[0001] 本专利申请要求2010年8月26日提交的美国临时申请61/377248和2010年12月30日提交的美国临时申请61/428277的权益，上述专利申请的公开内容据此全文以引用方式并入。

[0002] 本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明涉及制备编码突变型Δ-5脂肪酸去饱和酶（其中在细胞色素b5-样域的HPGG[SEQ ID NO:7]基序内发生至少一个突变，并且在HDASH[SEQ ID NO:8]基序内发生至少一个突变）的核酸片段。

[0003] 包括植物、藻类、真菌、原生藻菌（stramenopiles）和酵母在内的多种不同宿主正被研究旨在用于商业化多不饱和脂肪酸[“PUFA”]生产。基因工程已展示出，一些宿主（即使是亚油酸[LA；18:2ω-6]和α-亚麻酸[ALA；18:3ω-3]脂肪酸生产天然受限的那些）的天然能力可被充分改变以致使高水平生产多种长链ω-3/ω-6PUFA。花生四烯酸[ARA；20:4ω-6]、二十碳五烯酸[EPA；20:5ω-3]和二十二碳六烯酸[DHA；22:6ω-3]的生产可能都需要Δ-5去饱和酶基因的表达，无论这是天然能力还是重组技术的结果。

[0004] 因此，本发明涉及具有高活性的新型Δ-5去饱和酶，其很好地适于整合进商用宿主细胞中的PUFA生物合成途径中。

[0005] 在第一实施方案中，本发明涉及具有Δ-5去饱和酶活性的突变多肽，其包含：

[0006] (a)如SEQ ID NO:34[HxGx]所示的氨基酸基序，其中SEQ ID NO:34[HxGx]与SEQ ID NO:7[HPGG]不同；和

[0007] (b)如SEQ ID NO:1[HxxxH]所示的氨基酸基序，其中SEQ ID NO:1[HxxxH]与SEQ ID NO:8[HDASH]不同。

[0008] 在第二实施方案中，(a)的氨基酸基序选自：SEQ ID NO:9[HgGG]、SEQ ID NO:10[HhGG]、SEQ ID NO:11[HPGs]、SEQ ID NO:12[HcGG]、SEQ ID NO:13[HwGG]和SEQ ID NO:14[HaGG]；并且，(b)的氨基酸基序选自：SEQ ID NO:15[HDgSH]、SEQ ID NO:16[HDsSH]、SEQ ID NO:17[HDAaH]、SEQ ID NO:18[HDAgH]和SEQ ID NO:19[HeASH]。

[0009] 在第三实施方案中，基于BLASTP比对方法在与具有选自：SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:29的序列的多肽进行比较时，所述突变多肽具有至少90%的序列同一性。

[0010] 在第四实施方案中，所述突变多肽的氨基酸序列选自：SEQ ID NO:139[EgD5R*-34g157g]、SEQ ID NO:141[EgD5R*-34g158a]、SEQ ID NO:143[EgD5R*-34g158g]、SEQ ID NO:145[EgD5R*-34h158a]、SEQ ID NO:147[EgD5R*-34h158g]、SEQ ID NO:149[EgD5R*-
36s158a]、SEQ ID NO:151[EgD5R*-36s158g]、SEQ ID NO:153[EgD5M、密码子优化的
EgD5R*-34g158g]、SEQ ID NO:157[EgD5M1、密码子优化的EgD5R*-34g158g347s]、SEQ ID NO:181[EgD5S-36s156e]、SEQ ID NO:183[EgD5S-36s157g]、SEQ ID NO:185[EgD5S-
36s158a]、SEQ ID NO:187[EgD5S-36s158g]、SEQ ID NO:213[EaD5S-35a158g]、SEQ ID NO:
215[EaD5S-35a158s]、SEQ ID NO:217[EaD5S-35a159g]、SEQ ID NO:255[EgD5R-34g158g]、SEQ ID NO:260[EgD5R-34g158a]、SEQ ID NO:271[EaD5-35g159g]和SEQ ID NO:276[EaD5-
35g159a]。

[0011] 在第五实施方案中，所述突变多肽的二高-γ-亚麻酸至花生四烯酸的转化效率为亲本多肽的二高-γ-亚麻酸至花生四烯酸的转化效率的至少64%，所述亲本多肽包含与SEQ ID NO:7[HPGG]相同的氨基酸基序和与SEQ ID NO:8[HDASH]相同的氨基酸基序。

[0012] 在第六实施方案中，所述发明涉及编码所述突变多肽中的任一种的分离的核酸分子。优选地，所述分离的核酸分子具有选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO:138[EgD5R*-34g157g]、SEQ ID NO:140[EgD5R*-34g158a]、SEQ ID NO:142[EgD5R*-34g158g]、SEQ ID NO:144[EgD5R*-34h158a]、SEQ ID NO:146[EgD5R*-34h158g]、SEQ ID NO:148[EgD5R*-
36s158a]、SEQ ID NO:150[EgD5R*-36s158g]、SEQ ID NO:152[EgD5M、密码子优化的
EgD5R*-34g158g]、SEQ ID NO:156[EgD5M1、密码子优化的EgD5R*-34g158g347s]、SEQ ID NO:180[EgD5S-36s156e]、SEQ ID NO:182[EgD5S-36s157g]、SEQ ID NO:184[EgD5S-
36s158a]、SEQ ID NO:186[EgD5S-36s158g]、SEQ ID NO:212[EaD5S-35a158g]、SEQ ID NO:
214[EaD5S-35a158s]、SEQ ID NO:216[EaD5S-35a159g]、SEQ ID NO:254[EgD5R-34g158g]、SEQ ID NO:259[EgD5R-34g158a]、SEQ ID NO:270[EaD5-35g159g]和SEQ ID NO:275[EaD5-
35g159a]。

[0013] 在第七实施方案中，本发明涉及表达所述突变多肽中的任一种的转化的宿主细胞。优选地，所述转化的宿主细胞选自：微生物，最优选含油酵母；以及植物，最优选油料种子植物。

[0014] 在第八实施方案中，所述转化的宿主细胞产生选自ω-6脂肪酸和ω-3脂肪酸的多不饱和脂肪酸。

[0015] 生物保藏

[0016] 下列生物材料保藏于美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection）（ATCC）（10801University Boulevard，Manassas，VA20110-2209），并具有下列名称、保藏号和保藏日期。

[0017]

[0018] 上面列出的生物材料将按照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的有关条款来保存。所列出的保藏物将会被保持在指定的国际保藏机构中至少30年，并且一旦准予专利公开它就将会对公众开放。在由政府行为授予的专利权的部分废除中，保藏物的可用性不会构成实践主题发明的许可。

[0019] 根据如美国专利申请公布2010-0317072-A1所述的方法，解脂耶氏酵母Y9502来源于解脂耶氏酵母Y8412。

[0020] 附图说明和序列表

[0021] 图1A和图1B示出了ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径，并且当考虑下文对该途径的描述时应被视为是一起的。

[0022] 图2是小眼虫（Euglena gracilis）Δ-5去饱和酶的预测拓扑模型。

[0023] 图3A、3B、3C和3D示出了来自小眼虫的野生型Δ-5去饱和酶基因（即，EgD5[SEQ ID NO:20]）与变体野生型小眼虫（E.gracilis）Δ-5去饱和酶基因的DNA序列比对，所述突变野生型基因包含一个S347R突变（即，EgD5R[SEQ ID NO:24]）。

[0024] 图4A、4B和4C示出了质粒pDMW367-M4的构建。

[0025] 图5示出了来自小眼虫的变体野生型Δ-5去饱和酶基因（即，EgD5R[SEQ ID NO:24]）的5’部分与合成突变型Δ-5去饱和酶的前204bp的序列比对，后者来源于小眼虫并经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达，并且包含HgGG[SEQ ID NO:9]和HDAgH[SEQ ID NO:
18]基序（即，EgD5M[SEQ ID NO:152]）。

[0026] 图6提供了以下的质粒图谱：（A）pEgD5M和（B）pDMW367-5M。

[0027] 图7示出了解脂耶氏酵母菌株Z1978的发育。

[0028] 图8提供了以下的质粒图谱：（A）pZKUM和（B）pZKL3-9DP9N。

[0029] 图9示出了解脂耶氏酵母菌株Z8001至Z8054的发育。

[0030] 图10A示意性地示了与pYPS234的同源重组反应，而图10B提供了pYPS234的质粒图谱。

[0031] 图11A示意性地示了与pYPS233的同源重组反应，而图11B提供了pYPS233的质粒图谱。

[0032] 图12A示意性地示了与pYPS241的同源重组反应，而图12B提供了pYPS241的质粒图谱。

[0033] 图13提供了以下的质粒图谱：（A）pZR5AU-555和（B）pZR5AU-555M。

[0034] 根据下面的详细描述和附带的序列描述可更充分地理解本发明，下面的详细描述和附带的序列描述形成了本专利申请的一部分。

[0035] 下面的序列遵循37C.F.R.§1.821-1.825（“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求—序列规则”），并且符合世界知识产权组织（WIPO）标准ST.25（1998）以及EPO和PCT的序列表要求（规则5.2和49.5（a-bis）以及行政指令（Administrative Instructions）的208节和附录C）。核苷酸的符号和格式以及氨基酸序列数据符合如37C.F.R.§1.822所示的规则。

[0036] SEQ ID NO:1-311是编码基因或蛋白质（或其部分）的ORF、引物或质粒的ORF，如表1所鉴定的。

[0037] 表1：核酸和蛋白质SEQ ID号的汇总

[0038]

[0039]

[0040]

[0041]

[0042]

[0043]

[0044]

[0045] 本文引用的所有专利和非专利文献据此全文以引用方式并入本文。

[0046] 在本公开中，使用了大量的术语和缩写。标准三字母代码或单字母代码用于指氨基酸。提供了如下定义。

[0047] “开放阅读框”缩写为ORF。

[0048] “聚合酶链反应”缩写为“PCR”。

[0049] “美国典型培养物保藏中心”缩写为“ATCC”。

[0050] “多不饱和脂肪酸”缩写为“PUFA”。

[0051] “三酰基甘油”缩写为“TAG”。

[0052] “总脂肪酸”缩写为“TFA”。

[0053] “脂肪酸甲酯”缩写为“FAME”。

[0054] “细胞干重”缩写为“DCW”。

[0055] 将具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的基序（即，His-Pro-Gly-Gly）缩写为“HPGG”。

[0056] 将具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的基序（即，His-Asp-Ala-Ser-His）缩写为“HDASH”。

[0057] 如本文所用的术语“发明”或“本发明”旨在指如本文的权利要求和说明书中所描述的本发明的所有方面和实施方案，并不应局限于任何具体实施方案或方面。

[0058] 术语“脂肪酸”是指约C12-C22的不同链长的长链脂族酸（链烷酸），尽管更长和更短链长的酸均是已知的。主链长度介于C16和C22之间。脂肪酸的结构可由简单的记号系统“X:Y”来表示，其中X表示具体脂肪酸中碳[“C”]原子的总数，而Y表示双键的数目。另外的关于“饱和脂肪酸”对“不饱和脂肪酸”、“单不饱和脂肪酸”对“多不饱和脂肪酸（PUFA）”、以及“ω-6脂肪酸（ω-6或n-6）”对“ω-3脂肪酸（ω-3或n-3）”之间的区别的详细信息提供于美国专利7,238,482中，该专利据此以引用方式并入本文。

[0059] 下表2示出了用于描述本文PUFA的命名。在标题为“简化符号”一栏中，ω-参考系用于表明碳的数目、双键的数目和最接近ω碳的双键位置，双键位置的计数从ω碳开始（为此，ω碳编号为1）。该表的其余部分汇总了ω-3和ω-6脂肪酸以及它们的前体的通用名、将在整个说明书中使用的缩写以及每种化合物的化学名。

[0060] 表2：多不饱和脂肪酸和前体的命名

[0061]通用名 缩写 化学名 简化符号
肉豆蔻酸 -- 十四酸 14:0
棕榈酸 棕榈酸盐 十六酸 16:0
棕榈油酸 -- 9-十六碳烯酸 16:1
硬脂酸 -- 十八酸 18:0
油 -- 顺式-9-十八碳烯酸 18:1
亚油酸 LA 顺式-9,12-十八碳二烯酸 18:2ω-6
γ-亚麻酸 GLA 顺式-6,9,12-十八碳三烯酸 18:3ω-6
二十碳二烯酸 EDA 顺式-11,14-二十碳二烯酸 20:2ω-6
二高-γ-亚麻酸 DGLA 顺式-8,11,14-二十碳三烯酸 20:3ω-6
花生四烯酸 ARA 顺式-5,8,11,14-二十碳四烯酸 20:4ω-6
α-亚麻酸 Ala 顺式-9,12,15-十八碳三烯酸 18:3ω-3
十八碳四烯酸 STA 顺式-6,9,12,15-十八碳四烯酸 18:4ω-3
二十碳三烯酸 ETrA 顺式-11,14,17-二十碳三烯酸 20:3ω-3
二十碳四烯酸 ETA 顺式-8,11,14,17-二十碳四烯酸 20:4ω-3
二十碳五烯酸 EPA 顺式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸 20:5ω-3
二十二碳四烯酸 DTA 顺式-7,10,13,16-二十二碳四烯酸 22:4ω-6

[0062]二十二碳五烯酸 DPAn-6 顺式-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸 22:5ω-6
二十二碳五烯酸 DPA 顺式-7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸 22:5ω-3
二十二碳六烯酸 DHA 顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸 22:6ω-3

[0063] 虽然表2列出的ω-3/ω-6PUFA是最有可能在使用本发明所述方法的微生物和植物宿主的油级分中积聚的，但该列表不应被理解为限制性的或完全的。

[0064] 术语“油”是指在25℃下为液体的脂质物质；所述油是疏水性的，但可溶于有机溶剂中。在含油生物中，油构成总脂质的主要部分。“油”主要由三酰基甘油组成，但也可包含其它中性脂质、磷脂和游离脂肪酸。油中的脂肪酸组合物和总脂质的脂肪酸组合物一般来讲是相似的；因此，总脂质中的PUFA浓度的提高或降低将对应于油中的PUFA浓度的提高或降低，反之亦然。

[0065] “中性脂质”是指那些一般作为贮存脂肪存在于细胞中的脂质体中的脂质，它们之所以被称为“中性脂质”，是因为在细胞的pH下，所述脂质不含带电基团。一般来讲，它们是完全非极性的，对水无亲和力。中性脂质一般是指甘油与脂肪酸的单酯、二酯、和/或三酯，也分别称为单酰基甘油、二酰基甘油或三酰基甘油，或统称为酰基甘油。为了从酰基甘油中释放游离脂肪酸，必须发生水解反应。

[0066] 术语“三酰基甘油”[“TAG”]是指由三个脂肪酰残基酯化一个甘油分子组成的中性脂质。TAG可包含长链PUFA和饱和脂肪酸，以及较短链的饱和的和不饱和的脂肪酸。

[0067] 本文术语“总脂肪酸”[“TFA”]是指所有细胞脂肪酸的总和，所述脂肪酸在给定样品中通过碱酯交换方法（如本领域已知的）被衍生为脂肪酸甲酯[“FAME”]，所述样品可为例如生物质或油。因此，总脂肪酸包括来自中性脂质级分（包括二酰基甘油、单酰基甘油和TAG）和来自极性脂质级分（包括磷脂酰胆碱和磷酸酰乙醇胺级分）的脂肪酸，但不包括游离脂肪酸。

[0068] 术语细胞的“总脂质含量”是TFA的量度，以干细胞重量[“DCW”]的百分比表示，尽管总脂质含量可近似地为FAME的量度，以DCW的百分比[“FAME%DCW”]表示。因此，总脂质含量[“TFA%DCW”]等于，例如，脂肪酸毫克数/100毫克DCW。

[0069] 总脂质中的脂肪酸浓度在本文中以TFA的重量百分比[“%TFA”]表示，例如，给定脂肪酸的毫克数/100毫克TFA。在本公开中，除非另有具体地说明，所提及的给定脂肪酸相对于总脂质的百分比等同于所述脂肪酸以%TFA表示的浓度，例如%EPA对总脂质等同于EPA%TFA。

[0070] 术语“脂质特征”和“脂质组成”是可互换的，并且是指在具体脂质级分中，例如在总脂质或油脂中，包含的各种脂肪酸分别的量，其中所述量以TFA的重量百分比表示。混合物中存在的各单个脂肪酸的总和应为100。

[0071] 术语“PUFA生物合成途径”是指将油酸转化成诸如LA、EDA、GLA、DGLA、ARA、DTA和DPAn-6之类的ω-6脂肪酸和诸如ALA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA之类的ω-3脂肪酸的代谢过程。文献中详细描述了该过程。参见如美国专利申请7,932,077。简而言之，该过程涉及通过添加碳原子来延长碳链和通过加入双键来使分子去饱和，这通过存在于内质网膜中的一系列特异性延伸酶和去饱和酶（称为“PUFA生物合成途径酶”）进行。更具体地，“PUFA生物合成途径酶”是指与PUFA的生物合成相关联的任何以下酶（以及编码所述酶的基因），包括：Δ-4去饱和酶、Δ-5去饱和酶、Δ-6去饱和酶、Δ-12去饱和酶、Δ-15去饱和酶、Δ-17去饱和酶、Δ-9去饱和酶、Δ-8去饱和酶、Δ-9延伸酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、C18/20延伸酶和/或C20/22延伸酶。

[0072] 术语“去饱和酶”是指可在一种或多种脂肪酸中去饱和（即引入双键）而产生受关注的脂肪酸或前体的多肽。尽管在整个说明书中使用ω-参考系来指代具体的脂肪酸，但使用Δ-体系从底物的羧基端计数来表示去饱和酶的活性更方便。本文尤其关注的是使脂肪酸在从该分子的羧基端计数的第五个和第六个碳原子之间去饱和，并且能够（例如）催化DGLA至ARA的转化和/或ETA至EPA的转化的Δ-5去饱和酶。其它脂肪酸去饱和酶包括例如：Δ-8去饱和酶、Δ-6去饱和酶、Δ-4去饱和酶、Δ-12去饱和酶、Δ-15去饱和酶、Δ-17去饱和酶和Δ-9去饱和酶。在本领域中，基于Δ-15和Δ-17去饱和酶将ω-6脂肪酸转化成它们的ω-3相对物的能力（例如分别将LA转化成ALA以及将ARA转化成EPA），偶尔也将它们称作“Ω-3去饱和酶”、“w-3去饱和酶”和/或“ω-3去饱和酶”。期望通过用脂肪酸去饱和酶的基因来转化合适的宿主并确定它对该宿主脂肪酸特征的作用，来从经验确定特定脂肪酸去饱和酶的特异性。

[0073] 术语“EgD5”是指来自小眼虫的由本文SEQ ID NO:20编码的Δ-5去饱和酶（SEQ ID NO:21）。同样地，术语“EgD5S”是指来源于小眼虫的合成Δ-5去饱和酶，其经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达（即SEQ ID NO:22和23）。关于EgD5和EgD5S的更多细节描述于美国专利申请7,678,560中。术语“EgD5R”（即，SEQ ID NO:24和25）是指变体野生型EgD5，其中在位置347处的氨基酸残基为精氨酸。术语“EgD5R*”（即，SEQ ID NO:26和27）是指野生型EgD5R的修饰变体，其中从野生型编码区中去除了四个限制性酶位点。EgD5R和EgD5R*的氨基酸序列是相同的。

[0074] 术语“EaD5”是指来自Euglena anabaena的由本文SEQ ID NO:28编码的Δ-5去饱和酶（SEQ ID NO:29）。类似地，术语“EaD5S”是指来源于E.anabaena的、经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达的合成Δ-5去饱和酶（即SEQ ID NO:30和31）。关于EaD5和EaD5S的更多细节描述于美国专利申请7,943,365中。

[0075] 术语“保守域”或“基序”是指进化上相关的蛋白质的比对序列中在特定位置处保守的一组氨基酸。虽然同源蛋白质之间在其它位置处的氨基酸可发生变化，但在特定位置为高度保守的氨基酸表明这些氨基酸对蛋白质的结构、稳定性或活性来说可能是重要的氨基酸。因为这些氨基酸可通过它们在蛋白质同系物家族的比对序列中的高度保守来鉴定，所以它们可用作识别标签或“签名”来确定具有最新确定的序列的蛋白质是否属于此前鉴定的蛋白质家族。普遍存在于动物、植物和真菌的5去饱和酶中的基序包括三个组氨酸盒（即，H(X)3-4H[SEQ ID NO:1和2]、H(X)2-3HH[SEQ ID NO:3和4]和H/Q(X)2-3HH[SEQ ID NO:5和6]）和位于在N端处的融合的细胞色素b5域内的血红素结合基序（即，His-Pro-Gly-Gly或HPGG[SEQ ID NO:7]）。附加的基序（即，His-Asp-Ala-Ser-His或HDASH[SEQ ID NO:8]）在一些Δ-5去饱和酶基因中显得保守。

[0076] 术语“突变型Δ-5去饱和酶”和“双突变”是指如本文所述的Δ-5去饱和酶在细胞色素b5域的HPGG基序（SEQ ID NO:7）内具有至少一个突变，并且在HDASH基序（SEQ ID NO:8）内具有至少一个突变，其中所述突变导致保守或非保守的氨基酸取代。虽然所述突变可包括任何氨基酸取代，突变型Δ-5去饱和酶优选包含突变型HPGG（SEQ ID NO:7）基序，其具有His-Xaa-Gly-Xaa或“HxGx”（SEQ ID NO:34）（其中Xaa可为任何氨基酸）序列，并且包含突变型HDASH（SEQ ID NO:8）基序，其具有His-Xaa-Xaa-Xaa-His或“HxxxH”（SEQ ID NO:1）序列。更优选地，所述突变型Δ-5去饱和酶包含突变型HPGG基序，其选自HxGG（SEQ ID NO:32）和HPGx（SEQ ID NO:33）；以及突变型HDASH基序，其选自HxASH（SEQ ID NO:35）、HDxSH（SEQ ID NO:36）和HDAxH（SEQ ID NO:37），其中所述突变型Δ-5去饱和酶的突变型Δ-5去饱和酶活性为至少功能上约等于野生型Δ-5去饱和酶的Δ-5去饱和酶活性。更优选的，所述突变型HPGG基序选自：SEQ ID NO:9（HgGG）、SEQ ID NO:10（HhGG）、SEQ ID NO:11（HPGs）、SEQ ID NO:12（HcGG）、SEQ ID NO:13（HwGG）和SEQ ID NO:14（HaGG），并且所述突变型HDASH基序选自：SEQ ID NO:15（HDgSH）、SEQ ID NO:16（HDsSH）、SEQ ID NO:17（HDAaH）、SEQ ID NO:18（HDAgH）和SEQ ID NO:19（HeASH）。

[0077] 每种“突变型Δ-5去饱和酶”具有一个“对应的野生型Δ-5去饱和酶”。具体地，突变型Δ-5去饱和酶和对应的野生型Δ-5去饱和酶具有相同的氨基酸序列，不同的是野生型将在细胞色素b5域内包含HPGG基序（SEQ ID NO:7）并包含HDASH基序（SEQ ID NO:8），而突变型将在这些基序中的每一个内包含至少一个突变（如上所述）。

[0078] 当突变型Δ-5序列的酶活性和特异选择性基本相当于对应的野生型Δ-5去饱和酶的酶活性和特异选择性时，突变型Δ-5去饱和酶为与对应的野生型Δ-5去饱和酶“至少功能上约等同”。因此，当比较每种酶的“转化效率”时，功能上等同的突变型Δ-5去饱和酶相对于对应的野生型Δ-5去饱和酶活性将具有基本上不降低的Δ-5去饱和酶活性（即，突变Δ-5去饱和酶将具有野生型Δ-5去饱和酶活性的至少约50-64%，更优选至少60-74%，更优选至少约75-85%，更优选至少约85-95%，最优选至少约95%的酶活性）。尽管上文已描述了优选的范围，转化效率的有用实例包括从50%至100%的任何整数百分比，例如51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、
73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、
92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。两种多肽的Δ-5去饱和酶活性可基本上相同。优选地，突变型Δ-5去饱和酶在与对应的野生型Δ-5去饱和酶进行比较时将具有提高的酶活性和特异选择性，即，具有野生型Δ-5去饱和酶活性的至少约101%、102%、103%、104%或105%，更优选至少约106%、107%、108%、109%、110%、111%、112%、113%、114%或115%，并且最优选至少约116%或更高的酶活性。.

[0079] 术语“亲本多肽”或“亲本酶”是指本文所公开的突变多肽或酶来源于其中的任何多肽。该术语涵盖具有HPGG（SEQ ID NO:7）和HDASH（SEQ ID NO:8）氨基酸基序的野生型、变体野生型、和修饰的变体野生型多肽，以及基于它们的合成的和密码子优化的多肽。该术语还涵盖前述多肽的多个变型，从多肽中已经去除了多个限制性酶位点。

[0080] 突变型Δ-5去饱和酶使用两个不同的命名体系进行命名，但这两个都描述了突变体中突变型HPGG（SEQ ID NO:7）基序和HDASH（SEQ ID NO:8）基序的特定序列。第一种体系指明：1）野生型，亲本酶；2）连字符（-）；3）突变型HPGG基序；4）下划线（_）；5）突变型HDASH基序。突变型氨基酸残基以小写字母表示。因此，例如将包含HaGG（SEQ ID NO:14）和HDgSH（SEQ ID NO:15）基序的突变型Δ-5去饱和酶称为“EgD5S-HPGs_HDgSH”，其来源于合成Δ-5去饱和酶，该酶来源于小眼虫并经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达（即，“EgD5S”）。作为另外一种选择，这种相同的突变型Δ-5去饱和酶也可称为“EgD5S-36s157g”，其使用第二种命名体系。更具体地，EgD5S的HPGG（SEQ ID NO:7）基序位于氨基酸残基33-36之间，而EgD5S的HDASH（SEQ ID NO:8）基序位于氨基酸残基155-159之间。因此，“36s”表明氨基酸残基36从野生型修饰为Ser，而“157g”表明氨基酸残基157从野生型修饰为Gly。

[0081] 术语“转化效率”和“底物转化百分比”是指特定酶（如去饱和酶）可将底物转化成产物的效率。转化效率根据下式测量：（[产物]/[底物+产物]）*100。因此，“DGLA至ARA的转化效率”是指底物DGLA被转化成产物ARA的转化效率。

[0082] 术语“延伸酶”是指可延长脂肪酸碳链从而产生比该延伸酶作用于其上的脂肪酸底物长两个碳原子的酸的多肽。该延长过程在与脂肪酸合成酶相关的多步骤机制中发生，如美国专利7,659,120中所描述。由延长酶体系催化的反应的实例是将GLA转化成DGLA、将STA转化成ETA以及将EPA转换成DPA。

[0083] 通常，延伸酶的底物选择性有些广泛，但由链长度和不饱和程度及类型两者来区分。例如，C14/16延伸酶将利用C14底物（如肉豆蔻酸），C16/18延伸酶将利用C16底物（如棕榈酸），C18/20延伸酶将利用C18底物（如GLA、STA、LA、ALA），并且C20/22延伸酶[也称为Δ-5延伸酶]将利用C20底物（如ARA、EPA）。就本文目的而言，可定义两种不同类型的C18/20延伸酶：Δ-6延伸酶将分别催化GLA和STA转化成DGLA和ETA，而Δ-9延伸酶分别能够催化LA和ALA转化成EDA和ETrA。

[0084] 重要的是，注意一些延伸酶具有广泛的特异性并因而单个延伸酶可能能够催化多种延伸酶反应（例如，从而可用作C16/18延伸酶和C18/20延伸酶）。期望通过用脂肪酸延伸酶的基因来转化合适的宿主并确定它对该宿主脂肪酸特征的作用，来从经验确定脂肪酸延伸酶的特异性。

[0085] 一般来讲，术语“含油的”是指倾向于以油的形式贮存它们的能源的那些生物（Weete，Fungal Lipid Biochemistry，第2版，Plenum，1980）。在这个过程中，含油微生物的细胞油含量一般符合S形曲线，其中脂质浓度增加直至它在对数生长期晚期或稳定生长期早期时达到最高浓度，随后在稳定生长期晚期和死亡期期间逐渐下降（Yongrmanitchai和Ward，Appl.Environ.Microbiol.，57:419-25（1991））。出于本专利申请的目的并且当针对微生物使用时，术语“含油的”是指那些可积聚它们DCW的至少约25%的作为油的微生物。

[0086] 术语“含油酵母”是指那些可产油并被归类为酵母的含油微生物，即，其中油可积聚到超过它们DCW的约25%。含油酵母的实例包括但意在不限于以下属：耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属。积聚油到超过酵母DCW的约25%的能力可通过重组工程或通过生物的天然能力获得。

[0087] 产生从其中获得油的种子的那些植物可被称为“油料种子”植物或作物。油料种子植物的实例包括但不限于大豆、向日葵种子、低芥酸菜籽、油菜籽、红花、亚麻籽、芥菜种子、花生、棉籽、蓖麻子和芝麻。

[0088] 术语“保守氨基酸取代”是指将给定蛋白质中的氨基酸残基被另一种氨基酸取代，而不改变该蛋白质的化学或功能性质。例如，在本领域中熟知，导致在给定位点产生化学等价的氨基酸（但不影响所编码、折叠蛋白质的结构和功能性质）的基因改变是常见的。出于本文的目的，将“保守氨基酸取代”被定义为在下列五组中的一组内的互换：

[0089] 1.小的脂族非极性或稍微极性的残基：Ala[A]、Ser[S]、Thr[T]（Pro[P]、Gly[G]）；

[0090] 2.极性的、带负电荷的残基和它们的酰胺：Asp[D]、Asn[N]、Glu[E]、Gln[Q]；

[0091] 3.极性的、带正电荷的残基：His[H]、Arg[R]、Lys[K]；

[0092] 4.大的脂族非极性残基：Met[M]，Leu[L]、Ile[I]、Val[V]（Cys[C]）；以及[0093] 5.大的芳族残基：Phe[F]、Tyr[Y]、Trp[W]。

[0094] 因此如Ala这样的弱疏水性氨基酸可被另一种疏水性更弱的残基（例如Gly）取代。同样的，也期望导致一种带负电的残基取代另一种带负电的残基（例如Asp取代Glu）或一种带正电的残基取代另一种带正电的残基（例如Lys取代Arg）的改变能够产生功能上等同的产物。同样地，保守氨基酸取代一般保持取代区域中的多肽主链的结构、靶位点上的分子电荷或疏水性、或侧链的堆积体积。此外，在许多情形中，改变蛋白质分子的N末端和C末端部分也将预测不会改变蛋白质的活性。

[0095] 术语“非保守氨基酸取代”是指一般预测会使蛋白质性质发生最大变化的氨基酸取代。因此，例如，非保守氨基酸取代中可为以下之一：1）亲水性残基取代疏水性残基/被疏水性残基取代（例如，Ser或Thr取代Leu、Ile、Val/被Leu、Ile、Val取代）；2）Cys或Pro取代任何其它残基/被任何其它残基取代；3）具有带正电的侧链的残基取代带负电的残基/被带负电的残基取代（例如，Lys、Arg或His取代Asp或Glu/被Asp或Glu取代）；或者，4）具有大体积侧链的残基取代不具有侧链的残基/被不具有侧链的残基取代（例如Phe取代Gly/被Gly取代）。有时，这五组中的两组之间的非保守氨基酸取代将不会影响所编码的蛋白质的活性。

[0096] 术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸片段”和“分离的核酸片段”在本文中是互换使用的。这些术语涵盖核苷酸序列等的范围。多核苷酸可为RNA或DNA的聚合物，它们可为单链或双链，任选地包含合成的、非天然的或改性的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的多核苷酸可由cDNA、基因组DNA、合成DNA或它们的混合物的一个或多个片段构成。核苷酸（通常以它们的5’-单磷酸形式存在）通过如下的单字母命名表示：“A”是指腺苷酸或脱氧腺苷酸（分别用于RNA或DNA），“C”是指胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”是指鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”是指尿苷酸，“T”是指脱氧胸苷酸，“R”是指嘌呤（A或G），“Y”是指嘧啶（C或T），“K”是指G或T，“H”是指A或C或T，“I”是指肌苷，“N”是指任何核苷酸。

[0097] 当在合适的温度和溶液离子强度条件下单链形式的核酸片段可退火至另一核酸片段时，核酸片段“可杂交”至另一核酸片段，例如cDNA、基因组DNA或RNA分子。杂交和洗涤条件是熟知的并且例示于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor，NY（1989）（“Sambrook等人”），其以引用方式并入本文，尤其是第11章和表11.1。温度和离子强度条件确定杂交的“严格性”。可调节严格性条件以筛选中度相似的片段（例如来自远缘生物的同源序列），到筛选高度相似的片段（例如从近缘生物复制功能性酶的基因）。杂交后的洗涤确定严格性条件。一组优选的条件使用一系列洗涤，开始是6X SSC、0.5%SDS在室温下洗涤15分钟，然后用2X SSC、0.5%SDS在45℃下重复30分钟，再用0.2X SSC、0.5%SDS在50℃下重复洗涤两次，每次30分钟。更优选的一组严格性条件采用更高的温度，其中洗涤与上述洗涤相同，不同的是最后两次在0.2X SSC、0.5%SDS中洗涤30分钟时的温度被增加到60℃。另一组优选的高度严格的条件是最后两次洗涤在65℃下用0.1X SSC，0.1%SDS进行。例如，另一组严格条件包括在0.1X SSC，0.1%SDS中于65℃下杂交并用2X SSC，
0.1%SDS洗涤，随后用0.1X SSC，0.1%SDS洗涤。

[0098] 杂交需要两种核酸含有互补序列，但取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适的严格性取决于核酸的长度和互补的程度，它们是本领域内熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性（对应较高的Tm）按下列顺序依次降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经获得了计算Tm的公式（参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51）。对于较短核酸（即寡核苷酸）的杂交，错配的位置变得更为重要，并且寡核苷酸的长度确定其特异性（参见Sambrook等人，同上，11.7-11.8）。在一个实施方案中，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸；更优选地长度为至少约20个核苷酸；最优选地长度为至少约30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，必要时可根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液的盐浓度。

[0099] 氨基酸或核苷酸序列的“主要部分”是指这样的部分，该部分包括的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以通过推定而鉴定所述多肽或基因，所述鉴定或者可由本领域的技术人员通过人工评价序列来完成，或者可利用诸如BLAST（Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.，215:403-410（1993））的算法通过计算机自动化的序列比对和鉴定进行。一般来讲，为了推测鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有十个或更多邻接氨基酸或者三十个或更多核苷酸的序列。此外，针对核苷酸序列，包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定（如Southern杂交）和基因分离（如细菌菌落或噬菌斑的原位杂交）的方法中。此外，12-15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“主要部分”包含的序列足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。本公开教导了编码特定去饱和酶蛋白质的完整的氨基酸和核苷酸序列。具有如本文报道序列的有益效果，技术人员现在可使用全部公布序列或它们的主要部分用于本领域的技术人员已知的目的。因此，如所附序列表中报道的完整序列，以及那些序列的如上文所定义的基本部分，均包括在本公开之内。

[0100] 术语“互补的”用于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，针对DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补，并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开涵盖与所附序列表中报道的完全序列互补的分离核酸片段，以及那些基本上类似的核酸序列。

[0101] 术语“同源性”或“同源”是互换使用的。它们指具有相似但不同序列的核酸片段或多肽。这些术语有时也指核酸片段的修饰（例如缺失或插入一种或多种核苷酸），相对于初始的未经修饰的片段，该修饰基本上不会改变所得核酸片段的功能特性。因此，正如本领域的技术人员应当理解的，本发明涵盖的不仅仅是具体的示例性序列。

[0102] 此外，技术人员认识到，同源核酸序列也通过它们在中等严格条件（如0.5X SSC，0.1%SDS，60℃）下，与本文所例示的序列杂交的能力，或杂交至本文所公开的核苷酸序列和与其功能相当的序列的任何部分的能力而被限定。可调节严格性条件以筛选中度相似的片段例如来自远缘生物的同源序列，到筛选高度相似的片段例如从近缘生物复制功能性酶的基因。

[0103] 术语“选择性杂交”包括指在严格杂交条件下，核酸序列与特定核酸靶序列杂交至比其与非靶核酸序列的杂交更高的可检测程度（例如至少2倍于背景技术），并指基本排除了非靶核酸。选择性杂交的序列通常彼此具有约至少80%的序列同一性，或90%的序列同一性，最多并包括100%的序列同一性（即完全互补）。

[0104] 在核酸或多肽序列上下文中“序列同一性”或“同一性”是指两序列中的核酸碱基或氨基酸残基当在指定比较窗口中比对最大匹配时是相同的。

[0105] 用于确定“百分比同一性”和“百分比相似性”的方法在被编码于可公开获得的计算机程序中。百分比同一性和百分比相似性可通过已知的方法容易地计算，所述方法包括但不限于下列中所述的那些：1）Computational Molecular Biology（Lesk，A.M.，编辑）Oxford University：NY（1988）；2）Biocomputing：Informatics and Genome Projects（Smith,D.W.编辑）Academic:NY（1993）；3）Computer Analysis of Sequence Data，Part I（Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑）Humania：NJ（1994）；4）Sequence Analysis in Molecular Biology（von Heinje，G.编辑）Academic（1987）；以及，5）Sequence Analysis Primer（Gribskov，M.和Devereux，J.编辑。）Stockton：NY（1991）。

[0106] 序列比对和百分比同一性或相似性计算可使用经设计用于检测同源序列的多种比较方法来确定，这些方法包括但不限于LASERGENE生物信息学计算软件包（DNASTAR TMInc.，Madison，WI）的MegAlign 程序。序列的多重比对使用“Clustal比对方法”进行，该方法涵盖多种不同的算法，包括“Clustal V比对方法”和“Clustal W比对方法”（该方法描述于Higgins和Sharp，CABIOS5：151-153（1989）；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，
8:189-191（1992））并存在于MegAlignTM（版本8.0.2）程序（同上）中。使用Clustal程序比对序列后，可通过查看程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。

[0107] 对于使用Clustal V比对方法的多重比对，默认值相当于空位罚分=10并且空位长度罚分=10。使用Clustal V方法进行逐对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE=1，空位罚分=3，窗=5，以及DIAGONALS SAVED=5。对于核酸，这些参数为KTUPLE=2，空位罚分=5，窗=4，以及DIAGONALS SAVED=4。

[0108] 使用Clustal W比对方法进行的多重比对的默认参数是：空位罚分=10，空位长度罚分=0.2，延迟发散序列（Delay Divergent Seqs）（%）=30，DNA转换权重（Transition Weight）=0.5，蛋白质权重矩阵=Gonnet系列，DNA权重矩阵=IUB。

[0109] “BLASTN比对方法”是由美国国立生物技术信息中心[“NCBI”]提供的算法，采用默认参数比较核苷酸序列，而“BLASTP比对方法”是由NCBI提供的算法，采用默认参数比较蛋白质序列。

[0110] 本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性用于从其它物种中鉴定多肽，其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。适合的核酸片段，即根据本公开的分离的多核苷酸，编码与本文报道的氨基酸序列具有至少约70-85%同一性的多肽，并且更优选的核酸片段编码与本文报道的氨基酸序列具有至少约85-95%同一性的氨基酸序列。尽管上文已描述了优选的范围，百分比同一性的有用的实例包括从50%至100%的任何整数百分比，例如51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、
88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。而且，受关注的是这种分离核苷酸片段的任何全长的或部分的互补序列。

[0111] 合适的核酸片段不但具有上述同源性，而且通常编码具有至少50个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少150个氨基酸，还更优选至少200个氨基酸，并且最优选至少250个氨基酸的多肽。

[0112] “密码子简并性”是指允许核苷酸序列在不影响所编码多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。因此，本文描述了任何编码以下氨基酸序列的全部或主要部分的核酸片段，该氨基酸序列编码在SEQ ID NO:139、141、143、145、147、149、151、153、157、181、183、185、187、213、215、217、255、260、271和276中示出的本发明多肽。

[0113] 技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子来确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏好性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，期望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。

[0114] “合成基因”可由使用本领域的技术人员已知的方法化学合成的寡核苷酸基本单位组合而成。将这些寡核苷酸基本单位构件进行退火并随后连接以形成基因节段，该基因节段随后在酶促作用下组合而构建成完整的基因。因此，基于最优化核苷酸序列以反映宿主细胞的密码子偏好性，可定制基因以最优化基因表达。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子，则技术人员理解成功的基因表达的可能性。优选的密码子的确定可基于对来源于宿主细胞的基因（其中序列信息可获得）的检测。例如，在美国专利7,125,672中提供了解脂耶氏酵母的密码子使用特征。

[0115] “基因”是指表达特定蛋白的核酸片段，并且其可指单独的编码区或者可包括在编码区上游和/或下游的调控序列（例如编码区转录起始位点上游的5’非翻译区、3’非编码区）。“原生基因”是指自然状态下与其自身的调控序列一起的基因。“嵌合基因”是指为非原生基因的任何基因，包含天然状态下不一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自相同来源、但排列方式与天然存在的排列方式不同的调控序列和编码序列。“内源性基因”是指在生物体基因组中处于其天然位置处的原生基因。“外来”基因指通过基因转移引入至宿主生物内的基因。外来基因可包括插入非天然生物内的原生基因、引入天然宿主内的新位置处的原生基因，或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法引入基因组内的基因。“经密码子优化的基因”是其密码子使用频率经设计用以模仿宿主细胞优选的密码子使用频率的基因。

[0116] “编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“调控序列”是指位于编码序列的转录起始位点上游、5’非翻译区和3’非编码区的核苷酸序列，并且其可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性，或者翻译。调控序列可包括但不限于启动子、增强子、沉默子、5’非翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。

[0117] “启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，启动子序列位于编码序列的5’上游。启动子可整个源于原生基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件而引导基因的表达。导致基因在大部分时间内在细胞生长和/或发育的几乎所有阶段中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。还应认识到，由于在大多数情况下还不能完全确定调控序列（尤其是在它们的5’末端）的确切范围，一些变型的DNA片段可能具有相同的启动子活性。

[0118] 术语“3’非编码序列”、“转录终止子”、“终止子”和“终止序列”是指位于编码序列下游的DNA序列。这包括多腺苷酸化识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其它序列。多腺苷酸化信号的特征通常在于影响多腺苷酸片至mRNA前体的3’末端的添加。3’区可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。

[0119] “RNA转录物”是指由RNA聚合酶催化的DNA序列的转录所产生的产物。当RNA转录物与DNA序列拷贝完全互补时，它被称为初级转录物。当RNA转录物是来源于转录后加工的初级转录物的RNA序列时，它被称为成熟的RNA。“信使RNA”或“mRNA”是指无内含子并且可由细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”是指与mRNA模板互补并用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可为单链，或使用DNA聚合酶I的Klenow片段转化成双链。“有义”RNA是指包括mRNA并且在细胞内或体外可被翻译成蛋白质的RNA的RNA转录物。“反义RNA”是指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补并且可阻碍靶基因表达的RNA转录物（美国专利5,107,065）。

[0120] 术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的关联，以使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，即，该编码序列处于该启动子的转录控制下时，该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以有义或反义取向可操作地连接至调控序列。

[0121] 术语“重组”是指两个原本分离的序列片段的人工组合，例如通过化学合成或通过以遗传工程技术操纵分离的核酸片段实现人工合成。

[0122] 如本文所用，术语“表达”是指有义（mRNA）或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也包括mRNA翻译成蛋白质（其为前体蛋白或成熟蛋白）。

[0123] “转化”是指将核酸分子转移进宿主生物中，从而导致在遗传上稳定的遗传。例如，核酸分子可为自主复制的质粒，例如，或它可整合进宿主生物的基因组中。含有转化的核酸片段的宿主生物被称为“转基因”、“重组”、“转化”或“转化体”生物。

[0124] 术语“质粒”和“载体”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形式。这类元件可具有源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列，并且可为线性或环状，其中多个核苷酸序列已连接或重组为一种独特构建体，该独特构建体能够将表达盒引入细胞中。

[0125] 术语“表达盒”是指DNA片段，所述DNA片段包含：所选基因的编码序列和所选基因产物表达所需的位于该编码序列之前（5'非编码序列）和之后（3’非编码序列）的调控序列。因此，表达盒通常由下列组成：1）启动子；2）编码序列（即，ORF]）；和3）终止子，其在真核生物中通常包含多腺苷酸化位点。表达盒通常包含于载体中以有利于克隆和转化。可将不同表达盒转化进包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞在内的不同生物中，只要能针对每种宿主使用正确的调控序列。

[0126] 术语“重组构建体”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”和“重组DNA构建体”在本文中是互换使用的。重组构建体包括核酸片段的人工组合，例如天然条件下不一起存在的调控序列和编码序列。例如，重组构建体可包含一个或多个表达盒。在另一个实例中，重组DNA构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。此类构建体可独立地使用或与载体组合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于用以转化宿主细胞的方法，该宿主细胞是本领域的技术人员熟知的。例如可使用质粒载体。

[0127] 技术人员熟知为了成功地转化、选择和繁殖包含本文所述的任何分离的核酸片段的宿主细胞，必须存在于载体上的遗传因子。技术人员还将认识到，不同的独立转化事件将引起不同水平和模式的表达（Jones等人，EMBO J.，4：2411-2418（1985）；De Almeida等人，Mol.Gen.Genetics 218：78-86（1989）），因此为了获得显示所需表达水平和模式的菌株或细胞系，必须对多个事件进行筛选。这样的筛选可通过DNA的Southern印迹分析、mRNA表达的Northern印迹分析、蛋白表达的Western分析或表型分析等完成。

[0128] 术语“宿主细胞”和“宿主生物”在本文中互换使用并且是指能够接受外源或异源基因并能够表达那些基因的任何生物如微生物或植物（即，油料种子植物）。“重组宿主细胞”是指已经经重组工程化的宿主细胞。

[0129] 术语“序列分析软件”是指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于：1）GCG程序套（Wisconsin Package版本9.0，Genetics Computer Group（GCG），Madison，WI）；2）BLASTP，BLASTN，BLASTX（Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403-410（1990））；3）DNASTAR（DNASTAR，Inc.Madison，WI）；4）Sequencher（Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI）；和5）采用了Smith-Waterman算法的FASTA程序（W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.]（1994），开会日期1992，111-20.编辑：Suhai，
Sandor.Plenum：New York，NY）。在这一描述中，除非另外指明，序列分析软件无论何时用于分析，分析结果都基于所用程序的“默认值”。在此所用的“默认值”将指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。

[0130] 本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且更充分地描述于Sambrook等人；Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor，NY（1984）（下文“Silhavyu等人”）；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，公布于Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience，Hoboken，NJ（1987）（下文“Ausubel等人”）。

[0131] 图1A和图1B一起示出了ω-3/ω-6脂肪酸生产的多个途径，如下文所述。所有途径都需要最初通过Δ-12去饱和酶将油酸转化成亚油酸[“LA”]（第一个ω-6脂肪酸）。然后，使用“Δ-9延伸酶/Δ-8去饱和酶途径”并用LA作底物，如下形成长链ω-6脂肪酸：1）通过Δ-9延伸酶将LA转化成二十碳二烯酸[“EDA”]；2）通过Δ-8去饱和酶将EDA转化成二高-γ-亚麻酸[“DGLA”]；3）通过Δ-5去饱和酶将DGLA转化成花生四烯酸[“ARA”]；4）通过C20/22延伸酶将ARA转化成二十二碳四烯酸[“DTA”]；以及，5）通过Δ-4去饱和酶将DTA转化成二十二碳五烯酸[“DPAn-6”]。

[0132] “Δ-9延伸酶/Δ-8去饱和酶途径”也可利用α-亚麻酸[“ALA”]作为底物如下生产长链ω-3脂肪酸：1）通过Δ-15去饱和酶将LA转化成ALA，第一个ω-3脂肪酸；2）通过Δ-延伸酶将ALA转化成二十碳三烯酸[“ETrA”]；3）通过Δ-8去饱和酶将ETrA转化成二十碳四烯酸[“ETA”]；4）通过Δ-5去饱和酶将ETA转化成二十碳五烯酸[“EPA”]；5）通过C20/22延伸酶将EPA转化成二十二碳五烯酸[“DPA”]；以及6）通过Δ-4去饱和酶将DPA转化成二十二碳六烯酸[“DHA”]。任选地，可将ω-6脂肪酸转化成ω-3脂肪酸。例如，通过Δ-17去饱和酶活性，分别从DGLA和ARA产生ETA和EPA。

[0133] 用于生物合成ω-3/ω-6脂肪酸的替换途径利用Δ-6去饱和酶和C18/20延伸酶（即，“Δ-6去饱和酶/Δ-6延伸酶途径”）。更具体地，可通过Δ-6去饱和酶分别将LA和ALA转化成GLA和十八碳四烯酸[“STA”]；然后，C18/20延伸酶将GLA转化成DGLA和/或将STA转化成ETA。随后如上所述形成下游PUFA。

[0134] 预期需要在特定宿主生物中引入用以产生ω-3/ω-6脂肪酸的特定功能将取决于宿主细胞（及其原生PFUA特征和/或去饱和酶/延伸酶特征）、底物的可利用性和所需的终产物。例如在一些实施方案中，Δ-9延伸酶/Δ-8去饱和酶途径的表达是优选的，但它会抑制Δ-6去饱和酶/Δ-6延伸酶途径的表达，因为经由前者产生的PUFA缺乏GLA和/或STA。

[0135] 本领域的技术人员将能够鉴定多种编码ω-3/ω-6脂肪酸生物合成所需的每种酶的候选基因。有用的去饱和酶和延长酶序列可来源于任何来源，例如，分离自天然来源（来自细菌、藻类、真菌、植物、动物等）、经由半合成途径产生或从头合成。虽然引入宿主的去饱和酶和延伸酶基因的具体来源不是至关重要的，但选择具有去饱和酶或延伸酶活性的特定多肽的考虑因素包括：1）多肽的底物特异性；2）多肽或其组分是否是限速酶；3）去饱和酶或延伸酶对于合成期望PUFA是否是必需的；4）多肽所需的辅因子；和/或5）在多肽产生后是否对其进行修饰（例如通过激酶或异戊烯转移酶进行修饰）。表达的多肽优选具有与它在宿主细胞中的位置的生化环境相容的参数（更多细节参见美国专利7,238,482）。

[0136] 考虑每种特定的去饱和酶和/或延长酶的转化效率也将是有用的。更具体地，由于每种酶极少能以100%的效率将底物转化成产物，宿主细胞所产生的未纯化的油的最终脂质特征将通常是由期望的ω-3/ω-6脂肪酸及多种上游PUFA中间产物组成的多种PUFA的混合物。因此，当使所期望的脂肪酸的生物合成最优化时，每种酶的转化效率也是要考虑的变量。

[0137] 考虑到上述各个考虑事项，具有合适去饱和酶和延伸酶活性（例如Δ-6去饱和酶、C18/20延伸酶、Δ-5去饱和酶、Δ-17去饱和酶、Δ-15去饱和酶、Δ-9去饱和酶、Δ-12去饱和酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、Δ-9延伸酶、Δ-8去饱和酶、Δ-4去饱和酶和C20/22延伸酶）的候选基因可根据可公开获得的文献（如GenBank）、专利文献和对具有产生PUFA能力的生物的实验分析来鉴定。这些基因将适用于引入到特定的宿主生物中，以使该生物能够合成PUFA或增强生物的PUFA合成。

[0138] 一旦脂肪酸在生物体内合成（包括饱和的和不饱和的脂肪酸以及短链和长链脂肪酸），它们可能被掺入TAG中。TAG是脂肪酸的主要贮藏单位。

[0139] 迄今为止鉴定的大多数Δ-5去饱和酶具有将DGLA转化成ARA的主要能力，以及将ETA转化成EPA的次要活性。在公开文献和专利文献中均已公开了多种Δ-5去饱和酶。基于去饱和酶的进化，P.Sperling等人详述了Δ-5去饱和酶的一般特性（Prostaglandins Leukot.Essent.Fatty Acids，68:73–95（2003）。连同Δ-6、Δ-8和Δ-4去饱和酶一起，已知Δ-5去饱和酶是长链PUFA“前端”去饱和酶（其中去饱和发生在先前存在的双键和脂肪酸酰基的羧基末端之间，与甲基定向的去饱和相反）。这些去饱和酶的特征在于三个组氨酸盒[H(X)3-4H（SEQ ID NO:1和2）、H(X)2-3HH（SEQ ID NO:3和4）和H/Q(X)2-3HH（SEQ ID NO:5和6）]，并且是细胞色素b5稠合超级族的成员，因为它们在N末端具有稠合的细胞色素b5域，该域起到电子供体的作用。所述细胞色素b5域还包含保守的血红素结合基序（即，HPGG序列[SEQ ID NO:7]），尽管其余的细胞色素b5域序列有差异。此前在一些Δ-5去饱和酶中鉴定的其它基序也显现出富含组氨酸（即，HDASH序列[SEQ ID NO:8]），但HDASH基序对酶活性的重要性有待被阐明。

[0140] 许多研究已经表明HPGG（SEQ ID NO:7）基序涉及到酶活性。Sayanova，O.等人（Plant Physiol.,121:641（1999））进行了定点诱变以在琉璃苣的Δ-6去饱和酶中用Ala残基取代HPGG基序的His残基。突变酶在拟南芥属中表达；然而，不能测量到酶活性，表明去饱和酶的细胞色素b5域中的HPGG（SEQ ID NO:7）基序中的His残基对于功能是重要的。在大鼠Δ-6去饱和酶中进行了类似的研究，其中在HPGG（SEQ ID NO:7）基序内工程化Ala对His的取代基。突变的蛋白质也不具有活性（Guillou，H.等人，J.Lipid Res.，45:32-40（2004））。最近Hongsthong，A.等人（Appl.Microbiol.Biotechnol.，72:1192-1201（2006））报道了用螺旋藻Δ-6去饱和酶中的Ala残基取代HPGG（SEQ ID NO:7）基序的His残基。根据此前的报道，突变导致突变酶不能够在大肠杆菌中产生GLA，表明细胞色素b5域对于活性是重要的并且在HPGG（SEQ ID NO:7）基序中的组氨酸残基改变将导致酶活性降低。尽管Δ-5去饱和酶是相对普通的并且已被很好地表征，但依然存在对在能够制造PUFA的生产宿主细胞中以高水平有效表达的酶的需求。

[0141] 如上所述，Δ-5去饱和酶包含多个保守序列。然而，在序列内仅有血红素结合基序（即，HPGG[SEQ ID NO:7]）和HDASH基序（SEQ ID NO:8）缺少变型。选择这些基序作为本文的诱变目标。虽然HDASH（SEQ ID NO:8）基序对酶功能的重要性尚不清楚，但该文献表明至少在HPGG（SEQ ID NO:7）基序内的组氨酸残基对功能是重要的。因此，避免对基序中组氨酸残基的取代，有利于取代其余的残基。

[0142] 美国专利公布2010-0075386-A1描述了定点诱变多个Δ-5去饱和酶的HPGG（SEQ ID NO:7）基序内的Pro和第二Gly残基，随后表达所得突变多肽并测定它们相对于野生型酶的活性。该专利申请公开了多种突变型Δ-5去饱和酶的构建，所述酶包含包括HxGG（SEQ ID NO:32）和HPGx（SEQ ID NO:33）基序的氨基酸突变基序，其中突变型Δ-5去饱和酶的Δ-5去饱和酶活性与对应的野生型Δ-5去饱和酶的野生型Δ-5去饱和酶活性功能上等同。

[0143] 存在多种定点诱变规程[例如Ishii，T.M.等人，Methods Enzymol.，293:53–71（1998）；Ling M.M.和B.H.Robinson，Anal.Biochem.，254:157–178（1997）；Braman J.（编辑）In Vitro Mutagenesis Protocols.第2版，Humania:Totowa，NJ（2002）；Kunkel T.A.等人，Methods Enzymol.，154:367–382（1987）；Sawano A.和Miyawaki，A.Nucleic Acids Res.，28:e78（2000）]；然而，选择 定点诱变试剂盒（Stratagene，La Jolla，CA）使用，这是基于该试剂盒的易操作性和高效性。基本程序利用了超螺旋双链DNA载体以及受关注的插入序列和两个包含所需突变的合成低聚核苷酸引物。每个低聚核苷酸引物与载体的相反链互补，在温度循环过程中被DNA聚合酶延伸。结合低聚核苷酸引物产生包含交错切口的突变质粒。在温度循环后用DpnI内切酶（甲基化和半甲基化DNA特异性的）处理产物，以此作为消化亲本DNA模板并选择新合成的突变DNA的方法。然后用包含所需突变的带切口的载体DNA转化大肠杆菌宿主并在其中繁殖。

[0144] 使用上述技术，独立地对多个Δ-5去饱和酶的HDASH（SEQ ID NO:8）基序内的Asp[D]、Ala[A]和Ser[S]残基进行定点诱变，随后表达所得突变多肽并确定它们相对于野生型酶的活性。令人惊讶地是，产生了多种突变型Δ-5去饱和酶，所述酶包含包括HxASH（SEQ ID NO:35）、HDxSH（SEQ ID NO:36）和HDAxH（SEQ ID NO:37）的氨基酸突变基序，其中突变型Δ-5去饱和酶的Δ-5去饱和酶活性与对应的野生型Δ-5去饱和酶的野生型Δ-5去饱和酶活性功能上相似。

[0145] 例如，通过定点诱变将HDASH（SEQ ID NO:8）基序内对于Ala残基所有可能的氨基酸取代引入来源于小眼虫的修饰突变野生型Δ-5去饱和酶中，其位于包含嵌合的FBAIN::EgD5R*::Pex20基因（即，EgD5R*[SEQ ID NO:27]，在与EgD5[SEQ ID NO:21]进行比较时缺失基因内的四个内部限制性酶位点并在位置347处包含Arg而非Ser）的质粒构建体内。将具有突变序列的质粒单个转化到大肠杆菌中、测序并随后转化到合适的解脂耶氏酵母菌株中，所述菌株之前经工程化用以产生～18%的DGLA。这使得能够基于APA产量（即，通过GC分析）筛选Δ-5去饱和酶活性。

[0146] 鉴定了许多导致突变型Δ-5去饱和酶相对于野生型酶具有基本上降低的Δ-5去饱和酶活性的突变。然而，出人意料地，初步筛选鉴定到了两种氨基酸残基，其可取代在HDASH（SEQ ID NO:8）基序内的Ala，并且在突变体中导致在与对应的野生型酶（即EgD5R*）的Δ-5去饱和酶活性进行比较时大约等同或提高的Δ-5去饱和酶活性的氨基酸残基。因此，这一初步实验表明在HDASH（SEQ ID NO:8）基序内的Ala残基可被Gly或Ser取代，而不显著地影响EgD5R*的Δ-5去饱和酶活性。

[0147] 在定点诱变反应中使用EgD5R*作为模板进行类似的实验，其中HDASH（SEQ ID NO:8）基序的Ser残基被突变。突变酶的分析确定，两个氨基酸残基（即，Ala或Gly）足以替换野生型氨基酸（即，Ser）并产生具有等同或提高的Δ-5去饱和酶活性的突变EgD5R*酶。

[0148] 一旦如上所述完成了EgD5R*的HDASH（SEQ ID NO:8）基序中的氨基酸取代的初步分析，就进一步利用寡核苷酸介导的定点诱变以在与上述Δ-5去饱和酶的多个突变HDASH基序结合的HPGG（SEQ ID NO:7）基序内产生特定点突变。因此，将通过定点诱变将HPGG（SEQ ID NO:7）基序内的多个氨基酸取代引入上述三个突变型HDASH基序Δ-5去饱和酶（即，EgD5R*-157g[SEQ ID NO:87]、EgD5R*-158a[SEQ ID NO:127]和EgD5R*-158g[SEQ ID NO:128]）中的每一个中，它们分别位于质粒pDMW367M4-157g（SEQ ID NO:129）、pDMW367M4-
158a（SEQ ID NO:130）和pDMW367M4-158g（SEQ ID NO:131）内，从而产生在每个HPGG（SEQ ID NO:7）和HDASH（SEQ ID NO:8）基序中具有单突变的双突变体。双突变体在大肠杆菌中扩增、通过DNA测序确认并随后被转化到合适的解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株中。再次基于APA生产（即，通过GC分析）对Δ-5去饱和酶活性进行筛选。

[0149] 所有双突变体相对于无突变的野生型EgD5R*酶具有一些可检测到的Δ-5去饱和酶活性水平。更具体地，所有7个突变型Δ-5去饱和酶相对于相应的野生型EgD5R*对照具有至少64%的DGLA至ARA的转化效率，而3个能够以至少83%的转化效率将DGLA转化成ARA（表3，见下文）。筛选确认HPGG（SEQ ID NO:7）基序的Pro和第二Gly与HDASH（SEQ ID NO:8）基序的Ala和Ser可同时被取代并产生双突变体，该双突变体在与相应野生型酶（即，EgD5R*）中的Δ-5去饱和酶活性进行比较时，具有大约等同的Δ-5去饱和酶活性。因此，这一实验表明1）在HPGG[SEQ ID NO:7]基序内的Pro残基可被Gly取代，同时发生以下任一种取代：a）将HDASH[SEQ ID NO:8]基序内的Ala残基取代成Gly，或b）将HDASH[SEQ ID NO:8]基序内的Ser残基取代成Ala或Gly；2）在HPGG[SEQ ID NO:7]基序内的Pro残基也可被His取代，同时在HDASH[SEQ ID NO:8]基序内的Ser取代成Ala或Gly；以及3）在HPGG[SEQ ID NO:7]基序内的第二Gly残基可被Ser取代，同时在HDASH[SEQ ID NO:8]基序内的Ser取代成Ala或Gly，而不显著地影响EgD5R*的Δ-5去饱和酶活性。

[0150] 编码双突变EgD5R*Δ-5去饱和酶的基因的N-末端经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达（即，EgD5M；SEQ ID NO:152），所述去饱和酶经鉴定与EgD5R*（即，EgD5R*-34g158g；SEQ ID NO:142）相比具有最高的转化效率。然后修饰EgD5M以在位置347（即，EgD5M1；SEQ ID NO:156）处编码Ser，以便分析R347S突变对Δ-5去饱和酶活性的影响。将包含EgD5M（即，pDMW367-5M；SEQ ID NO:155）或EgD5M1（即，pDMW367-5M1；SEQ ID NO:159）的质粒分别转化到合适的解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株中，并且测量Δ-5去饱和酶的活性和转化效率并与野生型EgD5R*进行比较。

[0151] 与野生型EgD5R*相比，两种双突变型Δ-5去饱和酶，即，EgD5M和EgD5M1，均具有提高的活性（表3，见下文）。令人惊讶地是，EgD5M1展示了与EgD5M相比改善的Δ-5去饱和酶活性，表明在氨基酸残基347处的Ser改善了酶活性。

[0152] 使用上述技术，然后通过定点诱变将单氨基酸取代单个引入具有突变型HPGs（SEQ ID NO:11）基序的合成Δ-5去饱和酶的HDASH（SEQ ID NO:8）基序的Asp、Ala、或Ser残基中，该基序经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达并且来源于小眼虫（即，EgD5S-36s[SEQ ID NO:160]；美国专利申请公布2010-0075386-A1），它位于包含嵌合的FBAIN::EgD5S-36s::Pex20基因的质粒构建体内。使用具有突变型HaGG（SEQ ID NO:14）基序的合成Δ-5去饱和酶重复所述规程，该基序经密码子优化以在解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）中表达并且来源于Euglena anabaena（即，EaD5S-35a[SEQ ID NO:188]；美国专利申请公布2010-0075386-A1）。具有双突变体的质粒在大肠杆菌中独立地扩增、通过DNA测序确认、并且随后被转化到合适的解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株中用于基于ARA生产（即，通过GC分析）的Δ-5去饱和酶活性筛选。双突变型Δ-5去饱和酶获自每个实验，其包含HxGx（SEQ ID NO:34）和HxxxH（SEQ ID NO:1）基序并具有合适的Δ-5去饱和酶活性（参见附加细节实施例和表3，下文）。

[0153] 表3：优选的包含HxGx（SEQ ID NO:34）和HxxxH（SEQ ID NO:1）基序的突变型Δ-5去饱和酶

[0154]

[0155] a Δ-5去饱和酶活性相对于对应的野生型酶，具有HPGG（SEQ ID NO:7）和HDASH（SEQ ID NO:8）基序。

[0156] b Δ-5去饱和酶活性相对于对应的亲本酶，仅具有一个突变型HPGs（SEQ ID NO:11）基序。

[0157] c Δ-5去饱和酶活性相对于对应的亲本酶，仅具有一个突变型HaGG（SEQ ID NO:14）基序。

[0158] 上述研究不表明HPGG（SEQ ID NO:7）和HDASH（SEQ ID NO:8）基序中的特定同时氨基酸取代足以产生具有可接受的Δ-5去饱和酶活性的突变多肽。然而，与本领域此前的报道相反，数据令人惊讶地表明取代HPGG（SEQ ID NO:7）基序的Pro或Gly残基与取代HDASH（SEQ ID NO:8）基序的Asp、Ala或Ser残基一起可导致酶的功能等同于或优于它的野生型亲本酶的Δ-5去饱和酶活性。

[0159] 因此，提供具有Δ-5去饱和酶活性的多肽在本发明的范围内，所述去饱和酶包含第一氨基酸基序，其选自：SEQ ID NO:9（HgGG）、SEQ ID NO:10（HhGG）、SEQ ID NO:11（HPGs）、SEQ ID NO:12（HcGG）、SEQ ID NO:13（HwGG）和SEQ ID NO:14（HaGG）；以及第二氨基酸基序，其选自：SEQ ID NO:15（HDgSH）、SEQ ID NO:16（HDsSH）、SEQ ID NO:17（HDAaH）、SEQ ID NO:18（HDAgH）和SEQ ID NO:19（HeASH）。

[0160] 更优选地，上述突变型Δ-5去饱和酶（即，包含HxGx[SEQ ID NO:34]基序和突变型HxxxH[SEQ ID NO:1]基序附加地具有Δ-5去饱和酶活性，其至少为相应的野生型Δ-5去饱和酶活性的64%，所述野生型酶具有HPGG（SEQ ID NO:7）和HDASH（SEQ ID NO:8）氨基酸基序。

[0161] 基于BLASTP比对方法在与具有选自SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:29的序列的多肽进行比较时，包含突变型HPGG基序和突变型HDASH基序的突变型Δ-5去饱和酶多肽可具有至少90%的序列同一性，并且更优选具有至少95%的序列同一性。

[0162] 在一些实施方案中，所述多肽具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145[EgD5R*-34h158a]、SEQ ID NO:147[EgD5R*-34h158g]、SEQ ID NO:149[EgD5R*-36s158a]、SEQ ID NO:151[EgD5R*-36s158g]、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:255[EgD5R-34g158g]、SEQ ID NO:260[EgD5R-34g158a]、SEQ ID NO:271[EaD5-35g159g]和SEQ ID NO:276[EaD5-
35g159a]。

[0163] 本领域的技术人员将认识到，有用的Δ-5去饱和酶不限于以上所述的突变。相反，所述结果表明可使用任何Δ-5野生型去饱和酶进行相似的实验，该酶具有HDASH基序（SEQ ID NO:8）和在细胞色素b5域内的HPGG（SEQ ID NO:7）基序，从而工程化突变型Δ-5去饱和酶，该酶具有合适的Δ-5去饱和酶活性，其中所述突变将产生突变型HxGG（SEQ ID NO:32）或HPGx基序（SEQ ID NO:33）以及突变型HxASH（SEQ ID NO:35）、HDxSH（SEQ ID NO:36）或HDAxH基序（SEQ ID NO:37）。具有合适的Δ-5去饱和酶活性的突变酶可用于提高ω-3/ω-6脂肪酸的产量。

[0164] 例如体外诱变和选择或易错PCR（Leung等人，Techniques，1:11-15（1989）；Zhou等人，Nucleic Acids Res.，19:6052-6052（1991）；Spee等人，Nucleic Acids Res.，21:777-778（1993）；Melnikov等人，Nucleic Acids Res.，27（4）:1056-1062（1999年2月15日））也可用作获取天然存在的Δ-5去饱和酶基因突变的方式，其中所述突变可包括缺失、插入和点突变、或它们的组合。易错PCR的主要优点是，通过该方法引入的所有突变都将位于所期望的去饱和酶基因内，并且任何改变均可容易地通过改变PCR条件而加以控制。作为另外一种选择，也可使用可商购获得的材料如大肠杆菌XL1-Red菌株和大肠杆菌XL1-Red突变株进行体内诱变，所述菌株来自Stratagene（La Jolla，CA；Greener and Callahan，Strategies,
7:32-34（1994））。该菌株缺乏三条主要的DNA修复途径（mutS，mutD和mutT），导致比野生型高5000倍的突变率。体内诱变不取决于连接效率（如同易错PCR）；然而，突变可发生在载体的任何区域处并且突变率一般要低得多。

[0165] 也预期具有改变的或增强的Δ-5去饱和酶活性的突变型Δ-5去饱和酶可使用基因改组（gene shuffling）方法构建（美国专利申请5,605,793；美国专利申请5,811,238；美国专利申请5,830,721；美国专利申请5,837,458）。基因改组方法由于其易于实施并且具有高诱变率而尤其具有吸引力。基因改组的过程涉及在存在附加的DNA区域的群体的情况下将受关注的基因限制为特定大小的片段，与受关注的基因相似的（或不同的）DNA区域均包括在所述群体中。上述片段的集合将变性，然后退火，以产生突变的基因。然后就改变的活性对突变的基因进行筛选。也可使用这些方法中的任何一种产生Δ-5去饱和酶突变酶，其具有取代的基序HxGG（SEQ ID NO:32）或HPGx（SEQ ID NO:33）、以及HxASH（SEQ ID NO:35）、HDxSH（SEQ ID NO:36）、或HDAxH（SEQ ID NO:37），然后可使用本文所述的方法筛选合适的活性。

[0166] 预期在适当启动子的控制下，编码本文所述的突变型Δ-5去饱和酶（即，其中所述突变型Δ-5去饱和酶在编码HPGG氨基酸基序的区域中包含至少一个突变，并且在编码HDASH氨基酸基序的区域中包含至少一个突变，并且其中所述突变型Δ-5去饱和酶相对于对应的野生型Δ-5去饱和酶优选具有至少64%的Δ-5去饱和酶活性）的嵌合基因的引入将在转化的宿主生物中致使分别生产ARA和/或EPA。同样地，本文所公开的是直接生产PUFA的方法，其包括将脂肪酸底物（即，DGLA和/或ETA）暴露于本文所述的突变去饱和酶（例如任何SEQ ID NO:139、141、143、145、147、149、151、153、157、181、183、185、187、213、215、217、
255、260、271和276），使得底物被转化成期望的脂肪酸产物（即，分别是ARA和/或EPA）。

[0167] 更具体地，本文所述的是在微生物宿主细胞（例如细菌、酵母、藻类、类眼虫、原生藻菌、卵菌纲和真菌）或植物宿主细胞（例如油料种子植物细胞）中生产PUFA的方法，其中所述微生物或植物宿主细胞包含：

[0168] a)具有Δ-5去饱和酶活性的多肽，所述去饱和酶包含选自以下的第一氨基酸基序：SEQ ID NO:9（HgGG）、SEQ ID NO:10（HhGG）、SEQ ID NO:11（HPGs）、SEQ ID NO:12（HcGG）、SEQ ID NO:13（HwGG）和SEQ ID NO:14（HaGG）；以及选自以下的第二氨基酸基序：SEQ ID NO:15（HDgSH）、SEQ ID NO:16（HDsSH）、SEQ ID NO:17（HDAaH）、SEQ ID NO:18（HDAgH）和SEQ ID NO:19（HeASH）；和

[0169] b)选自DGLA和ETA的底物脂肪酸来源；

[0170] 其中所述宿主细胞在使得突变型Δ-5去饱和酶被表达并且底物脂肪酸被转化成产物PUFA的条件下生长，其中将DGLA转化成ARA和/或将ETA转化成EPA；并且其中任选地回收所述产物PUFA。

[0171] 作为另外一种选择，本文所述的每种突变型Δ-5去饱和酶基因及其对应的酶产物可被直接用于生产各种ω-6和ω-3PUFA（参见图1；美国专利7,238,482；美国专利7,678,560；美国专利7,695,950）。发生了间接产生ω-3/ω-6PUFA，其中脂肪酸底物经由中间步骤或途径中间产物间接转化成期望的脂肪酸产物。因此，预期本文所述的突变型Δ-5去饱和酶可结合表达编码PUFA生物合成途径的酶（例如Δ-6去饱和酶、C18/20延伸酶、Δ-17去饱和酶、Δ-8去饱和酶、Δ-15去饱和酶、Δ-9去饱和酶、Δ-12去饱和酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、Δ-9延伸酶、Δ-5去饱和酶、Δ-4去饱和酶、C20/22延伸酶）的附加基因以产生较高含量的长链ω-3/ω-6脂肪酸，例如ARA、EPA、DTA、DPAn-6、DPA和/或DHA。

[0172] 优选地，本文所述的Δ-5去饱和酶将结合表达至少Δ-9延伸酶和Δ-8去饱和酶。Δ-5去饱和酶也可结合表达至少Δ-6去饱和酶和Δ-6延伸酶。然而，包含于具体表达盒中的具体基因将取决于宿主细胞（及其PUFA特征和/或去饱和酶/延伸酶特征）、底物的可用性和所需的终产物。

[0173] 必须产生并引入重组构建体到合适的宿主细胞中，所述构建体包含编码突变型Δ-5去饱和酶的ORF（即，其中所述突变体包含选自以下的第一氨基酸基序：SEQ ID NO:9（HgGG）、SEQ ID NO:10（HhGG）、SEQ ID NO:11（HPGs）、SEQ ID NO:12（HcGG）、SEQ ID NO:13（HwGG）和SEQ ID NO:14（HaGG），和选自以下的第二氨基酸基序：SEQ ID NO:15（HDgSH）、SEQ ID NO:16（HDsSH）、SEQ ID NO:17（HDAaH）、SEQ ID NO:18（HDAgH）和SEQ ID NO:19（HeASH））。

[0174] 本领域的技术人员认识到标准来源的材料如下所述：1）构建、操纵和分离大分子例如DNA分子、质粒等的特定条件和程序；2）产生重组DNA片段和重组表达构建体；以及3）筛选并分离克隆或植物品系。参见Sambrook等人；Silhavy等人；Ausubel等人；Maliga等人，Methods in Plant Molecular Biology，Cold Spring Harbor:NY（1995）；Birren等人，Genome Analysis:Detecting Genes，第1卷，Cold Spring Harbor:NY（1998）；Birren等人，Genome Analysis:Analyzing DNA，第2卷，Cold Spring Harbor:NY（1998）；Plant Molecular Biology:A Laboratory Manual编辑，Clark，Springer:NY（1997）。

[0175] 一般来讲，包含于构建体中的序列的选择取决于期望的表达产物、宿主细胞的性质以及提出的相对于未转化细胞分离转化细胞的方法。技术人员知道必须存在于质粒载体上以成功地转化、选择并增殖包含嵌合基因的宿主细胞的遗传因子。然而，通常载体或盒含有引导相关基因的转录和翻译的序列、选择性标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的表达盒通常包括启动子、所选基因的编码序列、以及终止子。最优选两个控制区都来源于来自转化宿主细胞的基因。

[0176] 用于驱动所述Δ-5去饱和酶ORF在期望微生物宿主细胞或植物细胞中表达的启动子是人们熟知的。实际上能够引导这些基因在所选宿主细胞中表达的任何启动子（即，原生的、合成的、或嵌合）都是适用的。在宿主细胞中的表达可以诱导型或组成型的方式实现。诱导型表达通过诱导可操作地连接至受关注的基因的可调控启动子的活性而发生，而组成型表达通过使用组成型启动子而发生。

[0177] 例如，美国专利申请公布2009-0093543-A1描述了在解脂耶氏酵母使用的启动子。可使用许多启动子中的任一种，这取决于期望是组成型转录还是诱导型转录、启动子在表达受关注的ORF中的效率、构建的容易性等。

[0178] 已经发现围绕翻译起始密码子‘ATG’的核苷酸序列影响酵母细胞的表达。如果所需多肽在酵母中表达差，则可修饰外源基因的编码区以包括有效的酵母翻译起始序列，从而获得最佳的基因表达。对于酵母中的表达而言，这可通过定点诱变无效地表达的基因或通过将其融合到外源酵母启动子的框架区中来完成，优选高度表达的启动子。作为另外一种选择，可工程化宿主的共有翻译起始序列到异源基因中，以用于它们的最佳表达。

[0179] 终止子可来源于基因的3’区，启动子从该基因获得的基因或该基因来自不同的基因。大量的终止子是已知的并且（在用于与它们源自的属和物种相同和不同的属和物种两者时）在多种宿主中发挥的功能令人满意。终止子的选择通常更多是为了方便而不是因为任何特殊的性质。终止子可来源于原产自优选宿主的多种基因。终止子也可为合成的，本领域的技术人员可利用可用的信息设计并合成终止子。终止子可能是非必需的，但是高度优选的。

[0180] 仅将基因插入克隆载体并不能保证它以所期望的速度、浓度、量等表达。作为对高水平表达的需求的响应，通过调节控制转录、RNA稳定性、翻译、蛋白质稳定性和定位、以及从微生物宿主细胞或植物细胞的分泌的特定性质，构建了许多专门的表达载体。这些特性包括：相关转录启动子和终止子序列的性质；克隆基因的拷贝数（其中可通过增加质粒拷贝数或将克隆基因多次整合进基因组中将附加的拷贝在单个表达构建体中克隆和/或将附加的拷贝引入宿主细胞中）；基因是质粒传染的还是整合进宿主细胞基因组中的；合成外来蛋白的最终细胞位置；蛋白在宿主生物中的翻译效率和正确折叠；克隆基因的mRNA和蛋白在宿主细胞中的内部稳定性；以及在克隆基因中的密码子使用。这些性质每种均可被用于本文所述的方法和宿主细胞中，以进一步优化所述突变型Δ-5去饱和酶的表达。

[0181] 产生包含至少一种包含启动子、突变型Δ-5去饱和酶ORF和终止子的嵌合基因的重组构建体之后，将其置于能够在宿主细胞中自主复制的质粒载体中，或者使其直接整合进宿主细胞的基因组。表达盒的整合可在宿主基因组中随机地发生或者可通过使用这样的构建体来靶向，即该构建体含有足以靶向宿主基因座中的重组的与宿主基因组同源的区。如果构建体靶向内源性基因座，则转录和翻译调控区的全部或某些可由内源性基因座提供。

[0182] 如果两个或更多个基因从独立的复制载体表达，则希望每个载体具有不同的选择方式并且应该缺乏与其它构建体的同源性以便保持稳定表达和防止元件在构建体之间重配（reassortment）。可用实验方法确定对调控区、选择方式和所引入的构建体的增殖方法的正确选择，以便所有引入的基因都以需要的水平表达从而提供所需产品的合成。

[0183] 包含受关注的基因的构建体可通过任何标准技术引入微生物宿主细胞或植物宿主细胞中。这些技术包括转化如醋酸锂转化（Methods in Enzymology，194:186-187（1991））、基因枪轰击（bolistic impact）、电穿孔、显微注射或将受关注的基因引入宿主细胞中的任何其它方法。

[0184] 为方便起见，已经通过任何方法操纵以摄取DNA序列（如表达盒）的宿主细胞，在本文中将称为“转化的”、“转化体”或“重组体”。转化的宿主将具有至少一个复制的表达构建体，并且可具有两个或更多个复制，这取决于该表达盒是整合进基因组内的、被扩增的、还是存在于具有多复制数的染色体外元件上。转化的宿主细胞能通过就所引入的构建体上包含的标记进行的选择得到鉴定。作为另外一种选择，单独的标记构建体可与所期望的构建体进行共转化，该方法与将多种DNA分子引入宿主细胞的多种转化技术一样。

[0185] 典型地，就转化的宿主在选择性培养基上生长的能力对它们进行选择，所述选择性培养基可掺入了抗生素或缺少未被转化的宿主生长所必需的因子，例如营养物质或生长因子。引入的标记基因可赋予抗生素抗性，或编码必需的生长因子或酶，从而当在转化宿主中表达时允许在选择培养基上生长。转化宿主的选择也可发生在表达标记可被直接地或间接地检测出来时。更多的选择技术描述于美国专利7,238,482、美国专利7,259,255和美国专利7,932,077。

[0186] 转化后，适合本发明的突变型Δ-5去饱和酶（以及任选地，在宿主细胞中共表达的其它PUFA酶）的底物可由宿主天然地产生或通过转基因产生，或者它们可由外部来源提供。

[0187] 多种真核生物，包括细菌、酵母、藻类、原生藻菌、卵菌、眼虫、真菌和/或植物，适合作为宿主，从而产生包含如本文所述的突变型Δ-5去饱和酶的转化体。这是可预期的，因为转录、翻译和蛋白生物合成结构是高度保守的。因此，合适的宿主可包括但不限于在多种原料（包括简单或复杂的碳水化合物、脂肪酸、有机酸、油、甘油和醇类和/或碳氢化合物）上于广泛的温度和pH值范围内生长的那些宿主。

[0188] 优选的微生物宿主是含油生物。这些含油生物天然地能够合成并积聚油，其中总油含量可包含大于约25%的细胞干重[“DCW”]，更优选包含大于约30%的DCW，更优选包含大于约40%的DCW，更优选包含大于约50%的DCW，并且最优选包含大于约60%的DCW。多种细菌、藻类、眼虫、苔藓、真菌、酵母和原生藻菌被天然地分类为含油的。在可供选择的实施方案中，非含油生物可经基因修饰变成含油，例如酵母如啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）（参见国际申请公布WO 2006/102342）。

[0189] 在较优选的实施方案中，微生物宿主细胞是含油酵母，其能够产生至少25%的DCW作为油。通常鉴定为含油酵母的属包括但不限于：耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属。更具体地，示例性的合成油的酵母包括：圆红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）、斯达氏油脂酵母（Lipomyces starkeyii）、产油油脂酵母（L.lipoferus）、拉可夫氏假丝酵母（Candida revkaufi）、铁红假丝酵母（C.pulcherrima）、热带假丝酵母（C.tropicalis）、产朊假丝酵母（C.utilis）、茁芽丝孢酵母（Trichosporon pullans）、皮状丝孢酵母（T.cutaneum）、胶粘红酵母（Rhodotorula glutinus）、牧草红酵母（R.graminis）和解脂耶氏酵母。

[0190] 最优选的是含油酵母解脂耶氏酵母。在另一个实施方案中，最优选的是命名为ATCC#76982、ATCC#20362、ATCC#8862、ATCC#18944和/或LGAM S（7）1的解脂耶氏酵母菌株（Papanikolaou S.和Aggelis G.，Bioresour.Technol.，82（1）:43-9（2002））。

[0191] 适用于转化含油酵母（例如解脂耶氏酵母）的具体教导内容包括美国专利4,880,741、美国专利5,071,764，以及Chen,D.C.等人（Appl.Microbiol.Biotechnol.，48（2）:232-
235（1997））。适用于在解脂耶氏酵母中工程化ARA、EPA和DHA的具体教导分别在美国专利7,
588,931、美国专利申请公布2009-0093543-A1和2010-0317072-A1以及美国专利申请7,
550,286中提供。

[0192] 在这种酵母中表达基因的优选方法是将线性DNA整合进宿主的基因组中。当期望基因高水平表达时，整合进基因组中的多个位置可为尤其有用的，例如整合进如下基因座中：Ura3、Leu2、Lys5、Aco2、Pox3、Lip1、Lip2、SCP2、Pex3、Pex16和/或Pex10（参见例如美国专利申请公布2009-0093543-A1和2010-0317072-A1）。

[0193] 优选的用于解脂耶氏酵母的选择方法是对卡那霉素、潮霉素和氨基糖苷G418的抗性以及在缺乏尿嘧啶、亮氨酸、赖氨酸、色氨酸或组氨酸的培养基上生长的能力。5-氟乳清酸（5-氟尿嘧啶-6-羧酸一水合物；“5-FOA”）也可尤其用于选择酵母Ura-突变体（美国专利申请公布2009-0093543-A1），或赋予磺酰基脲抗除草剂性（美国专利申请7,932,077）的天然的乙酰羟酸合酶（或乙酰乳酸合酶；E.C.4.1.3.18）可用于选择转化体。美国专利申请公布2009-0093543-A1中还教导了一种独特的方法，该方法通过使用位点特异性重组酶体系，“循环利用”一对优选的选择标记，用于连续进行的多重转化中。

[0194] 基于上文，本文公开了分别生产ARA或EPA的方法，所述方法包括：

[0195] (a)提供含油酵母（例如解脂耶氏酵母），其包含：

[0196] (i)编码突变型Δ-5去饱和酶多肽的第一重组核苷酸分子，该核苷酸分子可操作地连接到至少一个调控序列；

[0197] (ii)分别由DGLA和/或ETA组成的去饱和酶底物源；并且

[0198] (b)在适合的可发酵碳源的存在下使步骤（a）的酵母生长，其中编码所述突变型Δ-5去饱和酶多肽的基因得到表达而且分别将DGLA转化成ARA和/或将ETA转化成EPA；并且[0199] (c)任选地，分别回收步骤（b）中的ARA和/或EPA。

[0200] 可能需要底物进料。在优选的实施方案中，所述突变型Δ-5去饱和酶多肽选自：SEQ ID NO:139[EgD5R*-34g157g]、SEQ ID NO:141[EgD5R*-34g158a]、SEQ ID NO:143[EgD5R*-34g158g]、SEQ ID NO:145[EgD5R*-34h158a]、SEQ ID NO:147[EgD5R*-34h158g]、SEQ ID NO:149[EgD5R*-36s158a]、SEQ ID NO:151[EgD5R*-36s158g]、SEQ ID NO:153[EgD5M、密码子优化的EgD5R*-34g158g]、SEQ ID NO:157[EgD5M1、密码子优化的EgD5R*-
34g158g347s]、SEQ ID NO:181[EgD5S-36s156e]、SEQ ID NO:183[EgD5S-36s157g]、SEQ ID NO:185[EgD5S-36s158a]、SEQ ID NO:187[EgD5S-36s158g]、SEQ ID NO:213[EaD5S-
35a158g]、SEQ ID NO:215[EaD5S-35a158s]、SEQ ID NO:217[EaD5S-35a159g]、SEQ ID NO:
255[EgD5R-34g158g],SEQ ID NO:260[EgD5R-34g158a]、SEQ ID NO:271[EaD5-35g159g]和SEQ ID NO:276[EaD5-35g159a]。因此例如编码突变型Δ-5去饱和酶多肽的基因的核苷酸序列可例如选自：SEQ ID NO:138、140、142、144、146、148、150、152、156、180、182、184、186、
212、214、216、254、259、270和275。

[0201] 由于含油酵母中天然产生的PUFA仅限于18:2脂肪酸（即LA）和通常较少的18:3脂肪酸（即ALA），除了本文所述的突变型Δ-5去饱和酶外，还可对含油酵母进行基因工程改造以表达多种长链PUFA生物合成所必需的酶（从而使得例如DPAn-6、DPA和DHA的生产成为可能）。

[0202] 具体而言，本文设想了含油酵母，其中所述酵母包含：

[0203] a)包含编码突变型Δ-5去饱和酶多肽的分离的多核苷酸的第一重组DNA构建体，其中所述多核苷酸可操作地连接到至少一种调控序列；和

[0204] b)包含分离的多核苷酸的至少一种附加的重组DNA构建体，其中所述多核苷酸可操作地连接到至少一种调控序列，并且编码选自以下的多肽：Δ-4去饱和酶、Δ-6去饱和酶、Δ-9去饱和酶、Δ-12去饱和酶、Δ-15去饱和酶、Δ-17去饱和酶、Δ-8去饱和酶、Δ-9延伸酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、C18/20延伸酶和C20/22延伸酶。

[0205] 其它适合的微生物宿主包括含油的细菌、藻类、眼虫、原生藻菌、卵菌和真菌。在该广泛的微生物宿主的组中，特别关注的是合成ω-3/ω-6脂肪酸的微生物，或那些可被基因工程化而达到该目的的微生物。因此，例如，用处于诱导型或调节型启动子控制下的任何本发明的Δ-5去饱和酶基因转化高山被孢霉（Mortierella alpina）（其在商业上被用于生产ARA），能够产生能合成增加量的ARA的转化生物。Mackenzie 等人（Appl.Environ.Microbiol.，66:4655（2000））描述了转化高山被孢霉（M.alpina）的方法。
类似地，美国专利7,001,772中公开了用于转化破囊壶菌目（Thraustochytriales）微生物（例如，破囊壶菌属（Thraustochytrium）、裂殖壶菌属（Schizochytrium））的方法。

[0206] 本文所述的Δ-5去饱和酶基因和基因产物也可在异源含油植物内的细胞中产生，其常称为“油料种子”植物。油料种子植物的实例包括但不限于：大豆（大豆属和野大豆属）、亚麻（亚麻属.）、油菜籽（芸苔属）、玉米、棉花、红花（红蓝花属）和向日葵（向日葵属）。

[0207] 在一个实施方案中，本发明涉及包括本发明任何一种Δ-5去饱和酶多核苷酸的重组构建体，将所述多核苷酸可操纵地连接到至少一种适于在植物中表达的调控序列。

[0208] 只要它具有足够的转录活性，通过在正确时间、在所需宿主组织中表达所需核酸片段的可翻译mRNA以完成本发明，经选择用于促进Δ-5去饱和酶编码序列表达的植物启动子是不重要的。异种的或非异种的（即内源的）启动子均可用于实施本发明。例如，合适的启动子包括但不限于：13-伴大豆球蛋白启动子的α-原初亚基、Kunitz型胰蛋白酶抑制剂3启动子、膜联蛋白启动子（又称为P34启动子；国际专利申请公布WO2004/071178）、Glyl启动子、13-伴大豆球蛋白启动子的13亚基、P34/Gly Bd m 30K启动子、白蛋白启动子、Leg Al启动子和Leg A2启动子。

[0209] 然后使用常规方法将启动子在有义方向上可操作地连接，所述方法是本领域的技术人员熟知的。

[0210] 然后可将重组构建体通过本领域普通技术人员熟知的方法（例如转染、转化和电穿孔），将其引入一种或多种植物细胞中。然后在允许表达长链PUFA的合适条件下培养和再生转化过的植物细胞，所述长链PUFA随后被回收并纯化。

[0211] 可如上所述完成至少一个期望的长链PUFA在植物细胞中的瞬时或稳定表达。此类PUFA也可在种子、获自转化植物的植物部分或获自转化植物种子的油中表达。

[0212] 植物部分包括分化和未分化的组织，其包括但不限于：根、茎、苗、叶片、花粉、种子、肿瘤组织和不同形式的细胞与培养物（例如单细胞、原生质体、胚芽和愈伤组织）。植物组织可存在于植株或植物器官、组织或细胞培养物中。

[0213] 术语“植物器官”是指构成植株的形态和功能不同部分的植物组织或组织群。

[0214] 因此，本发明也涉及转化细胞的方法，所述方法包括用本发明的重组构建体转化细胞并选择那些用重组构建体转化过的细胞，其中：所述重组构建体包含编码具有Δ-5去饱和酶活性的突变多肽的核苷酸序列，其中所述突变多肽的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:34[HxGx]所示的氨基酸基序，其中SEQ ID NO:34[HxGx]与SEQ ID NO:7[HPGG]不同；并且如SEQ ID NO:1[HxxxH]所示的氨基酸基序，其中SEQ ID NO:1[HxxxH]与SEQ ID NO:8[HDASH]不同。

[0215] 还关注用本发明的突变型Δ-5去饱和酶多核苷酸生产转化植物细胞并从转化过的植物细胞再生植物的方法。

[0216] 已经公布了转化双子叶植物（主要通过使用根癌农杆菌）并获取转基因植物的方法等等，适用于：棉花（美国专利申请5,004,863；美国专利申请5,159,135）；大豆（美国专利申请5,569,834；美国专利申请5,416,011）；芸苔属（美国专利申请5,463,174）；花生（Cheng等人，Plant Cell Rep.，15:653-657（1996）；McKently等人，Plant Cell Rep.，14:699-703（1995））；木瓜（Ling，K.等人，Bio/technology，9:752-758（1991））；和豌豆（Grant等人，Plant Cell Rep.，15:254-258（1995））。对其它常用植物转化方法的回顾参见Newell，C.A.（Mol.Biotechnol.，16:53-65（2000））。这些转化方法之一利用了发根土壤杆菌（Agrobacterium rhizogenes）（Tepfler，M.和Casse-Delbart，F.Microbiol.Sci.，4:24-28（1987））。已经公布了使用直接递送DNA转化大豆的方法，其使用PEG融合（国际专利申请公布WO 92/17598）、电穿孔（Chowrira，G.M.等人，Mol.Biotechnol.，3:17-23（1995）；
Christou，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci“.Sci.”，USA，84:3962-3966（1987））、显微注射、或粒子轰击（McCabe，D.E.等人，Bio/Technology，6:923（1988）；Christou等人，Plant Physiol.，87:671-674（1988））。

[0217] 存在多种用于从植物组织再生植物的方法。再生的具体方法将取决于起始植物组织以及待再生的具体植物物种。从单植物原生质体转化体或从多种经转化的外植体再生、发育和培育植物是本领域熟知的（Weissbach和Weissbach，In:Methods for Plant Molecular Biology，（编辑），Academic:San Diego，CA（1988））。该再生和生长方法通常包括如下步骤：选择转化的细胞和培养这些单独化的细胞通过胚发育的通常阶段以及通过生根小植株阶段。转基因胚以及种子以类似的方式再生。随后将所得转基因的生根小苗种植在诸如土壤之类的合适植物生长培养基中。优选地，将再生的植物进行自花授粉以产生纯合的转基因植物。或者，将获自再生植物的花粉与农学上重要的品系的产生种子的植株进行杂交。相反，将来自这些重要品系的植物用于给再生植物授粉。利用本领域的技术人员熟知的方法培育含有所需多肽的本发明的转基因植物。

[0218] 在一个实施方案中，本发明涉及油料种子植物，其包含：

[0219] a)包含编码具有Δ-5去饱和酶活性的突变多肽的分离多核苷酸的第一重组DNA构建体，其中所述多核苷酸可操作地连接到至少一种调控序列；和

[0220] b)包含分离的多核苷酸的至少一种附加的重组DNA构建体，其中所述多核苷酸可操作地连接到至少一种调控序列，并且编码选自以下的多肽：Δ-4去饱和酶、Δ-5去饱和酶、Δ-6去饱和酶、Δ-9去饱和酶、Δ-12去饱和酶、Δ-15去饱和酶、Δ-17去饱和酶、Δ-9延伸酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、C18/20延伸酶和C20/22延伸酶。

[0221] 此类附加的去饱和酶和延伸酶在多个专利和公开文献中进行了讨论（例如美国专利申请6,075,183、5,968,809、6,136,574、5,972,664、6,051,754、6,410,288、7,932,077和国际专利申请公布WO 98/46763、WO98/46764、WO 00/12720、WO 00/40705）。

[0222] 使用的盒组合的选择取决于拟转化的油料种子植物细胞的PUFA特征和/或去饱和酶/延伸酶特征部分和拟表达的长链PUFA。

[0223] 在另一方面，本发明涉及在植物细胞中制备长链PUFA的方法，其包括：

[0224] a)用本发明的重组构建体转化细胞；并且

[0225] b)选择那些产生长链PUFA的转化细胞。

[0226] 在另一方面，本发明涉及在植物细胞中制备至少一种PUFA的方法，其包括：

[0227] (a)用第一重组DNA构建体转化植物细胞，所述构建体包含：

[0228] i.编码具有Δ-5去饱和酶活性的突变多肽的分离多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地连接到至少一种调控序列；和

[0229] ii.包含分离的多核苷酸的至少一种附加的重组DNA构建体，其中所述多核苷酸可操作地连接到至少一种调控序列，并且编码选自以下的多肽：Δ-4去饱和酶、Δ-5去饱和酶、Δ-6去饱和酶、Δ-9去饱和酶、Δ-12去饱和酶、Δ-15去饱和酶、Δ-17去饱和酶、Δ-9延伸酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、C18/20延伸酶和C20/22延伸酶；

[0230] (b)从步骤（a）的转化细胞中再生植物；以及

[0231] (c)选择获自步骤（b）的植物的那些种子，所述植物与获自非转化植物的种子中的PUFA水平相比具有改变的PUFA水平。

[0232] 在尤其优选的实施方案中，至少一个附加的重组DNA构建体编码具有Δ-9延长酶活性和Δ-8去饱和酶活性的多肽。?

[0233] 无论选择用什么宿主表达本文所述的突变型Δ-5去饱和酶，为了获得表现出所需表达水平和模式的菌株或植物品系，必须筛选多个转化子。例如，Juretzek等人（Yeast，18:97-113（2001）提出，整合的DNA片段在解脂耶氏酵母中的稳定性取决于具体的转化体、受体菌株和所用的靶向平台。这种筛选可通过DNA的Southern印迹分析（Southern，
J.Mol.Biol.，98:503（1975））、mRNA表达的Northern分析（Kroczek，
J.Chromatogr.Biomed.Appl.，618（1-2）:133-145（1993））、蛋白质表达的Western和/或Elisa分析、PUFA产物的表型分析或GC分析来完成。

[0234] 对于在多种宿主细胞中操纵ω-3和/或ω-6脂肪酸的生物合成，有关本发明的突变型Δ-5去饱和酶序列的知识将是有用的。用于操纵生物化学途径的方法是本领域的技术人员熟知的，并且期望可能使用多个操纵最大化在含油酵母/尤其是解脂耶氏酵母和油料种子植物中的ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成。这种操纵可能需要直接在PUFA生物合成途径中进行代谢工程改造或需要另外对为PUFA生物合成途径贡献碳的途径进行操纵。可用于上调期望的生化途径和下调不期望的生化途径的方法是本领域的技术人员熟知的。

[0235] 例如与ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途径竞争能量或碳的生化途径或干扰特定PUFA终产物产生的天然PUFA生物合成途径中的酶可通过基因破坏来去除或通过其它方式（如反义mRNA）来下调。

[0236] 在PUFA生物合成途径内作为增加ARA、EPA或DHA方式的操纵及其相关技术的详述分别在美国专利申请7,588,931、美国专利申请7,932,077、美国专利申请公布2009-0993543-A1、和美国专利申请7,550,286中提供，所期望的对TAG生物合成途径和TAG降解途径的操纵（及其相关技术）同样见于上述文献。

[0237] 通过任何一种上述策略调节脂肪酸生物合成途径的表达都可能是有用的。例如，本文提供了将编码在Δ-9延伸酶/Δ-8去饱和酶生物合成途径和Δ-6去饱和酶/Δ-6延伸酶生物合成途径中的关键酶的基因引入含油酵母或油料种子植物中以生产ω-3和/或ω-6脂肪酸的方法。利用对宿主生物进行代谢工程改造的多种方法，使本发明的突变型Δ-5去饱和酶基因在天然地不具有ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途径的含油酵母或油料种子植物中表达并协调这些基因的表达，以使优选的PUFA产物的生产最大化，将是特别有用的。

[0238] 使转化的微生物宿主细胞在使嵌合基因（例如，去饱和酶、延伸酶）的表达最优化并且产生所期望的PUFA的产率最大且最经济的条件下生长。通常，可被优化的培养基条件包括碳源的类型和量、氮源的类型和量、碳氮比、不同矿物离子的量、氧水平、生长温度、pH、生物量生产期的时长、油脂积聚期的时长以及收获细胞的时间和方法。通常使受关注的微生物，例如含油酵母（如解脂耶氏酵母），在复合培养基，例如酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖肉汤培养基[“YPD”]，或缺乏生长所必需的成分并因此强迫选择所需表达盒的最低限定培养基（例如，Yeast Nitrogen Base（DIFCO Laboratories,Detroit,MI））中生长。

[0239] 用于本文所述方法和宿主细胞的发酵培养基必须包含合适的碳源，如在美国专利7,238,482和美国专利公布2011-0059204-A1中提出的碳源。虽然预期本文方法中利用的碳源可包括多种碳源，优选的碳源是糖（例如葡萄糖、转化蔗糖、果糖以及它们的组合）、甘油、和/或脂肪酸。

[0240] 氮可得自无机来源（例如（NH4）2SO4）或有机来源（例如脲或谷氨酸或“酵母提取物”）。除了包含合适的碳源和氮源外，发酵培养基还必须包含合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液、维生素和本领域的技术人员已知的适合含油宿主生长并促进PUFA产生所必需的酶促途径的其它组分。特别关注的是促进脂质和PUFA合成的几种金属离子，例如Fe+2、Cu+2、Mn+2、Co+2、Zn+2和Mg+2（Nakahara,T.等人，Ind.Appl.Single Cell Oils，D.J.Kyle和R.Colin，编辑，第61-97页（1992））。

[0241] 用于本文所述方法和宿主细胞的优选生长培养基是常规的商业制备培养基，如酵母氮源培养基（Yeast Nitrogen Base，DIFCO Laboratories，Detroit，MI）。也可使用其它确定成分的生长培养基或合成的生长培养基，适于转化宿主细胞生长的培养基对微生物学或发酵科学领域的技术人员来说将是已知的。适于发酵的pH范围通常介于约pH4.0至pH8.0之间，其中优选将pH5.5至pH7.5作为初始生长条件的范围。发酵可在有氧或厌氧条件下进行，其中优选微氧条件。

[0242] 通常，在含油酵母细胞中积聚高水平的PUFA需要包括两个阶段的过程，由于代谢状态必须在生长和脂肪的合成/贮存之间达到“平衡”。因此，最优选地，两阶段发酵过程是在含油酵母（例如解脂耶氏酵母）中产生PUFA所必需的。这种方法，以及多种适合的发酵工艺设计（即分批式、补料分批式和连续式）和生长过程中的注意事项，描述于美国专利7,238,482中。

[0243] PUFA可游离脂肪酸或以酯化的形式（例如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂）存在于宿主微生物中，并且可通过本领域熟知的多种方式从宿主细胞提取。关于酵母脂质的提取技术、质量分析和可接受标准的一篇综述是Z.Jacobs（Critical  Reviews  in Biotechnology，12（5/6）:463-491（1992））的综述。关于下游处理的简要回顾也可参见A.Singh和O.Ward（Adv.Appl.Microbiol.，45:271-312（1997））。

[0244] 一般来讲，用于纯化PUFA的方法可包括用有机溶剂萃取（例如，美国专利6,797,303和美国专利5,648,564）、超声处理、超临界流体萃取（例如使用二氧化碳）、皂化和物理方法如挤压，或它们的组合。附加细节参见美国专利7,238,482。

[0245] 存在过多掺入了ω-3和/或ω-6脂肪酸（尤其是例如ALA、GLA、ARA、EPA、DPA和DHA）的食物和饲料产品。预期包含长链PUFA的微生物或植物生物量、部分纯化的包含PUFA的生物量、纯化的包含PUFA的微生物油和/或纯化的PUFA将在食物和饲料产品中起作用以赋予当前制剂健康有益效果。更具体地，包含ω-3和/或ω-6脂肪酸的油将适用于多种食品和饲料产品包括但不限于：食物类似物、肉制品、谷类制品、烘焙食品、小吃食品和乳制品（参见例如美国专利7,588,931）。

[0246] 本发明的组合物可用于医疗食物的配方中以使其具有健康有益效果，所述医疗食物包括医疗营养品、膳食补充剂、婴儿代乳品以及药物。食物加工和食物配制领域的技术人员将了解所述各种油的量和组成如何加入到食物或饲料产品中。该量在本文中将称为“有效”量并将取决于食物或饲料产品、旨在补充该产品的膳食或医疗食物或医疗营养品旨在纠正或治疗的医疗状况。

[0247] 本发明的组合物也可用于改善动物健康状态；它们可用于动物食品、饲料和药物。

[0248] 实施例

[0249] 在以下实施例中进一步描述了本发明，其示出了实施本发明的简要方法，但不完全限定其所有可能的变型。

[0250] 一般方法

[0251] 实施例中使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且被如下等人进行描述：1）Sambrook等人；2）Silhavy等人；和3）Ausubel等人。

[0252] 适用于微生物培养物的维持和生长的材料和方法是本领域熟知的。适用于如下实施例的技术可在如下文献列出的内容中找到：Manual of Methods for General Bacteriology（Phillipp Gerhardt,R.G.E.Murray,Ralph N.Costilow,Eugene W.Nester,Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips编辑），American Society for Microbiology：Washington,D.C.（1994））；或Thomas D.Brock的Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology，第2版，Sinauer Associates：Sunderland,MA（1989）。用于微生物细胞的生长和维持的所有试剂、限制性酶和材料均获自Aldrich Chemicals（Milwaukee，WI）、DIFCO Laboratories（Detroit，MI）、GIBCO/BRL
（Gaithersburg，MD）或Sigma Chemical Company（St.Louis，MO），除非另外指明，大肠杆菌菌株通常在37℃下于Luria Bertani[“LB”]平板上生长。

[0253] 普通的分子克隆按照标准方法（Sambrook等人，同上）进行。DNA序列是在ABI自动测序仪上使用染料终止剂技术（美国专利5,366,860；EP272,007）使用载体和插入片段特异性引物的组合来产生的。序列编辑在Sequencher（Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI）中进行。所有序列表现在两个方向上覆盖至少两次。基因序列的比较是使用DNASTAR软件（DNAStar Inc.，Madison，WI）来完成的。

[0254] 缩写的含义为如下：“sec”表示秒，“min”表示分钟，“h”或“hr”表示小时，“d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“μM”表示微摩尔每升，“mM”表示毫摩尔每升，“M”表示摩尔，“mmol”表示毫摩尔，“μmole”表示微摩尔，“g”表示克，“μg”表示微克，“ng”表示纳克，“U”表示单位，“bp”表示碱基对并且“kB”表示千碱基。

[0255] 表达盒的命名：

[0256] 表达盒的结构将通过简单的记号系统“X::Y::Z”表示，其中X描述了启动子片段，Y描述了基因片段，并且Z描述了终止子片段，它们均彼此可操作地连接。

[0257] 解脂耶氏酵母的转化和培养：

[0258] ATCC登录号为#20362、#76982和#90812的解脂耶氏酵母菌株购自美国典型培养物保藏中心（Rockville，MD）。解脂耶氏酵母菌株通常在根据下面所示的配方的多种培养基中于28-30℃下生长。根据标准方法，按要求通过将20g/L琼脂加入到每种液体培养基中来制备琼脂平板。

[0259] YPD琼脂培养基（每升）：10g酵母提取物[Difco]；20g细菌蛋白胨[Difco]；和20g葡萄糖。

[0260] 基础培养基（MM）（每升）：20g葡萄糖；1.7g不含氨基酸的酵母氮基础；1.0g脯氨酸；和pH6.1（不需要调节）。

[0261] 基础培养基+亮氨酸（MM+亮氨酸或MMLeu）（每升）：制备如上的MM培养基并加入0.1g亮氨酸。

[0262] 高葡萄糖培养基（HGM）（每升）：80g葡萄糖；2.58g KH2PO4；和5.36g K2HPO4；pH7.5（不需要调节）。

[0263] 解脂耶氏酵母的转化如美国专利申请公布2009-0093543-A1所述进行，该专利据此以引用方式并入本文。

[0264] 解脂耶氏酵母的脂肪酸分析：

[0265] 为了进行脂肪酸分析，将细胞通过离心收集，并且如Bligh,E.G.&Dyer，W.J.（Can.J.Biochem.Physiol.，37:911-917（1959））所述提取脂质。通过脂质提取物与甲醇钠的酯交换反应来制备FAME（Roughan，G.和Nishida I.，Arch Biochem Biophys.,276（1）:
38-46（1990））并随后将其用配有30m×0.25mm（内径）HPINNOWAX（HewlettPackard）柱的Hewlett-Packard6890气相色谱仪（GC）进行分析。烘箱温度以3.5℃/分钟从170℃（保持25分钟）升到185℃。

[0266] 为了进行直接的碱催化酯交换反应，收获解脂耶氏酵母培养物（3mL），在蒸馏水中洗涤一次，并在Speed-Vac中在真空下干燥5-10分钟。将（100μl，1%的）甲醇钠加入样品中，然后将样品涡旋摇晃20分钟。在加入3滴1M氯化钠和400μl己烷后，涡旋并旋转样品。移出上层并如上所述通过GC进行分析。

[0267] 作为另外一种选择，描述于Lipid Analysis，William W.Christie，2003中的碱催化的酯交换方法的改进用于来自发酵样品或烧瓶样品的培养基样品的常规分析。具体地，将培养基样品快速融化在室温水中，然后称重（至0.1mg）加入2mL微量离心管中，其具有0.22μm的 离心管过滤器（目录号8161）。根据此前确定的DCW
来使用样品（75-800μl）。使用Eppendorf5430离心机以14,000rpm离心样品5-7分钟或长达移出培养基所必需的时间。取出过滤器，排出液体，并将～500μl去离子水加入过滤器中以洗涤样品。在离心去除水后，再次取出过滤器，排出液体并重新插入过滤器。然后将管重新插入离心机中，这次打开顶部～3-5分钟以进行干燥。然后沿着管往上切除过滤器的大约1/
2并将其插入新的2mL圆底Eppendorf管中（目录号2236335-2）。用合适工具将过滤器压到管底部，所述工具仅接触切除过滤器容器边沿并且不接触样品或过滤材料。加入已知量的C15:0TAG（同上）甲苯溶液和500μl新鲜制备的1%甲醇钠甲醇溶液。用合适的工具稳固地分散样品粒并封闭所述管，置于50℃热封闭（VWR目录号12621-088）中30分钟。然后使管冷却至少5分钟。随后加入400μl己烷和500μl1M氯化钠水溶液，涡旋所述管2×6秒并离心1分钟。
将大约150μl的顶层（有机层）置于具有插入件的GC小瓶中并通过GC进行分析。

[0268] 解脂耶氏酵母菌株Y4036U的构建

[0269] 描述于国际专利申请公布WO 2008/073367中的解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y4036U（Leu-，Ura-）在下文实施例3-5、7-8和10中用作宿主。

[0270] 菌株Y4036U通过菌株Y2224（Ura3-，由Ura3基因自主突变而产生的FOA抗性突变体）、菌株Y4001（产生17%EDA，具有Leu-表型）、菌株Y4001U1（Leu-和Ura-）和菌株Y4036（产生18%DGLA，具有Leu-表型）的构建，来源于解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）ATCC#20362。

[0271] 相对于野生型解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）ATCC#20362的菌株Y4036U的最终基因型是Ura3-、YAT1::ME3S::Pex16、EXP1::EgD9eS::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、GPAT::EgD9e::Lip2、FBAINm::EgD8M::Pex20、EXP1::EgD8M::Pex16、GPD::FmD12::Pex20、YAT1::
FmD12::OCT（其中FmD12是串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）Δ-12去饱和酶基因[美国专利申请7,504,259]；ME3S是密码子优化的C16/18延伸酶基因，其来源于高山被孢霉
（Mortierella alpina）[美国专利申请7,470,532]；EgD9e是小眼虫Δ-9延伸酶基因[美国专利申请7,645,604]；EgD9eS是密码子优化的Δ-9延伸酶基因，其来源于小眼虫[美国专利申请7,645,604]；以及EgD8M是合成突变型Δ-8去饱和酶[美国专利申请7,709,239]，其来源于小眼虫[美国专利申请7,256,033]）。

[0272] 实施例1

[0273] 开发小眼虫Δ-5去饱和酶[“EgD5”]的拓扑模型

[0274] 为了更好地预测在小眼虫Δ-5去饱和酶[“EgD5”；美国专利申请7,678,560]内的HDASH基序的可能的重要性，基于下文的逻辑和分析开发了一种拓扑模型（图2）。

[0275] 首先，使用TMHMM程序分析EgD5的跨膜域（“Prediction of transmembrane helices in proteins”；TMHMM Server v.2.0，Center for Biological Sequence 
Analysis，BioCentrum-DTU，Technical University of Denmark，DK-2800Lyngby，
Denmark）。预测指示了六个跨膜螺旋区（氨基酸残基103-125、130-152、165-187、234-256、
280-302和306-328），其N末端和C末端两者位于膜的细胞质侧。

[0276] 使用以下EgD5同源物进行相似的TMHMM分析：GenBank登录号AAT09160[小新月菱形藻（Nitzchia  closterium  f.minutissima）]、GenBank登录号BAG71007[Oblongichytrium sp.SEK347]、和GenBank登录号AAL92562[三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）]。对于每种同源物，预测有四个跨膜片段，它们对应于预测的EgD5的前两个和后两个跨膜域。

[0277] 膜结合脂肪酸去饱和酶属于膜二铁蛋白质的超级族，所述蛋白质的特征在于三个富含组氨酸的（富含His）基序：HX（3-4）H（SEQ ID NO:1和2）、HX（2-3）HH（SEQ ID NO:3和4）和(H/Q)X（2-3）HH（SEQ ID NO:5和6）。已经预测这些富含His的残基位于膜的细胞质面并且已经显示对酶活性是重要的（Shanklin，J.等人，Biochemistry，33:12787-12794（1994）；Shanklin，J.，和Cahoon，E.B.，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，49:611-641（1998））。在EgD5内，第一富含His的区域（HDASH[SEQ ID NO:8]）位于第三个预测的跨膜片段之前，该片段跨越氨基酸残基165-187，而第二富含His的区域（HIMRHH[SEQ ID NO:4]）位于这个跨膜片段之后。如果第三个跨膜片段实际上跨膜，则第二富含His的区域将位于周质空间中---因此防止它参与到铁活性位点。因此，假定第三个跨膜片段（氨基酸残基165-
187）和第四个跨膜片段（氨基酸残基234-256）都不是跨膜的。这与对三个Δ-5去饱和酶同源物（即，GenBank登录号AAT09160，BAG71007和AAL92562）的TMHMM预测一致。

[0278] 因为Δ-5去饱和酶底物（即，DGLA、ETA）是高度疏水性的，假定它可能分隔在脂质双层中。相似地，假定由三个富含His的簇组合成的活性位点将可能出现在膜表面或非常接近膜表面。因此，第三个和第四个跨膜片段分别出现在残基165-187和234-256之间，TMHMM最初预测它们跨越膜而不是预测它们位于接近膜表面处以确保活性位点接近膜。在氨基酸残基103-125、130-152、280-302和306-328处的跨膜区域与TMHMM预测的一致。

[0279] 因此，对于EgD5预测的最终拓扑模型示于图2中。立式圆柱体表示跨膜域，而水平圆柱体表示两个不跨膜但位于接近内膜表面的高度疏水性区域。圆圈对应于预测在活性位点中涉及的His残基。还鉴定了HPGG（SEQ ID NO:7）基序和HDASH（SEQ ID NO:8）基序的位置。最后，“IN”对应于胞质空间，而“OUT”对应于周质空间。

[0280] 实施例2

[0281] 确定去饱和酶中的自然HDASH（SEQ ID NO:8）基序变型

[0282] 检查选择的去饱和酶蛋白质序列以确定自然变型是否出现在HDASH（SEQ ID NO:8）基序内。具体地，去饱和酶蛋白质包括小眼虫Δ-5去饱和酶[“EgD5”；美国专利申请7,
678,560]、高山被孢霉（Morteriella alpina）Δ-5去饱和酶[“MaD5”；美国专利申请5,972,
664]和与其它已知Δ-5去饱和酶和/或Δ-6去饱和酶的匹配的BLAST，已知它们与Δ-5去饱和酶密切相关。使用LASERGENE生物信息学计算套（DNASTAR Inc.，Madison，WI）的
MegAlignTM程序比对所选的序列，并且HDASH基序（或其变体）汇总于下表4中。

[0283] 表4：HDASH（SEQ ID NO:8）基序的天然变体

[0284]

[0285]

[0286] 基于上述分析，显现出HDASH（SEQ ID NO:8）基序的Asp[“D”]残基可能被Glu残基[“E”]取代，Ala[“A”]残基可能被Gly[“G”]、Ser[“S”]、Phe[“F”]、Tyr[“Y”]或Met[“M”]残基取代，和/或HDASH（SEQ ID NO:8）基序的Ser[“S”]残基可能被Cys[“C”]、Asn[“N”]、Gly[“G”]、Ala[“A”]或Thr[“T”]残基取代。

[0287] 实施例3

[0288] 野生型小眼虫Δ-5去饱和酶[“EgD5”]的序列

[0289] 美国专利申请7,678,560描述了小眼虫的Δ-5去饱和酶（即，EgD5，SEQ ID NO:21）的分离和克隆。最近，对本文克隆EgD5的较详细分析已经鉴定另一个变体“野生型”小眼虫Δ-5去饱和酶序列，其被命名为EgD5R并且本文表示为SEQ ID NO:25，此前未识别该序列。如美国专利申请7,678,560所述，EgD5R（SEQ ID NO:25）在位置347处包含一个Arg残基，而不是在EgD5的位置347处包含一个Ser氨基酸残基。假定这一差异是由PCR或cDNA生成方法引起的。

[0290] 具体地，使用5’-和3’-RACE技术获取EgD5（SEQ ID NO:20，对应于美国专利申请7,678,560的SEQ ID NO:1），该方法使用小眼虫的双链cDNA作为模板（美国专利申请7,678,
560的实施例4-5）。然后编码小眼虫Δ-5去饱和酶的ORF通过PCR使用小眼虫cDNA作为模板进行扩增、纯化、进行限制性消化，并且随后定向连接到合适载体中以产生pDMW367（美国专利申请7,678,560的实施例6）。在美国专利申请7,678,560中以SEQ ID NO:23提供pDMW367序列（对应于本文的SEQ ID NO:38）。虽然在美国专利申请7,678,560中报道了pDMW367包含一个嵌合的FBAIN::EgD5::Pex20基因，现在认识到在这个嵌合基因中的Δ-5去饱和酶序列实际上是EgD5R（SEQ ID NO:24）的核苷酸序列。

[0291] EgD5（SEQ ID NO:20）和EgD5R（SEQ ID NO:24）（图3A、3B、3C和3D）的比对显示四种核苷酸差异，其中相对于SEQ ID NO:20的突变是G819A、T948C、C1041A和G1349A。G1349A突变归因于用于扩增克隆进pDMW367中的EgD5的特定引物序列。EgD5（SEQ ID NO:21）和EgD5R（即，SEQ ID NO:25）的翻译产物的比对揭示了单氨基酸差异，即，S347R突变。

[0292] 美国专利申请7,678,560，实施例9也描述了来源于EgD5并经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达的合成Δ-5去饱和酶（即，EgD5S；SEQ ID NO:22和23）的产生。EgD5的密码子最优化导致1350bp编码区中的196bp被修饰（14.5%）并最优化了总计449个密码子中的189个密码子（42%）。由密码子优化的EgD5S基因（即，SEQ ID NO:23）编码的蛋白质序列与野生型蛋白质序列（即，SEQ ID NO:21）相同，其中在347位置处的氨基酸是Ser。

[0293] 实施例4

[0294] 产生包含去除了四个限制性内切酶位点的野生型EgD5R构建体pDMW367-M4[“EgD5R*”]

[0295] 本实施例描述了包含嵌合的FBAIN::EgD5R*::Pex20基因的质粒pDMW367-M4的构建。EgD5R*（SEQ ID NO:26）是构建以利于随后的克隆程序的野生型EgD5R（SEQ ID NO:24）的修饰变体，其中从野生型EgD5R编码区去除四个限制性酶位点（即，EcoRI、HindIII、BglII和NcoI得到修饰。EgD5R（SEQ ID NO:25）和EgD5R*（SEQ ID NO:27）的氨基酸序列相同。

[0296] 具体地，质粒pDMW367-M4（SEQ ID NO:39；图4C）来源于pDMW367（SEQ ID NO:38，实施例3；图4A）。随后从EgD5R编码区中去除原生EcoRI HindIII、BglII和NcoI限制性酶位点以产生pDMW367-M4。首先通过体外诱变，使用pDMW367（SEQ ID NO:38）作为模板并使用两对寡核苷酸作为引物去除EcoRI和BglII位点。引物对YL813（SEQ ID NO:40）和YL814（SEQ ID NO:41）使EcoI位点发生突变，而引物对YL815（SEQ ID NO:42）和YL816（SEQ ID NO:43）使BglII位点发生突变。这些反应产生构建体pDMW367-M2（图4B；SEQ ID NO:44）。序列分析确认了pDMW367-M2中的变体EgD5R的氨基酸序列与pDMW367中的EgD5R的氨基酸序列相同。

[0297] 然后通过体外诱变，使用pDMW367-M2作为模板并使用两对寡核苷酸作为引物去除HindIII和NcoI位点。引物对YL829（SEQ ID NO:45）和YL830（SEQ ID NO:46）使HindIII位点发生突变，而引物对YL831（SEQ ID NO:47）和YL832（SEQ ID NO:48）使NcoI位点发生突变。这导致pDMW367-M4产生。序列分析再次确认了pDMW367-M4中的变体EgD5（即，EgD5R*）的氨基酸序列与pDMW367中的EgD5R的氨基酸序列相同。

[0298] 除非另外指明，对于四个随后的实施例，提到野生型EgD5时将有效地包括参照EgD5R（SEQ ID NO:24和25）与EgD5R*（SEQ ID NO:26和27）。

[0299] 实施例5

[0300] 鉴定导致与EgD5R*的Δ-5去饱和酶活性相似的Δ-5去饱和酶活性的HDxSH（SEQ ID NO:36）突变

[0301] HDASH（SEQ ID NO:8）基序包括EgD5R*（SEQ ID NO:27）的氨基酸残基155至159。使用pDMW367-M4（实施例4）作为模板并使用19对寡核苷酸（SEQ ID NO:49-86；表5，下文）作为引物，以通过定点诱变（QuickChange Kit,Stratagene,CA）单独地使EgD5R*的HDASH（SEQ ID NO:8）基序的Ala残基突变，来进行单氨基酸突变，从而产生全部可能的氨基酸取代（即，HDxSH[SEQ ID NO:36突变体）。将来自每个突变的质粒转化到大肠杆菌XL2Blue细胞中。从19个转化体中的每一个中挑出三个菌落，并使其在液体培养基中于37℃下单独生长过夜。
从这些培养物中分离质粒（即，总计57种）并单独测序，以确认突变。

[0302] 野生型pDMW367-M4质粒和分离的突变质粒被单独地转化到解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y4036U1中，如一般方法所述。在MMLeu平板上选择转化体。在30℃下生长2天后，将来自每个转化反应的三个转化体划线接种到新MMLeu平板上并在30℃下再温育
2天。然后使用克隆接种在24孔Qiagen板中的3mL MMLeu内。在以200rpm振动的30℃培养箱中温育所述板。将上述培养物温育2天后，离心上述板，移除上清液并加入3mL HGM。上述板被放回30℃的培养箱中，以200rpm再振动5天。通过离心收集细胞，提取脂质，并通过酯交换制备脂肪酸甲酯[“FAME”]，随后用Hewlett-Packard6890GC进行分析。

[0303] 下表5中汇总了来源于每个突变型HDxSH（SEQ ID NO:36）基序的Δ-5去饱和酶活性（3个转化体的平均值）。根据发生在EgD5R*内的位置157处的Ala残基的氨基酸取代命名转化体，该转化体包含突变型pDMW367-M4构建体的转化体，其中所述突变型构建体包含EgD5R*突变体（即，转化体pDMW367M4-157c包含突变型Δ-5去饱和酶，其被命名为EgD5R*-157c，并且具有在位置157处的Cys对Ala的取代，从而产生HDcSH[SEQ ID NO:277]基序；转化体pDMW367M4-157g包含被命名为EgD5R*-157g的突变型Δ-5去饱和酶，其具有Gly对Ala的取代，从而产生HDgSH[SEQ ID NO:15]基序等等）。转化效率（“平均转化效率”）根据下式测量：（[产物]/[底物+产物]）*100，其中‘产物’包括直接产物和途径中来源于它的所有产物。结果与质粒pDMW367-M4内的野生型EgD5R*（SEQ ID NO:26）的结果进行比较，其中GC分析确定转化体产生了总脂质的10.8%DGLA和3.6%ARA（即，平均转化效率为24.8%）。

[0304] 表5：EgD5R和HDxSH（SEQ ID NO:36）基序突变体中的Δ-5去饱和酶活性

[0305]

[0306]

[0307] *每个EgD5R*基因（突变型或野生型）在pDMW367-M4内表达。

[0308] **相对于EgD5R*的百分比活性。

[0309] 基于上文，清楚地是在HDASH（SEQ ID NO:8）基序内的Ala残基可被Gly或Ser取代，而基本上不影响EgD5R*的Δ-5去饱和酶活性。具体地，在pDMW367M4-157g转化体中的EgD5R*-157g（SEQ ID NO:87）能够以23.8%的转化效率将DGLA转化成ARA，而在pDMW367M4-
157s转化体中的EgD5R*-157s（SEQ ID NO:88）能够以23.3%的转化效率将DGLA转化成ARA。

[0310] 实施例6

[0311] 鉴定导致与EgD5R*的Δ-5去饱和酶活性相似的Δ-5去饱和酶活性的HDAxH（SEQ ID NO:37）突变

[0312] 使用pDMW367-M4（实施例4）作为模板并使用19对寡核苷酸（SEQ ID NO:89-126；表6，下文）作为引物，以通过定点诱变（QuickChange Kit，Stratagene，CA）单独地使EgD5R*（SEQ ID NO:27）的HDASH（SEQ ID NO:8）基序的Ser残基突变，来进行单氨基酸突变，从而产生全部可能的氨基酸取代（即，HDAxH[SEQ ID NO:37]突变体）。诱变之后，质粒被转化到解脂耶氏酵母Y4036U1中，选择转化体并使其在MMLeu和HGM中生长，制备FAME并通过GC进行分析，如实施例5中所述。

[0313] 下表6中汇总了来源于每个突变型HDASH（SEQ ID NO:8）基序的Δ-5去饱和酶活性（3个转化体的平均值）。根据发生在EgD5R*内的位置158处的Ser残基的氨基酸取代命名转化体，该转化体包含突变型pDMW367-M4构建体，其中所述突变型构建体包含EgD5R*突变体（即，转化体pDMW367M4-158a包含突变型Δ-5去饱和酶，其被命名为EgD5R*-158a，并且具有在位置158处的Ala对Ser的取代，从而产生HDAaH[SEQ ID NO:17]基序；转化体pDMW367M4-158r包含突变型Δ-5去饱和酶，其被命名为EgD5R*-158r，并且具有Arg对Ser的取代，从而产生HDArH[SEQ ID NO:306]基序等等）。根据实施例5所述的式测量转化效率。结果与质粒pDMW367-M4内的野生型EgD5R*（SEQ ID NO:26）的结果进行比较，其中GC分析确定转化体产生了总脂质的11.3%DGLA和3.4%ARA（即，平均转化效率为23.3%）。

[0314] 表6：在EgD5R*和HDAxH（SEQ ID NO:37）基序突变体中的Δ-5去饱和酶活性

[0315]

[0316]

[0317] *每个EgD5R*基因（突变型或野生型）在pDMW367-M4内表达。

[0318] **相对于EgD5R*的百分比活性。

[0319] 结果展示出在HDASH（SEQ ID NO:8）基序内的Ser残基可被Ala或Gly取代，而基本上不影响EgD5R*的Δ-5去饱和酶活性。具体地，在pDMW367M4-158a转化体中的EgD5R*-158a（SEQ ID NO:127）能够以23.5%的转化效率将DGLA转化成ARA，而在pDMW367M4-158g转化体中的EgD5R*-158g（SEQ ID NO:128）能够以25.1%的转化效率将DGLA转化成ARA。

[0320] 实施例7

[0321] 鉴定导致与EgD5R*的Δ-5去饱和酶活性相似的Δ-5去饱和酶活性的HxGx（SEQ ID NO:34）和HDxxH（SEQ ID NO:311）突变

[0322] 美国专利公布2010-0075386-A1描述了突变型Δ-5去饱和酶，其在细胞色素b5-样域的HPGG（SEQ ID NO:7）基序内具有至少一个突变（即，HxGx[SEQ ID NO:34]突变）。HPGG（SEQ ID NO:7）基序包括EgD5R（SEQ ID NO:25）的氨基酸残基33至36。

[0323] 本实施例在EgD5R*-157g（实施例5，SEQ ID NO:87）、EgD5R*-158a（实施例6，SEQ ID NO:127）和EgD5R*-158g（实施例6，SEQ ID NO:128）的HPGG（SEQ ID NO:7）基序内引入突变以观察在HPGG（SEQ ID NO:7）和HDASH（SEQ ID NO:8）域内的双突变的效应。

[0324] 使用pDMW367M4-157g（实施例5，SEQ ID NO:129）、pDMW367M4-158a（实施例6，SEQ ID NO:130）和pDMW367-158g（实施例6，SEQ ID NO:131）作为模板并使用多对寡核苷酸（SEQ ID NO:132-137；表7）作为引物，以通过定点诱变（QuickChange Kit，Stratagene，CA）单独地使突变型Δ-5去饱和酶基因的HPGG（SEQ ID NO:7）基序的Pro残基或第二Gly残基突变，来进行单氨基酸突变，从而在HPGG（SEQ ID NO:7）和HDASH（SEQ ID NO:8）基序内产生双突变。诱变之后，质粒被转化到解脂耶氏酵母菌株Y4036U1中，选择转化体并使其在MMLeu和HGM中生长，制备FAME并通过GC进行分析，如实施例5中所述。

[0325] 在下表7中汇总了具有HxGx（SEQ ID NO:34）和HDxxH（SEQ ID NO:311）突变的突变型Δ-5去饱和酶的Δ-5去饱和酶活性。根据发生在EgD5R*的HPGG（SEQ ID NO:7）基序内的Pro残基或第二Gly残基的氨基酸取代、以及在EgD5R*的HDASH（SEQ ID NO:8）基序内的Ala残基或Ser残基的氨基酸取代命名转化体，该转化体包含突变型pDMW367M4构建体，其中所述突变型构建体包含EgD5R*突变体。即，例如转化体pDMW367-34g158g包含被命名为EgD5R*-34g158g的突变型Δ-5去饱和酶，其具有在位置34处的Gly对Pro的取代（从而产生HgGG[SEQ ID NO:9]基序）并具有在位置158处的Gly对Ser的取代（从而产生HDAgG[SEQ ID NO:18]基序）等等。根据实施例5所述的式测量转化效率。结果与质粒pDMW367-M4内的野生型EgD5R*的结果进行比较，其中GC分析确定由转化体产生了总脂质的11.7%DGLA和4.4%ARA（即，平均转化效率为27.5%）。

[0326]

[0327] 结果展示出虽然HPGG（SEQ ID NO:7）基序和HDASH（SEQ ID NO:8）基序对Δ-5去饱和酶活性来说是重要的，但可构建具有HxGx（SEQ ID NO:34）和HDxxH（SEQ ID NO:311）基序的去饱和酶，其在与野生型进行比较时保留至少64%的Δ-5去饱和酶活性。具体地，在HPGG（SEQ ID NO:7）基序内的Pro残基可被氨酸取代，同时发生以下任一种取代：1）在HDASH（SEQ ID NO:8）基序内将Ala残基取代成Gly；或者，2）在HDASH（SEQ ID NO:8）基序内将Ser残基取代成Ala或Gly。在HPGG（SEQ ID NO:7）基序内的Pro残基也可被His取代，同时在HDASH（SEQ ID NO:8）基序内将Ser残基取代成Ala或Gly。并且在HPGG（SEQ ID NO:7）基序内的第二Gly残基可被Ser取代，同时在HDASH（SEQ ID NO:8）基序内将Ser残基取代成Ala或Gly。

[0328] 优选的双突变体是EgD5R*-34g157g（SEQ ID NO:139；其能够在pDMW367-34g157g转化体中以22.9%的转化效率将DGLA转化成ARA）、EgD5R*-34g158a（SEQ ID NO:141；其能够在pDMW367-34g158a转化体中以24.3%的转化效率将DGLA转化成ARA）和EgD5R*-34g158g（SEQ ID NO:143；其能够在pDMW367-34g158g转化体中以26.8%的转化效率将DGLA转化成ARA）。

[0329] 实施例8

[0330] 合成N-末端密码子优化的突变型Δ-5去饱和酶基因（“EgD5M”）以在解脂耶氏酵母中表达，来源于EgD5R*-34g158g

[0331] EgD5R*-34g158g（SEQ ID NO:142，实施例7）的5’部分使用的密码子经优化以一定方式在解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）中表达，所述方式类似于美国专利申请7,125,672中所述的方式。具体地，EgD5R*-34g158g的前204bp部分经密码子优化以合成密码子优化的Δ-5去饱和酶基因，其被命名为“EgD5M”（SEQ ID NO:152和153）。基于EgD5R*-34g158g的Δ-5去饱和酶基因的编码序列，根据耶氏酵母密码子使用模式（美国专利申请7,125,672）、‘ATG’翻译起始密码子周围的共有序列以及RNA稳定性的一般规则（Guhaniyogi，G.和J.Brewer，Gene，265（1-2）:11-23（2001）），来设计EgD5M。除了修饰翻译起始位点外，还修饰了在编码区的N-末端内的204bp中的52bp（25.5%；图5），并且优化了在去饱和酶蛋白质的N-末端内的68个氨基酸的45个密码子（66.2%）。分别将NcoI位点和NotI位点整合进EgD5M的翻译起始密码子的周围和终止密码子之后。由经密码子优化的EgD5M基因编码的蛋白质序列（即SEQ ID NO:153）与野生型EgD5R*-34g158g蛋白质序列（即SEQ ID NO:143）相同。经设计的EgD5M（SEQ ID NO:152）由GenScript Corporation（Piscataway,NJ）来合成并将其克隆到pUC57（GenBank登录号Y14837）中从而产生pEgD5M（图6A；SEQ ID NO:154）。

[0332] 实施例9

[0333] 产生包含EgD5M的构建体pDMW367-5M

[0334] 本实施例描述了包含嵌合的FBAIN::EgD5M::Pex20基因的质粒pDMW367-5M的构建。质粒pDMW367-5M（图6B；SEQ ID NO:155）通过用pEgD5M的NcoI/NotI EgD5M片段（图6A；
SEQ ID NO:154）替换pDMW367-M4的NcoI/NotI EgD5R*片段（图4；SEQ ID NO:39）进行构建。
这种连接产物是pDMW367-5M，其从而包含以下组分：

[0335] 表8：质粒pDMW367-5M（SEQ ID NO:155）的组分

[0336]

[0337] 实施例10

[0338] 产生包含N-末端密码子优化的突变型Δ-5去饱和酶基因的变体“EgD5M1”的构建体pDMW367-5M1

[0339] 本实施例描述了包含嵌合的FBAIN::EgD5M1::Pex20基因的质粒pDMW367-5M1的构建。EgD5M1（SEQ ID NO:156）的核苷酸序列与EgD5M（SEQ ID NO:152）的核苷酸序列相同，不同的是在EgD5M中的位置347处的Arg的CGA密码子改变为编码EgD5M1中的Ser的AGC密码子。修饰经设计用于分析R347S突变（实施例3中所述的）对Δ-5去饱和酶活性的效应。

[0340] 经设计的EgD5M1基因（也被称为“EgD5R*-34g158g347S”；SEQ ID NO:156）由GenScript Corporation（Piscataway,NJ）合成并将其克隆到pUC57（GenBank登录号Y14837）中以产生pEgD5M1（SEQ ID NO:158）。

[0341] 质粒pDMW367-5M1（SEQ ID NO:159）通过用来自pEgD5M1（SEQ ID NO:158）的NcoI/NotI EgD5M1片段替换pDMW367-M4的NcoI/NotI EgD5R*片段（图4；SEQ ID NO:39）进行构建。这种连接产物是pDMW367-5M1，其包含嵌合的FBAIN::EgD5M1::Pex20基因。

[0342] 实施例11

[0343] 功能分析在解脂耶氏酵母菌株Y4036U1中的EgD5M和EgD5M1Δ-5去饱和酶

[0344] 将对照质粒pDMW367-M4（SEQ ID NO:39；实施例4）和质粒pDMW367-5M（SEQ ID NO:155；实施例9）和pDMW367-5M1（SEQ ID NO:159；实施例10）每个分开转化到解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y4036U1中。选择转化体并使其在MMLeu和HGM中生长，制备FAME并通过GC进行分析，如实施例5所述。

[0345] 下表9汇总了EgD5R*、EgD5M和EgD5M1的Δ-5去饱和酶活性（3个转化体的平均值）。转化效率（“Conv.Effic.”）根据实施例5所述的式进行测量。将结果与质粒pDMW367-M4内的野生型EgD5R*（SEQ ID NO:26）的结果进行比较，其中GC分析确定由转化体产生了总脂质的
10.8%DGLA和3.6%ARA（即，平均转化效率为24.8%）。

[0346] 表9：在EgD5R*、EgD5M和EgD5M1中的Δ-5去饱和酶活性

[0347]

[0348]

[0349] 结果展示出EgD5M（SEQ ID NO:153）和EgD5M1（SEQ ID NO:157）具有比野生型EgD5R*（SEQ ID NO:27）更高的Δ-5去饱和酶活性。EgD5M1在与EgD5M进行比较时改善的Δ-5去饱和酶活性展示出氨基酸残基347不影响蛋白质的Δ-5去饱和酶活性，其优选具有Ser而不是Arg。

[0350] 实施例12

[0351] 鉴定在来源于小眼虫并经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达的合成Δ-5去饱和酶基因（“EgD5S”）中的HPGs（SEQ ID NO:11）和HxxxH（SEQ ID NO:1）突变

[0352] 本实施例在突变型EgD5S-36s（或“EgD5S-HPGs”）基因的HDASH（SEQ ID NO:8）基序内引入突变以确定在HPGG（SEQ ID NO:7）和HDASH（SEQ ID NO:8）保守域内的双突变的效应。

[0353] EgD5S（SEQ ID NO:22和23）是来源于EgD5（实施例3）并经密码子优化以在解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）中表达的合成Δ-5去饱和酶（美国专利申请7,678,560）。虽然EgD5S的氨基酸序列与EgD5相同，核苷酸序列不同；具体地，除了修饰翻译起始位点，还修饰1350bp编码区的196bp（14.5%）并且最优化189个密码子（42%）。GC含量从野生型基因（即EgD5）内的55.5%减少到合成基因（即EgD5S）内的54.4%。并且分别将NcoI位点和NotI位点整合进EgD5S的翻译起始密码子的周围和终止密码子之后。

[0354] 美国专利申请公布2010-0075386-A1的实施例1至4描述了突变型EgD5S-36s（SEQ ID NO:160）的鉴定，其使用EgD5S作为定点诱变反应中的模板，定向修饰EgD5S的HPGG（SEQ ID NO:7）基序的第二Gly残基，该基序包括细胞色素b5-样域的氨基酸残基33至36（即，HPGx[SEQ ID NO:33]突变）。因此，突变型EgD5S-36s包含HPGs（SEQ ID NO:11）基序，其中HPGG（SEQ ID NO:7）基序的第二Gly残基被Ser取代，所述取代使用EgD5S（SEQ ID NO:23）作为模板。EgD5S-36s的Δ-5去饱和酶活性（美国专利申请公布2010-0075386-A1）为EgD5S的Δ-5去饱和酶活性的约106.9%。质粒pDMW369S（SEQ ID NO:161）包含突变型EgD5S-36s基因；载体组分类似于pDME367-5M的那些（本文图6B），不同的是突变型EgD5S-36s基因取代EgD5M基因。

[0355] 基于在实施例7中成功产生双EgD5R*突变（即，同时包含突变型HPGG[SEQ ID NO:7]和突变型HDASH[SEQ ID NO:8]基序），预期相似的HxxxH（SEQ ID NO:1）突变当被引入EgD5S-36s中时将是可接受的。具体地，使用pDMW369S（包含嵌合的FBAIN::EgD5S-36S::
Pex20基因）作为模板并使用9对寡核苷酸（SEQ ID NO:162-179；表10）作为引物，以通过定点诱变（QuickChange Kit，Stratagene，CA）单独地使EgD5S-36s（SEQ ID NO:160）的HDASH（SEQ ID NO:8）基序的Asp、Ala或Ser残基突变，来进行单氨基酸突变，从而产生9个选择的氨基酸取代。诱变之后，质粒被转入解脂耶氏酵母菌株Y4036U1中，选择转化体并使其在MMLeu和HGM中生长，制备FAME并通过GC进行分析，如实施例5中所述。

[0356] 下表10汇总了具有HPGs（SEQ ID NO:11）和HxxxH（SEQ ID NO:1）突变两者的突变型Δ-5去饱和酶的Δ-5去饱和酶活性（3个转化体的平均值）。根据发生在HDASH（SEQ ID NO:8）基序内的Asp、Ala或Ser残基的氨基酸取代命名转化体，该转化体包含突变型pDMW369S构建体，其中所述突变型构建体包含EgD5S-36s的突变体（即，转化体pDMW369S-
156e包含突变型Δ-5去饱和酶，其被命名为EgD5S-36s156e，并且在位置156处具有Glu对Asp的取代，从而产生HeASH[SEQ ID NO:19]基序；转化体pDMW369S-157g包含突变型Δ-5去饱和酶，其被命名为EgD5S-36s157g，并且具有Gly对Ala的取代，从而产生HDgSH[SEQ ID NO:15]基序等）。根据实施例5中所述的式测量转化效率。将结果与质粒pDMW369S内的EgD5S-36s（SEQ ID NO:160）的结果进行比较，其中GC分析确定由转化体产生了总脂质的
8.1%DGLA和6.8%ARA（即，平均转化效率为45.8%）。

[0357]

[0358] 结果展示出可修饰密码子优化的EgD5SΔ-5去饱和酶以包含突变型HPGG（SEQ ID NO:7）和突变型HDASH（SEQ ID NO:8）基序，而在与具有仅突变型HPGG基序（即，HPGs[SEQ ID NO:11]）的突变型EgD5S-36s进行比较时仍保适当的Δ-5去饱和酶活性。优选的双突变体是EgD5S-36s156e（SEQ ID NO:180和181；其能够在pDMW369S-156e转化体中以36.2%的转化效率将DGLA转化成ARA）、EgD5S-36s157g（SEQ ID NO:182和183；其能够在pDMW369S-157g转化体中以36.6%的转化效率将DGLA转化成ARA）、EgD5S-36s158a（SEQ ID NO:184和185；其能够在pDMW369S-158a转化体中以39.1%的转化效率将DGLA转化成ARA）、和EgD5S-36s158g（SEQ ID NO:186和187；其能够在pDMW369S-158g转化体中以34.3%的转化效率将DGLA转化成ARA）。

[0359] 实施例13

[0360] 鉴定在来源于Euglena anabaena并经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达的合成Δ-5去饱和酶基因（“EaD5S”）中的HaGG（SEQ ID NO:14）和HxxxH（SEQ ID NO:1）突变[0361] 本实施例在突变型EaD5S-35a（或“EaD5S-HaGG”）基因的HDASH（SEQ ID NO:8）基序内引入突变以确定在HPGG（SEQ ID NO:7）和HDASH（SEQ ID NO:8）保守域内的双突变的效应。

[0362] 美国专利申请7,943,365描述了来自E.anabaena的Δ-5去饱和酶（即，EaD5；SEQ ID NO:28）的分离和克隆。然后这一基因经密码子优化以在解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）中表达，从而产生合成Δ-5去饱和酶EaD5S（SEQ ID NO:30）。虽然EaD5S的氨基酸序列与EaD5相同，但核苷酸序列不同；具体地，除了修饰翻译起始位点，还修饰1362bp编码区的183bp（13.4%）并且最优化174个密码子（38.3%）。GC含量从野生型基因（即EaD5）内的57.6%减少到合成基因（即EaD5S）内的54.6%。并且分别将NcoI位点和NotI位点整合进EaD5S的翻译起始密码子的周围和终止密码子之后。

[0363] 美国专利申请公布2010-0075386-A1的实施例6描述了突变型EaD5S-35a（SEQ ID NO:188）的鉴定，其使用EaD5S作为定点诱变反应中的模板，定向修饰EaD5S的HPGG（SEQ ID NO:7）基序Pro残基，该基序包括细胞色素b5-样域的氨基酸残基34至37（即，HxGG[SEQ ID NO:32]突变）。因此，突变型EaD5S-35a（SEQ ID NO:188）包含一个HaGG（SEQ ID NO:14）基序，其中HPGG（SEQ ID NO:7）基序的Pro残基被Ala残基取代，所述取代使用EaD5S（SEQ ID NO:31）作为模板。EaD5S-35a的Δ-5去饱和酶活性（美国专利申请公布2010-0075386-A1）为EaD5S的Δ-5去饱和酶活性的约99.2%。质粒pZuFmEaD5S-A(S)（SEQ ID NO:189）包含突变型EaD5S-35a基因；所述载体组分与pDMW367-5M（本文图6B）的那些组分相同，不同的是突变型EaD5S-35a基因取代了EgD5M基因）。

[0364] 基于在实施例7中成功产生双EgD5R*突变体和在实施例12中成功产生双EgD5S突变体（即，同时包含突变型HPGG[SEQ ID NO:7]和突变型HDASH[SEQ ID NO:8]基序），预期相似的HxxxH（SEQ ID NO:1）突变当被引入EaD5S-35a中时将是可接受的。HDASH（SEQ ID NO:8）基序包括EaD5S和EaD5S-35a的氨基酸残基156至160。

[0365] 使用pZuFmEaD5S-A(S)（包含嵌合的FBAIN::EaD5S-35a::Pex20基因）作为模板并使用9对寡核苷酸（SEQ ID NO:190-211；表11）作为引物，以通过定点诱变（QuickChange Kit，Stratagene，CA）单独地使EaD5S-35a（SEQ ID NO:188）的HDASH（SEQ ID NO:8）基序内的Asp、Ala或Ser突变，来进行单氨基酸突变，从而产生9个选择的氨基酸取代。诱变之后，质粒被转入解脂耶氏酵母菌株Y4036U1，选择转化体并使其在MMLeu和HGM中生长，制备FAME并通过GC进行分析，如实施例5中所述。

[0366] 下表11汇总了包含HaGG（SEQ ID NO:14）和HxxxH（SEQ ID NO:1）突变的突变型Δ-5去饱和酶的Δ-5去饱和酶活性（3个转化体的平均值）。根据发生在HDASH（SEQ ID NO:8）基序内的Asp、Ala或Ser残基的氨基酸取代命名转化体，该转化体包含突变型pZuFmEaD5S-A(S)构建体，其中所述突变型构建体包含EaD5S-35a的突变体。即，例如转化体pZuFmEaD5S-A(S)-157e包含被命名为EaD5S-35a157e的突变型Δ-5去饱和酶，并且在位置157处具有Glu对Asp的取代，从而产生HeASH（SEQ ID NO:19）基序；转化体pZuFmEaD5S-A(S)-158g包含被命名为EaD5S-35a158g的突变型Δ-5去饱和酶，并且具有Gly对Ala的取代，从而产生HDgSH（SEQ ID  NO:15）基序等。根据实施例5所述的式测量转化效率。将该结果与质粒
pZuFmEaD5S-A(S)内的EaD5S-35a（SEQ ID NO:188）的结果进行比较，其中GC分析确定由转化体产生了总脂质的8.6%DGLA和5.1%ARA（即，平均转化效率为37.2%）。

[0367]

[0368] 结果展示出可修饰密码子优化的EaD5SΔ-5去饱和酶以包含突变型HPGG（SEQ ID NO:7）和突变型HDASH（SEQ ID NO:8）基序两者，而在与具有仅突变型HPGG基序（即，HaGG[SEQ ID NO:14]）的突变型EaD5S-35a进行比较时仍保留适当的Δ-5去饱和酶活性。优选的双突变体是EaD5S-35a158g（SEQ ID NO:212和213；其能够在pZuFmEaD5S-A(S)-158g转化体中以28.4%的转化效率将DGLA转化成ARA）、EaD5S-35a158s（SEQ ID NO:214和215；其能够在pZuFmEaD5S-A(S)-158s转化体中以27.4%的转化效率将DGLA转化成ARA）和EaD5S-35a159g（SEQ ID NO:216和217；其能够在pZuFmEaD5S-A(S)-159g转化体中以26.5%的转化效率将DGLA转化成ARA）。

[0369] 实施例14

[0370] 产生用于生产总脂肪酸的约58.7%EPA的解脂耶氏酵母菌株Z1978

[0371] 本实施例描述了来源于解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Z1978的构建，该菌株能够通过Δ-9延伸酶/Δ-8去饱和酶途径的表达产生相对于总脂肪酸约58.7%EPA[“EPA%TFA”]并具有38.3%的总脂质含量[“TFA%DCW”]。

[0372] 解脂耶氏酵母菌株Y9502的基因型

[0373] 菌株Y9502的产生描述于美国专利申请公布2010-0317072-A1中。来源于解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）ATCC#20362的菌株Y9502能够经由Δ-9延伸酶/Δ-8去饱和酶途径的表达产生相对于总脂质约57.0%的EPA（图7）。

[0374] 相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Y9502的最终基因型为Ura+、Pex3-、未知1-、未知2-、未知3-、未知4-、未知5-、未知6-、未知7-、未知8-、未知9-、未知10-、YAT1::ME3S::Pex16、GPD::ME3S::Pex20、YAT1::ME3S::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、GPAT::EgD9e::Lip2、YAT1::EgD9eS::Lip2、FBAINm::EgD8M::Pex20、EXP1::EgD8M::Pex16、FBAIN::EgD8M::Lip1、GPD::EaD8S::Pex16（2个拷贝）、YAT1::
E389D9eS/EgD8M::Lip1、YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco、FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2、GPD::
FmD12::Pex20、YAT1::FmD12::Oct、EXP1::FmD12S::Aco、GPDIN::FmD12::Pex16、EXP1::
EgD5M::Pex16、FBAIN::EgD5SM::Pex20、GPDIN::EgD5SM::Aco、GPM::EgD5SM::Oct、EXP1::
EgD5SM::Lip1、YAT1::EaD5SM::Oct、FBAINm::PaD17::Aco、EXP1::PaD17::Pex16、YAT1::
PaD17S::Lip1、YAT1::YlCPT1::Aco、YAT1::MCS::Lip1、FBA::MCS::Lip1、YAT1::
MaLPAAT1S::Pex16。缩写为如下：FmD12是串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）Δ-12去饱和酶基因[美国专利申请7,504,259]；FmD12S是密码子优化的Δ-12去饱和酶基因，其来源于串珠镰刀菌（F.moniliforme）[美国专利申请7,504,259]；ME3S是密码子优化的C16/18延伸酶基因，其来源于高山被孢霉（Mortierella alpina）[美国专利申请7,470,532]；EgD9e是小眼虫Δ-9延伸酶基因[美国专利申请7,645,604]；EgD9eS是密码子优化的Δ-9延伸酶基因，其来源于小眼虫[美国专利申请7,645,604]；EgD8M是合成突变型Δ-8去饱和酶基因[美国专利申请7,709,239]，其来源于小眼虫[美国专利申请7,256,033]；EaD8S是密码子优化的Δ-8去饱和酶基因，其来源于Euglena anabaena[美国专利申请7,790,156]；E389D9eS/EgD8M是通过连接来源于小型绿藻属（Eutreptiella sp.）CCMP389（美国专利申请7,645,
604）的密码子优化的Δ-9延伸酶基因（“E389D9eS”）与Δ-8去饱和酶“EgD8M”（同上）产生的DGLA合酶[美国专利申请公布2008-0254191-A1]；EgD9eS/EgD8M是通过连接Δ-9延伸酶“EgD9eS”（同上）与Δ-8去饱和酶“EgD8M”产生的DGLA合酶（同上）[美国专利申请公布2008-
0254191-A1]；EaD9eS/EgD8M是通过将来源于E.anabaenaΔ-延伸酶的密码子优化的Δ-9延伸酶基因（“EaD9eS”）[美国专利7,794,701]连接到Δ-8去饱和酶“EgD8M”（同上）[美国专利申请公布2008-0254191-A1]；EgD5M和EgD5SM是包含突变型HPGs（SEQ ID NO:11）基序的合成突变型Δ-5去饱和酶基因[美国专利申请公布2010-0075386-A1]，其来源于小眼虫[美国专利申请7,678,560]；EaD5SM是包含突变型HaGG（SEQ ID NO:14）基序的合成突变型Δ-5去饱和酶基因[美国专利申请公布2010-0075386-A1]，其来源于E.anabaena[美国专利申请7,
943,365]；PaD17是瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）Δ-17去饱和酶基因[美国专利申请7,556,949]；PaD17S是密码子优化的Δ-17去饱和酶基因，其来源于瓜果腐霉菌
（P.aphanidermatum）[美国专利申请7,556,949]；YlCPT1是解脂耶氏酵母二酰基甘油胆碱磷酸转移酶基因[美国专利申请7,932,077]；MCS是密码子优化的丙二酰-辅酶A合成酶基因，其来源于豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）bv.viciae3841[美国专利申请公布
2010-0159558-A1]，并且，MaLPAAT1S是密码子优化的溶血磷脂酸酰基转移酶基因，其来源于高山被孢霉（Mortierella alpina）[美国专利7,879,591]。

[0375] 为了详细分析菌株Y9502中的总脂质含量和组成，进行烧瓶测定，其中细胞在2个阶段中生长总计7天。基于分析，菌株Y9502产生3.8g/LDCW，37.1TFA%DCW，21.3EPA%DCW，并且脂质特征为如下，其中每种脂肪酸的浓度以TFA的重量%[“%TFA”]表示：16:0（棕榈酸）—2.5，16:1（棕榈油酸）--0.5，18:0（硬脂酸）--2.9，18:1（油酸）--5.0，18:2（LA）—12.7，ALA—0.9，EDA—3.5，DGLA—3.3，ARA--0.8，ETrA--0.7，ETA—2.4，EPA—57.0，其它—7.5。

[0376] 从菌株Y9502产生解脂耶氏酵母菌株Z1978

[0377] 从菌株Y9502开发菌株Z1978示于图7中并描述于美国临时专利申请61/377248（代理人档案号CL4783USPRV，提交于2010年8月26日）中，其据此以引用方式并入本文。

[0378] 具体地，为了破坏菌株Y9502中的Ura3基因，SalI/PacI-消化的构建体pZKUM（图8A；SEQ ID NO:218；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表15中，其据此以引用方式并入本文）用于根据一般方法将Ura3突变体基因整合进菌株Y9502的Ura3基因中。总计27个转化体（选自包含8个转化体的第一组、包含8个转化体的第二组、和包含11个转化体的第三组）在基本培养基+5-氟乳清酸[“MM+5-FOA”]选择平板上生长并在30℃下维持2至5天。其它实验确定仅第三组转化体具有真正的Ura-表型。

[0379] 从MM+5-FOA平板上刮下Ura-细胞，并根据一般方法使其经受脂肪酸分析。用这种方法，GC分析显示分别有TFA的28.5%、28.5%、27.4%、28.6%、29.2%、30.3%和29.6%EPA在第3组的pZKUM-转化体#1、#3、#6、#7、#8、#10和#11中。这七个菌株分别被命名为菌株Y9502U12、Y9502U14、Y9502U17、Y9502U18、Y9502U19、Y9502U21和Y9502U22（统称为Y9502U）。

[0380] 产生构建体pZKL3-9DP9N（图8B；SEQ ID NO:219）以将一个Δ-9去饱和酶基因、一个胆碱-磷酸胞苷酰转移酶基因、和一个Δ-9延伸酶突变基因EPA进菌株Y9502U的耶氏酵母YALI0F32131p基因座中（GenBank登录号XM_506121）。pZKL3-9DP9N质粒包含以下组分：

[0381] 表12：质粒pZKL3-9DP9N（SEQ ID NO:219）的描述

[0382]

[0383]

[0384] 将pZKL3-9DP9N质粒用AscI/SphI消化，并然后根据一般方法将其用于转化菌株Y9502U17。将转化细胞铺在MM平板上并在30℃下维持3至4天。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min振动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，并然后以250rpm/min振动5天。使细胞经受脂肪酸分析，同上。

[0385] GC分析显示，所选择的96个用pZKL3-9DP9N转化的Y9502U17菌株中大多数生产TFA的50-56%EPA。将生产了TFA的约59.0%、56.6%、58.9%、56.5%和57.6%EPA的五个菌株（即，#31、#32、#35、#70和#80）分别命名为菌株Z1977、Z1978、Z1979、Z1980和Z1981。

[0386] 这些pZKL3-9DP9N转化体菌株相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的最终基因型是Ura+、Pex3-、未知1-、未知2-、未知3-、未知4-、未知5-、未知6-、未知7-、未知8-、未知9-、未知10-、未知11-、YAT1::ME3S::Pex16、GPD::ME3S::Pex20、YAT1::ME3S::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、GPAT::EgD9e::Lip2、YAT1::EgD9eS::Lip2、YAT::EgD9eS-L35G::Pex20、FBAINm::EgD8M::Pex20、EXP1::EgD8M::Pex16、FBAIN::
EgD8M::Lip1、GPD::EaD8S::Pex16（2个拷贝）、YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1、YAT1::
EgD9eS/EgD8M::Aco、FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2、GPDIN::YlD9::Lip1、GPD::FmD12::
Pex20、YAT1::FmD12::Oct、EXP1::FmD12S::Aco、GPDIN::FmD12::Pex16、EXP1::EgD5M::
Pex16、FBAIN::EgD5SM::Pex20、GPDIN::EgD5SM::Aco、GPM::EgD5SM::Oct、EXP1::EgD5SM::
Lip1、YAT1::EaD5SM::Oct、FBAINm::PaD17::Aco、EXP1::PaD17::Pex16、YAT1::PaD17S::
Lip1、YAT1::YlCPT1::Aco、YAT1::MCS::Lip1、FBA::MCS::Lip1、YAT1::MaLPAAT1S::Pex16、EXP1::YlPCT::Pex16。

[0387] 在任何这些通过用pZKL3-9DP9N转化产生的EPA菌株中，YALI0F32131p基因座（GenBank登录号XM_50612）在菌株Z1977、Z1978、Z1979、Z1980和Z1981中的敲除未被确认。

[0388] 培养了来自YPD平板的菌株Z1977、Z1978、Z1979、Z1980和Z1981的细胞并按照一般方法部分就总脂质含量和组成对它们进行了分析（同上）。下表13汇总了如通过烧瓶测定所确定的总DCW、tTFA%DCW、每种脂肪酸以TFA[“%TFA”]的重量%表示的浓度和菌株Z1977、Z1978、Z1979、Z1980和Z1981的EPA%DCW。脂肪酸是16:0（棕榈酸）、16:1（棕榈油酸）、18:0（硬脂酸）、18:1（油酸）、18:2（亚油酸）、ALA（α-亚麻酸）、EDA（二十碳二烯酸）、DGLA（二高-γ-亚麻酸）、ARA（花生四烯酸）、ETrA（二十碳三烯酸）、ETA（二十碳四烯酸）、EPA（二十碳五烯酸）及其它的脂肪酸。

[0389]

[0390] 在提交美国临时专利申请61/377248（代理人档案号CL4783USPRV，提交于2010年8月26日）后，菌株Z1978经受部分基因组测序。这一工作确定工程化菌株实际上仅具有四个整合进耶氏酵母基因组中的Δ-5去饱和酶基因，而不是六个。

[0391] 更具体地，两个分离的质粒片段（或其部分）在菌株Z1978中未检测出，如下文进一步所述。

[0392] (1)构建体pZKL2-5mB89C（参见美国专利申请公布2010-0317072-A1，本文SEQ ID NO:131）旨在将一个Δ-5去饱和酶基因整合进菌株Y8069U的Lip2基因座中。然而，基因组测序未能检测到pZKL2-5mB89C片段的Lip2.3N末端和GPDIN::EgD5SM::Aco嵌合基因。DNA重排可能已经导致GPDIN::EgD5SM::Aco盒在产生Y8154菌株期间丢失（图7）。

[0393] (2)构建体pZKL1-2SR9G85（参见美国专利申请公布2010-0317072-A1，本文SEQ ID NO:132）旨在将一个Δ-5去饱和酶基因整合进菌株Y8154U1的Lip1基因座中。然而，基因组测序和PCR扩增都不能检测到菌株Z1978中的Δ-5去饱和酶基因。DNA重排可能已经导致GPM::EgD5SM::Oct盒在产生菌株Y8269期间丢失（图7）。

[0394] 此外，确定构建体pZSCP-Ma83（参见美国专利申请公布2010-0317072-A1，本文SEQ ID NO:133）和构建体pZP2-85m98F（参见美国专利申请公布2010-0317072-A1，本文SEQ ID NO:135）都被整合进YALI0B21890g基因座中。

[0395] 因此，菌株Z1978相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的真实基因型为如下：Ura+、Pex3-、未知1-、未知2-、未知3-、未知4-、YALI0E12947g-、未知6-、YALI0B21890g-、未知8-、未知10-、未知11-、YAT1::ME3S::Pex16、GPD::ME3S::Pex20、YAT1::ME3S::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、GPAT::EgD9e::Lip2、YAT1::EgD9eS::Lip2、YAT1::EgD9eS-L35G::Pex20、FBAINm::EgD8M::Pex20、EXP1::EgD8M::Pex16、FBAIN::
EgD8M::Lip1、GPD::EaD8S::Pex16（2个拷贝）、YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1、YAT1::
EgD9eS/EgD8M::Aco、FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2、GPDIN::YlD9::Lip1、GPD::FmD12::
Pex20、YAT1::FmD12::Oct、EXP1::FmD12S::Aco、GPDIN::FmD12::Pex16、EXP1::EgD5M::
Pex16、FBAIN::EgD5SM::Pex20、EXP1::EgD5SM::Lip1、YAT1::EaD5SM::Oct、FBAINm::
PaD17::Aco、EXP1::PaD17::Pex16、YAT1::PaD17S::Lip1、YAT1::YlCPT1::Aco、YAT1::
MCS::Lip1、FBA::MCS::Lip1、YAT1::MaLPAAT1S::Pex16、EXP1::YlPCT::Pex16。

[0396] 实施例15

[0397] 产生包含双Δ-5去饱和酶突变体并产生超过50EPA%TFA的解脂耶氏酵母菌株

[0398] 本实施例描述了来源于解脂耶氏酵母菌株Z1978（实施例14）的一系列菌株的构建，其能够经由表达Δ-9延伸酶/Δ-8去饱和酶途径产生超过50EPA%TFA，以及超过35TFA%DCW。EPA菌株包括以下突变型Δ-5去饱和酶，其包含在HPGG（SEQ ID NO:7）和HDASH（SEQ ID NO:8）基序中的双突变：EgD5S-36s157g（SEQ ID NO:183；实施例12）和EaD5S-35a158g（SEQ ID NO:213；实施例13），以及EgD5M（即，EgD5R*-34g158g；SEQ ID NO:153；实施例9和11）或EgD5M1（即，EgD5R*-34g158g347s；SEQ ID NO:157；实施例10和11）。

[0399] 所述菌株在如图9所示的两步方法中产生，其中首先去除在菌株Z1978中的初始Δ-5去饱和酶基因以产生菌株Y0S9017（Ura-）和YOS9019（Ura-），它们产生至少约56%ETA，但不再能够产生EPA。然后将双突变型Δ-5去饱和酶（同上）整合进菌株Y0S9017（Ura-）和YOS9019（Ura-）的染色体中，从而恢复转化体菌株产生EPA的能力。

[0400] 更具体地，最初将在菌株Z1978中的四个Δ-5去饱和酶基因从两个不同的构建体整合进染色体中，所述构建体为：pZKSL-5S5A5（SEQ ID NO:226；也参见美国专利申请公布2010-0317072-A1，本文图4A和表6），其包含嵌合的EXP1::EgD5M::Pex16、FBAIN::EgD5SM::
Pex20和YAT1::EaD5SM::OCT基因，而pZP2-85m98F（SEQ ID NO:227；也参见美国专利申请公布2010-0317072-A1，本文图7B和表13），其包含嵌合的EXP1::EgD5SM::Lip1基因。需要三个分离的同源重组事件以去除这四个嵌合基因。

[0401] 首先通过同源重组用质粒pYPS234（图10B；SEQ ID NO:229）内的993bp填充DNA片段（SEQ ID NO:228）替换菌株Z1978U基因组中的嵌合的FBAIN::EgD5SM::Pex20基因和大部分Leu基因（即，来自pZKSL-5S5A5的基因），其中993bp填充片段包含耶氏酵母肉毒碱/酰基肉毒碱载体基因的5’和3’部分。更具体地，pYSP234质粒包含以下组分。

[0402] 表14：质粒pYPS234（SEQ ID NO:229）的描述

[0403]

[0404] 第一交换事件发生在Lys5-5’DNA片段内，而第二交换事件发生在YAT1启动子区域内。菌株YOS9001由这种同源重组产生，其具有Leu-、Ura-表型和在其基因组中的三个Δ-5去饱和酶基因。

[0405] 然后，通过同源重组用质粒pYPS233（图11B；SEQ ID NO:231）内的1019bp填充DNA片段（SEQ ID NO:230）替换在菌株YOS9001基因组中的嵌合EXP1::EgD5M::Pex16和YAT1::EaD5SM::OCT基因（图11A），其中所述1019bp填充片段包含耶氏酵母ALK2基因的5’和3’部分。pYSP233质粒包含以下组分：

[0406] 表15：质粒pYPS233（SEQ ID NO:231）的描述

[0407]

[0408] 第一交换事件发生在Lys5-3’DNA片段内，而第二交换事件发生在3’Leu或YAT1启动子区域内。菌株YOS9006和YOS9009（对应于具有相同基因型的两个分离的菌落）通过这种同源重组产生，每个菌株在基因组内具有Leu-、Ura-表型和一个Δ-5去饱和酶基因。

[0409] 最后，在菌株YOS9006和YOS9009的基因组中的嵌合的EXP1::EgD5SM::Lip1基因通过同源重组被替换为（图12A）质粒pYSP241（图12B；SEQ ID NO:232）内的功能Leu2基因。pYSP241质粒包含以下组分：

[0410] 表16：质粒pYPS241（SEQ ID NO:232）的描述

[0411]

[0412]

[0413] 第一交换事件发生在染色体B的位置2870148和2871250之间的区域中，而第二交换事件发生在质粒pYSP241的EaD8S区域中，从而产生菌株YOS9017（Ura-）和YOS9019（Ura-）。菌株YOS9017和YOS9019（对应于具有相同基因型的两个分离的菌落）通过这种同源重组产生，每个菌株在基因组内具有Ura-表型并且无Δ-5去饱和酶基因。

[0414] 为了分析菌株YOS9001（Leu-，Ura-）、YOS9006（Leu-，Ura-）、YOS9009（Leu-，Ura-）、YOS9017（Ura-）、YOS9019（Ura-）和Z1978U（Ura-）对照菌株的脂肪酸组成和油含量，根据实施例14的方法进行一式三份的烧瓶测定（识别为样品“A”、“B”和“C”）。

[0415] 表17汇总了每种脂肪酸的浓度，以TFA的重量%[“%TFA”]表示。脂肪酸如表13所示，而20:4（5，11，14，17）是指杜松烯酸（juniperonic）。在每种样品中的所有脂肪酸总计为100。

[0416] 表18汇总了总干燥DCW、TFA%DCW和EPA%DCW。

[0417]

[0418] 表18：在耶氏酵母属菌株YOS9001、YOS9006、YOS9009、YOS9017、YOS9019和Z1978U中的总脂质含量

[0419]

[0420] 烧瓶实验的数据展示出在基因组内包含三个Δ-5去饱和酶基因的菌株YOS9001（Leu-、Ura-）产生约57EPA%TFA，而在基因组中仅包含一个Δ-5去饱和酶基因的菌株YOS9006（Leu-，Ura-）和YOS9009（Leu-，Ura-）产生约52.0EPA%TFA。与之相反，菌株YOS9017（Ura-）和YOS9019（Ura-）不能够产生任何EPA，但确实产生约56%ETA。在菌株YOS9017（Ura-）和YOS9019（Ura-）中缺乏Δ-5去饱和酶活性通过上述总脂肪酸分析进行确认；PCR分析也确认缺少任何编码Δ-5去饱和酶的DNA序列。

[0421] 产生构建体pZR5AU-555（图13A；SEQ ID NO:233）以将三个嵌合突变型Δ-5去饱和酶基因（即，FBAIN::EgD5S-36s157g::Pex20[实施例12]、YAT1::EaD5S-35a158g::Oct[实施例13]和EXP1::EgD5M（EgD5R*-34g158g）::Pex16[实施例9和11]整合进菌株YOS9017和YOS9019的染色体C的1685392和1687267之间的区域，从而能够产生EPA。

[0422] pZR5AU-555质粒包含以下组分：

[0423] 表19：质粒pZR5AU-555（SEQ ID NO:233）的描述

[0424]

[0425]

[0426] 构建体pZR5AU-555M（图13B；SEQ ID NO:234）与pZR5AU-555相同，不同的是嵌合的EXP1::EgD5M1（EgD5R*-34g158g347s）::Pex16基因[实施例10和11]用于替换pZR5AU-555的嵌合的EXP1::EgD5M（EgD5R*-34g158g）::Pex16基因。

[0427] 分别用AscI消化pZR5AU-555和pZR5AU-555M质粒并随后根据一般方法用于单个转化菌株YOS9017和YOS9019。将转化细胞铺在MM平板上并在30℃下维持4至5天。然后将单菌落再次划线至MM平板上，并随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min振动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，并然后以250rpm/min振动5天。根据一般方法，使细胞经受脂肪酸分析。

[0428] 进入菌株YOS9017的96个pZR5AU-555转化体的GC分析鉴定了二十个菌株（即，#9、#17、#22、#27、#31、#32、#42、#44、#46、#52、#53、#63、#68、#72、#74、#75、#77、#79、#80、#84和#
89），它们生产超过TFA的48%EPA；这些菌株分别被命名为Z8001至Z8020。

[0429] 进入菌株YOS9017的82个pZR5AU-555M转化体的GC分析鉴定了十个菌株（即，#1、#27、#29、#33、#39、#41、#44、#49、#69和#82），它们生产超过TFA的48%EPA；这些菌株分别被命名为Z8021至Z8030。

[0430] 进入菌株YOS9019的84个pZR5AU-555转化体的GC分析鉴定了十二个菌株（即，#28、#31、#39、#41、#42、#45、#63、#71、#73、#75、#78和#84），它们生产超过TFA的48%EPA；这些菌株分别被命名为Z8031至Z8042。

[0431] 并且，进入菌株YOS9019的76个pZR5AU-555M转化体的GC分析鉴定了十二个菌株（即，#2、#24、#28、#30、#38、#46、#50、#66、#67、#69、#72和#73），它们生产超过TFA的48%EPA；这些菌株分别被命名Z8043至Z8054。

[0432] 为了分析这些新EPA菌株的脂肪酸组成和油含量，对13个代表性菌株（即，Z8001、Z8005、Z8007、Z8011、Z8014、Z8018、Z8020、Z8022、Z8024、Z8026、Z8035、Z8048和Z8049）进行一式两份的烧瓶测定。表20汇总了总DCW、TFA%DCW、每种脂肪酸以TFA[“%TFA”]和EPA（%DCW）的重量%表示的浓度。脂肪酸为如表13和表17中的。

[0433] 所有13个菌株能够产生大于53EPA%TFs，以及大于37TFA%DCW。菌株Z8024和Z8035分别产生58.5EPA%TFA和57.9EPA%TFA，以及40.8TFA%DCW和37.8TFA%DCW。

[0434]

[0435] 实施例16

[0436] 在用于克隆到植物表达载体中的突变型小眼虫Δ-5去饱和酶[“EgD5R”]中产生HgGG（SEQ ID NO:9）和HDAxH（SEQ ID NO:37）突变

[0437] 实施例7的表7汇总了来自各种EgD5R*变体的Δ-5去饱和酶活性，所述变体包含改变HPGG（SEQ ID NO:7）和HDASH（SEQ ID NO:8）基序两者的突变。表7中，具有修饰的HgGG（SEQ ID NO:9）和HDAgH（SEQ ID NO:18）基序（如EgD5R*-34g158g中；SEQ ID NO:143）或修饰的HgGG（SEQ ID NO:9）和HDAaH（SEQ ID NO:17）基序（如EgD5R*-34g158a中；SEQ ID NO:141）的EgD5R*蛋白质具有EgD5R*蛋白质（它与EgD5R蛋白质相同）至少88%的活性。

[0438] 本实施例描述了使用基于PCR的诱变，用包含期望核苷酸变化的寡核苷酸用于将相似突变引入EgD5R（SEQ ID NO:24）的DNA序列中的方法，所述DNA序列侧接NotI位点，以易于克隆到现有的植物表达载体中（下文，实施例18）。更具体地，通过两轮PCR扩增将双突变引入Δ-5去饱和酶基因中，每轮PCR使用PhusionTM高保真DNA Polymerase（目录号F553S，Finnzymes Oy，Finland），按照制造商规程进行。除非另外指明，通过琼脂糖凝胶电泳来分TM离产物并且使用Zymoclean 凝胶DNA恢复试剂盒（Zymo Research，Orange，CA）按照制造商规程来纯化产物。

[0439] 将HgGG（SEQ ID NO:9）突变引入侧接NotI位点的EgD5R中

[0440] 通过两轮PCR扩增，使用质粒pKR1032作为DNA模板将HgGG（SEQ ID NO:9）突变引入EgD5R基因（SEQ ID NO:24）中。质粒pKR1032此前描述于美国专利7,678,560中并包含侧接NotI位点的EgD5R基因（SEQ ID NO:24）。用经设计用于引入HgGG（SEQ ID NO:9）突变的DNA改变编码的寡核苷酸引物EgD5-5（SEQ ID NO:245）和引物EgD5M1-3（SEQ ID NO:246）从pKR1032来扩增EgD5R（SEQ ID NO:24）的5’末端。相似地用经设计用于引入HgGG（SEQ ID NO:9）突变的DNA改变编码并与EgD5M1-3（SEQ ID NO:246）完全互补的寡核苷酸引物EgD5M1-5（SEQ ID NO:247）和引物EgD5-3（SEQ ID NO:248）从载体pKR1032来扩增EgD5R（SEQ ID NO:24）的3’末端。分离并纯化所得DNA片段。

[0441] 然后混合两种纯化的DNA片段并在第二轮PCR中用寡核苷酸引物EgD5-5（SEQ ID NO:245）和EgD5-3（SEQ ID NO:248）来扩增具有HgGG（SEQ ID NO:9）突变的DNA改变编码的全长基因。纯化所得DNA片段。

[0442] 包含HgGG（SEQ ID NO:9）基序的全长Δ-5去饱和酶DNA序列如SEQ ID NO:249所示，而编码蛋白质如SEQ ID NO:250所示。

[0443] 在侧接NotI位点的EgD5R中混合HgGG（SEQ ID NO:9）突变与HDAgH（SEQ ID NO:18）突变

[0444] 使用上述方法并使用包含HgGG（SEQ ID NO:9）突变的纯化DNA片段作为模板，通过两轮附加的PCR扩增将HDAgH（SEQ ID NO:18）突变引入编码SEQ ID NO:250的Δ-5去饱和酶的DNA序列中。具体地，用经设计用于引入HDAgH（SEQ ID NO:18）突变的DNA改变编码的寡核苷酸引物EgD5-5（SEQ ID NO:245）和引物EgD5M2-3（SEQ ID NO:251）来扩增SEQ ID NO:249的5’末端；用经设计用于引入HDAgH（SEQ ID NO:18）突变的DNA改变编码并与EgD5M2-3（SEQ ID NO:251）完全互补的寡核苷酸引物EgD5M2-5（SEQ ID NO:252）和引物EgD5-3（SEQ ID NO:248）来扩增SEQ ID NO:249的3’末端。如上所述分离并纯化所得DNA片段。

[0445] 然后混合两种纯化的DNA片段并在第二轮PCR中使用寡核苷酸引物EgD5-5（SEQ ID NO:245）和EgD5-3（SEQ ID NO:248）来扩增具有HgGG（SEQ ID NO:9）和HDAgH（SEQ ID NO:18）突变的DNA改变编码的全长基因。使用Zero PCR Cloning Kit（Invitrogen 
Corporation），按照制造商规程将所得PCR产物克隆到pCR-Blunt克隆载体中，以生产pLF336（SEQ ID NO:253）。

[0446] 在pLF336中包含HgGG（SEQ ID NO:9）基序和HDAgH（SEQ ID NO:18）基序的所得Δ-5去饱和酶DNA序列如SEQ ID NO:254所示，而编码蛋白质如SEQ ID NO:255所示。

[0447] 在侧接NotI位点的EgD5R中混合HgGG（SEQ ID NO:9）突变与HDAaH（SEQ ID NO:17）突变

[0448] 使用上述方法并使用包含HgGG（SEQ ID NO:9）突变的纯化DNA片段作为模板，通过两轮附加的PCR扩增将HDAaH（SEQ ID NO:17）突变引入编码SEQ ID NO:250的Δ-5去饱和酶的DNA序列中。具体地，用经设计用于引入HDAaH（SEQ ID NO:17）突变的DNA改变编码的寡核苷酸引物EgD5-5（SEQ ID NO:245）和引物EgD5M3-3（SEQ ID NO:256）来扩增SEQ ID NO:249的5’末端；用经设计用于引入HDAaH（SEQ ID NO:17）突变的DNA改变编码并与EgD5M3-3（SEQ ID NO:256）完全互补的寡核苷酸引物EgD5M3-5（SEQ ID NO:257）和引物EgD5-3（SEQ ID NO:248）来相似地扩增SEQ ID NO:249的3’末端。如上所述分离并纯化所得DNA片段。

[0449] 然后混合两种纯化的DNA片段并在第二轮PCR中使用寡核苷酸引物EgD5-5（SEQ ID NO:245）和EgD5-3（SEQ ID NO:248）来扩增具有HgGG（SEQ ID NO:9）和HDAaH（SEQ ID NO:17）突变的DNA改变编码的全长基因。使用Zero PCR Cloning Kit（Invitrogen 
Corporation），按照制造商规程将所得PCR产物克隆到pCR-Blunt克隆载体中，以生产pLF337（SEQ ID NO:258）。

[0450] 在pLF337中包含HgGG（SEQ ID NO:9）基序和HDAaH（SEQ ID NO:17）基序的所得Δ-5去饱和酶DNA序列如SEQ ID NO:259所示，而编码蛋白质如SEQ ID NO:260所示。

[0451] 实施例17

[0452] 在用于克隆到植物表达载体中的Euglena anabaenaΔ-5去饱和酶[“EaD5”]中产生HgGG（SEQ ID NO:9）和HDAxH（SEQ ID NO:37）突变

[0453] 本实施例描述了如实施例16所述以类似的方法，通过PCR扩增将HgGG（SEQ ID NO:9）突变和HDAgH（SQE ID NO:18）或HDAaH（SEQ ID NO:17）突变引入EaD5（SEQ ID NO:28）的DNA序列中。所得基因侧接NotI位点以允许克隆到一组现有的植物表达载体中（实施例18，下文）；具体地，通过两轮PCR扩增将双突变体引入Δ-5去饱和酶基因中，每轮PCR使用PhusionTM高保真DNA聚合酶（目录号F553S，Finnzymes Oy，Finland），按照制造商规程进行。
除非另外指明，通过琼脂糖凝胶电泳来分离产物并且使用ZymocleanTM凝胶DNA恢复试剂盒（Zymo Research，Orange，CA）按照制造商规程来纯化产物。

[0454] 将HgGG（SEQ ID NO:9）突变引入侧接NotI位点的EaD5中

[0455] 通过两轮PCR扩增，使用质粒pKR1136作为DNA模板将HgGG（SEQ ID NO:9）突变引入EaD5基因（SEQ ID NO:28）中。质粒pKR1136此前描述于美国专利申请公布2008-0254191-A1中并且包含侧接NotI位点的EaD5基因（SEQ ID NO:28）。用经设计用于引入HgGG（SEQ ID NO:9）突变的DNA改变编码的寡核苷酸引物EaD5-5（SEQ ID NO:261）和引物EaD5M1-3（SEQ ID NO:262）从pKR1136扩增EaD5（SEQ ID NO:28）的5’末端。用经设计用于引入HgGG（SEQ ID NO:9）突变的DNA改变编码并与EaD5M1-3（SEQ ID NO:262）完全互补的寡核苷酸引物EaD5M1-5（SEQ ID NO:263）和EaD5-3（SEQ ID NO:264）从载体pKR1136相似地扩增EaD5（SEQ ID NO:28）的3’末端。分离并纯化所得DNA片段。

[0456] 然后混合两种纯化的DNA片段并在第二轮PCR中用寡核苷酸引物EaD5-5（SEQ ID NO:261）和EaD5-3（SEQ ID NO:264）来扩增具有HgGG（SEQ ID NO:9）突变的DNA改变编码的全长基因。纯化所得DNA片段。

[0457] 包含HgGG基序（SEQ ID NO:9）的所得Δ-5去饱和酶DNA序列如SEQ ID NO:265所示，而编码蛋白质如SEQ ID NO:266所示。

[0458] 在侧接NotI位点的EaD5中混合HgGG（SEQ ID NO:9）突变与HDAgH（SEQ ID NO:18）突变。

[0459] 使用上述方法并使用包含HgGG（SEQ ID NO:9）突变的纯化DNA片段作为模板，通过两轮附加的PCR扩增将HDAgH（SEQ ID NO:18）突变引入编码SEQ ID NO:265的Δ-5去饱和酶的DNA序列中。用经设计用于引入HDAgH（SEQ ID NO:18）突变的DNA改变编码的寡核苷酸引物EaD5-5（SEQ ID NO:261）和引物EaD5M2-3（SEQ ID NO:267）来扩增SEQ ID NO:265的5’末端；用经设计用于引入HDAgH（SEQ ID NO:18）突变的DNA改变编码并与EaD5M2-3（SEQ ID NO:267）完全互补的寡核苷酸引物EaD5M2-5（SEQ ID NO:268）和引物EaD5-3（SEQ ID NO:264）相似地扩增SEQ ID NO:265的3’末端。如上所述分离并纯化所得DNA片段。

[0460] 然后混合两种纯化的DNA片段并在第二轮PCR中使用寡核苷酸引物EaD5-5（SEQ ID NO:261）和EaD5-3（SEQ ID NO:264）来扩增具有HgGG（SEQ ID NO:9）和HDAgH（SEQ ID NO:18）突变的DNA改变编码的全长基因。使用Zero PCR克隆试剂盒（Invitrogen 
Corporation），按照制造商规程将所得PCR产物克隆到pCR-Blunt克隆载体中，以产生pLF338（SEQ ID NO:269）。

[0461] 在pLF338中包含HgGG（SEQ ID NO:9）基序和HDAgH（SEQ ID NO:18）基序的所得Δ-5去饱和酶DNA序列如SEQ ID NO:270所示，而编码蛋白质如SEQ ID NO:271所示。

[0462] 在侧接NotI位点的EaD5中混合HgGG（SEQ ID NO:9）突变与HDAaH（SEQ ID NO:17）突变

[0463] 通过两轮附加的PCR扩增并且使用包含HgGG（SEQ ID NO:9）突变的纯化DNA片段作为模板将HDAaH突变引入编码SEQ ID NO:270的Δ-5去饱和酶的DNA序列中。用经设计用于引入HDAaH（SEQ ID NO:17）突变的DNA改变编码的寡核苷酸引物EaD5-5（SEQ ID NO:261）和引物EaD5M3-3（SEQ ID NO:272）来扩增SEQ ID NO:270的5’末端；用经设计用于引入HDAaH（SEQ ID NO:17）突变的DNA改变编码并与EaD5M3-3（SEQ ID NO:272）完全互补的寡核苷酸引物EaD5M3-5（SEQ ID NO:273）和引物EaD5-3（SEQ ID NO:264）来相似地扩增SEQ ID NO:270的3’末端。如上所述分离并纯化所得DNA片段。

[0464] 然后混合两种纯化的DNA片段并在第二轮PCR中使用寡核苷酸引物EaD5-5（SEQ ID NO:261）和EaD5-3（SEQ ID NO:264）来扩增具有HgGG（SEQ ID NO:9）和HDAaH（SEQ ID NO:17）突变的DNA改变编码的全长基因。使用Zero PCR Cloning Kit（Invitrogen 
Corporation），按照制造商规程将所得PCR产物克隆到pCR-Blunt克隆载体中，以产生pLF339（SEQ ID NO:274）。

[0465] 在pLF339中包含HgGG（SEQ ID NO:9）基序和HDAaH（SEQ ID NO:17基序的所得Δ-5去饱和酶DNA序列如SEQ ID NO:275所示，而编码蛋白质如SEQ ID NO:276所示。

[0466] 实施例18

[0467] 构建用于在大豆中共表达EgD5R或EaD5双Δ-5去饱和酶突变体与Δ-9延伸酶和Δ-8去饱和酶的大豆表达载体

[0468] 本实施例描述了用于在大豆中共表达EgD5R或EaD5双Δ-5去饱和酶突变体与合适的Δ-9延伸酶和Δ-8去饱和酶的大豆载体的构建，前者包含分别如实施例16和17所述的HgGG（SEQ ID NO:9）和HDAgH（SEQ ID NO:18）基序或HgGG（SEQ ID NO:9）和HDAaH（SEQ ID NO:17）基序。

[0469] 来自pLF336和pLF337的EgD5R突变体（如实施例16所述），和来自pLF338和pLF339的EaD5突变体（如实施例17所述）可通过NotI消化从它们各自的载体中释放出来。这将随后使得Δ-5去饱和酶易于被克隆到任何数量的现有大豆表达载体中，所述载体在种子特异性的强启动子之后。

[0470] 例如，可将包含每种突变的Δ-5去饱和酶的NotI片段克隆到pKR974的NotI片段中，其此前描述于PCT公开WO2007/136877中（其内容据此以引用方式并入）。用这种方法，突变型Δ-5去饱和酶可在大豆球蛋白（Gy1）启动子后表达以进行种子特异性的强表达。

[0471] 然后用SbfI消化这些载体并且将包含突变的Δ-5去饱和酶的片段克隆到pKR913的SbfI位点中，其此前描述于PCT公开WO2008/137516中，其内容据此以引用方式并入。用这种方法，突变的Δ-5去饱和酶可与小眼虫Δ-8去饱和酶[“EgD8”]和小眼虫Δ-9延伸酶[“EgD9e”]在种子特异性启动子之后共表达。

[0472] 纯化由此产生的任何载体并与经设计用于增加ω-3PUFA例如但不限于pKR328（如PCT公开WO 04/071467中所述）的载体一起共转化所述载体或所述载体的AscI片段，其包含异丝水霉（Saprolegnia diclina）Δ-17去饱和酶[“SdD17”]，所述共转化在膜联蛋白启动子的控制下进行并具有用于在植物中选择的潮霉素抗性基因，转化到大豆胚芽培养物中，如PCT公开WO 2008/137516中所述。在转化后，选择转基因大豆胚芽，待其成熟后分析脂肪酸特征并再生植物。

[0473] 用这种方法，可获取表达突变的Δ-5去饱和酶的胚芽或种子，其包含长链PUFA如EPA和/或ARA。

[0474] 作为另外一种选择，共表达突变的Δ-5去饱和酶与EgD9和EgD8基因的载体或来源于它们的片段可与美国专利申请7,659,120中所述的其它包含合适选择性标记如pKR325的载体一起共转化。使胚芽成熟并对其进行分析，并且可在所得植物的种子中获取以完全相同的方式再生并因此改变脂肪酸特征如增加的ARA和减少的EPA的植物。

[0475] 表达突变的Δ-5去饱和酶与EgD9和EgD8基因的质粒也可与包含基因或DNA片段或人工miRNA的载体一起共转化，所述人工miRNA经设计用于沉默内源性大豆fad3基因，例如但不限于pKR1189或pKR1249或此前描述于美国专利申请公布2008-0194685A1中的其它构建体。用这种方法，可获得更高浓度ARA和更低浓度EPA的大豆种子。

[0476] 除了本文所述的基因、启动子、终止子和基因盒之外，本领域的技术人员还可认识到其它启动子/基因/终止子盒组合可以相似方式合成，但不限于本文所述用于表达Δ-5去饱和酶突变体的方式。相似地，可能期望表达其它PUFA基因（例如下表23中描述的那些），以用于与本发明的Δ-5去饱和酶共表达。

[0477] 例如，PCT公开WO 2004/071467和WO 2004/071178描述了分离多个用于大豆中胚芽特异表达的启动子和转录终止子序列。此外，PCT公开WO 2004/071467、WO 2005/047479和WO 2006/012325描述了通过将单个启动子、基因和转录终止子以独特组合形式连接到一起来合成多种启动子/基因/终止子盒组合。一般来讲，使用侧面连接有合适启动子（例如但不限于表21中列出的那些）和转录终止子（例如但不限于表22中列出的那些）的NotI位点来克隆所需基因。可使用PCR扩增，用经设计用于在基因5’和3’末端处引入NotI位点的寡核苷酸将NotI位点加到受关注的基因上，例如但不限于表23中列出的那些基因。然后用NotI消化所得PCR产物，并将其克隆到合适的启动子/NotI/终止子盒中。

[0478] 此外，PCT公开WO 2004/071467、WO 2005/047479和WO2006/012325描述了为获得所需的表型表达，进一步将单个基因盒与合适的选择性标记盒以独特组合形式连接到一起。虽然这主要使用不同的限制性酶位点来完成，但本领域的技术人员可认识到可利用多种技术来获得所需的启动子/基因/转录终止子组合。这样做可获得胚芽特异性启动子/基因/转录终止子盒的任何组合。本领域的技术人员还可认识到这些盒可位于单个DNA片段上或位于多个片段上，该处基因的共表达是多个DNA片段共转化的结果。

[0479] 此外，美国专利申请公布2008-0254191-A1描述了许多载体的产生，所述载体共表达单个Δ-9延伸酶与Δ-8去饱和酶，以及融合这些基因以产生复合酶。本文所述的任何突变型Δ-5去饱和酶可与美国专利申请公布2008-0254191-A1中所述的载体一起通过克隆到表达载体中或通过共转化合适的表达载体如质粒或片段进行共表达，从而获得产生PUFA例如但不限于ARA、EPA、DPA和DHA的大豆种子。

[0480] 表21：种子特异性启动子

[0481]

[0482] 表22：转录终止子

[0483]转录终止子 生物 参考文献
菜豆蛋白3’ 菜豆 WO2004/071467

[0484]kunitz型胰蛋白酶抑制剂3’ 大豆 WO2004/071467
BD30（也称为P34）3’ 大豆 WO2004/071467
豆球蛋白A23’ 豌豆 WO2004/071467
白蛋白2S3’ 大豆 WO2004/071467

[0485] 表23：PUFA生物合成途径基因

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