCC 7418 균주를 CRBIP Medium 1538 (파스퇴르 연구소, 프랑스)에서 배양하였다. CRBIP Medium 1538은 ASNIII 및 Turks Island Salts 4X 가 1:1(v/v)로 혼합된 배지이며, ASNIII medium 은 NaCl 25.0g, MgSO 4 ·H 2 O 3.5g, MgCl 2 ·H 2 O 2.0g, KCl 0.5g, CaCl 2 ·H 2 O 0.5 g, NaNO 3 0.75g, K 2 HPO 4 ·H 2 O 0.02 g, NaCO 3 0.04 g, Ammonium iron(III) citrate/Citric acid monohydrate solution 2.5ml[Ammonium iron(III) citrate 300 mg, Citric acid monohydrate 300 mg 및 증류수 250 ml 혼합], Magnesium titriplex dihydrate solution 2.5ml [Mg EDTA 0.1 g 및 증류수 500 ml 혼합], Trace metal A5 + Co 1ml [H 3 BO 3 2.86 g, MnCl 2 ·4H 2 O 1.81 g, ZnSO 4 ·7H 2 O 0.222 g, NaMoO 4 ·2H 2 O 0.39 g, CuSO 4 ·5H 2 O 0.079 g, Co(NO 3 ) 2 ·6H 2 O 0.049 g 및 증류수 1000 ml 혼합], 및 증류수 1000 ml까지로 구성되어 있다. Turks Island Salts 4X 는 NaCl 112 g, KCl 2.68 g, MgCl 2 ·6 H 2 O 22 g, MgSO 4 ·7 H 2 O 27.7 g, CaCl 2 ·2 H 2 O 5.8 g, 및 증류수 1000 ml 까지로 구성되어 있다. ASNIII medium 과 Tursk Island Salts 4X를 각각 120℃ 에서 20분간 멸균(autoclave)한 후 1:1(v/v) 혼합하여 사용하였다.
각 유리관(test tube)에 위 배양배지 5ml 를 넣고 여기에 Tiafenacil 을 첨가하지 않거나 각각 2 또는 10μM 첨가하였다. 종배양(seed culture)한 할로테세 속 PCC 7418 균주를 동일 부피로 각 유리관에 넣은 후 8일 동안 균주의 생장을 확인하였다. 그 결과, Tiafenacil 10μM 까지 처리에도 배양 8일 후 할로테세 속 PCC 7418 균주의 생장이 유지되었으므로, 위 균주가 제초제에 저항성이 있음을 확인할 수 있었다 (도 1).
실시예 3. PPO 결핍 대장균을 이용한 CyPPO2 , CyPPO4 , CyPPO8 및 CyPPO12의 제초제 저항성 검증 (Agar 배지)
실시예 1에서 분리한 CyPPO2, CyPPO4, CyPPO8 및 CyPPO12 의 제초제 저항성을 검증하기 위하여, PPO가 결핍된 BT3 대장균[이하, BT3(ΔPPO)]에 CyPPO2, CyPPO4, CyPPO8 및 CyPPO12 유전자를 각각 형질전환한 후 제초제를 처리한 환경에서 배양하여, 형질전환 대장균의 생장 저해 여부를 확인하였다. 음성 대조군으로는 애기장대 유래의 야생형 PPO (Wild type AtPPO1)를 사용하였는데 상기 Wild type AtPPO1 은 PPO계 제초제 감수성이 있으며 GeneBank accession no. AX084732 에 서열정보가 등록되어 있다 (유전자의 염기서열을 서열번호 10, 아미노산 서열을 서열번호 9에 나타냄). 양성 대조군으로는 상기 Wild type AtPPO1 의 아미노산 서열에서 Y426M (426번째 아미노산인 타이로신이 메티오닌으로 치환) 및 S305L (305번째 아미노산인 세린이 류신으로 치환)의 아미노산 치환이 발생한 Mutant AtPPO1 를 사용하였다 (아미노산 서열을 서열번호 11에 나타냄) (Li X, Volrath SL., ND BG, Chilcott CE, Johnson MA, Ward ER, Law MD (2003) Development of protoporphyrinogen oxidase as an efficient selection marker for agrobacterium tumefaciens- mediated transformation of maize. Plant physiology 133:736-747).
BT3(ΔPPO) 균주는 Hokkaido University (일본)에서 제공받았으며, hemG type PPO가 결여된 대장균이며 카나마이신(Kanamycine)에 저항성을 가지는 균주이다(Watanabe et al., (2001) Dual targeting of spinach protoporphyrinogen oxidase II to mitochondria and chloroplasts by alternative use of two in-frame inhibition codons. JBC 20474~20481)
3-1. 실험재료 및 기기의 준비
Autoclave 는 Hirayama 사의 HV-50, 전자저울은 한성계기의 HS2100A, Clean bench는 Jeio Tech 사의 CB-30V, Incubator 는 JSR 사의 JSI-200CL, UV-visible spectrophotometer는 Thermo Fisher Scientific 사의 1210 type, 광도계는 Apogee 사의 MQ-200, PCR 장비는 Bio-Rad MyCycler 를 사용하였다. Autoclave는 121℃에서 15분, Incubator 는 37℃, 광조건 160~200 μmol m -2 s -1 및 배양 시간 14~20시간의 조건으로 사용하였다. LB배지(Bacto-Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium chloride 10g/L, Bacto agar 15g/L) 및 항생제 클로람페니콜(Duchefa)을 사용하였다. 실험에 사용된 제초제는 다음 표에 기재하였다.
| Chemical family | 제초제(원제)명 | 제조사/입수처 |
| Pyrimidinedione | Tiafenacil | 동부팜한농㈜/ 동부팜한농㈜ |
| Saflufenacil | BASF/ Sigma | |
| Butafenacil | Syngenta/ Sigma | |
| Diphenyl ether | Fomesafen | Syngenta/ Sigma |
| Acifluorfen | United Phosphorus/ Supelco | |
| Oxyfluorfen | Dow/ Sigma | |
| N-phenylphthalimides | Flumioxazin | Sumitomo/ Sigma |
| Triazolinones | Sulfentrazone | FMC/ Waka |
| Oxazolidinediones | Pentoxazone | Kaken/Sigma |
| Phenylpyrazoles | Pyraflufen-ethyl | Nihon Nohyaky /Sigma |
| Others | Pyraclonil | Kyoyu Agri/Sigma |
| Oxadiazoles | Oxadiazon | Bayer/Sigma |
| Thiadiazoles | Fluthiacet-methyl | FMC/Sigma |
3-2. 실험방법
실시예 1 에서 분리 증폭한 CyPPO2, CyPPO4, CyPPO8 및 CyPPO12 유전자를 각각 pACBB(벡터의 구조는 도 2 참조) 에 클로닝하고자, 각각의 PPO 유전자 4 μl, pACBB 벡터 3.5μl, 10X buffer A 1μl, 10X buffer B 1μl, ligase 1μl(RBC, 3unit/μl)을 포함하는 용액 10μl로 제조하여 22℃에서 30분 반응하였다. 반응 용액을 DH5 alpha competent cell 100μl에 넣어 20분간 얼음에서 반응한 후 42℃에서 40초간 두었다. 그 후 얼음에서 2분간 둔 다음 LB broth 1ml 을 넣어 37℃에서 1시간 동안 진탕배양 하였다. 각 삽입 유전자 종류별로, 배양액에서 자란 균들을 수확하여 클로람페니콜이 포함된 LB agar 배지에서 배양하였다.
각 유전자로 형질전환된 대장균의 종배양을 위해, 각 단일 콜로니(single colony)를 클로람페니콜을 포함한 3ml LB broth에서 밤새 배양한 후 100μl를 새로운 3ml LB broth에 계대하여 흡광도(OD 600 )가 0.5~1 이 될 때까지 배양하고 흡광도(OD 600 )를 0.5에 맞추기 위해 LB broth 에서 희석하였다. 이 희석액을 LB broth 로 10배씩 5번 희석하였다. 다음으로, 클로람페니콜과 다양한 제초제 stock 이 농도별로 (0~ 400μM) 혼합된 LB Agar 배지(패트리디쉬)에 위에서 준비한 형질전환 대장균 배양 희석액을 10μl 씩 떨어뜨렸다. LB Agar 배지를 37℃ 조건에서 배양하였고, 배양 16~20시간 후 생장 저해 정도를 육안으로 확인하였다. 또한, Tiafenacil 이 혼합된 배지의 경우 명조건(광조건 169 μmol m -2 s -1 )과 암조건에서 각각 균주의 생장 저해 정도를 확인하였다.
3-3. 실험결과
도 4 내지 도 6은 CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8의 제초제 저항성을 확인한 결과를 나타내고, 도 7 및 도 8은 CyPPO12의 제초제 저항성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3에 나타난 바와 같이, Tiafenacil 이 혼합된 배지에서, Wild type AtPPO1 형질전환 균주의 경우 명조건 및 암조건에서 모두 생장이 저해되었으나, 명조건에서 배양시 암조건에서 배양한 경우보다 더 강한 생장 저해를 보였다. 예를 들어, 1μM Tiafenacil 농도에서 명조건 배양시 Wild type AtPPO1 형질전환 균주의 생장이 거의 완전하게 저해되었으나, 암조건 배양시에는 어느 정도 생장이 유지되어 있었다. 그러나, 5μM Tiafenacil 농도부터는 명조건과 암조건 모두에서 완전한 생장 저해를 나타내었다. 이와 같이, Wild type AtPPO1 형질전환 균주의 경우 Tiafenacil 의처리 농도에 의존적으로 생장 저해를 나타내어 제초제 감수성을 확인할 수 있었고, Mutant AtPPO1 형질전환 균주의 경우 Tiafenacil 25μM 까지도 생장 저해가 관찰되지 않아 제초제 저항성을 확인할 수 있었다.
따라서, 제초제 감수성 PPO의 기준을 Wild type AtPPO1에, 제초제 저항성 PPO의 기준을 Mutant AtPPO1에 설정하고, 대표적인 chemical family 별로 대표적인 PPO 제초제들에 대하여 CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 의 제초제 저항성을 검증해보았다.
도 4는 대표적인 Pyrimidinedione계 PPO 제초제인 Tiafenacil, Saflufenacil 및 Butafenacil, 및 대표적인 N-phenylphthalimides계 PPO 제초제인 Flumioxazin 을 각각 농도별로 처리한 결과를 나타낸다. Tiafenacil 및 Saflufenacil 처리시 Mutant AtPPO1 형질전환 균주, CyPPO2 형질전환 균주, CyPPO4 형질전환 균주 및 CyPPO8 형질전환 균주의 경우 Tiafenacil 또는 Saflufenacil 처리 농도 25μM 에도 생장 저해가 거의 관찰되지 않았다. Butafenacil 처리시 Mutant AtPPO1 형질전환 균주, CyPPO2 형질전환 균주 및 CyPPO8 형질전환 균주의 경우 Butafenacil 처리 농도 25μM 에도 생장 저해가 거의 관찰되지 않았다. Flumioxazin 처리시, CyPPO2 형질전환 균주, CyPPO4 형질전환 균주 및 CyPPO8 형질전환 균주에서 Flumioxazin 처리 농도 25μM 에도 생장 저해가 거의 관찰되지 않았다. 위 네 가지 제초제 모두에서 Wild type AtPPO1 형질전환 균주는 0.5μM에서 저해가 시작되어 5μM부터 거의 생장하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
도 5는 대표적인 Diphenyl ether계 PPO 제초제인 Fomesafen, Acifluorfen 및 Oxyfluorfen 을 각각 농도별로 처리한 결과를 나타낸다. Fomesafen 처리시 Mutant AtPPO1 형질전환 균주는 25μM까지 생장 저해가 관찰되지 않았고, CyPPO2 형질전환 균주, CyPPO4 형질전환 균주 및 CyPPO8 형질전환 균주의 경우 Fomesafen 처리 농도 400μM에도 생장 저해가 거의 관찰되지 않았다. Acifluorfen 처리시 CyPPO2 형질전환 균주, CyPPO4 형질전환 균주 및 CyPPO8 형질전환 균주의 경우 Acifluorfen 처리 농도 400μM에도 생장 저해가 거의 관찰되지 않았다. Oxyfluorfen 처리시 CyPPO2 형질전환 균주, CyPPO4 형질전환 균주 및 CyPPO8 형질전환 균주의 경우 Oxyfluorfen 처리 농도 400μM에도 생장 저해가 거의 관찰되지 않았다. 세 가지 제초제 모두에서 Wild type AtPPO1 형질전환 균주는 5μM 부터 거의 생장하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
도 6은 대표적인 Triazolinones계 PPO 제초제인 Sulfentrazone, 대표적인 Oxazolidinediones계 PPO 제초제인 Pentoxazone, 대표적인 Phenylpyrazoles계 PPO 제초제인 Pyraflufen-ethyl, 대표적인 Oxadiazoles계 PPO 제초제인 Oxadiazon, 대표적인 Thiadiazoles 계 PPO 제초제인 Fluthiacet-methyl, 및 기타 PPO 제초제인 Pyraclonil을 각각 농도별로 처리한 결과를 나타낸다. Sulfentrazone 처리시 CyPPO2 형질전환 균주, CyPPO4 형질전환 균주 및 CyPPO8 형질전환 균주의 경우 Sulfentrazone 처리 농도 400μM에도 생장저해가 거의 관찰되지 않았다. Pentoxazone, Pyraflufen-ethyl, Oxadiazon, Fluthiacet-methyl 및 Pyraclonil 처리시 CyPPO2 형질전환 균주 및 CyPPO8 형질전환 균주의 경우 Oxyfluorfen 처리 농도 400μM에도 생장 저해가 거의 관찰되지 않았다. 일곱 가지 제초제 모두에서 Wild type AtPPO1 형질전환 균주는 5μM 부터 거의 생장하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
도 7은 Tiafenacil, Saflufenacil, Flumioxazin, Fomesafen 및 Oxyfluorfen 처리 시 CyPPO12의 제초제 저항성을 확인한 결과이다. CyPPO12의 형질전환 균주는 Tiafenacil, Saflufenacil, Flumioxazin, Fomesafen 및 Oxyfluorfen 의 각 처리 농도 25μM 에도 생장저해가 거의 관찰되지 않았고, Fomesafen 또는 Oxyfluorfen 처리의 경우 처리농도 400μM에도 생장저해가 거의 관찰되지 않았다. Mutant AtPPO1 형질전환 균주는 Oxyfluorfen 처리시 5μM부터 생장저해가 관찰되었고, 그 외의 제초제에서는 25μM 에도 생장저해가 거의 관찰되지 않았다. 반면, Wild type AtPPO1 형질전환 균주는 Fomesafen을 제외한 네 가지 제초제 모두에서 처리농도 0.5μM에서 저해가 시작되어 5μM부터 거의 생장하지 않는 것을 관찰할 수 있었다. Fomesafen 처리시 Wild type AtPPO1 형질전환 균주는 5μM에서 생장 저해가 관찰되었다.
도 8은 Pyraflufen-ethyl, Oxadiazon, Sulfentrazone, Pentoxazone 및 Pyraclonil 처리시 CyPPO12의 제초제 저항성을 확인한 결과이다. Mutant AtPPO1 형질전환 균주와 CyPPO12의 형질전환 균주는 처리 농도 25μM에도 생장저해가 관찰되지 않았고, Sulfentrazone을 제외한 네 가지 제초제 처리시는 처리 농도 400μM에도 생장 저해가 관찰되지 않았다. 반면, Wild type AtPPO1 형질전환 균주의 경우 Pyraflufen-ethyl, Oxadiazon, Sulfentrazone, Pyraclonil 처리시 처리농도 0.5μM부터 생장저해가 관찰되었고, Pyraclonil 처리시에는 처리농도 5μM부터 생장저해가 관찰되어 25μM에서 거의 자라지 않는 것을 관찰할 수 있다.
실시예 4. PPO 결핍 대장균을 이용한 CyPPO2 , CyPPO4 및 CyPPO8의 제초제 저항성 검증 (LB broth 배지)
위 실시예 3에서 Wild type AtPPO1, Mutant AtPPO1, CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 유전자가 각각 형질전환된 BT3(ΔPPO) 균주에 대하여 다양한 제초제가 혼합된 Agar 배지 상에서 제초제 저항성을 검증하였는바, 이번에는 위 균주들에 대하여 다양한 제초제가 혼합된 LB 액체배지 상에서 제초제 저항성을 재확인해보았다.
4-1. 실험재료 및 기기의 준비
Autoclave 는 Hirayama 사의 HV-50, 전자저울은 한성계기의 HS2100A, Clean bench는 Jeio Tech 사의 CB-30V, Incubator 는 JSR 사의 JSI-200CL, 광도계는 Apogee 사의 MQ-200, UV-visible spectrophotometer는 Thermo Fisher Scientific 사의 1210 type 를 사용하였다. Autoclave는 121℃에서 15분, Incubator 는 37℃, 광조건 160~200μmol m -2 s -1 및 배양 시간 13.5시간의 조건으로, UV-visible spectrophotometer 는 600nm에서 사용하였다.
실험에 사용된 Tiafenacil (MW 511.87 g/mol)은 동부팜한농㈜에서, Saflufenacil(MW 500.85 g/mol)은 Sigma 에서, Fomesafen(MW 438.76 g/mol)은 Sigma 에서 입수하였다. 각 약제는 100% 아세톤에 200mM 농도로 조제한 후 -20℃ 에서 보관하였다. 그리고 Luria-Bertani(LB) 배지(Bacto-Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium chloride 10g/L) 및 항생제 클로람페니콜 (Duchefa)을 사용하였다.
4-2. 실험방법
각 유전자로 형질전환된 대장균의 종배양을 위해, 각 단일 콜로니(single colony)를 클로람페니콜을 포함한 3ml 액체 배지에서 12시간 배양한 후 흡광도(OD 600 )가 1.5가 될 때까지 LB 배지에서 희석하였다. 다음으로, 250ml LB 액체 배지에 클로람페니콜과 위에서 준비한 종배양된 형질전환 대장균 500μl를 첨가하고, 위 배양액을 50ml 씩 250ml 플라스크에 분주하였다. 각 플라스크에 다양한 제초제 (Tiafenacil, Saflufenacil, Fomesafen) stock 를 농도별로 (0, 10μM, 50μM, 100μM) 처리한 후, 처리한 배양액을 37℃ 및 200rpm 조건에서 배양하였고, 매 1.5 시간마다 spectrophotometer를 이용하여 흡광도(OD 600 )를 측정하였다. 실험 결과는 3회씩 반복하여 그 평균값을 그래프로 나타내었으며 3회 반복의 표준오차를 error bar로 표현하였다.
4-3. 실험결과
제초제 감수성 PPO의 기준을 제초제 Wild type AtPPO1에, 저항성 PPO의 기준을 Mutant AtPPO1에 설정하였다.
Tiafenacil을 처리한 결과를 도 9에 나타내었다.
Wild type AtPPO1 형질전환 균주의 경우 Tiafenacil 10μM 부터 거의 생장하지 않는 양상을 나타낸 반면, Mutant AtPPO1 형질전환 균주의 경우 Tiafenacil 10μM 에서는 생장에 영향을 받지 않았다가 50μM부터 생장 저해가 관찰되었다. 또한, CyPPO2 형질전환 균주 및 CyPPO4 형질전환 균주는 100μM까지 정상적인 생장을 보였다.
Saflufenacil을 처리한 결과를 도 10에 나타내었다.
형질전환 균주 별 저항성의 유무는 Tiafenacil을 처리한 결과와 유사하였으나, 저항성의 정도는 Tiafenacil에 비해 Saflufenacil 에서 높은 편으로 나타났다. Wild type AtPPO1 형질전환 균주의 경우 Saflufenacil 10μM 부터 거의 생장하지 않는 양상을 나타낸 반면, Mutant AtPPO1 형질전환 균주, CyPPO2 형질전환 균주, CyPPO4 형질전환 균주 및 CyPPO8 형질전환 균주의 경우 100μM까지 정상적인 생장 을 보였다.
Fomesafen 을 처리한 결과를 도 11에 나타내었다.
Wild type AtPPO1 형질전환 균주의 경우 Fomesafen 50μM 부터 생장저해가 관찰되었으나, Mutant AtPPO1 형질전환 균주, CyPPO2 형질전환 균주, CyPPO4 형질전환 균주 및 CyPPO8 형질전환 균주의 경우 100μM까지 정상적인 생장을 보였다.
실시예 5. CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8의 식물 내 발현
실시예 3 및 실시예 4를 통해 다양한 PPO 제초제에 대한 저항성이 검증된 CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8을 식물에서 발현시키기 위한 실험을 수행하였고, 형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP)을 이용하여 위 PPO 단백질들의 발현을 확인하였다.
5-1. 실험방법
Agrobacterium competent cell 을 제조하기 위하여, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV3101 균주(한국생명공학연구원) 를 5ml LB media 에 30℃ 및 200rpm 조건에서 12시간 배양하였다. 이 배양액을 200ml LB media 에 부은 뒤, 30℃ 및 200rpm 조건에서 3~4시간 배양하고, 3000g, 4 에서 20분간 원심분리하였다. 멸균 증류수로 pellet을 씻어 준 뒤 20ml LB media 로 재현탁(resuspension)하였다. 200μL씩 aliquot 하여 액체 질소에 snap freezing 한 뒤, 초저온 냉동고에 보관하였다.
Wild type AtPPO1, CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 유전자가 각각 클로닝된 벡터를 제조하기 위하여, CaMV 35S 프로모터, YFP 및 NOS terminator를 포함하는 벡터에 XbaI 및 XhoI 제한효소를 처리하고, PCR로 증폭한 transit peptide 유전자(서열번호 26) 에 XbaI 및 XhoI 제한효소를 처리하여 절단한 뒤, 위 벡터와 transit peptide 유전자를 연결하여 벡터 내에 엽록체 이동에 관여하는 트랜지트 펩타이드를 삽입하였다. 또한, XhoI 및 BamHI 제한효소를 이용해 각 PPO 유전자(Wild type AtPPO1, CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 유전자)와 vector 를 절단한 뒤 ligation 하여 벡터 내 PPO 유전자를 삽입하였다. 그 결과, PPO 유전자의 5'에 트랜지트 펩타이드가 결합되고, 3'에 YFP 유전자가 결합되었으며, 최종 벡터 구조 모식도는 도 12에 나타내었다.
다음으로, Agrobacterium 을 이용한 형질전환을 위하여, 위에서 제조한 Agrobacterium competent cell 을 얼음 위에서 녹이고, 각 PPO 유전자가 삽입된 벡터를 3~5 μL를 cell 과 섞어준 뒤, 액체질소에 2~3분간 snap freezing 한 후, 37에서 5분간 녹였다. 1ml LB media 넣어준 뒤 30 에 2시간 배양하고, LB/spectinomycin 배지에 도말하여 30 에 2일간 배양하였다.
Agrobacterium 을 담배 잎에 접종하기 위하여, 각 PPO 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 Agrobacteirum 단일 콜로니를 LB/spectinomycin media 에 30, 200rpm 으로 12시간 배양하고, 7000 rpm 에서 2분간 원심분리한 뒤 pellet 을 10mM MgCl 2 에 재현탁하였다. 흡광도(OD 600 )를 0.5 로 맞춘 뒤, 200μM acetosyringone 을 첨가하고 상온에서 2시간 동안 보관하였다. Agrobacterium은 1ml syringe 를 이용하여 정상적인 생육 상태의 담배 잎에 infiltration 한 뒤 2-5일간 재배하였다.
다음으로, 담배 잎의 protoplast를 분리하기 위하여, 표 3 또는 표 5의 조성으로 효소 용액을 제조하였다.
| 조성 | 함량 |
| CPW stock A (100x) | 5 ml |
| CPW stock B (10x) | 50 ml |
| mannitol | 45 g |
| MES | 533 mg |
| Viscozyme (Novozymes; KWN00019; 700 EGU/g Cellulase) | 5 ml |
| Celluclast (Novozymes; CCN03123; 100FBG/g Beta-glucanase) | 2.5 ml |
| pectinEX (Novozymes; KJN01013) | 2.5 ml |
| DDW | up to 500ml |
위 용액을 pH 5.8 로 맞춘 뒤, 0.22μm pore size 로 멸균 여과하였다.
| CPW stock A (100x) | CaCl 2 .2H 2 O | 1460 mg/L |
| CPW stock B (10x) | KH 2 PO 4 | 27.2 mg/L |
| KNO 3 | 101 mg/L | |
| MgSO 4 . 7H 2 O | 246 mg/L | |
| KI | 0.16 mg/L | |
| CuSO 4 .5H 2 O | 0.025 mg/L | |
| pH | 5.8 |
| 조성 | 함량 |
| mannitol | 1g |
| 200mM MES (pH 5.7) | 150μL |
| viscozyme | 100μL |
| celluclast | 50μL |
| pectinEX | 50μL |
| 1M CaCl 2 | 70μL |
| DDW | up to 10ml |
담배 잎을 면도날을 이용하여 잘게 일렬로 자르고, 자른 잎을 위에서 제조한 효소 용액에 띄운 뒤 알루미늄 호일로 싸고 상온에서 40-50rpm 으로 3-5 시간 동안 교반하였다. 현미경(Carl Zeiss Observer Z1) 및 생체물질 결합분석 시스템(Zeiss LSM710)을 이용하여, DIC, YFP 및 rhodamine 관찰 필터 3종을 이용하여 원형질체 세포를 관찰하였고, imaging tool 로 캡처한 뒤, ZEN lite 2012 (Carl Zeiss)프로그램을 이용하여 데이터화하였다.
CyPPO2, CyPPO4 또는 CyPPO8 단백질과 함께 발현된 형광 단백질(YFP)을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 이를 위하여, 샘플을 액체 질소에 얼려 보관하였다가 Micropestle 이용하여 마쇄하였다. IP buffer[50mM Tris-Cl(pH7.5), 75mM NaCl, 5mM EDTA, 1% Triton X-100, 1mM DTT, 1x protease inhibitor] (40μL for large well) 넣고 볼텍싱하고 얼음에서 10분 이상 상치하였다. 4℃에서 10분간 원심분리한 뒤 상층액을 새로운 1.5ml 튜브로 옮겼다. Protein loading dye 넣은 뒤 100℃ 에서 5분간 끓이고 얼음에 상치한 후 원심분리하고 상등액을 사용하였다. 전기영동은 7.5% SDS-PAGE gel 단백질 추출액을 로딩하고, Stacking gel은 100V 로, separating gel 150 V 로 단백질을 분리하였다. 전기영동한 단백질은 PVDF (polyvinylidene fluoride) 막으로 전이하고, Blocking buffer (4% skim milk powder, 10mM sodium phosphate, 0.15M NaCl, 0.05% Tween-20, pH 7.5)에 1시간 blocking 한 후, anti-GFP antibody (HRP-conjugated) (SantaCruz사)을 1/2000 넣고 2시간 동안 상온에서 반응 시겼다. 항체반응 후 막을 PBS-T(phosphate buffered saline-Tween) buffer 로 10분간 3회 세척하고, ECL(electrochemiluminescence) solution 500μL (버퍼 조성 또는 입수처: Bio-Rad 사) 을 뿌린 뒤 1분간 정치한 후 OHP film 등으로 덮은 뒤 X-ray film 에 노출하고 필름을 인화하였다.
5-2. 실험결과
Wild type AtPPO1, CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 유전자를 각각 식물에 도입한 후 각 유전자들의 발현을 확인한 결과를 도 13에 나타내었다. 각 PPO 유전자가 형질전환된 식물체 내에서 아그로박테리움 콜로니가 형성됨을 확인할 수 있었다. 음성 대조군으로 사용한 YFP 단백질의 경우 엽록체로 타겟팅되지 않고 세포질 및 핵 내에 발현하는 것이 확인되었고, PPO 단백질의 경우, 엽록소의 자가형광(autofluorescence) 이미지와 merge 한 결과 형광 시그널이 서로 겹쳐지는 것을 보아, 엽록체 타겟팅을 목적으로 N-말단에 붙인 cTP(chloroplast transit peptide) 의 영향으로 엽록체로 타겟팅됨을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 식물 형질전환 벡터 및 형질전환체 제작
식물 형질전환 선발은 BAR 유전자(glufosinate 저항성 유전자)의 ORF와 각각의 CyPPO2, CyPPO4 또는 CyPPO8 유전자 ORF를 지닌 이원벡터(binary vector)을 제작하여 사용하였다. PPO 계 제초제와 작용 기전이 다른 제초제를 교차 사용하는 경우 그 효과를 확인하기 위하여 BAR 유전자를 사용하였으며, 상기 유전자는 후대 유전이 안정적으로 진행되고 있는지 여부를 검증하는데에도 사용하였다. BAR 유전자의 발현을 위해 NOS 프로모터를 사용하였으며, 전사 종결을 위해 E9 터미네이터를 사용하였다. 한편, CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 의 식물체 발현 유도를 위해 CaMV35S 프로모터를 사용하였으며, 엽록체로의 단백질 이동을 유도하기 위해 AtPPO1 유전자의 transit peptide(TP) 부위를 XbaI, XhoI 제한효소를 이용하여 삽입하였다. 또한, 발현된 단백질의 확인을 위해 헤마글루티닌(hemaglutinin, HA) tag를 3' 말단 부위에 BamHI, SacI 제한효소를 이용하여 삽입하였다. 벡터 내 삽입된 transit peptide 부위를 서열번호 27로, 삽입된 HA tag 서열을 서열번호 28 로 나타내었다. CyPPO2, CyPPO8 유전자는 transit peptide 와 HA tag 의 사이에 XhoI, BamHI 제한효소를 이용하여 삽입되었고, HA tag 뒤에 NOS terminator 가 삽입되어 PPO 유전자의 전사 종결을 유도하였다. 본원에서 사용한 식물 형질전환 이원벡터의 구조 모식도를 도 14에 나타내었다.
한편 식물 형질전환체는 다음과 같이 제작하였다. 우선, 형질전환된 Agrobacterium 을 항생제 배지에서 선별한 뒤 콜로니를 액체 배양하였다. Agrobacterium 을 cell harvest 한 뒤 5% sucrose, 0.05% Silwet L-77 용액에 현탁하였다. 흡광도(OD 600 )를 0.8 로 맞춘 뒤 약 5-6주 자란 애기장대의 화기를 Agrobacterium 용액에 담가 주었다. 습도 유지를 위하여 비닐 백으로 화분을 덮어 준 뒤 암상태에서 하루 동안 두었다. Agrobacterium 으로 접종한 애기장대는 1-2달 정도 더 키운 후 종자를 후숙시킨 다음 수확하였다. 형질전환한 식물체에서 수확한 종자는 형질전환된 것과 되지 않은 것이 혼재되어 있으므로 수확된 종자에서 형질전환된 개체를 선발하는 작업이 요구 된다.
이에, 벡터 제작 시 형질전환된 개체 선발을 위해 삽입한 BAR 유전자(glufosinate을 이용하여 형질전환체를 선발)를 이용하여 형질전환된 개체를 선별하였으며, 이를 흙으로 이식하여 키움으로써 T1 식물체를 수득하였다.
이식한 T1 식물체들의 PPO 계 제초제에 대한 저항성을 판단하기 위해 약 3-4 주 키운 뒤 꽃대가 올라오기 전 제초제를 처리하였다. 애기장대 Col-0 ecotype 의 경우 식물체당 1μM tiafenacil (+0.05% Silwet L-77)을 2-3ml 처리에서 사멸되는 것을 확인하였다. 따라서, 식물체의 개체수에 적합하게 1μM tiafenacil 을 골고루 처리하고 7일 경과 뒤 형질전환체들의 PPO 계 제초제 저항성 여부를 판별하였다. 저항성을 나타내어 살아남는 식물체는 지속적으로 키워 종자를 수확하였고(T2 종자), 상기 T2 종자를 1/2 MS 배지에 일주일간 키운 뒤 흙으로 이식하여 키워 T2 식물체를 수득하였다.
실시예 7. 발아 실험
CyPPO2 및 CyPPO8 형질전환체 중 1μM tiafenacil 처리 하에도 생존한 개체의 T2 세대 종자를 이용하여 tiafenacil 저항성을 확인하고자, 70nM tiafenacil이 함유된 1/2 MS 배지 (1.125g/L MS salt, 10g/L sucrose, 7g/L Agar)에 애기장대 종자를 파종하였다. 50nM tiafenacil 이 함유된 1/2 MS 배지에서 야생형 애기장대(Col-0; Columbia-0 생태형)는 발아 장애가 관찰되고 70nM 함유된 1/2 MS 배지에서 Col-0는 정상 발아 하지 못하고 사멸되었다. 따라서, 70nM 에서 생존한다면 tiafenacil 에 대한 저항성을 갖는 것으로 판단할 수 있었다.
시험 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, CyPPO2 형질전환체의 T2 세대 라인 중 1번과 49번이 발아하는 것을 알 수 있었고, CyPPO8 형질전환체의 T2 세대 라인 중 6번, 16번 및 40번이 70nM tiafenacil이 함유된 1/2 MS 배지에서도 발아하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 음성 대조군으로 사용된 야생형 애기장대(Col-0) 종자는 70nM tiafenacil이 함유된 1/2 MS 배지에서 발아하지 않았으며, 양성 대조군으로 사용된 Mutant AtPPO1 형질전환체는 70nM tiafenacil이 함유된 1/2 MS 배지에서도 발아하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 8. 후대 유전성 시험
8-1. T2 세대 종자에서 분리비(segregation ratio)의 확인
형질전환 애기장대에서 제초제 저항성 형질이 세대가 진전됨에 따른 유전 양식을 판단하기 위해 T2 종자를 대상으로 BAR 유전자 저항성과 감수성 개체의 분리비(segregation ratio)를 라인 별로 판단하였다.
CyPPO2 형질전환체의 경우 10개 라인 중 10, 20, 38, 40번 라인이 3:1에 가까운 분리비를 보여 게놈 내 트랜스유전자(transgene)가 1 카피(single copy)로 삽입되어 멘델의 법칙에 따라서 분리 및 발현되었다는 것을 확인할 수 있었다. 나머지 6개 라인의 경우는 3:1 의 분리비를 보이지 않아 2 카피(double copy) 이상으로 예측되었다.
CyPPO8 형질전환체의 경우 5개 라인 중 6, 16, 40번 라인이 3:1에 가까운 분리비를 보여 게놈 내 트랜스유전자가 1 카피 삽입되어 멘델의 법칙에 따라서 분리 및 발현되었다는 것을 확인할 수 있었다. 나머지 2개 라인의 경우 3:1 보다 낮은 분리비를 보였다.
| CyPPO2-HA 형질전환체 (T2) | |
| line no. | 분리비 |
| 1 | 4.56:1 |
| 8 | 1.56:1 |
| 10 | 2.85:1 |
| 20 | 2.70:1 |
| 23 | 1.5:1 |
| 30 | 1.7:1 |
| 35 | 2.03:1 |
| 38 | 2.57:1 |
| 40 | 3.17:1 |
| 49 | 2.41:1 |
| CyPPO8-HA 형질전환체 (T2) | |
| line no. | 분리비 |
| 6 | 2.57:1 |
| 16 | 2.85:1 |
| 23 | 2.23:1 |
| 38 | 2.03:1 |
| 40 | 2.85:1 |
8-2. 제초제 저항성 T2 세대 종자에서 CyPPO2 및 CyPPO8 단백질의 발현 확인
후대에서 CyPPO2 및 CyPPO8 단백질의 발현이 유지되는지를 판단하고자 형질전환체의 T2 세대 라인별로 단백질을 추출하고 웨스턴 블랏을 수행하였다. HA tag PPO 단백질량을 검출하고자 애기장대 잎 약 100mg 에서 단백질을 추출하여 전기영동하여 PVDF membrane 에 전이한 뒤 anti-HA antibody 를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. T1 세대 식물체에 1μM tiafenacil 을 스프레이 처리하였을 때 생장하는 식물체를 저항성 라인, 죽는 식물체를 감수성 라인으로 분류하였다.
그 결과, CyPPO2 형질전환체의 경우 제초제 살포에서 저항성을 지니는 8번, 23번, 30번, 38번, 40번 및 49번 라인은 PPO 단백질이 검출되었으나, 감수성인 라인들은 단백질이 검출되지 않았다(도 16). CyPPO8 형질전환체에서도 제초제에 저항성을 지니는 6번, 23번, 38번, 40번 라인은 PPO 단백질이 검출되었으나, 감수성인 라인들은 단백질이 검출되지 않았다(도 17). 이는 저항성 라인들이 후대에서도 CyPPO2 및 CyPPO8 단백질 발현을 유지하며 저항성을 부여함을 나타낸다.
8-3. BAR 유전자를 이용한 트랜스유전자의 안정적 유전성 검증
형질전환된 유전자인 BAR 유전자의 게놈 내 삽입 여부를 검증함으로써, 세대 진전에 따른 트랜스유전자의 안정적 유전성을 확인하였다. CyPPO2 및 CyPPO8 형질전환체의 잎 100mg 을 이용하여 genomic DNA를 분리한 뒤 BAR 유전자의 삽입 여부을 PCR 을 통해 검증하였다. 그 결과, CyPPO2 형질전환체 및 CyPPO8 형질전환체 모두에 있어서 tiafenacil 저항성 및 감수성 라인이 모두 BAR 유전자가 게놈 내 삽입된 것을 알 수 있었다. 이는 형질전환된 유전자가 세대가 진전함에 따라 안정적으로 유지되고 있음을 보여준다.
실시예 9. 형질전환 애기장대의 제초제 저항성 검증
제초제 저항성 형질이 식물의 세대가 진전됨에 따라 유지되는지를 판단하고자 CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 유전자가 각각 형질전환된 애기장대의 T2 세대 식물체에 대하여 제초제 저항성을 테스트하였다. 약 4주 자란 애기장대 식물체 당 0.5μM Tiafenacil, 1μM Saflufenacil, 또는 3μM Fomesafen 2~3ml을 각각 스프레이하였다. 스프레이 뒤 7일차 관찰 결과, Wild Type Col-0 식물체는 모두 사멸한 반면, 양성 대조군인 Mutant AtPPO1 형질전환체과 실험군인 CyPPO2 형질전환체, CyPPO4 형질전환체 및 CyPPO8 형질전환체 모두 거의 손상없이 지속 생장하였다 (도 18 및 도 19). 이는 T1 식물체가 가졌던 제초제 저항성 형질이 T2 세대에 잘 유지되어 제초제 저항성을 부여함을 보여준다.
실시예 10. 작용 기전이 다른 복수의 제초제와의 교차 사용 시험
상기 실시예 6에서 제조한 식물 형질전환 벡터로 형질전환하여 수득된, CyPPO2 또는 CyPPO8 유전자를 포함하는 애기장대 형질전환체는, PPO 활성을 억제하는 제초제에 대한 저항성 유전자 및 글루포시네이트(glufosinate) 저항성 유전자를 동시에 발현한다. 따라서, 상기 애기장대 형질전환체에 대하여 두 가지 제초제, 즉 PPO 활성을 억제하는 제초제 및 글루포시네이트를 교차 사용하였을 때, 잡초를 방제하는 데 효과적인지 여부를 시험해보았다. 이를 위하여, CyPPO2 및 BAR 유전자가 삽입된 애기장대 형질전환체, 또는 CyPPO8 및 BAR 유전자가 삽입된 애기장대 형질전환체의 종자를 소독하여 4℃에서 2일간 저온 처리하였다. 종자를 각각 1/2MS 배지(Duchefa), 70nM Tiafenacil 를 첨가한 1/2MS 배지, 50uM glufosinate 를 첨가한 1/2MS 배지, 또는 70nM Tiafenacil 및 50uM glufosinate 를 첨가한 1/2MS 배지에 파종하여 23℃, 16시간 광 및8시간 암의 일장 조건에서 7~14 일간 생장 시켰다. 제초제 배지에 치상한 애기장대는 각각 CyPPO2 또는 CyPPO8를 형질전환한 종자와 대조구인 wild type Col0 이였다. 형질전환체와 대조구를 제초제 배지에 배양하여 배양 2주 후 관찰한 결과, CyPPO2, CyPPO8는 glufosinate 첨가 배지, Tiafenacil 첨가 배지, 또는 glufosinate 및 Tiafenacil 첨가 배지에서 정상적으로 생장하였으나, 대조구인 Col0는 발아하지 못하였다(도 20 참조).
상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 PPO 제초제 저항성 유전자와 BAR 유전자를 이원 벡터에 재조합함으로써 형질전환 식물체를 확보하고, 이들 GM 식물을 이용하여 서로 다른 기작을 가진 제초제를 교차 또는 이중 처리하는 경우, 원하지 않은 식물을 제어 할 수 있음을 확인하였다.
본 실시예에서 CyPPO 유전자와 함께 재조합 유전자로 도입한 BAR 유전자는 저항성 유전자의 예시일 뿐, 본 실시예에 의해 사용될 수 있는 유전자의 종류가 제한되는 것은 아니다. 목적에 적합한 저항성 유전자를 CyPPO 2, 4, 8 또는 12와 함께 이원 벡터에 재조합하는 한편, 각 유전자가 저항성을 나타내는 제초제를 교차 처리하는 경우, 목적하는 저항성을 얻을 수 있음은 당업자에게 자명하다.
실시예 11. 복수의 PPO 제초제의 교차 사용 시험
실시예 9 를 통하여, 본원에서 제작된 애기장대 형질전환체가 PPO 계 제초제인 Tiafenacil과 Saflufenacil 에 동시에 저항성을 가지는지를 확인하였으므로, 상기 애기장대 형진전환체에 대하여 Tiafenacil 과 Saflufenacil 를 교차 사용하였을 때, 잡초를 방제하는 데 효과적인지 여부를 시험해보았다. 이를 위하여, CyPPO2 또는 CyPPO8 유전자가 삽입된 애기장대 형질전환체 종자를 소독하여 4℃에서 2일간 저온 처리하였다. 종자를 각각 1/2MS 배지, 70nM Tiafenacil 를 첨가한 1/2MS 배지, 70nM Saflufenacil 를 첨가한 1/2MS 배지, 또는 35nM Tiafenacil 및 35nM Saflufenacil 를 첨가한 1/2MS 배지에 파종하여 23℃, 16시간 광 및 8시간 암의 일정 조건에서 7~14 일간 생장 시켰다. 제초제 배지에 치상한 애기장대는 각각 CyPPO2 또는 CyPPO8를 형질전환한 종자와 대조구인 wild type Col0 이였다. 형질전환체와 대조구를 제초제 배지에 배양하여 배양 2주 후 관찰한 결과, CyPPO2, CyPPO8는 Tiafenacil 첨가 배지, Saflufenacil 첨가 배지, 또는 Tiafenacil 및Saflufenacil 첨가 배지에서 정상적으로 생장하였으나 대조구인 Col0는 발아하지 못하였다(도 21 참조).
상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 PPO 제초제 저항성 유전자들을 이용하여 GM 식물을 제작하는 경우, PPO 계열에 해당하는 단일 제초제의 처리뿐만 아니라 복수의 제초제를 교차 또는 이중 처리하는 경우에도 원치 않는 식물을 제어할 수 있음을 확인하였다.
실시예 12. CyPPO2 , CyPPO4 및 CyPPO8 아미노산 서열 상동성에 따른 제초제 저항성 검증
제초제 저항성이 유지되는 CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 아미노산 서열 상동성 범위를 확인하기 위해 CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 단백질의 일부 아미노산 서열을 NtPPO (담배 유래 PPO 유전자)의 일부 아미노산 서열로 대체하였다. 그 결과 생성된 CyPPO2 아미노산 서열 변이체는 서열번호 12, 그 염기서열을 서열번호 13에 나타내었고, 상기 CyPPO2 서열 변이체는 CyPPO2 의 아미노산 및 염기 서열과 각각 98%의 서열 상동성을 가지는 것을 확인하였다. 또한, 생성된 CyPPO4 아미노산 서열 변이체는 서열번호 14, 그 염기서열을 서열번호 15에 나타내었고, 상기 CyPPO4 서열 변이체의 아미노산 및 염기 서열은 CyPPO4 의 아미노산 및 염기 서열과 각각 98%의 서열 상동성을 가지는 것을 확인하였다. 생성된 CyPPO8 아미노산 서열 변이체는 서열번호 16, 그 염기서열을 서열번호 17에 나타내었고, 상기 CyPPO8 서열 변이체는 CyPPO8 의 아미노산 및 염기 서열과 각각 98%의 서열 상동성을 가지는 것을 확인하였다.
CyPPO2 아미노산 서열 변이체, CyPPO4 아미노산 서열 변이체 및 CyPPO8 아미노산 서열 변이체의 제초제 저항성을 PPO가 결핍된 BT3 대장균[BT3(ΔPPO)]을 이용하여 검증하였으며, 구체적인 실험방법은 실시예 3과 유사하다. 실시예 3과 동일하게, 음성 대조군으로는 애기장대의 야생형 PPO (Wild type AtPPO1) 를 사용하여 제초제 감수성의 기준으로 설정하였고, 양성 대조군으로는 상기 야생형의 아미노산 서열에서 Y426M 및 S305L 의 아미노산 치환이 발생한 Mutant AtPPO1 를 사용하여 제초제 저항성의 기준으로 설정하였다.
12-1. 실험재료 및 기기의 준비
Autoclave는 121℃에서 15분, Incubator 는 37℃, 광조건 169 μmol m -2 s -1 및 배양 시간 14~16시간의 조건으로 사용하였다. UV-visible spectrophotometer 는 600nm 에서 측정하고, 94℃에서 4분간 반응한 후, 25 사이클 (94℃ 에서 30초, 56~60℃ 에서 30초 및 72℃에서 3분) 반복하고, 72℃에서 5분 및 4℃ 에서 5분 동안 PCR 반응하였다. 실험에 사용된 제초제는 다음 표 8에 기재하였다. 각 제초제는 DMSO에 200mM 농도로 조제하였고, -20℃ 보관한 후, 희석하여 LB broth 배지(클로람페니콜 34mg/ml 포함)에 첨가하여 사용하였다.
| Chemical family | 제초제(원제) 명 | 제조사/입수처 |
| Pyrimidinedione | Tiafenacil | 동부팜한농㈜/ 동부팜한농㈜ |
| Saflufenacil | BASF/ Sigma | |
| Butafenacil | Syngenta/ Sigma | |
| Diphenyl ether | Fomesafen | Syngenta/ Sigma |
| Acifluorfen | United Phosphorus/ Supelco | |
| Oxyfluorfen | Dow/ Sigma | |
| N-phenylphthalimides | Flumioxazin | Sumitomo/ Sigma |
| Triazolinones | Sulfentrazone | FMC/ Waka |
| Oxizolidinediones | Pentoxazone | Kaken/Sigma |
| Phenylpyrazoles | Pyraflufen-ethyl | Nihon Nohyaky/Sigma |
| Others | Pyraclonil | Kyoyu Agri/Sigma |
| Oxadiazoles | Oxadiazon | Bayer/Sigma |
| Thiadiazoles | Fluthiacet-methyl | FMC/Sigma |
12-2. 실험방법
클로람페니콜을 포함한 3ml LB broth 액체 배지에 saturated cell을 접종한 후, 37, 200rpm 조건에서 5시간 배양하였다. 600nm에서 배양한 cell 농도를 측정하여 형질전환체 간 1ml 당 흡광도(OD 600 )가 일정하도록 LB 액체 배지로 희석하였다(OD 600 =0.5). LB broth 액체 배지에 agar를 1%로 넣고, Autoclave에서 멸균하였다. 클로람페니콜(34μg/ml)과 농도에 따라 제초제를 넣고 혼합하였다. 동일한 농도로 희석한 cell을 10 0 , 10-- -1 , 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 로 희석하였다. cell을 1% agar, LB broth 고체 배지에 10μl씩 떨어뜨렸다. 37 incubator 에서 14~16시간 배양하였다(광조건 : 169 μmol m -2 s -1 ).
pACBB-CyPPO2, pACBB-CyPPO4 및 pACBB-CyPPO8 각각을 주형으로 하여, 치환할 부위를 프라이머(표 9)를 제작하였고, PCR 을 이용하여 pACBB-CyPPO2 변이체, pACBB-CyPPO4 변이체 및 pACBB-CyPPO8 변이체 벡터를 제작하였다. PCR 반응액은 Template (pACBB-CyPPO2, pACBB-CyPPO4 및 pACBB-CyPPO8 오리지널) 1μl, 10X buffer 5μl, dNTP mixture (각 10mM) 1μl, forward primer (10μM) 1μl, reverse primer (10μM) 1μl, DDW 35μl, 및 Pfu-X (Solgent, 2.5unit/μl) 1μl을 포함하는 반응액 50μl 으로 구성하였고, 94℃에서 4분간 반응한 후, 25 cycles (94℃ 에서 30초, 56℃ 에서 30초 및 72℃에서 3분) 반복하고, 72℃에서 5분 및 4℃ 에서 5분 반응하여 증폭하였다.
| 균주 | 프라이머 | 서열 (pACBB cloning 용) | 서열번호 |
| Oscillatoria nigro-viridis PCC 7112 | CyPPO2Nt98%_F | ATCTGATCAAAAGCAATTTTCTGAGTTTTCCGGGGAAAC | 29 |
| CyPPO2Nt98%_R | CAATTGGATTTGAAGGTAA CGGTTGCAGCTTATTTTCC | 30 | |
| Lyngbya sp. PCC 8106 | CyPPO4-Nt-98%_F | ATCTGATCAAAAGCAATTTTTTAAGTCCTGGAGGTAAACT | 31 |
| CyPPO4-Nt-98%_R | CAATTGGATTTGAAGGTAA AGGCATGAGTTGACCATTC | 32 | |
| Halothece sp. PCC 7418 | CyPPO8_Nt98%-F | ATCTGATCAAAAGCAATTTTCTGAGTCCAATCGGGAAAC | 33 |
| CyPPO8_Nt98%-R | CAATTGGATTTGAAGGTAAAGGGCGCAGTTTCCCCTCCC | 34 |
BT3(ΔPPO) competent cell 을 제작하기 위하여, BT3(ΔPPO) 균주를 5ml LB broth 에 50 μg/ml kanamycin 및 20 μg/ml hematin 첨가하여 37 shaking incubator 에서 12시간 동안 암배양하였다. 그 후 5ml culture 를 20μg/ml hematin 첨가된 100 ml LB broth에 넣어 준 뒤, OD 600 =0.5 정도 될 때까지 37 shaking incubator 에서 암배양하였다. 배양된 대장균을 CaCl 2 이용하여 competent cell 제작 프로토콜을 따라 BT3(ΔPPO) competent cell 을 제작하였다. 다음으로, BT3(ΔPPO) 균주에 CyPPO2 변이체, CyPPO4 변이체 및 CyPPO8 변이체를 함유하는 벡터를 형질전환하기 위하여, BT3(ΔPPO) competent cell 100 μl 에 벡터 5 μl를 첨가하여 섞어준 뒤, 20분간 얼음에서 반응한 후 42℃에서 40초간 두었다. 그 후 얼음에서 2분간 안정화 시키고 BT3(ΔPPO) 에 LB broth 1ml 을 넣어 37℃ 에서 1시간 동안 교반 배양하였다. 각 삽입 유전자 종류별로, 배양액에서 자란 균들을 모아 클로람페니콜(34μg/ml)이 첨가된 LB 고체 배지에 도말한 후 37 에서 12시간 이상 배양하였다. 그 후 각 단일 콜로니(single colony)를 액체 LB 배지에서 배양하였다. 이후, 광 상태에서 제초제 처리에 따른 생장 저해를 측정하였고, 제초제가 미첨가된 LB 고체 배지에서 자란 BT3 형질전환 균주의 생육 상태와 비교하여, 제초제가 농도별로 첨가된 LB 고체 배지에서 BT3 형질전환 균주가 자라는 상태를 관찰하였다.
12-3. 실험결과
도 22 내지 도 25은 CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 의 오리지널 서열과 각각 98%의 서열 상동성을 가지는 CyPPO2 변이체, CyPPO4 변이체 및 CyPPO8 변이체 유전자의 제초제 저항성을 확인한 결과를 나타낸다. 음성 대조군으로는 Wild type AtPPO1를 제초제 감수성의 기준으로 설정하였고, 양성 대조군으로는 Mutant AtPPO1 를 제초제 저항성의 기준으로 설정하였으므로, Mutant AtPPO1 로 형질전환된 균주과 유사하거나 더 높은 저항성을 나타낸 경우 제초제 저항성이 있는 것으로 판단하였다.
결과적으로, 9개 계통의 13종의 제초제(Tiafenacil, Saflufenacil, Butafenacil, Fomesafen, Acifluorfen, Oxyfluorfen, Flumioxazin, Sulfentrazone, Pentoxazone, Pyraflufen-ethyl, Pyraclonil, Oxadiazon, Fluthiacet-methyl) 모두에서, CyPPO2 변이체, CyPPO4 변이체 및 CyPPO8 변이체로 형질전환된 BT3 균주 모두 명조건에서 잘 생장하였으며, 양성 대조군인 Mutant AtPPO1과 유사하거나 더 높은 제초제 저항성을 나타내었다 (25μM 에도 생장 저해를 거의 나타내지 않음).
따라서, CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 뿐만 아니라, 이들과 98% 서열 상동성을 가지는 변이체들도 CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 의 저항성 수준과 비슷한 양상으로 저항성을 보여, CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8 의 일부 서열이 변경되더라도 여전히 PPO 의 기능을 나타내며 제초제 저항성에 관한 생물학적 활성이 유지됨을 확인할 수 있었다.
<110> Dongbu Farm Hannong Co., Ltd. <120> Method for conferring or enhancing herbicide resistance on plants and/or alga with protoporphyrinogen oxidase variants <130> DPP20165866KR <150> KR10-2014-0181791 <151> 2014-12-16 <160> 34 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 486 <212> PRT <213> Oscillatoria nigroviridis PCC 7112 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(486) <223> CyPPO2 <400> 1 Met Glu Leu Leu Asp Thr Leu Ile Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly Leu 1 5 10 15 Ser Leu Ala His Ala Leu His Lys Glu Ala Thr Ser Ala Ser Pro Leu 20 25 30 Lys Ile Leu Val Ala Glu Ser Gln Gly Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr 35 40 45 Thr Val Thr Ala Glu Gly Phe Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe 50 55 60 Ser Pro Thr Pro Glu Leu Met Lys Leu Ala Val Asp Val Gly Leu Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Ile Phe Ala Asp Arg Lys Leu Pro Arg Phe Val Tyr Trp 85 90 95 Glu Asn Lys Leu Gln Pro Val Pro Met Thr Pro Pro Ala Met Ile Gln 100 105 110 Ser Gln Leu Leu Ser Phe Pro Gly Lys Leu Arg Ala Leu Phe Gly Ala 115 120 125 Leu Gly Phe Val Ala Pro Ala Met Gly Asp Arg Leu Ser Gln Gln Gl y 130 135 140 Asn Glu Glu Thr Val Ser Gln Phe Phe Arg Arg His Leu Gly Thr Glu 145 150 155 160 Val Met Gln Arg Leu Val Glu Pro Phe Val Ser Gly Val Tyr Ala Gly 165 170 175 Asp Pro Gln Gln Leu Ser Ala Ala Ala Ala Phe Gly Arg Val Ala Lys 180 185 190 Met Ala Asp Val Gly Gly Gly Leu Val Ala Gly Ala Leu Leu Ser Ala 195 200 205 Lys Asn Arg Pro Lys Lys Met Pro Ala Asp Pro Asn Val Pro Lys Thr 210 215 220 Lys Pro Gly Glu Leu Gly Ser Phe Lys Gln Gly Leu Lys Ala Leu Pro 225 230 235 240 Glu Ala Ile Ala Ala Lys Leu Gly Asp Arg Val Lys Leu Asn Trp His 245 250 255 Leu Thr Arg Leu Gln Arg Thr Glu Arg Glu Thr Tyr Ile Ala Glu Phe 260 265 270 Ser Thr Pro Asp Gly Gln Gln Glu Val Glu Ala Arg Thr Val Val Leu 275 280 285 Thr Thr Pro Ala Tyr Val Thr Ala Asp Leu Leu Gln Pro Leu Glu Pro 290 295 300 Gln Val Ser Ser Ala Leu Gln Ala Phe Thr Tyr Pro Thr Val Ala Ser 305 310 315 320 Val Val Leu Ala Tyr Pro Gln Ser Asp Val Lys Gly Lys Leu Val Gly 325 330 335 Phe Gly Asn Leu Ile Pro Arg Gly Gln Gly Ile Arg Cys Leu Gly Th r 340 345 350 Ile Trp Thr Ser Ser Leu Phe Pro Asp Arg Ala Pro Ala Gly Trp Gln 355 360 365 Thr Leu Thr Ser Tyr Ile Gly Gly Ala Thr Asp Ser Glu Ile Gly Asn 370 375 380 Leu Asp Ser Glu Gln Ile Val Arg Glu Val His Arg Asp Leu Ser Arg 385 390 395 400 Ile Leu Leu Lys Pro Asp Val Pro Gln Pro Lys Val Leu Thr Val Lys 405 410 415 Leu Trp Lys Arg Ala Ile Pro Gln Tyr Asn Leu Gly His Phe Asp Arg 420 425 430 Leu Gln Gln Ile Asp Glu Gly Leu Lys Ser Leu Pro Gly Val Tyr Leu 435 440 445 Cys Ser Asn Tyr Val Gly Gly Val Ala Leu Gly Asp Cys Val Arg Arg 450 455 460 Gly Phe Asp Arg Ala Arg Glu Val Gly Glu Tyr Leu Gln Lys Lys Gln 465 470 475 480 Ser Asp Thr Arg Ser Ile 485 <210> 2 <211> 1461 <212> DNA <213> Oscillatoria nigroviridis PCC 7112 <220> <221> gene <222> (1)..(1461) <223> CyPPO2 <400> 2 atggaactat tagatacctt gattgtgggt gcgggtatta gcggtttgag tttggcgcac 60 gcacttcaca aggaagcaac gagtgcatcg ccgctgaaga ttttagtcgc tgagagtcag 120 ggacgtgtgg gcgggaacat cacgactgtg acagcagagg ggtttctctg ggaggagggc 180 ccgaaca gtt tttcgccgac gccggaattg atgaagttgg ctgtggatgt gggattgaag 240 caggagttga tttttgccga tcgcaaattg cctcgttttg tgtattggga aaataagctg 300 caaccggtgc cgatgactcc accggcgatg attcagtctc agttgctgag ttttccgggg 360 aaactgcggg cgttgttcgg ggctttgggg tttgtcgcgc cggcaatggg cgatcgactt 420 tcgcagcagg gtaacgagga aacagtttct caatttttcc gccgtcatct cggtacggaa 480 gtgatgcagc ggttggtgga accttttgtt tctggggttt atgccggcga tccgcaacaa 540 cttagcgcgg cggcggcttt tggccgggta gccaagatgg ctgatgtggg tggcgggctg 600 gtggcggggg cgctgctttc tgctaaaaac agaccgaaga aaatgcctgc agacccgaat 660 gttcctaaaa ctaagccggg ggagttgggt tcgttcaagc aggggttgaa ggctttgcca 720 gaggcgatcg ctgctaagtt gggcgatcga gtgaaactca actggcactt gactcgcctc 780 cagcgcacag aacgcgaaac ttacattgct gaattctcga cgcccgacgg acagcaggaa 840 gttgaggcgc gcaccgtggt tttgacaacg cccgcttacg ttacagccga tttgttgcaa 900 cctctggaac cgcaagttag cagcgcttta caagctttta cttatcctac ggttgcctcc 960 gttgtcttag catacccgca gtcggatgtc aagggtaaat tagtgggttt tggaaattta 1020 attccgaggg ggcagggaat tcgc tgtctc gggacgattt ggacatcgag tttatttccc 1080 gatcgcgcgc ctgcagggtg gcaaactctc accagttaca tcggcggggc aacagactcg 1140 gaaattggca atctcgactc agaacaaatc gttcgggagg tacaccgaga tttgtctcgg 1200 attttgctga aaccagatgt gccacagcca aaagttttaa cggtgaagct gtggaaacgg 1260 gcgattcctc agtacaattt ggggcatttc gatcgcctgc aacaaatcga tgagggctta 1320 aaatctttgc ctggagtgta tttgtgcagc aactacgttg gcggagtggc tttgggagat 1380 tgcgtgcgaa ggggtttcga tcgtgcgcga gaagtgggcg agtatttgca gaagaaacaa 1440 tcagatactc gatcgatctg a 1461 <210> 3 <211> 479 <212> PRT <213> Lyngbya sp. PCC 8106 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(479) <223> CyPPO4 <400> 3 Met Thr His Val Leu Asp Ser Leu Ile Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly 1 5 10 15 Leu Ala Leu Ala His Ala Leu His Gln Asn Gln Asp His Gln Leu Pro 20 25 30 Leu Asn Ile Leu Val Ser Glu His Gln Gly Arg Val Gly Gly Asn Ile 35 40 45 Thr Thr Val Ser Glu Gly Glu Phe Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser 50 55 60 Phe Ser Pro Thr Pro Glu Leu Leu Lys Leu Ala Val Glu Val Gly Leu 65 70 75 80 Lys Pro Glu Leu Val Phe Ala Asp Arg Lys Leu Pro Arg Tyr Val Tyr 85 90 95 Trp Asn Gly Gln Leu Met Pro Val Pro Met Ser Pro Pro Ala Leu Leu 100 105 110 Ser Thr Lys Leu Leu Ser Pro Gly Gly Lys Leu Arg Ala Leu Thr Gly 115 120 125 Ala Leu Gly Phe Val Gln Pro Ala Met Gly Glu Ser Leu Ser Gln Gln 130 135 140 Asn Gly Glu Glu Thr Ile Ser Gln Phe Phe Glu Arg His Leu Gly Ser 145 150 155 160 Glu Val Leu Lys Arg Leu Val Glu Pro Phe Val Ser Gly Val Tyr Ala 165 170 175 Gly Asp Pro Gln Gln Leu Glu Ile Ser Ser Ala Phe Ala Arg Val Ala 180 185 190 Arg Met Ala Tyr Ser Gly Gly Gly Leu Val Ala Gly Ala Val Leu Ser 195 200 205 Arg Arg Gln Asn Lys Ser Pro Arg Ser Pro Ala Asp Pro Ser Ile Pro 210 215 220 Gln Thr Lys Arg Gly Glu Leu Gly Ser Phe Arg Gln Gly Ile Gly Ala 225 230 235 240 Leu Pro Asn Ala Ile Ala Lys Gln Leu Gly Asp Gln Leu Lys Leu Asn 245 250 255 Trp Gln Leu Thr Arg Leu Glu Arg Thr Glu Asn Gln Thr Tyr Arg Ala 260 265 270 Glu Phe Ser Thr Pro Glu Gly Val Gln Gln Val Glu Thr Arg Thr Val 275 280 285 Val Leu Thr Thr Pro Ala Tyr Val Thr Ala Glu Ile Leu Lys Pro Leu 290 295 300 Gln Leu Gln Val Ser Gln Thr Leu Thr Glu Ile Pro Tyr Pro Pro Val 305 310 315 320 Ala Cys Val Val Leu Ala Tyr Pro Val Ser Ala Leu Lys Gln Lys Leu 325 330 335 Thr Gly Phe Gly Asn Leu Val Pro Arg Gly Gln Gly Ile Arg Thr Leu 340 345 350 Gly Thr Ile Trp Thr Ser Ser Leu Phe Pro Gly Arg Ala Pro Gln Gly 355 360 365 Trp Gln Val Leu Thr Ser Tyr Ile Gly Gly Ala Thr Asp Pro Glu Ile 370 375 380 Gly Glu Leu Glu Asp Asp Gln Ile Val Glu Ala Val His Gln Asp Leu 385 390 395 400 Arg His Ile Leu Leu Lys Glu Asp Ile Ser Pro Lys Val Leu Ala Val 405 410 415 His Leu Trp Lys Arg Ala Ile Pro Gln Tyr Asn Leu Gly His Gln Gln 420 425 430 Arg Leu Gln His Val Asn Glu Gly Leu Glu Ala Met Pro Gly Leu Tyr 435 440 445 Leu Cys Ser Asn Tyr Ile Asp Gly Val Ala Leu Gly Asp Cys Val Arg 450 455 460 Arg Ser Ile Gly Gln Ala Asn Glu Ile Leu Ser Phe Leu Gly Gln 465 470 475 <210> 4 <211> 1440 <212> DNA <213> Lyngbya sp. PCC 8106 <220> <221> gene <222> (1)..(1440) <223> CyPPO4 <400> 4 atgactcacg tactcgatag tttaatcgtc ggtgcaggca ttagcggcct ggcgttagct 60 catgctctcc atcagaacca agatcatcaa ttgcctctca acattcttgt cagcgagcat 120 caaggacggg taggaggaaa tataaccaca gtatccgaag gagaatttct ttgggaagaa 180 ggccccaata gtttttctcc aacccctgag ttactgaagt tagcggtaga agtaggtctt 240 aagcctgagc tagtctttgc cgatcgcaag ttacctcggt acgtttactg gaatggtcaa 300 ctcatgcctg tgccgatgag tcctccggct ttgttgagta caaaactctt aagtcctgga 360 ggtaaacttc gagcattaac gggggcattg gggtttgtac aacccgcgat gggagaatcg 420 ttaagtcaac aaaatgggga agaaacgatc tcgcagtttt ttgagcgtca tttgggttca 480 gaagttctca agcgactggt tgaacccttt gtttctggtg tttatgcagg cgatccccag 540 caactcgaaa ttagctcggc ttttgcccga gtcgcacgta tggcttacag tggcggtgga 600 ttggttgctg gagcggtttt atcgcgtcgt cagaacaaat ctccgcgatc gcctgccgac 660 ccgtctattc cccaaactaa acggggagag ttggggtctt ttcgtcaggg gattggagcc 720 ttacccaatg cgatcgccaa acagttaggc gatcaactca aattaaactg gcaactcacc 780 cgtctcgaac ggactgaaaa ccaa acctat cgggctgaat tttcgactcc agaaggggtt 840 caacaggtag aaactcgaac ggtggtgttg acgactccgg cctatgtcac agcagaaatt 900 ctcaaaccgt tgcaactcca agtcagtcaa acgttaactg aaattcccta tcccccggtg 960 gcttgcgtcg ttttagccta tcccgtttca gctttaaagc agaaattaac cggatttggc 1020 aatttagttc cccgaggaca agggattcgg acgttaggca cgatttggac atcgagttta 1080 tttcctggtc gcgcccccca aggctggcaa gtcctcacca gttatattgg cggagcgacg 1140 gatccagaaa ttggagagtt agaagatgat caaattgttg aggcggttca tcaagatttg 1200 cgtcacattt tactcaaaga agatatctct cccaaagtgc tagccgtgca tctgtggaaa 1260 cgtgctatcc ctcaatacaa tctcggacac caacaacggt tacaacacgt taatgagggt 1320 ctagaggcaa tgccggggtt atatctgtgt agcaactata tcgacggtgt agcgttggga 1380 gattgtgtgc gtcgttctat cggacaagct aacgaaattc tcagtttttt gggtcaatag 1440 1440 <210> 5 <211> 466 <212> PRT <213> Halothece sp. PCC 7418 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(466) <223> CyPPO8 <400> 5 Met Ile Asp Thr Leu Ile Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly Leu Ser Ala 1 5 10 15 Ala Tyr Arg Leu Asp Glu Lys Gln Arg Gln Val Leu Val Ala Glu Lys 20 25 30 Arg Asp Arg Ala Gly Gly Asn Ile Thr Ser Gln Gln Ser Gly Asp Phe 35 40 45 Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Ser Pro Thr Pro Glu Leu Leu 50 55 60 Lys Leu Ala Val Asp Ala Gly Leu Arg Asn Glu Leu Ile Phe Ala Asp 65 70 75 80 Arg Gly Leu Pro Arg Tyr Val Tyr Trp Glu Gly Lys Leu Arg Pro Val 85 90 95 Pro Met Ser Pro Pro Thr Ala Val Thr Ser Gln Leu Leu Ser Pro Ile 100 105 110 Gly Lys Leu Arg Ala Leu Thr Gly Ala Leu Gly Phe Ile Pro Pro Gln 115 120 125 Val Ser Ser Gln Glu Glu Thr Val Ala Asp Phe Phe Thr Arg His Leu 130 135 140 Gly Ser Glu Val Ala Gln Arg Leu Val Ser Pro Phe Val Ser Gly Val 145 150 155 160 Tyr Ala Gly Asp Val Asp Gln Leu Ser Ala Glu Ala Ala Phe Gly Arg 165 170 175 Val Thr Gln Leu Ala Asp Val Gly Gly Gly Leu Val Ala Gly Ala Ile 180 185 190 Leu Cys Arg Arg Gln Lys Pro Lys Ser Thr Pro Lys Thr Ala Lys Pro 195 200 205 Ser Asp Ile Pro Glu Thr Lys Ser Gly Gln Leu Gly Ser Phe Lys Glu 210 215 220 Gly Leu Gln Gln Leu Pro Ser Ala Ile Val Ser Gln Leu Gly Asp Lys 225 230 235 240 Val Lys Phe Gln Trp Glu Leu Lys Asn Ile Ser Pro His Pro Glu Ser 245 250 255 Gly Tyr Val Ala Thr Phe Ser Thr Pro Glu Gly Glu Gln Thr Val Glu 260 265 270 Ala Lys Thr Val Ile Leu Thr Thr Pro Ala Tyr Val Thr Ala Ser Leu 275 280 285 Val Lys Asp Leu Ser Pro Gln Ala Ser Gln Ala Leu Asn Glu Ile Ser 290 295 300 Tyr Pro Pro Val Ala Cys Val Val Leu Ala Tyr Pro Asp Glu Ala Leu 305 310 315 320 Arg Phe Pro Leu Lys Gly Phe Gly Asn Leu Asn Pro Arg Ser Gln Gly 325 330 335 Ile Arg Thr Leu Gly Thr Ile Trp Ser Ser Thr Leu Phe Pro Gly Arg 340 345 350 Thr Pro Lys Gly Trp His Leu Leu Thr Asn Phe Ile Gly Gly Ala Thr 355 360 365 Asp Pro Ala Ile Ala Glu Leu Ser Glu Asp Gln Ile Ile Glu Gln Val 370 375 380 His Gln Asp Leu Gln Gln Ala Val Ile Lys Ser Gly Ser Ile Pro Lys 385 390 395 400 Pro Leu Ala Val His Leu Trp Ser Lys Ala Ile Pro Gln Tyr Asn Leu 405 410 415 Gly His Leu Lys Arg Leu Glu Thr Ile Arg Asn His Leu Lys Pro Phe 420 425 430 Ser Gly Leu Phe Leu Ser Ser Asn Tyr Leu Asp Gly Val Ala Leu Gly 435 440 445 Asp Cys Val Arg Arg Gly Glu Glu Ser Ser Gln Ala Val Leu Asp Tyr 450 455 460 Leu Gly 465 <210> 6 <211> 1401 <212> DNA <213> Halothece sp. PCC 7418 <220> <221> gene <222> (1)..(1401) <223> CyPPO8 <400> 6 atgatagata ctttaattgt gggagcaggg attagtggtt taagtgctgc gtatcgactc 60 gatgagaagc agcgccaagt gctggttgca gaaaagcgcg atcgcgctgg gggaaatatc 120 accagccaac aaagtggcga tttcctctgg gaagaaggac cgaacagttt ttctcccaca 180 ccagaactcc taaaactagc ggttgatgcg ggcttaagaa atgagttaat ctttgctgat 240 cgcggacttc cccgttatgt ttattgggag gggaaactgc gccctgttcc tatgagtccc 300 cccacagccg tgacatccca gttgctgagt ccaatcggga aactacgggc gttaacgggt 360 gcattaggct ttattccccc gcaagtgtcg agtcaggaag aaacggttgc ggactttttt 420 acccgtcatc tcggttcaga agtagcccaa cggttagtga gtccgtttgt gtctggggtt 480 tatgcagggg atgtggatca actcagtgcg gaagctgcat ttggacgagt tacccaactg 540 gcggatgtgg gcggtggact ggtcgcaggt gcgattttat gtcgtcgtca aaagccaaag 600 tcaaccccaa aaacggctaa accgtctgat attccagaaa caaagtctgg acagttaggt 660 tcatttaagg aaggattaca acaattaccc agcgcgatcg tttctcaact gggagacaaa 720 gtaaagtttc aatgggaact gaaaaatatc tcccctcatc cagaatcggg ttacgtcgcg 780 acattttcca caccagaggg agaa caaaca gtcgaagcca aaaccgttat cctcaccact 840 cccgcctacg ttaccgcctc tctggtcaaa gatttatcac ctcaagccag tcaagcctta 900 aacgaaattt cctatccccc cgtagcttgt gtggtcttag cctatcccga tgaagccctc 960 cgttttcccc tcaaaggatt tggtaatctt aaccctcgca gtcaaggaat ccgcactctt 1020 ggtacaattt ggagttcaac actctttcca ggacgcacgc cgaaaggttg gcatctctta 1080 accaatttta ttggcggtgc aactgatccc gcaattgctg aactcagtga agatcaaatt 1140 attgaacaag tccatcaaga cttacaacaa gcggtgatta aatcgggaag tatcccgaaa 1200 cccttagccg ttcatttgtg gtcaaaagcg attccgcaat acaatctcgg acatctgaaa 1260 cggttagaaa ccatccgcaa tcacttaaaa cccttctctg gactcttttt atcgagtaac 1320 tatctcgatg gcgttgcgtt gggtgattgt gtgcgccgag gggaagagag tagtcaagcc 1380 gtgttagatt atttgggtta a 1401 <210> 7 <211> 486 <212> PRT <213> Microcoleus vaginatus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(486) <223> CyPPO12 <400> 7 Met Glu Leu Leu Asp Thr Leu Ile Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly Leu 1 5 10 15 Ser Leu Ala His Ala Leu His Lys Glu Ala Thr Ser Pro Ser Ser Leu 20 25 30 Lys Ile Leu Val Ala Glu Ser Gln Gly Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr 35 40 45 Thr Val Thr Ala Glu Gly Phe Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe 50 55 60 Ser Pro Thr Pro Glu Leu Met Lys Leu Ala Val Asp Val Gly Leu Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Ile Phe Ala Asp Arg Lys Leu Pro Arg Phe Val Tyr Trp 85 90 95 Gln Asn Lys Leu Gln Pro Val Pro Met Thr Pro Pro Ala Met Ile Gln 100 105 110 Ser Gln Leu Leu Ser Phe Pro Gly Lys Leu Arg Ala Leu Phe Gly Ala 115 120 125 Leu Gly Phe Val Ala Pro Ala Ile Gly Ser Gly Leu Ser Gln Gln Gly 130 135 140 Asp Glu Glu Thr Val Ser Gln Phe Phe Arg Arg His Leu Gly Thr Glu 145 150 155 160 Val Met Gln Arg Leu Val Glu Pro Phe Val Ser Gly Val Tyr Ala Gly 165 170 175 Asp Pro Gln Gln Leu Ser Ala Ala Ala Ala Phe Gly Arg Val Thr Lys 180 185 190 Met Ala Asp Val Gly Gly Gly Leu Met Ala Gly Ala Leu Leu Ser Ala 195 200 205 Arg Lys Arg Pro Lys Gln Met Pro Ala Asp Pro Asn Val Pro Ser Thr 210 215 220 Arg Pro Gly Glu Leu Gly Ser Phe Lys Gln Gly Leu Lys Ala Leu Pro 225 230 235 240 Glu Ala Ile Ala Ala Gln Leu Gly Asp Arg V al Lys Val Asn Trp His 245 250 255 Leu Thr Arg Leu Gln Arg Thr Glu Arg Glu Thr Tyr Ile Ala Val Phe 260 265 270 Ser Thr Pro Asp Gly Gln Gln Glu Val Glu Ala Arg Thr Val Val Leu 275 280 285 Thr Thr Pro Ala Tyr Ile Thr Ala Glu Leu Leu Gln Pro Leu Gln Pro 290 295 300 Lys Val Ser Ser Ala Leu Gln Ala Phe Thr Tyr Pro Thr Val Ala Cys 305 310 315 320 Val Val Leu Ala Tyr Pro Gln Ser Asp Val Lys Asp Lys Leu Val Gly 325 330 335 Phe Gly Asn Leu Ile Pro Arg Gly Gln Gly Ile Arg Thr Leu Gly Thr 340 345 350 Ile Trp Thr Ser Ser Leu Phe Ala Asp Arg Ala Pro Ala Gly Trp Gln 355 360 365 Thr Leu Ser Ser Tyr Ile Gly Gly Ala Thr Asp Ser Glu Ile Gly Asn 370 375 380 Leu Asp Ser Glu Gln Ile Val Arg Glu Val His Arg Asp Leu Ser Arg 385 390 395 400 Ile Leu Leu Lys Pro Asp Val Pro Gln Pro Lys Val Leu Ala Val Asn 405 410 415 Val Trp Lys Arg Ala Ile Pro Gln Tyr Asn Leu Gly His Phe Asp Arg 420 425 430 Leu Gln Gln Ile Asp Glu Gly Leu Lys Ser Leu Pro Gly Val Tyr Leu 435 440 445 Cys Ser Asn Tyr Val Gly Gly Val Ala Leu Gly A sp Cys Val Arg Arg 450 455 460 Gly Phe Glu Arg Ala Arg Glu Val Gly Glu Tyr Leu Gln Asn Lys Gln 465 470 475 480 Ser Asp Thr Arg Ser Ile 485 <210> 8 <211> 1461 <212> DNA <213> Microcoleus vaginatus <220> <221> gene <222> (1)..(1461) <223> CyPPO12 <400> 8 atggaactct tggatactct cattgttgga gcaggtattt caggactttc tctcgcacac 60 gctttacata aggaggctac ttcaccatct tcacttaaga ttttggttgc tgaatctcaa 120 ggtagagtgg gaggtaatat cactacagtt accgctgagg gttttctttg ggaagaggga 180 cctaacagtt tctctcctac tccagaactc atgaagttag ctgttgatgt gggacttaaa 240 caggagttga tttttgcaga tagaaaactt ccaagattcg tgtattggca aaacaaactt 300 caacctgttc caatgacacc tccagctatg atccaatctc agcttctttc ttttcctgga 360 aaacttagag ctttgtttgg tgcacttgga ttcgttgctc cagcaatagg ttcaggattg 420 agtcaacagg gagatgaaga gactgtttct caatttttca gaaggcatct cggaacagaa 480 gttatgcaga gattagtgga gccatttgtt agtggtgtgt acgctggaga tcctcaacag 540 ctttctgctg ctgctgcttt cggtagggtt acaaaaatgg ctgatgtggg aggtggattg 600 atggctggag cactcttatc tgctagaaag aggccaaaac aaat gcctgc tgatcctaat 660 gttccttcaa ctagacctgg tgaattggga agttttaagc aaggtctcaa ggctcttcca 720 gaggcaatag ctgcacagct cggagataga gttaaggtga actggcacct tacaagattg 780 caaaggactg aaagagagac atatattgct gtgttctcta ctcctgatgg acaacaggaa 840 gttgaggcaa gaacagttgt gcttaccact ccagcttaca tcaccgcaga acttttgcaa 900 ccacttcagc ctaaagttag ttctgctttg caagcattca catatccaac cgttgcttgt 960 gttgtgttgg cataccctca gtcagatgtt aaggataaac tcgtgggttt tggaaatctt 1020 attcctagag gtcaaggaat caggactctc ggtacaatat ggacctcaag tttattcgct 1080 gatagagcac ctgctggatg gcaaaccctt tcttcatata ttggtggagc tactgatagt 1140 gagatcggta acctcgattc tgaacagata gttagggagg tgcatagaga tttgtcaaga 1200 attttgctca agcctgatgt tcctcaacca aaagtgttgg ctgttaatgt gtggaagaga 1260 gcaataccac agtacaacct tggacacttt gataggttgc aacagattga tgaaggtctc 1320 aaatctttac ctggagttta tctctgttca aactacgttg gtggagtggc tttaggagat 1380 tgcgttagaa ggggattcga gagggcaaga gaggttggag aatacttaca aaacaaacaa 1440 tctgatacca ggtcaatctg a 1461 <210> 9 <211> 537 <212> PRT <21 3> Arabidopsis thaliana <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(537) <223> Wild type AtPPO1 <400> 9 Met Glu Leu Ser Leu Leu Arg Pro Thr Thr Gln Ser Leu Leu Pro Ser 1 5 10 15 Phe Ser Lys Pro Asn Leu Arg Leu Asn Val Tyr Lys Pro Leu Arg Leu 20 25 30 Arg Cys Ser Val Ala Gly Gly Pro Thr Val Gly Ser Ser Lys Ile Glu 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Thr Thr Ile Thr Thr Asp Cys Val Ile Val Gly Gly 50 55 60 Gly Ile Ser Gly Leu Cys Ile Ala Gln Ala Leu Ala Thr Lys His Pro 65 70 75 80 Asp Ala Ala Pro Asn Leu Ile Val Thr Glu Ala Lys Asp Arg Val Gly 85 90 95 Gly Asn Ile Ile Thr Arg Glu Glu Asn Gly Phe Leu Trp Glu Glu Gly 100 105 110 Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Met Leu Thr Met Val Val Asp 115 120 125 Ser Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val Leu Gly Asp Pro Thr Ala Pro Arg 130 135 140 Phe Val Leu Trp Asn Gly Lys Leu Arg Pro Val Pro Ser Lys Leu Thr 145 150 155 160 Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile Gly Gly Lys Ile Arg Ala 165 170 175 Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Ser Pro Pro Gly Arg Glu Glu 180 185 190 Ser Va l Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly Asp Glu Val Phe Glu 195 200 205 Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser 210 215 220 Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys Val Trp Lys Leu Glu Gln 225 230 235 240 Asn Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Phe Lys Ala Ile Gln Glu Arg 245 250 255 Lys Asn Ala Pro Lys Ala Glu Arg Asp Pro Arg Leu Pro Lys Pro Gln 260 265 270 Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly Leu Arg Met Leu Pro Glu 275 280 285 Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Ser Lys Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu 290 295 300 Ser Gly Ile Thr Lys Leu Glu Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Thr Tyr Glu 305 310 315 320 Thr Pro Asp Gly Leu Val Ser Val Gln Ser Lys Ser Val Val Met Thr 325 330 335 Val Pro Ser His Val Ala Ser Gly Leu Leu Arg Pro Leu Ser Glu Ser 340 345 350 Ala Ala Asn Ala Leu Ser Lys Leu Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val 355 360 365 Ser Ile Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile Arg Thr Glu Cys Leu Ile Asp 370 375 380 Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gln Leu His Pro Arg Thr Gln Gly Val 385 390 395 400 Glu Th r Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala 405 410 415 Pro Pro Gly Arg Ile Leu Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Ser Thr Asn 420 425 430 Thr Gly Ile Leu Ser Lys Ser Glu Gly Glu Leu Val Glu Ala Val Asp 435 440 445 Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Lys Pro Asn Ser Thr Asp Pro Leu 450 455 460 Lys Leu Gly Val Arg Val Trp Pro Gln Ala Ile Pro Gln Phe Leu Val 465 470 475 480 Gly His Phe Asp Ile Leu Asp Thr Ala Lys Ser Ser Leu Thr Ser Ser 485 490 495 Gly Tyr Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala 500 505 510 Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu Thr Ala Ile Glu Val Asn 515 520 525 Asn Phe Met Ser Arg Tyr Ala Tyr Lys 530 535 <210> 10 <211> 1614 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> gene <222> (1)..(1614) <223> Wild type AtPPO1 <400> 10 atggagttat ctcttctccg tccgacgact caatcgcttc ttccgtcgtt ttcgaagccc 60 aatctccgat taaatgttta taagcctctt agactccgtt gttcagtggc cggtggacca 120 accgtcggat cttcaaaaat cgaaggcgga ggaggcacca ccatcacgac ggattgtgtg 180 attgtcggcg gaggta ttag tggtctttgc atcgctcagg cgcttgctac taagcatcct 240 gatgctgctc cgaatttaat tgtgaccgag gctaaggatc gtgttggagg caacattatc 300 actcgtgaag agaatggttt tctctgggaa gaaggtccca atagttttca accgtctgat 360 cctatgctca ctatggtggt agatagtggt ttgaaggatg atttggtgtt gggagatcct 420 actgcgccaa ggtttgtgtt gtggaatggg aaattgaggc cggttccatc gaagctaaca 480 gacttaccgt tctttgattt gatgagtatt ggtgggaaga ttagagctgg ttttggtgca 540 cttggcattc gaccgtcacc tccaggtcgt gaagaatctg tggaggagtt tgtacggcgt 600 aacctcggtg atgaggtttt tgagcgcctg attgaaccgt tttgttcagg tgtttatgct 660 ggtgatcctt caaaactgag catgaaagca gcgtttggga aggtttggaa actagagcaa 720 aatggtggaa gcataatagg tggtactttt aaggcaattc aggagaggaa aaacgctccc 780 aaggcagaac gagacccgcg cctgccaaaa ccacagggcc aaacagttgg ttctttcagg 840 aagggacttc gaatgttgcc agaagcaata tctgcaagat taggtagcaa agttaagttg 900 tcttggaagc tctcaggtat cactaagctg gagagcggag gatacaactt aacatatgag 960 actccagatg gtttagtttc cgtgcagagc aaaagtgttg taatgacggt gccatctcat 1020 gttgcaagtg gtctcttgcg ccctctttct gaa tctgctg caaatgcact ctcaaaacta 1080 tattacccac cagttgcagc agtatctatc tcgtacccga aagaagcaat ccgaacagaa 1140 tgtttgatag atggtgaact aaagggtttt gggcaattgc atccacgcac gcaaggagtt 1200 gaaacattag gaactatcta cagctcctca ctctttccaa atcgcgcacc gcccggaaga 1260 attttgctgt tgaactacat tggcgggtct acaaacaccg gaattctgtc caagtctgaa 1320 ggtgagttag tggaagcagt tgacagagat ttgaggaaaa tgctaattaa gcctaattcg 1380 accgatccac ttaaattagg agttagggta tggcctcaag ccattcctca gtttctagtt 1440 ggtcactttg atatccttga cacggctaaa tcatctctaa cgtcttcggg ctacgaaggg 1500 ctatttttgg gtggcaatta cgtcgctggt gtagccttag gccggtgtgt agaaggcgca 1560 tatgaaaccg cgattgaggt caacaacttc atgtcacggt acgcttacaa gtaa 1614 <210> 11 <211> 537 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type AtPPO1 <400> 11 Met Glu Leu Ser Leu Leu Arg Pro Thr Thr Gln Ser Leu Leu Pro Ser 1 5 10 15 Phe Ser Lys Pro Asn Leu Arg Leu Asn Val Tyr Lys Pro Leu Arg Leu 20 25 30 Arg Cys Ser Val Ala Gly Gly Pro Thr Val Gly Ser Ser Lys Ile Glu 35 40 45 Gly Gly Gly Gly T 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cagttac 1080 atcggcgggg caacagactc ggaaattggc aatctcgact cagaacaaat cgttcgggag 1140 gtacaccgag atttgtctcg gattttgctg aaaccagatg tgccacagcc aaaagtttta 1200 acggtgaagc tgtggaaacg ggcgattcct cagtacaatt tggggcattt cgatcgcctg 1260 caacaaatcg atgagggctt aaaatctttg cctggagtgt atttgtgcag caactacgtt 1320 ggcggagtgg ctttgggaga ttgcgtgcga aggggtttcg atcgtgcgcg agaagtgggc 1380 gagtatttgc agaagaaaca atcagatact cgatcgatct ga 1422 <210> 14 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CyPPO4 mutant <400> 14 Met Thr His Val Leu Asp Ser Leu Ile Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly 1 5 10 15 Leu Ala Leu Ala His Ala Leu His Gln Asn Gln Asp His Gln Leu Pro 20 25 30 Leu Asn Ile Leu Val Ser Glu His Gln Gly Arg Val Gly Gly Asn Ile 35 40 45 Thr Thr Val Ser Glu Gly Glu Phe Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser 50 55 60 Phe Ser Pro Thr Pro Glu Leu Leu Lys Leu Ala Val Glu Val Gly Leu 65 70 75 80 Lys Pro Glu Leu Val Phe Ala Asp Arg Lys Leu Pro Arg Tyr Val Tyr 85 90 95 Trp Asn Gly Gln Leu Met Pro Leu Ser Pro Gly Gly 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ggcatctctt aaccaatttt attggcggtg caactgatcc cgcaattgct 1080 gaactcagtg aagatcaaat tattgaacaa gtccatcaag acttacaaca agcggtgatt 1140 aaatcgggaa gtatcccgaa acccttagcc gttcatttgt ggtcaaaagc gattccgcaa 1200 tacaatctcg gacatctgaa acggttagaa accatccgca atcacttaaa acccttctct 1260 ggactctttt tatcgagtaa ctatctcgat ggcgttgcgt tgggtgattg tgtgcgccga 1320 ggggaagaga gtagtcaagc cgtgttagat tatttgggtt aa 1362 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCC7112_BmHIF primer <400> 18 ccccggatcc atggaactat tagatacctt gattgtggg 39 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCC7112_StuIR primer <400> 19 cccaggcctg atcgatcgag tatctgattg 30 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCC7418_BmHIF primer <400> 20 ccccggatcc atgatagata ctttaattgt ggg 33 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCC7418_XhoIR primer <400> 21 ccccctcgag acccaaataa tctaacacgg 30 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <2 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