[0001] 本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种来源于氧化葡萄糖酸杆菌的老黄酶基因及其应用。

[0002] C=C双键的不对称还原因为其可以产生含有多至两个手性中心的化合物，并且这些化合物通常都是有机合成中的重要手性砌块，已经成为使用最广泛的生产手性化合物的合成方法之一。生物催化法不对称还原C=C双键因为低成本高效率的特性在精细化学品、医药和农药中间体的生产中逐渐形成完整的工业制造路径。

[0003] 老黄酶是一类典型的可以还原C=C双键的酶。1933年老黄酶首次分离于啤酒酵母，并且是最早被发现的含有黄素辅酶FMN的酶。老黄酶在自然界的分布十分广泛，尤其是植物，细菌和低等真菌。到目前为止，已报道的老黄酶微生物来源主要有Saccharomyces carlsbergensis 、Saccharomyces cerevisiae、Bacillus subtilis、Pseudomonas putida 、Pseudomonas fluorescens、Shewanella oneidensis 、Escherichia coli 和Zymomonas mobilis。后续的研究表明老黄酶可以催化一系列的活性烯烃，包括 α,β-不饱和醛酮，硝基烯，羧酸及各种衍生物（包括酯，内酯，酰亚胺等）。虽然老黄酶的底物谱广泛，并且这些底物在生物和药物上都有着很大的应用，但是目前已经被鉴定的老黄酶数量稀少，这很大程度上限制了对C=C双键不对称还原的研究，且十分不利于该行业的工业化发展。

[0004] 本发明的目的是提供一种来源于氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）的老黄酶基因及其应用，该基因编码的老黄酶能高效催化2, 6, 6-三甲基-2-环己烯-1,4-二酮（茶香酮）的碳碳双键手性还原生成类胡萝卜素（如玉米黄质）合成中的重要手性砌块，(6R)-2, 2, 6-三甲基环己烷-1, 4-二酮（左旋二酮）。

[0005] 目前，未发现该老黄酶基因的相关研究报道，其编码的老黄酶与现有文献报道的老黄酶氨基酸序列相似性在30% 40%左右。~

[0006] 来源于G. oxydans的老黄酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因序列含有1104 bp碱基。

[0007] 所述的老黄酶基因编码的老黄酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其包含367个氨基酸。

[0008] 一种表达载体，它包含所述的老黄酶基因。

[0009] 一种重组菌，其是通过利用所述的表达载体转化宿主细胞获得的。

[0010] 用细菌DNA Kit (TIANGEN, China)提取G. oxydans基因组，基于如SEQ ID NO：1所示的核酸序列设计引物，扩增的DNA片段克隆到pET-22b载体中，将所构建的重组质粒pET-22b-OY1转化到大肠杆菌 BL21中构建工程菌，通过适宜浓度的IPTG诱导基因工程菌高效表达老黄酶。

[0011] 应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。因此，本发明的来源于G. oxydans的老黄酶还包括由SEQ ID No：2 所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由SEQ ID No：2所示的蛋白质衍生的蛋白质。例如通过在末端添加标签序列，如His-tag 或Strep-tag 而衍生的蛋白质。

[0012] 通过Blast软件在线比较分析，发现来源于G. oxydans的老黄酶基因的核苷酸序列与其它微生物的己知老黄酶基因的同源性差异较大。

[0013] 本发明中，术语“老黄酶基因”还包括能编码具有与老黄酶相同功能的蛋白的SEQ ID NO：1的突变形式，所述突变类型包括：确实、无义、插入、错义。本领域技术人员能够理解，作为遗传密码简并性的结果，许多不同的多核苷酸能够编码相同的多肽。另外，应当理解，本领域技术人员能够使用常规的技术进行核苷酸取代，所述取代不会影响本发明中所使用的多核苷酸编码的多肽序列。另外，还可以使用本领域中的已知的方法对多核苷酸进行修饰，以增强本发明多核苷酸在体内的活性或者存活期。

[0014] 一种含有老黄酶基因的重组表达载体，是将SEQ ID NO：1所示基因与表达载体pET-22b连接所构建的重组载体。

[0015] 一种含有上述重组表达载体的宿主细胞宿主大肠杆菌BL21（Escherichia coli BL21）。

[0016] 所述的来源于G. oxydans的老黄酶在催化茶香酮的碳碳双键手性还原生成左旋二酮中的应用。在1.5 100 g/L的茶香酮浓度下，添加8 U 2000 U老黄酶、20 U 5 000 U的~ ~ ~葡萄糖脱氢酶和0.05 0.2 mmol/L 的NADP+，在pH 6.0 7.5，20 30℃、180 280 rpm条件下~ ~ ~ ~
反应3 24h，得到左旋二酮。
~

[0017] 有益效果：本发明基于生物信息学的分析方法和分子生物学技术所获得的核酸序列是一种高活性、高选择性的老黄酶基因，可将其与载体连接后转化至宿主细胞内生产老黄酶，该酶能高效催化茶香酮的碳碳双键手性还原生成左旋二酮。本发明首次将氨基酸序列如SEQ ID NO：
2所示的老黄酶应用于左旋二酮的合成，取得很好的效果。在添加葡萄糖脱氢酶用于辅酶原位再生的条件下，可以催化合成100 g/L 左旋二酮。老黄酶对底物茶香酮的得率高（大于
95%）、产物左旋二酮的光学活性高（e.e%为100％），且产量高，大大降低了生产成本。
附图说明

[0018] 图1为老黄酶基因表达载体的构建图；图2为老黄酶基因诱导表达后的SDS-PAGE分析图。

[0019] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

[0020] 实施例1：老黄酶基因的克隆氧化葡糖杆菌Gluconobacter oxydans(菌种保藏编号：1.110)购于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），培养基（g·L-1）：葡萄糖 100 g，酵母提取物10 g，CaCO3 20 g，补蒸馏水至1 L。

[0021] 将G. oxydans接种于5 mL液体培养基中，30℃培养至对数生长期，使用DNA Kit (TIANGEN, China)提取G. oxydans基因组。

[0022] 构建引物加设酶切位点，引物序列如下：上游引物（OY1-sense含NcoⅠ）为：
5'- CATGCCATGGATGGAAGTTTCGATCAAGG -3'
下游引物（OY1 -anti含BamHⅠ）为：
5'- CGGGATCCATGGAAGTTTCGATCAAGGAGTAC -3'
所有引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。基因的PCR条件： 94℃变性5 min，按如下参数循环30次：94℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸45 s。最后72℃延伸10 min。
PCR反应结束后取产物2 μL，然后在浓度为0.8%的琼脂糖凝胶中，进行电泳分析。经凝胶成像系统成像确认片段大小正确后，采用TaKaRa公司的DNA纯化回收试剂盒（TaKaRa Agarose Gel DNA Purification）回收目的片段，序列如SEQ ID NO：1所示，该基因序列含有1104 bp碱基。

[0023] 实施例2：重组表达载体pET-22b-OY1的构建用NcoⅠ及BamHⅠ分别酶切pET-22b（购于Novagen默克中国）及所扩增含有两个酶切位点的目的基因（实施例1PCR扩增获得），分别胶回收已双酶切的目的片段和表达载体，将已双酶切的表达载体pET-22b与目的基因（SEQ ID NO：1所示的基因）用T4-DNA连接酶（购于TaKaRa公司）进行过夜连接，得到重组载体pET-22b-OY1；将10 μL的连接产物加入100 μL的大肠杆菌BL21感受态细胞中，冰上放置30 min，42℃热激90 s。冰上放置2 min。加入预热的
0.45 mL SOC培养基（2% (W/V)蛋白胨，0.5% (W/V)酵母浸粉，0.05% (W/V) NaCl，2.5 mM KCl，10 mM MgCl2，20 mM 葡萄糖。）。220 rpm 37℃ 1 h。将200 μL菌液加入含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃过夜培养12 16 h，得到重组菌E.coli BL21（含pET-22b-~
OY1）。构建图谱见图1。

[0024] 实施例3：老黄酶基因在大肠杆菌BL21中的诱导表达挑取重组菌E.coli BL21（含pET-22b-OY1）及对照菌E. coli BL21（含pET-22b）至含
100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。然后按2%接种量分别接种到新鲜含100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600约为0.6时，加入IPTG至终浓度0.2 mmol·L-1，30℃，220 rpm，诱导表达8 h后，离心(4℃，5000 rpm，15 min)，菌泥用100 mM 磷酸钠缓冲(pH 7.0)重悬，超声破碎细胞(功率300 W，超声3 s，间歇5 s，共5 min)，离心(4℃，12000 rpm，15 min)。SDS-PAGE分析显示，重组菌E.coli BL21（含pET-22b-OY1）表达出一条分子量约40 kDa的蛋白(见图2泳道3-OY1)，对照菌相应位置并没有明显表达条带（见图2泳道2-BL21）。分析蛋白的氨基酸序列，如SEQ ID NO：2所示，其包含367个氨基酸。

[0025] 上清酶活的测定：酶反应体系包括1 mM NADPH，10 mM茶香酮，1% 吐温80，100 mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)中进行测定。在30 °C，波长340 nm处检测吸光值变化。每分钟催化氧化1 μmol NADPH所需的酶量定义为一个活力单位(U)。

[0026] 蛋白采用Brandford法进行测定。结果显示，对照菌E.coli BL21（含pET-22b）的比酶活为0，而重组菌E.coli BL21（含pET-22b-OY1）的比酶活为10 U/mg。

[0027] 实施例4取实施例3诱导表达后离心收集的菌泥用100 mM 磷酸钠缓冲(pH 7.0)洗涤两次。称取
10 g（湿重）的大肠杆菌菌泥，悬浮于200 mL的pH 7.0 磷酸钠缓冲中。超声处理细胞(功率
300 W，超声3 s，间歇5 s，共30 min)，加入茶香酮100 g/L，葡萄糖脱氢酶5000 U，葡萄糖
150 g/L，NADP+ 0.2 mmol/L，25℃，200 rpm，24 h。产物左旋二酮的产量为98.4 g/L，产物的得率为：99.5%，光学纯度e.e%为100%。

[0028] 产品检测方法：反应结束后，加入等体积乙酸乙酯，剧烈振荡10 min然后放置两小时，8000 rpm离心10 min分离有机层和水层。小心吸取上层乙酸乙酯过有机膜，加入内标，保存测样。

[0029] 测定茶香酮和左旋二酮的浓度使用美国 DIONEX 公司UltiMate3000高效液相仪，色谱柱为日本Nacalai Tesque公司Cosmosil 5C18-ARII column（250×74.6 mm）色谱柱；流动相为50% 甲醇；流速1 mL/min；柱温为35℃；
使用气相7820A(Agilent)对左旋二酮的旋光性进行分析，色谱柱为BGB-176 毛细管柱（BGB Analytik AG；30m×0.25mm；Switzerland）。程序为：检测器FID，温度210℃，汽化室温度210℃，柱温150℃，柱头压0.03MPa，氢气0.05MPa，空气 0.1MPa，尾吹0.08MPa。产物左旋二酮的对映体过量值(e.e.%)由下式计算：对映体过量值(e.e.%)＝ ，式中S为右旋二酮的浓度，R为左旋二酮的浓度。