细胞粘附性光控制基材 |
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| 申请号 | CN201280017709.1 | 申请日 | 2012-04-11 | 公开(公告)号 | CN103502425A | 公开(公告)日 | 2014-01-08 |
| 申请人 | 学校法人东邦大学; 株式会社日立高新技术; | 发明人 | 古田寿昭; 铃木商信; 杉山寿; 小泽理; 多田博子; | ||||
| 摘要 | 本 发明 的目的是在活细胞的状态下进行解析、区分、培养时，可以更简便地进行实时操作，可以在使不要细胞从培养细胞除去并纯化的同时进行培养，此外，从培养细胞解析所希望的细胞，进行区分，提高该细胞的纯度、回收率、生存 力 。通过使用细胞粘附性光控制基材，从而可以对细胞图像进行检测、解析，获得所希望的细胞的 位置 信息，所述细胞粘附性光控制基材的特征在于，通过光照射而包含香豆素基甲基骨架的光解离性基结合解离，细胞粘附性材料脱离，残留细胞非粘附性材料。此外，基于这样获得的位置信息，能够在活细胞的状态下进行解析、区分。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种细胞粘附性光控制基材，其特征在于，通过光照射而包含香豆素基甲基骨架的光解离性基结合解离，细胞粘附性材料脱离，细胞非粘附性材料残留在基材上。 |
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| 说明书全文 | 细胞粘附性光控制基材技术领域[0001] 本发明涉及再生医疗、干细胞研究领域，特别是涉及细胞的解析区分、培养技术。 背景技术[0002] 在再生医疗领域中，进行下述操作：对体细胞中所含的极少的成体干细胞、前体细胞进行鉴定、离析，对成体干细胞、前体细胞进行培养并分化诱导而制作体细胞。此外，尝试将iPS细胞、ES细胞等多能性干细胞分化诱导成成体干细胞、体细胞。然而，这些iPS细胞、ES细胞不是均一的，此外，由其分化诱导而得的细胞也不是均一的，产生出各种细胞。此外，多能性干细胞往往与通常被称为饲养细胞的细胞共培养，因此有在培养的结果所得的产物中，不仅混入多能性干细胞、由其分化诱导出的细胞，而且混入饲养细胞的可能性。在供于再生医疗的细胞或组织中，要求作为体细胞的均一性，包含成体干细胞，而且不含癌细胞、癌干细胞、iPS细胞、ES细胞等多能性干细胞、以及饲养细胞。 [0003] 这样，在再生医疗领域中，对细胞进行解析、区分、培养的技术的重要性日益增加。为了区分包含多个种类的细胞群，识别它们的解析技术是必要的。此外，需要由识别出的包含多个种类的细胞群区分成单一种类的细胞。只有可以区分成单一种类的细胞，才能够解 析其分子生物学的性质、细胞生物学的性质。此外，只有可以进行单一种类的细胞的区分、解析，才能够开发严密地控制分化诱导的技术。在研究开发的中途阶段，只要可以除去不要的细胞，则可高纯度地获得单一种类的细胞，因此可以达到100%的分化诱导效率和构建等 效的实验体系，对于加速研究开发是极其有效的。 [0004] 作为在活细胞的状态下进行解析的装置，光学显微镜、对进行了荧光标识的细胞进行观察的荧光显微镜、荧光成像装置等是周知的，但这些装置不能区分细胞。另一方面，作为在活细胞的状态下进行区分的装置，有通过细胞表面的抗原与对磁珠赋与的抗体的抗 原抗体反应而区分收集目的的细胞的装置，但该装置不能解析细胞，此外，在纯度、回收率等方面存在课题。作为区分细胞的装置，也有激光显微切割装置，但其主要用于从进行了石蜡包埋的组织切片离析死细胞。 [0005] 作为在活细胞的状态下进行解析、区分的装置，应用了流式细胞光度术的原理的分选装置是周知的。该装置是使乘载于鞘流的样品流中的细胞1个1个地接触激光，通过观 察散射光、荧光来对细胞进行解析、识别，基于该信息，使包含一个一个细胞的液滴带电荷，施加电场而进行区分的装置。可以通过照射多色的激光来解析多个荧光标记，但荧光校正、光轴调整、液滴的稳定形成、带电荷的时机的调整复杂。为了对在培养基材上进行了培养的细胞应用流式细胞光度术，必须暂时从培养基材取出细胞。此外需要将细胞预先分离成各 个细胞。如果为此而进行胰蛋白酶处理等，则会对细胞带来不小破坏。此外由于通过胰蛋 白酶处理来分解细胞表面的蛋白质，因此可能会在解析细胞表面抗原之后带来障碍。进一 步存在分选出的细胞由于分选时的冲击而生存力降低等课题。 [0006] 作为在活细胞的状态下进行解析、区分、培养的技术，有专利文献1所记载的方法(以下第1现有例)。该技术涉及使用将通过光照射而其物性变化的光响应性材料成膜而成的细胞培养基材，在细胞粘附性表面粘附细胞。通过监测器识别进行了培养的细胞，特定所希望的细胞的位置，对所希望的细胞位置进行光图案照射，用于将所希望的细胞从培养 基材剥离的装置。这里记载的“通过光照射而其物性变化的光响应性材料”，可举出具有通过光照射而结构异构化，其极化率、亲水－疏水性变化，从而将细胞从培养基材剥离的功能的材料，特别优选这些物性变化是可逆的。 [0007] 作为在细胞培养下能够进行细胞粘附图案的形成和尺寸变更的、将细胞固定化了的基板的制成方法，有专利文献5所记载的方法(以下第2现有例)。该技术的第1形态 是，将通过光分解性保护基而保护了末端官能团的化合物在基板上固定化，通过光照射将 光分解性保护基的一部分脱离而使末端官能团露出，使细胞吸附于露出的末端官能团。第 2形态与第1形态类似，但使细胞粘附抑制物质吸附于光解离性保护基，通过光照射将细胞 粘附抑制物质吸附了的光分解性保护基的一部分脱离而使末端官能团露出，使细胞吸附于 露出的末端官能团。第3形态与第2形态类似，但使细胞粘附促进物质吸附于露出的末端 官能团，使细胞吸附于细胞粘附促进物质。 [0008] 第2现有例中的通过光分解性保护基而保护了末端官能团的化合物是，通过光照射而光分解性保护基脱离，末端官能团露出的化合物。光分解性保护基被认为是细胞不吸 附、或细胞粘附促进物质不吸附的保护基，作为那样的保护基的例子，言及了亲水性高的保护基、具有带有氢结合受体的基团的中性化合物。作为细胞粘附抑制物质的具体例，例示了血清白蛋白等。末端官能团被认为是易于吸附细胞的官能团，作为具体例，例示了羧基、氨基等带电了的官能团。作为细胞粘附促进物质的具体例，例示了纤连蛋白等。 [0009] 第2现有例中的任一形态，都为了在固定于基板上的化合物上粘附细胞而需要2～3小时左右的时间。 [0010] 现有技术文献 [0011] 专利文献 [0012] 专利文献1：日本专利第3975266号公报 [0013] 专利文献2：日本专利第3472723号公报 [0014] 专利文献3：日本特开2004－170930号公报 [0015] 专利文献4：日本特开2008－167695号公报 [0016] 专利文献5：日本特开2006－6214号公报 [0017] 非专利文献 [0018] 非专利文献1：石原一彦，生体材料，18(1)、33(2000). [0019] 非专利文献2：Y.Arima et al.，J.Meter.Chem.，17，4079(2007). [0020] 非专利文献3：Y.Arima et al.，Biomaterials28，3074(2007). [0021] 非专利文献4：M.N.Yousaf et al.，PNAS98(11)、5992(2001). [0022] 非专利文献5：古田寿昭，光学，34(4)、213(2005). [0023] 非专利文献6：J.Eahiro et al.，Biomacromolecules，6(2)、970(2005). [0024] 非专利文献7：J.Nakanishi et al.，Analytical Sciences，24，67(2008). 发明内容[0025] 发明所要解决的课题 [0026] 作为上述的第1现有例(日本专利第3975266号公报)所记载的通过光照射而其物性变化的光响应性材料，通过光而可逆地结构变化的材料难以100%保持为2个异构体中 的一个，这导致细胞粘附性的选择性降低。此外，实施例中那样的通过长波长的光而反应的材料，例如，进行荧光观察时与激发光反应，粘附性变化，因此不能兼有荧光观察和粘附性维持。此外，该技术中，未考虑到即使可以将细胞从培养基材剥离，也会剥离细胞间的粘附。 因此，存在将培养基材中存在的孤立的细胞或细胞块整个剥离，而不能将粘附的包含多个 种类的细胞的细胞块区分成单一细胞这样的课题。 [0028] 上述的第2现有例(日本特开2006－6214号公报)，在第1形态中，光分解性保护基完全不吸附细胞，需要其脱离而露出的末端官能团极其良好地吸附细胞。细胞粘附性 象那样地显示戏剧性变化的光分解性保护基是未知的，实际上，并未记载与该第1形态对 应的实施例。因此存在实施该第1形态是困难的这样的课题。第2形态中需要使细胞粘附 抑制物质吸附于光解离性保护基的工序。此外需要细胞极其良好地吸附于光分解性保护基 脱离而露出的末端官能团。细胞粘附性象那样地极其高的末端官能团是未知的，实际上，也并未记载与该第2形态对应的实施例。因此存在该第2形态的工序非常复杂，实施也困难 这样的课题。第3形态中，需要使细胞粘附抑制物质吸附于光解离性保护基的工序和使细 胞粘附促进物质吸附于露出的末端官能团的工序。此外细胞粘附抑制物质由于是仅吸附于 光解离性保护基的不稳定的结构，因此在使细胞粘附促进物质吸附时，有根据条件而吸附 于光解离性保护基的细胞粘附抑制物质脱附，发生置换成细胞粘附促进物质这样的目的外 的副反应的可能性。如果发生该副反应，则目的外的区域变化为细胞粘附性区域，细胞粘附的选择性可能会降低。因此存在该第3形态的工序非常复杂，根据条件而细胞粘附的选择 性低这样的课题。此外在任一形态中，都会为了在固定于基板上的化合物上粘附细胞而花 费2～3小时左右的时间。一般而言，本领域技术人员认为为了使细胞粘附于基材而需要 该程度的时间。然而在为了解析而对细胞区分、离析的用途中，需要迅速简便地进行不过是工序的一部分的细胞粘附，不能容许花费2～3小时。换言之，存在现有例的细胞粘附时间 过长这样的课题。 [0029] 本发明是鉴于以上的现有技术，而提供用于在活细胞的状态下进行解析、区分、培养的细胞粘附性光控制基材。 [0030] 本发明所要解决的课题是，在活细胞的状态下进行解析、区分、培养时，可以更简便地进行实时操作，可以在从培养细胞除去不要细胞并纯化的同时进行培养，此外，从培养细胞解析区分所希望的细胞，将该细胞的纯度、回收率、生存力提高到以往以上。 [0031] 此外本发明所要解决的第2课题是，在活细胞的状态下进行解析、区分、培养时，确实并且短时间地进行细胞粘附。 [0032] 用于解决课题的方法 [0033] 本发明中为了解决上述以往技术的课题而采取以下的方法。 [0034] 即，本发明的细胞粘附性光控制基材是将细胞粘附性光控制材料在基材上成膜而成的，所述细胞粘附性光控制材料是从基材侧顺次地在细胞非粘附性材料上介由光解离性 基而结合细胞粘附性材料而成的。 [0035] 此外，本发明的细胞粘附性光控制基材，通过光照射而光解离性基结合解离，细胞粘附性材料脱离，残留细胞非粘附性材料。 [0036] 此外，本发明的细胞粘附性光控制基材，通过光照射而光解离性基结合解离，被照射后的部分的表面从细胞粘附性材料向细胞非粘附性材料不可逆地变化。 [0037] 此外，本发明的细胞粘附性光控制基材，是将细胞结合性光控制材料在基材上成膜而成的，所述细胞结合性光控制材料是从基材侧顺次地在细胞非粘附性材料上介由光解 离性基而结合细胞结合性材料而成的。这里所谓细胞结合性材料，是通过共价结合等而与 细胞牢固地结合的材料，或对动物种特异性的抗体。 [0038] 此外，使用了本发明的细胞粘附性光控制基材的细胞的解析区分方法包含以下的工序。 [0039] 对细胞粘附性光控制基材接种细胞，进行培养的工序，所述细胞粘附性光控制基材的特征在于，是将细胞粘附性光控制材料在基材上成膜而成的，所述细胞粘附性光控制 材料是从基材侧顺次地在细胞非粘附性材料上介由光解离性基而结合细胞粘附性材料或 细胞结合性材料而成的，或者所述细胞粘附性光控制基材的特征在于，通过光照射而光解 离性基结合解离，细胞粘附性材料脱离，残留细胞非粘附性材料，或者所述细胞粘附性光控制基材的特征在于，通过光照射而光解离性基结合解离，被照射后的部分的表面从细胞粘 附性材料向细胞非粘附性材料不可逆地变化。 [0040] 通过对所希望的细胞区域的第1光照射而将所希望的细胞从基材剥离回收的工序。 [0041] 此外，使用了本发明的细胞粘附性光控制基材的细胞的解析区分方法包含以下的工序。 [0042] 对细胞粘附性光控制基材进行第1光照射，而设置细胞粘附区域和细胞非粘附区域的工序，所述细胞粘附性光控制基材的特征在于，是使介由光解离性基而从基材侧顺次 在细胞非粘附性材料上结合有细胞粘附性材料或细胞结合性材料的细胞粘附性光控制材 料在基材上成膜而成的，或者所述细胞粘附性光控制基材的特征在于，通过光照射而光解 离性基结合解离，细胞粘附性材料脱离，残留细胞非粘附性材料，或者所述细胞粘附性光控制基材的特征在于，通过光照射而光解离性基结合解离，被照射后的部分的表面从细胞粘 附性材料向细胞非粘附性材料不可逆地变化。 [0043] 此外，使用了本发明的细胞粘附性光控制基材的细胞的解析区分方法包含以下的工序。 [0044] 在上述解析区分方法的工序中，在细胞粘附性光控制基材上接种细胞后，在细胞粘附性光控制基材的方向，特别优选为相对于该基材表面垂直地使离心力作用的工序。 [0045] 此外，使用了本发明的细胞粘附性光控制基材的细胞的解析区分装置具备第1光照射单元，所述第1光照射单元用于使细胞粘附性光控制基材与基材上的细胞粘附性光控 制材料进行光反应，所述细胞粘附性光控制基材的特征在于，是将细胞粘附性光控制材料 在基材上成膜而成的，所述细胞粘附性光控制材料是从基材侧顺次地在细胞非粘附性材料 上介由光解离性基而结合细胞粘附性材料或结合细胞结合性材料而成的，或者，所述细胞 粘附性光控制基材的特征在于，通过光照射而光解离性基结合解离，细胞粘附性材料脱离，残留细胞非粘附性材料，或者，所述细胞粘附性光控制基材的特征在于，通过光照射而光解离性基结合解离，被照射后的部分的表面从细胞粘附性材料向细胞非粘附性材料不可逆地 变化。 [0047] 发明的效果 [0048] 在活细胞的状态下进行解析、区分、培养时，可以更简便地进行实时操作，可以在从培养细胞除去不要细胞并进行纯化的同时进行培养。此外，可以从培养细胞解析区分所希望的细胞，提高该细胞的纯度、回收率、生存力。此外可以更确实并且短时间地进行解析。 附图说明[0049] 图1是显示对培养中的细胞进行解析，区分所希望的细胞的方法(实施例1、2)的概要的图。 [0050] 图2是显示对各个分离出的细胞进行解析，区分所希望的细胞的方法(实施例3、5、6、7)的概要的图。 [0051] 图3是显示对各个分离出的细胞进行解析，区分所希望的细胞的方法(实施例4)的概要的图。 具体实施方式[0052] 以下，显示用于实施本发明的方式，但本发明不限定于此。 [0053] 本发明的一实施方式是，将细胞粘附性光控制材料在基材上成膜而成的细胞粘附性光控制基材，所述细胞粘附性光控制材料是从基材侧顺次地在细胞非粘附性材料上介由 光解离性基而结合细胞粘附性材料而成的。该细胞粘附性光控制材料，通过光照射而光解 离性基结合解离，可以使细胞粘附性材料从基材脱离。光结合解离可以是细胞非粘附性材 料与光解离性基之间或光解离性基与细胞粘附性材料之间的任一种。通过光照射，在基材 上残留细胞非粘附性材料。光反应了的光解离性基的残余部分作为细胞非粘附性基而起作 用。通过该不可逆的光解离反应而从细胞粘附性向细胞非粘附性高效率地并且确实地变 化，可以使粘附选择性良好。这里，细胞粘附性材料也包含通过共价结合等而与细胞牢固地结合的材料、或包含对动物种特异性的抗体等的细胞结合性材料。在本发明中，在称为细胞粘附性材料的情况下，既包含通过共价结合等而与细胞牢固地结合的材料，也包含与抗体 等细胞结合的细胞结合性材料。 [0054] 通过使用上述的细胞粘附性光控制基材，可以进行特定的细胞的解析区分。这里，所谓解析区分，是指对细胞进行解析，与其它细胞区分。 [0056] [0057] 式中R1表示氢或甲基，n表示1～20的数。 [0058] 此外，下述通式(2)所示的(甲基)丙烯酸酯聚合物也可以作为细胞非粘附性材料而使用。 [0059] [0062] (R3O)3Si-R2-H ---(3) [0063] 式中，R2与通式(1)和(2)相同，R3表示氢或烷基。 [0064] 作为细胞粘附性材料，可举出末端具有细胞粘附性基的材料。作为细胞粘附性基，可举出下述通式(4)所示的基团。 [0065] -X ---(4) [0066] 式中X表示羧酸、单或多羧酸烷基、氨基、单或多氨基烷基、酰胺基、单或多酰胺烷基、酰肼基、单或多酰肼基烷基、氨基酸基、多肽基、或核酸基。 [0067] 通过改变通式(4)的细胞粘附性基X，可以获得对各种细胞的粘附性的变化。此外，该细胞粘附性材料也包含使促进与细胞的粘附的细胞外基质、可与细胞的表面抗原结 合的抗体和用于使该抗体结合的蛋白质等结合或粘附于上述通式(4)所示的基团而得的 材料。作为细胞外基质，是胶原类、非胶原性糖蛋白类(纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、腱生蛋白、血小板反应蛋白、冯维勒布兰德氏(von Willebrand)因子、骨桥蛋白、血纤蛋白原等)、弹性蛋白类、蛋白聚糖类等。作为使抗体结合的蛋白质，有抗生物素蛋白/生物素、蛋白质A、蛋白质G等。 [0068] 光解离性基可与特定的波长的光反应，进行解离。光解离性基的光反应波长需要在不显示细胞毒性的360nm以上，并且，与光学显微镜观察用入射光、荧光观察用激发光波长相比为短波长。由此，在细胞观察时可以不会因为细胞观察用的光而发生细胞的粘附性 的变化。作为这样的光解离性基，可举出O－硝基苄基、羟基苯甲酰甲基、香豆素基甲基等，但从不显示细胞毒性方面、光反应波长区域、光反应效率高方面考虑，优选包含香豆素基甲基骨架的材料。特别是，作为连接基，可以适合使用下述通式(5)所示的2价的包含香豆素 基甲基骨架的连接基。 [0069] [0070] 这里，式中，R4为2价且表示O、CO、CO2、OCO、OCO2、OCONH、OCONR、NHCO2、NH、SO3或5 6 (OPO(OH))1～3OPO2，R 表示氢、卤基或烷氧基，R 表示氢、羟基、烷氧基或二烷基氨基，或不存 7 8 9 在，R 表示氢或卤基，或不存在，R 表示氢或卤基，R 表示氢，或不存在，作为连接基的通式 4 6 7 9 (5)的2价的位置是，以R 的位置为共同位置，另一方为R 或R 的苯骨架的位置、或R 的 6 7 9 香豆素基甲基的位置。上述R、R 和R 中的“不存在”以其含义使用。 [0071] 进一步说，对于作为连接基的通式(5)的2价的位置，从(R4的位置和R6的苯骨架4 7 4 9 的位置)，作为(R 的位置和R 的苯骨架的位置)或(R 的位置和R 的香豆素基甲基的位 4 置)，适当地选择剩下的取代基，从而可以通过细胞毒性少的更长波长的光高效地使R 光反应。 [0072] 光解离性基与细胞粘附性材料具有将通式(4)所示的细胞粘附性基与通式(5)所4 示的2价的光解离性基的一方的结合位置直接或间接地结合而成的结构。光解离在R 的位 6 置发生。例如，在苯骨架的R 的位置结合的情况下，如下述通式(6)所示，只要介由2价的 10 7 连接基R 而结合即可。此外，在苯骨架的R 的位置结合的情况下，如下述通式(7)所示， 11 9 只要介由2价的连接基R 而结合即可。进一步地，在R 的香豆素基甲基的位置结合的情 12 况下，如下述通式(8)所示，只要介由2价的连接基R 而结合即可。 [0073]4 5 7 8 9 [0074] 这里，R、R、R、R 和R 与通式(5)相同。10 [0075] 作为2价的连接基R ，可以利用O(CH2)m、O(CH2CH2O)m、OCO(CH2)m、OCOCH2O(CH2CH2O)m、OCH2CO2(CH2CH2O)m(CH2)m’、OCH2CONHCH2(C2HN3)(CH2)m’(OCH2CH2)m、OCH2CONCH3CH2(C2HN3)(CH2)m’(OCH2CH2)m、OCH2CON(CH2(C2HN3)(CH2)m’(OCH2CH2)mX)CH2(C2HN3)(CH2)m’(OCH2CH2)m、(m、m’为0～20的整数)等。 [0076]4 5 6 8 9 [0077] 这里，R、R、R、R 和R 与通式(5)相同。11 [0078] 作为2价的连接基R ，可以利用CH2NH(CH2CH2O)m(CH2)m’、CH2N((CH2CH2O)m(CH2)m’X)(CH2CH2O)m(CH2)m’、CH2NHCH2(C2HN3)(CH2)m’(OCH2CH2)m、CH2N(CH2(C2HN3)(CH2)m’(OCH2CH2)mX)CH2(C2HN3)(CH2)m’(OCH2CH2)m、CH2N(CH3)、CH2N(CH3)CH2(C2HN3)(CH2)m’(OCH2CH2)m(m、m’为0～20的整数)等。 [0079]4 5 6 7 8 [0080] 这里，R、R、R、R 和R 与通式(5)相同。12 [0081] 作为2价的连接基R ，可以利用CH2OCO(CH2CH2)m’、(CH2)m’’(C2HN3)(CH2)m’(OCH2CH2)m、(m、m’、m’’为0～20的整数)等。10 11 12 [0082] R 、R 和R 仅具有使光解离性基与细胞粘附性基结合的作用。 [0083] 此外，如果使光解离性基的方向相反，则可以在光解离性基与细胞粘附性基之间4 进行光解离。可以举出例如，作为在R 的位置进行了结合的结构的下述通式(9)所示的结 构。 [0084] [0085] 这里，R4、R5、R6、R7、R8和R9与通式(5)相同。 [0086] 作为2价的连接基R13，可以利用(CH2CH2O)m(CH2)m’、(CH2)m(C2HN3)(CH2)m’、(m、m’为0～20的整数)等。 [0087] 上述那样结合有细胞粘附性材料与光解离性基的结构直接或间接地与细胞非粘附性材料结合。 [0088] 例如，可以形成下述通式(10)、(11)、(12)、(13)、(14)或(15)所示的(甲基)丙烯酸酯聚合物的形式，并入细胞非粘附性材料中。 [0089] [0090]1 4 5 6 7 8 9 [0091] 在上述通式(10)～(12)中，R 与通式(1)相同，R、R、R、R、R 和R 与通式(5)10 11 12 14 相同，R 与通式(6)相同，R 与通式(7)相同，R 与通式(8)相同，R 可以利用亚烷基、 (CH2)p’CO(OCH2CH2)p、(CH2)p’’(C2HN3)(CH2)p’CO(OCH2CH2)p、(p、p’、p’’为1～20的整数)等。 [0092]1 4 5 7 8 9 [0093] 在通式(13)中，R 与通式(1)相同，R、R、R、R 和R 与通式(5)相同，2价的连13 15 接基R 与通式(9)相同，R 可以利用(CH2CH2O)pCOCH2O、(p为1～20的整数)等。 [0094] [0095] 在通式(14)中，R1与通式(1)相同，R4、R5、R6、R8和R9与通式(5)相同，2价的13 16 连接基R 与通式(9)相同，R 可以利用(CH2CH2O)pCOCH2NHCH2、(CH2CH2O)pCOCH2N(CH3)CH2、(CH2CH2O)pCO(CH2)p’(N3C2H)CH2NHCH2、(CH2CH2O)pCO(CH2)p’(N3C2H)CH2N(CH3)CH2、(p、p’为1～ 20的整数)等。 [0096]1 4 5 6 7 8 [0097] 在通式(15)中，R 与通式(1)相同，R、R、R、R 和R 与通式(5)相同，2价的连13 17 接基R 与通式(9)相同，R 可以利用(CH2)pCO2CH2、(p为1～20的整数)等。 [0098] 作为使本发明的结合有细胞粘附性基和光解离性基的结构结合于细胞非粘附性材料而得的材料，可以举出例如，上述通式(1)或(2)和(10)；上述通式(1)或(2)和(11)； 上述通式(1)或(2)和(12)；上述通式(1)或(2)和(13)；上述通式(1)或(2)和(14)； 上述通式(1)或(2)和(15)；上述通式(1)、(2)和(10)；上述通式(1)、(2)和(11)；上述 通式(1)、(2)和(12)；上述通式(1)、(2)和(13)；上述通式(1)、(2)和(14)；上述通式 (1)、(2)和(15)所示的(甲基)丙烯酸酯的共聚物。通过形成共聚物，可以任意地改变细 胞粘附性材料和细胞非粘附性材料的比率，通过比率的变化而提供对各种细胞的粘附性的 变化。此外，如果将这些聚合物的侧链上包含烷氧基硅烷的(甲基)丙烯酸酯进行共聚，则 可以进一步提高与基材的粘附性。 [0099] 这些体系可以采用共聚物的形式，但也可以使用作为单独的聚合物的形式。例如，可以单独使用具有上述通式(10)～(15)的任一通式所示的结构的形式。通过使结合有这些细胞粘附性基和光解离性基的结构结合于细胞非粘附性材料而得的材料在基材上成膜， 从而可以制造细胞粘附性光控制基材。 [0100] 此外，使结合有通式(6)、(7)、(8)、(9)所示的细胞粘附性材料和光解离性基的结构为烷氧基硅烷的形式，可以直接或间接地并入细胞非粘附材料中。 [0101] 例如，也可以形成下述通式(16)、(17)或(18)所示的烷氧基硅烷的形式，通过硅烷偶联而在基材上成膜后，使用Huisgen反应，制作结合有具有下述通式(19)、(20)或(21)所示的导入有细胞粘附性基X的结构的化合物的细胞粘附性光控制基材。通过使用这样的 点击反应，可以防止由细胞粘附性基X引起的烷氧基硅烷的水解。 [0102] 此时，将通式(16)、(17)或(18)所示的烷氧基硅烷在基材上成膜后，通过与下述通式(57)所示的包含细胞粘附性基X的叠氮基化合物的反应，可以在末端形成细胞粘附性 基X。 21 [0103] X-R -N3 ---(57) [0104] 这里，式中X表示选自由羧酸、单或多羧酸烷基、氨基、单或多氨基烷基、酰胺基、单或多酰胺烷基、酰肼基、单或多酰肼基烷基、氨基酸基、多肽基和核酸基所组成的组中的21 基团，2价的连接基R 表示(CH2)q’(OCH2CH2)q(q、q’为0～20的整数)的基团。 [0105]2 [0106] 通式(16)中，R 与通式(2)相同或为(CH2)qCONH(CH2)q’，(q、q’为0～20的整数)3 4 5 7 8 9 18 等，R 与通式(3)相同，R、R、R、R 和R 与通式(5)相同，2价的连接基R 表示CH2NHCOCH2O、CH2NCH3COCH2O、CH2N(CH2CCH)COCH2O等。 [0107] [0108] 在通式(17)中，R2与通式(2)相同或为(CH2)qCONH(CH2)q’，(q、q’为0～20的3 4 5 6 8 9 19 整数)等，R 与通式(3)相同，R、R、R、R 和R 与通式(5)相同，2价的连接基R 表示 CH2NHCH2、CH2NCH3CH2、CH2N(CH2CCH)CH2等。 [0109]2 [0110] 在通式(18)中，R 与通式(2)或(CH2)qCONH(CH2)q’，(q、q’为0～20的整数)等3 4 5 6 7 8 20 相同，R 与通式(3)相同，R、R、R、R 和R 与通式(5)相同，2价的连接基R 表示(CH2)q、 (q为0～20的整数)等。 [0111]2 [0112] 在通式(19)中，R 与通式(2)相同或为(CH2)qCONH(CH2)q’，(q、q’为0～20的整4 5 7 8 9 10 数)等，R、R、R、R 和R 与通式(5)相同，2价的连接基R 与通式(6)相同。 [0113] [0114] 在通式(20)中，R2与通式(2)相同或为(CH2)qCONH(CH2)q’，(q、q’为0～20的整4 5 6 8 9 11 数)等，R、R、R、R 和R 与通式(5)相同，2价的连接基R 与通式(7)相同。 [0115] [0116] 在通式(21)中，R2与通式(2)相同或为(CH2)qCONH(CH2)q’，(q、q’为0～20的整4 5 6 7 8 12 数)等，R、R、R、R 和R 与通式(5)相同，2价的连接基R 与通式(8)相同。 [0117] 此外，形成这样的烷氧基硅烷的形式时，可以有效地使用硅烷偶联反应和点击反4 7 应。例如，作为通式(5)的香豆素基甲基骨架的2价的位置，如果以R 与R 的位置为例进 行说明，则可以有效地使用下述通式(22)、(23)那样的中间体与通式(57)的叠氮基化合物 与通式(58)的烷氧基硅烷。 [0118] [0119] 这里，R31表示(CH2)r等，R32表示CH2NHCH2、CH2NCH3CH2等，R33表示(CH2)r等，X表示选自由羧酸、单或多羧酸烷基、氨基、单或多氨基烷基、酰胺基、单或多酰胺烷基、酰肼基、单或多酰肼基烷基、氨基酸基、多肽基和核酸基所组成的组中的基团，Y表示选自由叠氮基、氨基、环氧基、氰酸酯基所组成的组中的基团(r为0～20的整数)。 [0120] 例如，通过通式(22)与通式(58)(Y为叠氮基)的组合，形成通式(24)， [0121] [0122] 由通式(22)(X为羧基)与通式(58)(Y为氨基)与通式(57)的组合，形成通式(25)， [0123] [0124] 由通式(23)与通式(58)(Y为叠氮基)的组合，形成通式(26)， [0125] [0126] 由通式(23)(X为羧基)与通式(58)(Y为氨基)与通式(57)的组合，形成通式(27)。 [0127] [0128] 这些通式(24)、(25)、(26)、(27)的化合物一旦合成后，可以在基材表面成膜，也可以在基材表面上顺次合成而进行。在通过表面反应进行合成的情况下，剩下的氨基、叠氮基可以通过PEG羧酸、PEG炔烃等而转换成细胞非粘附性。 [0129] 在这些情况下，X所示的细胞粘附性材料也包含结合或粘附有促进与细胞的粘附的细胞外基质、可与细胞的表面抗原结合的抗体和用于使该抗体结合的蛋白质等的材料。 [0130] 作为成膜有这些细胞粘附性光控制材料的基材，可以使用透明的塑料制培养容器等，但从光学性能、耐久性考虑，可以优选使用透明的玻璃制培养容器。 [0131] 接下来利用图对于使用本细胞粘附性光控制基材对细胞进行解析区分的方法进行详细说明。 [0132] 图1是显示使用了本发明的细胞粘附性光控制基材的细胞的解析区分方法的一形态的图。该方法包含(1)、(2)、(3)、(4a)、(5a)的工序，或包含(1)、(2)、(3)、(4b)、(5b)的工序。图1中，各工序以左右的图的组显示，左侧图是右侧图的点划线所显示的部分的截面图。各工序的说明如下所述。(1)在成膜于玻璃制培养容器(透明基材)1的细胞粘附性 的细胞粘附性光控制材料2上将细胞3进行接种、粘附、培养。(2)通过显微镜观察(包含 透射像、相位差像、微分干涉像等)、荧光观察、散射光观察、拉曼光观察等来检测细胞图像，提取细胞的特征量后，(3)在鉴定所希望的细胞的同时获得该细胞的位置信息。所谓所希 望的细胞，既包含要解析区分的必要的细胞也包含不必要的细胞。此时，将细胞通过荧光标记等进行标识，但荧光标记标识等也可以在培养前也可以在培养后进行。(4a)本形态的例 子中，(3)所示的细胞4为不要的细胞，除此以外的细胞3为必要的细胞。对细胞3与细胞 4的边界的细胞4侧周边和细胞粘附性光控制材料6进行第2光照射5，切断(4a)中由矩 形显示的部分的细胞4和细胞粘附性光控制材料6。作为此时的第2光照射5，可以适合使 用激光。(5a)在细胞4存在的基材上的面积大的情况下，相对于细胞4存在的区域8进行 第1光照射7，使细胞粘附性光控制材料变化为细胞非粘附性，将剩下的细胞4从玻璃制培 养容器1剥离，与培养液一起回收。在细胞4存在的基材上的面积小的情况下，也可以通过 相对于全部的细胞4和细胞粘附性光控制材料8进行第2光照射5来切断、破坏。然后继 续进行培养，逐次除去不要细胞4，从而可以一边纯化一边继续进行基材上剩下的细胞3的 培养。 [0133] 另一方面，图1的工序(4b)是为了进行解析而要区分、离析细胞4的情况(细胞4为必要的情况)的工序。相对于细胞3与细胞4的边界的细胞3侧周边和细胞粘附性光 控制材料6进行第2光照射5，切断细胞3和细胞粘附性光控制材料6。 [0134] 作为第2光照射5，可以适合使用激光。然后，(5b)相对于细胞4存在的基材上的区域8进行第1光照射7，使细胞粘附性光控制材料变化为细胞非粘附性，将细胞4从玻璃 制培养容器1剥离，与培养液一起回收。可以回收并解析区分细胞。 [0135] 图2是显示使用了本发明的细胞粘附性光控制基材的细胞的解析区分方法的另一形态的图。该方法包含(1)、(2)、(3)、(4)、(5)和(6)的工序。图2中，各工序由左右的图的组显示，左侧图是右侧图的点划线所显示的部分的截面图。(1)相对于成膜于玻璃制 培养容器1的细胞粘附性的细胞粘附性光控制材料，如图所示，进行第1光照射7，设置细 胞粘附区域69和细胞非粘附区域8。细胞粘附区域69和细胞非粘附区域8可以通过改变 光的照射图案来设定为任意的图案。图2所示的例子中，将细胞粘附区域69作为1个细胞 的面积排列成格子状。即，以细胞粘附区域69排列成格子状的方式进行第1光照射7。此 时，为了可以鉴定细胞粘附区域，期望分配地址(address)。 [0136] (2)接着，将已经进行了培养的细胞块通过胰蛋白酶等处理而分离成各个细胞，在基材上接种，进行粘附。(3)通过显微镜观察(包含透射像、相位差像、微分干涉像等)、荧光观察，散射光观察、拉曼光观察等来检测细胞图像，提取细胞的特征量后，(4)在鉴定所希望的细胞的同时获得该细胞的位置信息。所谓所希望的细胞，既包含要解析区分的必要的细胞也包含不必要的细胞。此时，将细胞通过荧光标记等进行标识，但荧光标记标识等也可以在接种前也可以在接种后进行。图2所示的例子中，除了细胞3以外，存在其它细胞(例 如细胞4和细胞9)。(5)在全部的地址(细胞粘附区域69)不粘附细胞的情况下，相对于 不粘附细胞的地址的区域进行第1光照射7，成为细胞非粘附性(图中所示的参照符号10 的区域)。(6)接着，相对于所希望的细胞，这里是细胞4存在的区域11进行第1光照射7， 将细胞4从玻璃制培养容器1剥离，与培养液一起回收。通过将该(6)的工序逐次反复进 行，从而可以进一步区分离析细胞3和9。 [0137] 图3是显示使用了本发明的细胞粘附性光控制基材的细胞的解析区分方法的另一形态的图。该方法包含(1)、(2)、(3)、(4)、(5)和(6)的工序。图3中，各工序由左右的图的组显示，左侧图是右侧图的点划线所显示的部分的截面图。(1)相对于成膜于玻璃制 培养容器1的细胞粘附性的细胞粘附性光控制材料，空出规定的间隔，在行方向和列方向 进行第2光照射(例如通过激光进行光照射)5，切断相邻的细胞粘附性光控制材料(图3 中，切断线由符号6表示)。此外，相对于规定的位置进行第1光照射7，设置细胞粘附区域 69和细胞非粘附区域8。此时，为了可以鉴定细胞粘附区域，期望分配地址。 [0138] 细胞粘附区域69和细胞非粘附区域8可以通过改变光的照射图案来设定为任意的图案，这里将细胞粘附区域69作为1个细胞的面积排列成格子状。(2)接着，将已经进 行了培养的细胞块通过胰蛋白酶等处理分离成各个细胞，在基材上接种，进行粘附。(3)通过显微镜观察(包含透射像、相位差像、微分干涉像等)、荧光观察、散射光观察、拉曼光观察等来检测细胞图像，提取细胞的特征量后，(4)在鉴定所希望的细胞的同时获得该细胞的位置信息。所谓所希望的细胞，既包含要解析区分的必要的细胞也包含不必要的细胞。此 时，将细胞通过荧光标记等进行标识，但荧光标记标识等也可以在接种前也可以在接种后 进行。图3所示的例子中，除了细胞3以外，也存在细胞4和细胞9。 [0139] (5)在全部的细胞粘附区域(地址)69不粘附细胞的情况下，相对于细胞未粘附的地址10的区域进行第1光照射7，成为细胞非粘附性。(6)接着，相对于所希望的细胞，这 里是细胞4存在的区域11进行第1光照射7，将细胞4从玻璃制培养容器1剥离，与培养 液一起回收。通过将该(6)的工序逐次反复进行，可以进一步区分离析细胞3和9。与图2 不同的是，图2所示的方法中，在细胞粘附性材料的上层有细胞外基质、饲养细胞那样的纤维状或膜状物质的情况下，仅通过第1光照射7，不能每个区域都切断细胞粘附性材料，但 在图3所示的方法中，通过进行第2光照射5来切断区域间。 [0140] 实施使用了本发明的细胞粘附性光控制基材(例如，将细胞粘附性光控制材料成膜于透明基材上而得的)的细胞的解析区分方法的装置至少具备以下的(1)、(2)、(3)、 (4)、(6)和(7)。 [0141] (1)该细胞粘附性光控制基材 [0142] (2)载置该基材的台 [0143] (3)取得细胞图像的光学检测单元 [0144] (4)从细胞图像获得位置信息的单元 [0145] (5)用于切断或破坏细胞间和细胞粘附性光控制材料的第2光照射单元 [0146] (6)用于使该基材上的细胞粘附性光控制材料进行光反应，变化为细胞非粘附性的第1光照射单元 [0147] (7)控制各单元的动作的单元 [0148] 上述(3)的取得细胞图像的光学检测单元可以使用周知的光学系统。取得细胞图像时，照射对细胞粘附性光控制材料的光解离性基没有影响的波长的光来进行。例如，作为光源，使用可获得宽范围的发光光谱的灯或LED，通过用于至少除去光反应波长以下的波长的光的短波长截止滤波器进行光照射，由CCD等2维传感器检测透射光、反射光等。在来自 细胞的荧光图像的情况下，作为激发光，由带通干涉滤波器等而分光出比光反应波长长的 波长带且为目的的荧光色素的吸收波长带的光来进行照射。也可以使用上述波长带的激 光。通过激发光截止滤波器、荧光波长透射滤波器(带通干涉滤波器等)等波长滤波器，由 CCD等2维传感器检测荧光。如果使激发光较细地集中，变为2维扫描的方式，则也能够通 过光电倍增管来计测荧光图像。如果切换多个波长滤波器进行测定，则可以获得多个荧光 波长的荧光图像，可以对应于多个荧光体。如果通过棱镜、衍射光栅等分散元件，由线传感器等检测，则也可以获得更细的波长光谱图像。 [0149] 上述(5)的第2照射单元，光源可以使用红外激光器或紫外激光器，以通过上述(4)的单元而得到的位置信息为基础通过激光扫描来实施。激光扫描时使用XY偏转器，对 目的的位置进行光照射。此外，也可以通过反映出通过上述(4)的单元而得到的位置信息 的光掩模来一并进行光图案照射。在该情况下，为了不制成每次实验时固定的光掩模，通过作为图案发生器的空间光调制器件而在基材上聚光激光的光学系统是适合的。作为空间光 调制器件，可以使用反射型或透射型空间光调制器件。作为反射型空间光调制器件，可以使用数字微镜器件，此外，作为透射型空间光调制器件，可以使用液晶空间光调制器件。这里，数字微镜器件、液晶空间光调制器件可使用的激光波长主要是从可见光至近红外光区域。 因此，作为激光源，可以使用水的吸收强的近红外激光器。此外，在想要将波长设定在紫外区域的情况下，对于可视至近红外激光光，使用通过空间光调制器件后，通过非线形结晶、铁电体结晶等波长变换器件，波长变成1/2、1/3的第二谐波、第三谐波即可。 [0150] 上述(6)的第1光照射单元，光源使用细胞粘附性光控制材料的光反应波长。使用可获得宽范围的发光光谱的灯或LED等，由波长滤波器阻断360nm以下的波长的光、根 据情况阻断荧光激发波长以上的波长的光，或者可以使用光反应波长的激光。以通过上述 (4)的单元而得到的位置信息为基础，使用XY偏转器进行光扫描，对目的的位置进行光照 射，或者也可以通过反映出通过上述(4)的单元而得到的位置信息的光掩模一并进行光图 案照射。在该情况下，为了不制成每次实验时固定的光掩模，通过作为图案发生器的空间光调制器件而在基材上聚光的光学系统是适合的。作为空间光调制器件，可以使用反射型或 透射型空间光调制器件。作为反射型空间光调制器件，可以使用数字微镜器件，此外，作为透射型空间光调制器件，可以使用液晶空间光调制器件。 [0151] 期望上述(3)、(5)和(6)的光学系统尽量使用共同的部件。 [0152] 本发明的使用法进行大致区分，可以认为是(1)将包含所希望的目的细胞的细胞群捕捉在容器中，解析后进行分取的情况，和(2)将所希望的目的以外的细胞群捕捉在容 器中，进行解析，不捕捉包含目的细胞的细胞群而直接回收的情况。这里所谓容器，是指能够将细胞无菌地收纳的器皿、微板等容器，优选在内部的底面上具有细胞粘附性光控制基 材。在干细胞研究、再生医疗领域中，有时对来源于不同动物种的细胞进行共培养。可举 出例如将小鼠成纤维细胞作为饲养细胞，对人iPS细胞进行共培养的例子，或将相同的小 鼠成纤维细胞作为饲养细胞，对人表皮干细胞进行共培养的例子等。这些例子中，有必要区分人iPS、表皮干细胞、或来源于它们的人细胞、和小鼠细胞。在作为目的细胞，设定来源于人的细胞，作为目的以外的细胞，设定来源于小鼠的细胞的情况下，在例如上述(1)的情况下，只要使作为目的细胞的来源于人的细胞群结合于细胞粘附性光控制基材即可，在上述 (2)的情况下，只要使作为目的以外的细胞的来源于小鼠的细胞群结合于细胞粘附性光控 制基材即可。在任一情况下，都可以提供可以结合来源于人(或小鼠)的细胞的细胞粘附 性光控制基材(以下，简称为基材)，是合适的。 [0153] 为了该目的，例如通过使用将针对对动物种特异性的抗原的抗体结合于细胞粘附性基X而得的细胞粘附性材料，可以提供结合来源于特定动物种的细胞的基材。然而为了 选定该抗体，需要特别的特性。在上述目的的情况下，需要不仅捕捉例如人iPS细胞，而且从它们分化诱导出的各种人细胞也完全捕捉进行解析。另一方面，抗体通常针对特定抗原 的特异性的反应性(特异性)极其高。即，仅仅是细胞的性质略微变化，该抗原的表达量、 结构微妙地变化，抗体对于细胞的反应性也会敏锐地受到影响，即使是来源于相同动物种 的细胞，也可能出现不能结合的细胞。即，为了上述目的，特异性极其高的通常的抗体反而不合适，不如说相对于与目的的动物种共同的抗原的广泛的(其含义是特异性低)特性是 合适的。此外，相对于目的外的动物种的类似的抗原，反应性极其低(其含义是特异性高) 也有必要。作为这样的动物种特异性的细胞表面抗原的候选，本发明中对于主要组织相容 性基因复合体(MHC)进行了研究。MHC被称为主要组织相容性抗原，在人的情况下也称为人 白血球型抗原(HLA)，它们编码的糖蛋白称为MHC抗原、MHC分子。在MHC类分子内，MHC类 I分子几乎存在于全部的有核细胞的表面，其中类Ia中对于人而言有HLA-A、B、C这3种， 对于小鼠而言有H-2K、2D、2L这3种。MHC类I分子作为区分自身与他者的标识而起作用。 HLA-A、B、C分子相当于人HLA类I分子的非多型性决定基，被认为在全部的人有核细胞的 表面表达。作为抗人HLA-A、B、C抗体，克隆W6/32以及克隆B9.12.1被市售。作为抗小鼠 H-2抗体的克隆M1/42与小鼠MHC即H-双分子的a、b、d、j、k、s、u这样的多个单体型反应。 因此，可以认为上述的抗体分别与全部的人细胞、或多数的小鼠细胞结合。 [0154] 是否可以将这些抗体适用于本发明的目的，需要不仅与目的细胞反应，而且其反应性高，与目的外细胞的交叉反应性低。实验地研究的结果表明，在上述抗体中，克隆W6/32和克隆B9.12.1不仅与作为株化人细胞的HCT116的反应性高，而且与作为株化小鼠细胞的 NIH/3T3的反应性极其低，表明可以适合使用于本目的。另一方面表明了，克隆M1/42虽然 与人细胞HCT116的交叉反应性极其低，但是与小鼠细胞NIH/3T3的反应性不一定充分高这 样的课题。这样，本目的中是否能够利用特定的抗体，不能仅通过添附于抗体的数据表等的公知信息来判断，实验地评价与细胞的反应性后，才能表明是否可以利用，即抗体的性能处于难以预测的状况。 [0155] 对于关于上述克隆M1/42的反应性的课题进行了以下的研究。即，稍微限定目的，在将小鼠成纤维细胞作为饲养细胞，对人iPS细胞等进行共培养的体系中，探索出为了捕捉小鼠成纤维细胞而能够使用的抗体。作为成纤维细胞的表面抗原，已知CD9、CD10、CD29、CD44、CD47、CD49b、CD54、CD81、CD90、CD91、CD121a、CD248、FSP1、SFA等。其中对作为抗小鼠CD9抗体的克隆MZ3的反应性进行了确认的结果表明，与小鼠细胞NIH/3T3的反应性极 其高，而且与人细胞HCT116的反应性极其低，表明了可适合用于本目的。另外，抗体通过后述的方法而介由光解离性基结合于细胞非粘附性材料。 [0156] 另一方面也表明了，市售抗人EpCAM抗体(克隆名Ber-EP4)、由本申请发明者等开发出的抗人EpCAM抗体(克隆名hrk29，由cosmobio社销售)和抗人CD9抗体(暂称 C1D3-G4D9)与多数的人细胞(HeLa、HCT116、CaR-1)的反应性高。这些抗体也有可以适合 用作人细胞用的通用性高的抗体的可能性。 [0157] 在上述的使用法(1)、即在容器中结合包含目的细胞的细胞群而进行捕捉的使用法的情况下，在本发明的一构成中通过使用如上述那样选定的抗人HLA-A、B、C抗体，从而可以提供捕捉来源于人的细胞而结合，并且，不结合来源于小鼠等的细胞的细胞粘附性光 控制基材。该构成具有下述效果：在进行人细胞的详细解析的目的下仅可以高效率地捕捉 必要的人细胞，并可以预先高效率地除去不要的来源于动物的细胞。通过同样地使用抗小 鼠H-2抗体，也可以提供结合来源于小鼠的细胞，并且，不结合来源于人等的细胞的细胞粘附性光控制基材。 [0158] 在上述的使用法(2)、即在容器上结合目的以外的细胞群而除去，包含目的细胞的细胞群不结合而直接回收的情况下，通过适用上述后者的构成，可以提供结合来源于小鼠的细胞，并且，不结合来源于人等的细胞的容器。此外，在此外不同的构成中，通过同样地使用抗小鼠CD9抗体，从而可以提供结合小鼠饲养细胞，并且，不结合来源于人的细胞的容器。通过使用后2者的容器，具有在进行人细胞的详细解析的目的下可以预先高效率地除 去不要的来源于动物的细胞，仅可以高效率地回收必要的人细胞这样的效果。 [0159] 另外，也有时优选全部捕捉进行了共培养的多个细胞。在该情况下，可以混合使用针对多个细胞的抗体。可以混合使用例如抗人HLA-A、B、C抗体与抗小鼠H-2抗体、或抗人HLA-A、B、C抗体与抗小鼠CD9抗体。也当然能够并用3种以上针对预想的细胞的抗体。通 过这些构成，具有捕捉所有种类的细胞后进行解析，根据需要要通过光照射来分取的情况 下，可不遗漏地进行捕捉这样的效果。 [0160] 作为适于全部捕捉细胞的目的的方法，也可以采用以下的构成。即，作为细胞粘附性材料，使用与细胞的结合极其牢固，换言之，结合常数为例如107M以上，极其大，实质上不可逆地与细胞结合的材料(以下细胞结合性材料)。作为细胞结合性材料的例子，可举出末端具有细胞结合性基的材料。作为细胞结合性基的一例，可举出在包含上述通式(4)的 材料中，作为式中X，具有共价官能团的例子。这里所谓共价官能团，是能够与存在于细胞表面的作为化合物的构成要素的官能团(以下细胞表面官能团)进行共价结合反应的官能 团。作为细胞结合性基的另一例，也可举出在包含上述通式(4)的材料中，使针对细胞的表面抗原的抗体结合于式中X的材料。 [0161] 第2现有例(日本特开2006－6214号公报)中的末端官能团、吸附于末端官能团的细胞粘附促进物质与本申请发明中的细胞结合性基的主要不同点如下所述。在末端官 能团、细胞粘附促进物质的情况下，细胞利用其表面所具备的细胞粘附因子等的功能，相对于末端官能团、细胞粘附促进物质进行粘附，即细胞成为主体而进行粘附。另一方面，在细胞结合性基的情况下，相反地细胞结合性基利用共价官能团、抗体，与细胞表面的化合物进行共价结合、抗原抗体反应，即细胞结合性基成为主体而进行粘附。换言之，与细胞的粘附中，第2现有例中的末端官能团、细胞粘附促进物质是被动的，本申请的细胞结合性基具有积极的作用。在使用第2现有例中的末端官能团、细胞粘附促进物质的情况下，有粘附力一般较弱的课题，此外细胞发挥粘附功能，因此需要等待因子的产生、分泌、细胞表面的分子的排列等功能表现，因此存在粘附花费时间这样的课题。另一方面，在使用本申请中的细胞结合性基的情况下，具有不仅粘附力高，而且不依存于细胞侧的功能表现，因此具有粘附时间短这样的优点。 [0162] 作为共价官能团的具体例，可举出以下例子。例如在细胞表面存在各种细胞表面蛋白质(细胞膜蛋白质)，蛋白质存在多个氨基，因此细胞表面广泛存在氨基。作为相对于 细胞表面的氨基的共价官能团的代表性例子，可举出羧酸的活性酯基，具体可举出N－羟 基琥珀酰亚胺酯、N－羟基磺基琥珀酰亚胺酯等。作为相对于氨基的共价官能团的其它例 子，羧酸卤化物、羧酸酐、羧酸叠氮基等活化了的羧酸也能够使用。此外环氧化物基、氮丙啶基、吖丙啶 基、环锍 基等变形大的三元环官能团等也能够使用。此外对甲苯磺酰基等 也能够使用。此外细胞表面也存在各种糖链。构成糖链的糖类可以采用具有醛基或酮基的 异构体结构，因此在细胞表面也广泛存在醛基、酮基。作为相对于细胞表面的醛基、酮基的共价官能团的例子，可举出1,3－二醇、肼、羟基胺醚等。对甲苯磺酰基与羟基等反应，与细胞表面的具有羟基的蛋白质、糖类等各种化合物也能够共价结合。 [0163] 作为细胞粘附性材料，通过使用如上所述与细胞的结合极其牢固的细胞结合性材料的构成，从而具有细胞粘附性光控制基材可以介由该官能团而与细胞表面的官能团极其 牢固地结合这样的效果。特别是，通过使用末端具有相对于细胞表面的官能团的共价官能 团的细胞结合性材料的构成，从而具有细胞粘附性光控制基材可以介由该官能团而通过与 细胞表面的官能团进行共价结合来极其牢固地结合这样的效果。这些构成中的基材与细 胞之间所形成的共价结合是牢固的，因此仅通过细胞与基材接触而细胞固定化于基材的表 面，无需等待细胞侧的粘附功能表现。因此，也具有细胞相对于细胞粘附性光控制基材的粘附时间缩短这样的效果。 [0164] 这里，作为细胞粘附性材料使用细胞结合性材料，该细胞结合性材料为末端具有相对于细胞表面的氨基的共价官能团的情况下，该材料不仅可以与细胞结合而且抗体也可 以通过共价键进行结合。原因是，抗体中也存在多个氨基。因此，首先制作具有末端具有相对于氨基的共价官能团的细胞粘附性材料的细胞粘附性光控制材料后，对其添加抗体而进 行反应，从而可以制作结合有抗体的细胞粘附性光控制材料。 [0165] 相关地，该材料不仅与细胞、抗体结合，而且细胞外基质等蛋白质也通过共价结合进行结合。其原因是，细胞外基质蛋白中也存在多个氨基。因此，首先制作具有末端具有相对于氨基的共价官能团的细胞粘附性材料的细胞粘附性光控制材料后，对其添加细胞外基质而进行反应，从而可以制作结合有细胞外基质的细胞粘附性光控制材料。同样地，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、蛋白质A、蛋白质G等的结合抗体时通用的蛋白质也可以通过 共价结合而结合。 [0166] 作为细胞粘附性材料，使用末端具有共价官能团的细胞结合性材料的情况下，通过适当地选择官能团，可以实现稳定性高的细胞粘附性光控制基材。例如N－羟基琥珀酰 亚胺酯、环氧化物基、对甲苯磺酰基等作为稳定性高的共价官能团是已知的。 [0167] 在细胞粘附性材料中的细胞粘附性基X上结合抗体而使用的情况下，抗体一般稳定性高，能够稳定地维持结合性能，因此在将细胞粘附性光控制材料在基材上成膜而形成 的细胞粘附性光控制基材的制造阶段，可以预先将抗体结合于细胞粘附性光控制基材。同 样地，细胞外基质也可以预先结合。在该情况下，细胞粘附性光控制基材充满包含保存料的缓冲液，或保冷，从而可以长地维持有效期间。 [0168] 通过将共价官能团、抗体在制造阶段预先结合于细胞粘附性光控制基材，从而使用者能够直接使用细胞粘附性光控制基材。通过该构成，具有可以省略使用者调制官能团 或结合抗体的劳力和时间这样的效果。 [0169] 另一方面，通过将共价官能团在制造阶段预先结合于细胞粘附性材料，也能够是使用者亲自结合所希望的抗体、细胞外基质后再使用。通过该构成，具有使用者可以省略调制官能团的劳力和时间，并且使用者可以任意地选择所使用的抗体、细胞外基质这样的效 果。 [0170] 在细胞粘附性材料中的细胞粘附性基X上结合动物种特异性的抗体而使用的情况下，作为分散细胞的分散介质，能够自由地选择培养基、缓冲液等一般在细胞培养中通用的分散介质。另一方面，在作为细胞粘附性材料中的通式(4)的细胞粘附性基X而使用共 价官能团的情况下，分散介质可以利用不含共价官能团进行反应的成分的分散介质。在使 用具有相对于氨基的共价官能团的细胞结合性材料的情况下，作为细胞的分散介质，例如 2+ 2+ HBSS(Hanks’Balanced Salt Solution，含有Ca 、Mg )(以下简称为HBSS(+))等不含氨基 2+ 2+ 的缓冲液能够适合使用。HBSS(+)包含作为细胞粘附因子的Ca 、Mg ，因此具有可以促进细胞粘附这样的效果。HBSS(+)不仅在细胞粘附工序中，而且在对粘附的细胞进行解析、或部分地回收等对细胞进行处置的全部工序中对于细胞的粘附性维持是有效的。另一方面，细 胞粘附结束后，在不需要其以上的细胞粘附性的情况下，也可以例如通过导入如三羟基甲 基氨基甲烷那样包含氨基的缓冲剂、细胞外基质等蛋白质、含有血清的培养基等进行反应，从而使其与上述共价官能团反应，使其以上的反应性丧失。 [0171] 为了缩短细胞相对于细胞粘附性光控制基材的粘附时间，在本发明中，优选也讨论了以下的手段。即，如上所述细胞粘附性的提高只有细胞与基材接触才能发挥作用。然而即使将细胞试样导入基材中，细胞也会悬浮在试样液中，换言之大部分的细胞悬浮于试样 液中，因此不能立即与基材接触。到试样液中的悬浮细胞沉降而与基材接触为止，需要大致 30分钟左右的时间。如本申请发明的一形态那样，在将细胞暂时捕捉到基材而进行解析，仅剥离目的细胞而回收的使用形态的情况下，等待细胞沉降的工序花费约30分钟，存在时间 效率差这样的课题。因此，为了缩短沉降细胞的工序时间，本发明中研究了应用离心力而加速细胞的沉降。在使用典型的离心机(日立工机制himac CF7D2型)的情况下，通过与摆 动转子(RT3S3型)、SBS标准微板用的叶片(旋转半径170mm)组合，使用微板型的细胞培 养容器，从而可以相对于在容器底面形成的细胞粘附性光控制基材大致垂直地使离心力作 用，相对于细胞粘附性光控制基材而使细胞均一地沉降。在通过上述装置构成，使约400xg的离心力作用于细胞悬浮液的情况下(转速约1450转/分钟)，通过进行最短30秒，长地 为90秒的短时间的离心操作，而表明悬浮状态的细胞几乎能够全部沉降。在作为细胞培养 容器使用器皿(培养皿)、烧瓶等的情况下，通过使用将它们固定于SBS板用叶片的夹具，从而可以防止离心操作中的容器的移动、破损。在使用上述装置构成的情况下，加减速另行花费时间，分别为约33秒、约41秒。即如果采用本发明方式，则细胞的沉降所要的时间包含 加减速在内为约1.5～3分钟。因此，具有与以往的自然沉降所需要的约30分钟相比，可 以将细胞沉降所需要的时间缩短1位数以上这样的效果。 [0172] 此外，在自然沉降的情况下，仅仅是大致球形的细胞的最下端与容器底部接触，因此也有接触面积小，粘附弱这样的课题。本发明方式中，对细胞提供离心力而与容器压接，因此也有细胞变化而扁平化，接触面积增大，可以通过宽的粘附面积而牢固地粘附这样的效果。 [0173] 离心的有效性不限于细胞沉降的工序。细胞沉降工序之后，一般需要细胞粘附的工序，两工序合起来而需要通常3小时左右的时间。如果如本申请发明那样作为细胞粘附 性材料而使用末端具有共价官能团的细胞结合性材料，或在细胞粘附性材料中的细胞粘附 性基X上结合动物种特异性抗体而使用，则结合变得牢固，因此缩短细胞粘附时间如上所 述。该细胞粘附工序中通过并用离心，从而细胞与容器的接触面积增大而促进粘附。即， 在细胞沉降所需要的30至90秒离心未结束，接着继续离心数分钟，从而具有细胞粘附也促 进，可以将细胞更牢固地粘附于容器(所形成的细胞粘附性光控制基材)这样的效果。 [0174] 以下，显示用于作为本发明的一形态的原理验证的实施例，但本发明不限定于此。 [0175] ［实施例1］ [0176] 准备成膜有通式(1)所示的甲基丙烯酸酯聚合物(R1：CH3，n：1)与通式(2)所示的1 2 1 甲基丙烯酸酯聚合物(R ：CH3，R ：CH2CH2CH2)与通式(14)所示的甲基丙烯酸酯聚合物(R ： 4 5 6 8 9 13 16 CH3，R ：OCONH，R ：Br，R ：OH，R ：H，R ：H，R ：CH2CH2OCH2CH2，R ：CH2CH2OCOCH2NHCH2，X：CO2H，) 2 的3元共聚物的玻璃制培养容器(底面积9.6cm)。作为不要的细胞的模型，准备12万个 NIH/3T3细胞(来源于小鼠成纤维细胞的细胞系)，悬浮于该细胞专用培养基(10%小牛血 清，90%DMEM)1.6mL。将该NIH/3T3细胞悬浮液加入玻璃制培养容器中，在37℃、5%CO2培养箱中培养1天。作为必要的细胞的模型，准备24万个HCT116细胞(来源于人结肠癌的细胞 系)，悬浮在该细胞专用培养基(10%FBS，90%McCoy’s5a)1.6mL中。从培养有上述NIH/3T3 细胞的玻璃制培养容器除去培养基，将HCT116细胞的细胞悬浮液加入玻璃制培养容器中， 在37℃，5%CO2培养箱中培养1天。此外另行分别单独地同样地培养两细胞，预先取得它们 的相位差显微镜像。另外HCT116细胞显示铺路石状，NIH/3T3细胞显示纺锤状的细胞形态。 将上述玻璃制培养容器设置于本发明的装置中，阻断450nm以下的光而进行相位差显微镜 观察。通过监测器确认不要细胞(即纺锤状的NIH/3T3细胞)的位置，将该不要细胞群内 周边设定为激光消融区域(参照图1(1)(2)(3)(4a)(5a))。将337nm的激光进行激光扫描 照射而切断必要细胞(即铺路石状的HCT116细胞)与不要细胞之间和细胞粘附性光控制 材料。然后，在通过激光消融照射而被包围的内侧的区域内的目的外细胞群区域中，进行光反应用的375nm激光扫描。将玻璃制培养容器从装置取出，将不要细胞群与培养基一起回 收，加入新的培养基，返回到培养箱而继续培养。由此，可以除去几乎全部的不要细胞，残留必要细胞而继续培养。 [0177] 本例使用模型细胞来显示动作原理，但也能够将必要细胞与正常细胞置换，将不要细胞与异常细胞置换而进行同样的操作。具体而言，例如在干细胞的分化诱导研究中除 去异常细胞(分化成目的外的细胞的细胞，直接维持干细胞性的未分化细胞等)，残留正常 细胞(根据目的而分化出的细胞等)而挑选分取的目的等，同样地能够适用。相反地也能 够将必要细胞与异常细胞置换，将不要细胞与正常细胞置换而进行同样的操作。具体而言，在例如癌细胞的研究中，除去正常细胞(目的外的未癌化的细胞)，残留异常细胞(目的的 癌细胞等)而挑选分取并浓缩的目的等，也同样地能够适用。 [0178] 对于上述的例子中作为细胞的观察方法使用相位差显微镜而以细胞的形态作为判断基准来识别细胞的情况，进行了例示，但也可以通过其它方法来识别细胞。例如也能够使用对细胞特异性的荧光染色试剂，使用荧光显微镜像来识别目的细胞与目的外细胞。 [0179] 本例中通过适当地选择细胞粘附性光控制材料的细胞粘附性基、适当地控制细胞粘附性材料与细胞非粘附性材料的比，从而能够使各种种类的细胞粘附。此外，由于通过光解离反应从细胞粘附性向非粘附性进行高效地不可逆地变化，因此细胞与该基材的粘附选 择性优异，而且，由于将细胞间的粘附和细胞粘附性光控制材料通过激光进行切断，因此回收存在于任意的区域的所希望的细胞时，可以提高该细胞的纯度、回收率。进一步此外，对细胞进行培养时，不需要如流式细胞器或分选装置那样从培养基材暂时取出细胞而进行纯 化，可以在相同培养基材上实时除去不要的目的外细胞的同时进行培养，培养、纯化的操作变得简单。即使目的细胞与目的外细胞密合或进入，目的细胞与目的外细胞也在空间上被 分离，细胞区域被区分化。由此，可以将光解离反应限定在目的外细胞区域而进行，可以选择性地剥落目的外细胞。暂时剥落的细胞由于原场所不可逆地变化为细胞非粘附性，因此 不会进行再粘附，可以有效果地除去目的外细胞。进一步此外，没有如流式细胞器或分选装置那样的电刺激、冲击，此外，通过控制光反应波长、相位差显微镜观察用光波长、荧光观察用激发光波长也可以降低对细胞的光毒性，因此可以提高细胞的生存力。此外，将细胞在2维平面上排列，基本上同时对各细胞接触光，进行相位差显微镜或荧光观察，因此不需要如流式细胞器那样1维地排列细胞而用于使各个细胞接触激光的光轴调整。 [0180] ［实施例2］ [0181] 将通式(17)所示的烷氧基硅烷(R2：CH2CH2CH2，R3：CH3，R4：OCOO、R5：Br，R6：OH，R8：9 19 H，R ：H，R ：CH2NHCH2)在玻璃制培养容器上成膜，接着，在Cu离子存在下，使叠氮基化合物：RGD肽NHCOCH2CH2OCH2CH2N3进行Huisgen反应。对该玻璃制培养容器与实施例1同样 地操作而将NIH/3T3细胞和HCT116细胞连续进行4天共培养后，将玻璃制培养容器从培 养箱取出。将细胞用PBS洗涤，通过细胞表面标记用封闭液(JRH社)进行1小时处理。加 入将用于检测作为人细胞的标记的HLA抗原的小鼠抗人HLA－A、B、C抗体的FITC标识品 (BioLegend社，克隆W6/32)、与用于检测作为小鼠细胞的标记的H－2抗原的大鼠抗小鼠 H－2抗体的PE(藻红蛋白)标识品(BioLegend社，克隆M1/42)用细胞表面标记用封闭液 稀释而得的染色液，在室温反应1小时，用PBS洗涤。细胞的观察和区分如下进行。将玻璃 制培养容器设置于本发明的装置中。显微镜观察和荧光观察时，为了不进行光反应，在光源波长内阻断450nm以下的光。利用荧光观察和相位差显微镜观察，利用监测器确认人细胞 (用FITC标识的、荧光波长520nm，绿橙色)和小鼠细胞(用PE标识的、荧光波长575nm， 橙色)的位置，设定各自细胞群内的激光消融区域(参照图1(1)(2)(3)(4b)(5b))。扫描 337nm的激光，切断人细胞与小鼠细胞之间和细胞粘附性光控制材料，分离各自细胞群的区域。然后，首先，在人细胞区域，进行用于光反应的375nm激光扫描。然后，进行剥离，将在培养基中悬浮的人细胞与培养基一起回收。根据需要，接下来，进行洗涤，添加培养基后，在不同的区域，即，小鼠细胞区域，进行光反应用的375nm激光扫描。然后，进行剥离，将在培养基中悬浮的小鼠细胞与培养基一起回收。 [0182] 本例中，与实施例1不同地，通过使发生光解离反应的区域相反，从而以高纯度、高回收率、高生存力分取所希望的必要细胞。 [0183] 作为在如本实施例所述进行荧光观察的情况下的特有的效果，可举出即使混入极微量的不要细胞，也可以分别选择性地荧光染色必要细胞和不要细胞，通过荧光检测而高 灵敏度地分别进行检测、识别，仅高精度地挑选分取必要细胞这样的效果。此外，本实施例中也能够从3种以上细胞的混合物，设定2种以上必要细胞，分别依次回收。 [0184] 本例中虽然使用模型细胞来显示动作原理，但也能够将必要细胞与人细胞置换，将不要细胞与小鼠饲养细胞置换而进行同样的操作。具体而言，例如在人干细胞的未分化 维持、分化诱导的研究中，能够适用于除去不要细胞(小鼠饲养细胞)，依次挑选分取多个 目的细胞(维持多能性的人干细胞和从人干细胞分化出的各种分化细胞)的目的等。在该 情况下，人干细胞的未分化性的识别时，能够采用由相位差显微镜得到的细胞形态、以各种干细胞标记为指标的荧光染色等。当然本实施例中使用的模型细胞与实施例1同样，能够 根据各种目的而各自设定。本例的其它效果与实施例1同样。 [0185] ［实施例3］ [0186] 在与实施例1同样地操作而进行了培养的其它玻璃制培养容器中加入PBS并洗涤后，加入胰蛋白酶/EDTA溶液，在室温放置数分钟，从玻璃制培养容器使细胞剥离。然后，加入胰蛋白酶抑制液而使反应停止，利用冲吸将细胞回收到离心管中，进行数分钟离心分离，除去上清液而加入培养基，制成细胞的悬浮液。此外，如果以人细胞标记、小鼠细胞标记作为指标，则细胞染色与实施例2同样地进行。接下来，准备成膜有通式(1)所示的甲基丙烯 1 1 2 酸酯聚合物(R ：CH3，n：1)与通式(2)所示的甲基丙烯酸酯聚合物(R ：CH3，R ：CH2CH2CH2) 1 4 5 6 8 9 11 与通式(11)所示的甲基丙烯酸酯聚合物(R ：CH3，R ：OCOO、R ：Br，R ：OH，R ：H，R ：H，R ： 14 CH2NHCH2CH2OCH2CH2，R ：CH2CH2，X：CO2H，)的3元共聚物的玻璃制培养容器，添加PBS，设置在本发明的装置内。而且，以20μm见方的细胞粘附区域以40μm间距排列成格子状的方式， 对除此以外的区域进行375nm激光扫描，将反应生成物与PBS一起除去，再次，用PBS洗涤。 在该玻璃制培养容器中接种上述细胞悬浮液并摇动后，静置3小时。或者，为了加速粘附，在接种、摇动后，使用板离心机等使细胞沉降在玻璃制培养容器的底部后，静置30分钟。为了除去未粘附的细胞，更换培养基后，将本容器设置在本发明的装置内。细胞的观察和区分如下进行。显微镜观察和荧光观察时，为了不进行光反应，在光源波长内阻断450nm以下的光。根据由显微镜观察和荧光观察得到的各地址的色信息，来检测人细胞、小鼠细胞、细胞无粘附的位置。在细胞粘附区域的细胞无粘附的地址区域进行光反应用的375nm激光扫 描，使回收细胞不会再次粘附，然后对人细胞的地址区域进行光反应用的375nm激光扫描，将剥离出的人细胞与培养基一起回收。根据需要，接下来，添加培养基，对小鼠细胞的地址区域进行光反应用的375nm激光扫描，将剥离出的小鼠细胞与培养基一起回收。 [0187] 本实施例中，除了与实施例1、2同样的效果以外，对细胞进行解析、分析时，通过使各个细胞与格子状的地址粘附，从而可以加快光学检测、解析区分速度。此外，通过这样的方法，具有对通过化合物进行的细胞的反应等进行观察、解析，即，可以区分，同时能够进行实时的对应这样的效果。 [0188] ［实施例4］ [0189] 将15万个Colo320HSR细胞悬浮在该细胞用培养基(10%FBS，90%RPMI1640)中，在涂布有胶原的玻璃制培养容器中接种并培养7天。然后，用0.25%胰蛋白酶PBS液剥落，反 应停止后，悬浮于新鲜的该培养基中。 [0190] 另行，准备成膜有通式(1)所示的甲基丙烯酸酯聚合物(R1：CH3，n：1)与通式(2)1 2 所示的甲基丙烯酸酯聚合物(R ：CH3，R ：CH2CH2CH2)与通式(12)所示的甲基丙烯酸酯聚合 1 4 5 6 7 8 12 14 物(R ：CH3，R ：OCOO、R ：Br，R ：OH，R ：H，R ：H，R ：CH2CH2(C2HN3)CH2CH2OCH2CH2，R ：CH2CH2，X：CO2H，)的3元共聚物，并在其上涂布有胶原的玻璃制培养容器，添加PBS，设置在本发明的装置内。而且，以20μm见方的细胞粘附区域以40μm间距排列成格子状的方式，首先， 棋盘格状地激光扫描337nm的激光而切断细胞粘附性光控制材料。接着，375nm激光扫描细 胞粘附区域以外的区域，将反应生成物与PBS一起除去，再次，用PBS洗涤。 [0191] 在其中接种上述细胞悬浮液并摇动后，静置3小时。或者，为了加速粘附，接种、摇动后，使用板离心机等使细胞沉降于玻璃制培养容器的底部后，静置30分钟。为了除去未粘附的细胞，更换培养基，细胞的观察和区分如下进行。显微镜观察时，为了不进行光反应，在光源波长内阻断450nm以下的光。根据由显微镜观察得到的各地址的细胞图像信息，检测Colo320HSR细胞的位置。对细胞粘附区域的细胞无粘附的地址区域进行光反应用的 375nm激光扫描，使回收细胞不会再次粘附，然后对Colo320HSR细胞的地址区域进行光反 应用的375nm激光扫描，将剥离出的Colo320HSR细胞与培养基一起回收。 [0192] 本实施例中，除了与实施例1、2同样的效果以外，将细胞外基质、饲养细胞等纤维状、膜状的物质用于与细胞的粘附的情况下，对于该材料的图案形成有效地作用。在上层有纤维状或膜状物质的情况下，仅进行第1光照射时，有细胞粘附性材料不能在每个区域进行切断的可能性。将其通过第2光照射而切断区域间。 [0193] 本实施例中作为细胞外基质使用胶原，作为粘附性低的细胞将Colo320HSR细胞作为模型而使用。本实施例中其它细胞外基质、粘附性低的细胞也能够同样地适合使用。作为细胞外基质的例子，除了上述胶原以外，有纤连蛋白、层粘连蛋白、明胶等，此外作为饲养细胞，可以利用对小鼠胎儿成纤维(MEF)细胞、STO细胞、3T3细胞、SNL细胞等通过γ射线 照射、抗生素而进行了增殖停止处理的细胞。作为需要细胞外基质的细胞的例子，可举出ES细胞、iPS细胞等多能性干细胞、角膜上皮干细胞等。 [0194] ［实施例5］ [0195] 在与实施例3同样地操作而进行了培养的其它玻璃制培养容器中加入PBS而洗涤后，加入胰蛋白酶/EDTA溶液，在室温放置数分钟，从玻璃制培养容器使细胞剥离。然后，加入胰蛋白酶中和液而使反应停止，利用冲吸而将细胞回收到离心管，进行数分钟离心分 离，除去上清液而加入培养基，制成细胞的悬浮液。此外，以人细胞标记、小鼠细胞标记为指标的荧光染色也与实施例3同样地进行。接下来，准备成膜有通式(1)所示的甲基丙烯 1 1 2 酸酯聚合物(R ：CH3，n：1)与通式(2)所示的甲基丙烯酸酯聚合物(R ：CH3，R ：CH2CH2CH2) 1 4 5 7 8 9 13 与通式(13)所示的甲基丙烯酸酯聚合物(R ：CH3，R ：OCONH，R ：Br，R ：H，R ：H，R ：H，R ： 15 CH2CH2OCH2CH2，R ：CH2CH2OCOCH2O、X：CO2H)的3元共聚物的玻璃制培养容器，添加PBS，设置在本发明的装置内。而且，以20μm见方的细胞粘附区域以40μm间距排列成格子状的方 式，对除此以外的区域进行365nm激光扫描，将反应生成物与PBS一起除去，再次，用PBS洗涤。在该玻璃制培养容器中接种上述细胞悬浮液并摇动后，静置3小时。或者，为了加速粘附，在接种、摇动后，使用板离心机等而使细胞沉降在玻璃制培养容器的底部后，静置30分钟。为了除去未粘附的细胞，更换培养基后，将本容器设置在本发明的装置内。细胞的观察和区分如下进行。显微镜观察和荧光观察时，为了不进行光反应，在光源波长内阻断450nm以下的光。根据由显微镜观察和荧光观察得到的各地址的色信息，检测人细胞、小鼠细胞、细胞无粘附的位置。对细胞粘附区域的细胞无粘附的地址区域进行光反应用的365nm光图 案照射，使回收细胞不会再次粘附，然后对人细胞的地址区域进行光反应用的365nm光图 案照射，将剥离出的人细胞与培养基一起回收。根据需要，接下来，添加培养基，对小鼠细胞的地址区域进行光反应用的365nm光图案照射，将剥离出的小鼠细胞与培养基一起回收。 [0196] 本实施例中，除了与实施例1、2同样的效果以外，对细胞进行解析、分析时，通过使各个细胞粘附于格子状的地址，从而可以加速光学检测、解析区分速度。此外，通过这样的方法，可以对通过化合物进行的细胞的反应等进行观察、解析，即，可以区分，同时能够进行实时的对应。 [0197] ［实施例6］ [0198] 将与实施例3同样地进行了培养的细胞进行剥离、回收后，分别独立地进行荧光染色，获得将荧光染色了的HCT116细胞和NIH/3T3细胞悬浮于缓冲液(HBSS(+))的细胞悬 浮液。以下只要未特别记载，则作为缓冲液使用HBSS(+)。 [0199] 接下来，准备将成膜有通式(1)所示的甲基丙烯酸酯聚合物(R1：CH3，n：1)与通式1 2 (2)所示的甲基丙烯酸酯聚合物(R ：CH3，R ：CH2CH2CH2)与通式(14)所示的甲基丙烯酸酯聚 1 4 5 6 8 9 13 16 合物(R ：CH3，R ：OCONH，R ：Br，R ：OH，R ：H，R ：H，R ：CH2CH2OCH2CH2，R ：CH2CH2OCOCH2NHCH2，X：CO2H，)的3元共聚物的玻璃构件设置于底部的培养容器。 [0200] 将由1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)0.4mg溶解于活化缓冲液(0.1M MES，0.5M NaCl，pH6.0)1mL而得的反应液，添加到成膜有上述聚合物的培养容器中。此外将磺基-NHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺)以终浓度为5mM的方式添加到上述的反 应液中，在室温摇动15分钟。弃去反应液，用pH7.4的PBS洗涤3次，制作设置有上述取代 基X由CO－Z(其中Z为N-氧基磺基琥珀酰亚胺基)表示的具有共价官能团的细胞结合 性光控制基材的培养容器。上述的操作全部在遮光状态下实施。该细胞结合性光控制基材 具有羧酸的活性酯基作为共价官能团，因此具有与氨基进行共价结合反应的特性。只要不 与氨基等亲核试剂反应，则是稳定的，能够在氮气气氛中、空气中，此外在无菌状态下在PBS中、HBSS(+)中等各种环境下在维持结合性的状态下长期保存。 [0201] 在上述培养容器中添加缓冲液，设置在本发明的装置内。而且，以20μm见方的细胞粘附区域以40μm间距排列成格子状的方式，对除此以外的区域进行375nm激光扫描，将反应生成物与缓冲液一起除去，再次，用缓冲液洗涤。在该培养容器中接种上述细胞悬浮液并摇动后，设置于离心机的板用摆动转子，通过固定夹具固定后，通过400xg的离心加速度而进行约2分钟离心，从而使细胞沉降于培养容器的底部后，静置5分钟。另外作为固定夹 具使用不仅可以将培养容器固定于摆动转子，而且具有将培养容器从外光遮蔽的盖，从而 在维持遮光条件的同时能够容易地进行离心操作。通过该操作，在细胞结合性光控制基材 上细胞沉降而接触、压接，细胞结合性光控制基材的共价官能团与作为细胞表面官能团的 氨基进行共价结合，细胞与细胞结合性光控制基材牢固并且迅速地粘附。更换细胞缓冲液 而除去未粘附的极少数的细胞后，将本容器设置在本发明的装置内。上述的操作全部以遮 光状态实施。细胞的观察和区分与实施例3同样地进行。即显微镜观察和荧光观察时，为 了不进行光反应，在光源波长内阻断450nm以下的光。根据由显微镜观察和荧光观察得到 的各地址的色信息，检测人细胞、小鼠细胞、细胞无粘附的位置。对细胞粘附区域的细胞无粘附的地址区域进行光反应用的375nm激光扫描，使回收细胞不会再次粘附，然后对人细 胞的地址区域进行光反应用的375nm激光扫描，剥离出的人细胞与缓冲液一起回收。根据 需要，接下来，添加缓冲液，对小鼠细胞的地址区域进行光反应用的375nm激光扫描，将剥离出的小鼠细胞与缓冲液一起回收。 [0202] 本实施例中，除了与实施例3同样的效果以外，在细胞粘附工序中，使用细胞结合2+ 2+ 性光控制基材，而且作为细胞的分散介质，使用不含氨基而包含Ca 、Mg 的HBSS(+)，从而可以缩短细胞粘附时间，加速操作的速度。此外，通过这样的方法，可以缩短前处理时间，即，可以区分，能够抑制细胞的损伤、变质，进行实时的对应。 [0203] ［实施例7］ [0204] 将与实施例6同样地进行了培养的细胞剥离、回收后，分别独立地进行荧光染色，获得将荧光染色了的HCT116细胞与NIH/3T3细胞悬浮于缓冲液(HBSS(+))的细胞悬浮液。以下只要没有特别记载，则作为缓冲液使用HBSS(+)。 [0205] 接下来，准备将成膜有通式(1)所示的甲基丙烯酸酯聚合物(R1：CH3，n：1)与通式1 2 (2)所示的甲基丙烯酸酯聚合物(R ：CH3，R ：CH2CH2CH2)与通式(14)所示的甲基丙烯酸酯聚 1 4 5 6 8 9 13 16 合物(R ：CH3，R ：OCONH，R ：Br，R ：OH，R ：H，R ：H，R ：CH2CH2OCH2CH2，R ：CH2CH2OCOCH2NHCH2，X：CO2H，)的3元共聚物的玻璃构件设置于底部的培养容器。 [0206] 将由1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)0.4mg溶解于活化缓冲液(0.1M MES，0.5M NaCl，pH6.0)1mL而得的反应液，添加在成膜有上述聚合物的培养容器。此外将磺基-NHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺)以终浓度为5mM的方式添加在上述的反 应液中，在室温摇动15分钟。通过弃去反应液，用pH7.4的PBS洗涤3次，从而制作上述的 取代基X以CO－Z(其中Z为N-氧基磺基琥珀酰亚胺基)所示的具有共价官能团的培养 容器。接下来，将小鼠抗人HLA－A、B、C抗体的精制品(BioLegend社，克隆W6/32)100μg 的PBS溶液添加到培养容器中，在室温摇动30分钟。通过弃去反应液，用pH7.4的PBS洗 涤1次，从而制作设置有上述的取代基X以CO－Z(其中Z为从抗体的氨基除去了H的残 基)所示的具有针对细胞表面抗原的抗体的细胞结合性光控制基材的培养容器。上述的操 作全部以遮光状态实施。该细胞结合性光控制基材具有针对人细胞表面抗原的抗体，因此 通过抗原抗体反应，具有与人细胞牢固地结合，与小鼠细胞不结合的特性。此外抗体为稳定的，能够在无菌状态下在PBS中、HBSS(+)中等各种环境下维持结合性的状态下长期保存。 [0207] 在上述培养容器中添加缓冲液，而设置在本发明的装置内。而且，以20μm见方的细胞粘附区域以40μm间距排列成格子状的方式，对除此以外的区域进行375nm激光扫描，将反应生成物与缓冲液一起除去，再次，用缓冲液洗涤。在该培养容器中接种上述细胞悬 浮液并摇动后，设置于离心机的板用摆动转子，通过固定夹具而固定后，通过400xg的离心加速度而进行约5分钟离心，从而使细胞沉降、压接于培养容器的底部。通过该操作，在细胞结合性光控制基材上细胞沉降而接触、压接，细胞结合性光控制基材的抗体与人细胞的 表面抗原通过抗原抗体反应而结合，人细胞与细胞结合性光控制基材牢固并且选择性地粘 附。此外该抗体与小鼠细胞的表面抗原不反应，因此小鼠细胞不粘附。更换细胞缓冲液而 除去不粘附的小鼠细胞后，将本容器设置在本发明的装置内。上述的操作全部以遮光状态 实施。细胞的观察和区分与实施3同样地进行。即显微镜观察和荧光观察时，为了不进行 光反应，在光源波长内阻断450nm以下的光。根据由显微镜观察和荧光观察得到的各地址 的色信息，检测人细胞、细胞无粘附的位置。对细胞粘附区域的细胞无粘附的地址区域进行光反应用的375nm激光扫描，使回收细胞不会再次粘附，然后对人细胞的地址区域进行光 反应用的375nm激光扫描，将剥离出的人细胞与缓冲液一起回收。 [0208] 本实施例中，除了与实施例3同样的效果以外，在细胞粘附工序中，通过作为细胞结合性光控制基材而使用具有抗体的基材，从而可以缩短细胞粘附时间，加速操作的速度。此外，通过使用针对对人细胞特异性的抗原的抗体，能够预先除去过剩地共存的小鼠细胞，能够降低解析中的妨碍。通过这样的方法，缩短前处理时间即，可以区分，能够抑制细胞的损伤、变质，进行实时并且高精度的对应。 [0209] 另外，作为本实施例的变形例，下述方法也能够采用。即，使用底部设置有表面具有COOH基的市售的基材的容器，与上述实施例7同样地，制作取代基X以CO－Z(其中Z为N-氧基磺基琥珀酰亚胺基)所示的具有共价官能团的容器。接下来，将抗小鼠CD9抗体 精制品(克隆MZ3)的PBS溶液与实施例7同样地添加到容器中，进行反应，制作具有针对 小鼠细胞表面抗原的抗体的容器。在该容器中接种细胞悬浮液并摇动后，进行离心，从而使细胞沉降、压接于容器的底部。通过该操作，小鼠细胞通过抗原抗体反应而选择性地结合，由于人细胞不反应，因此不粘附。即，该上清液液中仅包含人细胞。使用该上清液液作为细胞悬浮液而与实施例7同样地进行细胞的观察和区分，从而能够降低解析中的妨碍。 [0210] 以下，显示使用于与实施例1至实施例7同样的细胞处理操作的、其它细胞粘附性光控制材料的实施例。 [0211] ［实施例8］ [0212] 在 通 式(14) 中，(R1：CH3，R4：OCOO、R5：Br，R6：OH，R8：H，R9：H，R13：CH2CH2，R16：CH2CH2OCOCH2CH2CH2CH2CH2(N3CHC)NCH3CH2，X：CO2H)的材料。 [0213] [0214] (1)6-溴-7-羟基-4-(羟基甲基)-8-((甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-2H-苯并吡喃-2-酮的合成 [0215] [0216] 在安装有回流冷却器和带有氩气球的三通阀50mL的茄型烧瓶中，加入电磁搅拌子和多聚甲醛(446.4mg，14.87mmol)。对烧瓶内进行氩气置换后，依次加入乙醇(5mL)和 N-甲基炔丙基胺(1.25mL，14.8mmol)。在室温搅拌1小时而生成的溶液中，加入6-溴-7-羟 基-4-羟基甲基-香豆素(1.3668g，5.042mmol)，在油浴中一边加热至80℃一边继续搅拌 12小时。将反应混合物冷却至室温后，抽滤生成的沉淀，用乙醇洗涤，在真空干燥器中进行干燥，作为淡黄色固体而获得1.3933g(3.956mmol，收率78%)的目的化合物：6-溴-7-羟 基-4-(羟基甲基)-8-((甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-2H-苯并吡喃-2-酮。 1 [0217] H NMRδ(CDCl3)7.62(1H,s),6.45(1H,t,J1.5Hz),4.84(2H,d,J1.5Hz),4.19(2H,s),3.47(2H,d,J2Hz),2.48(3H,s),2.40(1H,t,J2Hz) [0218] (2)叔丁基3-((((6-溴-7-羟基-8-((甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-4-基)甲氧基)羰基)氧)丙酸酯的合成 [0219] [0220] 在安装有CaCl2管的50mL的茄型烧瓶中加入电磁搅拌子和叔丁基3-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧)丙酸酯(100.0mg，0.321mmol)。依次加入CH2Cl2(2mL)、4-二甲基氨基吡 啶(48.8mg，0.400mmol)、和6-溴-7-羟基-4-(羟基甲基)-8-((甲基(丙-2-炔-1-基) 氨基)甲基)-2H-苯并吡喃-2-酮(70.0mg，0.199mmol)，在室温搅拌13小时。加入水而 停止反应后，将分离出的有机层用无水硫酸镁干燥。在过滤分离干燥剂后，将浓缩滤液而得到的粗生成物用快速柱色谱(20g的硅胶60，Merk社，洗脱溶剂为2.4%甲醇-二氯甲烷) 精制，则获得了83.1mg(0.153mmol，收率77%)的目的化合物：叔丁基3-((((6-溴-7-羟 基-8-((甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-4-基)甲氧基) 羰基)氧)丙酸酯。 [0221] 1H NMRδ(CDCl3)7.60(1H,s),6.34(1H,t,J1Hz),5.26(2H,d,J1Hz),4.45(2H,t,J6Hz),4.18(2H,s),3.47(2H,d,J2Hz),2.92(1H,brs),2.65(2H,t,J6Hz),2.49(3H,s),2.42(1 H,t,J2Hz),1.46(9H,s) [0222] (3)3-((((6-溴-7-羟基-8-((甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-2-氧4 5 代-2H-苯并吡喃-4-基)甲氧基)羰基)氧)丙酸的合成(通式(23)中，(R ：OCOO、R ： 6 8 9 31 32 Br，R ：OH，R ：H，R ：H，R ：CH2CH2，R ：CH2NCH3CH2，X：CO2H)的材料的合成) [0223] [0224] 在安装有CaCl2管的50mL的茄型烧瓶中，加入电磁搅拌子和叔丁基3-((((6-溴-7-羟基-8-((甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-2-氧代-2H-苯并吡 喃-4-基)甲氧基)羰基)氧)丙酸酯(83.1mg，0.15mmol)。一边将烧瓶用冰浴冷却，一边 依次加入CH2Cl2(1mL)和三氟-乙酸(0.5mL)，在冰浴中搅拌3小时。如果将溶剂减压蒸馏 除去，则作为三氟-乙酸盐而获得了90.3mg(0.15mmol)的目的化合物：3-((((6-溴-7-羟 基-8-((甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-4-基)甲氧基) 羰基)氧)丙酸。 [0225] 1H NMRδ(CDCl3)7.77(1H,s),6.40(1H,s),5.29(2H,s),4.56(2H,s),4.49(2H,t,J6Hz),3.97(2H,d,J2Hz),2.95(1H,s),2.90(3H,s),2.73(2H,t,J6Hz),2.78(1H,t,J2Hz) [0226] (4)聚(2-(6-叠氮基-己酸酯)乙基甲基丙烯酸酯)的合成 [0227] [0228] 在安装有带有氩气球的三通阀的10mL的茄型烧瓶中，加入电磁搅拌子和6-叠氮化物已酸(195.2mg，1.24mmol)。对烧瓶内进行氩气置换后，依次加入DMF(1.5mL)、65.0mg的聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)(聚HEMA，平均MV～300,000，Aldrich 192066-10G)、 N,N’-二异丙基碳二亚胺(156.6μL，1.00mmol)和4-二甲基氨基吡啶(6.5mg，0.29mmol)，在室温搅拌3天。将生成的沉淀过滤而除去，在滤液中加入水，则生成了白色沉淀。抽滤所得的白色沉淀后，溶解于THF中。在该溶液中加入己烷，倾析再沉淀了的固体，进行分离，则获得了目的化合物：聚(2-(6-叠氮基-己酸酯)乙基甲基丙烯酸酯)。 1 [0229] H NMRδ(CDCl3)4.28(宽),4.15(宽),3.31(宽),2.40(宽),1.9-1.4,1.03(宽),0.88(宽) 1 4 5 6 8 9 13 16 [0230] (5)通式(14)中，(R ：CH3，R ：OCOO、R ：Br，R ：OH，R ：H，R ：H，R ：CH2CH2，R ：CH2CH2OCOCH2CH2CH2CH2CH2(N3CHC)NCH3CH2，X：CO2H)的材料的合成 [0231] 在安装有带有氩气球的三通阀的5mL的茄型烧瓶中，加入电磁搅拌子、3-((((6-溴-7-羟基-8-((甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-2-氧代-2H-苯并吡 4 5 6 8 9 31 喃-4-基)甲氧基)羰基)氧)丙酸(通式(23)中，(R ：OCOO、R ：Br，R ：OH，R ：H，R ：H，R ： 32 CH2CH2，R ：CH2NCH3CH2，X：CO2H)的材料)(60.8mg，0.12mmol)、CuBr(I)(4.2mg，0.028mmol)、 4-二甲基氨基吡啶(16.1mg，0.13mmol)。对烧瓶内进行氩气置换后，依次加入DMF(1.8mL)、N,N,N’,N’’,N’’-五甲基二亚乙基三胺(6μL，0.029mmol)、聚(2-(6-叠氮基-己酸酯)乙基甲基丙烯酸酯)(23.5mg)，在室温搅拌19小时。减压除去DMF后加入CHCl3(5mL)，则 1 4 5 6 8 9 13 获得了目的化合物：通式(14)中，(R ：CH3，R ：OCOO、R ：Br，R ：OH，R ：H，R ：H，R ：CH2CH2， 16 R ：CH2CH2OCOCH2CH2CH2CH2CH2(N3CHC)NCH3CH2，X：CO2H)的材料的沉淀。 [0232] 以下的(6)(7)是利用了玻璃制培养容器上的表面反应的制成方法。 [0233] (6)聚(2-(6-叠氮基-己酸酯)乙基甲基丙烯酸酯)在玻璃基板上的成膜 [0234] 将聚(2-(6-叠氮基-己酸酯)乙基甲基丙烯酸酯)溶解于DMF中，制成0.2w/v%溶液。接着，将玻璃制培养容器用有机溶剂洗涤，进一步用H2SO4：H2O2＝3：1的混合溶液洗涤。将上述聚合物溶液滴加到上述玻璃制培养容器上，进行一晚干燥，从而在玻璃表面成膜上述聚合物的薄膜。 [0235] (7)与3-((((6-溴-7-羟基-8-((甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-4-基)甲氧基)羰基)氧)丙酸的点击反应 [0236] 在1mM的3-((((6-溴-7-羟基-8-((甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-4-基)甲氧基)羰基)氧)丙酸和1.35mM的二甲基氨基吡啶的DMF溶 液中以1.25v%混合1mM的N,N,N’,N’’,N’’-五甲基二亚乙基三胺和1mM的CuBr的DMF溶 液，制成反应液。将该反应溶液添加到成膜有上述叠氮化物聚合物的玻璃表面，在暗处室温 1 4 5 6 8 9 13 反应24小时，从而将通式(14)中，(R ：CH3，R ：OCOO、R ：Br，R ：OH，R ：H，R ：H，R ：CH2CH2， 16 R ：CH2CH2OCOCH2CH2CH2CH2CH2(N3CHC)NCH3CH2，X：CO2H)的材料成膜于玻璃制培养容器。 [0237] ［实施例9］ [0238] 在 通 式 (26) 中，(R3：CH3，R4：OCONH，R5：Br，R6：OH，R8：H，R9：H，R31：32 33 CH2CH2CH2CH2CH2CH2，R ：CH2NCH3CH2，R ：CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2，X：NH2)的材料。 [0239] [0240] (1)(6-溴-7-羟基-8-((甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-4-基)甲基叔丁基己烷-1,6-二基二氨基甲酸酯的合成 [0241] [0242] 在安装有CaCl2管的30mL的茄型烧瓶中，加入电磁搅拌子和N,N’-羰基二咪唑(159.1mg,0.981mmol)。加入CH2Cl2(3mL)和6-溴-7-羟基-4-(羟基甲基)-8-((甲基 (丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-2H-苯并吡喃-2-酮(344.5mg,0.978mmol)，在室温搅 拌1小时，在所得的反应混合物中加入4-二甲基氨基吡啶(136.6mg,1.12mmol)、和溶于 1mL的CH2Cl2的叔丁基(6-氨基己基)氨基甲酸酯(211.8mg,0.979mmol)，在室温搅拌3小 时。一边将生成的沉淀用CH2Cl2洗涤，一边过滤分离而除去，浓缩滤液，将所得的粗生成物(988.0mg)用快速柱色谱(50g的硅胶60，Merck社，洗脱溶剂为二氯甲烷/甲醇:30/1)进 行精制，则获得了376.6mg(0.633mmol，收率65%)的目的化合物：(6-溴-7-羟基-8-((甲基 (丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-4-基)甲基叔丁基己烷-1,6-二 基二氨基甲酸酯。 [0243] 1H NMR δ (DMSO-d6)7.82(1H,s),7.52(1H,t,J5Hz),6.76(1H,brs),6.14(1H,s),5.24(2H,s),4.12(2H,s),3.62(2H,d,J2Hz),3.04(2H,m),2.90(2H,m),2.50(1H,t,J2Hz),2 .40(3H,s),1.40-1.20(8H,m),1.37(9H,s) [0244] (2)(6-溴-7-羟基-8-((甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-4-基)甲基(6-氨基己基)氨基甲酸酯的合成(通式(23)中，(R4：OCONH，R5：Br， R6：OH，R8：H，R9：H，R31：CH2CH2CH2CH2CH2CH2，R32：CH2NCH3CH2，X：NH2)的材料的合成)[0245] [0246] 在安装有CaCl2管的20mL的茄型烧瓶中，加入电磁搅拌子和(6-溴-7-羟基-8-((甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-4-基)甲基叔丁 基己烷-1,6-二基二氨基甲酸酯(15.6mg，0.026mmol)。一边将烧瓶用冰浴冷却，一边依次 加入二氯甲烷(0.5mL)和三氟乙酸(0.5mL)，用冰浴搅拌3小时。将溶剂减压蒸馏除去，则作为三氟乙酸盐获得了26.5mg的目的化合物：(6-溴-7-羟基-8-((甲基(丙-2-炔-1-基) 氨基)甲基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-4-基)甲基(6-氨基己基)氨基甲酸酯(通式(23) 4 5 6 8 9 31 32 中，(R ：OCONH，R ：Br，R ：OH，R ：H，R ：H，R ：CH2CH2CH2CH2CH2CH2，R ：CH2NCH3CH2，X：NH2)的材料)。 [0247] 1H NMRδ(DMSO-d6)8.01(1H,s),7.74(2H,brs),7.58(1H,t,d6Hz),6.24(1H,s),5.29(2H,s),4.47(2H,s),4.14(2H,s),3.84(1H,s),3.05(2H,m),2.80(2H,m),2.71(3H, s),1.60-1.25(8H,m) [0248] (3)11-叠氮基-十一烷基三甲氧基硅烷在玻璃基板上的成膜 [0249] 将玻璃制培养容器与实施例8(6)同样地洗涤。接着，滴加11-叠氮基-十一烷基三甲氧基硅烷(altech株式会社，SI005-m11)的1mM乙醇溶液，在室温反应24小时。水洗 后，在95℃进行15分钟干燥，从而将上述叠氮化物醇氧基硅烷的自组装单层膜形成于玻璃 基板。 [0250] (4)与(6-溴-7-羟基-8-((甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-4-基)甲基(6-氨基己基)氨基甲酸酯的点击反应 [0251] 在1mM的(6-溴-7-羟基-8-((甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-4-基)甲基(6-氨基己基)氨基甲酸酯和1.35mM的二甲基氨基吡啶的 DMF溶液中以1.25vol%混合1mM的N,N,N’,N’’,N’’-五甲基二亚乙基三胺和1mM的CuBr 的DMF溶液，制成反应液。将该反应溶液添加在形成有上述叠氮化物醇氧基硅烷的自组装 单层膜的玻璃表面，在暗处室温反应24小时，从而在玻璃制培养容器上成膜在通式(26) 3 4 5 6 8 9 31 32 33 中，(R ：CH3，R ：OCONH，R ：Br，R ：OH，R ：H，R ：H，R ：CH2CH2CH2CH2CH2CH2，R ：CH2NCH3CH2，R ： CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2，X：NH2)的材料的自组装单层膜。 [0252] 本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请直接以参考的方式并入本说明书中。 [0253] 符号的说明 [0254] 1 透明基材 [0255] 2 细胞粘附性光控制材料 [0256] 3，4，9 细胞 [0257] 5 第2光照射 [0258] 6 细胞间和细胞粘附性光控制材料的切断区域 [0259] 7 第1光照射 [0260] 8 通过光反应而从细胞粘附性向非粘附性变化的区域(细胞非粘附区域) [0261] 10，11 通过光反应而从细胞粘附性向非粘附性变化的区域 [0262] 69 细胞粘附区域。 |
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