[0001] 本发明涉及到基因工程领域，具体涉及一种单氧化酶转化植物甾醇的方法。

[0002] 在分支杆菌内，胆固醇的侧链降解是从C26开始，被依次氧化成羟基(-OH)、醛基(-CHO)和羧基(-COOH)(如图1)，然后在细胞内发生脂肪酸的β-氧化，逐步将胆固醇侧链降解。分支杆菌都会含有利用P450(CYP)家系的125和142酶系通过侧链环氧化方式进行胆固醇降解途径。经过这两种酶的结构和序列比对表明CYP125上N端域上的残基58-67以及100-109最有可能锁定和氧化长的胆固醇脂分子链。CYP142A2同胆固醇硫酸脂的晶体结构表明底物分子紧紧的靠近小的活性位点。另外，CYP125较大的活性位点允许胆固醇的多种硫酸盐结合模式。其中大部分触发P450催化循环，但是以非耦合模式而不是氧化的模式固醇。

[0003] 分枝杆菌中胆固醇侧链的降解是由两个细胞色素启动的P450，形成CYP125A1和CYP142A1，将植物甾醇C26位依次氧化成羟基(-OH)、羰基(-CHO)、羧基(-COOH)代谢物。同源2
酶CYP125A3和CYP142A2来自耻垢分枝杆菌MC155。异源表达纯化的CYP125A3和CYP142A2能够结合胆固醇，4-胆甾烯-3-酮和抗真菌唑类药物。重组CYP125A3或CYP142A2以及铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶羟基化4-胆甾烯-3-酮加入到C-26中后产生酸。无底物的CYP125A3和CYP142A2X射线结构以及cholest-4-en-3-one-结合CYP142A2表明与同源的结核分枝杆菌相比，蛋白质底物结合位点有显着差异。删除cyp125A3会减少醇和酸代谢物和acyp142在mRNA和蛋白质上的强诱导水平。分泌细菌中甾醇的分解代谢是非常重要的，本发明使植物甾醇首先氧化转化成相应的羧酸，对进一步实现侧链降解生成相关甾体药物非常重要。

[0004] 针对上述现有技术，本发明提供了一种单氧化酶转化植物甾醇的方法。本发明的植物甾醇C26位单氧化酶基因序列是来自分枝杆菌HGMS2GL。经查阅相关文献发现这种酶的相关报道较少，基本为一新型基因。本发明的目的之一在于提供一种降解甾醇侧链的单氧化酶，为以后相关研究提供理论支撑。在此基础上，为分支杆菌植物甾醇C26单氧化酶的侧链降解在基因工程方面的应用提供参考价值。

[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0006] 通过对分枝杆菌HGMS2GL的全基因组测序，从基因组中以PCR的方法提取甾醇C26单氧化酶基因序列(对应SEQ ID NO：1以及氨基酸序列SEQ ID NO：2)。由于遗传密码子的简并性，本发明的植物甾醇C26单氧化酶基因还可以是编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其他核苷酸序列；而本发明的植物甾醇C26单氧化酶不仅限于具有序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，还可以是将序列2中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有相同酶活性的由序列2衍生的蛋白质，比如在N末端或C末端添加一个或数个氨基酸，如与载体编码的氨基酸融合、不影响序列的修饰形式上的差异等情况。

[0007] 本发明提供的包括甾醇C26位单氧化酶基因的核苷酸序列的表达载体是用常规方法将本发明的甾醇C26位单氧化酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成，该载体可以是市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，如pUC，pET和pGEX，但不限于这些载体。

[0008] 构建甾醇C26单氧化酶基因于pRSV载体中，选用的酶切位点为BamHI和EcoRI，通过酶切、连接和PCR鉴定显示载体成功构建。

[0009] 将构建好的载体转化于大肠杆菌BL21中，在IPTG作为诱导剂下，进行蛋白表达，通过不同的诱导条件实现最优蛋白表达条件。

[0010] 本载体pRSV上含有6个组氨酸标签便于蛋白纯化之用，通过Ni柱纯化实现蛋白的提纯和富集。纯化后的蛋白可用于底物降解酶活测定，具体测定方案见下述的具体的实验方案实例。

[0011] 一种单氧化酶转化植物甾醇的方法，包括以下步骤：将植物甾醇与权利要求1或2所述的单氧化酶加入含有体积百分含量0.05％Tween-20的50mM磷酸钾，pH7.0的缓冲液中预孵育2h，再加入50μmol的菠菜铁氧还蛋白和铁氧还蛋白-NADP+还原酶、5mmolNADH，25℃，搅拌3h。优选的，植物甾醇与单氧化酶的摩尔比为0.3:1。

[0012] 本发明提供的重组菌株通过表达目的蛋白高效转化植物甾醇，进一步催化转化制备重要甾体药物，解决了工业生产中甾体转化效率低的问题，在工业化生产中具有重要意义。使用本发明提供的重组菌株表达酶可实现多甾体化合物的氧化转化法生产，有助于降低甾体药物生产过程中的能耗，提高药物前体的利用率，降低生产成本，且反应条件温和、环境友好，适合于大力推广应用，具有较高的经济效益和社会效益。附图说明

[0013] 图1为单氧化酶(Mono164)降解胆固醇侧链的示意图。

[0014] 图2为单氧化酶(Mono164)基因扩增结果，大小为1329bp。

[0015] 图3为构建的单氧化酶(Mono164)表达甾体pRSV-Mono164的菌落PCR鉴定结果，大小为1.8kbp。

[0016] 图4为单氧化酶(Mono164)表达后的SDS-PAGE电泳结果，大小约为48.6KD。图5为单氧化酶(Mono164)的蛋白纯化情况。

[0017] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

[0018] 实施例1、分枝杆菌HGMS2GL甾醇C26单氧化酶基因的获取

[0019] 1.1、提取分枝杆菌HGMS2GL基因组

[0020] 使用基因组提取试剂盒(OMEGABIO-TEK)，提取分枝杆菌HGMS2GL基因组。

[0021] 1.2、引物设计

[0022] 根据对分枝杆菌HGMS2GL全基因组测序设计胆固醇C26单氧化酶基因的特异性引物，引物序列如引物对1所示。引物对1(上游引物如SEQ ID NO：3所示，下游引物对如SEQ ID NO：4所示)和引物对2(上游引物如SEQ ID NO：5所示，下游引物对如SEQ ID NO：6所示)。

[0023] 1.3、PCR法提取胆固醇C26单氧化酶基因

[0024] 以提取好的分枝杆菌HGMS2GL基因组为模板，使用引物对1进行PCR，跑DNA胶(1329bp，如图2所示)，PCR条件如下：

[0025] 25μLPCR反应体系：

[0026]

[0027]

[0028] 反应程序如下：

[0029]

[0030] 实施例2：载体pRSV-Mono164的构建

[0031] 2.1、目的片段Mono164与载体pRSV的酶切

[0032] 酶切采用双酶BamHⅠ和EcoRⅠ(TAKARA)同时酶切，反应条件：37℃，3h。

[0033] 2.2、目的片段Mono164切胶回收，载体pRSV直接回收

[0034] 采用DNA回收试剂盒(OMEGABIO-TEK)回收2.1中酶切后的基因片段，根据DNA回收试剂盒说明书操作。

[0035] 2.3、目的片段Mono164与载体pRSV连接

[0036] 将2.2回收到的载体pRSV大片段与目的片段Mono164用T4DNA连接酶作连接。基因回收试剂盒、质粒提取试剂盒是OMG。

[0037] 2.4、筛选大肠杆菌表达载体pRSV-Mono164

[0038] 将构建好的pRSV-Mono164转入大肠杆菌DH5а，在含有卡那霉素的LB平板上涂布平板，37℃，过夜培养。

[0039] Luria Bertani培养基配方如下：1％蛋白胨，0.5％酵母粉，1％氯化钠；

[0040] Luria Bertani固体培养基配方如下：1％蛋白胨，0.5％酵母粉，1％氯化钠，1.8％的琼脂糖；

[0041] 2.5、筛选阳性转化子pRSV-Mono164

[0042] 挑取2.4中平板上的单菌落作菌落PCR鉴定，每个单菌落都保藏菌种。使用引物对2进行PCR，跑DNA胶(如图3)，大小约为1800bp，确定阳性转化子。

[0043] 25μLPCR反应体系：

[0044]

[0045] 反应程序如下：

[0046]

[0047] 2.6、提取转化子pRSV-Mono164的克隆质粒

[0048] 将2.5中筛选得到的阳性转化子37℃，200rpm过夜培养，按照质粒提取试剂盒说明书进行操作。

[0049] 2.7、测序

[0050] 将2.6提取得到的pRSV-Mono164重组质粒进行测序，测序结果与已知序列进行对比，确定是构建成功的重组质粒。

[0051] 实施例3：甾醇C26单氧化酶的表达

[0052] 3.1、重组质粒转化BL21

[0053] 将2.6提取的重组质粒pRSV-Mono164转化到大肠杆菌BL21，涂布在含有卡那霉素的LB平板上，37℃，过夜培养。

[0054] 3.2、甾醇C26单氧化酶蛋白的表达

[0055] 在3.1中卡那霉素的LB平板上挑取单菌落于3mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养，转1mL到含有50mL含有卡那霉素的LB的三角瓶中，37℃，200rpm，2-
3h。将50mL全部转到1L含有卡那霉素的LB培养基中，培养到OD600＝0.8，加入终浓度为
0.4mmoL的IPTG(1M)，18℃，200rpm，6h，收集菌体，-20℃保藏。

[0056] 3.3、蛋白胶制样

[0057] 取3.2中IPTG诱导6h后菌液2mL,10000rpm，10min，4℃，收集菌体。加入100μLpH＝7.4的1xPBS吹匀，细胞超声破碎仪破碎细胞到细胞液变澄清为止，12000rpm，10min，4℃，分别收集上清与沉淀。沉淀中加入50μL的蛋白上样缓冲液(1x蛋白上样缓冲液)，取45μL上清，加入5μL5xLoading buffer，95℃，10min，16000rpm，10min，跑12％的SDS-PAGE蛋白胶(如图
4)，从图中可知单氧化酶(Mono164)可以表达为可溶性蛋白和包含体，分别存在于上清和沉淀中。

[0058] 实施例4：甾醇C26单氧化酶纯化与酶活测定

[0059] 4.1目的蛋白纯化

[0060] 将步骤3.2表达的蛋白经过His-Tag-Beads纯化，然后采用SDS-PAGE确定蛋白纯化情况(结果如图5所示)，从图中可以看出本发明纯化得到了纯的单氧化酶蛋白。

[0061] 4.2目的蛋白酶活测定

[0062] 对步骤4.1纯化后的酶进行活性测定。将底物胆固醇与酶Mono164(1.0mM)加入含有0.05％(V/V)Tween-20的50mM磷酸钾，pH7.5的缓冲液中预孵育2h，再

[0063] 加入菠菜铁氧还蛋白、铁氧还蛋白-NADP+还原酶、过氧化氢酶、MgCl2、NADPH再[0064] 生系统(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸)开始反应，25℃，8h。在饱和底物浓度下测定酶活性。酶活定义为1min内转化1μmol胆固醇的酶量为一个酶活单位，得到一个酶活单位为:一个酶活单位1U＝4.49mg/min/μmol。

[0065] 4.3单氧化酶转化β-谷甾醇的应用

[0066] 300μmol的底物β-谷甾醇与酶Mono164(1.0mM)加入含有0.05％(V/V)[0067] Tween-20的50mM磷酸钾，pH7.0的缓冲液中预孵育2h，再加入50μmol的菠菜铁氧还蛋白和铁氧还蛋白-NADP+还原酶、5mmolNADH，25℃，搅拌3h。