用于固定和干燥酶的方法 |
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申请号 | CN201480068662.0 | 申请日 | 2014-12-08 | 公开(公告)号 | CN105849130A | 公开(公告)日 | 2016-08-10 |
申请人 | 巴斯夫欧洲公司; | 发明人 | S·莫勒; R·拜尔; M·布德; M·柯博尔; F·法里法尔-梅马尔; J·道韦尔; T·贝格; S·罗利; | ||||
摘要 | 在支持物上固定 蛋白质 的方法,其中蛋白质与支持物在不连续 接触 式 真空 混合物干燥器中的 水 相内孵育并且固定化蛋白质随后立即在相同的接触真空混合物干燥器中干燥,任选地在任选的洗涤步骤后干燥。 | ||||||
权利要求 | 1.一种在支持物上固定蛋白质的方法,其中蛋白质与支持物在不连续接触式真空混合物干燥器中的水相内孵育并且固定的蛋白质随后立即在相同的接触真空混合物干燥器中干燥,任选地在任选的洗涤步骤后干燥。 |
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说明书全文 | 用于固定和干燥酶的方法[0001] 发明描述 [0003] EP382767描述了一种用于固定脂肪酶的方法。在这种情况下,给定的脂肪酶的水溶液在固定的pH在室温借助转动与树脂(例如 )混合。随后通过过滤收集含固定的脂肪酶的树脂,随后用水洗涤并且在降低的压力下干燥。 [0004] 酶固定化通常伴随酶损失,原因在于不结合在支持物上或因已经结合的酶解吸附(“放出”)。另外,固定的酶在固定化的方法步骤期间频繁出现酶活性损失,这导致明显的产率损失和相关的费用增加,特别在产业规模下如此。 [0005] 发明描述 [0006] 本发明的目的因此是找到允许实现在支持物上高效固定蛋白质的方法,所述方法意味着,存在于支持物上的完整量的酶尽可能永久结合并保留,并且在酶活性蛋白质的情况下,在固定化后获得尽可能与固定化前相同的高度酶活性。 [0007] 已经发现一种在支持物上固定蛋白质的方法,其中蛋白质与支持物在不连续接触式真空混合物干燥器中的水相内孵育并且固定的蛋白质随后立即在相同的接触真空混合物干燥器中干燥,任选地在任选的洗涤步骤后干燥。 [0008] 现在已经发现,本文伊始限定的方法导致特别有利的结果,因为固定化的总体步骤,如蛋白质与支持物高效孵育,任选地洗涤固定的蛋白质及干燥固定的蛋白质,在单个装置中实施以产生可以轻易地贮存和运输的稳定产品。如果固定化的蛋白质准备按数百千克规模直至吨规模产生,则这种方法特别良好地适合产业规模。 [0010] 它特别良好地适用于固定水解酶、尤其脂肪酶。 [0011] 在脂肪酶范围内,来自南极假丝酵母(Candida antarctica)的那些脂肪酶可特别有效地固定,尤其南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)或结构性地从其衍生的这类酶。在结构上衍生自CALB的这类脂肪酶是与CALB多肽序列相比,具有至少一个、优选地两个或更多个氨基酸改变如插入、缺失或置换的脂肪酶。 [0012] 结构上衍生自CALB的这类脂肪酶的例子在WO 2009/080676(“CALB突变蛋白”)中描述,其中WO 2009/080676中关于CALB突变蛋白的公开内容明确地通过引用的方式并入。 [0013] 待固定的酶可以通过已知方法从初始生物分离或也还可以通过重组DNA技术在合适的宿主生物如芽孢杆菌属(Bacillus)、大肠杆菌(E.coli)、毕赤酵母属(Pichia)、金孢属(Chrysosporium)、曲霉属(Aspergillus)和酵母属(Saccharomyces)中产生。 [0014] 合适的支持物是多种有机或无机物质如硅胶、活性碳或聚合支持物。合适的聚合支持物是具有100至1000μm粒度和平均孔半径10-20nm的大孔交联聚合物。特别合适的是大孔交联的丙烯酸酯聚合物如与二乙烯基苯交联的聚甲基丙烯酸酯,所述聚合物可以例如包含丙烯酸、丙烯酸酯、甲基丙烯酸和甲基丙烯酸酯。这类聚合物例如由Lanxess按名称VP OC1600或由DOW按名称 XAD-7出售。 [0015] 合适的不连续接触式真空混合物干燥器是本领域技术人员从文献已知(例如Friedrich Kneule,"Das Trocknen"[Drying], AG,Aarau,1975,ISBN 3-7941-0429-3)。特别有利的是使用真空转鼓式干燥器或双锥干燥器。充分适合的是具有大于10升、优选大于100升、优选地大于1立方米内部容积的转鼓式干燥器。 [0016] 待固定的蛋白质与支持物在(通常借助缓冲液)调节至特定pH的水相中孵育。 [0017] pH取决于待固定酶的性质,主要取决于酶的等电点。已经证明3直至11、特别地4至8的pH范围是有利的。 [0018] 4.8-5.2的pH范围推荐用于CALB脂肪酶。 [0019] 用于水相的合适缓冲液例如是磷酸盐和乙酸盐缓冲液。 [0020] 孵育通常在0℃至40℃,尤其4℃至30℃的温度实施。如果待固定酶特别耐受温度,甚至50℃以上的温度可能是合适的。 [0021] 在孵育后,含酶的起始溶液与固定的酶分离。通过过滤法经安装在转鼓式干燥器中的筛板最简单地实施这个步骤。如果需要,固定的酶可以随后在洗涤步骤中纯化。这类洗涤步骤还通过以下方式实施:将固定的酶与洗涤液(通常是水)混合并且随后借助集成过滤装置与固定化酶分离。 [0022] 固定的酶随后还在不进一步转移至不连续接触式真空混合物干燥器的情况下干燥,其中设定干燥器中降低的压力小于1013毫巴、优选地小于100毫巴。 [0023] 调节护套温度至小于100℃,优选地小于65℃,其中必须确保产物温度不超过50℃,优选地不超过40℃。 [0024] 通常不推荐设定待干燥的固定化酶的温度高于50℃以避免酶的热失活。然而,特别在温度不敏感性酶的情况下,这些酶可以甚至在50℃以上干燥。 [0026] 目标通常是提供具有小于5%、优选地小于2%的残余含湿量和特别优选地具有0.5%至1.5%水的固定化产品。 [0027] 如果产品过分干燥,则这导致部分妨碍操作的静电荷。 [0028] 使用本发明方法生产的产品易在室温贮存,而不发生活性的明显损失。另外,它易于操作,即它可以轻易地填充和转移。 [0029] 在下文中更详细地描述新方法。实施例: [0030] CALB按500kg规模固定在 上 [0031] 用于这种方法的T0055转鼓式干燥器具有以下技术数据: [0032] ·容积:6.3m3 [0033] ·加热表面:17m2 [0034] 1.所用原料 [0035] 实验方法需要以下组分: [0036] · VP OC 1600潮湿(Lanxess)[544kg] [0037] ·脂肪酶超滤CALB-2012-01[21kg蛋白质] [0038] ·脱矿质水(用于3个洗涤步骤[3x 2000L] [0039] ·N2解吸气[5-20Nm3/小时] [0040] 根据方案,应当填充总计544kg潮湿Lewatit。这544kg潮湿Lewatit对应于约233kg干燥Lewatit。 [0041] 比活性460TBU/mg的蛋白质和纯度61%的脂肪酶是明确的。 [0042] 总量21kg的酶用于固定化。 [0043] 2.实验方法 [0044] 用 装填转鼓式干燥器和第一洗涤步骤 [0045] ·在08:15,开始对Lewatit鼓称量并且随后借助漏斗转移入转鼓式干燥器[0046] ·将总计544.1kg潮湿Lewatit VP OC1600置于干燥器中从全部转鼓采集混合样品 [0047] ·随后通过管、还通过漏斗,将2000L脱矿质水(借助水表)以流速80-90l/分钟输入干燥器 [0048] →以这种方式,漏斗无Lewatit残余物 [0049] ·填充过程在08:55完成 [0050] ·通过在干燥器中观察,可以看到水具有略微乳状变色并且一些蛋白质泡沫已经在表面上形成 [0051] ·现在将过滤装置(160μm)安装在检修孔盖上(09:20) [0052] ·随后将干燥器抽真空至78.6毫巴以检验泄漏 [0053] ·随后释放真空以返回标准压力(1020毫巴)(09:30) [0054] ·混合物随后在标准压力、室温和以0.33转/分钟混合2小时(为此目的,转鼓式干燥器上的驱动电机设定至5.5Hz,这对应于0.33转/分钟→手工测量:1转/2.43分钟=0.41转/分钟) [0055] →加热浴设定在完全冷却 [0056] ·在2小时过程后(11:26),使T0055处于盖向下位置并且借助掺入的160μm筛滤除洗涤水至IBC中 [0058] →该正压由输入的氮气产生 [0059] ·在每种情况下在20L,1000L和1700L后取得样品 [0060] →目视纯净,第一样品具有轻微浊度,然而不沉降在底部 [0061] →第二和第三样品清亮;迎着光可见小的独立悬浮粒子 [0062] ·排放总计1700L水(11:30–12:25) [0063] ·允许IBC静置2小时 [0064] ·随后检查悬浮的粒子是否已经沉降在底部;但是情况并非如此 [0065] ·将填充有洗涤水的IBC称重 [0066] IBC1:净重1003kg [0067] IBC2:净重717kg [0068] ·水随后排放至bbA中 [0069] 第二洗涤步骤 [0070] ·检修孔再次向上安置 [0071] ·随后,在800–700绝对毫巴吸出已经在两个1000L IBC中的2000L水(2000kg)。(12:40–13:22) [0072] ·填充过程耗时约20分钟/容器 [0073] ·混合物随后在转鼓式干燥器中以0.33转/分钟(5.5Hz)、在室温和标准压力混合2小时 [0074] ·在2小时过程后,将检修孔向下放置并且借助掺入的160μm筛滤除洗涤水至IBC中 [0075] →将这种洗涤水再次在100-200毫巴的正压过滤 [0076] ·在每种情况下在50L,1000L和2000L后取得样品 [0077] ·总计排放约2050L水 [0078] ·过滤耗时约每个容器(即,每1000L)30分钟 [0079] ·随后将填充有洗涤水的IBC称重 [0080] IBC1:净重1002kg [0081] IBC2:净重1043kg [0082] ·洗涤水随后排放至bbA中 [0083] ·随后提取洗涤的Lewatit的样品 [0086] 添加脂肪酶和固定化 [0087] ·首先再次称重冷却的脂肪酶鼓 [0088] →脂肪酶净重1749.6kg [0089] ·随后从每个鼓抽出2L样品(09:30–09:50) [0090] ·将全部9个鼓(每个鼓200L)的脂肪酶CALB-2012-01填充至转鼓式干燥器中[0091] ·为此目的,将3个鼓各自的内容物吸入干燥器中 [0092] ·为此目的,施加降低的压力300毫巴 [0093] ·首先,吸出容器7、8、9的内容物(10:19–10:32) [0094] ·仅很低量的酶溶液留在鼓中 [0095] →在添加3个鼓各自的内容物后,将干燥器每10分钟以0.33转/分钟转动[0096] ·随后,将容器3、2、1的内容物在(11:06–11:23)吸出并且每10分钟以0.33转/分钟转动 [0097] ·最后,将容器6、5、4的内容物在(11:52–12:07)吸出 [0098] ·从12:20至13:00,将鼓以200绝对毫巴和0.33转/分钟转动 [0099] ·在13:00,将转鼓式干燥器脱气至900绝对毫巴。 [0100] ·随后,直至13:15,将内容物在降低的压力100–200毫巴进一步混合[0101] →内部温度此时是20℃;出于这个原因,关闭设定至24℃的冷却过程[0102] ·随后在干燥器中施加轻微正压100–200毫巴 [0103] ·在这些条件下,干燥器以0.33转/分钟开动15小时 [0104] ·每小时记录压力和温度一次 [0105] ·在前3小时(15:15)后,第一样品(250ml)从固定物的上清液取得并且在8-14℃冷藏贮存 [0106] ·总计,在3、5、7、9、12和15小时固定化后取得样品 [0107] ·在15小时后,关闭干燥器并且每小时仅转动一次(1次转动)(直至次日,07:00)[0108] 固定化后过滤酶-Lewatit溶液 [0109] ·在07:00,将转鼓式干燥器再次转动并且放置成检修孔盖向下的位置[0110] ·在干燥器中施加正压约100毫巴 [0111] ·随后允许母液经160μm筛流入IBC(07:10–08:20) [0112] ·在约300L后,将第一样品抽入玻璃烧瓶 [0113] →在此注意到,样品更呈云雾状并且不再像前一天那样呈深绿色并且还起泡[0114] →样品因此在光学上比前一天的样品更浅和更为云雾状,并且现在闻起来还不同(丁酸味) [0115] ·在约900L后,将第二样品同样抽入玻璃烧瓶 [0116] ·由于母液在填充入IBC时明显起泡,第一IBC仅可以用900L母液填充[0117] ·随后,将第二IBC同样用约700L母液填充,所述母液首先用氮气吹扫[0118] ·出于这个原因,关闭笼头并静置10分钟以给予母液在底部沉降的时间[0119] ·随后将母液剩余部分添加至IBC [0120] ·这里,将第三样品抽入玻璃烧瓶 [0121] ·在结束时,第二IBC用总计750L母液填充 [0122] ·最后,将两个IBC称重 [0123] →IBC 1+2=1683kg净重 [0124] 洗涤固定化的脂肪酶 [0125] ·在排出母液后,首先将转鼓式干燥器再次转动一次并且使其处于滑盖(slide)向上位置 [0126] ·随后经滑盖取得潮湿未洗涤的固定物样品 [0127] →固定物再次经滑盖(sides)落入干燥器 [0128] →固定物具有浅绿色调 [0129] ·随后再次如此转动干燥器,从而检修孔盖向上 [0130] ·在干燥器中施加降低的压力约300毫巴 [0131] ·随后将2000L脱矿质水(装在2个IBC中)吸入转鼓式干燥器(08:55–09:30)[0132] ·随后允许在0.33转/分钟、室温和标准压力混合2小时 [0133] ·在2小时后,检修孔盖位置向下 [0134] ·在干燥器中施加正压400-580毫巴并将洗涤水排入IBC(11:45–13:15)[0135] ·在50L后取得第一样品,在1000L后取得第二样品并且在1825L后取得第三样品[0136] →全部样品均为略呈云雾状的浅绿色;但是无沉积物沉降下来 [0137] →不能在样品之间看到明显差异 [0138] ·在已经排放约1750L洗涤水后,将混合物首先用N2吹扫 [0139] ·在已经排放约1850L洗涤水后,外部放置第三IBC并且将管路连接至外部,原因是已经吹扫很大数量的氮气 [0140] ·现在施加900毫巴正压至干燥器,以有效滤除水总量 [0141] ·在这个压力,将混合物吹干15分钟(在结束时仅有氮气离开管路并且偶尔有几滴洗涤水) [0142] ·随后,称重IBC [0143] →IBC 1+2=1921kg净重 [0144] ·经检修孔取得1L固体样品 [0145] →这种样品也呈极浅绿色(但是不像先前取得的固体样品那样深)[0146] 真空干燥 [0147] ·转鼓式干燥器起初在0.33转/分钟的转动下抽真空 [0148] ·转动随后逐步增加至2.4转/分钟(1/1.5/2.0/2.4转/分钟) [0149] →从外部认定,干燥器非常安静,这转而提示固定物从干燥器壁均匀滑下(滑落)(因此在这个时间点,尚未形成相对大的团块) [0150] ·在14:20,将加热过程设定至50℃ [0151] ·在17:30,再次停止加热,并且代以25m3/小时维持解吸氮气 [0152] ·在02:15,调节冷却过程以便能够取得第一样品 [0153] ·在冷却2小时时间后,在04:15取得固定物第一样品 [0154] →内部温度已经从39.3℃降至23℃ [0155] ·样品交给公司自己的实验室测定残余水分 [0156] →在105℃/60分钟确定残余水分:35.76% [0159] ·在13:45,调节冷却过程以便能够取得第二样品 [0160] ·在冷却30分钟时间后,则取得样品 [0161] →这里注意到,在固定物的白色珠之间还存在更小的深棕色粒子[0162] ·随后在公司自己的实验室中测定残余水分 [0163] →在105℃/60分钟确定残余水分:9.72% [0165] ·在17:28,内部温度升至46℃→槽设定至50℃ [0166] ·在17:47,内部温度已经降回至45.5℃→槽设定至53℃ [0167] ·从18:00启动冷却过程 [0168] ·从19:00–19:20,取得样品并送至公司自己的实验室测定残余水分[0169] →在105℃/60分钟确定残余水分:1.4% [0170] ·由于残余水分低于目标值3%,因此停止干燥 [0171] ·在20:30,释放真空 [0172] →这里,温度从25℃增加至31.7℃ [0173] ·在20:50,在内部温度为25.8℃时关闭电机 [0174] ·从这个时间点,每2小时转动干燥器一次 [0176] ·使干燥器放置为滑盖向下位置 [0177] ·再次脱开筛分装置 [0178] →筛上有少许产品残余物 [0179] ·检修孔盖保持部分开启以便进行装瓶工序 [0180] ·安装Nibbler/衔接头 [0181] ·干燥器随后用约2.4m3/小时N2惰性化 [0183] ·灌装装置上的排气孔半开放 [0184] ·借助手工轻叩,最初允许产品小心地流出;在稍后阶段,使其转动至约一半位置[0185] →固定物毫不困难地撒入悬挂的大袋中,未留在薄膜上或干燥器本身中[0186] →随着更多产品短时间流出,大袋也仅非常短暂地鼓胀一次 [0187] ·随后敲出仍然在转鼓式干燥器中的残余物 [0188] →总体上没有明显的残留物留在转鼓式干燥器中(仅3个约DIN A3大小的位置,在所述位置可能已经形成2mm厚的层;否则干燥器内壁仅以极细尘层包覆) [0189] ·从大袋取得1L另一份样品到塑料烧瓶中 [0190] ·最终,将大袋再次称重并随后干燥处储存 [0191] →皮重:25kg [0192] →毛重:271kg [0193] ·灌装工序本身仅耗时约5分钟(连同准备过程,它耗时约20分钟)[0194] 3.分析结果 [0195] 在开始算得理论绝对活性9 460 000 000TBU [0196] 在固定化过程中测量的活性/总蛋白: [0197] [0198] |