[0001] 本发明公开了一种利用沼液和造纸黑液制备木质素酶的方法，属于木质素酶制备技术领域。

[0002] 木质素酶是具有催化木质素氧化降解能力的一类酶的总称，这类酶催化氧化还原反应，系统名为氧化还原酶，俗名为脱氢酶，其包括四个组份：漆酶即系统名为本二酚氧化还原酶，作用与邻醌醇和对醌醇，氨基苯酚和本二胺的氧化反应；木质素过氧化物酶即系统名为木质素过氧化氢氧化还原酶，催化木质素的氧化反应；锰过氧化物酶即系统名为二价锰过氧化氢氧化还原酶，催化二价锰氧化成三价锰的反应，是木质素氧化降解；二芳基丙烷过氧化物酶又称木质素酶I即系统名为二芳基丙烷：氧，过氧化氢 氧化还原酶，催化许多相关典型化合物碳—碳键的断裂和苯甲醇氧化生成醛或酮。

[0003] 木质素酶不仅对木质素，而且对许多种类的有机物尤其是人工合成的有机污染物都有很强的降解能力，而且具有高谱、高效、低耗、高适用性等特点。这种特殊的降解机制在饲料工业、化学工业、煤炭化学和环境保护方面展现了巨大的应用前景，已经引起了学术界和工业界的广泛关注。

[0004] 目前木质素酶的生产大多采用合成培养基，进行液态深层发酵生产，必须添加昂贵的诱导物藜芦醇，并且发酵周期长，生产成本高，酶活低，难于进行大规模的生产。最近的几十年，学者逐渐开始用固态发酵技术生产木质素酶，它可模仿天然微生物的生长过程，生产人们需要的产品，但产量很低，实现工业化困难。

[0005] 本发明主要解决的技术问题：针对目前传统方法在制备木质素酶的过程中，大多数采用合成培养基进行液态深层发酵生产，且必须添加昂贵的诱导物，不仅发酵周期长、生产成本高，而且酶活性低，产量较少，难以大规模生产的现状，提供了一种利用沼液中丰富可降解木质素菌种，依附于自制的玉米秸秆中进行培养发酵，再通过造纸黑液中丰富的木质素，对其进行诱导筛选有益菌种，通过厌氧有氧两种发酵，最后通过浓缩喷雾干燥，从而得到利用沼液和造纸黑液制备木质素酶的方法。该方法操作工艺简便，利用造纸黑液为原料，不仅降低了生产成本，减少了环境污染，而且在无需添加昂贵诱导物的情况下制得的木质素酶酶活性高达550U/mL，产量较多，可进行大规模生产应用。

[0006] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：（1）取番薯去皮，将其切成边长为0.3～0.6cm的方块放入蒸锅中，向蒸锅中加入去皮后番薯质量60～65％的质量分数为0.9％的氯化钠溶液，搅拌均匀，再进行加热直至蒸锅内的液体沸腾，保持温度20～30min，自然冷却至室温，进行减压过滤，收集过滤液，得番薯营养液；
（2）按重量份数计，取40～50份上述所得的番薯营养液、20～25份蛋白胨、15～20份酵母浸膏、8～12份羧甲基纤维素钠、3～6份氯化钙、1～4份七水硫酸铁及1～2份硫酸二氢钾，搅拌均匀，在120℃下灭菌25～30min，得浸渍营养液；
（3）取玉米秸秆放入90℃的干燥箱中干燥10～15min，取出并浸泡于上述所得的浸渍营养液中，在30～35℃下浸泡过夜，按固液比1:3，再将浸泡后的秸秆取出放入经减压过滤后的沼液中浸泡1～2h，再将混合物移入发酵池内，密封发酵池，使用二氧化碳将发酵池内的空气排出；
（4）待上述空气排出后，控制发酵池内的温度为35～40℃，以130r/min搅拌发酵10～12天，在发酵过程中向发酵池内加入造纸黑液，起始加入量为发酵池容积的1～3％，每隔9～
10h，添加一次造纸黑液，每添加一次，造纸黑液的添加量比上一次添加量增加0.5～0.8％；
（5）待上述发酵结束后，以10m3/h的速率向发酵池内通入无菌风，通入时间40～50min，在通风结束后，收集发酵液，将发酵物放入挤压机中进行挤压直至无液体流出，收集挤压液，将其与发酵液混合放入离心机中，在3000～5000r/min下分离10～15min，收集上清液；
（6）把上述所得的上清液放入浓缩罐中浓缩，浓缩至原体积的30～40％，将所得的浓缩液放入喷雾干燥机中进行喷雾干燥，入口温度为110～120℃，出口温度为60～70℃，收集干燥物，即可得到木质素酶。

[0007] 本发明的应用方法是：在造纸行业进行生物制浆的过程中，向其中加入浆料质量5～10％的本发明制得的木质素酶，充分搅拌均匀，即可。不仅可以有效降低生产成本，使得纸浆具有更好的抗张强度和平滑度，而且可以提高纸浆得率，检测后发现，添加了本发明制得的木质素酶的纸浆得率比未添加本发明制得的木质素酶的纸浆得率高45％以上，可以大规模推广应用。

[0008] 本发明的有益效果是：（1）本发明方法独特新颖，不仅未添加昂贵的诱导物，而且以造纸黑液为原料，在降低了成本的同时减少了环境污染，属于环保生产工艺；
（2）本发明操作简单易行，可以显著提高木质素酶的活力，使得木质素酶酶活性从
500U/mL增加到550U/mL，且产量较多，可进行大规模生产应用。

[0009] 首先取番薯去皮，将其切成边长为0.3～0.6cm的方块放入蒸锅中，向蒸锅中加入去皮后番薯质量60～65％的质量分数为0.9％的氯化钠溶液，搅拌均匀，再进行加热直至蒸锅内的液体沸腾，保持温度20～30min，自然冷却至室温，进行减压过滤，收集过滤液，得番薯营养液；然后按重量份数计，取40～50份上述所得的番薯营养液、20～25份蛋白胨、15～20份酵母浸膏、8～12份羧甲基纤维素钠、3～6份氯化钙、1～4份七水硫酸铁及1～2份硫酸二氢钾，搅拌均匀，在120℃下灭菌25～30min，得浸渍营养液；之后取玉米秸秆放入90℃的干燥箱中干燥10～15min，取出并浸泡于上述所得的浸渍营养液中，在30～35℃下浸泡过夜，按固液比1:3，再将浸泡后的秸秆取出放入经减压过滤后的沼液中浸泡1～2h，再将混合物移入发酵池内，密封发酵池，使用二氧化碳将发酵池内的空气排出；待上述空气排出后，控制发酵池内的温度为35～40℃，以130r/min搅拌发酵10～12天，在发酵过程中向发酵池内加入造纸黑液，起始加入量为发酵池容积的1～3％，每隔9～10h，添加一次造纸黑液，每添加一次，造纸黑液的添加量比上一次添加量增加0.5～0.8％；待上述发酵结束后，以
10m3/h的速率向发酵池内通入无菌风，通入时间40～50min，在通风结束后，收集发酵液，将发酵物放入挤压机中进行挤压直至无液体流出，收集挤压液，将其与发酵液混合放入离心机中，在3000～5000r/min下分离10～15min，收集上清液；最后把上述所得的上清液放入浓缩罐中浓缩，浓缩至原体积的30～40％，将所得的浓缩液放入喷雾干燥机中进行喷雾干燥，入口温度为110～120℃，出口温度为60～70℃，收集干燥物，即可得到木质素酶。

[0010] 实例1首先取番薯去皮，将其切成边长为0.3 cm的方块放入蒸锅中，向蒸锅中加入去皮后番薯质量60％的质量分数为0.9％的氯化钠溶液，搅拌均匀，再进行加热直至蒸锅内的液体沸腾，保持温度20min，自然冷却至室温，进行减压过滤，收集过滤液，得番薯营养液；然后按重量份数计，取40份上述所得的番薯营养液、20份蛋白胨、15份酵母浸膏、8份羧甲基纤维素钠、3份氯化钙、1份七水硫酸铁及1份硫酸二氢钾，搅拌均匀，在120℃下灭菌25min，得浸渍营养液；之后取玉米秸秆放入90℃的干燥箱中干燥10min，取出并浸泡于上述所得的浸渍营养液中，在30℃下浸泡过夜，按固液比1:3，再将浸泡后的秸秆取出放入经减压过滤后的沼液中浸泡1h，再将混合物移入发酵池内，密封发酵池，使用二氧化碳将发酵池内的空气排出；待上述空气排出后，控制发酵池内的温度为35℃，以130r/min搅拌发酵10天，在发酵过程中向发酵池内加入造纸黑液，起始加入量为发酵池容积的1％，每隔9h，添加一次造纸黑液，每添加一次，造纸黑液的添加量比上一次添加量增加0.5％；待上述发酵结束后，以
10m3/h的速率向发酵池内通入无菌风，通入时间40min，在通风结束后，收集发酵液，将发酵物放入挤压机中进行挤压直至无液体流出，收集挤压液，将其与发酵液混合放入离心机中，在3000r/min下分离10min，收集上清液；最后把上述所得的上清液放入浓缩罐中浓缩，浓缩至原体积的30％，将所得的浓缩液放入喷雾干燥机中进行喷雾干燥，入口温度为110℃，出口温度为60℃，收集干燥物，即可得到木质素酶。

[0011] 本实例操作简单易行，在造纸行业进行生物制浆的过程中，向其中加入浆料质量5％的本发明制得的木质素酶，充分搅拌均匀，即可。不仅可以有效降低生产成本，使得纸浆具有更好的抗张强度和平滑度，而且可以提高纸浆得率，检测后发现，添加了本发明制得的木质素酶的纸浆得率比未添加本发明制得的木质素酶的纸浆得率高45％，可以大规模推广应用。

[0012] 实例2首先取番薯去皮，将其切成边长为0.45cm的方块放入蒸锅中，向蒸锅中加入去皮后番薯质量63％的质量分数为0.9％的氯化钠溶液，搅拌均匀，再进行加热直至蒸锅内的液体沸腾，保持温度25min，自然冷却至室温，进行减压过滤，收集过滤液，得番薯营养液；然后按重量份数计，取45份上述所得的番薯营养液、23份蛋白胨、18份酵母浸膏、10份羧甲基纤维素钠、5份氯化钙、3份七水硫酸铁及1.5份硫酸二氢钾，搅拌均匀，在120℃下灭菌28min，得浸渍营养液；之后取玉米秸秆放入90℃的干燥箱中干燥13min，取出并浸泡于上述所得的浸渍营养液中，在33℃下浸泡过夜，按固液比1:3，再将浸泡后的秸秆取出放入经减压过滤后的沼液中浸泡1.5h，再将混合物移入发酵池内，密封发酵池，使用二氧化碳将发酵池内的空气排出；待上述空气排出后，控制发酵池内的温度为38℃，以130r/min搅拌发酵11天，在发酵过程中向发酵池内加入造纸黑液，起始加入量为发酵池容积的2％，每隔9.5h，添加一次造纸黑液，每添加一次，造纸黑液的添加量比上一次添加量增加0.65％；待上述发酵结束后，