抗冻蛋白、DNA及其表达体系

本发明的范围

本发明涉及植物抗冻蛋白、肽和多肽(下文又称为“AFP”)，它 们凝固在冰的晶体上，阻止冰重结晶，并且保护在低温状况下的脂 质体、细胞膜和蛋白质、细胞和有机体。

本发明还涉及以几丁质酶和抗冻活性给蛋白质编码的DNA序 列，以及在细菌、酵母、植物和动物中的DNA序列的表达方法，以 便生产有抗冻活性的几丁质酶。

本发明的背景

对于农作物的生产，低温是一种主要的环境限制因素。例如，暮 春的霜冻延误了种子的萌芽，初秋的霜冻降低了农作物收成的质量 和产量，冬季的低温降低了越冬作物(例如谷物和果树)的存活机 会。然而，有些植物能够长期，耐受住低于冰点的温度。通过认出 和分离在这些植物中的有助于形成耐霜冻能力的蛋白质，以及相应 的基因，可以把对霜冻敏感的农作物改造成耐霜冻的农作物，并延 长作物的生产期，。

GUY等人(I-5.1)分析对冷驯化的菠菜组织中的蛋白质总含 量与在温暖地区生长的植物组织中的蛋白质总含量进行了比较分 析，发现蛋白质与植物对寒冷的耐受能力有关。在冷驯化的叶的提 取物中发现的，分子量为110，82，66，55和13 KD的蛋白质，没 有出现在温暖地区生长的叶的提取物中。GUY等人(I-5.2)还检 查了冷驯化的菠菜叶中的蛋白质总含量，并且观察了高分子量的蛋 白质(110，90和79KD)的积聚。对于GUY等人(I-5.1)，在 植物内部，这些蛋白质的位置和功能仍然是未知的。

然而，我们已经知道，许多生物有机体通过避开冰的形成而能够 在低于冰点的温度条件下存活下来。这个策略要求合成抗冻蛋白 (AFP)，这种蛋白质又称为“热滞后蛋白质”(THP)。各种AFP冻 结在冰晶体的表面，防止冰晶的进一步生成。各种AFP的存在是由 下列研究确定的：1)在冰晶形成的过程中，考察冰晶的形状(III- 19、III-35、III-22)，2)测量热滞后性，这种滞后性是溶液中的 冰晶熔化温度和冻结温度的差值(III-19)，以及3)测量对冰晶的 重结晶的抑制能力。

在鱼中认出出四种不同的AFP类型(II-4)，并且在昆虫中 认出出一些不同的THP(III-12)。这些先前的发现提示了，这种适 应机制已经在不同的有机体中独立的形成，而且这种机制是在防止 在有机体内部生成任何结冰方面起着作用的。人们通常认为，各种 AFP不存在于植物当中，因为能在低于冰点的温度条件下长期，存 活下来的大多数植物在它们的组织中实际上有冰形成，通常是在胞 间空隙中，以及在木质部导管中。KURKELA和FRANCK(I-9.1) 报道过，一种在低温条件下显示的植物基因给一种蛋白质编码，类 似于DAVUS和GEW所报道过的在氨基酸中给比目鱼的各种抗冻 蛋白编码的情形(II-4)。KURKELA和FRANCK(I-9.1)未能 有足够数量的编码蛋白质来确定是否呈现抗冻活性。CUTLER等人 (I-1.1)CUTLER等人(I-1.1)指出，被注入了比目鱼抗冻蛋 白的植物组织显示出其抗冻活性有轻微的提高。GEORGES等人(I -3.1)使用比目鱼抗冻蛋白的一种合成基因来改造谷物的原生质 体，试图改善植物的抗冻活性。结果生成了一种蛋白质，但它未能 有效地分泌，而且未能检测出抗冻活性。

尽管从鱼类和昆虫中分离出来的抗冻蛋白已经被用于开发适用于 储存在低温和低冰点的温度条件下的食品和生物物质的新的添加 剂，但这些蛋白质仍然未有进入市场，因为它们被消费者认为是不 合适的。例如，把一种鱼抗冻蛋白添加到冰琪琳中被认为是不可接 受的，而把一种植物抗冻蛋白添加到冰琪琳中则被认为是可以接受 的。从植物中分离出来的AF可望能比那些已经被定性为来自动物的 抗冻蛋白在市场中有更广泛的应用。

附图的简要说明

本发明的首选实施方案将结合附图来加说明。这些附图包括： I.植物的寒冷耐受能力

图1描述了取自生长在不同温度条件下的冬裸麦叶的细胞间蛋白 质的浓度。

图2描述了分离自生长在不同温度条件下的冬裸麦叶的胞外蛋白 质的多肽的“SDS-PAGE”。第一道：分子量标记；第二道：分离自 生长在20/16摄氏度(昼/夜)(白天占16小时)的温度条件下的 裸麦作物的胞外多肽；第三道：分离自生长在5/2摄氏度(昼/夜) (白天占16小时)的温度条件下的裸麦作物的胞外多肽；第四道： 分离自生长在5/2摄氏度(昼/夜)(白天占8小时)的温度条件 下的裸麦作物的胞外多肽。

图3描述了分离自生长在白天占8个小时的，在不同生长阶段的 冷驯化冬裸麦叶的胞外蛋白质的多肽的“SDS-PAGE”。第一道：分 子量标记；第二道：分离自生长在20/16摄氏度(昼/夜)(白天 占16小时)温度条件下生长7天的裸麦作物的胞外多肽；第三道： 分离自首先生长在20/16摄氏度的温度条件下生长7天，然后移植 到5/2摄氏度(昼/夜)，白天占8个小时的光照体制下再生长28 天的裸麦作物的胞外多肽；第四道：分离自移植到5/2摄氏度的温 度条件下生长43天的温度条件下的裸麦作物的胞外多肽；第五道： 分离自移植到5/2摄氏度的温度条件下生长50天的温度条件下的 裸麦作物的胞外多肽；第六道：分离自移植到5/2摄氏度的温度条 件下生长71天的温度条件下的裸麦作物的胞外多肽；第七道：分离 自移植到5/2摄氏度的温度条件下生长95天的温度条件下的裸麦 作物的胞外多肽。

图4描述了分离自驯化冬裸麦叶的胞外蛋白质的多肽的“SDS- PAGE”。第一道：分子量标记；第二道：分离自首先生长在20/16 摄氏度的温度条件下生长7天，然后移植到5/2摄氏度(昼/夜)， 白天占8个小时的光照体制下再生长42天的裸麦作物的胞外多肽； 第三、四和五道：分别是分离自首先经过第二道所描述的生长过程， 然后再移植到20/16摄氏度，白天所占的时间为16个小时的光照 体制下分别再生长4天、6天和8天的裸麦作物的胞外多肽；

图5描述了分离自生长在各种不同温度条件下的裸麦叶的，经过 高度精密过滤的胞外提取物的冰晶形成能力。

图6说明了在冷驯化的冬裸麦叶的胞外提取物中的抗冻活性。抗 冻活性是通过利用一台毫微米渗压计(生产厂家：美国纽约州哈特 福特市CLIFTON技术物理公司，II-5)观察冰晶的形态来测定的。 在C、D、E和F中的冰晶取向：A轴线表示沿着基本平面生长，而 C轴线则表示垂直于基本平面生长。

图7说明了利用柱型色层分离法来分离自冷驯化的裸麦叶的胞外 提取物的组分。

图8说明了分离自冷驯化冬裸麦的叶的部分提纯和浓缩的抗冻蛋 白的冰晶形态。A：如图6所描述的晶体的取向。B、C和D：在温 度下降的过程中，冰晶的生长顺序。B：不完全的双锥形；C：双锥 形；D：针状晶体。

图9与在图8中所示的每个280毫微米峰值的柱上分级相关的多 肽“SDS-PAGE”。

图10描述了利用三羟基麦黄酮缓冲液(TRIS-TRICNE BUFFERS)通过“SDS-PAGE”从冷驯化的冬裸麦叶分离出来的胞 外多肽。多肽被从凝胶体中洗提出来，被用于检验抗冻活性。分子 量为161，93到99，33，31，27，23，15和11 KD的多肽全部显示 出抗冻活性。

图11说明了分离自A：没有经过驯化的冬裸麦叶，B：经过冷 驯化的裸麦叶的胞外提取物。多肽被“SDS-PAGE”溶解并且分离 出来，然后使用抗几丁质酶抗血清作为主要抗体对其进行测试。分 子量标准(以kD为单位)在C列中给出。

图12说明了从冷驯化冬裸麦的叶中提取的一个胞外提取物的一 种免疫印迹分析。多肽被“SDS-PAGE”分离出来，印迹到硝化纤 维上，然后使用抗几丁质酶抗血清作为主要抗体进行测试。

图13说明了使用从冷驯化的冬裸麦作物上分离得到的胞外提取 物对重结晶进行抑制。当稀释到1∶10,000时，蛋白质的浓度大约 为每公升28微克。当冷却至-20摄氏度，然后在-8摄氏度下6个 小时后，形成片条。(备注：让片条在-8摄氏度的温度下“退火”6 个小时，以观察冰晶的重结晶。这里的照片是由美国国家大气研究 中心CHARLES KNIGHT博士提供的。)

图14说明了在非驯化的叶中(σ)、在经过冷驯化的叶中(λ)、 以及为了养活胞外蛋白质含量而在冻结之前被抽提的经过冷驯化的 叶中(υ)的冷冻伤害的程度，以泄漏来度量。这些叶被放进水中， 冷却至发生结冰的温度，然后在这个温度下维持22分钟。在此之后， 从冷冻浴中把叶取出来，放到冰上慢慢解冻。离子泄漏可以计算为 叶被冻结之后的溶液导电率除以煮沸后的溶液的总导电率。得到的 数据用未经冻结的样品的离子泄漏进行矫正，然后以平均值±SE的 形式给出，这里N等于3。致命的伤害发生在组织出现在50％或更 大的离子泄漏时。 II.冷驯化草本植物的抗冻活性

图15说明了非驯化(NA)和冷驯化(CA)的植物的叶中的抗 冻活性。每种植物叶的胞外提出物中的抗冻活性是通过观察在溶液 中生长的冰晶的形态来测定的。在所有非驯化的叶的提出物中没有 观察到抗冻活性。经冷驯化的羽衣甘蓝叶和冬canola叶的提出物， 以及经过冷驯化的冬裸麦和春季裸麦、冬小麦和春季小麦、冬大麦 和春季燕麦的叶的提出物都显示出抗冻活性。所有照片都是以相同 的放大倍数拍摄的。放大条表示17微米。

图16：在下列各种作物经受冷驯化期间.在其叶中的胞外蛋白质 积聚——A：冬裸麦、冬大麦和冬小麦；B：春季裸麦、春季小麦、 春季燕麦和玉米；C：菠菜、冬canola和羽衣甘蓝；D：春季canola 和烟草。植物在非驯化的条件下生长(0时间点)，然后转移到进行 冷驯化的条件下(5/2摄氏度)经历1至7个星期，。蛋白质浓度以 平均值±SE的形式表示出来，这里N等于3。

图17：冬裸麦cv Voima中的胞外多肽的积聚和抗冻蛋白的免疫 检测。A：从生长期为3星期的非驯化(NA)的裸麦(第一道)分 离出浓缩的胞外提出物，并各自从生长期分别为一星期，(第二道)、 两星期，(第三道)、四星期，(第四道)、七星期，(第五道)和九星 期，(第六道)，温度条件为5/2摄氏度(昼/夜)的，经过冷驯化 的(CA)麦分离出浓缩的胞外提取物，然后通过SDS-PAGE从这 些浓缩胞外提出物中分离出等量的多肽(每道5微克)。把装载有等 量(每道一微克)的浓缩胞外提取物SDS-聚丙烯酰胺凝胶体印迹 出来，然后使用B进行测试。B为参照冬裸麦32kD类似葡聚糖酶 的蛋白质制备的抗类似葡聚糖酶的蛋白质抗血清(稀释比为1∶ 10000)；C为参照冬裸麦35kD抗类几丁质酶蛋白制备的抗类几丁质 酶蛋白抗血清(稀释比为1∶10000)；而D为参照冬裸麦25kD的类 似西非竹芋精的蛋白质制备的抗类似西非竹芋精的蛋白质抗血清(稀 释比为1∶10000)。相应的每种多肽的明确的检测在右边指示出来。 左边数字是指Bio-Rad低分子量标志。CLP，类几丁质酶蛋白；GLP， 类葡聚糖酶蛋白；TLP，类西非竹芋精的蛋白质。

图18说明了在非驯化(NA)的和经过完全冷驯化(CA)的谷 物中的胞外多肽的积聚。在15％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶体中分离 出等量的胞外多肽(每道1微克)。A：一种染上bio-Rad银迹的凝 胶体。这种凝胶体被使用B、C和D来印迹和测试。B为抗类似葡 聚糖酶的蛋白质抗血清(稀释比为1∶10000)；C为抗类几丁质酶蛋 白抗血清(稀释比为1∶10000)；而D为抗类西非竹芋精蛋白抗血 清(稀释比为1∶10000)。相应的每种多肽的明确的检测在右边指示 出来。左边数字是指Bio-Rad低分子量标示物。

图19说明了在非驯化(NA)的和经过完全冷驯化(CA)的谷 物中的胞外多肽的积聚。在15％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶体中分离 出等量的胞外多肽(每道1微克)。A：一种染上Bio-Rad银色的凝 胶体。在转移之后，使用B、C和D来对免疫印迹进行测试。B为 抗类似葡聚糖酶的蛋白质抗血清(稀释比为1∶10000)；C为抗类几 丁质酶蛋白抗血清(稀释比为1∶10000)；而D为抗类西非竹芋精 蛋白抗血清(稀释比为1∶10000)。相应的每种多肽的明确的检测在 右边指示出来。左边数字是指Bio-Rad低分子量标示物的分离。

图20说明了在分离自非驯化的(白色带条)和经过冷驯化的(有 阴影的带条)的单子叶植物(A)和双子叶植物(B)中存在的总糖 量。利用葡萄糖作为标准来把糖的浓度计算为毫克/克FW，并且表 示为平均值+SE，其中n等于3。 III.对具有抗冻活性的类几丁质酶蛋白的DNA分离和蛋白质序列

图21描述了一种具有抗冻活性的类几丁质酶蛋白的DNA和蛋 白质序列。A：CH-9全长DNA和氨基酸序列；B：CH-9 DNA和 氨基酸序列(缺少预测的信号肽编码区)；C：CH-9，包括一个由20 种氨基酸组成的前置序列，这个序列从植物细胞中被除去(最后提 纯得到的，具有几丁质酶和抗冻活性的蛋白质缺少这个前置序列)； D：CH-9氨基酸序列，缺少由20种氨基酸组成的一个假定的信号 序列。

图22描述了一种具有抗冻活性的类几丁质酶蛋白的DNA和蛋 白质序列。A：CH-46 DNA和氨基酸序列(被除去的未翻译的序列 和假定的前置序列)；B：CH-46 DNA和氨基酸序列(被除去的未 翻译的序列)；C：CH-46序列(被除去的未翻译的序列)；D：CH -46(被除去的未翻译的序列)。

图23是一个由分离自不同植物的几丁质酶的氨基酸序列组成的 多重队列。1是分离自裸麦种子的几丁质酶-a的氨基酸序列(蛋白 质信息源登记号JC 2071)，rye(裸麦)是分离自裸麦种子的几丁质 酶-c(蛋白质信息源登记号JN 0884、pCHT 9和pCHT 46是两种具 有抗冻活性的冬裸麦类几丁质酶蛋白的预测的氨基酸序列)。 编码类几丁质酶蛋白的DNA序列的表达法

图24说明了在大肠杆菌中的DNA序列和类几丁质酶蛋白的表 达法。全部细胞提取物是使用未经诱导细胞(第1道和第31道)和 IPTG-诱导细胞(第2道和第4道)制备出来的，采用SDS-PAGE 分离，并且经过免疫印迹。一种由抗类几丁质酶蛋白抗血清认出的， 分子量为32 kD的蛋白质，很明显存在于诱导细胞中(第2道和第4 道)。图中还说明了用经过冷驯化的冬裸麦(M)提纯得到的类几丁 质酶蛋白。

图25A说明了在酵母中的DNA序列和类几丁质酶蛋白的表达 法。酵母细胞在YPD介质中分别生长了24个小时(第1道)，和48 小时(第2道)。细胞经过离心处理，上层清液在与样品缓冲液混合 之后，多肽被SDS-PAGE分离出来。在两道中，都存在一种分子量 为32kD的多肽。

图25B说明了对带有抗类几丁质酶蛋白抗血清的上层清液和细 胞切片进行一种免疫印迹分析。取自上层清液(第3道和第4道) 和细胞切片(第1道和第2道)的蛋白质被溶解，然后采用SDS-PAGE 分离，并且经过免疫印迹。大多数蛋白质被发现存在于上层清液(第 3道和第4道)中。图中还说明了用经过冷驯化的冬裸麦提纯得到的 类几丁质酶蛋白。

图26说明了采用SDS-PAGE分离得到的热稳定的抗冻蛋白。 从经过冷驯化的冬裸麦叶分离出来的胞外提取物分别被加热到60摄 氏度，历时30分钟(A道)，和加热到100摄氏度，历时10分钟。 C道显示出BioRad范围宽广的分子量标示物(207，121，81，51.2， 33.6，28.6，21.1和7.5kD)。GLP：类葡聚糖酶蛋白；TLP：类西非 竹芋精蛋白。

本发明的小结

过去，人们一般认为，与植物的抗冻活性相关的机制存在于细胞 的内部，因而应当保护细胞，使之不会从内部形成冰晶。没有人曾 经想到过，在植物内部有存在抗冻蛋白和有形成冰晶核能力的蛋白 质的可能性。此外，没有人曾经想到过存在这样的可能性：这些蛋 白质能够定位在细胞的外侧，为保护植物免受霜冻之害执行着一种 完全不同的机制。令人十分惊奇的是，我们已经发现了，有一组多 肽积聚在细胞的外面，并且显示出形成冰晶的能力和抗冻活性，从 而能够控制在细胞之间的空间和木质部中的冰晶生长。在它们的天 然的形式中，这些蛋白质也呈现出酶活性，例如葡聚糖和几丁质酶 的水解，这种水解作用分改变植物的细胞壁，并且/或者抑制低温 病原体的生长。这些胞外多肽位于植物的非原质体的可提取部分， 这个部分包括血浆膜的外表面、血浆膜和细胞壁之间的区域、细胞 壁、细胞中层、胞间空隙、以及木质部的管胞和导管。应当指出， 在本专利说明书的全部内容中，术语“胞外”均具有上述含义。

冬裸麦是一种能够在低于-20摄氏度的温度条件下存活下来 的，越冬的一年生草本植物。当冬裸麦的叶冻结时，冰在叶肉内部 的胞间空隙中和在木质部导管中生长(III-40)。冻结的植物组织能 否存活取决于能否阻止由于细胞间的冰晶的生长导致细胞损坏。在 冷驯化期间积聚在冬裸麦叶的非原质体中的各种抗冻蛋白(植物抗 冻蛋白、肽和多肽)有能力改变冰晶在冻结的组织中生长的状况(III -35和III-22)，而且相关于冬裸麦叶所具有的较强的耐受冻结的 能力(III-35)。除此之外，如免疫定位所示，抗冻蛋白是与表皮相 关的，并且是与经过冷驯化的冬裸麦的叶的胞间空隙周围的叶肉细 胞相关的(III-2)。这些位置相当于在叶表面上的，以及在叶肉内 部的胞间空隙中的已知的生成冰的地方(III-40和III-41)，并且 提示抗冻蛋白还能够阻止细胞的接种冻结(III-41)。

其分子量从16到35kD的六种抗冻蛋白已经从经过驯化的冬裸 麦的叶的叶肉中分离出来(III-22)。它们与三类与发病机理有关的 (PR)蛋白质的成员相类似：有两种抗冻蛋白是类似于几丁质酶的 蛋白质(CLPs)，有两种抗冻蛋白是类似于β-1，3-葡聚糖酶的蛋 白质(TLPs，III-23)。一种类几丁质酶蛋白从经过冷驯化的冬裸麦 叶中提纯为同质，并且显示出同时具有抗冻活性和几丁质酶活性(III -23)。因为这；些低温裸麦蛋白质显示出两种活性，它们可以在抵抗 不明确的疾病方面起作用(几丁质酶活性)，也可以在增强耐受霜冻 的能力方面起作用(抗冻活性，III-48)。

如果改变在非原质体中的冰晶的生长的状况的能力是抗冻活性的 一个重要的组成部分，那么，它可能是在植物当中一种十分普遍的 机制。对各种越冬植物的考察结果已经表明，在从许多植物的组织 中榨出的树液当中，存在抗冻活性，这些植物包括21种双子叶植物 和9种单子叶植物(III-19，III-17，III-52，III-11，III-12)。 一种蛋白质已经从白英(Solanum dulcamara，一种又苦又甜的茄属 蔓生木本植物)(III-10)。茄属植物的抗冻蛋白是一种大分子量(67 kD)的糖基化蛋白质，通常具有较高的甘氨酸含量(大约24％)， 并且具有一种独特的N-端氨基酸序列(III-1)。

从植物来源分离出来的抗冻蛋白是那些涉及改变冰晶的生长状 况、减少在低温条件下由微生物引起的疾病、腐烂和损坏，以及改 善曝露于低温所造成的后果，包括生产和储存冷冻食品，以及生物 物质的低温储存。给抗冻蛋白编码的基因在为生产更多用作添加剂 的抗冻蛋白的表达系统方面是十分重要的，在为增加抗冻蛋白的合 成以促进存活和养活在寒冷环境中的伤害和疾病方面也是十分重要 的。根据本发明的一个方面，我们制备了抗冻能力强的植物所共有 的一些抗冻蛋白。这些蛋白质位于胞外面，以控制冰晶在植物内部 的木质部和胞间空隙中的生长。具有抗冻活性的多肽是从分别具有 如下近似表观分子量的一组多肽中选择出来的：大约5到9kD、大 约9到11kD、大约11到15kD、大约21到23kD、大约24到27kD、 大约30到31kD、大约31到33kD、大约32到36kD、大约60到68 kD、大约89到100kD，以及大约161kD，

根据本发明的另一个方面，我们还提供了具有上述分子量，和分 离自对霜冻具有耐受能力的植物的多肽。在这些多肽中，有一些是 冰晶的成核剂，它们植物的组织的胞外空间中启动冰晶生长的过程。 有一些多肽是酶，它们能够改变植物的细胞壁和/或抑制植物胞间 空隙中的病原体的生长。

根据本发明的各个不同的方面，多肽所显示的特征是它们的表观 分子量：它们的表观分子量是与它们在SDS-PAGE凝胶体中相对于 已知的分子量标示物的迁移的相关的。可以理解为，本发明的各种 多肽在不同类型的凝胶体中可以发生不同的迁移，特别是当凝胶体 在的丙烯酰胺的浓度不同时，或还原条件不同时，或所使用的操作 缓冲液不同时，情形更是这样。因此，本发明的分子量特征打算被 用于代替等量的多肽，因为等量的多肽在不同的凝胶体中的分子量 会略有差异。除此之外，胞外多肽被发现存在于分离自植物的组织 的，含有全部可溶性蛋白质的提取物中。

根据本发明的另一个方面，我们制备了分离自单子叶草本植物和 双子叶草本植物的抗冻蛋白。抗冻活性和全部蛋白质积聚被发现于 分离自生长在低温环境中的8种草本植物的叶细胞外提取物中，其 中包括单子叶草本植物(冬裸麦和春季裸麦、冬小麦和春季小麦 Triticum aestivum L.、冬大麦Hordeum vulgare l.、春季燕麦Avena sativa L.)和双子叶草本植物(冬canola Brassica napul L.和羽衣甘蓝Brassica oleracea L.)。能够改变冰晶生长状况的胞外蛋白质的分泌物是这些单 子叶草本植物和双子叶草本植物能够越冬存活的机制的一个方面。 除此之外，蛋白质分泌物进入非原质体内，并伴随着抗冻活性的增 强，是所有生长在寒冷环境中的禾本科的所有植物的共同响应。因 此，在另一个实施方案中，本发明涉及一种具有抗冻活性的被分离 出来的多肽，选取自由禾本科成员和十字花科成员构成一组植物中。 在一个优先考虑的实施方案中，禾本科植物选自由大麦、小麦和裸 麦、春季裸麦、冬裸麦、春季小麦、冬小麦、冬大麦和春季燕麦构 成的一组植物中，而十字花科植物则选自羽衣甘蓝和冬canola。

根据本发明的另一个方面，某些单子叶植物，在经过诱导或驯化 之后，会产生一系列与发病机理相关的蛋白质有关的抗冻蛋白，如 经过冷诱导的的蛋白质和免疫印迹的N端序列所示。我们从禾本科 植物制备了相关的植物，包括裸麦、小麦、和大麦，在冷驯化期间 积聚了类似于与发病机理相关的蛋白质。因此，本发明还涉及冷诱 导的与发病机理相关的蛋白质，它们是从一种单子叶草本植物中分 离出来的，并且是具有抗冻活性的。单子叶草本植物优先从禾本科 中选取。在一种优选的实施方案中，单子叶草本植物选自由大麦、 燕麦和裸麦、春季裸麦、冬裸麦、春季小麦、冬小麦、和冬大麦。 本发明还包括每种多肽的一种拟态。在一种优选的实施方案中，本 发明的各种多肽可以选取自由类几丁质酶蛋白、类西非竹芋精蛋白、 以及葡糖酶构成的一组蛋白质。这些多肽可以用于产生抗冻蛋白， 用以增强植物和微生物中的抗冻活性，抑制生物物质或食物产品中 的冰晶的重结晶，减少在生物物质或食物产品中由于微生物在低温 条件下的活性而引起的疾病、腐烂或损坏，细胞的超低温冷藏，细 胞的超低温保护，人体血小板的冷保护，以及杀死肿瘤细胞。

根据本发明的另一个方面，可能会形成对上述多肽的一个或多个 抗体，例如在免疫测定中被选择适用于测定抗冻蛋白的水平，或用 于确定类似的抗冻蛋白是否会由其它植物产生。有三种胞外抗冻蛋 白从冬裸麦中分离现来，它们相当于一种32-kD的类似葡聚糖酶的 蛋白质、一种32-kD的类似几丁质酶的蛋白质、以及一种25-kD 的西非竹芋精的蛋白质，它们被提纯出来，并且相对于它们当中的 每一种培养出抗血清。

根据本发明的另一个方面，在冷冻食品的制备过程中，可以加入 一种或多种上述的多肽。具体地说，在冰琪琳和水果制品中加入了 一种或多种多肽，以便获得具有微小晶体结构的上乘的产品。此外， 在生产组织的冷藏保护、各种组织的冷藏、以及种质的冷藏方面， 多肽也是很有用的。

根据本发明的另一个方面，我们确定了多种糖存在于经过冷驯化 的胞外提取物中，并且改变了胞外冰晶的生长状况，同时抑制了冰 晶的重结晶。这些糖增强了抗冻蛋白的活性。

根据本发明的另一个方面，两种分离自冬裸麦的类几丁质酶蛋白 被利用分子生物技术复制出来，并且同时用细菌系统和酵母系统表 达出来。被表达的蛋白质同时显示出几丁质酶活性和抗冻活性。本 发明包括类几丁质酶蛋白的DNA和蛋白质序列、对上述序列的任何 修正、这些序列的表达法、以及它们在农业、食品工业和医药方面 的应用。本发明是从一种单子叶植物中分离出来的一种核酸分子， 给一种抗冻蛋白编码。在一个优选的实施方案中，分子具有在图 21.a.、图21.b、或图22.a、或图22.B中的DNA序列。本发 明还包括一种这样的分子，其序列与在图21.a.、图21.b、或图22.a、 或图22.b中的DNA序列的全部或部分大体上是相同的(下面将参 照序列特征的数量对这种同一性进行讨论)这种分子可以从由 mRNA、cDNA、有义链(sense)DNA、反义链(anti-sense)DNA、单 链DNA、以及双链DNA构成的一组核酸中选取。本发明还涉及由 核酸分子编码的一种多肽，以及一种提纯和分离得到的多肽的拟态。 在一个优选的实施方案中，多肽具有在图21.a.、图21.b、图21.c、 图21.d、图22.a、图22.B、图22.c、或图22.d中所示的氨 基酸序列。在另一个实施方案中，多肽可以大体上与在图21.a.、图 21.b、图21.c、图21.d、图22.a、图22.B、图22.c、或图22.d 中所示的氨基酸序列的全部相同或部分相同。

本发明还涉及给多肽信号序列编码的DNA序列，这种多肽信号 序列让分泌物离开细胞。本发明包括一种分子，其序列大体上与在 图21.a.、图21.c、图21.d、图22.B、或图22.d中所示的DNA 序列的全部相同。这种分子可以从由mRNA、cDNA、有义链DNA、 反义链DNA、单链DNA、以及双链DNA构成的一组核酸中选取。 本发明还涉及由核酸分子编码的一种多肽，以及一种提纯和分离得 到的多肽的拟态。在一个优选的实施方案中，多肽具有在图21.a.、 图21.c、图21.d、图22.B、或图22.d中所示的氨基酸序列。在 另一个实施方案中，多肽可以大体上与在图21.a.、图21.c、图21.d、 图22.B、或图22.d中所示的氨基酸序列的全部相同或部分相同。 这种目标序列可以用于把蛋白质分泌物导入一个转基因有机体内或 表达系统内。表达的主体可以是植物、植物细胞、海藻细胞、细菌、 酵母、真菌类、动物、以及动物细胞。

本发明还包括一个给类几丁质酶蛋白编码的基因表达系统，包括 一个表达矢量和嵌入在这个表达矢量内的类几丁质酶蛋白的cDNA。 在一个优选的实施方案中，表达矢量是大肠杆菌质体pET 12a。在另 一个实施方案中，这个系统由Pichia矢量pGAPZαA构成。在一个 优选的实施方案中，这个系统包括在图21.a.、图21.b、图22.a、 或图22.b中所示的类似几丁质酶的氨基酸序列。本发明还包括由 系统改造的一种植物、植物细胞、动物、动物细胞、细菌、真菌类、 或酵母。本发明的另个方面包括一种表达类几丁质酶蛋白的方法， 这种方法由改造一种带有类几丁质酶蛋白DNA表达矢量的表达主体 和培养表达主体构成。这种表达主体可以是一种植物、植物细胞、 海藻细胞、细菌、酵母、真菌类、动物、以及动物细胞。表达系统 的产物可以用于产生抗冻蛋白，增强植物、动物、微生物体的耐严 寒能力和抵抗低温度引起的疾病的能力，抑制生物物质或食物产品 中的冰晶的重结晶，细胞的超低温冷藏，细胞的超低温保护，人体 血小板的冷保护，以及杀死肿瘤细胞。

本发明还涉及给经过冷诱导的内几丁质酶编码的DNA序列，这 种内几丁质酶是从单子叶植物和/或禾本科植物的所有成员在分离 得到的，其用法与在这项专利申请中对冬裸麦序列的用法的描述相 同。

本发明还涉及被抗冻蛋白DNA序列改造的有机体(植物、动物 和微生物)，以促进在冷冻储存期间的存活能力，越冬的存活能力和 /和在转基因的有机体中的抗冻活性。有机体可以被改造用于过度 地生产蛋白质，而抗冻蛋白也允许有机体本身在接近零摄氏度或在 低于摄氏零度的温度条件下储存，而允许继续对它们进行工作。因 为许多细菌1动物、植物和酵母细胞谱系对霜冻和寒冷是十分敏感 的。

本发明是从一种单子叶植物中分离出来的一种核酸分子，给一种 抗冻蛋白编码。在一个实施方案中，核酸分子具有在图21.a.、图21.b、 或图22.a、或图22.b中的DNA序列。核酸分子可以省略掉在图 21或图22中所示的目标序列。这种分子最好有40％的序列与在图 21.a.、图21.b、或图22.a、或图22.b中的DNA序列的全部相 同或部分相同。这种分子最好选取自由mRNA、cDNA、有义链DNA、 反义链DNA、单链DNA、以及双链DNA构成的一组核酸中选取。 本发明还包括这样的一些核酸分子，它们如图21和图22中的核酸 分子那样给同样的氨基酸序列编码。本发明还包括这样的一种核酸 分子，这种分子给一种类似几丁质酶的防冻多肽编码，这种多肽与 图22(a)中的340至744各个位置的编码链核酸分子杂交，其过程 在一种严格由0.2×SSC到2×SSC，0.1％的SDS(十二烷基磺酸钠) 组成的洗提液中，在温度为42摄氏度的温度条件下进行。本发明的另 一个实施方案还包括一种这样的核酸分子，这种分子给一种类似几 丁质酶的抗冻蛋白编码，这种蛋白质与图21(a)中的541至745各 个位置的编码链核酸分子杂交，其过程在一种严格由0.2×SSC到2× SSC，0.1％的SDS组成的洗提液中，在温度为42摄氏度的温度条件 下进行。

在另一个实施方案中，本发明包括一种由本发明的一种核酸分子 编码的多肽，正如在前一段所描述的那样。本发明还包括经过提纯 和分离得到的多肽的一种拟态。这种多肽最好包括在图21(a)、图21 (b)、图21(c)、图21(d)、图22(a)、图22(b)、图22(c)、 或图22(d)中所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，这种多肽 包括有至少40％的序列与在图21(a)、图21(b)、图21(c)、图21 (d)、图22(a)、图22(b)、图22(c)、或图22(d)中所示的氨 基酸序列全部相同或部分相同。

本发明和一种变异包括分离自一种单子叶植物的，经过冷诱导的 一种防冻多肽，或分离自一种单子叶植物的，经过冷诱导的一种与 发病机理相关的蛋白质。这种单子叶植物最好选自禾本科。这种单 子叶植物最好选自由大麦、小麦和裸麦、春季裸麦、春季小麦、冬 小麦、冬大麦、和春季燕麦组成的一组禾本科植物。本发明还包括 这些多肽的拟态。

本发明包括一种具有抗冻活性的被分离出来的多肽，选取自由大 麦、小麦和裸麦、春季裸麦、春季小麦、冬小麦和冬大麦、冬canola、 春季燕麦和羽衣甘蓝组成的一组植物。这种多肽最好选取自由几丁 质酶、西非竹芋精、和葡聚糖酶组成的一组酶。这种多肽对于生产 抗冻蛋白、增强植物和微有机体对严寒的耐受能力、增强处在低于 零摄氏度的温度条件下的植物、动物和微生物在野外的存活能力和 产量，抑制在生物物质或食物产品中的冰晶的重结晶，细胞的冷藏， 细胞的低温保护，人体血小板的冷保护，以及杀死肿瘤细胞是十分 有用的。

本发明还包括一种NDA重组体，这种重组体包括本发明的一种 DNA分子和一个促进剂区，它们在功能上是互相链接的，从而能使 促进剂增强在宿主细胞中的上述DNA的分子的转录。本发明还包括 表达一种几丁质酶基因的一个系统，这个系统包括一种表达矢量和 嵌入在这个表达矢量中的几丁质酶cDNA。这种表达矢量最好包括一 个质体，例如大肠杆菌矢量(例如pET 12a)。这个表达矢量也可以 是Pichia矢量(例如pGAPZαA)。在这个表达系统中，几丁质酶DNA 最后包括在图21(a)、图21(b)、或图22(a)、或图22(b)中的 DNA序列的全部或部分。本发明还包括被这个系统改造的一种植物、 植物细胞、动物、动物细胞、细菌、和酵母。

在另一个实施方案中，本发明是一个表达几丁质酶的方法。这个 方法包括：把一种带有一个几丁质酶DNA矢量的表达宿主加以改造， 并且培养这个表达宿主。在这个方法中，表达宿主最好选取自由一 种植物、植物细胞、细菌、酵母、真菌类、原生动物、海藻、动物、 和动物细胞组成的一组生物。这个表达系统对于下列工作是特别有 用的：生产抗冻蛋白、增强植物、和微生物体对严寒的耐受能力、 增强处在低于零摄氏度的温度条件下的植物、动物和微生物在野外 的存活能力和产量，抑制在生物物质或食物产品中的冰晶的重结晶， 细胞的冷藏，细胞的低温保护，人体血小板的冷保护，以及杀死肿 瘤细胞等。

本发明还包括一种核苷序列，这种序列以由编码链的目标序列或 其补足物所构成的植物中的蛋白质分泌物为目标，如图21(a)，位 置1到60位所示。这种以植物中的蛋白质分泌物为目标的核苷序列 最好包括编码链及其补足物，如图22(a)，位置1到60位所示。

本发明一种增强抗冻活性的方法，这种方法包括把防冻多肽结合 起来，以提高防冻多肽的活性，从而抑制冰晶的重结晶，并且改变 冰晶的正常生长状况。本发明包括一种由一种或多种抗冻蛋白与一 种或多种糖结合所构成的一种组份。本发明的这些多肽可以与一种 糖结合起来使用，例如可以用来产生抗冻蛋白，增强处在低于零摄 氏度的温度条件下的植物、动物、微生物体在野外的存活能力和产 量，抑制生物物质或食物产品中的冰晶的重结晶，细胞的超低温冷 藏，细胞的超低温保护，人体血小板的冷保护，以及杀死肿瘤细胞。

本发明的这些多肽可以用于抑制在某种植物、某种冷冻食品或任 何冷藏生物物质中，由某种低温病原体引起的疾病的发生和发展， 以及损坏。本发明还包括一个从植物材料或重组体表达系统分离出 抗冻蛋白的方法，这种方法包括把可溶性的提取物到最少大约60摄 氏度的温度，然后离心脱水或过滤，除去变性的蛋白质和可溶性物 料。本发明还涉及到一种给一种分离自一种单子叶植物的防冻多肽 编码的cDNA。这种单子叶植物最好选取自禾本科或小麦属植物(最 好选取冬裸麦)。这种cDNA最好还给多肽易位的一个信号序列编码。 本发明还涉及给分离自禾本科或小麦属的某种单子叶植物的经过冷 诱导的内几丁质酶编码的核酸分子。本发明还涉及从核酸分子产生 出来的多肽。本发明还涉及到这些核蛋白质的用途，其用法与在这 项专利申请中对冬裸麦和其它防冻多肽的描述相同。

本发明包括一种分离出来的，包括一种从这样一组物质选取的核 苷序列。这组物质包括：如图21或图22所示的一种核酸分子，或 其补足物；一个与上述(a)的核苷序列在中等严格或高度严格的条 件下杂交的核苷序列，例如在这项专利申请中所描述的条件，且该 序列给一种防冻多肽编码；一种防冻核酸分子，与上述(a)的核苷 序列具有分别至少为40％、至少为60％、至少为80％、至少为90 ％、至少为95％、97％、98％、或99％的序列同一性，而且这种防 冻核酸分子给一种防冻多肽编码；一种如(a)的核苷序列那样给同 样的氨基酸序列编码的核苷序列；以及一种如(b)的核苷序列那样 给同样的氨基酸序列编码的核苷序列。

本发明还涉及一种分离出来的核酸分子，这种分子能够在中等严 格或高度严格的条件下，与单子叶植物中的一种核苷序列杂交，这 种序列给具有抗冻活性的某种多肽编码，而且在此当中，DNA分子 能够在中等严格或高度严格的条件下，与图21或图22所示的一种 核苷序列杂交。

“中等严格”的条件被用于例25、25.1和25.2.6。而某种 “高度严格”的条件也可以使用，例如，在例25.2.2中，通过把 温度增加到55摄氏度，并且使用在例26.1中所描述的用于CHT 46 的基因专用探针。最常使用的严格条件(0.2×SSC，0.1％ SDS， 30分钟，42摄氏度)，也就是我们为我们的杂交探针提出权利要求 的那种条件，在F.Ausubel等人著，1995年由John Wiley and Sons 出版公司于1995年出版的《分子生物学中的简要协议》一书的第25 页，第4章中，被定义为中等严格条件。

本发明还涉及一种从冬裸麦复制出来的CH 9或CH 46核酸分 子，和一种包括核酸分子的表达矢量，以及一种控制分子表达的促 进剂。本发明还包括核酸分子的表达产物。本发明还涉及一种防冻 核酸分子或从一种禾本科单子叶植物(最好采用冬裸麦)复制出来 的基因。

本发明还涉及在一个样品中，通过下面的步骤检测出CH 46、CH 9或一种给抗冻蛋白编码的核酸分子的存在的一种方法：A)从在图 21或图22中在的核酸序列中选择一种探针；B)把这种探针与生物 样品杂交；以及C)检测由探针与CH 46、CH 9或样品中的防冻核 酸分子杂交所生成的一种杂交复合体，在这当中，复合体的存在指 示出在样品中存在CH 46、CH 9或防冻核酸分子。这种核酸可以是 DNA(脱氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)。这种探针最好至少75 ％补足在这项专利申请中所披露的一种探针中存在的10个邻接的分 子的一个核苷序列。对在这项专利申请中所描述的探针进行补足的 序列也是很有用的。

本发明还涉及一种能够耐受寒冷的植物，已经在其基因群中嵌入 了一个依次包含如下内容的一个重组体，双链DNA分子：

·A)一个促进剂区，它在植物中的作用是导致产生一个RNA 序列，这个序列在功能上与B)链接；

·B)能够导致产生RNA序列的一种DNA序列，这种RNA序 列可以给具有在图21或图22中的序列的一种防冻多肽编码，这种 多肽是一种变体，或在生物功能上等效的多肽。

在本发明的另一个专利技术实施方案中，DNA序列在功能上与 至少与一个信号序列及一个未翻译的序列链接。促进剂最好是相对 于DNA序列异种的，并且能够在植物的细胞或组织中引起足够的抗 冻蛋白的表达，以增强以这种基因改造过的某种植物对寒冷的耐受 能力。

本发明的核酸分子可以通过一个方法用于改造一种宿主细胞，经 过采用一种表达包含核酸分子的矢量加以改造，这种宿主细胞可以 产生防冻多肽。本发明还涉及一个可用于通过利用一种包含本发明 的一种核酸分子，并表示由核酸分子的多肽的表达矢量来改造某种 宿主细胞来改变某种细胞中的防冻多肽的含量(过度表达防冻多 肽)。这种表达矢量最好包括一种防冻核酸分子和一个促进剂区，它 们在功能上是互相链接的，从而使促进剂能够增强所述DNA分子在 宿主细胞中的转录。本发明还包括一种用于产生一种在遗传学上经 过改造的植物的方法，这种植物表达抗冻蛋白。这种方法包括下面 几个步骤：1)把一个重组体，双链DNA分子嵌入一种宿主植物细 胞的基因组内，这种双链DNA分子含有一种促进剂，其功能是在植 物细胞中增强一个相邻的DNA编码序列的转录；2)本发明的一个 防冻DNA分子被链接到该促进剂，然后从该宿主植物细胞中，再生 出一种在遗传学上经过改造的植物。这种DNA分子最好包括一个独 立的DNA分子，它是CH 9或CH 46，或如图21或图22所示的一 种具有CH 9或CH 46核苷序列的DNA分子，一种变体，或在中等 严格条件或高度严格条件下，在生物学功能上等效的分子。本发明 还包括使用这一方法产生的植物。

本发明还涉及一种改变某种植物中的防冻多肽的含量的方法。这 一方法包括如下步骤：

·把DNA传递到一个植物细胞，植物从这里开始再生，其中， DNA包括一个独立的DNA分子，它是CH 9或CH 46，或者与如图 21或22所示的，具有CH 9或CH 46核苷序列杂交，一种变体，或 是在中等严格或高度严格的条件下在生物功能上等效的分子，在此 当中，该DNA给一个防冻多肽编码；

·然后从这个植物细胞再生这种植物，以便让这种植物表达该 DNA。

在这个方法的一个优先选择的具体实施方案中，这种DNA是一 种核酸分子，分离自禾本科的一种单子叶植物，最好是冬裸麦。这 种分子也可以分离自某种双子叶植物。这种优选的DNA改变了内生 的防冻多肽的含量，从而使这种植物的耐受寒冷的能力相对于这种 植物种属的正常情况发生了改变。

本发明还包括一种通过利用本发明的核酸分子和通过表达基因来 改造某种细胞或植物，让细胞或植物获得抵抗低温疾病的能力(最 好是抵抗真菌疾病的能力)的方法。这一方法还包括应用一种组份， 这种组份包含本发明的多肽和一个在农业上可被接受的载体。各种 几丁质酶、葡聚糖酶、和西非竹芋精都是抗真菌的蛋白质。本发明 的各种多肽展示出几丁质酶、葡聚糖酶、和西非竹芋精的活性。即 使当多肽获得抗冻活性时，这种活性仍然存在。有许多疾病是由在 低温环境中能够正常生长的微生物引起的。冷冻只能阻延，而不能 阻止微生物的生长，而在食品或生物物质中的任何微生物在解冻期 间都可以快速生长。

本发明还涉及一种为植物提供耐受寒冷的能力的组份，这种组份 包括防冻多肽和一种在农业上可被接受的载体。本发明还包括一种 适宜于添加到食物产品中的组份，包含一种防冻多肽和一种适宜于 人体消耗的载体。 对本发明的详细说明

抗冻蛋白有很多有趣的性质，包括对冰晶生长的约束和抑制，通 过抑制冰的再结晶而对脂质体、蛋白质、细胞膜和细胞的保护(更 详细的说明见III-21，III-17)。因此，这些蛋白质在食品工业中将得 到广泛的应用，通过抑制冰的再结晶来改善在冷冻状态下食用或以 冷冻方式储存的粮食、蔬菜、水果、肉类以及很多其它食品的质地、 质量和增加其货架期，减少由微生物引起的损失。此外，这些蛋白 质可用于细胞、膜、卵母细胞、组织(III-4)的低温贮藏，以及细胞 和组织的低温保护(III-44)。抗冻蛋白(AFP)还有某些最新用途， 包括对人类血小板的冷保护(III-49)。更为令人关注的是，AFP调节 冰晶生长的特性具有其它生物医药用途，可杀死某些细胞例如癌细 胞。在转基因植物中，当植物表达AFP时，这些AFP能够改善植物 的抗冻能力和增强植物对低温病原体的抵抗力。 植物对寒冷的耐受

我们发现的与植物耐寒性有关的奇异蛋白质有三类：

i)冰晶成核蛋白

ii)抗冻蛋白(AFP)

iii)对植物和真菌细胞壁进行酶修饰的多肽

在植物体内水分冻结的过程中，如果允许水在受控制的条件下冻 结，植物组织中的水分就穿过细胞壁进入胞间空隙，导致胞间冰晶 的形成。冰晶成核蛋白的作用是引发冰晶在细胞外的植物组织胞间 空隙中形成。AFP同样存在于细胞外，以约束和调控冰晶在胞间空 隙中的生长，从而阻止细胞膜的破裂。存在于细胞外空间中的酶起 修饰细胞壁物质的作用，增加细胞壁物质的弹性，以增强植物组织 在冻结和解冻时是生存能力。这些酶还可以降解低温病原体的细胞 壁物质，从而提供对低温病原体的某些抵抗力。

人们相信，植物在暴露于低温冰冻环境的过程中，与抗冻有关的 蛋白质由植物细胞产生于体内，透过原生质膜分泌到胞间空隙中产 生作用，调控冰晶的形成。耐冻蛋白的形成可以理解为包含一条或 多条特定的多肽。这些多肽中的多条联结在一起，提供了蛋白质的 一种特定结构，使之具有冰晶成核、抗冻结或酶作用等显著的耐霜 冻特性中的一种或多种特性。

我们发现，在温暖的环境如20℃下，植物细胞产生与耐冻有关 的多肽的能力下降。当植物处于早春或晚秋的霜冻气候条件下时， 这些多肽的产生就显著增加。据我们所知，这就是抗霜冻诱导多肽 在植物组织中最初的发现。由我们在植物的胞间空隙中发现这些多 肽的这一角度出发，我们在这些部位中提取了这些多肽(I-16和II- 12)。一般来说，采用如下的两步提取法：

i)将植物的叶切碎或剪碎，用最好含20mM氯化钙和10mM抗 坏血酸盐的缓冲剂进行真空抽提

ii)抽提液从植物组织中提取，而细胞未受到破坏

获得的提取液具有冰晶成核活性、葡聚糖酶活性和几丁质酶活性 以及抗冻结活性。冰晶成核活性更适宜于用小滴冻结测试来测量。 在讨论的实例中，当加入象二硫苏糖醇和巯基乙醇这样的巯基还原 剂时，冰晶成核活性就降低。提取液的抗冻活性通过观察安装在光 学显微镜上的冷冻台中的冰晶形成过程来确定。这样的结构同从其 它来源如海乌鱼中提取(II-4)的其它类型的抗冻蛋白质类似。实验 发现，当加入蛋白酶时，提取液的抗冻活性消失，从而证实了AFP 的存在。葡聚糖酶活性是通过对从可溶性昆布多糖(多聚β-1，3 -葡萄糖)中酶性释放葡萄糖等价物的测量来测量。葡聚糖酶在钙 的存在下更为活跃。几丁质酶活性是通过对从胶体几丁质中(外源 几丁质酶)和从几丁质寡聚体中(内源几丁质酶)中酶促释放氨基 葡萄糖的测量来测定(I-10.1)。

可以理解，为了从胞间空隙中抽取抽提液而不破坏植物细胞，可 以采取不同的分离技术。这些技术包括在离心管中放置一个漏斗或 锥形体使植物叶垂直定向以避免叶片的弯折。然后将叶片离心，从 而在不破坏细胞的情况下获取抽提液。其它技术可用于多肽的提取。 例如，可通过灌注适当的抽提溶液来抽提叶片。当植物组织均质化 时，细胞外的多肽是水溶性的，将分布于整个可溶性组分中。

当冰冻发生时，引起对霜冻耐受性的多肽对任何类型的植物都是 有益的。任何植物都可以通过不同的方式使用或本身含有这些多肽， 而这些多肽可以调节冰晶的生长。植物如果含有这些蛋白，就能在 寒冷或冰冻的气温中耐受更长时间的暴露，就能在更严酷的气候中 生存，就能有更长的生长季节，因为春秋季的霜冻对它们的影响会 更小。

此外，个别蛋白的使用为暴露于零度以下温度中的植物选择了另 一种生存机制。例如，有些植物通过完全阻止冰的形成来避免冻伤。 这种过冷的策略要求不存在冰晶核原，或者存在钝化冰晶核原的物 质。AFP表现出抑制冰晶核形成的特性(II-13)。因此，任何植物组 织都可以通过不同的方式驯化产生或从外部给予AFP，以阻止冰晶 核形成和促进植物体液的过冷化。

正如所说明的那样，本发明提供的与冰冻耐受性有关的蛋白质具 有多种用途。一个重要的用途就是用于检测植物在抗冻方面的特性。 针对这些多肽，制备了多种抗体。凭借这些抗体，可以通过免疫测 定的方法来确定其它植物中类似多肽的存在，以判断它们产生冷诱 导AFP、冰晶核和酶的能力，并测定它们耐冰冻能力的强弱。同样 可以理解，植物能够被编码了上述多肽的遗传信息所转化，从而在 其它类型的植物中改进或提供耐霜冻能力。本发明中的多肽同样可 应用于工厂化操作，但必须实用适当的载体以加速植物、水果、粮 食或其它生物材料对这些多肽的吸收。AFP必须存在于水溶液中， 以影响冰的形成。为促进吸收，我们使用一些物理方法，如真空抽 提、灌注、混合、搅拌，以及在研磨或非研磨情况下的浸泡。在蔬 菜、水果的种植中，当周围温度骤降到零度以下时，可以用喷洒的 方式施用这些多肽，以防止霜冻造成的破坏。此外，这些多肽在生 物组织的低温贮藏中得到应用。这些多肽还广泛应用于所有冷冻食 品的质量，特别是冰淇淋和其它在冷冻状态下食用的食物。这些多 肽的应用，使得冰晶的结构变得微小并减少了再结晶，从而产生更 高质量的产品。原则上，只要哪里需要抑制冰晶的再结晶，本发明 中的多肽就可以得到应用。这种对再结晶的抑制保持了冰晶颗粒的 微小，防止了对细胞壁和膜的损伤，从而维持了冷藏细胞和组织的 生存。通过以下的详细讨论和例证，可以使本发明得到更进一步的 理解。

实施例1：细胞外蛋白质的提取和量化

将冬裸麦(Secale cereale L.cv.Musketeer)种子播种到装有粗蛭石 的15cm塑料罐中，在20∶16℃(昼∶夜)下发芽一周，期间每天的昼 长为16小时。植物转移到5∶2℃(昼∶夜)的环境，光照体制为16∶8 小时(昼∶夜)，经过这种处理的植物称为冷驯化裸麦(RH)。植物生 长于5∶2℃(昼∶夜)环境下，但光照体制为8∶16小时(昼∶夜)，经过 这种处理的植物称作短昼型冷驯化裸麦(RH-SD)。余下的塑料罐留 在20℃的生长室中再生长三周，作为对照，或称非驯化裸麦(RNH)。 裸麦在5∶2℃(昼∶夜)(8小时昼∶16小时夜)条件下生长整整七周然 后转移到20℃生长室中生长四天，这一过程称作脱驯化(Deacc)。 所有的植株用经修饰的Hoagland营养液(Huner和Macdowall配方， 见1-6)浇灌。

分别从RNH，RH，RH-SD和Deacc植株中提取细胞外蛋白质。 在每次提取中，都用5mM EDTA，10mM抗坏血酸，10mM巯基乙 醇，1mM苯基甲基磺酰氟，2mM己酸和2mM苯甲脒，以真空抽 提法制备胞外提取液。该真空抽提的程序是按照Mauch和 Staehelin(I-16)的描述进行的。经处理的叶片垂直塞入一漏斗后放入 离心管中，以避免叶片的弯折。离心以分离胞外抽提液，并收集于 离心管中。该提取液是在不破坏叶细胞的情况下获得的。

分别从RNH，RH，RH-SD和Deacc叶片中提取胞外蛋白，正如 前文“蛋白质提取”中略述的那样。提取液的蛋白质浓度用Bio-Rad 方法以BSA为标准测定，测定时至少作四次独立的重复。从胞间空 隙中提取的蛋白质的量因植物生长条件的不同而不同。非驯化植物 叶片中的胞外蛋白含量平均为0.034毫克蛋白/克鲜重。在5℃条件下 分别于16小时和8小时昼长下生长的叶片，其胞外蛋白含量分别平 均为0.149毫克蛋白/克鲜重和0.307毫克蛋白/克鲜重。可见，在低 温和短昼条件下生长的裸麦，其胞外蛋白含量增加了九倍。而当它 们被转移到20℃条件下驯化时，这些蛋白质水平下降(图1)。 实施例2：胞外蛋白的电泳

对如图2、图3和图4显示的结果而言，为电泳的需要，胞外提 取液中加入1.5倍量的1％乙酸的甲醇溶液，在-20℃下保温过夜，以 使胞外蛋白从胞外提取液中沉淀下来。蛋白质沉淀分别用100％乙醇 和70％乙醇在5℃下洗涤，然后在干燥器中干燥。蛋白质用 Laemmli(I-10)样品缓冲液[60mM Tris-HCl，pH6.8；10％甘油；2％ 十二烷基磺酸钠(SDS)；5％巯基乙醇]再悬浮，以Biorad无染色标 准进行电泳分离，采用10％丙烯酰胺凝胶，对堆积胶用90V电压， 对分离胶用110V电压(I-10)。用考马斯蓝对凝胶染色。对图9展示 的结果而言，存在于胞外提取物的柱组分中的蛋白质直接溶解于 Laemmli样品缓冲液(I-10)，以Biorad预染色标准进行电泳分离， 采用13.5％丙烯酰胺凝胶，200V电压。凝胶用氨银染色。

在不同类型的植物叶之间，胞外提取液中的蛋白质形态表现出显 著的不同。SDS-PAGE(10％丙烯酰胺凝胶)显示在胞外提取液中至 少存在12种多肽。其中两种多肽的分子量分别为77和73kD，被考 马斯蓝染成红色，它们仅在冷驯化的叶中发现(图2；第3和第4道)。 在经驯化的叶中，分子量分别为36、33、30、25、21、15、14和13kD 的多肽被检测到含量的增加(图2)。分子量分别为23和20kD的两 种多肽仅在短昼冷驯化的叶这才检测到增加。 实施例3：冷驯化期间多肽的积聚

为进一步研究胞间空隙中多肽的特性，进行了时程实验，其目的 是了解这些多肽的出现与冰冻耐受性的发展之间的关系。检测发现， 在非驯化叶中，大多数胞间多肽的含量很低(图3，第2道)。在冷 驯化的第35、50、57和78天，测定到多肽的持续积累(图3，第3、 4、5和第6道)。在第78天，短昼冷驯化裸麦叶的冰冻耐受性达到 最高值(LT50＝-30℃)，同时展示出最高的胞外多肽含量并出现一种 分子量为109kD的新多肽。在冷驯化102天以后，109kD、77kD和 73kD的多肽不复存在，同时植物叶的冰冻耐受性降低，推测可能是 因为植株已春化的缘故(图3，第7道)。这一发现表明，这13种胞 外多肽中大多数的存在，与植株的冰冻耐受性和春化作用有关。在 脱驯化过程中，即将冷驯化的植株从最严酷的环境中转移到20℃的 环境中经历不同长度的时间段，同时也检测胞外蛋白的形态。如图4 所示，12种多肽中大多数多肽(第2道，最高程度的冷驯化)的含 量在此后4天的脱驯化(第3道)中大大降低，并在此后6天和8 天的脱驯化中(第4和第5道)持续降低。图中左手的一栏是分子 量刻度尺，藉此可估测第1道中多肽的分子量。在第1道和第2道 之间的分子量刻度尺相信是更为精确的。 实施例4：胞外多肽的冰晶成核活性

用通过Amicon小体(I-13)超滤的方法将叶的胞外蛋白浓缩十倍。 在给定的温度范围内，将浓缩液用小滴冻结技术确定活性冰晶核的 光谱。在冷冻期间(图5)，冷驯化裸麦叶的胞外提取液在-9℃下生 长短光周期的成核冰晶，在10℃下则生长长光周期的成核冰晶。非 驯化和脱驯化叶的提取液则在最低的温度下(-13℃)才开始结冰。 非驯化和冷驯化的叶提取液冰晶成核活性的不同(图5)，可能是因 为驯化叶的胞间空隙中保持了更高的蛋白质含量(图1)。用超滤的 方法获得相同蛋白质含量的非驯化和冷驯化叶提取液来测定蛋白质 浓度的影响。当用小滴冻结法对两种提取液的冰晶成核活性进行测 定和计算时，在冷驯化叶中发现每克鲜重的冰晶核累积数呈统计学 上的显著增加(p＝0.01)。在-15℃下，非驯化叶的胞外提取液中每克 鲜重的冰晶核数(平均标准偏差，n＝4)是2269±292，而长昼冷驯 化裸麦叶的胞外提取液中每克鲜重的冰晶核数为7048±917。低的冰 晶核形成起始温度表明，存在于提取液中的冰晶引发物不是完整的 冰晶形成点。 实施例5：胞外提取液的抗冻活性

对用前文提及的技术制备的胞外提取物在抗冻发明的活性进行评 价。抗冻活性的测定，是通过用纳升渗压计观测提取液中形成的冰 晶的形态来实现的(Clifton Technical Physics，Hartford，N.Y.，U.S.A， II-3，II-5)。在纯水中，冰晶的正常生长与晶格的基面平行(a-轴方向) 而很少垂直于基面(c-轴方向)生长，因此冰晶的外观平而圆(II-5) (图6A)。相反地，低浓度(nM)的AFP优先抑制冰晶沿a-轴方向 的生长，因而冰晶呈现出六棱柱面(II-6)(图6G)。在更高浓度的AFP 中，冰晶主要沿c-轴方向生长，形成双六棱锥形(II-6)(图8C)。

在这一实验中，非驯化裸麦叶提取液的冻结就象蒸馏水一样，亦 即，只观测到薄而圆的冰晶(图6B)。相反地，所有从冷驯化冬裸麦 叶的的胞间空隙中提取的粗提取液在冷冻时都产生六边形的冰晶(图 6C至6G)。当温度降低时，冰晶首先沿c-轴扩展，形成不完整的双 六棱锥形(图6D)，然后沿a-轴生长，形成六棱柱(图6D)和更大 的六边形冰晶(图6E至6G)。六棱形冰晶的形成和冰晶沿c-轴的生 长，表明这些冬裸麦的粗提取液中存在抗冻活性(II-3，5)。此外， 当冷驯化裸麦叶胞外提取液加入5％(w/v)Streptomyces griseus蛋白酶 (Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，U.S.A.)在22℃下孵化一小时， 提取液对冰晶形态的影响就消失，这一事实说明抗冻活性与蛋白质 有关。 实施例6：胞外蛋白对再结晶的抑制

AFP在耐冻性植物和生物体中的作用之一是阻止冰的再结晶 (II-10)。尽管冰最初是形成小的冰晶，然而如果没有AFP的存在， 随着时间的推移，这些冰晶会融合形成大的冰晶，从而对生物组织 造成机械损伤。用“条形物实验”对再结晶进行测定。把少量胞外 提取液滴加到-20℃的表面上，形成一薄层小冰晶。然后将这一条形 物在-8℃下退火6小时。用光学显微镜和偏振光观察退火后冰晶的大 小，并将本发明的胞外提取物与蒸馏水进行对照，以确定提取物是 否具有抑制水中冰的再结晶的作用(图13)。所有稀释度的提取液中 的冰晶都明显比纯水退火后观察到的冰晶小。当胞外提取液按 1∶10,000稀释，即稀释到每升含大约28微克蛋白质时，仍然表现出 显著的抑制再结晶作用。 实施例7：胞外提取液中蛋白质的分级分离

将胞外提取液浓缩五倍，用超滤交换到50mM的NH4HCO3(Centriprep-10，Amicon Canada Ltd.，Oakville，ON，Canada)中，并以 50mM NH4HCO3为介质，采用Sephacryi 200(Pharmacial LKB Biotechnology，Uppsala，Sweden)柱(0.5×32cm)。洗出液用紫外吸收法 在280nm(O--O)和230nm(v-v)下监测。标准蛋白质被分别洗 出以估测蛋白质的大小。铁蛋白，440kD，在第9.5ml洗出；醛缩酶， 158kD，在第11.5ml洗出；牛血清白蛋白，67kD，在第13.5ml洗出； 以及胰蛋白酶原，24kD，在第16.5ml洗出。如图7所示，监测到四 个明显的大分子峰：305kD(峰1)，5kD(峰2)，2kD(峰3)和＜1kD (峰4)。在测试每一组分的抗冻结特性时，只有与峰2相关的组分 形成六边形和双棱锥形冰晶。

如图7所示，用SDS-PAGE(13.5％丙烯酰胺，银染色凝胶，如 图9所示)对与280nm下每个峰的柱分相关的多肽进行估测。第1 道包含预染色的标准大分子；第2道包含原胞外提取物；第3道包 含在第8ml洗出的多肽(峰1)；第4道包含在第18ml洗出的多肽(峰 2的肩)；第5道包含在第22ml洗出的多肽(峰2)；第6道包含在 第26ml洗出的多肽(峰2的肩)；第7道包含在第31ml洗出的多肽 (峰3)；第8道包含在第35ml洗出的多肽(峰4)。从峰2得到的 柱分(图7)包含几条主要的多肽，其大小从5kD到36kD(图9， 第4道，以及表I和表II)。该柱分具有抗冻结活性。 实施例8：经分级分离的胞外多肽的冰晶成核活性

蛋白质经Sephacryl柱洗出后，从峰1和峰4监测出低的冰晶成 核活性，如图4所示。而峰3则显示出较高的冰晶成核活性。SDS-PAGE 分离出两种分子量分别为60和68kD的多肽。冰晶成核蛋白可以是 两者之一，也可以是两者的结合。这两种多肽在图2、图3和图4中 分别识别为77kD和73kD的多肽，因为60和68kD多肽被考马斯蓝 染色。 实施例9：经分级分离的胞外多肽的热滞后现象

AFP通过阻止冰晶的形成和抑制冰晶的生长依质性地降低溶液 的冰点，而这些蛋白质对熔点的改变则仅靠依数效应(II-5)。这一 热滞后现象(冰点和熔点不相同的现象)通过观察温度对单个冰晶 生长的影响来测定。熔解在冰晶变圆时开始发生；冻结在冰晶沿c- 轴延伸时发生(II-5)。

为证明热滞后现象的存在，我们将280nm吸收和具有抗冻活性 的柱分(峰2)合并，冻干后在蒸馏水中再溶解，用于观测热滞后现 象。在这一更高的蛋白质浓度下，沿a-轴方向的冰晶生长被抑制(图 8B至8D)。此外，五个冰晶沿c-轴方向排列，其平均冻结温度为-1.10 ℃。它们的平均熔解温度是-0.78℃，因而热滞后温度被计量为0.33 ±0.06℃(平均±标准偏差，n＝5)。因此，冬裸麦叶产生了AFP。这 种(这些)AFP具有修饰冰晶生长的正常模式和依质性地降低溶液 冰点的能力。冬裸麦AFP表现出来的热滞后效应比从极地鱼中发现 的AFP(大约0.6℃，II-7)和在昆虫这发现AFP(5℃，II-7，II-8) 小。这可能是因为冬裸麦AFP没有完全纯化，或者是因为结构及功 能上的差异。 实施例10：胞外多肽中至少11种多肽的抗冻活性

用20mM CaCl2和10mM抗坏血酸从冬裸麦叶中提取胞外多肽， 用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳分离时使用无还原剂(不含 二硫苏糖醇)的Tris-tricine缓冲系和大(16×18×0.15cm)12％丙烯 酰胺凝胶。在冰温的0.25M KCl中保温10分钟后，多肽在凝胶中显 色。凝胶经蒸馏水洗后，将各波段切开，用0.1％SDS和50mM Tris-HCl将多肽从凝胶中洗出。然后用80％丙酮在-20℃将多肽从洗脱缓 冲液中析出，沉淀并风干。将多肽用0.1M NH4HCO3再溶解，分别用 观察冰晶形态变化的方法测定各种多肽的抗冻活性。如图10所示， 有8种多肽，分子量从111kD到161kD，可以改变正常类型的冰晶 生长而形成六边形冰晶。93kD的多肽实际上代表一组具有抗冻活性 的多肽，它们在Tris-tricine凝胶系统中分离为分子量从93kD到99kD 不等的一组。这些多肽依据其被考马斯亮蓝染成红紫色来识别。在 早期实验中，多肽用Tris-glycine缓冲系和12.5％胶或梯度胶来分离， 因此这些多肽的大小在本系统中的表现与在早期的凝胶中相比有所 不同。 实施例11：对AFP所含氨基酸的分析

对具有抗冻活性的多肽的氨基酸成分分析表明，它们相对富含甘 氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸，以及丝 氨酸(见表III对所有多肽的展示)，但不含氨基己糖(监测条件： 将每种多肽15皮摩尔水解4小时后进行氨基酸分析)。没有任何多 肽展示抗冻糖蛋白和I型AFP的高丙氨酸含量特性(II-10)。相反， 裸麦多肽显示出高的亲水氨基酸含量，就象在海乌鱼和大西洋鲑中 检测到的那样(II-4)；同时也具有高含量的甘氨酸，正如在某些昆 虫AFP中检测到的那样(II-7，表III)。 实施例12：用免疫吸附法对胞外提取液中的类几丁质酶蛋白进行鉴定

用SDS-PAGE分离胞外多肽，并将其电吸附到硝化纤维上。印 迹用对几丁质酶的初级抗体探针。初级抗体来源：Dr.Michel Legrand， Laboratoire de Virologie，Institut de Biologie Moleculaire et Celluire de la Recherche Scientifique，15，rue Descartes，67000 Strasbourg，France(I- 10.1)。为显影的需要，用次级抗体(抗兔1gG抗体与碱性磷酸酶结 合)对印迹进行探针。结果表明，两种分子量分别为27和32kD的 多肽具有与几丁质酶类似的抗原决定部位(图11)。27kD多肽在冷 驯化叶中的含量高于非驯化叶，而32kD多肽则是由低温诱导而产生 的。次级免疫吸附如图12所示。图中的每一道分别代表用几丁质酶 抗体探针的在5℃下生长2、5、6、7、8和9周后的冬裸麦胞外多肽。 27kD几丁质酶在2周龄的植物叶中存在不明显，但在整个9周的时 间内持续积累。32kD几丁质酶仅仅当植物在5℃下生长7周后才明 显存在。到第9周，两种几丁质酶都以双重道出现(32和31kD，27 和26kD)。 实施例13：胞外多肽在裸麦冰冻耐受性中所起的作用

在5℃和8小时昼长下冷驯化的冬裸麦叶用20mM CaCl2和10mM 抗坏血酸抽提，以减小非原质体中的蛋白质浓度。非驯化叶、冷驯 化叶和经抽提的冷驯化叶分别被切成2.5cm长的碎片，并用蒸馏水 充分漂洗。三份样品中的每一份都将碎叶片放入50个装有4mL HPLC 级水的试管中。将这些试管置于冰浴中，每隔22分钟将温度降低1 ℃。在每一温度下，都将冰冻的样品移动并置于冰上缓慢解冻。然 后将样品置于室温并测定样品的传导率。将样品煮沸以除去所有的 内离子，冷却至室温，再次测定溶液的传导率。结果如图14所示。 对胞外蛋白的抽提导致冷驯化叶在-11℃出现致命的冻伤。如果胞外 蛋白不被抽提，冰晶在-1℃下成核时，冷驯化叶到-30℃这样低的温 度下仍然可以正常生存。即使让未经抽提的冷驯化叶自然冷冻，它 们在-13℃以上的温度下都不会冻死。由此可见，胞外蛋白的存在确 实减轻了冰冻带来的伤害。 实施例14：AFP的N-端氨基酸序列分析，证明AFP与病原相关蛋白 类似

对图9第4道所示七种主要多肽中的三种进行了部分氨基酸顺序 的测定。其中具有抗冻活性的9kD多肽的N-端前20个氨基酸被测 序：

NH2-ALA-ILE-PHE-CYS-GLY-GLN-VAL-ASN-PRO-ALA-LEU- GLY-

PRO-PRO-ILE-TYR-PRO-ALA-PHE-GLY-

11kD多肽的前16个氨基酸的顺序如下：

NH2-ARG-SER-PHE-SER-ILE-THR-ASN-ARG-CYS-TRP-SER- PHE-

THR-VAL-PRO-GLY-

其中前11个氨基酸显示与一种激酶有关的转移蛋白(列于蛋白 质信息库的文件名MUSHCK和TVMSHC下)有55％的同源性。

30kD蛋白质的N-端前30个残基的序列如下：

NH2-ILE-GLY-VAL-CYS-TYR-GLY-VAL-ILE-GLY-ASN-ASN- LEU-

PRO-SER-ARG-SER-ASP-VAL-VAL-GLN-LEU-TYR-ARG-SER- GLY-

X-ILE-ASN-X-MET-

其中X代表未知的氨基酸残基。

将这一顺序与列于国立癌症研究所的超型计算机数据库中列出的 蛋白质进行同源性比较。这一序列与以前从大麦中纯化的葡聚糖内- 1，3-β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.39)具有63％的同源性。30kD带有时 表现为一条31至33kD的带，推测为内葡聚糖酶的前体。这些结果 表明，冷驯化所诱导的过程之一，是产生修饰细胞壁的能力。细胞 壁流动性的增加，对于冻结-解冻周期中细胞的收缩和此后的膨胀可 能是重要的。这一葡聚糖酶活性或许还能抑制真菌菌丝的生长，因 而提供对低温病害的抵抗力。

除此之外的六种表现出抗冻活性的胞外多肽的氨基酸序列也得到 了确定。这些多肽用SDS-PAGE分离，采用Tris-tricine缓冲液，从 凝胶中洗出，进行抗冻活性的测定，如图10所示，然后用于序列分 析。它们的N-端序列如下：

11kD多肽：

NH2-ALA-ILE-SER-X-GLY-GLU-GLN-VAL-ASN-

SER-ALA-LEU-[GLY]-PRO-X-ILE-[SER]-TYR-

ALA-[ARG]-[GLY]

对蛋白质信息库的FASTA检索揭示这一序列与大麦中的一种分 子量为9kD的脂质转移蛋白的20个的氨基酸重叠区具有80％的同源 性(II-14.2)。图10中这一11kD的多肽与图9前文中已提及经测序 的多肽相对应。正如前文所述，这一分子量的差异是由凝胶电泳的 可变性造成的。

15kD多肽：

NH2-ARG-SER-PHE-SER-ILE-THR-ASN-ARG-X-

ALA-PHE-THR-VAL-X-PRO-ALA-ALA-THR-PRO-

VAL-GLY-GLY-GLY-GLY-GLN

对国立生物医药研究基金蛋白质信息资源库的FASTA检索发 现，该序列与一种从Oryza sativa中提取的类西非竹芋精蛋白所报道 的一段24个氨基酸的重叠区有75％的同源性。这一图10中15kD的 多肽或许与前文图9中的11kD多肽相对应。

25kD多肽：

NH2-ALA-THR-ILE-THR-VAL-VAL-ASN-[LYS]-

PHE-SER-TYR-THR-VAL-X-PRO-GLY-ALA-LEU-

PRO-PHE-GLY-GLY-VAL-GLY-LEU-GLY-PRO-GLY

-GLN-

经FASTA检索发现，该序列与大麦西非竹芋精同源蛋白1中的 一段29个氨基酸的重叠区有79％的同源性。它同时还与燕麦中分离 的avematin中的一段22个氨基酸的重叠区有77％的同源性，与小麦 中分离的trimatin中的一段22个氨基酸的重叠区有82％的同源性。 与西非竹芋精类似的蛋白被证明具有一系列的活性，包括α-淀粉酶 活性、蛋白酶活性和膜渗透活性(II-8.2)。

图10中的31kD多肽与前文图9中的30kD多肽相对应，只是多 出一段氨基酸序列：

NH2-ILE-GLY-VAL-X-TYR-GLY-VAL-ILE

32kD多肽：

NH2-ILE-GLY-VAL-X-TYR-GLY-VAL-ILE-GLY-

ASN-ASN-LEU-PRO-[SER]-ARG-[SER]-ASP-VAL-

VAL-GLU

33kD多肽：

NH2-ILE-GLY-VAL-X-TYR-GLY-VAL-ILE-GLY-

ASN-ASN-LEU-PRO-SER

以上列出的三个序列都与葡聚糖内-1，3-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.39) 具有显著的同源性。

33kD多肽：

NH2-GLU-GLN-X-GLY-SER-GLN-ALA-GLY-GLY-

ALA-THR-X-PRO-ASN-ASN-LEU-LEU-

FASTA检索表明，这一序列与类橡胶树的橡胶蛋白中一段16个 氨基酸的重叠区具有81％的同源性。该序列同时也与从水稻和烟草 中分离出来的内源几丁质酶(EC3.2.1.14)中一段16个氨基酸的重 叠区具有88％的同源性，还与从小麦中分离的凝集素(又称异血凝 素11)中的一段14个氨基酸的重叠区具有92％的同源性。

象类西非竹芋精蛋白(TLP)，葡聚糖酶和几丁质酶这样的蛋白 质都是人们所知的与致病机理有关的蛋白质，因为它们是病原体大 批滋生的植物中累积。现在我们可以证明，类西非竹芋精蛋白(TLP)， 类葡聚糖酶蛋白(GLP)和类几丁质酶蛋白(CLP)在冰冻耐受性植 物的冷驯化期间产生，并展现抗冻活性。除我们的工作外，其他的 科学文献未见有报道低温可以诱导与致病机理相关的蛋白质产生， 未见报道低温诱导的致病机理相关蛋白表现出抗冻活性，亦未见报 道低温诱导蛋白质或低温诱导基因的产品展现抗冻活性。 实施例15：胞外提取液的葡聚糖酶和几丁质酶活性

用20mM氯化钙和10mM抗坏血酸组成的pH3.5的提取剂抽提 冬裸麦叶，获得胞外提取液。通过用二硝基水杨酸试剂测定从海带 多糖中释放的葡萄糖来测定胞外提取液中β-1，3-葡聚糖酶活性(II- 1.0)。在我们的实验中，葡聚糖酶测定在如下条件下最为理想：pH3.5， 1％海带多糖，CaCl2(与MgCl2或MnCl2相对立)，5℃，以及测定470nm 的吸光率。在粗胞外提取液中，β-1，3-葡聚糖酶活性大约为312毫克 葡萄糖当量每毫克总蛋白每小时。当采用羧甲基纤维素作底物时， 提取液不表现β-1，4-葡聚糖酶活性。

在5℃短昼长下生长的冬裸麦叶的粗胞外提取液中，内源几丁质 酶活性(I-10.1)为每克鲜重每小时释放115纳摩尔氨基葡萄糖，而 外源几丁质酶活性则为每克鲜重每小时释放9纳摩尔氨基葡萄糖。 在20℃下生长的裸麦植株则表现每克鲜重每小时释放出34纳摩尔氨 基葡萄糖的内源几丁质酶活性和每克鲜重每小时释放不到3纳摩尔 氨基葡萄糖的外源几丁质酶活性。 实施例16：对细胞悬浮液冰晶成核活性的表征

分别将20℃和5℃的冬裸麦叶组织用果胶酶降解，然后用密度梯 度法纯化，以获得单个叶肉细胞的悬浮液。为对冬裸麦中存在的冰 晶核原进行定量，用小滴技术对经系列稀释的单细胞悬浮液进行冰 晶成核活性测定。对从20℃叶和从5℃叶分离出来的叶肉细胞来说， 平均冰晶成核起始没有显著的差别，均为-7.3℃(表IV和表V)。

在不同条件下生长的植物叶中冰晶核原成分，是通过将单个细胞 在已知能够影响蛋白质、巯基和与蛋白质相连的二硫键、碳水化合 物和磷脂(表IV)的化合物和酶存在下保温的方法来确定。将细胞 用3M尿素处理并加热到90℃使蛋白质变性后，冰晶成核活性明显 下降。非特异性蛋白酶(链霉蛋白酶E和蛋白酶K)也使冰晶成核 活性降低。由此可见，与冬裸麦叶肉细胞相关的冰晶核原具有蛋白 质的成分。二硫苏糖醇对二硫键的还原和N-乙基马来酰亚胺与游离 巯基的反应也降低冰晶成核活性，表明蛋白质的结构对冰晶成核活 性的产生是重要的。硼酸和高碘酸两者都能与碳水化合物反应，而 两种化合物都能使冰晶成核活性降低，这也证明冰晶核原同样含有 碳水化合物成分。最后，磷脂酶C由于能释放磷酸基和磷脂的头部， 同样也能降低冰晶成核活性。综合以上结果表明，与冬裸麦叶肉细 胞有关的冰晶核原具有蛋白质、碳水化合物和磷脂成分。由于游离 多肽的冰晶成核活性发生在植物组织的胞间空隙中，它在细胞悬浮 液实验中的表现说明冰晶成核蛋白可能被束缚于细胞壁上，并被还 原二硫键的试剂所释放。 实施例17：具有抗冻活性多肽的抗体

对存在于冷强化的冬裸麦叶胞外提取液中的多肽制备单克隆和多 克隆抗体。用SDS-PAGE分离和从凝胶中电洗提(用经生物放射预 备的细胞)的单独的多肽用作抗原。将抗体纯化，用于多肽的免疫 纯化，以确定每一多肽的冰晶成核活性、抗冻性以及藕节它们葡聚 糖酶或几丁质酶活性。此外，这些抗体用于多肽的免疫测定。抗体 的制备及纯化，抗原的免疫纯化，以及免疫测定的操作步骤按Harlow 和Lane的详尽描述(II-8.1)。这些多肽的检测和定量可用于选择为 减少低温引起的植物冻伤和产量降低而设计的程序。以前对程序的 选择依赖于越冬作物在冬季的生存，以增加对霜冻的耐受性，这些 程序是不成功的。免疫测定因为具有高度敏感性，因而为选择含有 高浓度的与防冻(AFP的存在和冰晶核原的不存在)抑或耐冻(冰 晶成核蛋白、抗冻蛋白和葡聚糖酶蛋白的存在)有关的植物提供了 一种非伤害性的方法。抗体也可用于其它植物中抗冻蛋白质的鉴定 和分离。此外，这些抗体也可通过与AFP结合来增加其抗冻活性。 实施例18：粗提取液和不同植物器官中的抗冻结活性

将冷驯化冬裸麦的叶、冠和根分开。将植物的这些器官装入塑料 袋中，在液氮中冷冻并在室温下解冻。然后将这些植物组织经压榨、 过滤和离心处理，以获得可溶性组分。测定这些组分调控冰晶生长 的能力。在抗冻活性测定中，叶、冠和根部的可溶性组分均表现出 六边形双棱锥的形成。这些结果表明，抗冻活性不但存在于粗提取 液中，而且这一活性存在于植物的所有部位。 实施例19：具有抗冻活性的不同植物种和变种

十六个不同的植物种或变种，既包括单子叶植物又包括双子叶植 物(见表IV)在5/2℃(目温/夜温)和16小时昼长下生长。所有这 十六种植物的叶分别用真空抽提法提取，然后离心法分离，采用20mM CaCl2和10mM抗坏血酸，pH3.5的溶液。尽管在变种和种之间程度 有所不同，但所有这十六种胞间提取液都表现出调节冰晶生长的正 常模式的能力。在实验的植物中，冬裸麦(Secale cereale cv. Musketeer)，玉黍螺(Vinca minor)，冬小麦(Triticum aestivum cv.Karat and Ruby)和冬大麦(Hordeum vulgrare cv.Acton)提取物通过形成 六边形双棱锥冰晶来表现出对冰晶生长的最大影响，而冬canola (Brassica napus cv.Ceres)提取液对冰晶生长的影响最小，只形成 六边形的碟状冰晶。

正如对这些多肽进一步的描述所证明的那样，至少11种多肽是 在非冰冻低温下合成，也就是图9第4道和图10的那些多肽，分子 量从5kD到36kD，以及60，68kD，93到99kD和16kD的附加多肽。 我们已经证明，其中的六种多肽，包括两种葡聚糖酶，两种几丁质 酶和两种类西非竹芋精蛋白质，具有出人意料的抗冻性。同时这些 多肽也与本发明的其它多肽一样，在很低的浓度下呈现抑制再结晶 的活性。

重要的是关注图3的这些结果，特别是时程实验中的裸麦叶胞间 蛋白在冷驯化过程中的变化。在霜冻的严重性和胞间多肽的增加之 间存在一种相关性。胞外多肽的含量在第78天达到最高峰，这与裸 麦植株在8小时昼长下的冷驯化进入最严酷的阶段相对应。在萌芽 后的第102天，大多数的胞外多肽降低了浓度，而余下的则再也检 测不到。这一结果表明当植物春化时失去其冰冻耐受性。冰晶成核 活性也在表V中显现，其水平高达-7℃。这相信是对高等植物蛋白 质性质中与冰晶核有关的性质的首次报道。也有迹象似乎表明，在 装配供冰晶生长的模板过程中需要一些冰晶成核分子。可以理解， 胞间空隙中的冰晶成核蛋白对于冷驯化叶中冰冻耐受性的发展是重 要的。

关于如上所述而分离出来并与符合发明的描述的多肽已确立明确 的结论，即植物对霜冻耐受的这一优点，是依靠冰晶成核作用和对 冰晶的调节这两方面的抗冻结机制结合来实现的。这些胞外蛋白同 样具有抗真菌活性并提供对低温病原体如真菌和细菌的抵抗力。已 经得到证明的是，冷驯化的冬裸麦叶即使当首次降温达到-12℃时也 不会因结冰而受到伤害，而非驯化冬裸麦叶只要一结冰就受到伤害。 同时，根据本发明，胞间空隙中冰的形成表明，AFP的存在并非并 非决定冰冻条件下细胞生存的低温极限的唯一因素。随着温度的降 低，细胞内的水分因为细胞间冰块的形成而丧失，从而造成细胞本 身的脱水。因此，霜冻耐受型植物的低温生存极限也与细胞对干燥 的耐受程度有关(II-16，II-18)。

传统的栽培程序无法改善作物的抗冻性，是因为缺乏特异性的生 理标记(II-2)。正如本发明所证实的那样，冰晶核原和冰冻耐受性 植物产生固有AFP的发现，标志着农业上的重大突破。这主要有两 个原因。首先，冰晶核原和AFP是第一次被证明直接参与影响植物 体内冰的形成过程的多肽，因而抗冻结和冰晶成核多肽可以被证明 为增加越冬作物成活率的选择标记。其次，随着冰晶核原和AFP的 进一步分离和描述，它们将用于生产更高成活率和更高产量的转基 因植物。到将来，作物在因低温冰冻的限制而不能栽种的地区和季 节生长将成为可能。

正如已经表述的那样，也可用于生产冷冻食品以及生物组织的低 温贮藏。用这些多肽处理冷冻食品，可以确保食品在解冻后保持优 良的质量。同样，不论是生产冰淇淋这样的产品还是低温保藏生物 组织，都需要更小的冰晶结构。AFP限制冰晶的大小和阻止冰再结 晶的特性对于提供优良产品和减少贮藏损耗都是非常有用的。正如 实施例中所证明的那样，多肽在这些生物材料和食物成分中的用量 是很小的。例如，在生物材料和食品中的每升含水量中加入象25微 克这样小量的多肽就会产生效果。 冷驯化草本植物这的抗冻活性 实施例20：不同植物中的抗冻活性

将冬裸麦(Secale cereale L.cv.Voima)、春裸麦(S.Cereale L.cv.Jo 02)、冬小麦(Triticum aestivum L.cv.Ruby)和春大麦(T.Aestivum L. cv.Katepwa)种植于粗蛭石中，在20/16℃(昼/夜)、16小时昼长下 生长，用经改进的Hoagland溶液(III-34)每周浇灌一次。7天后， 或将这些植物收获以提供非驯化的植物组织，或转移到低温(5/2℃) 和8小时昼长下进行7周的冷驯化。将春燕麦(Avena sativa L.cv. Ogle)、冬canola(Brassica napus cv.Ceres)、羽衣甘蓝(B.Oleracea var. acephala cv.Dwarf兰色卷曲)和烟草(Nicotiana tabacum L.)种植 于Pro-Mix中并在23℃和16小时昼长下生长，直到长到够大，以便 提供足够多的叶用于实验。然后，或将这些植物收获以提供非驯化 的植物组织，或在上文描述的条件下冷驯化7周。

分别用冬大麦、冬小麦和春小麦、冬裸麦和春裸麦、春燕麦、菠 菜、冬canola和春canola，以及羽衣甘蓝的叶的胞外提取液做抗冻 活性测定(图15)。在所有的非驯化植物中都检测不到抗冻活性，它 们的胞外提取液中只形成平而圆的冰晶(图15)。经过冷驯化后，所 有的春冬谷类的叶都耐受低温，耐受的温度范围从-10℃到-27℃，而 且全都表现出抗冰冻活性。抗冻活性在经冷驯化的冬裸麦、冬小麦、 冬大麦、春裸麦、春小麦以及春燕麦、冬canola和羽衣甘蓝中检测 到。因此，抗冻活性存在于本次实验所检测的所有耐冻的单子叶植 物叶的胞外提取液中，它们包括实验中所检测的所有禾本科植物(冬 裸麦、冬小麦、冬大麦、春裸麦、春小麦)(图15，表1)。

在冷驯化的双子叶植物冬canola和羽衣甘蓝中也检测到低水平 的抗冻活性(图15)。Duman和Olsen(III-11)还在羽衣甘蓝叶的全 提取液中检测到了高水平的热滞后现象，而我们只是对胞外提取液 进行检测。羽衣甘蓝的某些抗冻活性有可能存在于细胞内。最先得 到鉴定的胞内AFP是在冬季比目鱼的皮肤中(III-15)，它被认为能 够防止外界的冰接种到表皮细胞上。对我们在羽衣甘蓝中检测到低 的抗冻活性的另一种解释，是与发育阶段或环境因素有关。Urrutia 等(III-52)在十字花科的其它成员，包括Brassica oleracea的亚种如 卷心菜和Brussel的苗芽中检测到热滞后活性，但必须在5℃下冷驯 化4个月。此外，还发现Brassica napus只有在经暴露于轻微的冰冻 条件下之后(III-27)才表现出更强的耐冻性。因此，越冬的双子叶 植物产生AFP的条件，可能是必需暴露于轻微的霜冻中。烟草中检 测不到抗冻活性，即便经过冷驯化也是如此。 表1.12种草本植物在5/2℃和8小时昼长下冷驯化后的耐冻性 (LT50，半数致死温度)。LT50(℃)依据传导性而确定，是取至少 三个独立冷驯化样品的平均值±标准偏差。 单子叶植物      LT50(℃)       双子叶植物        LT50(℃) 冬裸麦          -27±1.0       菠菜              -17.3±1.3 冬小麦          -19.5±1.7     冬canola          -16.0±1.2 春小麦          -15.0±0.6     羽衣甘蓝          -14.7±0.7 冬大麦          -14.7±1.3     春canola          -14.0±0.0 春裸麦          -14.0±1.6     烟草              ＞1 春燕麦          -10.3±0.5 玉米            ＞-2 实施例21：在不同植物中胞外蛋白的累积

我们对不同植物的胞外蛋白在低温下的累积进行了定量。将谷类 植物的叶切成3cm的小段，进行胞外蛋白的抽提，按照Hon等(III- 22)的操作步骤。阔叶植物的叶则切成规格相等(3cm×1cm)的小 片其它操作按照与谷类植物类似的步骤进行。通过真空抽提的方法 用20mM抗坏血酸和20mM氯化钙(pH3)提取30分钟，然后离心。 以BSA为标准，用经Bio-Rad Laboratoties Ltd.，Mississauga，ON， Canada改进的Bradford(1976年)蛋白质测定法进行蛋白质浓度的测 定，每个样品做三次独立重复。这些实验的结果表明，低温下蛋白 质在非原质体中的累积普遍发生于单子叶植物(图16)。在耐冻的双 子叶植物中同样有小量胞外蛋白的累积(图16)。 实施例22：在不同的冷驯化植物中AFP的免疫测定

将冷驯化期间累积的胞外蛋白浓缩，并用SDS-PAGE检测。为 对AFP进行免疫检测的需要，采用预先制备的对三类Musketeer裸 麦AFP(III-2)抗血清来探测胞外多肽的印迹。这三种抗血清分别特 异性地作用于35和32kD GLP，35和28kD CLP，以及25和16kD TLP。 这三种多肽都在冷驯化的Musketeer裸麦叶(III-2)胞外提取液中显 示抗冻活性。

将等量经提取的胞外蛋白按照Laemmli(1970年)的方法，在 15％SDS聚丙烯酰胺凝胶中分离。用超滤法将稀的提取液浓缩，并将 对这些多肽进行电泳和染色，染色用考马斯亮蓝或银染色法(Bio- Rad)。为免疫印迹法测定的需要，按照制造商的指示使用微型转移- 印迹槽(Bio-Rad)将蛋白质转移到0.45-m硝基纤维素膜上。印迹在 25mM Tris-HCl(pH7.6)，140mM NaCl，0.01％(v/v)Tween 20和5％脱 脂奶粉的缓冲液中成块。抗冬裸麦GLP和TLP的抗血清在1∶10000 的稀释度下使用，而抗冬裸麦CLP的抗血清按1∶1000稀释并保温过 夜，如Antikainen等所述(1996年)。免疫反应通过碱性磷酸酶结合 的山羊抗兔IgG(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)以5-溴-4- 氯-3-吲哚磷酸-甲苯胺盐(BCIP；Sigma)和硝基蓝四唑(NBT；Sigma)为 底物而检测。冬裸麦cv.Musketeer的胞外蛋白经分离和转移，作为 所有免疫印迹的正对照。只要正对照在背景下清晰可辨，印迹就可 以继续展开。

所有三种AFP(即GLP，GLP和TLP)都在Musketeer冬裸麦、 Voima冬裸麦、春裸麦、冬小麦、春小麦和春大麦的胞外提取液中用 免疫方法检测到，但燕麦中检测不到(图17，18)。这些AFP在经 检测的禾本科小麦属植物的所有成员中发现(III-6)。在双子叶植物 中，抗-TLP血清是唯一从冷驯化的菠菜中检测到胞外多肽(分子量 为25kD)的血清(图19D)。有一种可能，是因为从冬裸麦多肽产生 的抗血清与双子叶植物的多肽不产生交叉反应。

冷特异性小麦蛋白WCS 120的分布与冷诱导AFP相似但不完全 相同(III-24)。WCS120在冬小麦、冬裸麦和冬大麦中发现，但在燕 麦或低温敏感性的玉米和水稻，抑或在低温耐受性的双子叶植物如 冬canola中都检测不到(III-24)。 实施例23：胞外糖类对调节细胞间冰晶生长的作用

植物同样可以用分泌的糖类来调节细胞间冰晶的生长。我们用蒽 酮实验检测所有非驯化和完全冷驯化植物胞外提取液中糖的浓度(图 20)。由于胞外提取物要受到浓硫酸的水解，因此这一实验可能既测 定了提取液中的单糖，又测定了因多糖和糖蛋白水解而释放的单糖。 通过在5％的显著度下的t检验，我们发现，冬裸麦、春燕麦、冬大 麦和冬小麦在冷驯化后胞外糖类显著增加(图20A)。在春小麦或春 裸麦中则观测到胞外糖类发生了较小的变化。而在玉米中，胞外糖 类水平在冷诱导下的增加则不呈现统计意义上的显著。我们的结果 证明，在非原质体中累积糖类的同一植物通常也累积AFP(图16， 图17，图18和图20)。这些结果表明，胞外糖类的累积在调节冰的 形成上冰不能代替AFP。相反，更有可能的情况是，这些糖类增强 了冷驯化植物组织的抗冻活性。冬裸麦的胞外糖类在冷驯化期间的 累积在前人的研究中也曾被发现过(III-37，III-38，III-39)，但早期 研究所检测的糖类是更大的多聚糖，被认定为阿拉伯糖基木聚糖 (III-29)。

为减少抗冻蛋白发生效用所需的用量，或为增强或补足抗冻蛋白 的抗冻活性，在抗冻蛋白中加入糖类是有用的。为达到使用一种或 多种抗冻蛋白所达到的同样目的，使用一种或多种类型的糖类与一 种或多种抗冻蛋白的配方也是有效的。合适的糖类包括果糖，葡萄 糖，蔗糖或果聚糖(多聚果糖)。例如，为增强抗冻蛋白的活性，可 在将一种或多种抗冻蛋白加入冰淇淋之前、之后或在加入抗冻蛋白 的同时将果糖或其它糖加入冰淇淋中。 实施例24：用加热的方法纯化冬裸麦抗冻蛋白

为简化AFP的纯化过程，对冬裸麦AFP的热稳定性进行了测定。 冬裸麦和冬小麦在在低温下生长，如实施例1所述。全叶组织提取 液的获得，是用含20mM抗坏血酸和20mM CaCl2的水性缓冲液，或 用含20mM重碳酸铵的缓冲液与叶和/或冠组织匀浆，而胞外提取液 则按照实施例1所述的程序而获得。将全叶组织和胞外提取液加热 到60℃持续30分钟，或加热到100℃持续10分钟，离心除去变性 蛋白质和微粒物质。不论在加热前还是加热后，用观测对冰晶的调 节来测定抗冻活性，都发现冬小麦和冬裸麦的全叶组织提取液和胞 外提取液的上层清液在pH3到pH8的范围内存在抗冻活性。用SDS- PAGE检测经加热的提取液，显示类葡聚糖酶蛋白和类西非竹芋精蛋 白在加热后仍然可溶(图26)。这一简化纯化过程的技术对重组蛋白 也有效。这一技术对本申请书所描述的其它多肽或多肽片段同样有 用。

本发明从植物材料或重组表达系统中分离抗冻蛋白的方法，该方 法包括将可溶性提取物加热到至少60℃左右，然后将经加热的提取 液离心或过滤，以除去变性的蛋白质和不溶性物质。 类几丁质酶AFP的DNA分离和蛋白质序列(CH-9和CH-46) 实施例25：类几丁质酶AFP的cDNA分离

本研究的目的，是分离几丁质酶的cDNA，并确定那些DNA编 码了类几丁质酶AFP。那些熟练这一技术的人相信，克隆具有抗冻 活性的几丁质酶是困难的，因为植物基因组本身含有编码几丁质酶 的基因族。同样有人认为，在某些场合下，只需对一个蛋白质作很 小的修饰，就可以对该蛋白赋予抗冻活性，因此很难将不具备抗冻 活性的几丁质酶同具备抗冻活性的几丁质酶区分开来。例如，KV Ewart等(1998，Biochemistry 37：4080-4085)展示，在鱼的C-型外源 凝集素中将其中一段Glu-Pro-Asn改变为Glu-Pro-Asp，就将该蛋白 赋予了抗冻活性。通过从在使得只有具备抗冻活性的几丁质酶才能 够表达的条件下，亦即，低温而无病原体或其它压力的条件下生长 的裸麦植株中分离mRNA的方法，我们得以克隆带有抗冻活性的几 丁质酶。冷诱导几丁质酶的cDNA被分离然后分类，以确定哪一段 cDNA编码了对冰晶具有调节能力的蛋白。熟练于这一技术的同行将 会发现，还可用其它的方法来克隆编码裸麦AFP的基因。 25冬裸麦基因组DNA的Southern印迹分析

对裸麦基因组DNA进行Southern印迹分析，以估计裸麦基因组 中存在多少个几丁质酶基因，从而知道可能分离出多少个克隆。基 因组DNA按照改进后的方法提取(III-42)。从8日龄的裸麦植株中 采集叶和冠组织，在液氮中冷冻，用研钵研成粉末。将经上述处理 的植物组织加入到5mL 60℃的抽提缓冲液(100mM Tris，1.4M NaCl， 20mM EDTA，pH 8.0，2％(w/v)CTAB，使用前加入0.3％(v/v)2-巯基乙 醇)中，并加入50mg PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。该溶液在60℃下保 温并振荡1小时，冷却至室温，用6mL氯仿∶辛醇(24∶1)萃取。经 3000rpm离心20分钟后，上层液再次用6mL氯仿∶辛醇(24∶1)萃 取。加入0.5倍体积的5M NaCl和2倍体积的95％EtOH，先在4℃ 下保温30分钟，然后在-20℃下保温10分钟，以沉降DNA。经离心 后，沉淀物用70％EtOH洗涤两次，干燥后用TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.0，0.1mM EDTA)再次悬浮。DNA用核糖核酸酶A和 蛋白酶K处理，用苯酚∶氯仿∶IAA(25∶24∶1)萃取两次，并在20℃下 用0.1倍体积的3M NaOAc，pH 5.2和2倍体积的100％EtOH沉降。 经离心后，沉淀物用70％EtOH洗涤两次，干燥并在200μL TE中 再次悬浮。

从8日龄非驯化冬裸麦叶和冠组织中提取的全部DNA用Bam HI， Eco RI，Hind III，Xba I或Xho I限制性内切酶消化。断片用琼脂糖凝 胶电泳分离，并转移到尼龙膜上。采用一种已知的可由病原体诱导 的基本大麦几丁质酶cDNA，即pHvch2a，用于鉴别几丁质酶基因。 将膜与pHvcht2a在两种不同的严格控制条件下杂交：30％或50％甲 酰胺，42℃，6×SSC，并在42℃下洗至0.2×SSC和0.1％ SDS，然 后用放射自显影胶片曝光(图3B)。在高严格条件(50％甲酰胺)下 至少存在三个基因，因为在Eco RI，Hind III和Xba I道上都有三个 DNA断片同pHvch2a探针杂交。高严格条件下有两条带出现在Bam HI道。在低严格条件杂交中，显然还多出两个基因，因为在Eco RI 道出现五条带。五个DNA断片杂交到探针上，其中三条非常模糊。 相似地，在Xba I和Hind III道至少出现两条额外的带。 25.1冷驯化冬裸麦cDNA文库的筛选

将已知的可由病原体诱导的基本大麦几丁质酶cDNA，即 pHvch2a，用于筛选冷驯化冬裸麦的cDNA文库。PHvch2a的序列是 插入pBluescript SK+的Eco RI位点中的一段1028bp。Eco RI用于分 离用作探针的断片。用作探针的断片的大小为915bp，因为插入者 在靠近cDNA的3′端有一个Eco RI限制性位点。PHvcn2a编码一个 几丁质酶，该几丁质酶具有高度保藏的几丁质酶催化功能区，但缺 失几丁质捆绑功能区。由于大麦也是单子叶植物，而且与裸麦是近 亲(III-6)，因此可以想象，大麦和裸麦的几丁质酶或许具有非常相 似的核苷顺序。

在筛选文库前，用Northern印迹分析法确定pHvcht2a是否适合 于筛选文库和检测所有的裸麦几丁质酶。全RNA从非驯化和冷驯化 裸麦叶中分离，并在变性甲醛琼脂糖凝胶中进行凝胶电泳分离，然 后转移到尼龙膜上。将膜同pHvcht2a在高严格条件(50％甲酰胺，6 ×SSC，42℃)下杂交，并在42℃下洗至0.2×SSC和0.1％ SDS。 印迹曝光到放射自显影胶片上，显示出杂交到探针上的mRNA。大 小分别为1.25kb和1.00kb的两种不同的几丁质酶mRNA得到识别。 另一大约3.7kb大小的转录本也杂交到pHvcht2a上，但这可能是因 为与探针的非特异性结合。1.25和1.00kb的转录本分别与依据35 和26kD类几丁质酶AFP所预测的转录本大小相符合。pHvcht2a探 针用于筛选从冷驯化裸麦叶分离的多聚A+RNA得到的λZap-cDNA 文库，以识别全长度几丁质酶cDNA，如下文所述。

用前文所述(III-33)的经改进的方法从组织中提取全RNA。将 液氮冷冻的植物组织在研钵中研磨。将Z6缓冲液(8M盐酸胍，20Mm MES pH 7.0，20mM EDTA)和200μL的2-巯基乙醇加入到在冷冻 条件下进一步均质化的植物组织中。将这一浆状物与1倍体积的苯 酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混和以提取蛋白质。经8000×g离心15分钟， 上层清液再次用1倍体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇提取，与1倍体积的异 丙醇和0.1倍体积的3M NaOAc pH 5.2混合，并在-20℃保温2小时 以沉降RNA。将溶液在8000×g下离心45分钟，使RNA沉降。将 沉淀物用70％EtOH洗涤2次，干燥后在经DEPC处理的水中再次 悬浮。RNA用8M LiCl在20℃下沉降析出。在8000rpm下离心45 分钟，使RNA沉淀，并用70％EtOH洗涤两次。将沉淀物干燥，在 经DEPC处理的水中再次悬浮。用PolyATtract mRNA分离系统 (Promega，Madison，WI，USA)将多聚A+mRNA从全RNA中分离 出来。

用λZap-cDNAGigapack克隆试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA， USA)将多聚A+RNA制成cDNA文库。将膜在含有6×SSC，0.5％(w/v) SDS，50％甲酰胺，5×Denhardt氏溶液(1×Denhardt氏溶液是 0.02％(w/v)Ficoll，0.02％(w/v)PVP，0.02％(w/v)BSA)和100mg mL-1 剪切变性的鲑鱼精子DNA的50％甲酰胺溶液中于42℃下进行至少 小时的预杂交。用大麦几丁质酶cDNA探针在42℃下杂交过夜。探 针由Tomas Bryngelsson博士(瑞典农业科技大学，Svalov，Sweden) 提供，用32P-dCTP作标记，随机装填至大约1×108至2×108cpm μ g-1DNA。杂交液的成分与预杂交时一样，只是不用鲑鱼精子，而用 新鲜的变性标记探针添加到1×106cpm mL-1浓度。在42℃保温过夜 后，在42℃下将膜洗到从1×SSC和0.1(v/v)SDS至0.2×SSC和 0.1(v/v)SDS的不同严格条件，历时30分钟。大约92700个克隆 得到筛选，89个阳性区被识别。在第二轮筛选中，从阳性区回收噬 菌体并分成17组。E.coli细胞用经分组的噬菌体再感染，重新涂平 板，转移到硝基纤维素膜上，用pHvcht2a再筛选。识别出四十八个 推定的克隆，并通过体内切除从噬菌体中重组到pBluescript SK-质粒 上。这些克隆用重组质粒pCHT-1至pCHT-48表示。 25.2推定克隆的分组 25.2.1 Pvu II限制性酶消化和G-轨迹分析

Pvu II限制性酶消化可让重新构建的pBluescript质粒释放出插入 片段，以决定插入片段的大小。pBluescriptr质粒有2个Pvu II酶切 位点，相距445bp，侧翼有多个克隆位点。酶消化释放出插入片段， 并将450bp结合在实际大小的插入片段。在琼脂凝胶上质粒大小为 2500bp，插入片段显示为另一带。若插入片段本身含有任何的Pvu II 限制位点，那么总体上应有二条或更多的带出现，即2500bp代表质 粒，其它带为插入片段总的大小。消化克隆的琼脂凝胶电泳显示不 同的插入片段大小为350-2655bp之间。一些克隆显示相同的带型， 根据Pvu II限制性酶切模式可首先将这些克隆分组。消化后有17类 别具有相似的带。很明显，由含31个克隆的10个类别的插入片段 大于950bp，而含17克隆的7个类别插入片段小于950bp。估计用 于36KD和26KD类几丁质酶AFP全长转录使用pHvcht2a的Northern 印迹杂交资料的插入片段长度最小为950bp。 G-轨迹分析可决定那些克隆是相同的因而为富余克隆。对每个克隆 以T3和T7序列为引物进行桑格序列分析的G反应，再进行聚丙烯 酰胺凝胶电泳分离，以引物基因组的每个克隆进行带型对照，确定 哪些相同。G-轨迹分析可获得一些序列资料并指示相同的克隆。实 验显示有9个克隆的8个类别相互克隆不匹配。 25.2.2 pHvcht2a杂交

将酶消化物经凝胶电泳分离，转移DNA到尼龙膜上，在严格控 制条件下(6×SSC，50％的甲酰胺，42℃)以pHvcht2a为探针杂交 后高严格控制条件(0.2×SSC，0.1％ SDS，55℃)冲洗，决定假阳 性DNA克隆(图6B)。实验显示有9个克隆未和pHvcht2a重新杂 交。这些克隆是PCHT-10，-13，-17，-18，-19，-28，-32，-38和-39， 这些基因可能不是几丁质酶cDNA。 25.2.3纯化的几丁质酶cDNA的序列分析。

首先进行的序列分析是那些在pvuII限制酶切资料中具有全长序 列的克隆，即选择那些插入序列大于950bp的克隆。对这些克隆首 先进行以下T3和T7通用引物的杂交分析，在此基础上可采取一些 序列分析策略以获得更详尽的序列资料。一些具有限制性酶切位点 的序列允许插入片段的部分从质粒中删除，而后，以T3或T7为引 物重新连结质粒测序以得到更多的序列信息。在一些情况下不可能 通过以上方法测序，还需要以序列资料来设计引物，继续进行测序。 PCHT9插入片段为N-末端氨基酸序列，和35KD类几丁质酶ATP的 N-末端序列(III-23)相同。PCHT46的插入片断也具有全长序列。 基因翻译产物和26KD的类几丁质酶AFP相同，且相对其它类别显 示有最长的5’非翻译区。估计基因翻译产物的N-末端氨基酸序列和 pHvcht2a的氨基酸序列非常相似。两种基因都具有ATG起始密码和 可读框(ORF)，以保证其氨基酸顺序和已知几丁质酶(顺序)一致。 25.2.4 CHT9特征分析

在加拿大多伦多大学的儿童医疗生物技术研究中心，根据多种构 建质粒和由初始的及不断增长的顺序资料设计引物，用ALFexpress DNA测序仪双向测定CHT9顺序，。cDNA带聚A尾，长度为1193bp。 可读框(ORF)包括编码318个氨基酸，由位于插入片段5’末端下 游的48bp蛋氨酸密码子开始到ATG启动密码子的955bp终止密码子 结束。估计基因产物的第一个氨基酸为谷氨酸，在可读框(ORF)的 21位点，和编码35KD类几丁质酶蛋白的N-末端核酸序列相同。估 计基因产物含301个氨基酸，分子量为31647Da，等电点为6.96。在 3’端有190bp的非编码区。cDNA的PSORT分析显示有一20个氨 基酸的信号序列和蛋白质向细胞外转移有关(图21(c)。本发明也 包括一些突变体，这些突变体是和信号顺序(或编码核酸分子)生 物功能相同的肽、多肽及蛋白质，显示了相似或相同的信号靶活力。 有关抗冻多肽的突变体讨论将在以下涉及到信号序列本身的不同。 这一信号序列可容易地结合到除抗冻多肽以外的多肽上以激活它们 向细胞外的转移。本发明还包含有通过重组DNA将肽、多肽或蛋白 质转移到细胞外的方法，采用蛋白质分析或其它技术将产生的多肽、 肽或蛋白质固定在信号序列(或相同生物功能序列)上，将多肽、 肽或蛋白质转移到细胞外。 25.2.5 CHT46特征分析

已知有很多可用克隆能编码26KD的类几丁质酶AFP。通过 pharmacia T7 kit试剂盒对可能的克隆测序，以决定那些具有全长且 能编码26KD类几丁质酶AFP的克隆。利用T3和T7引物作用产生 的顺序排列信息，确定CHT46编码全长的几丁质酶及26KD类几丁 质酶AFP，及它的全部顺序(图22)。CHT46含有998bp大小的插 入片段，它有从启动252氨基酸的可读框(ORF)的ATG开始的78bp 下游。基因产物的分子量为26835Da，等电点为8.25。终止密码子 位于自ATG启动密码子开始的757bp位点，含有163bp为3’非翻 译区。PSORT分析也预测这种蛋白有一22个氨基酸的序列[图(d)]， 并被转移到细胞外。 25.2.6 CHT9和CHT46的序列对比

通过使用GCG顺序分析软件包的GAP研究表明，PCHT9和 PCHT46(图23)在核苷酸水平有62.1％的相同，氨基酸水平有58.6％ 的相同和63.3％的相似。同时，CHT46在核苷酸和氨基酸水平和 PHvcht2a较PCH9更为相似(两个水平都大于90％的相似)。A BLAST研究可用于每种克隆，以揭示和关系相近种类其它几丁质酶 的相似性分析。CHT9和中国春小麦几丁质酶高度同源(在核苷酸和 氨基酸水平高达90％以上的相似)。对比CHT9；CHT46及裸麦种子 几丁质酶，它们在核苷酸水平有82％相同，在氨基酸水平有86.6％相 似。而CHT46和裸麦种子几丁质酶在核酸水平仅为57.4％相同，氨 基酸水平为62.2％的相似。CHT9，CHT46，Hvcht2a，烟草几丁质酶 (x16939)，谷几丁质酶(D16223)；春麦几丁质酶(x76041)及裸 麦种子的2种几丁质酶的氨基酸序列非常保守(conserved)。我们 以前的结果显示烟草在低温条件(图16和19)并不累积细胞外AFP 酶或几丁质酶。尽管烟草和裸麦几丁质酶序列是高度保守的，但事 实是裸麦蛋白受低温诱导，显示抗冻活力而烟草蛋白是非低温诱导， 不显示抗冻活力。

根据图21和22的顺序设计cDNA探针来鉴定类几丁质酶AFP。 一种是404bp的探针(CH46bp)，由一段和CHT46的第340位核苷 酸到774位核苷酸的基因段相补的基因序列组成[图22(b)]。第二 种是404bp探针(ch9hp)，其序列和CHT9序列的以541位核苷酸开 始到第945位核苷酸结束的同源区互补[图21(a)]。这些探针的核 苷酸序列突变体(相同生物功能探针)同样是有益的。这些探针有 益于用以下方法鉴定相似的DNA，cDNA或RNA序列。将有疑问的 DNA或RNA转移到膜上，最好接着以50％甲酰胺，6×SSC，0.5％SDS， 5×Denhardt溶液(a×1溶液是0.02％W/V聚蔗糖，0.02％W/V PVP， 0.02％W/V BSA)和100kg/ml切割变性鲑鱼精子DNA条件下预杂 交，温度为42℃，有疑问的DNA或RNA可在同样条件下，以标记 的变性ch46p或标记的变性ch9hp代替鲑鱼精子DNA进行杂交。膜 最好于42℃下用0.2×SSC和0.1％SPS冲洗30分钟。

正如以下将要详细讨论的，来发明不仅包括裸麦类几丁质酶AFP (由图21和22所示的基因序列编码)，而且还含有相同生物功能活 力的肽，多肽和蛋白质，它们都显示出和裸麦ATPs相同或相似的抗 冻活力。本发明也包括一些和CHT9，CHT46，PCHT9或PCHT46 具有相同生物功能的核苷酸序列。 实施例26：几丁质酶CHT9和CHT46的表达分析 26.1在低温和非低温驯化叶的表达

分离非低温驯化和低温驯化叶子的总RNA含量。通过甲醛变性 琼脂糖凝胶电泳(图11A)，分离出RNA总量，显示为核糖体RNA 带。将RNA转移到尼龙膜上，后和CHT9、CHT46基因特异探针杂 交。根据两者不同的3’非翻译区分别设计两种探针。CHT9基因特 异探针为含有30个核苷酸寡核苷酸：CGAATAATGGTGCAATCCAT CGCAAGATGC。CHT46基因特异探针是长度为292bp的cDNA片 段，它包含转录子聚A尾 (TCGAGTGCGGCATGGGCCGGAACGACGCCAACGTCGACCGCAT CGGCTACTACACACGCTACTGCGGCATGCTTGGCACGGCCAGGG GGGGCAACTCGACTGCATCACCCAGCGAAACTTCGCTAGCTAGA CAGTGTATCTCACGTGTTATAAATAAATGGCAATGCATATGCCATC CCCGAATAAATAATTCAACATGTGACAGTTGATTTGTATGGTAAT ACGAGTAAGTTGTTGCAACAAATTATGAATATTGAATAAAATCAA ATTTTATCAAAAAAAAAAAAAAAAA)。

CHT9基因特异探针杂交产物为1.25kb转录物而CHT46基因特 异探针杂交物为1.0kb转录物。对于CHT46基因特异探针，应在高 严格控制条件(0.2×SSC，0.1％SDS，温度为65℃)下冲洗，以减少 探针的聚A尾引起的非特异结合。非驯化和冷驯化RNA的相对强度 由光密度来衡量。对于CHT9和CHT46，冷驯化叶子的强度分别较 非冷驯化叶的强度增加了2.5和1.3倍。 26.2冷驯化期间不同裸麦组织的表达

冷驯化期间对裸麦组织取样。于冷驯化期间的一周，三周，五周， 七周后分别对冠(分生或分裂组织)，新叶、老叶和根组织取样，以 非冷驯化条件生长了四周的植物组织为对照。当植物转移到冷驯化 条件下以后长出的叶子为新叶样本，在非冷驯化条件下，转移到冷 驯化条件以前已伸展的叶子为老叶样本。

抽提出样本组织的总RNA含量并以变性甲醛凝胶电泳(图13) 分析，后转移到尼龙膜上，用以上描述的CHT9和CHT46基因特异 探针进行Northern印迹分析。CHT9的杂交产物为1.25kb的转录物 (根组织除外)，这一转录物的信号强度在冷驯化一周后较低，但随 后不断增强，在驯化七周后达到最高；CHT46基因特异探针的杂交 产物为1.0kb的转录物，转录物的信号强度变化同上，即在冷驯化一 周后较低，但随后不断增强。CHT46探针杂交转录物存在于包括根 组织在内的所有组织样本。 26.3非驯化、冷驯化和驯化减少条件下在叶中的表达

为证实低温诱导是可逆转的，我们将裸麦植物置非驯化条件下一 周，后移入冷驯化条件七周，再转回到非冷驯化条件。以非冷驯化 条件下生长二周的植物作为对照。冷驯化期间的取样时间为6、12、 36小时和1、3、5、7周后，7周后将植物转移到非冷驯化条件下， 分别于6、12、30小时和9天后取样。分别从这些样本组织中抽提RNA 总量，以甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析带型，而后和基因特异探针 (见实施例26.1)杂交。对于CHT9基因特异探针，1.25kb的转录 物于冷驯化七周以后及转移到非驯化条件后的6、12小时才得到， 以后信号强度减弱，而在其它样本组织中无信号强度；而PCHT46 基因特异探针杂交物(在低控制条件下为1中kb的转录物出现于所 有的样本组织，其信号强度在低温强化条件下不断提高，而在植物 转移到非驯化条件后慢慢消失。这些结果证实CHT9和CHT46的表 达低温调节可逆转。 26.4水杨酸处理的叶中的表达

水杨酸能诱导编码抗真菌几丁质酶的基因表达。在冷驯化条件 下，对生长了二周的裸麦植物进行20ppm的水杨酸(溶解于0.5％Tween 液)喷雾，一天一次，连续8天。以未喷雾植物为对照，每天水杨 酸处理后一小时对植物叶组织取样以分离总RNA含量，以CHT46 基因特异探针的Northern印迹法(在低控制条件下冲洗)分析表达 情况。1kb和3.7kb的转录物存在于所有样本中(水杨酸处理或非处 理样本)，3.7kb的转录物可能是由于低控制条件冲洗造成的非特异 结合。开始，转录物的信号强度相似，水杨酸处理5和6天后，对 照样本的转录物信号强度高于水杨酸处理的植物样本转录物强度。 使用CHT9基因特异探针不产生任何阳性结果。以上结果显示CHT46 和CHT9的表达并非象抗真菌几丁质酶基因那样由相同的信号诱导。 实施例27：拟南芥(Arabidopsis thaliana)中CHT46和CHT9的超 级表达

将CHT9和CHT46克隆到pkylx7.1-35s2 Agrobacterinm temefaciecs相容性载体，通过电穿孔将载体转化到A.tumefacicn菌株 (C58PGV3850)中.真空抽滤使菌株导入拟南芥后，将获种子。对这些种 子进行卡那霉素抗性筛选，对T1植物进行插入片段数量分析。含有 两个CHT9或CHT46中任何一个插入片段的植物在T3代表纯合性。 通过基因特异探针的Northern印迹法(实施例25)和抗冻活力测定 证实类几丁质酶AFP的累积。抗冻活力能在实施例18所描述的粗抽 提物或实施例5描述的细胞外抽提物中加以测定。

DNA编码类几丁质酶AFP的超表达

“编码DNA”是指编码本发明中的冬裸麦AFP或其它AFP例 类几丁质酶AFP的蛋白质的染色体DNA，质粒DNA，cDNA或合 成DNA。本发明的编码DNA可导入微生物，植物或动物寄主。微 生物寄主包括藻、细菌、真菌和原生动物。导入寄主的编码DNA能 嵌入到微生物细胞核才细胞器的质粒、染色体中。超级表达是在通 常情况下不存在的重组蛋白的累积或较一般的内源基因有更高的表 达水平。 实施例28大肠杆菌(E.coli)中的CHT9的表达及类几丁质酶AFP 的分泌 28.1克隆CHT9到细菌表达载体

将CHT9基因插入到大肠杆菌((E coli)表达载体pET12a (Novagen，Madson，WI)的BamHI位点，以合成寡核苷酸5’- TTAAGGATCCGGAGCAGTGCGGCTCGCAGGC和5’-GGTTGGAT CCTGCGAACGGCCTCTGGTTGTA作为引物对CHT9进行PCR扩 增，在基因的开始和结尾产生BamHI酶切位点。用BamHI消化约 800bp PCR扩增片段，连接pET12a的单一BamHI位点。将连接混 合物转化入到DH52，涂布LB-氨苯青霉素(150kg/ml)平板，37℃ 培养。分析单个菌落的质粒，以发现含有按正确方向插入BamHI片 段的克隆，例如CHT9阅读方向和载体上的分泌信号方向相同。鉴 定菌落并命名为cht9/12a。为证实PCR-扩增的几丁质酶cDNA的DNA 序列，根据厂商指南(Pharmacia，Montreal，Quebec，Canada)使用T7 DNA 测序试剂盒，按照双脱氧核苷酸链终止法进行双链DNA测序。 28.2 ch9/12a重组质粒的表达

用QIAGEN DNA纯化试剂盒(QIAGEN Germany)从DH52细 胞中纯化虫ch9/12a的质粒DNA，后转化到来源于 Novagen(Madison，WI)的寄主BL-21(DE3)细胞，这些细胞含有质 粒嵌入的T7聚合酶以指导质粒编码基因的表达。为表达类几丁质酶 AFP，从新鲜的划线LB平板挑取单个菌落；接种于2ml LB/氨苄青 霉素培养液中于30℃振荡培养，过夜，后将1ml的过夜培养物接种 于含50ml LB/氨苄青霉素培养液的250ml烧瓶中振荡培养，温度为30 ℃，直到培养液的OD600达到0.4。再在培养液中加入IPTG(sigma) 直到其最终浓度为0.4mm，继续培养3小时，而后将培养液于4℃下 离心(转速为5000×g)5分钟，收获细胞。 28.3表达蛋白的纯化和分析

为纯化周质蛋白，将细菌沉淀重新悬浮于冰冷20％蔗糖，2.5mm EDTA，20mm tris-HCL PH8.0液中，直到其达到50D550单位/ml的 浓度并在冰上培养10分钟。将悬浮液离心(转速为1500×g)5分 钟，细菌沉淀重新以上操作，后再将悬浮液离心(转15000×g)10 分钟。上清液即为周质蛋白片段，运用SDS-PAGE和由裸麦类几丁 质酶AFP产生的抗血清免疫印迹法进一步分析(见实施例17)。

细菌表达载体pET12a含有ompT(外膜蛋白T)蛋白的前导序列。 在某些情况下，目的蛋白可被转移到细胞外空间。前导序列对于转 移到周质是必需的，但不是充分的。蛋白的转运也依赖于目的蛋白 的成熟区。从BL-21细胞获得周质部分的一个简单方法是渗透休克 方法。图24显示了细胞中用pEL12a/cha转化的细胞几丁酶的表达。 所有细胞获得的蛋白抽提物显示了约32Kda(列2.4)主要带，而在 对照组细胞中缺失(列1，3)。尽管周质部分含有表达蛋白，但表达 的类几丁质酶AFP的大多数存在于细胞内(资料未见)。为评估周质 部分中的类几丁质酶AFP是否有抗冻活力，将这些部分浓度提高到 1000倍，后通过观察冷冻过程中形成的冰晶形态来确定其抗冻活力。 结果显示这些片段具有抗冻活力，因为冰晶以垂直六位双金字塔形 式生长。重组蛋白同样显示有几丁质酶活力，这可由实施例15所描 述的方法测定。 实施例29：在Pichia pastoris中类几丁质酶AFP的表达和分泌 29.1具C-末端His/MYC标记的CHT基因

从Ivitrogen(San Diego，CA)购买Pichia表达载体，将CHT9 cDNA 插入到表达载体PGAPZA的EcoRI和Notl位点，以合成寡核苷酸5’ -AATTGAATTCGAGCAGTGCGGCTCGCAGGCC和5’-AATTGCG GCCGCTGCGAACGGCCTCTGGTTGTA为引物将CHT9进行PCR 扩谱，分别在cDNA的5’和3’端产生EcoRI和Notl位点。用Ecoli 和Notl消化扩增片段，和用相同限制性酶消花的PGAPZαA载体相 连。将连接混合物转化到DH52，涂布在低盐LB-Zeocin(25ug/ml)平 板，37℃培养。分析重组质粒鉴别有EcoRT/Notl片段嵌入酵母-因子 序列中的菌落并命名为pGAPZ/cht9。用以上提到的DNA序列分析 方法确定重组质粒的DNA序列。以His/MYC作为标记的策略有助 于产生活性几丁质酶和其它抗冻蛋白。因此本发明也包括纯化几丁 质酶和其它抗冻蛋白的一种方法。和His/MYC标记相似的标记也可 用于纯化。 29.2无C-末端标记的CHT9构建克隆

以合成的新寡核苷酸5’-TCTGGAGACTATGCGAACGGCCTCT TGGTT-3’，及以上已描述的5’-寡核苷酸作为引物，对CHT9进行 PCR反应，分别产生CHT9 5’和3’端EcoRI和Xbal位点。用EcoRI 和xbal消化扩增片段并和用相同限制酶消化的PGAP2A相连。这一 策略保证了由载体编码的带His/MYC标记的序列不会附着在CHT9 的C-末端。如以上方法选择和扩增重组质粒。阳性菌命名为pGAPZ αA/chtgc-tag)，它有助于提高重组蛋白的抗冻活力。 29.3 pGAPZαA/cht9和pGAPZαA/chtg(-tag)转化到Pichiax-33

使用大量DNA纯化试剂盒(QIAGEN Germany)纯化pGAPZα A/chtg和pGAPZαA/chtg(-tag)的质粒DNA。根据用户手册推荐 的参数进行电穿孔(Bio-Rad基因脉冲)将大约10ug的质粒DNA转 化到酵母细胞株x-33(Invitrogen)，将转化细胞于含100ug/ml Zeocin 的YPDS平板(1％酵母汁，2％D-葡萄糖，2M山梨糖醇，2％琼脂) 培养3天。在新鲜的YPS/Zeocin平板划线以获得单个菌落，更一步 纯化。分析8种抗Zeocin Picha转化子以获知CHT9 cDNA的存在。 分离出单个菌落的基因DNA并根据Pichia表达手册(invitrogen) 进行PCR扩增以确定插入片段的存在。选择在染色体插入有CHT9 cDNA的克隆进行表达分析。 29.4在Pichia中重组CHT的表达及类几丁质酶AFP分析

从一个重组菌落中挑取单个菌落接种于10ml的YPD培养基(1％ 酶母汁，2％胨，2％葡萄糖)，28-30℃振荡培养过夜，将约0.1ml的 夜培养液接种于含50mlYPD培养基的250ml烧瓶中继续培养2-3天。 在每一天结束时收集1ml培养液，离心，以SDS-PAGE和免疫印迹 法分析上清液和沉淀。

PGAPZαA(2.9kb)载体以GAP启动子组成性表达Pichia pastoris 中的重组蛋白。GAP是甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的启动 子，在包括Pichta pastoris 5很多有机体中都组成性表达。另外，这 种载体一编码啤酒酵母(Saccharomyces cererisisiae)α因子分泌信 号的N-末端肽，在某些情况下，能将外源蛋白转移到细胞外空间(上 清液)。图25a显示了酵母细胞的重组质粒的超级表达和分泌。酵母 培养上清液的蛋白质样本在SDS-PAGE分析中为-约32KD(列1，2) 的带。图25b显示了相同样本的免疫印迹分析。然而无论怎样，和 以上描述的细菌表达系统不同的是，在酵母中表达的大多数几丁质 AFP存在于上清液中(对比列1，2和3，4)，这说明分泌过程己基本 完成。经计算表达和分泌水平为每升培养液含50至100mg。Pichia pastoris很少分泌自身蛋白，所以说重组类几丁质酶AFP的成功分泌 使纯化和特征鉴定更加容易。 实施例30.PGAPZαA/chtg(-tag)的表达和分泌

为使获得的蛋白更加符合其天然形式，可选择构建一基因来消除 His/MYC标记和天然几丁质酶C-末端连接。对比和PGAPZαA/chtg 的表达和分泌水平，两者表达蛋白的SDS-PAGE和免疫印迹分析表 明重组类几丁质酶AFP酶具有抗冻活力，因在AFP液中形成了六体 体形冰晶。重组类几丁质酶AFP也显示几丁质酶活力，这已在实施 例15中加以描述。 实施例31：大肠杆菌(E.coli)中CHT46的表达

CHT46通过载体(见实施例27)在大肠杆菌(E.coli)中以融合 蛋白形式表达，其融合蛋白有一含6个组氨酸的前导链。以实施例27 描述方法准备并以Ni螯合物柱从溶菌产物中纯化重组蛋白，经过重 折叠(refolding)和His标记切除，成熟重组蛋白显示一定的抗冻活 力，因在重组AFP液中形成了六位体冰晶。 实施例32：抗冻活力的增强

位点选择性突变可进一步增强类几丁质酶AFP的抗冻活力。例 如通过这种途径(III32)可提高大西洋鲑(Ocean Pout)的活力。使用 蛋白模型分析和其它一些预测方法，我们确定AFP的冰结合区和其 它关键氨基酸残基可突变、嵌合或删除。通过U.S.E(独特位点消去) 突变试剂盒(pharmacia生物技术)或其它相似的商用突变试剂盒对 含有类几丁质酶AFP基因的DNA质粒表达载体进行研究。一旦DNA 序列分析确认发生突变，即可用任何一种表达系统进行突变蛋白的 表达及其抗冻蛋白活力测定。此途径不仅能提高蛋白抗冻活力，而 且有利于其它性状的功能区的操作，例如纯化蛋白质的应用或其生 物功能的添加等等。同时使合成基于几丁质酶样ATPs序列的DNA 片段成为可能，这些片段编码较少蛋白且更为容易表达。另外这也 可能修饰cDNA的表达，以便其表达可受环境条件所诱导，例如低 温、不同的化学诱导物或荷尔蒙等。再者通过修饰DNA序列，使蛋 白质可定位不同分布，所有的DNA序列的修饰见图21和22，并且 本发明还包含了由这些修饰序列表达的蛋白质。 实施例33：冬麦和春麦中抗冻蛋白的遗传

Cheyenne冬小麦(Triticum aesticum aestivum Lcv Cheyenne)，中 国春小麦(Triticum aesticum Lcv Chinese Spring)和21个染色体取 代品系的生长情况见实施例1。在每种染色体取代品系中，中国春小 麦的一对染色体被Cheyenn冬小麦的同源染色体所取代，而Cheyene 冬小麦具更强的低温忍受力。如实施例20和21中描述的从中国春 小麦、Cheyene冬小麦和21个染色体取代品种的叶中获得质外体抽 提物，对每种抽提物进行抗冻活力测定(见实施例5)，量化抽提物 中蛋白(见实施例21)，SDS-PAGE法分离，用由裸麦AFP产生的 抗血清免疫印迹分析，这些AFP和葡聚糖酶，几丁质酶及西非竹芋 精相似(见实施例22)。

冷驯化后，所有品种的叶质外体抽提液都显示抗冻活力，都有葡 聚糖酶，几丁质酶和类西非竹芋精AFP存在(chun et al 1998，Euphytica 102：219-226)每片叶子的质外体蛋白及抗冻活力水平和23种品种的 冬季存活时间呈正协同相关。染色体5B和5D携带了和更多的质外 体蛋白累积及更高抗冻活力相关的主要基因。 实施例34：真核细胞和原核细胞中AFP的表达产物

从cDNA文库中可获得本发明的DNA序列(也称核酸分子)， 如实施例25所描述的方法(基因DNA文库)。从其它来源也可得到 核苷酸分子，例如标记序列的表达分析或体外(ln vitro)合成。这里 应用的AFP编码DNA(含相同生物功能突变体)可导入多种真核和 原核寄主细胞并加以表达。AFP的重组核苷酸分子含有适用的可操 作联结的转录和翻译调节因子，由多种来源可获得适当的调节因子， 它们可被选择性地读取[Sambrook，J.，Fritsch，E.E & Maniatis，T(1989) 分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版社，纽约；Ausubel et al (1989)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&sons Inc.]。 例如，若要提高基因的表达，可通过插入有义序列和适当的启动子 于载体中。植物启动子可以是诱导性、组成性、环境和发育调节性 或细胞和组织特异性。转录过程也可通过一些已知技巧例如用超级 启动子(superpromoter)[Niet al(1995)Plant Journal 7：661-676]或菜花 嵌合病毒的35s启动子[Shah et al.(1986)Science 233：478-481]启动子 增强。

诱导启动子包括：a)干旱和ABA诱导启动子，含ABA-反应因 子[Ono et al.(1996)Plant physiol.112：483-491；Abe et al.(1997)Plant Cell 9：1859-1868]；b)热休克诱导启动子包括HSES(热休克因子)和CCAAT 框序列因子[Raghitgama et al.，(1997)Plant Mol Biol 34：393-402]；d)铜 诱导启动子，包括ACE1结合位点[Mett et al.，(1996)Transgenic Res 5：105-113.]；e)类固醇诱导启动子，包括糖皮质素反应因子和编码哺乳 动物类固醇受体的表达载体[Schena et al.，PNAS 88：10421-10425]。

另外，运用组织特异性启动子也可获得特异表达，例如，调节绿 叶高水平表达的Fd(Ferredorin)启动子[Vorst et al.，(1990)Plant Mol Biol 14：491-499.]和根特异性表达的过氧化物酶启动子[Wanapu&shinmyo (1996)Ann.NY Acad.Sci.782：107-114].花粉、花、果实和种子特异性启 动子也同样适用。这些启动子可以改变转录的比率和效率。

若要调低基因的表达，可在载体中嵌入反义序列和适当的启动 子；这些技术已有公开发表。核酸分子或基因片段可由自然基因源 (在有义或反义方向)分离、合成，也可由突变来源或合成序列或 两者结合而获得。

调节因子包括有例如转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序 列，核糖体结合序列，核糖体结合序列(含翻译启动信号)等。另 外，根据不同的载体，其它一些遗传因子例选择标记可被整合入重 组分子。其它的调节区如启动子和终止区域也可作为调节因子。以 上调节因子可由动物、植物、酵母、细菌、真菌、病毒、鸟、昆虫 或其它来源获得，包括合成和突变因子。

除实施例28所用的表达载体外，可将多肽插入到已知的细菌、 病毒、哺乳动物、昆虫、真菌或鸟类的表达系统的重组核酸分子中。 利用诸如基于细胞类型的根癌农杆菌介导转化、粒子-轰击介导转化、 直接吸收、微注射、协同沉淀、转染和电穿孔等技术可将重组分子 插入细胞中。载体有挽回载体，腺病毒载体，DNA病毒载体和脂质 体。适量的构建序列嵌入表达载体，它包含转化细胞的选择性标记。 构建序列可被嵌入到由限制性酶得到的酶切位点上。

本发明的一个核心是带有本发明核酸分子或嵌入到载体的核酸片 段在细胞中能被转化和表达AFP的细胞能繁殖且具相同分泌特性。 基因组或基因由自然来源分离，合成或由突变来源、合成序列及这 几方面的结合而获得。

本发明的另一核心是转化本发明的核酸分子或核酸分子片断的插 入质粒，并使细胞表达AFP的方法以及在细胞中表达本发明多肽的 方法。

转录后的植物细胞可进一步进行组织培养、种子或整个植物。产 生突变的结合体及方法已有文章报道。

在单子叶植物和双子叶植物中成功地进行了转化和植物再生。能 转化AFP核酸分子或受含AFP的组分处理的植物(或植物细胞)包 括芦笋、arabidopsis、土豆、烟草、油菜属(例如canola)、棉花、葵 花、草莓、菠菜、莴苣、大米、大豆、小麦、园草、稞麦、大麦、atriplex、 saliconia oat、高粱、苜蓿、甜菜、胡椒、柠檬、南瓜、豌豆、可可 树、大麻、咖啡树、甘蔗、黄瓜和葡萄。树也可被转化，这里包括 枫树、桦树、松树、桉树、苹果树、梨树、李树、杏树、橄榄树、 无花果、柠檬树、菩提树、桔、红橘和葡萄柚。装饰性花植物例如 康乃馨和玫瑰也可转化本发明的基因。荚果植物例如山核桃，胡桃 和如树等可转录出抗冻蛋白核酸分子。一些香料及中草药的植物， 例如人参、姜、银杏、柠檬香草、肉桂、荳蔻、胡椒和孜然芹同样 能被抗冻蛋白核酸分子转化。

本发明的突出特点在于，我们选择那些已转化的并表明抗冻活性 的植物组织细胞或培养物和表达抗冻蛋白并且低渴忍受力的植物是 培养物的再生。这些植物能繁殖例如通过对有低温耐受力植物和不 具低温耐受力植物的相互授粉等。如果植物的自身授粉，同源的不 耐低温子代基因可在种子中进行鉴定。例如将这些植物种植于低温 环境，使用基因标记或低温耐受或抗冻蛋白的活性检测等。经过相 互授粉获得的成熟植物能栽培，生长到性成熟进一步进行相互授粉 或自身授粉。

在一些植物种类通过回交的栽培方法也能插入核酸分子来产生和 AFP耐低温核酸分子同源的植物。对于AFP核酸分子同合子的植物 可作为父本或母本与缺失AFP忍受核酸分子的植物杂交可产生杂交 植株，通常是其核酸分子为杂合子。AFP抗性核酸分子同合子的两 个植株杂交可产生杂合子，其为抗性核酸同合子。

本发明的核酸分子在植物的转化实验中可作为标记。低温敏感植 物可转化带有抗冻蛋白核酸分子，连结了有益的核酸分子，这样被 转化了有益核酸分子的植物能在低温环境下生长，相反，未转化植 物将不能生长。

本发明的核酸分子也能用于仅仅植物某些部分的表达。例如，核 酸分子可仅仅在果实中或收获部分表达，以提高其在低温或冰冻环 境下的储存质量及提高壳或储藏寿命。本发明的核酸分子可仅在植 物的温度敏感部位表达，例如花，它在春天开花但可能发生霜冻； 或者根茎，它在过冬植物中对低温敏感。

也可控制本发明的核酸分子低水平表达，主要是通过反义技术或 共抑制对核酸分子处理，以降低野生型和导入核酸分子的表达水平， 这样就增加了植物对低温的敏感，例如可通过对杂草处理，使之对 低温敏感，降低成活率，达到除去杂草的目的。 实施例35：相同生物功能肽、多肽及蛋白质

目前，本发明不仅指由图21、22的核酸序列编码的类几丁质酶 AFP和实施例中描述的蛋白质，而且也包括那些具相同植物功能的 肽、多肽及蛋白质，它们和应用中的AFP具有相同或相似的抗冻活 性。相同生物功能活性肽、多肽及蛋白质指那些具有和本发明检测 的一种或多种的AFP相同或相似AFP活力的肽、多肽及蛋白质。“相 同或相似AFP活力”意味着具有和本发明AFP相同或相似功能的能 力。这些肽、多肽及蛋白质包合一些区域或部分和应用中的AFP相 同的对应区域或部分，但这并不是一定要求，只要两者表现相同或 相似的AFP活性。相同是指将两种多肽(或核酸序列)排列起来获 得两者的匹配程度的相似度。根据已发表的文章，例如以下介绍的 GAP或BestFit软件可计算出同一度。例如，若一多肽(称“序列A”) 和图21或明或22有90％的相同，那么，序列A就和图21或明或22 中的多肽的相应部分相同，除非序列A含有高达10个位点的突变， 例如被其它氨基酸删除或取代，图21或明或22中多肽部分区域的 每100氨基酸。和AFP生物功能相同的肽、多肽及蛋白质可以以下 多种突变体形式出现。

如实施例18所描述的，应用中的AFP也可用于抗体准备的抗原， 用于纯化或指示AFP或其它类AFP蛋白质。单克隆和多克隆抗体的 准备技术已有文章发表。例如单克隆抗体的准备及应用见美国专利： 5688681、5688657、5683693、5667781、5665356、5591628、5510241、 5503987、5501988、5500345、和5496705。多克隆抗体的准备及应 用见美国专利：5512282、4828985、5225331和5124147。识别AFP 的抗体能用于筛选含AFP或类AFP蛋白的有机物。同时，抗体有益 于从粗抽提物中纯化AFP和类AFP蛋白。

A).AFP序列中的保守氨基酸变化

AFP蛋白的生物功能活性相同的肽，多肽和蛋白质含有和AFP 序列相同的但也有部分变化的氨基酸序列。相同生物功能活性肽， 多肽和蛋白质和自然产生的多肽或相应部分有40％的序列相同，或 更高，至少约60％，80％或90％相同。大多数情况下，至少97％，98％ 或99％相同。“序列相同”由GAP或BestFit软件包确定。BestFit软 件排列出两条相似序列的最适部分。可用Smith和Waterman的部分 同源算法确定排列(1981 Adv.Appl.Math.2：482-489)。GAP软件使用 的是Needlemen和Wunsch的算法(1970 J Mol.Biol.48：443-453)。

B).抗冻蛋白片段和突变体

本发明包含了和AFP具有相似或相同AFP活力的AFP片段及突 变体。

C).AFP片段

本发明的多肽片段和多肽有相似或相同的活力。这种肽大多数由 至少5个氨基酸组成，在最佳情况下，由本发明多肽链的第6至10， 16至25，26至50位氨基酸组成。只要片段和AFP保持相似或相同 的AFP酶活力，通过从C-末端，N-末端或蛋白质的内部区域(或以 上结合)去除一个或多个氨基酸来获得AFP片段。这些片段可以是 AFP的自然突变或对编码核苷酸序列的限制性核酸酶处理的产物。 多肽片段可用于结合多肽的相同复合物测定。一些文章已发表的方 法可鉴定这些片段的激动剂和拮抗剂。

本发明中的AFP片段和变型必需大多和自然生成蛋白或相应区 域部分有40％的相同序列，最好至少60％、80％、90％或95％。在大 多数情况下，片段和自然生成蛋白或相应区域部分有97％、98％或99％ 的相同序列，GAP或BestFit软件的任何一种都较适合片段相同性的 测定。

本发明还包括一些无多肽相似或相同活力的多肽片段，但它们可 作为多肽特征分析的研究工具。 实施例36：AFP突变体

突变(实施例32)或剪切的实验技术可创造AFP的突变体。本 发明的AFP自然突变也可产生变型突变体。正如很多文章已发表的 氨基酸取代，通过蛋白质工程技术中的位点指向突变能产生本发明 的蛋白质变型突变体。这些已知技术的结合可用于氨基酸的取代、 去除和添加。例如，蛋氨酸的疏水残基可被另外的疏水残基例丙氨 酸所取代；丙氨酸残基可被较多的疏水残基例亮氨酸、拮氨酸或异 亮氨酸所取代；一芳香族残基例苯丙氨酸可被苏氨酸取代；一酸性 负电荷氨基酸例如天冬氨酸可被谷氨酸取代；一带正电荷氨基酸例 如赖氨酸可被带正电荷氨基酸例如精氨酸取代。使用改变侧链组的 物质处理来发明的多肽可对蛋白进行修饰，例如，将一氢基转化为 另外的例羟基或氨基酸基团。

本发明注意到了有一或多个D-氨基酸的肽及有一或多个N-末端 乙酰化氨基酸的肽。已发表资料表明这些可使用多种技术对多肽处 理以利于构建修饰肽(例如修饰肽或多肽或蛋白质)，它们不仅具有 本发明相应肽结合物的相同或相似生物活力，而且在溶解性、稳定 性或对水解和蛋白酶解易感性等方面具有比肽更多的有利活力。具 体实施例见Morgan和Gainor，Ann.Rep.Med.Chem.，24：243-252(1989)。

本发明还包括杂交基因和多肽。例如，当一基因的核酸序列和其 它核酸序列结合形成融合肽。例如可将有益AFP的核酸分子或其它 核酸分子和编码本发明中描述的AFP的AFP核酸分子相连接。利用 化学合成或其它已知技术也能产生融合基因和肽。

和自然生成的AFP一样，突变体较好的保持有相似或相同的AFP 活力。这里可对此类变型进行AFP活力测定。

以上提到的由生物技术结合的有相似或相同AFP活力的突变体 (同自然生成)已包括在本发明中(例如：氨基酸添加、去除、取 代或三者结合)。 实施例37：相同生物活性核酸分子

本发明包括那些和图21或22所示序列或其它序列具有相同生物 功能活力的核酸序列。相同生物功能活力的核酸序列是指DNA和 RNA(例如基因DNA、cDNA、合成DNA、和mRNA核酸序列，编 码肽、多肽和蛋白质，具有和图21或22或本发明所含的AFP相同 或相似的AFP活力。相同生物功能活力的核酸序列能编码和本发明 中的AFP具有部分相同的肽、多肽和蛋白质。

A)编码AFP中保守氨基酸变化的核苷酸分子 本发明包括有编码AFP氨基酸序列中的保守氨基酸变化的相同生物 功能活力的核酸序列，这些序列同时对AFP序列产生沉默氨基酸变 化。 B)编码AFP中非保守氨基酸的取代、添加或去除的核苷酸序列

本发明包括那些和图21或22所示序列或其它序列具有相同生 物功能活力的核酸序列。相同生物功能活力的核酸序列是指DNA和 RNA(例如基因DNA、cDNA、合成DNA、和mRNA核酸序列，编 码非保守氨基酸的取代、添加或去除但具有和图21或22或本发明 所含的AFP相同或相似的AFP活力肽、多肽和蛋白质。DNA和RNA 能编码本发明中AFP的片段或变型。用以上所述检测方法确定这些 片段和变型的AFP或类AFP活力。本发明包括的相同AFP生物功 能活力的核酸序列、片段和变型应和自然生成的多肽或匹配区域至 少有40％的相同序列，较好至少60％、80％、95％。最好的是片段和 自然生成的多肽或匹配区域至少有97％、98％或99％的相同序列。 本发明包括那些和图21或22所示AFP具有相同生物功能活力的核 酸序列。序列相同性采用Gap或BestFit软件测定。 (1)来源于冬裸麦和其它抗冻蛋白的DNA。例如：如图21(a)

所示序列被自然或人为突变比方说有部分核苷酸插入或去除，

从而改变了序列长度。若以图21(b)的编码序列长度定为100％，

那么具有相同生物功能活力的核酸序列长度仅为60-120％，最

好是约80-110％。 (2)含部分自然或人为突变的核苷酸序列(通常为全长的80％或

少，较好60％或少，最好是40％或更少)，它们编码不同的氨基

酸，但其产物有和自然生成的抗冻蛋白相同或相似的AFP酶活

力。突变DNA编码的蛋白质序列应和图21或22的AFP酶序

列有至少40％，较好60％、80％、90％和95％，最好97％、98％

或99％的相同。序列相同性采用Gap或BestFit软件测定。

C)遗传简并核苷酸序列

随着基因密码子的简并，我们将认识到图21或22以及其它核 酸序列不再是能编码有抗冻酶、葡聚糖酶、几丁质酶或西非竹芋精 活性多肽的唯一序列。本发明包括那些和图21或22中描述的核酸 分子具有主要相同信息的核酸序列。和研究中描述的核酸序列以及 如图21或22显示的编码多肽的序列相比，有一个或多个核酸变化 的核酸分子(含RNA)也纳入了本发明的范围。在申请书中讨论的 所有核酸序列简并形式也包含于本发明中。

本发明也包括那些有一或多个核酸变化的核酸分子以及和图21 或22有化学相似氨基酸的但已有一或多个氨基酸替代的多肽。

D)杂交指示的相同生物功能核苷酸顺序 编码AFP的几种核苷酸序列见图21或22或使用本应用所描述的方 法可很容易地确定。采用传统的DNA-DNA或DNA-RNA杂交技 术可很容易地分离出编码AFP的核酸的相同生物功能形式。因此， 本发明也包括和图21或22的一条或多条链杂交的序列，它们的互 补序列以及那些编码和AFP是有相同或相似活力的序列(这些序列 表达之物为肽、多肽和蛋白质。这些核苷酸序列在中等至高控制条 件下较易和图21或明或22中的一条或多条序列杂交(见Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：Alaboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.)。最适条件见实施例25描述。

本发明也包括那些和基因DNA、cDNA或编码本发明AFP的 氨基酸序列的合成DNA分子或遗传退化形式(在同本应用中描述的 盐和湿度条件下，遗传密码退化造成的)以及编码和本发明AFP是 相同生物功能活力的肽、多肽及蛋白质的序列。如果仍然可以观察 到再结晶或冰晶生长修饰的抑制作用，那么以上所述的核苷酸序列 被认为是和本发明AFP基因具有相对等同的生物功能。当编码的多 肽的浓度为0.1g/l或更小，较好1g/l或更少，或更好100mg/l或更少。 实施例38：探针

本发明也包括由实施例25中的克隆APF核酸分子或其它核酸 分子获得的寡核酸探针。探针在长度上为15至30个核苷酸，最好 至少30或以上核苷酸。实施例25给出了较满意(优越)的探针。 这些探针较其它优越之处在于它有利于辨别植物中编码抗冻肽、多 肽和蛋白质的核酸序列，也包括本应用描述的和ATPs生物功能相同 的多肽、肽和蛋白质的核酸序列。在控制杂交条件下，寡核苷酸探 针可和图21或22或本发明的其它的基因序列杂交。采用在高控制 条件下和标记探针杂交筛选基因文库，就可以由其它有机物中分离 出编码本发明所含肽的一个核酸分子。由核酸分子编码的肽、多肽 及蛋白质活力采用实施例25描述的DNA克隆和表达来检测。对表 达产物进行葡聚糖酶、几丁质酶或西非竹芋精活性测定。

采用PCR方面扩增可从其它植物中分离出相同AFP生物功能基 因，相同的AFP编码cDNAs和合成DNAs。根据图21或22的氨基 酸序列，可以准备寡核苷酸引物，包括简并引物，这些引物结合用 逆转录酶的PCR技术，以扩增从其它有机物的基因cDNA中获得的 相同生物功能DNAs。

可以另外选择的是寡核苷酸，包括简并核酸也可作为探针来筛选 cDNA文库。 实施例39：AFP的异源超级表达

使用实施例25中的表达载体可获得高水平的蛋白表达。转化了 本发明的核酸分子的植物和细胞培养物是很好的研究工具。根据文 章中公布的多种技术，在研究中采用植物和细胞培养。通过包含AFP 核酸分子(或突变体)的载体转化细胞系(固定化细胞培养物或原 始细胞培养物)，可以核酸分子的表达水平和核酸分子的活力。本发 明的一多肽用于辨别结合多肽的复合物。文章中的方法可用于辨别 多肽的激活剂和拮抗剂。在实验中你可以不表达AFP的植物来检测 AFP基因的表达。采用含AFP基因的不同类型基因(或相似AFP， AFP片段核酸分子)的内合子转化到实验组的植物，以测定产生的 蛋白水平和功能以及植物的表型(phenotype)。多肽同样有益于AFP 活力的活体分析。例如，表现蛋白可用于显微镜或X射线结晶拓扑 研究。其它表达系统也可用于在重组植物中AFP的超级表达。 实施例40：冬稞麦中编码多余AFP的核酸分子克隆

采用实施例25描述的发明方法，克隆冬稞麦中编码类葡聚糖酶 和类西非竹芋精AFP的DNA和RNA。采用异源单子叶植物，或最好 是禾本科植物中得到的探针(实施例25)，可筛选由从低温训化冬稞 麦的健康组织中分离的mRNA产生的cDNA文库。这种探针在中等 控制条件下(实施例25.1)利用Northern印迹来和低温诱导稞麦AFP 的转录物杂交显示其编码葡聚糖或类西非竹芋精蛋白，通过这些探 针来杂交确定的阳性基因可如实施例25描述的进行特征和序列分 析。如实施例27，39或实施例28，29，30，31，34的其它表达系 统所述，cDNAs可通过转化植物被表达。本发明包括有相同生物功 能肽、多肽和蛋白质，这些AFP变型和类葡聚糖酶、类西非竹芋精 AFP具相同生物功能核酸和它们的核酸序列。本发明也包括适用于 编码葡聚糖酶样和类西非竹芋精AFP核酸的探针。 实施例41：在食物或生物材料贮存中作为添加剂的AFP的生产

可以以粗抽提物，部分片化抽提物或纯化肽、多肽、蛋白质产品 形式生产出在原核或真核生物表达系统合成的编码AFP或相同生物 功能AFP的肽、多肽或蛋白质，用于食物和生物材料。例如，图21 或明或暗2发明DNA能在植物中表达，然后从植物中获得总溶解抽 提物(实施例18，24)或细胞外抽提物(实施例1，15，19和20)， 这些抽提物可用于食物或生物材料。通过Nidcel Chelation、胶体几 丁质亲和层析、免疫亲和层析、标准脂质层析技术纯化肽、多肽或 蛋白质。

如果原核或真核细胞系将产生的肽、多肽或蛋白质分泌在生长培 养基或保存在细胞内，那么我们就可以获得总溶解抽提物，部分纯 化抽提物或纯化肽、多肽或蛋白质，以用于食品或生物材料的添加 剂。

这里已详细描述了本发明内容特别是对核心部分的描述尤为详 尽。不管怎样，只要对文章中的技能有一般认识的人都会懂得万变 不离其宗的道理，例如，讲到多肽，那么很清楚一定会涉及肽和蛋 白质。

本说明书将所有出版物、专利和专利申请在此整合为一体，并保 持其完整性；每一单独出版物、专利或专利申请都特定地或个别地 指示其整合为一体，并保持其完整性。

在本专利申请中，完整地引用和采用了下列专利：英国专利临时 申请号9112774.69(1991年6月13日提出申请)，美国申请号08/ 060,425(1993年5月11日提出申请)，美国申请号08/419,061 (1995年4月10日提出申请)，美国申请号08/485,647(1995 年6月10日提出申请)，加拿大专利申请号2,110,510(1992年6 月12日提出申请)，欧洲专利申请号92911435.3(1992年6月12 日提出申请)，PCT申请号PCT/CA92/00255(1992年6月12日 提出申请)，以及美国专利申请号08/903,872。本专利申请要求基 于美国专利申请号08/903,872的优先权。

参考文献 为了便于对关于植物耐受霜冻的能力的已知的各个方面以及本主体 发明进行讨论，这里按照下列第I组、第II组和第III组参考文献的 索引号参考了几种杂志文章。 第I组： 1.0作者：Andersson JA，Ashworth EN(1986年)；文章题目： 链霉素、干燥和紫外线辐照对由假单胞菌viridiflava引起的冰晶成核 的影响；杂志名：植物生理学；80期，956至960页。 1.1作者：Cuter AJ，Saleem M，Kendall E，Gusta LV，Georges F， Fletcher GL(1989年)；文章题目：冬季比目鱼抗冻蛋白可改善植物 组织对寒冷的耐久力；杂志名：植物生理学杂志；135期，351至354 页。 2.作者：Duman JG，Morris JP，Castellino FJ(1984年)；文章题目： 取自大黄蜂皇，Vespula maculata的冰晶成核蛋白质的提纯和组成；杂 志名：比较生物化学生理学杂志；B 154期，79至83页。 3.作者：Fischer R，Behnke S，Apel K(1989年)；文章题目：化学应 力对大麦叶的细胞内液体的多肽组成的影响；杂志名：植物；178期， 61至68页。 3.1作者：Georges F，Saleem M，Cutleer AJ(1990年)；文章题目： 比目鱼抗冻蛋白的一种合成基因的设计和复制以及其在植物细胞中 的表达；杂志名：基因；91期，159至165页。 4.作者：Guy CL(1990年)；文章题目：冷驯化和对冻结应力的耐 受能力：蛋白质代谢的作用；杂志名：Annu Rev植物生理学植物分 子生物学；41期，187至223页。 5.作者：Guy GL，Haskell D(1987年)；文章题目：菠菜中的霜冻 耐受能力诱导作用是与冷驯化一诱导蛋白质的合成相关的；杂志名： 植物生理学；84期，872至878页。 5.1作者：Guy CL，Neimi KJ和Brambl R(1985年)；文章题目： 菠菜冷驯化期间的基因表达变更；杂志名：Proc.Natl.Acad.Sci.USA； 82期，3673至3677页。 5.2作者：Guy GL，Haskell D(1989年)；文章题目：与菠菜冷驯 化相关的高分子量蛋白质的初步表示特征；杂志名：植物生理学生 物化学；27期，777至784页。 6.作者：Huner NPA，Macdowall FDH(1976年)；文章题目：在冷 硬化温度条件下生长的小麦和裸麦的叶绿体蛋白质；杂志名：加拿 大生物化学杂志；54期，848至853页。 7.作者：Kaku S(1973年)；文章题目：植物叶中的冰晶高成核能 力；杂志名：植物细胞生物学；14期，1035至1038页。 8.作者：Kieft TL(1988年)；文章题目：地衣类的冰晶成核活性； 杂志名：实用环境微生物学；54期，1678至1681页。 9.0作者：Kieft TL，Ruscetti T(1990年)；文章题目：从地衣形成 的生物学冰核的表示特征；杂志名：细菌学杂志；172期，3519至3523 页。 9.1作者：Kurkela和Franck(1990年)；植物分子生物学，15期， 137至144页。 10.作者：Laemmili UK(1970年)；文章题目：在抗菌素T4头部集 结期间结构蛋白质的分裂；杂志名：自然；227期，680至685页。 10.1作者：Legrand M，Kaufman S，Geoffroy P，和Fritig B(1987年)； 文章题目：与发病机理相关的蛋白质的生物学功能：与发病机理相 关的四种烟草蛋白质是几丁质酶；杂志名：Proc.Natl.Acd.Sci.USA； 84期，6750至6754页。 11.作者：Lindow SE(1983年)；文章题目：在霜冻对植物造成的 伤害中细菌冰晶成核的作用；杂志名：Annu Rev寄生植物学；21期， 363至384页。 12.作者：Lindow SE，Atny DC，Upper CD，Barchet WR(1978年a)； 文章题目：在霜冻对敏感植物造成的伤害中细菌冰晶成核的作用； 出自Li PH，Sakai A(eds)的：植物对寒冷的耐久力和冻结应力；伦 敦学术出版社出版，第I卷：249至263页。 13.作者：Lindow SE，Arny DC，Upper CD(1978年b)；文章题目： 草上寄生欧文氏菌属：在霜冻伤害加重的过程中细菌冰晶成核的作 用；杂志名：植物病理学；68期，523至527页。 14.作者：Lindow SE，Arny DC，Upper CD(1982年)；文章题目： 细菌冰晶成核：导致植物霜冻伤害的一个因素；杂志名：植物生理 学；70期，1084至1089页。 15.作者：Maki LR，Willoughby KJ(1978年)；文章题目：细菌作 为冻结晶核形成的生物源；杂志名：实用气象学杂志；17期，1049 至1053页。 16.作者：MauchF，Staehelin LA(1989年)；文章题目：豆叶中的乙 烯诱导几丁质酶和乙撑-1，3-葡聚糖酶的亚细胞定位的功能含义； 杂志名：植物细胞；第1期，447至457页。 17.作者：Meza-Basso L，Alberdi M，Raynal M，Ferro-Cardinahos M-L， Delseny M(1986年)；文章题目：低温处理期间油菜籽Brasica napus 苗中的蛋白质合成的变化；杂志名：植物生理学；82期，733至738 页。 18.作者：Mohapatra SS，Poole RJ，Dhindsa RS(1987年)；文章题目： 在紫花苜蓿冷驯化期间蛋白质模式和可翻译的信使RNA种群的变 化；杂志名：植物生理学；84期，1172至1176页。 19.作者：Mohapatra SS，Poole RJ，Dhindsa RS(1988年)；文章题目： 由两种脱落酸和冷驯化诱导的两种膜多肽的检测：对霜冻的耐受能 力的可能作用；杂志名：植物细胞生理学；29期，727至730页。 20.作者：O、Farrell PH(1975年)；文章题目：蛋白质的高分辨 率二维电泳现象；杂志名：生物化学杂志；250期，4007至4021页。 21.作者：Perras M，Sarhan F(1989年)；文章题目：在小麦冷驯化 期间，叶、冠和根中的耐冻蛋白质的合成；杂志名：植物生理学；89 期，577至585页。 22.作者：Rajashekar CB，Li PH，Carter JV(1983年)；文章题目： 在有块茎的茄属植物的叶中的霜冻伤害和不同种类的冰晶的成核； 杂志名：植物生理学；71期，749至755页。 23.作者：Robertson AJ，Gusta Lv，Reaney MJT，Ishikawa M(1987年)； 文章题目：在使用脱落酸和低温进行耐霜冻能力诱导期间，在雀麦 草(Bromus inermis Leyss)培养细胞中的蛋白质合成；杂志名：植 物生理学；34期，1331至1336页。 24.作者：Southworth M W，Wolber PK，Warren GJ(1988年)；文章 题目：浓度和某种细胞冰晶成核蛋白质的活性之间的非线性关系； 杂志名：生物化学杂志；263期，15211至15216页。 25.作者：Warren GJ(1987年)；文章题目：细菌冰晶核的形成： 分子生物学及其应用；杂志名：生物技术基因工程评论；5期，109 至135页。 26.作者：Wolber P， Warren G(1989年)；文章题目：细菌冰晶成核 蛋白质；杂志名：生物化学科学发展趋势；14期，179至182页。 第II组： 1.0作者：Abeles，F.B和Forrence L.E.(1970年)，植物生理学； 45期，395至400页。 作者：Ashworth，E.N.植物生理学；92期，728至725页(1990年)。 2.作者：Blum，A.杂志：CRC Crit.植物生理学评论，第2期，199 至238页(1985年) 2.1作者：Broekaert W.Lee H，KushA，Chua NH，Raikhel N(1990 年)，国家科学院学报IJSA，87期，7633至7637页。 3.作者：Chakrabartty，A.，Yang，D.S.C.&Hew，C.L.J.，生物化学， 264期，11313至11316页(1989年)。 4.作者：Davies，P L.Hew，C.L.杂志名：FASEB杂志.第4期，2460 至2468页(1990年)。 5.作者：DeVries，A.L.Meth.酶学，127，293(1986年)。 6.Duman，J.G.，Su，L.，Neven，L.G.，Tursman，D.&Wu，D.W.低温条 件下的昆虫，R.J.Lee，Jr.及D.L.Denlinger，Eds.(Chapman and Hall 出版公司，纽约，1991年)，94至127页。 7.作者：Feeney，R.E.，农业及食品工业评论，第1期，147至181 页(1988年)。 8.0作者：Foumey，R.M.，Joshi，S.B.&Hew，C.L.，加拿大动物学 杂志，62期，28至33页(1988年)。 8.1作者：Harlow，E.&Lane D.Antibodies，实验室手册，Cold Spring Harbor实验室，纽约Cold Spring港(1988年)。 8.2作者：Hejgaard J，Jacobsen S，Svendsen 1(1991年)欧洲生物 化学协会联合会通信，291期，127至131页。 8.3Huang JK，Wen L，Swedle M，Tran HC，Thin TH，Naylor HM， Muthukrishnan S，Reeck GR(1991年)植物分子生物学，16期，479 至480页。 9.作者；Hew，C.L.，Slaughter，D.，Joshi，S.B.，Fletcher，G.L.& Ananthanarayanan，V.S.J.比较生理学，B 155期，81至88页(1984 年)。 10.作者：Knight，C.A.及Duman，J.G.，低温生物学，23期，256 至262页(1986年)。 11.作者：Krol，M.，Griffith，M.及Huner，N.P.A.加拿大生物学杂志， 62期，1062至1068页(1984年)。 12.作者：Mauch，F.及Staehelin，L.A.植物细胞，第1期，447至 457页(1989年)。 12.1作者：Neale AD，Wahleithner KA，Lund M，Bennett HT，Kelly A， Meeks-Wagner DR，Peacock WJ，Dennis ES(1990年)，植物细胞，第 2期，673至684页。 13.作者：Parody-Morreale，A.，Murphy，K.P.，Di Cera，E.，Fall，R.， DeVries，A.L.及Gill，S.J.自然，333期，782至783页。 14.作者：Pearce，R.S.植物，175期，313至324页，(1988年)。 15.作者：Sakai，A.及Larcher，W.植物的抗霜冻生存，(Springer- Verlag，柏林，海德尔堡，1987年)，1至38页。 15.1作者：Schagger H，Von Jagow G(1987)，分析生物化学，166 期，368至379页。 16.作者：Storey，K.B.及Storey，J.M.，生理学评论，68期，27至 84页，(1988年)。 17.作者：Tomchaney，A.P.，Morris，J.P.，Kang，S.H.及Duman，J.G.生 物化学，第21期，716至721页，(1982年)。 18.作者：Uemura，M.及Steponkus，P植物生理学，91期，1131至 1137页(1989年)。 18.1作者：Wright CS，Raikhel N(1989年)，分子进化杂志，28期， 327至336页。 19.作者：Wu，D.W.及Duman，J.G.J.比较生理学，B 161期，279 至283页(1991年)。 20.作者：Wu，D.W.，Duman，J.G.及Xu，Lei.，杂志名：Biochim. Biophys.Acta，1076期，416至420页。 第III组： 1.作者：Aloni R，Griffith M(1991年)；文章题目：六种谷物种类 的根茎接合部的功能木质部解剖；杂志名：植物；184期，123至129 页。 2.作者：Antikainen M，Griffith M，Zhang J，Hon W-C，Yang DSC， Phihakaski-Maunsbach K(1996年)；文章题目：利用组织印刷法对 冬裸麦叶、冠部和根部的抗冻蛋白进行检测；杂志名：植物生理学； 110期，845至857页。 3.作者：Antikainen M&Pihakaski S(1994年)；文章题目：在冬裸 麦(Secale cereale)叶中发生应激反应期间RNA、蛋白质、和糖的 水平的早期发展；杂志名：Ann.Bot；74期，335至341页。 4.作者：Arav A，Rubinsky B，Seren E，Roche JF，Boland MP(1994 年)；文章题目：热滞后蛋白质在卵母细胞和胚芽超低温冷藏期间的 作用；杂志名：兽医产科及母畜医学；41期，107至112页。 5.作者：Bradford MM(1976年)；文章题目：利用蛋白质染料粘合 原理对蛋白质的显微照片数量进行量化的一种快速而灵敏的方法； 杂志名：分析生物化学；72期，248至254页。 6.作者：Dahlgren RMT，Clifford HT，Yeo PF(1985年)；书名：单子 叶植物的结构、进化、和分类学；柏林Springer-Verlag出版社出版， 书号：ISBN 3-540-13655-X。 7.作者：Davis BJ(1964年)；文章题目：圆盘电泳法：II方法和 对人类血清蛋白质的应用；杂志名：AnnN.Y.Acad.Sci.；121期，404 至427页。 8.作者：DeVries AL(1986年)；文章题目：防冻糖肽和肽：与冰和 水的相互作用；杂志名：酶学方法；127期，293至303页。 9.作者：Dexter ST，Tottingham WE，Graber LF(1932年)；文章题目： 利用电导率对植物对寒冷的耐久力的研究；杂志名：植物生理学；7 期，63至78页。 10.作者：Duman JG(1964年)；文章题目：提取自一种又苦又甜 的茄属植物Solanum dulcamara的热滞后蛋白质的提纯和表示特征； 杂志名：Biochim.Biophys.Acta，1206期，129至135页。 11.作者：Duman JG，Olsen TM(1993年)；文章题目：细菌、真菌 类、和各种不同种类史的植物中的热滞后蛋白质的活性；杂志名： 低温生物学；30期，322至328页。 12.作者：Duman JG，Wu DW，Olsen TM，Urrutia M，Tursman D(1993 年)；文章题目：热滞后蛋白质；杂志名：高级低温生物学；2期，131 至182页，书号：ISBN 1-55938-536-7。 13.作者：Feinberg AP，Vogelstein B(1983年)；文章题目：一种用 放射性同位素把DNA约束核酸内切酶片段标记为高比活性的技术； 杂志名：分析生物化学；132期，6至13页。 14.作者：Gatschet MJ，Taliaferro CM，Porter DR，Anderson MP， Anderson JA，Jackson KW(1996年)；文章题目：提取自赫木达草冠 部的一种冷调节蛋白质是几丁质酶；杂志名：作物科学；36期，712 至718页。 15.作者：Gong Z，Ewart KV，Hu Z，Fletcher GL，Hew CL(1996年)； 文章题目：冬季比目鱼的抗冻蛋白基因，Pleuronectes americanus，给 无分泌信号和前置序列的独特的活性多肽编码；杂志名：生物化学 杂志；271期，4106至4112页。 16.作者：Griffith M，Antikainen M(1996年)；文章题目：耐冻植 物中的胞外冰晶形成；杂志名：高级低温生物学；3期，107至139 页，书号：ISBN 0-7623-0160-0。 17.作者：Griffith M，Ewart KV(1995年)；文章题目：抗冻蛋白及 其在冷冻食物中的潜在用途；杂志名：高级生物技术；13期，375 至402页。 18.作者：Griffith M，Mcintyre HCH(1993年)；文章题目：冬小麦 的生长与其对霜冻的耐受能力之间的相互关系；杂志名：植物生理 学；87期，335至344页。 19.作者：Griffith M，Ala P，Yang DSC，Hon W-C，Moffatt BA(1992 年)；文章题目：在冬裸麦叶中内生形成的抗冻蛋白；杂志名：植物 生理学；100期，593至596页。 20.作者：Harlow E，Lane D(1988年)；文章题目：免疫印迹。见 于：抗体：实验室手册(E.Harlow及D Lane，eds)471至510页，Cold Spring Harbor实验室，纽约。 21.作者：Hew Cl，Yang DSC(1992年)；文章题目：蛋白质与冰的 相互作用；杂志名：欧洲生物学杂志；203期，33至42页。 22.作者：Hon W-C，Griffith M，Chong P，Yang DSC(1944年)；文章 题目：从冬裸麦(Secale cereale L.)叶中提取和分离抗冻蛋白；杂志 名：植物生理学；104期，971至980页。 23.作者：Hon W-C Griffith M，Mlynarz A，Kwok YA，Yang DSC(1995 年)；文章题目：冬裸麦中的抗冻蛋白类似于与病原体相关的蛋白质； 杂志名：植物生理学；109期，879至889页。 24.作者：Houde M，Dhindsa RS，Sarhan F(1992年)；文章题目：用 于在禾本科植物中选择抗冻蛋白的分子标记；杂志名：分子基因遗 传学；234期，43至48页。 25.作者：Hunder NPA，Macdowall FDH(1976年)；文章题目：在 温暖和冷硬化温度条件下生长的小麦和裸麦的叶绿体蛋白质；杂志 名：加拿大生物学杂志；54期，848至853页。 26.作者：Huynh QK，Hironaka CM，Levine EB.Smith CE，Bvormeyer JRE，Shah DM(1992年)；文章题目：从玉米种子中分离得到的几丁 质酶的提纯、分子复制、和抗真菌类特性；杂志名：生物化学杂志； 267期，6635至6640页。 27.作者：Kacperska-Palacz A(1978年)；文章题目：草本植物的 冷驯化机制；见于：植物对寒冷的耐久力和霜冻应激反应(PH Li及 A Sakai，eds)，139至152页，美国纽约州纽约市学术出版社，书号： ISBN 0-12-447650-3。 28.作者：Kenward KD，Altschuler M，Hildebrand D，Davies PL(1993 年)；文章题目：转基因烟草中的I类鱼抗冻蛋白的积聚是专门适用 于寒冷的；杂志名：植物分子生物学；23期，377至385页。 29.作者：Kindel PK，Liao S-Y，Liske MR，lien CR(1989年)；文章 题目：从裸麦和小麦种子中提取的阿拉伯对苄基苯基甲酰胺与冰的 相互作用；杂志名：碳水化合物Res.；187期，173至185页。 30.作者：Krol M，Griffith M，Huner NPA(1984年)；文章题目：适 用于环境温度研究的一种生理学控制：冬裸麦的比较生长动力学； 杂志名：加拿大植物杂志；62期，1062至1068页。 31.作者：Laemmli UK(1970年)；文章题目：在抗菌素T4头部集 结期间结构蛋白质的分裂；杂志名：自然；227期，680至685页。 32.作者：Li X，Hew CL(1991年)；文章题目：从海洋大头鱼类， Macrozoarces Americanas提取的防冻多肽的结构和功能；谷氨酸残余 物通过场所定向突变形成在蛋白质稳定性和抗冻活性方面所起的作 用；杂志名：蛋白质工程；第4期，1003至1008页。 33.作者：Llogemann J，Schell J，Willmitzer L(1987年)；文章题目： 从植物组织中分离RNA的改良方法；杂志名：分析生物化学；163 期，16至20页。 34.作者：Macdowall FDH(1974年)；文章题目：“侯爵”(Marquis) 小麦生长动力学；IV.动力学相关性和冬季硬化；杂志名：加拿大 植物学杂志；52期，151至157页。 35.作者：Marentes E，Griffith M，Mlynarz(1993年)；文章题目：冷 驯化期间蛋白质在冬裸麦叶的非原质体中的积聚；杂志名：植物生 理学；87期，499至507页。 36.作者：Merril CR，Goldman D，Sedman SA，Ebert MH(1981年)； 文章题目：用于聚丙烯酰胺凝胶体中的蛋白质的超灵敏色斑在脑脊 髓液蛋白质中显示区域性变异；杂志名：科学；211：1437。 37.作者：Olien CR(1965年)；文章题目：用霜冻干预谷类聚合物 和相关化合物；杂志名：低温生物学；第2期，47至54页。 38.作者：Olien CR(1967年)；文章题目：对霜冻的应激反应和存 活能力；杂志名：植物生理学年鉴；18期，387至408页。 39.作者：Olien CR，Lester GE(1985年)；文章题目：在裸麦的可 溶性碳水化合物中的霜冻诱导变化；杂志名：作物科学；25期，288 至290页。 40.作者：Pearce RS(1988年)；文章题目：在产生霜冻应力的谷物 叶中的胞外冰晶和细胞形状；杂志名：植物；175期，313至324 页。 41.作者：Pearce RS，Ashworth EN(1992年)；文章题目：田野中出 现霜冻应力期间越冬小麦叶中的细胞形状和冰晶定位；杂志名：植 物；188期，324至331页。 42.作者：Porebski S，Bailey LG，Baum BR(1997年)；文章题目： 对含有大量多醣和多酚成份的植物的CTAB DNA提取协议的修正； 杂志名：植物分子生物学报道；15期，8至15页。 43.作者：Raymond J A，DeVries AL(1977年)；文章题目：作为极 地鱼类的抗冻活性的机制的吸附抑制；杂志名：Proc Natl Acad Sci USA；74期，2589至2593页。 44.作者：Rubinsky等人(1991年)；文章题目：低温保护作用：抗 冻蛋白的一种基本特性；杂志名：生物化学及生物物理学通信；180 期，566至571页。 45.作者：SAS学会，1985年；用户指导：统计学；第6版ed.SAS Institute Inc.，Cary，NC.书号：ISBN 0-917382-66-8。 46.作者：Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T(1989年)；文章题目： 分子复制：实验室手册；Cold Spring Harbor实验室出版社，美国纽 约Cold Spring港。 47.作者：Sanger F，Nickleu S，Coulson AR(1977年)；文章题目： 带有链终止抑制物的DNA序列；杂志名：Proc Natl.Acad Sci USA； 第4期，5463至5467页。 48.作者：Stintzi A，Heitz T，Prasad V，Wiedemann-Merdinoglu S， Kauffmann S，Geoffroy P，Legrand M，Fritig B(1993年)；文章题目： 与致病机理相关的植物蛋白质及其在抵抗病原体方面的作用；杂志 名：Biochimie；75期，687至706页。 49.作者：Tablin F，Oliver AE，Walker NJ，Crowe LM，Crowe JH(1966 年)；文章题目：完好无缺的人体血小板中膜的相转变；杂志名：植 物生理学；168期，305至313页，1996年。 50.作者：Tronsmo AM，Gregersen P，Hjeljord L，Sandal T，m Bryngelsson T，Collinge DB(1933年)；文章题目：冷诱导的抗疾病能力；见于： 植物防卫反应机制(B.Fritig及M.Legrand，eds)，369页，Kluwer学 术出版社，Dordrecht.书号：ISBN 0-7923-2154-5。 51.作者：Trudel J，Asselin A(1989年)；文章题目：经聚丙烯酰胺 凝胶体电泳之后对几丁质酶活性的检测；杂志名：分析生物化学；178 期，362至366页。 52.作者：Urrutia ME，Duman JG，Knight CA(1992年)；文章题目： 植物的热滞后蛋白质；杂志名：生物化学生物生理学，Acta；1121 期，199至206页。 53.Williams RJ作者：(1992年)；文章题目：冰伴阿拉伯对苄基苯 基甲酰胺溶液中冰晶的反常行为；杂志名：Thermochim.Acta.；212 期，105至113页。 54.作者：Zamecnik J，Bieblova J，Grospietch，M(1994年)；文章题 目：安全区成为根茎冰繁殖的障碍；杂志名：植物土壤；167期，149 至155页。 55.作者：Zhu B，Chen THH，Li PH(1993年)；文章题目：在茄属 植物Solanum commersonii中的抗冻活性诱导期间一种ABA一响应性 的类似osmotin的基因的表达；杂志名：植物分子生物学；21期，729 至735页。