具有产量增加潜能的植物生长相关ENOX蛋白、序列和方法 |
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| 申请号 | CN201380079129.X | 申请日 | 2013-06-25 | 公开(公告)号 | CN105705642A | 公开(公告)日 | 2016-06-22 |
| 申请人 | 摩-纽克企业; | 发明人 | D.J.莫雷; D.M.莫雷; | ||||
| 摘要 | 本文描述了可用于增加转基因 农作物 的产量的物质组合物和方法。公开了ENOX蛋白的序列信息和用于 转染 的方法。另外，公开了ENOX蛋白的小分子激活剂。公开了来自 酵母 菌 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、拟南芥(Aribidopsis thaliana)和桃树(Prunus persicaria)的ENOX蛋白的序列信息。公开了可表现出一种或多种下列特征的转基因 微 生物 和/或 植物 ，所述特征包括但不限于 加速 成熟、细胞大小增加、站立能 力 增加、根和木质部发育增加以及产量增加。 | ||||||
| 权利要求 | 1.包含编码外-烟酰胺二核苷酸氧化酶二硫键巯基互换蛋白的分离DNA的DNA构建体。 |
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| 说明书全文 | 具有产量增加潜能的植物生长相关ENOX蛋白、序列和方法发明领域 [0001] 在某些方面，本发明涉及基因工程、分子生物学、植物生物学、细菌学和农业领域。 [0002] 发明背景由于许多因素如天气、昆虫或其它动物侵袭，农民可能遭受低作物产量或作物歉收。当此发生时，其可对农民具有经济影响。有时，由于这样的事件农民可能希望重新种植一种作物来减轻其损失。在其它时候，农民可能只是希望通过种植第二种作物来增加其生产力。 [0003] 在单个季节内种植一种或多种作物的这种实践被称为“双作”或“复种”。复种允许农民在给定的季节使用相同数量的土地同时增加其生产力。 [0004] 然而，取决于计时，在季节内可能没有足够的剩余时间使第二种作物成熟。因此，成功的复种季节需要小心管理作物的种植日期和收获日期。 [0005] 种植的第二种作物可与种植的第一种作物相同，或其可为不同的。例如，可在第一批大豆或第一批小麦之后种植第二批大豆。 [0006] 根据该背景，存在对具有增加的产量和/或减少的成熟时间的改善的和/或备选的农产品的需求。本发明的各方面致力于这些需求。 [0007] 发明概述在某些实施方案中，本发明描述了来自琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)的植物候选 组成型ENOX (CNOX或ENOX1)蛋白的克隆、表达和表征。编码该335 (165)个氨基酸的蛋白的基因参见登录号XP-002882467。先前通过定点诱变鉴定并且存在于植物的候选ENOX1蛋白中的ENOX蛋白的特征性功能基序包括腺嘌呤核苷酸和铜结合基序连同必需的半胱氨酸。然而，人ENOX2的药物结合基序(EEMTE)序列缺失。在大肠杆菌中表达的重组蛋白的活性不受辣椒素、EGCg和其它ENOX2-抑制物质影响。用NAD(P)H和还原型辅酶Q二者作为底物均显示周期性氧化活性。结合的铜对于活性必不可少并且活性受到ENOX1-特异性抑制剂苦木内酯D抑制。褪黑激素的加入使24 min周期相位同步(phase)以致下一个完整的周期在褪黑激素加入后24 min开始，如同是一般性ENOX1活性所特有的。周期性蛋白二硫键-巯基互换活性(disulfide-thiol interchange activity)连同24 min ENOX1蛋白周期特有的2氧化加3互换活性模式也得到证明。纯化的植物ENOX1蛋白的浓缩溶液形成不可溶的聚集体，缺乏酶活性，与淀粉样蛋白相似。聚集的制备物通过等电聚焦恢复活性。上述特征与哺乳动物ENOX1的那些类似，使来自拟南芥属(Arabidopsis)的ENOX1成为植物中过表达的理想候选，作为增加生物量和产量的手段。 [0009] 另外，本发明的实施方案描述了通过向植物施用ENOX1的小分子量激活剂增加植物产量的方法。指定为TR-III，优选半胱氨酸的激活剂作为叶面喷洒以约0.005-1.0磅/英亩(lb/A)的量施用。优选地，施用0.01 lb/A的半胱氨酸。此外，本发明提供增强植物生长的方法，所述方法包括作为种子处理向植物种子施用半胱氨酸。半胱氨酸以约0.001-1 mg/g合适载体(mg/g)例如滑石的量施用到种子。优选地，半胱氨酸在0.002-0.02 mg/g滑石的范围之间施用。本发明还提供增强植物根生长和茎直径(增加的站立能力)的方法，其包括向植物施用半胱氨酸。半胱氨酸以约0.005-1.0 lb/A的量施用。优选地，给植物施用0.01 lb/A的半胱氨酸。 [0010] 在另一个实施方案中，本发明公开了植物候选组成型ENOX蛋白的克隆、表达和表征，在某些实施方案中所述蛋白被天然(IAA)和合成的(2,4-二氯苯氧乙酸，2,4-D)生长素植物生长调节因子以约1 μM的最适条件激活，并且更高的浓度不太有效。先前通过定点诱变鉴定并且在候选的生长素-激活的ENOX (dNOX)中存在的植物ENOX1蛋白的特征性功能基序，除了先前鉴定的生长素结合基序外还包括腺嘌呤核苷酸和铜结合基序连同必需的半胱氨酸。通过氧化的[NAD(P)H和还原型辅酶Q作为底物]均显示周期性氧化活性，以及对于蛋白二硫键互换，产生其它生长-相关ENOX蛋白的24 min周期性特征性的2氧化加3互换活性模式。结合的铜对于活性必不可少并且活性受到ENOX1-特异性抑制剂苦木内酯D抑制。制备物在生长素不存在时缺乏活性。无活性的生长素2,3-D无效，如ENOX2抑制剂一样。纯化的植物ENOX1蛋白的浓缩溶液形成不可溶的聚集体，缺乏酶活性，与淀粉样蛋白相似。聚集的制备物通过等电聚焦恢复活性。上述与哺乳动物ENOX1的那些类似的特征使植物dNOX成为在植物中过表达的第二候选，作为增加生物量和产量的手段。 [0013] 附图简述图1. 细胞生长与ENOX1活性相关。 [0014] 图2. 人ENOX1过表达增加细胞大小。 [0015] 图3. NCBI参考序列：XP_002882467.1 (SEQ ID NO 5)。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) YML117w (SEQ ID NO: 6)与拟南芥属ENOX1 (SEQ ID NO: 7)的比对。重组拟南芥属ENOX1氨基酸84-126与YML117W氨基酸932-968之间存在37% (16/43)的同一性和58% (25/43)的相似性。 [0016] 图4. 在银染色的15% SDS-PAGE上显示的14 kD重组拟南芥属ENOX1的表达。泳道1和2：pET11a-AraENOX1转化的大肠杆菌的全细胞(2 µl)；泳道3：弗式压碎器压碎的pET11a-AraENOX1转化的大肠杆菌的沉淀(2 µl)。表达的重组拟南芥属ENOX1 (箭头)存在于弗式压碎器压碎的大肠杆菌的沉淀中。 [0017] 图5. 对于IEF纯化的拟南芥属ENOX1的级分显示12 min期间对作为NADH消耗的量度的A340减少的连续跟踪。测定条件如(Jiang, Z., Gorenstein, N. M., Morré, D. M.和Morré, D. J. 2008.Biochemistry 47:14028-14038)所描述的，不同之处在于NADH浓度为0.75 mM和使用SPECTRA max 340PC微板阅读器自动收集和存储数据。混合物在200 μl的总体积中包含大约20 μg ENOX1。 [0018] 图6. IEF-纯化的重组拟南芥属ENOX1的NADH氧化酶活性。图示了5个极大值的振荡模式。相隔6 min的主要极大值由标记为1和2的极大值指示。之后的三个次要的极大值与主要的极大值分离并且彼此相隔4.5 min，建立了24 min的周期[6 + (4.5 x 4) = 24]。 [0019] 图7. IEF-纯化的重组拟南芥属ENOX1的NADH氧化酶活性和对1 µM褪黑激素的反应。加入褪黑激素后，新的极大值在褪黑激素加入(箭头)之后24 min出现，其为ENOX1的一个特征。 [0020] 图8. 从二硫代二吡啶(DTDP)底物的裂解测量的IEF-纯化的重组拟南芥属ENOX1的蛋白二硫键-巯基互换活性。观察到振荡的活性，活性与相隔4.5 min的三个极大值而非相隔6 min的两个极大值最密切相关。 [0021] 图9. 通过A410(A)的增加或A290 (B)的减少测量的重组拟南芥属ENOX1氧化氢醌(还原型辅酶Q)的能力。如图6的NADH氧化一样，活性振荡，具有相隔6 min的突出的极大值(箭头)，以建立包含相隔4.5 min的3个额外的极大值(总计5个极大值)的24 min周期。 [0022] 图10. 通过等电聚焦，纯化和活化重组拟南芥属ENOX1。 [0023] 图11. 特异性ENOX1苦木苦味素抑制剂苦木内酯D对重组拟南芥属ENOX1的抑制。 [0024] 图12. 用TFA + 浴铜灵减小的重组拟南芥属ENOX1的NADH氧化酶活性。A. 在TFA的存在下，24 min的周期未受影响。B. 当用TFA和浴铜灵测定时，24 min的周期大大减少。C. 通过透析去除浴铜灵和重新加入铜恢复全部的活性。 [0025] 图13. 当在D2O中测定时拟南芥属ENOX1的NADH氧化酶活性显示24 min至30 min的周期长度增加。重水增加周期长度的作用为生物钟的标志之一。 [0026] 图14. 半胱氨酸对NADH氧化的刺激对在细菌中表达的重组ENOX1蛋白的ENOX1活性周期的极大值③特异。 [0027] 图15. 使大豆种子于黑暗中在蛭石中发芽并收集恰在钩部分(hook)下方的2 cm下胚轴切片。将这些均质化，制备质膜，并测定ENOX1活性。 [0028] 图16. 如图15中，除了在温室中生长1个月后的大豆植物的叶组织(第一和第二个三叶)外。 [0030] 图18. 如图17中，不同之处在于使未处理的种子发芽和将切除的芽转移至在水中制备的不同浓度的TR-III溶液中。 [0031] 图19. 植物在温室中自处理的种子生长。 [0032] 图20. 如图19中，不同之处在于植物来自未处理的种子和用不同比率的TR-III喷雾。该实验仍在进行中但在0.01 lb/A TR-III时观察到上胚轴增大，与过去一样，0.001或0.1 lb/A作用很小或无作用。 [0033] 图21. 田间实验中每棵大豆植物的豆荚，该实验比较了无TR-III (实心符号)与7月3日作为叶面喷洒施用的0.01 lb/A TR-III (开符号，虚线)。 [0034] 图22. 比较无TR-III、TR-III 1:50和TR-III 1:500，从用滑石处理的种子生长的植物的大豆茎的次生木质部的增加。 [0035] 图23. 来自图21的田间实验的大豆的站立能力。无TR-III植物(左)严重倒伏。TR-III处理的植物(右)不倒伏。 [0036] 图24. 重组生长素-活化的ENOX蛋白(ABP-20)的序列(SEQ ID NO: 8)。 [0037] 图25. 在银染色的15% SDS-PAGE上显示的20 kD重组ABP-20的表达。泳道1：携带载体pET-11b的全细胞；泳道2：pET11b-ABP-20转化的大肠杆菌的全细胞(2 µl)；泳道3：弗式压碎器压碎的pET11b-ABP-20转化的大肠杆菌的上清液(2 µl)；泳道4：弗式压碎器压碎的pET11b-ABP-20转化的大肠杆菌的沉淀(2 µl)。表达的重组ABP-20存在于弗式压碎器压碎的大肠杆菌的沉淀中(箭头)。 [0038] 图26. IEF纯化的重组ABP-20的NADH氧化酶活性。在60 min时加入2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D) (1 µM)以活化该酶。图示了5个极大值的振荡模式。相隔6 min的主要极大值由单箭头指示。之后的三个次要极大值与主要极大值分离并彼此相隔4.5 min，建立了24 min的周期[6 + (4.5 x 4)] = 24]。 [0039] 图27. 如图26，不同之处在于通过60 min后加入的10 μM吲哚-3-乙酸(箭头)活化。 [0040] 图28. 从二硫代二吡啶(DTDP)底物的裂解测量的IEF-纯化的重组ABP-20的蛋白二硫键-巯基互换活性。60 min时加入2,4-D (1 µM)以活化该酶。观察到振荡的活性，活性与相隔4.5 min的三个极大值③、④和⑤而非相隔6 min的两个极大值①和②最密切相关。 [0041] 图29. 通过A410(A)的增加或A290 (B)的减少测量的重组ABP-20氧化氢醌(还原型辅酶Q = 泛醇)的能力。如图6的NADH氧化一样，活性振荡，具有相隔6 min的突出的极大值(箭头)，建立包含相隔4.5 min的3个额外的极大值(总计5个极大值)的24 min周期。60 min时加入2,4-D (1 µM)以活化该酶。 [0042] 图30. 用TFA + 浴铜灵减小的重组ABP-20的NADH氧化酶活性。A. 在TFA的存在下，24 min的周期未受影响。B. 当用TFA和浴铜灵测定时，24 min的周期大大减少。C. 通过透析去除浴铜灵和重新加入铜恢复全部的活性。从开始时加入2,4-D (1 µM)以活化该酶。 [0043] 发明详述为了促进理解本发明原理的目的，现在将参考某些实施方案并且将使用特定的语言对 其进行描述。然而要理解，不因而意在限制本发明的范围，考虑如本发明所涉及领域的技术人员通常会想到的本文所描述的发明原理的这样的变更和进一步的修饰，以及这样的进一步的应用。 [0044] 冠词和短语例如，“所述”，“一个”、“一种”、“至少一个”和“第一”、“包括”、“具有”和“包含”在此处不限于仅指一个，而是囊括的和开放式的，还任选包括两个或多个所述要素和/或其它要素。关于本文的词语或术语或短语的含义，其中的字面差异并非多余的并且具有不同的含义，并且不与同一权利要求或其它权利要求中的词语或术语或短语同义。 [0045] 本专利基于植物、动物和酵母菌的生长-相关细胞表面NADH氧化酶(ECTO-NOX = ENOX)蛋白家族的潜在效用。ENOX (ECTO-NOX = 外-烟酰胺二核苷酸氧化酶二硫键巯基互换)蛋白显示交替的氰化物-不敏感的、计时的还原型辅酶Q (CoQH2) (NAD(P)H)氧化酶(NOX)活性和蛋白二硫键-巯基互换活性(Morré, D. J. 1998.In: Asard, H., Bérczi, H. and Canbergs, R., eds., 质膜氧化还原系统及其在生物应激和疾病中的作用(Plasma Membrane Redox Systems and Their Role in Biological Stress and Disease), Kluwer, Dordrecht, pp. 121-156;Morré, D. J.和Morré, D. M.2003. Free Radical Res. 37: 795-808)。ENOX蛋白执行质膜电子转运和蛋白二硫键-巯基互换活性，后者驱动细胞增大。我们已经从拟南芥属、酵母菌(酿酒酵母)和人鉴定和克隆了组成型的ENOX (ENOX1)蛋白以及同样为人源的癌症-特异性ENOX2形式。我们有证据表明一种或多种这些ENOX家族成员在农作物中适当过表达将导致显著增加的产量。ECTO命名源自其在质膜外表面上的外部定位并将其与所有其它细胞NADH氧化酶区别开来。该外部定位以及氧化和蛋白二硫键互换活性的交替已经在大范围的动物和植物组织及细胞系中得到证明(D. J. Morr和D. M. Morré, 2012, ECTO-NOX蛋白(ECTO-NOX Proteins), Springer, New York, 507 pp)。在ENOX蛋白中，组成型CNOX或ENOX1由于对于在生产农业中过表达具有最大的效用而显现出来。 [0046] 我们在ENOX1蛋白中的兴趣基于近30年发表的表明ENOX1在植物和动物细胞二者中驱动细胞增大的重要和必要作用的基础研究(D. J. Morré和D. M. Morré, 2012, ENOX蛋白(ENOX Proteins), Springer, New York, 507 pp)。大约100位同行评审了已经发表的追溯到20世纪60年代早期的与理解细胞生长增大期有关的期刊文章，ENOX蛋白从20世纪70年代中期 -20世纪80年代中期开始涉及。 [0047] 实验室结论主要基于三条证据线索：1. 细胞增大与ENOX1活性之间的强烈相关(图1)。 [0048] 2. ENOX1和细胞增大二者的相对特异的抑制剂对细胞增大(和生长)的抑制(Morré, D. J.和Greico, P. A. 1999.Int. J. Plant Sci. 160:291-297)。 [0049] 3. 克隆的ENOX1在哺乳动物细胞系(HEK)中的过表达导致细胞增大的速率增加和细胞体积增加(Bosneaga, E.和Tang, X. Unpublished)。 [0050] 对细胞生长的伸长(细胞扩大)期必不可少的生长-相关细胞表面ENOX-1蛋白首先在人ENOX1基因中克隆(Jiang, Z., Gorenstein, N. M., Morré, D. M.和Morré, D. J. 2008.Biochemistry 47:14028-14038)，该基因在Williams 82大豆中过表达。结果为更短的节间，总体约2.5个结荚节/植物的增加，约3英寸的植物高度增加，木质部和茎直径的增加和主要由额外的结荚节引起的15%的产量增加。同时，作为用于在植物中过表达的更可能的候选，如同来自拟南芥属的ENOX1，克隆了来自酵母菌酿酒酵母的ENOX1。还克隆了植物独特的第二种ENOX1样蛋白(dNOX)，其活性依赖于天然或合成的生长素的存在。 [0051] 另外，我们发现了一种专有的小分子ENOX1活化剂，其作为种子处理有效并且已经在很少费用或无额外费用时产生大幅增加的产量，特别是对于双作大豆。种子处理的一个优点在于其加速晚夏缩短的光周期的植物发育以在可用以生产作物的时间内使豆荚产量达到最大。 [0052] 哺乳动物ENOX1的过表达来自人基因组的组成型ENOX1蛋白的基因由Jiang等人(2008)克隆，命名为ENOX1 (以 前为CNOX)，类似于增殖-诱导基因38蛋白。所述蛋白在大肠杆菌中克隆和表达(该蛋白的NCBI登录号为AB028524)。 [0053] 当用NusA标签在细菌中表达时，cENOX1具有来自其它哺乳动物或植物源的ENOX1蛋白的活性特征。在人类基因组中，该基因位于染色体13上(13q 14.11)并且编码643个氨基酸的开放阅读框。编码cENOX1的基因存在于所有目前测序的脊椎动物和昆虫物种的基因组中并且该蛋白高度保守。在具有XY性别决定系统的哺乳动物中，该基因具有X染色体的常染色体定位。尽管具有常见的功能基序，但哺乳动物ENOX1与植物、酵母菌或原核生物中的ENOX1之间未发现相似性，但植物和酵母菌ENOX1副本与人基因不具有序列相似性。 [0054] 为了将概念变为实践，通过Iowa State University, Ames, Iowa的基因转染服务(Gene Transfection Service)将哺乳动物ENOX1基因引入大豆中。在2011和2012两年在两个地点Indiana和Illinois，释放调节物质用于田间试验。使用旗子和标桩以允许的区域作为边界确定释放位点。生长季节结束时，除了收获的种子以外将所有的调节物质留在调节位点并通过耕作破坏。 [0055] 基因型：目的基因： 启动子：来自花椰菜花叶病毒的35S – 增强的35S 增强子：来自烟草蚀纹多病毒(polyvirus)的TEV– 来自35S启动子的额外上游序列 基因：来自智人的CNOX – 使用密码子使用表设计的基因 终止子：来自根癌农杆菌的NOX – 来自T-DNA的NOX 3’ 选择标记： 启动子：来自花椰菜花叶病毒的35S – 增强的35S 增强子：来自烟草蚀纹多病毒的TEV– 来自35S启动子的额外上游序列 基因：来自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的除草剂抗性 – 选择标记 终止子：来自根癌农杆菌的NOX – 来自T-DNA的NOX 3’ 在Williams 82中表达的CNOX (ENOX1)合成基因构建体的2011田间试验的性能评估 2011年大约一半的可用于评估的调节物质分布在两个释放位点之间，Atlanta, Indiana位点约三分之二，Downs, Illinois位点约三分之一。 [0056] 手工收集和收获所有的转基因植物并与Iowa State University Williams 82变种加可比数量的来自Indiana和Missouri种子库的Williams 82植物比较(表1)。评估的表型参数在表2和3中列出。对从获自所有四个来源的种子生长的Williams 82植物进行比较(表1)。从Atlanta, Indiana释放位点收获在四个来源中平分并在与转基因植物完全相同的条件下生长的五十五(55)棵Williams 82，野生型非转基因植物，并从Downs, Illinois位点收获二十四(24)棵Williams 82植物。在Williams 82植物的四个来源之间未注意到差异。综合数据作为不同Williams 82来源之间的均值 ± 标准差呈现。 [0057] 从Atlanta, Indiana位点收获和分析了来自18个不同事件的一百一十五(115)棵转基因植物，从Downs, Illinois位点收获了来自5个事件的十一(11)棵植物。并非所有的事件都产生植物。收获所有达到成熟的转基因植物并包含在最终的数据汇总中。表2和3中给出的发现为产生植物的所有事件的平均值 ± 事件之间的标准差。 [0058] 比较野生型Williams 82与转基因，植物高度在很大程度上不受影响(表2)。来自Atlanta位置的结果(表2A)显示11%的结荚节增加、20%的满豆荚/结荚节增加和小而轻微显著的每颗豆子重量的增加。这三个参数(结荚节的增加、满豆荚/节的增加和每颗豆子重量的增加)提供了33%的组合增加，与每棵植物豆子总重量32%的增加有利地比较。 [0059] 用从Downs, Illinois位点收集的物质观察到相似的结果(表2B)。 [0060] 比较转基因植物与Williams 82植物的其他参数(表3)在很大程度上未改变。分枝程度、豆子/豆荚、空豆荚/植物(作为总豆荚的百分数；空豆荚从满豆荚计数中排除)与来自Atlanta, Indiana释放位点(表3A)或来自Downs, Illinois释放位点(表3B)的植物均无不同。仅对于从植物顶端起第九个节间处，约从顶端至基部的中间位置测量的茎直径，注意到差异。转基因植物的茎比来自相同位置的Williams 82植物平均厚15% (茎直径增加15%，来自Atlanta位点的转基因植物)和厚7% (来自Downs, Illinois位点的转基因植物)。 [0061] 在Atlanta释放位点的四个Williams 82种植区(planting)和Atlanta释放位点的转基因种植区中的三个包含23或更多(31 ± 8)棵相邻植物。来自这些植物的评估显示58 bu/A (Williams 82)和83 bu/A (转基因)的计算产量，总体增加43% (表2A)。 [0062] 绝对计算产量基于相隔5.5英寸的平均株距(相隔4英寸73%发芽)和30英寸的行距。比较中包含的Williams 82地块和转基因事件小块土地具有几乎完全相同的株距并且同样在30英寸的行中。Downs, Illinois释放位点没有足够的相邻植物，以允许类似有意义地计算每英亩的产量。 [0063] 促成产量增加的两个主要参数(结荚节数目增加伴随节间的相应缩短和每节的豆荚数目增加)对于两个释放位点在四个Williams 82来源之间和在所有具有小标准差和高统计显著性的事件之间重现性良好。通过比较来自Williams 82和转基因二者的分离植物，促成产量增加的主要参数不受行内的株距影响。然而，不能排除除转基因之外的对30 - 40%的表观产量增加的贡献因素。 [0064] 表1. 收获和分析的植物表2. 收获数据汇总 表3. 收获数据汇总 在Williams 82中表达的人ENOX1合成基因构建体的2012田间试验的性能评估 与2011相比，转基因植物更高，尽管个体高度与Williams 82重叠(二者中最高的植物 均为30英寸，但Williams 82包含更多较矮的植物(表4))。节长未增加。因此，节/植物增加，该特征与2012一致。同样增加的为结荚节/植物。豆荚/节、空豆荚、豆荚/结荚节、无豆荚节和茎直径未改变。 [0065] 与Williams 82的均值相比，每棵植物的豆荚增加16%并且大豆总重量增加15%。这与Atlanta的ST104-2-4 GH2010 (行11)的60 bu/A 15%的增加一致(与Williams ISU GH2010 (行1 + 行2)和Williams ISU GH2010 (行2B1)的均值52 ± 4 bu/A相比)，其中Williams ISU GH2010 (行1 +行2)在两个位置平行地比Williams 82 GH2010 (行2B1)产量更接近ST 104-2-4 GH2010行11。 [0066] 表4. 2012年收获的来自El Paso, Illinois的转基因大豆结果汇总从植物检索候选的组成型ENOX1 (ENOX1)：使用以ENOX1或ENOX2序列作为查询的蛋白 BLAST (基本局部比对检索工具)在不同数据库(非冗余蛋白序列、UniProt、EST和其它)中进行相似检索(Altschul, S., Madden, T. L., Schäffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W.和Lipman, D. J.1997.Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)，未发现具有显著相似性的植物蛋白。然而，从酿酒酵母克隆的ENOX1的序列(图3)确实显示显著的同源性。 [0067] 选择来自琴叶拟南芥的同源蛋白作为来自植物的组成型ENOX1的候选进行评估。 [0068] 质粒构建：通过将拟南芥属ENOX1序列插入pET11a载体(NheI和BamHI位点之间)制备携带拟南芥属ENOX1 (假定蛋白ARALYDRAFT_477943[Arabidopsis lyrata aubsp. Lyrata] XP_002882467的M458 - V580)序列的质粒。拟南芥属ENOX1序列由GenScript USA Inc. (Piscataway, NJ)合成。连接产物(pET11a-AraENOX1)的DNA序列通过DNA测序确认。 [0069] 重组拟南芥属ENOX1的表达：将pET11a-AraENOX1转化BL21 (DE3)感受态细胞。挑取单菌落并接种到5 ml LB + 氨苄青霉素 (LB/AMP)培养基中。将过夜培养物(1ml)稀释到100 ml LB/AMP培养基中(1:100稀释)。细胞在剧烈摇动下(250 rpm)于37℃生长至OD600 0.4-0.6，加入IPTG (0.5 mM)进行诱导。37℃摇动(250 rpm)孵育5 h后收集培养物。 [0070] 以5,000 g离心细胞6 min。然后将沉淀重悬在包含0.5 mM PMSF、1 mM苯甲脒和1 mM 6-氨基己酸的20 mM Tris-HCl, pH 8.0中并通过在20,000 psi通过弗式压碎器(SLM Aminco)裂解三次。约14 kDa的重组拟南芥属ENOX1的表达通过SDS-PAGE用银染色确认。转化的细胞在标准甘油储存液中于-80℃保存。在Criterion IEF凝胶(Bio-Rad, Hercules, CA)上进一步纯化拟南芥属ENOX1蛋白。将IEF凝胶切成7等段。每个切片代表的pH基于IEF标准(Bio-Rad)。将切片浸渍在15 mM Tris-Mes缓冲液pH 7中，4℃摇动过夜。测定无凝胶提取物的ENOX1活性。 [0071] 蛋白测定：通过二辛可宁酸(BCA)方法用牛血清白蛋白作为标准品测定蛋白浓度(Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mailia, A. K., Gartner, F. F., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Groeke, N. M., Olson, B. J.和Klenk, D. C.1985.Anal. Biochem. 150: 70-76) (BCA蛋白测定试剂盒, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)。 [0072] 酶活性测定：NADH的氧化在包含25 mM Tris-MES (pH 7.2)、100 μM GSH、1 mM KCN (以抑制线粒体氧化酶活性)、150 μM NADH和酶的反应混合物中于37℃在温度控制(± 0.5℃)和搅拌下根据在340 nm处测量的NADH的消失，通过分光光度法测定。测定之前，加入 1 μM还原型谷胱甘肽以在底物的存在下还原蛋白。10 min后，加入0.03%过氧化氢以在复性条件和在底物存在下再氧化蛋白以开始反应。使用成对的Hitachi U3210或成对的SLM Aminco 2000分光光度计测量活性，二者均连续记录。运行测定1 min并以1.5 min的间隔在同一样品上重复指定的次数。使用6.22 cm-1 mM-1的消光系数测定比活。 [0073] 还原型辅酶Q10 (CoQ10H2)的氧化作为在290 nM和410 nM二者处CoQ10H2的消失测量(19)。反应以加入40 μl 5 mM Q10H2开始(Tischcon Corp., Westbury, NY)。使用0.805 mM-1 cm-1的消光系数计算Q10H2氧化速率。 [0074] 蛋白二硫键-巯基互换根据二硫代二吡啶(DTDP)裂解引起的340 nm处的吸光度增加，通过分光光度法测定(Morré, D. J., Gomez-Rey, M. L., Schramke, C., Em, O., Lawler, J., Hobeck, J. 和 Morré, D. M. 1999.Mol. Cell. Bochem. 200: 7-13)。DTDP裂解为缓冲处理的(50 mM Tris-MES, pH 7)。测定用5 μl DMSO中的0.5微摩尔2,2’-二硫代二吡啶 (DTDP)预孵育(室温1 h)以与伴随质膜存在的内源性还原剂反应。10 min后，加入35 μl DMSO中的另外的3.5微摩尔DTDP以开始反应。终反应体积为2.5 ml。监测反应在340 nm处吸光度的增加。使用6.21的毫摩尔吸收系数计算比活。 [0075] 铜(II)从ENOX1的去除：通过使用配备10,000标称分子量限制ultracel YM膜的Centricon 浓缩器(Millipore Corporation, Danvers, MA)将IEF纯化的ENOX1浓缩至0.7 mg/ml。在15 μl 10 mM 浴铜灵存在或不存在下将样品(50 μl)与1 μl三氟乙酸(TFA)组合。室温孵育2 h后，将样品用20 mM Tris-HCl, pH 8在4℃透析过夜(Spectra/Pro透析膜，分子量截留值6-8,000，Spectrum Laboratories (Rancho Dominquez, CA))。 [0076] 半胱氨酸对ENOX1的活化(TR-III)：为了使用半胱氨酸(TR-III)活化植物ENOX1，将半胱氨酸作为溶液或粉末，或以其它合适形式直接施用于植物。半胱氨酸优选以约0.005 - 1.0 lb/a的量施用。在优选的实施方案中，施用0.01 lb/A的半胱氨酸。另外，半胱氨酸可以作为喷雾，单独或与其它物质例如除草剂组合施用。 [0077] 除了向植物施用半胱氨酸，本发明提供在种植前作为种子处理向植物种子施用半胱氨酸以增强生长。将半胱氨酸施用于种子在行播作物如大豆中引起产量增加。半胱氨酸优选以约0.001 - 1 mg/g合适载体的量施用于种子。例如，一种合适的载体为滑石。特别地，半胱氨酸以约0.002 - 0.02 mg/g滑石的量施用。半胱氨酸可作为喷雾、粉尘、油或以任何其它合适的形式或施用方法施用于种子。半胱氨酸还可与杀真菌剂、杀虫剂或肥料组合施用。半胱氨酸还可作为粉末、粉尘、浆液或液体形式的种子包衣施用。在一个实施方案中，半胱氨酸与其它化合物例如与杀真菌剂、与杀虫剂或与肥料组合施用于种子。优选地，植物种子在种植时用半胱氨酸与其它物质组合包覆。半胱氨酸可为多种形式，例如粉末形式、粉尘形式、浆液形式或液体形式以包覆植物种子。 [0078] 本发明还提供通过向种子施用半胱氨酸加速所有植物种子发芽的方法。半胱氨酸以10 mM - 1 nM的量施用。在优选的实施方案中，施用1 µM或2.5 g/cwt大豆种子的半胱氨酸。 [0079] 本发明还提供通过向植物施用半胱氨酸增强植物根生长的方法。半胱氨酸优选以约0.005 - 1.0 lb/A的量施用。在优选的实施方案中，施用0.01 lb/A的半胱氨酸。通过使用前述用于植物或种子的施用方法施用半胱氨酸以增强根生长。 [0080] 还提供用于通过施用半胱氨酸加速植物开始开花的方法。半胱氨酸以约0.005 - 1.0 lb/A的量作为叶面喷洒施用于植物。在优选的实施方案中，施用0.01 lb/A的半胱氨酸。 [0081] 检索来自植物的候选生长素-激活的ENOX1：在已知的生长素结合蛋白的文库中检索腺嘌呤核苷酸结合位点(GXGXXG)、潜在的蛋白二硫键互换位点(CKX)和铜结合位点(H(Y)XH(y)Y))。鉴定了一个这样的包含适当的序列基序G59LGIAG、C44KK、H106TH和L160LH，还包含生长素结合基序H106THP109GASEVLIVAQ (其包含铜I基序)的蛋白并选择其用于作为来自植物的生长素-刺激的ENOX1 (dNOX)的候选进行评估。 [0082] 质粒构建：通过将拟南芥属ENOX1序列插入pET11b载体(NheI和BamHI位点之间)制备携带开放阅读框[ABP-20 (桃树(Prunus persica))的M1 - N209]序列的质粒。DNA序列由GenScript USA Inc. (Piscataway, NJ)合成。连接产物(pET11b-ABP-20)的DNA序列通过DNA测序确认。 [0083] 重组dNOX的表达：将pET11b-ABP-20转化BL21 (DE3)感受态细胞。挑取单菌落并接种到5 ml LB + 氨苄青霉素 (LB/AMP)培养基中。将过夜培养物(1ml)稀释到100 ml LB/AMP培养基中(1:100稀释)。细胞在剧烈摇动下(250 rpm)于37℃生长至OD600 0.4-0.6，加入IPTG (0.5 mM)进行诱导。37℃摇动(250 rpm)孵育16 h后收集培养物。 [0084] 以5,000 g离心细胞6 min。然后将沉淀重悬在包含0.5 mM PMSF、1 mM苯甲脒和1 mM 6-氨基己酸的20 mM Tris-HCl, pH 8.0中并通过在20,000 psi通过弗式压碎器(SLM Aminco)裂解三次。约20 kDa的重组ABP-20蛋白的表达通过SDS-PAGE用银染色确认。转化的细胞在标准甘油储存液中于-80℃保存。在Criterion IEF凝胶(Bio-Rad, Hercules, CA)上进一步纯化重组蛋白。将IEF凝胶切成7等段。每个切片代表的pH基于IEF标准(Bio-Rad)。将切片浸渍在15 mM Tris-Mes缓冲液pH 7中，4℃摇动过夜。如下测定无凝胶提取物的ENOX活性： 定点诱变：根据Braman等人(Braman, J., Papworth, C.和Greener, A.1996.Methods Mol. Biol. 57:32-44)通过定点诱变用丙氨酸置换指定的氨基酸。剪接变体产物的编号的氨基酸和核苷酸位置是指为全长转录物的氨基酸分配的编号。 实施例 [0085] 候选植物ENOX1 (YML117W) (来自琴叶拟南芥的ENOX1)的鉴定基于通过与酿酒酵母ENOX1 (YML117W)比较的同源性(BLAST)检索(图3)。所选择的14 kDa氨基酸序列(图3)在拟南芥属XP002882467的氨基酸84-126与酵母菌EDN64277 (YML117W)的氨基酸932-968之间具有37%同一性和58%相似性。 [0086] 该14 kDa转录物内的潜在功能基序在与YML117W中的G958XGXXV对齐的G570XGXXL处包含潜在的NADH结合位点。潜在的蛋白二硫键位点位于M458XXXXCC和M527XXXXXXC连同C534处。潜在的铜位点位于H466PY、Y531LY (与M527XXXXXXC重叠)和Y479XXXXH处。 [0087] 分子量约14 kDa的重组拟南芥属ENOX1的表达通过SDS-PAGE用银染色确认(图4)。 [0088] 蛋白表征：IEF-纯化的重组MBP-标记的cENOX2制备物的连续跟踪说明了ENOX蛋白的振荡活性特征(图5)。快速活性(箭头)的间隔中穿插较小活性的间隔。周期长度为24 min。对于单独NADH或植物ENOX1在NADH不存在时，未观察到振荡。 [0089] 对于更详细的评估，在细菌中表达的重组植物ENOX1在每个1.5 min的1 min内平均的速率更清楚地显示了ENOX1蛋白特有的对外源添加NADH的氧化的振荡模式(图6)。重复模式为5个极大值的重复，其中两个相隔6 min (箭头)，剩余的相隔4.5 min [6 + (4 X 4.5) = 24 min]。如来自其它来源的ENOX1蛋白的特征，通过加入1 µM 褪黑激素使振荡模式相位同步(phase)(图7)。褪黑激素加入后恰好24 min观察到新的极大值并在其后通过褪黑激素加入进行相位同步而继续。 [0090] 如同一般性ENOX蛋白的特征，该蛋白还显示蛋白二硫键-巯基互换(蛋白二硫键异构酶)活性，其通过二硫代二吡啶基底物的时间-依赖性裂解说明(图8)。观察到与对于NADH氧化相似的具有24 min的周期长度的振荡模式(箭头)。NADH氧化和蛋白二硫键互换两种活性的主要极大值交替。 [0091] 重组ENOX1在标准测定中氧化还原型辅酶Q (图9)，活性在A410处(图9A)或在A290处(图9B)测定。如同NADH氧化(图6)和二硫代二吡啶裂解(图8)，重现了具有24 min周期的特征性振荡模式(箭头) (图9)。质膜的氢醌(对于动物还原型辅酶Q/对于植物还原型辅酶Q或叶绿醌)为ENOX蛋白的生理学底物。 [0092] 主要通过减少重组蛋白的聚集，取得所报道的比活需要通过等电聚焦进一步纯化。最高的比活在接近重组蛋白的计算等电点的约6.9的聚焦pH时取得(图10)。 [0093] 通过其对包括顺铂、脱氢雌马酚(phenoxodiol)、EGCg和辣椒素在内的多种ENOX2抑制剂的抗性进一步将从IEF凝胶洗脱的ENOX活性鉴定为ENOX1，所有抑制剂均在足以完全抑制ENOX2活性的浓度检验(表5)。用从IEF凝胶洗脱的ENOX，重组拟南芥属ENOX1蛋白，未观察到抑制。活性受到ENOX1-特异性性苦木苦味素抑制剂苦木内酯D (图11)连同生长调节性除草剂氟磺酰草胺(mefluidide)和磺酰磺隆(sulfosulfuron)抑制(表5)。在1 µM时约2倍刺激大豆质膜NOX活性的生长素除草剂2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，没有作用(表5)。 [0094] dNOX活性需要铜存在：铜对于dNOX活性必不可少(图30)。当在三氟乙酸存在下解折叠时，IEF-纯化的dNOX在透析后和在生理pH时保留活性(图30A)。然而，若dNOX在三氟乙酸加铜螯合剂浴铜灵存在下解折叠，则活性丧失(图30B)。随后通过透析去除浴铜灵并在铜存在下于生理pH时重折叠，活性恢复(图30C)。 [0095] 在氧化氘中的周期长度：当在重水中测定ENOX1活性时产生周期长度从24 min增加至约30 min的活性模式(图13)。 [0096] 半胱氨酸对NADH氧化的刺激：半胱氨酸对NADH氧化的刺激对细菌中表达的重组拟南芥属ENOX1蛋白的ENOX1活性周期的极大值③特异(图14)。 [0097] 表5. IEF-纯化重组拟南芥属ENOX1的NADH氧化酶活性和对ENOX2抑制剂，2,4-D和ENOX1抑制剂苦木内酯D的反应。3个测定的均值 ± 标准差平行测定导致> 90%的重组人ENOX2抑制的顺铂、脱氢雌马酚、EGCg和辣椒素浓度。然 而，使用的酪醇和没食子酸的浓度导致> 90%的arNOX (ENOX3)抑制，在约两倍刺激大豆dNOX的1 μM 2,4-D没有作用。苦木内酯D为一般的ENOX1抑制剂。 [0098] 添加的TR-III增强大豆生长的期望基于以下两个前提：1. ENOX1细胞表面和生长-相关蛋白与细胞伸长(增大)活性速率通常成正比；和 2. TR-III通过ENOX1蛋白的构象变化不可逆地活化ENOX1。 [0099] 从经处理种子生长的幼苗如预期的显示提高的ENOX1活性。 [0100] 如图16中所示，从TR-III处理的种子生长的植物的叶显示提高的ENOX1，提高比例与图15中黑暗-生长的幼苗大致相同。 [0101] TR-III对ENOX1活性的不可逆刺激如预期持续并且似乎通过募集过程(recruitment process)维持。 [0102] 与Escalate相比，用2.5 g/cwt TR-III处理的幼苗的1周后生长增强，但更低或更高的比率未增强(图17)。 [0103] 用Escalate + 2.5 g/cwt TR-III进行种子处理增强上胚轴伸长，但并非以与ENOX1活性的ENOX1刺激成比例的方式，因为0.25或25 g/cwt无作用。 [0104] TR-III在约10-7 M的狭窄浓度范围内刺激芽生长(图18)。 [0105] 在温室研究中TR-III增强了用TR-III喷雾的大豆植物的生长(表6)。 [0106] 仅用Escalate + 0.25 g/cwt TR-III时上胚轴伸长增强(与未处理或单独Escalate相比50%) (图19)。 [0107] 生长反应与平行测量的TR-III对叶ENOX1水平的作用不相似。 [0108] 0.01 lb/A时观察到上胚轴增大。如过去一样，TR-III在0.001或0.1 lb/A时作用很小或无作用(图20)。 [0109] 在温室研究中Escalate加0.25和2.5 g/cwt的TR-III增加重量和茎直径(表7)。 [0110] TR-III种子处理增强的ENOX1活性在从温室生长大豆的1 cm茎段分离的质膜中反映出来(表8)。对于TR-III的两个比率，均存在平均1节/植物的增加和1.2个豆荚/节-1.8个豆荚/节的增加。分枝数目从对于单独的Escalate 0.5个/植物增加至对于Escalate + TR-III 1.5-1.6个分枝/植物。总之，以平均2个豆荚/分枝、1个额外的节和0.6个额外的豆荚/节计，如所观察到的产生(2 + 2 + 6 = 10)个额外的豆荚/植物。每个豆荚产生约0.25 g豆子，这转化为10 X 0.25 g = 2.5额外克豆子/植物，与对于单独的Escalate 2.8 g/植物相比，这使TR-III小块土地的产量为2.8 + 2.5 = 5.3克/植物(表9)。低和高TR-III比率之间的主要差异为变异性。用0.25 g/cwt TR-III，与单独的Escalate相比仅重要参数轻微显著。然而，用2.5 g/cwt TR-III，由于单独的Escalate 和TR-III加2.5 g/cwt Escalate二者的重复试验之间惊人的一致，与单独Escalate的差异非常显著。 [0111] 11/5/12收获的双作大豆植物通过增加的豆荚/植物、增加的节/植物、分枝/植物和茎直径响应TR-III种子处理(表9)。植物高度未受影响。 [0112] 双作大豆响应TR-III的一个主要指标为略低于第一节的植物基部处茎直径的增加(表9)。茎变厚通过组织学分析确认(表10)。用在九月初收集的样品，与对于单独的Escalate 2.7 +/- 0.3 mm的木质部相比，Escalate + 2.5 g/cwt TR-III具有3.3 +/- 0.4 mm 的木质部(p = 0.0847)，这转化为约40%的木质部体积增加。收获时，与对于单独的Escalate 4.2 mm的木质部相比，对于Escalate + 2.5 g/cwt TR-III，木质部的量为5.3 mm。 [0113] 当校正站立计数(stand count)时，对于Escalate + 2.5 g/cwt TR-III，双作大豆产量增加23%。 [0114] 与在温室中的第二个和第三个三叶的叶子之间收获的1 cm茎段的质膜ENOX1活性增加70%相比(表11)。 [0115] 表6. TR-III喷雾。温室生长的375 NR大豆在种植后14天喷雾并在喷雾后10天测量。 [0116] 表7. 子叶以上第一个节间的重量和茎直径。3个重复试验的均值，每个重复试验5棵植物。种植后40天温室生长的375 NR大豆。 [0117] 表8. 种植后40天在温室生长的375 NR大豆的第二和第三个三叶的叶子之间收获的2 cm茎段的质膜ENOX1活性。来自3个重复试验的双份测定，每个重复试验5棵植物。 [0118] 表9. 2012 Arcadia South DC大豆处理研究的汇总。Beck Plots, Atlanta, IN.种植：6/27/12耕作：免耕 前作物：小麦 行：11 行宽：7.5” 重复试验：3 收获：11/05/12(平均20棵植物/重复试验) * 不显著 ** p = 0.075-0.098 (轻微显著) *** p = 0.0025-0.0039 (非常显著) **** p = 0.0001-0.0005 (极其显著) 表10. 从3棵成熟期植物的10-12个切片组织学测量的大豆木质部直径和面积。 [0119] 表11. 来自在Becks 375 NR温室生长大豆的第二和第三个三叶的叶子之间收获的1 cm茎段的质膜ENOX1活性。比较3盆每盆5棵植物的平均值 ± 标准差的双份测定(测定各植物)。 [0120] 表12. 种植后2个月在温室中生长的转基因ST109-2-4 (10棵植物)和Williams 82 ISU (20棵植物)大豆的生长和质膜ENOX1活性。 [0121] 在从新出现三叶的叶子和新出现三叶的叶子下1 cm收获的茎制备的质膜上测量ENOX1活性。三叶的叶子和茎组织并无不同，所报告的值为二者的平均值 ± 标准差。 [0122] *与Williams 82 ISU显著不同 p < 0.001**与Williams 82 ISU显著不同 p = 0.015 与Williams 82相比在温室中种植后2个月收获的ST-109-2-4大豆植物显示80%提高的 与从新出现三叶的叶子和恰在新出现的三叶下方收获的茎段分离的质膜相关的ENOX1活性。然而，植株仅高16%并且基部茎直径仅增加5%。转基因ST-109-2-4和Williams 82植物二者的质膜ENOX1活性均以约12%响应加入的100 µM半胱氨酸。这些数据证明转基因植物中过表达的ENOX1到达质膜并且仍响应加入的半胱氨酸但生长响应不成比例地更少。 [0123] 候选植物生长素-活化的ENOX蛋白(dNOX)的鉴定基于还包含已知ENOX蛋白的相应功能基序的已知生长素-结合蛋白的同源性检索。所选择的20 kDa的氨基酸序列，ABP-20 (图24，SEQ ID NO: 8)，在20 kD的转录物内包含所需的功能基序，包括在G59LGTAG处的潜在NADH结合位点、位于C44KK的潜在的蛋白二硫键位点以及顺着位于H106TH和L160LH的潜在的铜位点连同生长素结合基序H106THPGASSVLIVAQ。 [0124] 具有约20 kDa分子量的重组ABP-20的表达通过SDS-PAGE用银染色确认(图25)。 [0125] 蛋白表征：没有生长素添加时重组蛋白在纯化期间都不显示超过NADH自动氧化的背景速率的NADH氧化酶活性。添加生长素(例如，1 µM 2,4-D)时活性在基线活性之上增强10-20倍，IEF-纯化级分的平均比活为约0.6 ± 0.2 µmol/min/mg蛋白。 [0126] 对于更详细的评估，在细菌中表达和通过等电聚焦纯化的重组植物ENOX1在每个1.5 min的1 min内平均的速率清楚地显示ENOX1蛋白特有的对外源提供的NADH的氧化的振荡模式(图26)。重复模式为5个极大值的重复，其中两个相隔6 min (极大值①和②)，剩余的(极大值③、④和⑤)相隔4.5 min [6 + (4 X 4.5 min) = 24 min]。如来自其它来源的ENOX1蛋白所特有的，标记为①和②的极大值比极大值③、④和⑤更突出。当用2,4-D代替天然生长素，吲哚-3-乙酸(IAA)时获得相似的结果(图27)。 [0127] 如同一般性ENOX蛋白所特有的，该蛋白还显示蛋白二硫键-巯基互换(蛋白二硫键异构酶)活性，其通过二硫代二吡啶基底物的时间-依赖性裂解说明(图28)。观察到与对于NADH氧化相似的具有24 min的周期长度的振荡模式。如先前所报道的(Morré, D. J.和Morré, D. M.2003.Free Radical Res. 37: 795-808)，用DTDP，标记为③、④和⑤的极大值比标记为①和②的那些更显著，这提示NADH氧化和蛋白二硫键互换的主要极大值的交替。 [0128] 重组ENOX1在标准测定中氧化还原型辅酶Q (图29)，活性在A410处(图29A)或在A290处(图29B)测定。就NADH氧化而言(图27)标记为①和②的极大值比标记为③、④和⑤的那些更显著。质膜的氢醌(对于动物还原型辅酶Q/对于植物还原型辅酶Q或叶绿醌)为ENOX蛋白的生理学底物。 [0129] 主要通过减少重组蛋白的聚集，取得所报道的比活需要通过等电聚焦进一步纯化。最高的比活在接近重组蛋白的计算等电点pH 5.19的约5.0的聚焦pH时取得。 [0130] 活性受到硫醇试剂PCMB和PCMS (表12)抑制。无活性的生长素类似物2,3-二氯苯氧乙酸 (2,3-D)没有作用，如ENOX1-特异性苦木苦味素抑制剂苦木内酯D一样(表12)。抑制生长素诱导的生长但不控制植物生长(Morré, D. J., Crane, F. L., Barr, R., Penel, C.和Wu, L. Y.1988.Physiol. Plant. 72: 236-240)的抗癌药物顺铂、多柔比星(阿霉素)和ENOX2特异性苦木苦味素抑制剂glaucarubolone也抑制该重组蛋白的活性。生长惰性的反铂没有作用(表12)。 [0131] ENOX1活性需要铜的存在：铜对于ENOX1活性必不可少(图30)。当在三氟乙酸存在下解折叠时，IEF-纯化的ENOX1在透析后和在生理pH时保留活性(图30A)。然而，若ENOX1在三氟乙酸加铜螯合剂浴铜灵存在下解折叠，则活性丧失(图30B)。随后通过透析去除浴铜灵并在铜存在下于生理pH时重折叠，活性恢复(图30C)。 [0132] 通过定点诱变对ABP-20基序的功能分配的确认：对于dNOX (ABP-20)的特定功能基序通过定点诱变提供ENOX蛋白共有基序的功能分配的确认(表13)。在ENOX1蛋白共有的CKK基序内，对于NADH氧化和蛋白二硫键-二巯基互换活性二者C44A置换中的活性减少81%。假定腺嘌呤核苷酸结合基序中的G59A置换很大程度上消除了NADH氧化但对二硫键-巯基互换没有作用。生长素结合基序中的E113H置换还消除NADH氧化酶活性的生长素-刺激。假定铜位点的置换，H106A和H152A，使NADH氧化和二硫键-巯基互换二者的活性减少至与接近背景。 [0133] 表13. IEF-纯化的重组ABP-20的NADH氧化酶活性和对生长素及ENOX抑制剂的响应。3个测定的平均值 ± 标准差表14. 通过定点诱变对dNOX (ABP-20)的功能基序的确认 术语“一个”和“一种”和“所述”以及相似的提及对象在描述本发明的情境中，特别是在所附权利要求的情境中，解释为涵盖单数和复数二者，除非本文中另外指明或上下文明显矛盾。本文对数值范围的叙述仅意在用作逐一提及落入范围内的每个单独值的速记方法，除非本文另外指明，并且每个单独的数值如同其在本文中逐一列出而包括到说明书中。本文所述的所有方法可以以任何合适的次序实施，除非本文另外指明或另外与上下文明显矛盾。本文所提供的任何和所有实施例，或示例性语言(例如，“例如”)的使用，仅意在更好地阐明本发明并且不构成对本发明范围的限制，除非另外要求。说明书中的任何语言均不应解释为指示任何非-要求的要素为本发明的实践所必需的。 [0134] 尽管本发明已经在附图和前述说明书中详细说明和描述，但性质上其应被认为是说明性的而非限制性的，应理解的是仅显示和描述了优选的实施方案并且在本发明精神内的所有变化和修饰均期需得到保护。另外，本文引用的所有参考文献指示本领域的技术水平并且通过引用以其整体结合到本文中。 |
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