应用糖皮质激素在哺乳动物细胞培养物中生产糖蛋白的方法 |
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| 申请号 | CN201080044802.2 | 申请日 | 2010-10-06 | 公开(公告)号 | CN102753572A | 公开(公告)日 | 2012-10-24 |
| 申请人 | 百时美施贵宝公司; | 发明人 | Y.京; 李正剑; 钱月明; | ||||
| 摘要 | 本 发明 描述通过动物细胞或 哺乳动物 细胞培养，优选但不限于分批补料式细胞培养用于产生 蛋白质 的方法和过程。在一个方面，该方法包含在培养期过程中添加糖皮质 激素 化合物。添加糖皮质激素化合物维持所培养细胞的高活 力 ，且如例如通过所产生蛋白质的唾液酸含量测定的，可以获得终点滴度增加的蛋白质产物和高品质的蛋白质产物。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种用于产生糖蛋白的细胞培养方法，其包含：a）在允许蛋白质产生的条件下，培养在细胞培养物中产生糖蛋白的宿主细胞；和b）添加无毒水平的糖皮质激素。 |
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| 说明书全文 | 应用糖皮质激素在哺乳动物细胞培养物中生产糖蛋白的方法 发明领域 [0001] 本发明涉及用于培养哺乳动物细胞的新过程，所述哺乳动物细胞产生蛋白质产物、优选糖基化蛋白质产物。细胞培养过程的执行导致高细胞活力，并且也可以导致高产物品质和生产率、延长生长期和在死亡期中降低死亡率。 [0002] 发明背景优选使用动物细胞培养，尤其是哺乳动物细胞培养用于表达用于治疗性和/或预防性应用的重组产生的糖基化蛋白质。重组糖蛋白的糖基化模式具有重要意义，因为糖蛋白的寡糖侧链影响蛋白质功能，以及在蛋白质的不同区域之间的分子内相互作用。此类分子内相互作用涉及糖蛋白的蛋白质构象和三级结构。（参见例如，A. Wittwer等人，1990，Biochemistry，29:4175-4180；Hart，1992，Curr. Op. Cell Biol.，4:1017-1023；Goochee等 人，1991，Bio/Technol.，9:1347-1355；和 R.B. Parekh，1991，Curr. Op. Struct. Biol.，1:750-754）。此外，寡糖可以作用于使特定多肽靶向基于特异性细胞碳水化合物受体的某些结构。（M.P. Bevilacqua等人，1993，J. Clin. Invest.，91:379-387；R.M. Nelson等人，1993，J. Clin. Invest.，91:1157-1166；K.E. Norgard等人，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，90:1068-1072和Y. Imai等人，1993，Nature，361-555-557）。 [0003] 已知糖蛋白寡糖侧链的末端唾液酸组分对糖蛋白的多个方面和特性有作用，包括吸收、溶解度、热稳定性、血清半衰期、从血清中的清除、以及其物理和化学结构/行为及其免疫原性。（A. Varki，1993，Glycobiology，3:97-100；R.B. Parekh，同前，Goochee等人，同前，J. Paulson等人，1989，TIBS，14:272-276；和A. Kobata，1992，Eur. J. Biochem.，209:483-501；E.Q. Lawson等人，1983，Arch. Biochem. Biophys.，220:572-575；和E. Tsuda等人，1990，Eur. J. Biochem.，188:405-411）。 [0004] 唾液酸在糖蛋白中的量受两个相反过程影响：唾液酸通过唾液酸转移酶活性的细胞内添加和唾液酸通过唾液酸酶切割的细胞外去除。 [0005] 唾液酸的细胞内添加是在反面高尔基中发生的糖基化过程的最后阶段。这涉及将唾液酸从核苷酸糖前体（CMP-唾液酸）酶促转移到附着至新合成蛋白的新出现聚糖结构上的可用半乳糖。对该过程的可能引起不完全唾液酸化的可能限制包括CMP-唾液酸的可用性、唾液酸转移酶的活性、半乳糖在新出现聚糖结构上的量和半乳糖基转移酶的活性。大量研究已集中于经由唾液酸转移酶和糖基转移酶的基因过表达和酶活性增强来使唾液酸化达到最大。Zhang等人（Biochim Biophys Acta 1425（3）:1998，441-52）报道，人α2,6-唾液酸转移酶在具有组织纤溶酶原激活物（tPA）产生的CHO细胞中的表达增强tPA的α2,6-唾液酸化。Weikert等人（Nat Biotechnol 17（11）:1999，1116-21）报道，α2,3-唾液酸转移酶和β1,4-半乳糖基转移酶的共表达导致TNK-tPA和TNFR-IgG的唾2+ 液酸化大于90％。此外，补充适当量的锰（Mn ）（关于β1,4-半乳糖基转移酶的辅因子）极大减少较低唾液酸化级分中rHuEPO的量，增加碳水化合物位点占有，并且使这些较低唾液酸化种类中的碳水化合物分支（Zhang等人，1998）缩小至二触角（bi-antennary）结构（Crowell等人，Biotechnol Bioeng 96（3）:538-49，2007）。 [0006] 唾液酸在糖蛋白中的量也受通过唾液酸酶切割的唾液酸细胞外去除影响。Gramer和Goochee（Biotechnol Prog 9（4）:366-73,1993）已证实，在CHO灌注培养中，乳酸脱氢酶（LDH）的增加（其表示细胞裂解的增加）与细胞外唾液酸酶的活性的增加有关。Gu等人（Biotechnol Bioeng 55（2）:390-8，1997）也举例说明，在整个长期分批培养中，干扰素-γ（IFN-γ）的末端唾液酸的显著损失连同CHO细胞活力中的降低和死细胞的伴随增加。 [0007] 因此，必需延迟细胞死亡的开始且改善细胞活力，以降低或避免这种降解效应。 [0008] 一般而言，在基于哺乳动物细胞培养的系统中的蛋白质表达水平显著低于微生物表达系统（例如细菌或酵母表达系统）。然而，细菌和酵母细胞的以下能力有限：最佳表达高分子量蛋白质产物、正确折叠具有复杂立体结构的蛋白质、和/或提供所需翻译后修饰以使所表达糖蛋白成熟，由此影响产物的免疫原性和清除率。 [0009] 由于培养动物或哺乳动物细胞，特别是产生重组产物的动物或哺乳动物细胞的限制，已研究了多种参数的操纵，包括采用大规模培养容器；改变基本培养条件，例如温育温度、溶解氧浓度、pH等；使用不同类型的培养基和对于培养基的添加剂；和增加所培养细胞的密度。此外，用于哺乳动物细胞培养的过程开发会受益于延长运行时间的能力的进步，以增加终产物浓度，同时维持高产物品质。重要产物品质参数是多肽产物中糖基化结构的程度和完全性，其中唾液酸含量通常用作糖蛋白品质的量度。 [0010] 细胞培养过程，特别是非连续性过程的运行时间通常受限于细胞的剩余活力，这通常随着运行过程而下降。因此期望高细胞活力的最大可能延长。产物品质问题也为活细胞密度的减少降到最低和维持高细胞活力提供了动力，因为细胞死亡可以将唾液酸酶释放至培养物上清液中，这可以降低所表达蛋白中的唾液酸含量。蛋白质纯化问题为活细胞密度的减少降到最低和维持高细胞活力提供了另一个动力。培养物中细胞碎片和死细胞内含物的存在可以对在培养运行结束时分离和/或纯化蛋白质产物的能力造成负面影响。通过使细胞在培养中维持活力较长时间段，由此存在通过细胞蛋白和酶（例如细胞蛋白酶和唾液酸酶）的培养基污染的伴随减少，所述污染可以引起通过细胞产生的期望糖蛋白的品质的降解和最终减少。 [0011] 已研究多种参数以在细胞培养中达到高细胞活力。一种参数涉及在37℃开始培养后单独降低培养温度（例如，Roessler等人，1996，Enzyme and Microbial Technology，18:423-427；1998年颁给T. Etcheverry等人的美国专利号5,705,364和5,721,121；1999年颁给K. Furukawa等人的美国专利号5,976,833；颁给L. Adamson等人的美国专利号 5,851,800；颁给Genentech公司的WO 99/61650和WO 00/65070；颁给Biogen公司的WO 00/36092；和颁给Girard等人的美国专利号4,357,422）。 [0012] 所研究的其他参数涉及向培养物中添加组分。已显示生长因子抑制剂舒拉明在CHO K1:CycE细胞的指数生长过程中防止细胞凋亡（Zhangi等人，Biotechnol. Prog.2000，16，319-325）。然而，舒拉明不在死亡期过程中防止细胞凋亡。因此，舒拉明能够在生长期过程中维持高活力，但不允许延长培养寿命。相同作者报道，对于CHO 111-10PF细胞系，类似于舒拉明，相对于对照培养，硫酸葡聚糖和聚乙烯硫酸盐可以增加第3天的活细胞密度和活力。然而，未报道硫酸葡聚糖或聚乙烯硫酸盐在死亡期过程中的效应。还报道舒拉明、硫酸葡聚糖和聚乙烯硫酸盐在防止细胞聚集方面是有效的。 [0013] 用地塞米松或N-乙酰甘露糖胺补充昆虫细胞培养基对经由杆状病毒表达载体系统（BEVS）制备的蛋白质的复杂糖基化（包括末端唾液酸残基对N联寡糖的添加）的效应公开于2002年颁给Boyce Thompson Institute For Plant Research公司（Ithaca，NY）的美国专利号6,472,175中。 [0014] 由于其大小、结构复杂性和生物生产的性质，蛋白质治疗药物是固有异质的（Chirino和Mire-Sluis，Nat Biotechnol. 2004；22:1383-1391）。甚至在“纯”蛋白质溶液中，也存在一定百分比的低分子量片段、高分子量种类和不同程度的化学修饰。高分子量种类的形成通常是由于蛋白质聚集，其是在制造生物制品过程中遇到的常见问题。通常，认为聚集体的存在是不期望的，因为担心聚集体可以导致免疫原性反应或可以在施用后引起不良事件（Cromwell等人，AAPS J. 2006；8:E572-579）。尽管某些类型的生物制品聚集体可以正常发挥功能，但维持产物品质的一致性仍然重要，因为产品一致性是行政审批的先决条件。 [0015] 蛋白质聚集体可以起于若干种机制，且可以在制造过程期间的每一阶段发生。在细胞培养中，分泌蛋白可以暴露于不利于蛋白质稳定性的条件；但更经常地，由于未折叠蛋白质分子的相互作用或通过负责正确折叠的分子伴侣对新生肽链的无效识别，大量蛋白质的积累可以导致细胞内聚集（Cromwell等人，AAPS J. 2006；8:E572-579）。在细胞的内质网（ER）中，新合成蛋白的二硫键在氧化环境中形成。在正常条件下，蛋白质巯基可逆地氧化为蛋白质二硫化物和次磺酸，但更高氧化态例如蛋白质半胱氨酸的亚磺酸和磺酸形式是不可逆的（Thomas和Mallis，Exp Gerontol. 2001；36:1519-1526）。过氧化蛋白质可以含有不正确的二硫键或具有与其他内腔ER蛋白的混合二硫键；在任一情况下，导致蛋白质不正确的折叠和聚集。因此在ER中维持适当受控的氧化环境是至关重要的。在这点上，Cuozzo和Kaiser（Nat Cell Biol. 1999；1:130-135）首先证实，在酵母中谷胱甘肽可以针对ER过氧化进行缓冲，且后来由Chakravarthi和Bulleid（J Biol Chem. 2004；279:39872-39879）确认，在哺乳动物细胞中，也需要谷胱甘肽来调节进入分泌途径的蛋白质内天然二硫键的形成。 [0016] 随着培养物中产物浓度的增加，如通过测量寡糖糖结构的唾液酸含量测定的，在细胞培养过程中可以观察到产物品质降低。通常，如通过药物清除研究测定的，存在关于可接受的唾液酸含量的下限。在培养中通过细胞产生的蛋白质的高丰度最佳地伴随蛋白质的高品质，所述蛋白质最终回收用于预期用途。 [0017] 正确糖基化的重组产生的蛋白质产物对于用作治疗性药物、治疗和预防性药物在医学和临床上变得越来越重要。因此，可靠细胞培养过程的开发满足本领域中的期望和所需的目标，所述细胞培养过程经济有效地达到与高水平的产物品质（例如通过唾液酸含量测定的）结合的最终蛋白质产物浓度增加。 [0018] 发明概述本发明提供通过动物或哺乳动物细胞培养用于产生蛋白质的新过程，所述蛋白质优选重组蛋白质产物、更优选糖蛋白产物。这些新过程达到在后期增加的活细胞密度、细胞活力、生产率和唾液酸含量以及降低的蛋白质聚集。 [0019] 本发明的一个方面涉及向培养基中添加糖皮质激素。在这个方面，本发明的细胞培养过程可以有利地达到增强的比生产率（例如糖蛋白），以及通过培养细胞产生的糖蛋白的唾液酸含量增强。更具体而言，根据本发明，在细胞培养期过程中添加糖皮质激素维持培养物中细胞的高细胞活力，且可以在整个培养运行中提供高数量和品质的所产生产物。同样，根据本发明的一个方面，对培养过程添加糖皮质激素可以有利地允许延长培养的生产期。在延长的生产期过程中，期望产物的滴度增加；如通过唾液酸含量表征的产物品质维持在高水平；蛋白质聚集水平维持在较低水平且细胞活力也维持在高水平。此外，与本发明的培养过程有关的延长的生产期允许产物生产超过在标准生产期过程中产生的那种。 [0020] 在一个具体方面，本发明提供这样的过程（或方法），其中通过添加糖皮质激素来增强比生产率，降低蛋白质聚集水平且所产生糖蛋白的唾液酸含量更高。糖皮质激素化合物优选是地塞米松。根据这个具体方面，添加糖皮质激素维持培养物的高细胞活力，由此使得延长的生产期成为可能，在此过程中产物优选重组产物的滴度增加，并且如通过唾液酸含量表征的产物品质维持在高水平。在细胞培养过程期间，添加糖皮质激素可以使在产物产生中的蛋白质滴度和唾液酸含量之间流行的折衷降到最低。因此，添加糖皮质激素对增强培养过程的重要性能参数提供正面作用，即“终点（即最终）滴度”ד终点（即最终）唾液酸”ד单体含量”的数学乘积（“终点滴度×终点唾液酸”ד终点单体含量”）。 [0021] 在本发明的一个方面，在接种时或在接种后初始死亡期开始前、或在初始生长期过程中、或在初始生长期的后半部分过程中、或在初始生长期结束时或大约结束时，将糖皮质激素化合物添加至培养物中。根据本发明的这个方面，生长期延长一段时间和/或死亡期的开始延迟一段时间，例如若干天。 [0022] 在本发明的另一个优选方面且如本文进一步描述的，涉及添加糖皮质激素化合物的新近开发的细胞培养过程，尤其适合于通过经遗传改造为表达且产生这些蛋白质的宿主细胞来产生可溶性CTLA4分子和可溶性CTLA4突变分子，例如CTLA4Ig和L104EA29YIg。本发明的优选实施方案涵盖培养产生CTLA4Ig和L104EA29YIg的细胞，其涉及在培养运行过程中添加糖皮质激素化合物，以达到大量高品质CTLA4Ig和L104EA29YIg产物，如通过最终产物的唾液酸测量和/或低蛋白质聚集测定的。 [0024] 附图/图表描述图1显示如实施例1中所述，β1,4-半乳糖基转移酶（1A）和α2,3-唾液酸转移酶 （1B）的表达一般随着经DEX处理的CHO细胞中的地塞米松（DEX）浓度增加。DEX在接种后第2天时以0.1 µM至10 µM的浓度加入培养物中。在接种后第5天时，收集细胞样品并制备全细胞裂解物，在4-15％梯度凝胶上分离并用针对各糖基转移酶的抗体进行探测。然后用β-肌动蛋白抗体再次探测印迹，以评价相等负荷。 [0025] 图2显示如实施例1中所述，DEX导致培养物上清液中的唾液酸酶活性降低的细胞保护效应。在经DEX处理和未经处理的培养物之间沿着培养期的细胞活力（2A）和上清液唾液酸酶活性测定的吸光度（2B）概况分析。以1 µM浓度的DEX处理在第2天时开始。值反映来自5次实验的数据的平均值和标准差。 [0026] 图3显示如实施例1中所述，用糖皮质激素类似物（氢化可的松（HYC）和泼尼松龙（PRD））处理的培养物中糖蛋白唾液酸化的改良。分别用DEX、HYC和PRD处理的培养物的标准化总唾液酸含量（3A）和标准化N联唾液酸化种类比例（fraction）（3B）。处理在接种后第二天时对于各化合物以0.1、1和10 µM的浓度在培养基中开始。各参数的值作为平均值±差值/2（n=2）报告。 [0027] 图4显示如实施例1中所述，通过DEX的唾液酸化增强被糖皮质激素拮抗剂RU-486阻断。在RU-486的存在和不存在下，标准化总唾液酸含量（4A）和标准化N联唾液酸化种类比例（4B）。在接种后48小时，将RU-486以0或1 µM引入细胞培养悬浮液中。24小时后，随后将0.1、1和10 µM DEX加入培养物中。各参数的值作为平均值± 差值/2（n=2）报告。 [0028] 图5显示如实施例1中所述，在5 L生物反应器中经DEX处理的CHO细胞的分批补料式培养导致增加的唾液酸含量和唾液酸化种类比例。在培养自始至终未经处理和经处理的培养物的标准化总唾液酸含量（5A）和标准化N联唾液酸化种类比例（5B）。各参数的值作为平均值±标准差（n=3）报告。标准化值是实际值除以任意值。 [0029] 图6显示如实施例1中所述，DEX在7、10和20 L规模的生物反应器中改良糖蛋白唾液酸化的能力。概括了来自不同运行的经DEX处理和未经处理的培养物的与标准化唾液酸化比例比较的标准化最终总唾液酸摩尔比。标准化值是实际值除以任意值。 [0030] 图7显示如实施例2中所述，在经地塞米松（DEX）处理的CHO细胞产生的IgG-融合蛋白中高分子量（HMW）种类的减少百分比。7A，首先使所有细胞在相同摇瓶中一起培养两天，且随后分为两组，其中一半在基础培养基中接受1 µM终浓度的单一剂量DEX。在第10天时收集上清液，并且在测定HMW种类百分比的SEC-HPLC分析前进行纯化。数据点是来自单一实验中的5个摇瓶的结果的平均值（±S.D.）。**与对照（CON）相比，P<0.01。7B，在第2天时将DEX以不同浓度加入CHO细胞培养物中，并且在第10天时收集上清液。数据点是得自一式两份烧瓶的结果的平均值。7C，所有培养在相同时间开始，但在不同天数时添加1 μM DEX，在第10天时的相同时间收获细胞时给出如所示的不同温育时间。数据点是来自一式两份烧瓶的结果的平均值。 [0031] 图8显示如实施例2中所述，在用地塞米松（DEX）处理的CHO细胞中谷胱甘肽还原酶的表达增加。在接种当天时，将DEX以不同浓度加入细胞培养物中，且在第5天时收集细胞样品。在4-15％梯度凝胶上分离全细胞裂解物。在检测谷胱甘肽还原酶后，使用相同印迹来检测β-肌动蛋白用于样品负荷比较。 [0032] 图9显示如实施例2中所述，在体外与GSH一起温育的IgG-融合蛋白中HMW种类的减少百分比。将0、1 mM和3 mM终浓度的减少谷胱甘肽（GSH）加入经纯化IgG-融合蛋白的Tris-乙酸盐缓冲（pH 7.5）溶液中，且在SEC-HPLC分析前，将GSH和蛋白质的混合物在37℃温育1小时。数据点是来自2个实验的4次测定的平均值（± S.D.）。*与对照（0 mM GSH）相比，P<0.05。 [0033] 图10显示如实施例2中所述，在糖皮质激素受体拮抗剂RU-486存在下，地塞米松（DEX）的效应减弱。10A，由未经处理的HepG-2和CHO细胞制备全细胞裂解物且在4-15％梯度凝胶上分离。使用HepG-2样品作为用于初次抗体验证目的的人起源对照。10B，在接种后一天（第1天），将RU-486以1 μM引入培养物中，且在第2天时分开经RU-486预处理的CHO细胞，其中一半在基础培养基中接受0.1 µM终浓度的单一剂量DEX。在第10天时收集细胞样品；所有其他程序都与图2中的那些相同。10C，在第1天时将RU-486以1 μM引入培养物中，并且随后在第2天时将DEX以0.1 μM或1 μM的终浓度加入经RU-486预处理的培养物中。在第10天时收集上清液。数据点是来自一式两份烧瓶的结果的平均值。 [0034] 图11显示如实施例3中所述，在无血清培养基中CHO细胞的培养物中细胞死亡被DEX抑制。对于在第2天开始的处理，DEX对活细胞密度（11A）和活力（11B）的作用的剂量反应曲线。对于1 µM处理浓度，DEX对活细胞密度（11C）和活力（11D）的作用的时间过程曲线。各值是得自一式两份完成的实验的数据的平均值。 [0035] 图12显示如实施例3中所述，通过DEX，CHO细胞比生长速率减少，同时细胞比生产率增加。DEX对CHO细胞比生长速率（12A）、标准化体积生产率（12B）和标准化细胞比生产率（12B）的作用。DEX处理在第2天时开始。值反映来自5个实验的数据的平均值和标准差。标准化值是实际值除以任意值。 [0036] 图13显示如实施例3中所述，通过qRT-PCR和蛋白质印迹分析证实抗细胞凋亡基因GILZ在经DEX处理CHO细胞中的上调。（13A）在接种后第2天时，将DEX分别以0和1 µM的终浓度加入一式三份培养物中。在接种后第5天和第8天时提取mRNA样品。各参数的值作为平均值±标准差（n=3）报告。（13B）在接种后第2天时，将DEX分别以0和1 µM的终浓度加入一式三份培养物中。收集细胞样品且在接种后第5天和第8天时制备全细胞裂解物。 [0037] 图14显示如实施例3中所述，地塞米松的死亡抑制作用涉及GILZ和糖皮质激素受体。在RU-486的存在和不存在下，由DEX诱导的最终活力的百分比增加（与不含DEX处理相比）（14A）、GILZ基因表达（14B）和GILZ蛋白表达（14C）的倍数变化。在接种后48小时，将RU-486以0或1 µM引入细胞培养悬浮液中，24小时后，随后将0、0.1 µM和1 µM的DEX加入培养物中。收集细胞用于活力、qRT-PCR和蛋白质印迹分析。小图A 中报告的各值是得自一式两份实验的数据的平均值。小图B中报告的各值是得自一式三份实验的数据的平均值和标准差。 [0038] 图15显示如实施例3中所述，在10 L生物反应器中经DEX处理的CHO细胞的分批补料式培养导致改良的VCD、活力、滴度和唾液酸摩尔比。未经处理培养物和经处理培养物的活细胞密度（15A）、活力（15B）和标准化滴度（15C）概况，其中DEX处理在第2天和第7天时开始。标准化值是实际值除以任意值。 [0039] 图16展示DEX对具有CTLA4Ig分泌的CHO细胞培养物中的细胞生长的作用。DEX对用DEX分别以0、0.001、0.01、0.1、1和10 µM的终浓度处理的活细胞密度（16A）和活力（16B）的作用的剂量反应曲线。处理在接种后第二天时开始，且各值是得自一式两份完成的实验的数据的平均值。 [0040] 图17显示DEX对CTLA4Ig的唾液酸摩尔比和HMW水平的作用。该图显示用DEX分别以0、0.001、0.01、0.1、1和10 µM的终浓度处理的培养物的最终总唾液酸摩尔比（17A）和HMW种类（17B）。处理在接种后第二天时开始，且各值是得自一式两份完成的实验的数据的平均值。小图A 中报告的值是标准化值，其是实际值除以任意值。 [0041] 图18显示如实施例5中所述，在大规模重组糖蛋白生产中包括DEX的可行性。该图显示分别以7 L（n=16）和500 L（n=6）和5000 L（n=3）规模产生的重组糖蛋白的活细胞密度（18A）、活力（18B）、标准化滴度（18C）和标准化唾液酸含量（18D）。值反映在各规模来自多个实验的数据的平均值和标准差。标准化值是实际值除以任意值。在所有规模中使用相同除数用于标准化。 [0042] 图19描绘CTLA4Ig的核苷酸序列（SEQ ID NO:1）和所编码的氨基酸序列（SEQ ID NO:2），其具有信号肽、CTLA4细胞外结构域的野生型氨基酸序列（始于+1位置的甲硫氨酸到+124位置的天冬氨酸，或始于-1位置的丙氨酸到+124位置的天冬氨酸）、和Ig区域。 [0043] 图20描绘CTLA4突变分子（L104EA29YIg）的核苷酸序列（SEQ ID NO:3）和所编码的氨基酸序列（SEQ ID NO:4），其具有信号肽、CTLA4的突变细胞外结构域（始于+1位置的甲硫氨酸且止于+124位置的天冬氨酸，或始于-1位置的丙氨酸且止于+124位置的天冬氨酸）、和Ig区域。 [0044] 图21描绘与制瘤素M信号肽（在-26位置至在-2位置）融合的人CTLA4受体（在本文中称为“野生型” CTLA4）的核酸序列（SEQ ID NO:5）和所编码的完整氨基酸序列（SEQ ID NO:6）。（美国专利号5,434,131和5,844,095）。 [0045] 发明详述本发明描述用于在哺乳动物或动物细胞培养中产生蛋白质的新过程，所述蛋白质优选重组蛋白质产物、更优选糖蛋白产物。此类方法达到增加的活细胞密度、细胞活力、生产率和唾液酸含量以及降低的蛋白质聚集。 [0046] 在一个实施方案中，本发明涉及细胞培养过程，其包含：培养表达目的蛋白的宿主细胞；和将糖皮质激素化合物加入细胞培养物中。 [0047] 糖皮质激素化合物包括但不限于氢化可的松（可从Sigma-Aldrich，St. Louis，MO获得）、泼尼松（可从Sigma-Aldrich获得）、泼尼松龙（可从Sigma-Aldrich获得）、甲泼尼龙（可从Sigma-Aldrich获得）、地塞米松（可从Sigma-Aldrich获得）、倍他米松（可从Sigma-Aldrich获得）、曲安西龙（可从Sigma-Aldrich获得）、乙酸氟氢可的松（可从Sigma-Aldrich获得）。所述化合物从所列出的来源可容易获得，或通过本领域技术人员已知的方式可容易获得。 [0048] 优选糖皮质激素化合物包括但不限于氢化可的松、泼尼松龙、倍他米松和地塞米松。最优选的是地塞米松。 [0049] 在本发明的一个实施方案中，糖皮质激素化合物在接种时添加或可以为基础培养基的组分。接种在第0天时发生。 [0050] 在本发明的一个实施方案中，糖皮质激素化合物在接种后某一时间点添加，即其在基础培养基中不存在且在接种时不存在。优选地，糖皮质激素化合物在培养第1天时或以后添加。 [0051] 根据本发明，糖皮质激素化合物可以在指定时间段过程中一次、两次、三次或任何次数加入细胞培养物中。可以联合使用一或多种糖皮质激素化合物。即，糖皮质激素化合物的任何给定单次添加可以包括一或多种其他糖皮质激素化合物的添加。类似地，如果存在糖皮质激素化合物的超过一次添加，则可以在不同添加时添加不同糖皮质激素化合物。可以在糖皮质激素化合物添加前、同时或后，在指定时间段过程中或不在指定时间段过程中，将额外化合物和物质（包括糖皮质激素化合物）加入培养物中。在优选实施方案中，存在糖皮质激素化合物的单次即一次添加。在优选实施方案中，添加一种糖皮质激素化合物。 [0052] 根据本发明，可以通过任何方式将糖皮质激素化合物加入细胞培养物中。添加糖皮质激素化合物的方式包括但不限于以其所获得的形式溶于DMSO中、溶于有机溶剂中、溶于水中、溶于培养基中、溶于补料培养基中、溶于合适培养基中、或其任何组合。 [0053] 优选地，DEX作为其中DEX溶于乙醇中的溶液添加，所述溶液随后用水稀释用于进一步使用（即例如将DEX加入补料培养基中）。 [0054] 根据本发明，添加糖皮质激素化合物以使培养物中的浓度达到合适水平。作为非限制性例子，添加糖皮质激素化合物至1 nM-1 mM的浓度。优选地，添加糖皮质激素化合物至1 nM-0.1 μM或0.1 μM-10 μM；更优选约5 nM-15 nM或0.5 μM-5 μM的浓度；更优选约10 nM或1 μM靶量。 [0055] 根据本发明，培养可以在添加糖皮质激素化合物后运行任何时间长度。培养运行时间可以由本领域技术人员基于下述相关因素进行测定：例如可回收蛋白的数量和品质、和上清液中起因于细胞裂解的污染性细胞种类（例如蛋白质和DNA）的水平，所述种类使目的蛋白的回收复杂。 [0056] 在本发明增加细胞活力的细胞培养过程和方法的特定实施方案中，糖皮质激素化合物在接种后初始死亡期开始前某一时间点添加。优选地，糖皮质激素化合物在接种后初始生长期过程中某一时间点添加。更优选地，糖皮质激素化合物在初始生长期的后半部分过程中添加。更优选地，糖皮质激素化合物在初始生长期结束时或大约结束时添加。 [0057] 初始生长期指在不存在指定添加糖皮质激素化合物的情况下观察到的生长期。初始死亡期指在不存在指定添加糖皮质激素化合物的情况下观察到的死亡期。 [0058] 初始生长期可以在初始死亡期开始时结束，或在初始生长期与初始死亡期之间可以存在任何时间长度的静止期。 [0059] 例如，在其中初始生长期是第0天至第6天且初始死亡期始于第7天时的细胞培养中，在特定实施方案中，糖皮质激素化合物在接种后且在第7天前某一时间点添加。在具体实施方案中，糖皮质激素化合物在接种后且不迟于第6天添加。在具体实施方案中，糖皮质激素化合物在第1天和第6天之间添加。在另一具体实施方案中，糖皮质激素化合物在第3-6天时与补料培养基一起添加。在其他具体实施方案中，糖皮质激素化合物在大约第2天时或在第2天时添加。 [0060] 已发现（参见实施例3）在实施本发明时，细胞培养物的活力延长。如果在培养中的细胞活力对于在条件的存在下高于在不存在条件的情况下一段时间，那么例如添加糖皮质激素化合物的条件引起延长的细胞活力。 [0061] 因此，在其他实施方案中，本发明涉及（1）细胞培养过程，和（2）延长培养物中的细胞活力的方法，其包含：培养表达目的蛋白的宿主细胞；和将糖皮质激素化合物加入细胞培养物中；其中细胞培养物的细胞活力是延长的。 [0062] 已发现（参见实施例3）当糖皮质激素化合物在接种后且在初始死亡期开始前某一时间点添加时，死亡期的死亡率可以是减少的，低于在不存在添加糖皮质激素化合物的情况下观察到的死亡期的那种。 [0063] 因此，在其他实施方案中，本发明涉及（1）细胞培养过程，和（2）用于减少细胞培养的死亡期的死亡率的过程，其包含：培养表达目的蛋白的宿主细胞；和在接种后初始死亡期开始前某一时间点，将糖皮质激素化合物加入细胞培养物中；其中死亡期的死亡率是减少的。在更特定的实施方案中，本发明涉及（1）细胞培养过程，和（2）用于减少细胞培养的死亡期的死亡率的过程，其包含：培养表达目的蛋白的宿主细胞；和在接种后在初始生长期过程中某一时间点，将糖皮质激素化合物加入细胞培养物中；其中死亡期的死亡率是延迟的。在更特定的实施方案中，本发明涉及（1）细胞培养过程，和（2）用于减少细胞培养的死亡期的死亡率的过程，其包含：培养表达目的蛋白的宿主细胞；和在初始生长期的后半部分过程中，将糖皮质激素化合物加入细胞培养物中；其中死亡期的死亡率是减少的。在其他特定实施方案中，本发明涉及用于减少细胞培养的死亡期的死亡率的过程，其包含：培养表达目的蛋白的宿主细胞；和在初始生长期结束时或大约结束时，将糖皮质激素化合物加入细胞培养物中；其中死亡期的死亡率是延迟的。 [0064] 实施例3也证实，当与未经处理的细胞培养物相比时，氢化可的松（HYC）、泼尼松龙（PRD）和地塞米松（DEX）在经处理的细胞培养物中都显示剂量依赖性细胞保护效应。然而，需要较高浓度的HYC和PRD，以达到相同水平的细胞保护效应，这与其效力差异一致（即HYC和PRD仅与DEX 5％和20％一样有效）。 [0065] 细胞培养过程，尤其是非连续性过程的运行时间通常受剩余活细胞密度限制，所述活细胞密度在死亡期过程中降低。较长运行时间可以允许达到较高产物滴度。产物品质问题也为减少死亡率提供了动力，因为细胞死亡可以将唾液酸酶释放至培养物上清液中，这可以降低所表达蛋白质中的唾液酸含量。蛋白质纯化问题为延迟或阻止死亡期提供了另一个动力。培养物中细胞碎片和死细胞内含物的存在可以对在培养运行结束时分离和/或纯化蛋白质产物的能力造成负面影响。 [0066] 已发现（参见实施例2），将糖皮质激素化合物加入细胞培养物中减少目的蛋白质的聚集。 [0067] 因此，在其他实施方案中，本发明涉及（1）细胞培养过程，和（2）用于减少蛋白质聚集百分比的过程，其包含：培养表达目的蛋白的宿主细胞；和将糖皮质激素化合物加入细胞培养物中；其中高分子量种类的百分比是降低的。 [0068] 已发现（参见实施例1），将糖皮质激素化合物加入细胞培养物中通过增强总唾液酸含量和增加唾液酸化种类的百分比来改良目的蛋白的唾液酸化。 [0069] 实施例1也证实，当与未经处理的细胞培养物相比时，氢化可的松（HYC）、泼尼松龙（PRD）和地塞米松（DEX）在经处理的细胞培养物中都显示剂量依赖性唾液酸化改良。然而，需要较高浓度的HYC和PRD，以达到相同程度的改良，这与其效力差异一致。 [0070] 因此，在其他实施方案中，本发明涉及（1）细胞培养过程，和（2）用于增加唾液酸化种类的百分比的过程，其包含：培养表达目的蛋白的宿主细胞；和将糖皮质激素化合物加入细胞培养物中；其中唾液酸化种类的百分比是增加的。 [0071] 因此，在其他实施方案中，本发明涉及（1）细胞培养过程，和（2）用于增加总唾液酸含量的过程，其包含：培养表达目的糖蛋白的宿主细胞；和将糖皮质激素化合物加入细胞培养物中；其中总唾液酸含量是增加的。 [0072] 因此，在其他实施方案中，本发明涉及（1）细胞培养过程，和（2）用于减少细胞培养物中糖蛋白的去唾液酸化比率的过程，其包含：培养表达目的糖蛋白的宿主细胞；和将糖皮质激素化合物加入细胞培养物中；其中去唾液酸化比率是减少的。 [0073] 关于糖蛋白纯化和分析的技术与程序在本发明所涵盖的培养方法中，根据需要使用本领域已知并实践的分离和纯化方法，通常在总细胞培养期结束时收集、回收、分离和/或纯化、或基本上纯化由细胞产生的蛋白。优选地，从培养基或上清液中分离由培养细胞分泌的蛋白质；然而，使用本领域已知并实践的方法且如下文进一步描述的，也可以从宿主细胞例如细胞裂解物中回收蛋白质。 [0074] 需要时，通过碳水化合物分析的常规技术可以照常规分析通过本发明的过程产生的包含糖蛋白的复合碳水化合物。例如，本领域众所周知的例如凝集素印迹技术揭示末端甘露糖或其他糖例如半乳糖的比例。通过使用无水肼或酶促方法从蛋白质中释放糖，且通过离子交换层析、尺寸排阻层析或本领域众所周知的其他方法分级寡糖，可以证实单-、二-、三-或四-触角寡糖通过唾液酸的终止。 [0075] 在用神经氨酸酶处理以去除唾液酸前和后，也可以测量糖蛋白的pI。在神经氨酸酶处理后pI的增加指示唾液酸存在于糖蛋白上。碳水化合物结构通常作为N联或O联碳水化合物存于所表达蛋白质上。N联和O联碳水化合物主要在其核心结构方面不同。N联糖基化指碳水化合物部分经由GlcNAc附着至肽链中的天冬酰胺残基。N联碳水化合物都含有共同的Man1-6（Man1-3）Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-R核心结构，其中在这种核心结构中的R代表天冬酰胺残基。所产生蛋白质的肽序列含有天冬酰胺-X-丝氨酸、天冬酰胺-X-苏氨酸、和天冬酰胺-X-半胱氨酸，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。 [0076] 相比之下，O联碳水化合物的特征在于共同的核心结构，其是附着至苏氨酸或丝氨酸的羟基上的GalNAc。在N联和O联碳水化合物中，最重要的是复合N-和O联碳水化合物。此类复合碳水化合物含有若干触角结构。单-、二-、三-、和四-外部结构对于末端唾液酸的添加具有重要意义。此类外部链结构为包含蛋白质产物的碳水化合物的特异性糖和连接提供额外位点。 [0077] 所得到的碳水化合物可以通过本领域已知的任何方法来分析。本领域已知用于糖基化分析的若干种方法且其可以用于本发明的背景中。这些方法提供关于附着至所产生肽的寡糖的身份和组成的信息。与本发明结合有用的用于碳水化合物分析的方法包括但不限于凝集素层析法；HPAEC-PAD，其使用高pH阴离子交换层析，以基于电荷分离寡糖；NMR；质谱法；HPLC；GPC；单糖组成分析；和序贯酶促消化。 [0078] 此外，用于释放寡糖的方法是本领域已知且实践的。这些方法包括1）酶促方法，其通常使用肽-N-糖苷酶F/内-β-半乳糖苷酶执行；2）β消除方法，使用强碱性环境以主要释放O联结构；和3）化学方法，使用无水肼以释放N联和O联寡糖。分析可以使用以下步骤来执行：1.针对去离子水透析样品以去除所有缓冲盐，随后为冻干。2.用无水肼释放完整寡糖链。3.用无水甲醇HCl处理完整寡糖链，以释放作为O-甲基衍生物的个别单糖。4.任何伯氨基的N-乙酰化。5.衍生化以获得全O-三甲基甲硅烷基甲基糖苷。6.通过在CP-SIL8柱上的毛细气液层析（GLC）分离这些衍生物。7. 与已知标准比较，通过来自GLC的保留时间和质谱法鉴定个别糖苷衍生物。8.通过FID使用内部标准（13-O-甲基-D-葡萄糖）定量个别衍生物。 [0079] 中性糖和氨基糖可以通过与脉冲安培检测组合的高效阴离子交换层析（HPAE-PAD碳水化合物系统；Dionex公司）进行测定。例如，可以通过在100℃在20％（v/v）三氟乙酸中水解6小时来释放糖。然后通过冻干或用Speed-Vac（Savant Instruments）来干燥水解产物。然后将残渣溶于1％三水合乙酸钠溶液中，并且在HPLC-AS6柱上进行分析（如Anumula等人，1991，Anal. Biochem.，195:269-280所述）。 [0080] 可替代地，可以执行免疫印迹碳水化合物分析。在这个程序中，使用市售聚糖检测系统（Boehringer）来检测结合蛋白质的碳水化合物，该系统基于由Haselbeck等人（1993，Glycoconjugate J.，7:63）所述的氧化性免疫印迹程序。遵循由制造商推荐的染色方案，除将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜上而不是硝酸纤维素膜上，且封闭缓冲液含有溶于10 mM Tris缓冲液（pH 7.4）中的5％牛血清白蛋白连同0.9％氯化钠。用与碱性磷酸盐缀合物（Boehringer）相连的抗地高辛配基抗体溶于Tris缓冲盐水中的1:1000稀释液来执行检测，使用溶于100 mM Tris缓冲液（pH 9.5）中的磷酸酶底物4-氯化硝基四氮唑蓝（0.03％（w/v））和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐（0.03％（w/v）），所述缓冲液含有100 mM氯化钠和50 mM氯化镁。含有碳水化合物的蛋白质条带通常在约10至15分钟内显影。 [0081] 也可以通过用肽-N-糖苷酶F消化来分析与蛋白质结合的碳水化合物。根据这个程序，使残渣悬浮于14 μL缓冲液中，所述缓冲液含有0.18％SDS、18 mM β-巯基乙醇、90 mM磷酸盐、3.6 mM EDTA，pH 8.6，且在100℃加热3分钟。在冷却至室温后，将样品分为两个等份。不再进一步处理的一份用作对照。将另一份调整至约1％NP-40去污剂，随后添加0.2单位的肽-N-糖苷酶F（Boehringer）。两个样品都在37℃加热2小时，且随后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析。 [0082] 此外，通过常规方法来评价糖蛋白产物的唾液酸含量。例如，可以通过直接比色法来分开测定唾液酸（Yao等人，1989，Anal. Biochem.，179:332-335），优选使用一式三份样品。另一种唾液酸测定方法涉及使用硫代巴比妥酸（TBA），如由Warren等人（1959，J. Biol. Chem.，234:1971-1975）所述的。另外一种方法涉及高效层析，例如由H.K. Ogawa等人（1993，J. Chromatography，612:145-149）所述的。 [0083] 举例说明地，对于糖蛋白回收、分离和/或纯化，使细胞培养基或细胞裂解物离心，以去除细胞微粒和细胞碎片。通过合适纯化技术从污染性可溶蛋白和多肽中分离或纯化出期望多肽产物。以下程序提供示例性但非限制性用于蛋白质的纯化方法：在免疫亲和或离子交换柱上的分离或分级；乙醇沉淀；反相HPLC；在树脂（例如二氧化硅）或阳离子交换树脂（例如DEAE）上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75、Sepharose的凝胶过滤；蛋白A琼脂糖层析用于去除免疫球蛋白污染物；等。可以使用其他添加剂例如蛋白酶抑制剂（例如PMSF或蛋白酶K）来抑制纯化过程中的蛋白降解。熟练从业者应理解，用于给定目的多肽的纯化方法可能需要修改，所述修改允许在细胞培养中重组表达的多肽中的变化。可以选择碳水化合物且富集唾液酸的那些纯化程序是特别优选的，例如离子交换软凝胶层析或使用阳离子或阴离子交换树脂的HPLC，在其中收集一种或多种更酸性的级分。 [0084] 细胞、蛋白质和细胞培养在本发明的细胞培养过程或方法中，可以将细胞维持在如本领域常规已知的多种细胞培养基，即基础培养基中。例如，所述方法适用于与维持在细胞培养基中的大量细胞一起使用，所述培养基可以补充有营养素等。通常，“细胞培养基”（也称为“培养基”）是本领域从业者所理解且已知指营养液的术语，在所述营养液中生长细胞优选动物或哺乳动物细胞，且一般提供来自以下的至少一种或多种组分：能源（通常以碳水化合物例如葡萄糖的形式）；所有必需氨基酸，且一般是二十种基础氨基酸加上半胱氨酸；维生素和/或通常以低浓度需要的其他有机化合物；脂质或游离脂肪酸，例如亚油酸；和微量元素，例如通常以极低浓度（通常在微摩尔范围中）需要的无机化合物或天然存在的元素。细胞培养基也可以经补充而含有多种任选组分，例如激素及其他生长因子，例如胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、血清等；盐，例如钙、镁和磷酸盐，以及缓冲液（例如HEPES）；核苷和碱，例如腺苷、胸苷、次黄嘌呤；以及蛋白质和组织水解产物，例如水解动物蛋白（蛋白胨或蛋白胨混合物，其可以得自动物副产物、纯化明胶或植物材料）；抗生素，例如庆大霉素；和细胞保护剂，例如普流尼克多元醇（普流尼克F68）。优选的是无血清且不含动物起源产物或成分的细胞营养培养基。 [0085] 如从业者所了解的，动物或哺乳动物细胞在这样的培养基中进行培养，所述培养基适合于待培养的特定细胞，并且可以通过本领域技术人员无需过度实验进行确定。可以利用商购可得的培养基，且包括例如最小必需培养基（MEM，Sigma，St. Louis，MO）；Ham's F10培养基（Sigma）；达尔伯克氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagles Medium）（DMEM，Sigma）；RPMI-1640培养基（Sigma）；HyClone细胞培养基（HyClone，Logan，UT）；和化学成分确定的（CD）培养基，其经配制用于特定细胞类型，例如CD-CHO培养基（Invitrogen，Carlsbad，CA）。根据需要或期望且如本领域技术人员已知且使用常规技术实践的，可以向上述示例性培养基中以合适浓度或量添加上述补充性组分或成分，包括任选组分。 [0086] 此外，适合于本发明方法的细胞培养条件是通常采用且已知用于分批、分批补料式、或连续培养细胞的那些，除温度外还应注意pH，例如约6.5至约7.5；溶解氧（O2），例如在约5-90％之间的空气饱和度和二氧化碳（CO2），搅动和湿度。作为举例说明性但非限制性例子，用于本发明的分批补料式过程的合适细胞培养基包含经修改的CD-CHO培养基（Invitrogen，Carlsbad，CA）。也可以采用补料培养基，例如经修改的eRDF培养基（Invitrogen，Carlsbad，CA）。优选的是还含有糖皮质激素例如地塞米松的补料培养基。 [0087] 动物细胞、哺乳动物细胞、培养细胞、动物或哺乳动物宿主细胞、宿主细胞、重组细胞、重组宿主细胞等是关于可以根据本发明的过程培养的细胞的所有术语。此类细胞通常是得自或衍生自哺乳动物的细胞系，并且当置于含有合适营养素和/或生长因子的培养基中的单层培养物或悬浮培养中时能够生长且存活。具有相关领域技术者能够凭经验容易地确定生长和维持特定细胞培养物所需的生长因子和营养素，例如以下文献中所述：Barnes和Sato（1980，Cell，22:649）；Mammalian Cell Culture，J.P. Mather编辑，Plenum Press，NY，1984；和美国专利号5,721,121。 [0088] 根据本发明方法可以培养多种类型的细胞。所述细胞通常是动物或哺乳动物细胞，其可以向培养基中表达并分泌、或可以经分子改造而表达并分泌大量特定蛋白、更特别地目的糖蛋白。应当理解由宿主细胞产生的糖蛋白对于宿主细胞可以是内源或同源的。可替代且优选地，糖蛋白对于宿主细胞是异源即外源的，例如由中国仓鼠卵巢（CHO）宿主细胞产生并分泌的人糖蛋白。同样优选地，哺乳动物糖蛋白即最初得自或衍生自哺乳动物生物的那些通过本发明的方法来获得，且优选通过细胞分泌到培养基内。 [0089] 可以有利地通过本发明的方法产生的哺乳动物糖蛋白的例子包括但不限于细胞因子、细胞因子受体、生长因子（例如EGF、HER-2、FGF-α、FGF-β、TGF-α、TGF-β、PDGF、IGF-1、IGF-2、NGF、NGF-β）；生长因子受体，包括融合或嵌合蛋白。其他非限制性例子包括生长激素（例如人生长激素、牛生长激素）；胰岛素（例如胰岛素A链和胰岛素B链）、胰岛素原；红细胞生成素（EPO）；集落刺激因子（例如G-CSF、GM-CSF、M-CSF）；白细胞介素（例如IL-1到IL-12）；血管内皮生长因子（VEGF）及其受体（VEGF-R）；干扰素（例如IFN-α、β或γ）；肿瘤坏死因子（例如TNF-α和TNF-β）及其受体TNFR-1和TNFR-2；血小板生成素（TPO）；凝血酶；脑利钠肽（BNP）；凝血因子（例如因子VIII、因子IX、血管性血友病因子（von Willebrands factor）等）；抗凝血因子；组织纤溶酶原激活物（TPA），例如尿激酶或人尿或组织型TPA；卵泡刺激激素（FSH）；促黄体激素（LH）；降钙素；CD蛋白（例如CD3、CD4、CD8、CD28、CD19等）；CTLA蛋白（例如CTLA4）；T细胞和B细胞受体蛋白；骨形态发生蛋白（BNP，例如BMP-1、BMP-2、BMP-3等）；神经营养因子，例如骨源性神经营养因子（BDNF）；神经营养蛋白，例如3-6；肾素；类风湿因子；RANTES；白蛋白；松弛素；巨噬细胞抑制蛋白（例如MIP-1、MIP-2）；病毒蛋白或抗原；表面膜蛋白；离子通道蛋白；酶；调节蛋白；抗体；免疫调节蛋白（例如HLA、MHC、B7家族）；归巢受体；转运蛋白；超氧化物歧化酶（SOD）；G蛋白偶联受体蛋白（GPCR）；神经调节蛋白；阿尔茨海默氏病相关蛋白和肽（例如A-β）、和如本领域已知的其他。融合蛋白和多肽，嵌合蛋白和多肽，以及上述蛋白和多肽任何的片段或部分、或突变体、变体、或类似物也包括在可以通过本发明方法产生的合适蛋白、多肽和肽中。 [0090] 适合具有、表达和产生蛋白质用于后续分离和/或纯化的动物或哺乳动物宿主细胞的非限制性例子包括中国仓鼠卵巢细胞（CHO），例如CHO-K1（ATCC CCL-61）、DG44（Chasin等人，1986，Som. Cell Molec. Genet.，12:555-556；和Kolkekar等人，1997，Biochemistry，36:10901-10909）、CHO-K1 Tet-On细胞系（Clontech）、命名为ECACC 85050302的CHO（CAMR，Salisbury，Wiltshire，UK）、CHO克隆13（GEIMG，Genova，IT）、CHO克隆B（GEIMG，Genova，IT）、命名为ECACC 93061607的CHO-K1/SF（CAMR，Salisbury，Wiltshire，UK）、命名为ECACC 92052129的RR-CHOK1（CAMR，Salisbury，Wiltshire，UK）、二氢叶酸还原酶阴性CHO细胞（CHO/-DHFR，Urlaub和Chasin，1980，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，77:4216）、和dp12.CHO细胞（美国专利号5,721,121）；通过SV40转化的猴肾CV1细胞（COS细胞，COS-7，ATCC CRL-1651）；人胚肾细胞（例如293细胞、或亚克隆用于在悬浮培养中生长的293细胞，Graham等人，1977，J. Gen. Virol.，36:59）；幼仓鼠肾细胞（BHK，ATCC CCL-10）；猴肾细胞（CV1，ATCC CCL-70）；非洲绿猴肾细胞（VERO-76，ATCC CRL-1587；VERO，ATCC CCL-81）；小鼠睾丸支持细胞（TM4，Mather，1980，Biol. Reprod.，23:243-251）；人宫颈癌细胞（HELA，ATCC CCL-2）；犬肾细胞（MDCK，ATCC CCL-34）；人肺细胞（W138，ATCC CCL-75）； 人肝细胞瘤细胞（HEP-G2，HB 8065）；小鼠乳腺肿瘤细胞（MMT 060562，ATCC CCL-51）；水牛鼠肝细胞（BRL 3A，ATCC CRL-1442）；TRI细胞（Mather，1982，Annals NY Acad. Sci.， 383:44-68）；MCR 5细胞；FS4细胞。优选的是CHO细胞，特别是CHO/-DHFR细胞。 [0091] 适合于在本发明的方法和过程中培养的细胞可以含有例如经由转化、转染、感染或注射引入的表达载体（构建体）例如质粒等，所述载体具有编码用于在培养过程中表达并产生的蛋白质的编码序列或其部分。此类表达载体含有转录和翻译所插入编码序列的必需元件。可以使用本领域技术人员众所周知并实践的方法来构建表达载体，其含有编码所产生蛋白和多肽的序列，以及合适转录和翻译控制元件。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术、和体内遗传重组。此类技术描述于以下文献中：J. Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.；和F.M. Ausubel等人，1989，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，N.Y。 [0092] 控制元件或调节序列是载体的非翻译区，例如增强子、启动子、5'和3'非翻译区，其与宿主细胞蛋白相互作用以执行转录和翻译。此类元件可以在其强度和特异性方面不同。取决于所用载体系统和宿主细胞，可以使用任何数量的合适转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。在哺乳动物细胞系统中，来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子是优选的。用于在蛋白质表达系统中使用的构建体经设计为含有至少一个启动子、增强子序列（对于哺乳动物表达系统是任选的）、和基因表达的正确转录和调节所需或所要求的其他序列（例如转录起始和终止序列、复制起始点、多腺苷酸化序列例如牛生长激素（BGH）多腺苷酸序列）。 [0093] 如本领域技术人员应当理解的，用于正确转录、表达和分离真核（例如哺乳动物）表达系统中产生的蛋白质的合适载体例如质粒组分的选择是本领域技术人员已知且照常规确定和实践的。可以将通过根据本发明方法培养的细胞的蛋白质表达置于启动子的控制下，所述启动子例如病毒启动子，例如巨细胞病毒（CMV）、Rous肉瘤病毒（RSV）、磷酸甘油激酶（PGK）、胸苷激酶（TK）、或α-肌动蛋白启动子。此外，经调节启动子赋予通过特定化合物或分子的诱导性，例如小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）的糖皮质激素反应元件（GRE）由糖皮质激素诱导（V. Chandler等人，1983，Cell，33:489-499）。同样，如果需要或期望的话，可以使用组织特异性启动子或调节元件（G. Swift等人，1984，Cell，38:639-646）。 [0094] 可以通过本领域技术人员已知的多种基因转移方法将表达构建体引入细胞中，所述方法例如常规基因转染方法，例如磷酸钙共沉淀、脂质体转染、显微注射、电穿孔、和感染或病毒转导。方法的选择在本领域熟练从业者的能力内。对于本领域技术人员显而易见的是，可以将携带用于在细胞中表达的DNA序列的一种或多种构建体转染到细胞内，从而使得随后在细胞中产生和/或从细胞中获得表达产物。 [0095] 在特定方面，含有合适对照和调节序列的哺乳动物表达系统优选用于在本发明的蛋白质表达哺乳动物细胞中使用。用于哺乳动物表达载体中使用的常用真核控制序列包括与哺乳动物细胞相容的启动子和控制序列，例如巨细胞病毒（CMV）启动子（CDM8载体）和禽肉瘤病毒（ASV）、（πLN）。其他常用启动子包括来自猿猴病毒40（SV40）的早期和晚期启动子（Fiers等人，1973，Nature，273:113），或其他病毒启动子，例如衍生自多瘤病毒、腺病毒2和牛乳头瘤病毒的那些。也可以使用诱导型启动子，例如hMTII（Karin等人，1982，Nature，299:797-802）。 [0096] 适合于真核宿主细胞的表达载体的例子包括但不限于用于哺乳动物宿主细胞的载体（例如BPV-1、pHyg、pRSV、pSV2、pTK2（Maniatis）；pIRES（Clontech）；pRc/CMV2、pRc/RSV、pSFV1（Life Technologies）；pVPakc载体、pCMV载体、pSG5载体（Stratagene）、逆转录病毒载体（例如pFB载体（Stratagene））、pcDNA-3（Invitrogen）、腺病毒载体；腺病毒相关病毒载体、杆状病毒载体、酵母载体（例如pESC载体（Stratagene））、或上述任何的经修饰形式。载体也可以含有在启动子区序列上游或下游的增强子序列用于最佳化基因表达。 [0097] 在重组载体（例如质粒）中也可以使用选择标记，以对具有（优选已稳定整合）该载体的细胞赋予抗性，以允许其在合适选择培养基中的选择。可以使用多种选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV TK）（Wigler等人，1977，Cell，11:223）、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）（Szybalska和Szybalski，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，48:202）和腺嘌呤磷酸核糖转移酶（Lowy等人，1980，Cell，22:817）基因，所述基因分别可以用于tk-、hgprt-或aprt-细胞（APRT）中。 [0098] 也可以使用抗代谢物抗性作为选择标记基因的以下非限制性例子的基础：dhfr，其赋予对氨甲蝶呤的抗性（Wigler等人，1980，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，77:357；和O'Hare等人，1981，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，78:1527）；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性（Mulligan和Berg，1981，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，78:2072）；neo，其赋予对氨基葡糖苷G418的抗性（Clinical Pharmacy，12:488-505；Wu和Wu，1991，Biotherapy， 3:87-95；Tolstoshev，1993，Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.，32:573-596；Mulligan， 1993，Science，260:926-932；Anderson，1993，Ann. Rev. Biochem.，62:191-21；May，1993，TIB TECH，11（5）:155-215）；和hygro，其赋予对潮霉素的抗性（Santerre等人，1984，Gene，30:147）。重组DNA技术领域中通常已知的方法可以照常规应用，以选择期望重组细胞克隆，且此类方法描述于例如以下文献中：Ausubel等人（编辑），Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY（1993）；Kriegler，1990，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY；第12和13章，Dracopoli等人（编辑），Current Protocols in Human Genetics，John Wiley & Sons，NY（1994）； Colberre-Garapin等人，1981. J. Mol. Biol.，150:1，所述文献整体引入本文作为参考。 [0099] 此外，可以通过载体扩增来增加所表达蛋白质分子的表达水平（关于综述参见Bebbington和Hentschel，“The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning”，第3卷，Academic Press，New York，1987）。当表达蛋白质的载体系统中的标记是可扩增的时，存在于宿主细胞培养物中的抑制剂水平的增加将增加标记基因的拷贝数。因为扩增区域与蛋白质编码基因结合，所以蛋白质的产生将伴随地增加（Crouse等人，1983，Mol. Cell. Biol.，3:257）。 [0100] 具有谷氨酰胺合酶（GS）或二氢叶酸还原酶（DHFR）编码核酸作为选择标记的载体可以分别在药物甲硫氨酸砜亚胺或氨甲蝶呤的存在下进行扩增。基于谷氨酰胺合酶的载体的优点是其为谷氨酰胺合酶阴性的细胞系（例如鼠骨髓瘤细胞系，NSO）的可用性。通过提供额外抑制剂来防止内源性基因发挥作用，谷氨酰胺合酶表达系统也可以在谷氨酰胺合酶表达细胞（例如CHO细胞）中发挥作用。 [0101] 表达DHFR作为选择标记的载体包括但不限于pSV2-dhfr质粒（Subramani等人，Mol. Cell. Biol. 1:854（1981））。表达谷氨酰胺合酶作为选择标记的载体包括但不限于Stephens和Cockett，1989，Nucl. Acids. Res.，17:7110中所述的pEE6表达载体。谷氨酰胺合酶表达系统及其组分详细描述于以下PCT公开中：WO 87/04462、WO 86/05807、WO 89/01036、W O 89/10404、和WO 91/06657，所述公开整体引入本文作为参考。此外，可以根据本发明使用的谷氨酰胺合酶表达载体是从供应商商购可得的，所述供应商包括例如Lonza Biologics Inc.（Portsmouth，NH）。 [0102] 在特定实施方案中，可以将编码可溶性CTLA4分子或可溶性CTLA4突变分子的核酸序列插入设计用于在真核宿主中表达外源序列的载体。载体的调节元件可以根据具体真核宿主而改变。在真核宿主细胞中表达可溶性CTLA4或可溶性CTLA4突变体的载体可以包括最佳化蛋白质表达的增强子序列。 [0103] 细胞培养类型为了理解但非限制性的目的，熟练从业者应当理解，用于蛋白质生产的细胞培养和培养运行可以包括三种一般类型；即，连续培养、分批培养和分批补料式培养。例如，在连续培养中，在培养期过程中向细胞提供新鲜培养基补充物（即补料培养基），同时每天去除旧培养基且例如每天或连续收获产物。在连续培养中，补料培养基可以每天添加且可以连续添加，即作为滴或输注。对于连续培养，细胞可以与期望一样久地保留在培养中，只要细胞保持为活的且维持环境和培养条件。 [0104] 在分批培养中，最初在培养基中培养细胞，且在培养运行过程中或结束前既不去除、更换也不补充这种培养基，即不用新培养基“补给”细胞。在培养运行结束时收获期望产物。 [0105] 对于分批补料式培养，在运行过程中通过每天一或多次（或连续地）用新鲜培养基补充培养基来增加培养运行时间，即在培养期过程中用新培养基（“补料培养基”）“补给”细胞。分批补料式培养可以包括多种补料方案和时间，例如每天、每隔一天、每两天等、每天超过一次、或少于每天一次等等。此外，分批补料式培养可以用补料培养基连续补料。 [0106] 然后在培养/生产运行结束时收获期望产物。本发明优选涵盖分批补料式细胞培养，其中在接种后某一时间点添加糖皮质激素化合物。 [0107] 根据本发明，在用于大规模或小规模蛋白质生产的条件下，使用照常规用于动物或哺乳动物细胞培养的培养容器和/或培养装置，可以执行细胞培养，且可以由细胞产生糖蛋白。如本领域技术人员应当理解的，组织培养皿、T形瓶和旋转瓶通常使用实验室规模上。对于在更大规模上的培养（例如500 L、5000 L等，例如如共同受让的美国专利号7,541,164、美国专利号7,332,303、和2006年12月19日提交的美国申请系列号12/086786中所述，所述专利的内容整体引入本文作为参考），可以使用包括但不限于流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶培养或搅拌罐生物反应器系统的程序。在滚瓶或搅拌罐生物反应器系统中可以使用或可以不使用微载体。此类系统可以分批、连续或分批补料式模式操作。此外，培养装置或系统可以配备有或不配备有使用滤器、重力、离心力等的细胞分离器。 [0108] 细胞培养期和相关参数术语“接种”指向启动培养基中添加细胞以开始培养。 [0109] 培养的“生长期”是在任何时间点的活细胞密度高于任何先前时间点的时期。 [0110] 培养的“静止期”是在其过程中经过任何长度的时间段活细胞密度都大致恒定（即在测量误差内）的时期。 [0111] 培养的“死亡期”是跟在生长期或生长期和静止期后面的时期，且在此过程中任何时间点的活细胞密度都低于在该时期过程中的任何先前时间点。 [0112] 在“生长相关”培养过程中，例如在其中糖皮质激素化合物引起延长的生长期的情况下，生产期可以在延长的生长期过程中起始。 [0113] 在“非生长”相关培养过程中，细胞培养的生产期可以是静止期。 [0114] 优选地，在生产期过程中特别是在延长的生产期中补充（“补给”）培养基，以支持连续蛋白质产生，且获得大量高品质糖蛋白产物（如在蛋白质回收后通过高水平的最终唾液酸含量例示和/或测定的）。补料可以在每天基础上或根据其他时间表发生，以支持细胞活力和蛋白质生产。 [0115] 根据本发明的培养过程可以导致更多活细胞存活直到培养期结束时。相应地，在一些实施方案中，存活细胞越多，产生期望产物的细胞越多。这进而导致在培养过程结束时更大积累量的产物，其中通过个别细胞的蛋白质生产速率（即细胞比生产率）保持不变。如本领域已知的细胞比生产率或细胞比速率通常指每个细胞或每细胞质量或体积的量度所产生产物的比表达速率。细胞比生产率以例如每天每个细胞所产生蛋白质的克数来测量，且可以根据涉及下式的积分方法来测量：dP/dt=qp X，或 t P=qp ∫0 Xdt 其中qp是细胞比生产率常数；X是细胞数目或细胞体积或细胞质量当量；且dP/dt是t 蛋白质生产速率。因此，qp可以得自与活细胞的时间积分（∫0 Xdt“活细胞天数”）比较的产物浓度曲线。根据此式，当针对活细胞天数绘制所产生糖蛋白产物的量时，斜率等于细胞比速率。活细胞可以通过若干种量度来测定，例如生物量、O2摄取速率、乳酸脱氢酶（LDH）、细胞压积或浊度（例如颁给T. Etcheverry等人的美国专利号5,705,364）。 [0116] 通过本发明的培养方法产生可溶性CTLA4分子和可溶性CTLA4突变分子在由本发明涵盖的其他实施方案中，采用本发明的细胞培养方法来产生可溶性CTLA4分子或可溶性CTLA4突变分子，如下文所述。可溶性CTLA4分子优选是CTLA4融合蛋白，优选CTLA4Ig。更优选的是如图19中所示，包含氨基酸-1至357或+1至357的CTLA4Ig。可溶性CTLA4突变分子优选是如图20中所示，包含氨基酸-1至357或+1至357的L104EA29YIg。 涉及蛋白质产物的延长生产期的细胞培养方法特别适合于通过其培养中的宿主细胞来产生高品质和大量可溶性CTLA4分子和可溶性CTLA4突变分子。 [0117] 在优选实施方案中，CTLA4Ig通过重组改造的宿主细胞来产生。CTLA4Ig融合蛋白可以通过用含有编码CTLA4Ig的DNA序列的载体转染的CHO细胞重组产生。（参见颁给P.S. Linsley等人的美国专利号5,844,095）。在根据本发明的过程培养时，CTLA4Ig融合蛋白以大量产生且是合适唾液酸化的。本发明提供高水平的可回收蛋白质产物（例如唾液酸化CTLA4Ig蛋白质产物）的产生。在另一优选实施方案中，如图20中所示包含氨基酸-1至357或+1至357的可溶性CTLA4突变分子L104EA29YIg通过本发明的细胞培养方法来产生。 [0118] 关于CTLA4的配体是B7分子。如本文使用的，“配体”指特异性识别并结合另一种分子的分子。分子与其配体的相互作用可以通过本发明培养过程的产物来调节。例如，CTLA4与其配体B7的相互作用可以通过施用CTLA4Ig分子来阻断。作为其他例子，肿瘤坏死因子（TNF）与其配体TNF受体（TNFR）的相互作用可以通过施用依那西普或其他TNF/TNFR阻断分子来阻断。 [0119] 野生型CTLA4或“未突变CTLA4”具有如图20中所示的天然存在的全长CTLA4的氨基酸序列（且也如美国专利号5,434,131、5,844,095和5,851,795中所述，其整体引入本文作为参考），或其识别并结合B7分子或干扰B7分子的任何部分，从而阻断与CD28和/或CTLA4（例如内源性CD28和/或CTLA4）的结合。野生型CTLA4包含特定部分，包括例如始于+1位置的甲硫氨酸且止于+124位置的天冬氨酸的野生型CTLA4的细胞外结构域，或始于-1位置的丙氨酸且止于+124位置的天冬氨酸的野生型CTLA4的细胞外结构域，如图21中所示。 [0120] 天然存在的野生型CTLA4是细胞表面蛋白，其具有N-末端细胞外结构域、跨膜结构域和C-末端细胞质结构域。细胞外结构域结合靶分子，例如B7分子。在细胞中，天然存在的野生型CTLA4蛋白被翻译为未成熟的多肽，其包括在氨基末端或N-末端的信号肽。未成熟的多肽经历翻译后加工，其包括切割并去除信号肽以生成CTLA4切割产物，其具有与未成熟形式中的N-末端不同的新近生成N-末端。本领域技术人员应当理解，可能发生额外翻译后处理，其从CTLA4切割产物的新近生成N-末端去除一个或多个氨基酸。成熟CTLA4蛋白可以始于+1位置的甲硫氨酸或-1位置的丙氨酸。CTLA4分子的成熟形式包括结合B7的细胞外结构域或其任何部分。 [0121] 如本文使用的，CTLA4突变分子指包含如图21中所示的野生型CTLA4或其任何部分或衍生物的分子，所述部分或衍生物具有在野生型CTLA4序列优选野生型CTLA4中的细胞外结构域中的一个突变或多个突变，且结合B7。CTLA4突变分子具有与野生型CTLA4分子的序列类似但不等同，但仍可以结合B7的序列。所述突变可以包括由具有保守性（例如亮氨酸取代异亮氨酸）或非保守性（例如甘氨酸由色氨酸取代）结构或化学特性的氨基酸取代一个或多个氨基酸残基，氨基酸缺失、添加、移码或截短。 [0122] CTLA4突变分子可以包括在其中或与其附着的非CTLA4分子，即CTLA4突变体融合蛋白。突变分子可以是可溶的（即循环的），或它们可以结合至细胞表面（膜结合的）。CTLA4突变分子包括L104EA29YIg和描述于以下文献中的那些：美国申请系列号60/214,065和60/287,576；WO 01/92337 A2；美 国 专 利 号6,090,914、5,844,095、7,094,874 和5,773,253；和如R.J. Peach等人，1994，J Exp Med，180:2049-2058中所述。CTLA4突变分子可以合成或重组产生。 [0123] CTLA4Ig是可溶性融合蛋白，其包含与免疫球蛋白（Ig）分子或其部分连接的，野生型CTLA4的细胞外结构域或其结合B7的部分。CTLA4或其部分的细胞外结构域与Ig部分连接，所述Ig部分包含全部或一部分免疫球蛋白分子，优选全部或一部分免疫球蛋白恒定区，例如全部或一部分IgCγ1（IgCgamma1）、IgCγ2（IgCgamma2）、IgCγ3（IgCgamma3）、IgCγ4（IgCgamma4）、IgCμ（IgCmu）、IgCα1（IgCalpha1）、IgCα2（IgCalpha2）、IgCδ（IgCdelta）或IgCε（IgCepsilon），致使融合分子可溶。Ig部分可以包括上述恒定区或其他恒定区的铰链、CH2和CH3结构域，或CH1、铰链、CH2和CH3结构域。优选地，Ig部分是人或猴且包含铰链、CH2和CH3结构域。最优选地，Ig部分包含人IgCγ1的铰链、CH2和CH3结构域，或由人IgCγ1的铰链、CH2和CH3结构域组成。在CTLA4Ig的Ig部分中，Ig恒定区或其部分可以突变，由此导致其效应子功能减少（参见例如，美国专利号5,637,481、5,844,095和5,434,131）。如本文使用的，术语Ig部分、Ig恒定区、Ig C（恒定）结构域、IgCγ1（IgCgamma1）、IgCγ2（IgCgamma2）、IgCγ3（IgCgamma3）、IgCγ4（IgCgamma4）、IgCμ（IgCmu）、IgCα1（IgCalpha1）、IgCα2（IgCalpha2）、IgCδ（IgCdelta）或IgCε（IgCepsilon）包括天然序列和已突变的序列，例如具有在恒定区中减少效应子功能的突变的序列。 [0124] 关于CTLA4的具体实施方案包含野生型CTLA4的细胞外结构域，其始于+1位置的甲硫氨酸且止于+124位置的天冬氨酸，或始于-1位置的丙氨酸至+124位置的天冬氨酸；在+125位置的连接氨基酸残基谷氨酰胺；和免疫球蛋白部分，其涵盖在+126位置的谷氨酸直到在+357位置的赖氨酸，如图19中所示。编码这种CTLA4Ig的DNA根据布达佩斯条约的条款在1991年5月31日保藏于美国典型培养物保藏中心（ATCC）（10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209），且已给予ATCC登记号ATCC 68629；P. Linsley等人， 1994，Immunity 1:793-80。表达CTLA4Ig的CHO细胞系在1991年5月31日在识别号 CRL-10762下保藏于ATCC。根据本文所述方法产生的可溶性CTLA4Ig分子可以包括或不包括信号（前导）肽序列。图19和20包括信号（前导）肽序列的举例说明。通常，所述分子不包括信号肽序列。 [0125] L104EA29YIg是融合蛋白，其是包含与Ig尾连接的野生型CTLA4的细胞外结构域的可溶性CTLA4突变分子，所述细胞外结构域具有氨基酸变化A29Y（酪氨酸氨基酸残基取代在29位置的丙氨酸）和L104E（谷氨酸氨基酸残基取代在+104位置的亮氨酸）。图20举例说明L104EA29YIg。如图20中所示，L104EA29YIg的氨基酸序列包含在-1氨基酸位置的丙氨酸至在+357氨基酸位置的赖氨酸。可替代地，如图20中所示，L104EA29YIg的氨基酸序列包含在+1氨基酸位置的甲硫氨酸至在+357氨基酸位置的赖氨酸。L104EA29YIg包含在+125位置的连接氨基酸残基谷氨酰胺，和Ig部分，其涵盖在+126位置的谷氨酸至在+357位置的赖氨酸。编码L104EA29YIg的DNA根据布达佩斯条约的条款在2000年6月20日保藏于美国典型培养物保藏中心（ATCC），且已给予ATCC登记号PTA-2104。104EA29YIg描述于共同未决的美国专利申请系列号09/579,927、60/287,576和60/214,065以及WO/01/923337 A2中，所述专利整体引入本文作为参考。通过本发明的培养方法产生的可溶性L104EA29YIg分子可以包括或不包括信号（前导）肽序列。通常，根据本发明产生的分子不包括信号肽序列。 [0126] 如本文使用的，术语“可溶性”指未结合或附着至细胞的任何分子或其片段，即循环的。例如，可以通过使Ig部分附着至CTLA4的细胞外结构域来使CTLA4可溶。可替代地，可以通过去除其跨膜结构域来致使分子例如CTLA4可溶。通常，根据本发明产生的可溶性分子不包括信号（或前导）序列。 [0127] 可溶性CTLA4分子指非细胞表面结合的（即循环的）分子，其包含野生型CTLA4或结合B7的任何部分或衍生物，包括但不限于可溶性CTLA4融合蛋白；可溶性CTLA4融合蛋白，例如CTLA4Ig融合蛋白（例如ATCC 68629），其中CTLA4的细胞外结构域与Ig部分融合，该Ig部分是全部或一部分Ig分子，优选是全部或一部分Ig恒定区，例如全部或一部分IgCγ1（IgCgamma1）、IgCγ2（IgCgamma2）、IgCγ3（IgCgamma3）、IgCγ4（IgCgamma4）、IgCμ（IgCmu）、IgCα1（IgCalpha1）、IgCα2（IgCalpha2）、IgCδ（IgCdelta）或IgCε（IgCepsilon），致使融合分子可溶；可溶性CTLA4融合蛋白，其中细胞外结构域与生物活性或化学活性蛋白的一部分融合或连接，所述活性蛋白例如乳头瘤病毒E7基因产物（CTLA4-E7）、黑色素瘤相关抗原p97（CTLA4-p97）或HIV env蛋白（CTLA4-env gp120），如整体引入本文作为参考的美国专利号5,844,095中所述；杂交（嵌合）融合蛋白，例如CD28/CTLA4Ig，如整体引入本文作为参考的美国专利号5,434,131中所述；去除跨膜结构域以致使蛋白质可溶的CTLA4分子（参见例如，M.K. Oaks等人，2000，Cellular Immunology，201:144-153，该文献整体引入本文作为参考）；可溶性CTLA4突变分子L104EA29YIg。 [0128] 可溶性CTLA4分子还可以是可溶性CTLA4突变分子。根据本发明产生的可溶性CTLA4分子可以包括或不包括信号（前导）肽序列。信号肽可以是允许分子分泌的任何序列，包括来自制瘤素M的信号肽（Malik等人，1989，Molec. Cell. Biol.，9:2847-2853）、或CD5（N.H. Jones等人，1986，Nature，323:346-349）、或来自任何细胞外蛋白的信号肽。通过本发明的培养过程产生的可溶性CTLA4分子可以包括在CTLA4细胞外结构域的N-末端连接的制瘤素M信号肽。通常，在本发明中，所述分子不包括信号肽序列。 [0129] 如本文使用的，“CTLA4融合蛋白”指包含与致使CTLA4分子可溶的非CTLA4部分例如Ig部分融合的，野生型CTLA4的细胞外结构域或其结合B7的部分的分子。例如，CTLA4融合蛋白可以包括与全部或一部分Ig恒定区融合的CTLA4细胞外结构域。可以与CTLA4融合的Ig恒定结构域（或其部分）的例子包括上文所列出的所有，但不限于那些。CTLA4融合蛋白也可以是CTLA4突变分子。 [0130] 本文所用“非CTLA4部分”指不结合CD80和/或CD86且不干扰CTLA4与其配体的结合的分子或其部分。例子包括但不限于作为全部或一部分Ig分子的Ig部分、生物活性或化学活性蛋白的一部分，例如乳头瘤病毒E7基因产物（CTLA4-E7）、黑色素瘤相关抗原p97（CTLA4-p97）或HIV env蛋白（CTLA4-env gp120）（如整体引入本文作为参考的美国系列号5,844,095中所述）。Ig部分的例子包括全部或一部分免疫球蛋白恒定结构域，例如IgCγ1（IgCgamma1）、IgCγ2（IgCgamma2）、IgCγ3（IgCgamma3）、IgCγ4（IgCgamma4）、IgCμ（IgCmu）、IgCα1（IgCalpha1）、IgCα2（IgCalpha2）、IgCδ（IgCdelta）或IgCε（IgCepsilon）。Ig部分可以包括上述恒定区或其他恒定区的铰链、CH2和CH3结构域，或CH1、铰链、CH2和CH3结构域。优选地，Ig部分是人或猴且包括铰链、CH2和CH3结构域。最优选地，Ig部分包括人IgCγ1的铰链、CH2和CH3结构域，或是人IgCγ1的铰链、CH2和CH3结构域。在Ig部分中，Ig恒定区或其部分可以突变，以便减少其效应子功能（参见例如，美国专利号5,637,481、5,844,095和5,434,131）。 [0131] CTLA4的细胞外结构域指野生型CTLA4中识别并结合B7的任何部分。例如，CTLA4的细胞外结构域包含在+1位置的甲硫氨酸至在+124位置的天冬氨酸（图21）。例如，CTLA4的细胞外结构域包含在-1位置的丙氨酸至在+124位置的天冬氨酸（图21）。 [0132] 如本文使用的，术语“突变”指野生型分子的核苷酸或氨基酸序列中的变化，例如野生型CTLA4细胞外结构域的DNA和/或氨基酸序列中的变化。DNA中的突变可以改变密码子，导致所编码的氨基酸序列中的变化。DNA变化可以包括取代、缺失、插入、可变剪接或截短。氨基酸变化可以包括取代、缺失、插入、添加、截短、或蛋白质的加工或切割错误。可替代地，如本领域所充分理解的，核苷酸序列中的突变可以导致氨基酸序列中的沉默突变。如同样理解的，某些核苷酸密码子编码相同氨基酸。例子包括核苷酸密码子CGU、CGG、CGC和CGA，其编码氨基酸精氨酸（R）；或密码子GAU和GAC，其编码氨基酸天冬氨酸（D）。 [0133] 因此，可以通过在其特定核苷酸序列中不同但仍编码具有等同序列的蛋白质分子的一个或多个核酸分子来编码蛋白质。突变分子可以具有一处或超过一处突变。关于指导，氨基酸编码序列如下：氨基酸 符号单字母符号 密码子 丙氨酸 Ala A GCU、GCC、GCA、GCG 半胱氨酸 Cys C UGU、UGC 天冬氨酸 Asp D GAU、GAC 谷氨酸 Glu E GAA、GAG 苯丙氨酸 Phe F UUU、UUC 甘氨酸 Gly G GGU、GGC、GGA、GGG 组氨酸 His H CAU、CAC 异亮氨酸 Ile I AUU、AUC、AUA 赖氨酸 Lys K AAA、AAG 亮氨酸 Leu L UUA、UUG、CUU、CUC、CUA、CUG 甲硫氨酸 Met M AUG 天冬酰胺 Asn N AAU、AAC 脯氨酸 Pro P CCU、CCC、CCA、CCG 谷氨酰胺 Gln Q CAA、CAG 精氨酸 Arg R CGU、CGC、CGA、CGG、AGA、AGG 丝氨酸 Ser S UCU、UCC、UCA、UCG、AGU、AGC 苏氨酸 Thr T ACU、ACC、ACA、ACG 缬氨酸 Val V GUU、GUC、GUA、GUG 色氨酸 Trp W UGG 酪氨酸 Tyr Y UAU、UAC [0134] 如本文使用的，“片段或部分”是分子的任何部分或区段。对于CTLA4或CD28，片段或部分优选是CTLA4或CD28的细胞外结构域，或其识别并结合B7或干扰B7的部分或区段，从而它阻断与CD28和/或CTLA4的结合。同样，如本文使用的，“相应的”意指共享序列一致性。 [0135] 如本文使用的，“衍生物”是与其母体分子共享序列相似性和活性的分子。例如，CTLA4的衍生物包括可溶性CTLA4分子，其具有与野生型CTLA4的细胞外结构域至少70％相似的氨基酸序列，并且识别并结合B7，例如CTLA4Ig或可溶性CTLA4突变分子L104EA29YIg。衍生物意指对氨基酸序列和/或氨基酸的化学性质的任何变化，例如氨基酸类似物。 [0136] 如本文使用的，“调节免疫反应”是活化、刺激、上调、抑制、阻断、减少、减弱、下调或改变免疫反应。通过调节免疫反应，例如调节功能性CTLA4-和/或CD28-阳性细胞与B7阳性细胞的相互作用，可以治疗多种疾病例如自身免疫疾病。例如，调节免疫反应的方法包含使B7阳性细胞与可溶性CTLA4分子例如根据本发明产生的那些接触，以形成可溶性CTLA4/B7复合物，其中所述可溶性CTLA4分子干扰内源性CTLA4和/或CD28分子与B7分子的反应。如本文提及的，“阻断”或“抑制”受体、信号或分子意指干扰受体、信号或分子的活化，如通过领域公认的测试检测的。阻断或抑制可以是部分或完全的。 [0137] 如本文使用的，“阻断B7相互作用”指干扰B7与其配体例如CD28和/或CTLA4的结合，由此阻碍T细胞和B7阳性细胞相互作用。阻断B7相互作用的试剂的例子包括但不限于，识别并结合CTLA4、CD28或B7分子（例如B7-1、B7-2）中任何的分子例如抗体（或其部分）；分子例如可溶性CTLA4的可溶性形式（或其部分）；设计为经由CTLA4/CD28/B7介导的相互作用来干扰细胞信号的肽片段或其他小分子。在优选实施方案中，阻断剂是可溶性CTLA4分子，例如CTLA4Ig（ATCC 68629）或L104EA29YIg（ATCC PTA-2104）；可溶性CD28分子，例如CD28Ig（ATCC 68628）；可溶性B7分子，例如B7-Ig（ATCC 68627）；抗B7单克隆抗体（例如ATCC HB-253、ATCC CRL-2223、ATCC CRL-2226、ATCC HB-301、ATCC HB-11341和如美国专利号6,113,898或Yokochi等人，1982，J. Immunol.，128（2）:823-827中所述的单克隆抗体）；抗CTLA4单克隆抗体（例如ATCC HB-304和如参考文献82-83中所述的单克隆抗体）；和/或抗CD28单克隆抗体（例如ATCC HB 11944和MAb 9.3，如Hansen等人，1980，Immunogenetics，10：247-260或Martin等人，1984，J. Clin. Immunol.，4（1）:18-22中所述）。可以通过领域公认的测试来检测阻断B7相互作用，例如测定免疫疾病（例如风湿性疾病）相关症状的减少，其通过测定T细胞/B7细胞相互作用中的减少、或通过测定B7与CTLA4/CD28相互作用中的减少。阻断可以是部分或完全的。 [0138] 如本文使用的，分子的有效量指阻断该分子与其配体的相互作用的量。例如，阻断B7与CTLA4和/或CD28的相互作用的分子的有效量是这样的量，当与B7阳性细胞上的B7分子结合时，其抑制B7分子结合内源性配体例如CTLA4和CD28。可替代地，阻断B7与CTLA4和/或CD28的相互作用的分子的有效量是这样的量，当与T细胞上的CTLA4和/或CD28分子结合时，其抑制B7分子结合内源性配体例如CTLA4和CD28。抑制或阻断可以是部分或完全的。 [0139] 对于临床方案，优选融合蛋白（例如CTLA4Ig或突变体CTLA4Ig）的Ig部分在受试者中不引发有害免疫反应。优选部分是全部或一部分Ig恒定区，包括人或非人灵长类Ig恒定区。合适Ig区域的例子包括IgCγ1（IgCgamma1）、IgCγ2（IgCgamma2）、IgCγ3（IgCgamma3）、IgCγ4（IgCgamma4）、IgCμ（IgCmu）、IgCα1（IgCalpha1）、IgCα2（IgCalpha2）、IgCδ（IgCdelta）或IgCε（IgCepsilon），包括铰链、CH2和CH3结构域，或CH1、铰链、CH2和CH3结构域，其涉及效应子功能，例如与Fc受体结合、补体依赖性细胞毒性（CDC）或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。Ig部分可以具有在其中的一处或多处突变（例如在CH2结构域中，以减少效应子功能例如CDC或ADCC），其中所述突变通过增加或降低Ig结合Fc受体的能力来调节Ig结合其配体的能力。例如，Ig部分中的突变可以包括在其铰链结构域内任何或所有半胱氨酸残基中的变化。例如，在+130、+136和+139位置的半胱氨酸由丝氨酸取代。Ig部分也可以包括在+148位置的脯氨酸，其由丝氨酸取代。此外，Ig部分中的突变可以包括在+144位置的由苯丙氨酸取代的亮氨酸；在+145位置的由谷氨酸取代的亮氨酸；或在+147位置的由丙氨酸取代的甘氨酸。 实施例 [0140] 以下实施例描述本发明的具体方面，以举例说明本发明且为本领域技术人员提供本方法的描述。实施例不应解释为限制本发明，因为实施例仅提供在理解和实践本发明及其各方面中有用的具体方法和范例。 [0141] 如下文所述的实施例1-5描述与细胞培养过程相关的实验，所述细胞培养过程涉及在培养运行过程中添加糖皮质激素。 [0142] 实施例1在这个研究中，研究地塞米松（DEX）对CHO细胞糖基化过程的细胞内效应，和由于唾液酸酶活性的细胞外效应。此处首次证实，DEX能够改良由CHO产生的重组融合糖蛋白的唾液酸化。然后在受控生物反应器中成功确认了在摇瓶培养中测试的DEX在促进增加唾液酸化中的净效应，且在分批补料式培养中导致增强的唾液酸含量以及减少的去唾液酸化比率。 [0143] 细胞系和培养基在这个研究中使用的CHO细胞系最初亚克隆自DG44亲代细胞，且在有专利权的无蛋白质生长培养基中培养。 [0144] 摇瓶实验5 实验在250 mL摇瓶（VWR国际）中执行，使用100 mL的起始体积和6×10 细胞/mL的初始细胞密度。将培养物置于150 rpm的振荡器平台（VWR国际）上，且在37℃和6％CO2下维持10天。每天进行培养物取样，并根据需要使用1 M碳酸钠调整pH，且每两天补给葡萄糖和谷氨酰胺以维持其充足水平。使用Cedex自动化细胞计数器（Innovatis AG，Bielefeld，德国）脱机测量细胞密度和活力。使用Bioprofile分析仪400（Nova Biomedical公司，Waltham，MA）脱机测量培养物pH以及关于葡萄糖和谷氨酰胺的浓度。 [0145] 生物反应器操作在5-L生物反应器（Sartorius AG，Goettingen，德国）中执行生物反应器实验，使用 1.5 L的初始工作体积。搅动、pH和溶解氧分别控制在150 rpm、7.05和50％空气饱和度下。最初将温度控制在37℃，但在培养过程中转变为较低温度以延长培养物活力。生物反应器以分批补料式模式操作，且在第3天时开始每天补给有专利权的补料培养基，以维持用于葡萄糖及其他营养素的足够浓度。在细胞培养过程期间取样并分析细胞密度、细胞活力、底物和代谢产物。 [0146] 对α2,3-唾液酸转移酶（α2,3-ST）和β1,4-半乳糖基转移酶（β1,4-GT）的蛋白质印迹分析7 用1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤约10 CHO细胞，用1 mL Laemmli样品缓冲液 （Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA）裂解，然后在90℃变性5分钟。在4-15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离全细胞裂解物，印迹至0.45 µm硝酸纤维素膜（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA），并用初次和二次抗体探测。初次抗体是抗人α2,3-ST兔多克隆抗体和抗人β1,4-GT兔多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）。二次抗体是辣根过氧化物酶（HRP）缀合的抗兔抗体（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）。剥离膜并用β-肌动蛋白抗体（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）和HRP缀合的抗小鼠二次抗体再次探测。使用增强型化学发光蛋白质印迹检测系统（GE Healthcare）执行免疫检测，且用VersaDoc成像系统（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA）显现。 [0147] 上清液中唾液酸酶活性的测量使用Amplex Red神经氨酸酶（唾液酸酶）测定试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA）分析唾液酸酶活性。简言之，样品中的神经氨酸酶用于使胎球蛋白去唾液酸化。这种测定采用Amplex Red，以检测通过半乳糖氧化酶氧化在胎球蛋白上的去唾液酸化半乳糖残基而生成的H2O2。在HRP存在下，H2O2与Amplex Red试剂化学计量地反应，以生成红色荧光氧化产物试卤灵5，然后荧光计量地或分光光度计量地对其进行分析。在各测定中，将50 µL工作溶液（100 µM Amplex Red、0.2 U/mL HRP、4 U/mL半乳糖氧化酶和500 µg/mL胎球蛋白）加入含有50 µL稀释细胞培养上清液的各微量滴定板孔内。在37℃30分钟温育后，使用微量滴定板读数器在560 nm下分析样品的吸光度。 [0148] 唾液酸测定通过测定唾液酸和重组蛋白的浓度来计算唾液酸与重组蛋白的摩尔比。通过部分酸水解来释放唾液酸（SA），包括N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）和N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）。 然后通过反相HPLC来分离衍生物，以测定唾液酸含量。通过在280 nm下的UV吸光度测定蛋白质浓度。唾液酸含量作为摩尔比报告，所述摩尔比是每摩尔重组糖蛋白的Neu5Ac和Neu5Gc总摩尔。唾液酸含量作为标准化值报告，所述标准化值是实际值除以任意值。在此处报告的研究中使用相同除数来标准化所有唾液酸含量数据。 [0149] N联寡糖测量使用具有脉冲安培检测的高pH阴离子交换层析（HPAEC-PAD）用于N联寡糖的概况分析（Basa和Spellman 1990；Townsend和Hardy 1991），以提供关于位点特异性N联糖基化的信息。从蛋白质中切割N联寡糖，且基于存在的唾液酸的量在HPAEC-PAD上分离到四个域内。域I代表无唾液酸种类。域II、III和IV是唾液酸化种类，且分别代表单唾液酸化、二唾液酸化以及三和四唾液酸化种类。N联唾液酸化种类比例作为在总N联寡糖种类（其包括无唾液酸种类和唾液酸化种类）内的N联唾液酸化种类百分比报告。N联唾液酸化种类比例作为标准化值报告，其为实际值除以任意值。在此处报告的研究中使用相同除数来标准化所有N联唾液酸化种类比例数据。 [0150] O联寡糖测量通过参照标准和融合蛋白的蛋白A纯化样品的完整质量分析来表征O联糖基化（参考文献）。将样品在100 mM Tris、25 mM NaCl，pH 7.6中稀释，且与PNG酶F一起温育过夜，以酶促去除所有N联寡糖。然后在与胰岛素的内部标准混合后注入样品进行完整质量分析。 O联唾液酸含量作为摩尔比报告，所述摩尔比是每摩尔重组糖蛋白的O联唾液酸摩尔。 [0151] 结果地塞米松增强N联寡糖中的唾液酸含量和唾液酸化种类的百分比 用不同水平的DEX处理表达融合糖蛋白的CHO DG44细胞系，以评价DEX是否影响唾 液酸含量和不同唾液酸化种类的百分比。这个研究使用如上所述的培养条件在一式两份的 250 mL摇瓶中执行。在接种后第二天时，将DEX以范围为0.01 μM至10 μM DEX的终浓度加入CHO细胞培养物中。在第10天时收获培养物，且使用蛋白A柱纯化融合蛋白，并分析总唾液酸含量、O联唾液酸含量和N联概况。唾液酸化在DEX处理的培养物中以浓度依赖性方式增加（表1）。 [0152] 表1 [0153] 0.01 μM至10 μM的DEX浓度导致唾液酸含量9.3％至20.4％的增加，其中最大效应在10 μM。与对照相比，关于用DEX处理的培养物的N联寡糖层析显示，单唾液酸化、二唾液酸化以及三加上四唾液酸化比例分别地4.3％- 7.3％、13.9％- 24.3％和4.5％-20.5％的增加。相反地，与对照相比，关于补充DEX的培养基的寡糖分布中无唾液酸比例存在8.5％- 15.6％减少。N联层析图也显示在10 µM DEX下的最大效应。这些结果指出在经DEX处理的培养物中改良的唾液酸化。然而，在来自经DEX处理的样品的O联唾液酸摩尔比中未观察到显著变化。 [0154] DEX促进β1,4-半乳糖基转移酶（β1,4-GT）和α2,3-唾液酸转移酶（α2,3-ST）表达通过研究涉及唾液酸添加途径的两种酶β1,4-GT和α2,3-ST的表达，采用蛋白质印迹来阐明DEX对唾液酸化的可能机制。在这个实验中，在接种后第二天时，将DEX以0.1 µM至10 µM的浓度加入培养物中，并在三天后收获细胞用于蛋白质印迹分析。使用管家蛋白β-肌动蛋白来比较样品负荷。如图1A和1B中所示，与不含DEX处理的培养物相比，在经DEX处理的培养物中β1,4-GT和α2,3-ST的表达水平大量增加。关于两种酶的表达强度一般随着DEX浓度而增加。这些结果证实，DEX能够刺激在CHO细胞中唾液酸转移酶β1,4-GT和α2,3-ST的表达。 [0155] DEX的细胞保护效应导致培养物上清液中减少的唾液酸酶活性在实施例3中，显示DEX处理增加抗细胞凋亡蛋白GILZ的表达，导致CHO细胞培养物的活力增强。为了测定由于DEX在细胞活力中的改良是否可以减弱唾液酸酶对重组融合蛋白的降解作用，开始摇瓶研究，以比较来自含和不含1 μM DEX的培养物的细胞活力和上清液唾液酸酶活性概况。如图2A和图2B中所示，在经DEX处理和未经处理的培养物中，增加的唾液酸酶活性与降低的细胞活力相关。与关于对照70.2±4.6％的第10天活力比较，在经DEX处理的培养物中，细胞活力从在第4天时的98.0±0.1％降低到在第10天时的 85.0±2.7％。与对照中0.047±0.004的第10天值比较，在经DEX处理的培养物中，唾液酸酶活性的吸光度测量从在第4天时的0.006±0.002增加到在第10天时的0.024±0.003。 因此，在经DEX处理的培养物中，在其下培养物细胞活力下降以及唾液酸酶活性增加的速率明显更慢。这些结果暗示DEX能够经由其细胞保护效应来抑制唾液酸酶释放。 [0156] 比较地塞米松与其他两种糖皮质激素，氢化可的松和泼尼松龙还评估其他糖皮质激素化合物氢化可的松（HYC）和泼尼松龙（PRD），以测定DEX对CHO细胞中增加唾液酸化的作用是否可以扩展至其他糖皮质激素化合物。在接种后第二天时，DEX、HYC和PRD以0、0.1、1和10 μM的终浓度加入细胞培养基内。图3A和图3B显示对于不同糖皮质激素条件，在培养10天后的标准化总唾液酸含量和标准化N联唾液酸化种类比例。与关于对照的10.2±0.2相比，在0.1至10 μM的糖皮质激素浓度下的总唾液酸含量对于DEX是12.4±0.4至14.0±0.5，对于HYC是11.2±0.1至13.0±0.2，且对于PRD是 11.8±0.2至13.4±0.8。与关于对照的77.1±0.7相比，在0.1至10 μM的糖皮质激素浓度下的N联唾液酸化种类比例对于DEX是85.6±1.6至88.8±0.9，对于HYC是79.8±1.6至89.6±0.1，且对于PRD是83.7±0.1至89.0±0.2。因此，类似于DEX，HYC和PRD也显示唾液酸化中的增加，且对于在研究的浓度范围内的所有三种糖皮质激素化合物在10 μM下观察到最大效应。然而，需要更高浓度的HYC和PRD，以达到与DEX相同水平的唾液酸化增强。 [0157] 关于通过地塞米松的唾液酸化增强机制涉及糖皮质激素受体。 [0158] 为了测定来自DEX添加的唾液酸化改良是否经由糖皮质激素受体（GR）介导，在DEX处理前将GR拮抗剂米非司酮（RU-486）加入细胞培养基中。具体而言，在接种后48小时添加1 µM RU-486，且随后在24小时后以0.1、1和10 µM的浓度添加DEX。还将DEX加入不含RU-486的培养物中作为对照。对于含和不含RU-486的条件，由DEX诱导的标准化总唾液酸含量和标准化N联唾液酸化种类比例分别显示于图4A和图4B中。DEX增强产物唾液酸化的能力在1 µM RU-486的存在下显著减少，并且对于0.1 µM DEX条件是最明显的。对于0.1 µM DEX条件，总唾液酸含量和N联唾液酸化种类比例分别从15.1±0.1和92.2±2.0（不含RU-486）降低到12.7±0.1和81.5±0.8（含1 μM RU-486）。这些结果指出DEX通过其增加唾液酸化的机制是GR依赖性的，因为RU-486与DEX竞争GR的配体结合结构域（Raux-Demay等人，1990）。 [0159] DEX在分批补料式生物反应器培养中的应用然后使用受控5-L生物反应器在分批补料式培养中测试DEX增加在摇瓶中发现的融 合蛋白唾液酸化的效应。生物反应器如方法部分中所述来操作。在具有1 µM DEX推注剂（bolus）添加的培养物中观察到较高的总唾液酸含量（图5A）和N联唾液酸化种类比例（图 5B）。与关于对照的14.2±0.1比较，含有DEX的总唾液酸含量为16.5±0.1（增加16.2％）。 类似地，与关于对照的77.9±1.6比较，含有DEX的N联唾液酸化种类比例为90.2±1.3（增加15.8％）。与在摇瓶唾液酸酶活性研究中的观察（图3A和3B）一致，与关于对照的 16.3±0.1至14.2±0.1比较（-12.9％），含有DEX的总唾液酸含量在第8至14天之间从 17.9±0.1降低到16.5±0.1（-7.8％）。类似地，与关于对照的91.3±0.9至77.9±1.6比较（-14.7％），含有DEX的唾液酸化比例百分比在第8至14天之间从97.7±0.9降低到 90.2±1.3（-7.7％）。 [0160] 在不同生物反应器规模进一步证实通过DEX在糖蛋白唾液酸化中的增加。来自不同运行的标准化最终唾液酸含量和标准化唾液酸化比例百分比概括于图6中。在这些运行内，DEX条件包括具有DEX作为推注剂添加或包括补料培养基中的运行。如图6中所示，DEX显示显著的唾液酸化改良，伴随增强的最终唾液酸含量（通过t检验p值<0.001）和最终唾液酸化种类比例（通过t检验p值<0.001）。 [0161] 结论地塞米松加入产生重组融合糖蛋白的CHO培养物导致改良的唾液酸化。这个研究首次证实地塞米松能够增加糖基转移酶α2,3-ST和β1,4-GT的表达，并且地塞米松的效应经由糖皮质激素受体介导。总之，地塞米松在改良唾液酸化中的效应涉及经由糖基转移酶的细胞内效应以及经由延长培养物活力的细胞外效应，所述延长培养物活力降低经由细胞裂解释放到培养物上清液内的唾液酸酶存在。发现地塞米松是用于改良唾液酸化的便捷方法。 [0162] 实施例2细胞系和培养基 在这个研究中使用的CHO细胞系最初亚克隆自DG44亲代细胞，且在有专利权的无蛋白质生长培养基中培养。宿主细胞进行遗传改造以在CMV启动子的控制下分泌IgG-融合蛋白。 [0163] 摇瓶实验5 实验在250-mL摇瓶（VWR国际）中执行，使用100 mL的起始体积和6×10 细胞/mL的初始细胞密度。将摇瓶置于以150 rpm旋转速度的振荡器平台（VWR国际）上。细胞在37℃和6％CO2的标准加湿条件下培养10天持续时间，使用1 M碳酸钠每天调整pH，且每两天补给葡萄糖和谷氨酰胺以维持其一定水平。通过自动化细胞计数系统Cedex（Innovatis AG，Bielefeld，德国）和Bioprofile分析仪400（Nova Biomedical公司，Waltham，MA）脱机分析细胞密度、细胞活力和底物/代谢产物。收集来自各培养收获物的上清液用于SEC分析。 [0164] 尺寸排阻层析（SEC）根据先前公开的方法（Perico等人，2008）执行SEC分析，作出一些修改。简言之，在Agilent 1100 HPLC系统（Agilent Technologies公司，Palo Alto，CA）上在Tosoh Bioscience TSK-Gel G3000 SWxl柱（7.8 ID×30 cm，5 μm颗粒）上运行蛋白A纯化样品。流动相含有pH 7.4的1 x磷酸盐缓冲盐水（PBS）。流速为0.5 mL/min，且将柱温控制在25℃。通过280 nm波长下的吸光度来监测信号。 [0165] 谷胱甘肽还原酶和糖皮质激素受体的蛋白质印迹分析在用1 x PBS洗涤后，用1 mL Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad Laboratories）裂解 7 约10 CHO细胞且在90℃变性5分钟。在4-15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离全细胞裂解物，印迹至0.45 µm硝酸纤维素膜（Bio-Rad Laboratories）上，并用初次抗体和二次抗体探测。用于检测谷胱甘肽还原酶的初次抗体是针对接近人起源谷胱甘肽还原酶C末端的氨基酸391-510产生的单克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）。尽管制造商并未列出中国仓鼠起源用于使用这种抗体来检测谷胱甘肽还原酶，但初步实验显示，在来自CHO细胞和人起源HL60细胞的裂解物中检测到仅一个条带，具有在印迹上的等同表观分子大小。用于检测糖皮质激素受体的初次抗体是抗人单克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）。二次抗体是辣根过氧化物酶（HRP）缀合的抗小鼠抗体（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）。剥离膜并用β-肌动蛋白抗体（Santa Cruz Biotechnology）和HRP缀合的二次抗体再次探测。用增强型化学发光蛋白质印迹检测系统（GE Healthcare）执行免疫检测，且用VersaDoc成像系统（Bio-Rad Laboratories）显现。 [0166] 结果地塞米松（DEX）在宽浓度范围内减少CHO产生的IgG-融合蛋白的聚集 图7A显示用DEX在培养基中以1 μM终浓度处理CHO细胞后，IgG-融合蛋白中显著 减少的高分子量（HMW）种类百分比。HMW种类的主要组分是共价或非共价形成的二聚体和三聚体且明确视为蛋白质聚集体。考虑到蛋白质聚集体的15％减少在已最佳化的培养条件下获得，改良实际上在制造过程中是重要的。为了建立关于DEX对蛋白质聚集的作用的剂量反应曲线和时间进程，我们在不同DEX浓度下或在相同浓度（1 μM）下但具有不同温育时间培养细胞。如图7C中所示，DEX时间依赖性减少蛋白质聚集体的比率，这与先前观察到的DEX对细胞活力和蛋白质糖基化概况分析改良的时间依赖性一致（表1和图11）。然而，DEX对蛋白质聚集体水平减少的浓度依赖性并不明显（图7B），这暗示抗聚集效应并不仅是由于改良的细胞活力，因为我们的先前结果证实CHO细胞的活力随着培养基中DEX的浓度从0.01 µM到10 µM而增加。 [0167] 地塞米松上调CHO细胞中的谷胱甘肽还原酶表达执行蛋白质印迹，以检测在由CHO细胞制备的全细胞裂解物中的谷胱甘肽还原酶表达，所述CHO细胞用不同浓度DEX处理。如图8中所示，DEX增加谷胱甘肽还原酶的表达，即使当药物在1 nM时也可以看到这点。β-肌动蛋白的检测用于样品负荷比较，以消除谷胱甘肽还原酶条带增强是由于同时增加样品负荷的可能性。 [0168] GSH在体外减少纯化的IgG-融合蛋白聚集体为了测定GSH自身是否可以通过与蛋白质直接相互作用来影响蛋白质聚集，实施以下体外研究：将GSH加入在Tris-乙酸盐缓冲液中重构的蛋白A纯化的IgG-融合蛋白中，并分析SEC概况。如图9中所示，高分子量种类的百分比显著降低，其中在1和3 mM GSH的存在下的减少比率分别为15.3％和27.3％。数据明确证实GSH可以直接抑制IgG-融合蛋白聚集。 [0169] 地塞米松效应经由糖皮质激素受体介导DEX是具有广泛药理作用的有效糖皮质激素。为了测定DEX对IgG-融合蛋白聚集体的抑制性作用是否经由糖皮质激素受体的活化特异性介导，首先确认在所用细胞系中存在糖皮质激素受体（GR）的内源性表达，这呈现于图10A中。因为在蛋白质印迹中使用的抗体针对人GR的保守区域产生，所以还装载HepG-2细胞的全细胞裂解物样品作为人起源样品用于抗体验证目的。尽管该抗体可以检测GRα和GRβ，但本分析仅显示单一条带。这可以是由于这两种同种型的分子量（95 kDa与90 kDa比较）太接近而无法在5-15％梯度凝胶上分离，或更可能是由于样品中仅存在一种同种型。 [0170] 因为发现DEX上调在CHO细胞中的谷胱甘肽还原酶表达（参见图8），实施进一步评价以确定这种效应是否是通过GR受体活化来诱导。RU-486是GR拮抗剂且经常在多种GR相关研究中用作工具药物。我们的初步实验显示，如果浓度不高于1 μM，那么RU-486不影响CHO细胞活力和代谢参数；在10 μM观察到细胞活力和细胞生长速率的显著降低。在后续实验中，RU-486因此以1 μM或更低浓度使用，且在DEX添加前一天，将其引入培养物内以预处理CHO细胞。图10B显示在1 μM RU-486的存在下，DEX对谷胱甘肽还原酶表达的上调效应减弱，确认GR的牵涉。 [0171] 最后，评估通过用0.1 μM DEX及其与不同浓度RU-486的组合处理的CHO细胞产生的IgG-融合蛋白中HMW种类的百分比。与图7B中的结果一致，在单独用0.1 μM DEX处理培养物时，HMW种类的百分比降低约17％，且这种效应随着RU-486的浓度增加而逐渐减小（图10C）。在使用相等浓度的DEX和RU-486的条件下，HMW种类的抑制率是得自单独DEX的比率的大约一半，指示作为激动剂的DEX和作为拮抗剂的RU-486在CHO细胞中具有彼此竞争GR的相似亲和力。因此，将图9中所有三份数据汇总在一起，结果明确证实IgG-融合蛋白聚集体的抑制经由GR介导。 [0172] 结论作为廉价但有效的糖皮质激素且由于其有利的三联效应（triad）：如实施例3中所述的改良细胞活力，和如实施例1中所述的改良糖基化，和如此处所述的抑制蛋白质聚集体，地塞米松可以提供总体增强细胞培养过程的简单、成本效率和有效方式。 [0173] 实施例3这个研究首次证实，地塞米松能够在无血清条件下以浓度和时间依赖性方式防止CHO细胞凋亡。DEX诱导CHO细胞GILZ（糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链）基因表达。DEX在10-L生物反应器CHO培养中成功用于改良细胞活力以及Fc-融合蛋白生产率和唾液酸含量。这个研究证实，在工业细胞培养中DEX的施加改良重组蛋白生产率和糖基化。 [0174] 细胞系和培养基在这个研究中使用的CHO细胞系亚克隆自DG44亲代细胞，且在有专利权的化学成分确定的生长培养基中培养。 [0175] 摇瓶实验5 实验在250 mL摇瓶（VWR国际）中执行，使用100 mL的起始体积和6×10 细胞/mL的初始细胞密度。将培养物置于以150 rpm的振荡器平台（VWR国际）上，且在37℃和6％CO2下10天。每天进行培养物取样，并使用1 M碳酸钠调整pH，且每两天补给葡萄糖和谷氨酰胺以维持其一定水平。使用Bioprofile分析仪400（Nova Biomedical公司，Waltham，MA）脱机测量细胞密度和活力。 [0176] 生物反应器操作在10-L生物反应器（Sartorius Stedim Biotech，France）中执行生物反应器实验，使用5 L的初始工作体积。搅动、pH和溶解氧分别控制在150 rpm、7.05和50％空气饱和度下。最初将温度控制在37℃，且在培养过程中转变为较低温度以延长培养物活力。生物反应器以分批补料式模式操作，且在第3天时开始每天补给有专利权的补料培养基，以维持用于葡萄糖及其他营养素的足够浓度。在细胞培养过程期间取样并分析细胞密度、细胞活力、底物和代谢产物。 [0177] qRT-PCR分析执行TaqMan® 5'-核酸酶实时定量RT-PCR分析，以验证GILZ通过DEX的上调。如 上所述使用RNeasy® midi试剂盒，从含和不含1 µM DEX的每种一式三份培养物中纯化总RNA。将纯化的RNA用无RNA酶DNA酶I（Qiagen）处理，且随后用作模板以使用RT²第一链试剂盒（SA Biosciences，Frederick，MD）来合成第一链cDNA。使用GILZ特异性TaqMan MGB探针（6-FAM-AGAGGACTTCACGTGT）和引物（正向：5-CCTCCCTCATCTGTCCACTGA-3和反向： 5-TGGTGGGTTTGGCATTCAA-3）定量测定GILZ的表达。在1×TaqMan Fast Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems，Carlsbad，CA）中，使用900 nM引物和250 nM探针扩增 20 ng cDNA。使用通用循环参数（95℃20秒，95℃3秒、60℃30秒的40个循环），在Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR系统上一式三份运行反应。在相同板上建立平行反应，分析各样品中作为内源性对照的β-肌动蛋白。将各基因的阈值循环针对“管家基因”β-肌动蛋白的阈值循环进行标准化。使用δ-δ阈值循环方法（Livak和Schmittgen， 2001），计算就对照而言在基因表达中的标准化变化。 [0178] GILZ的蛋白质印迹分析7 用1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液洗涤约10 CHO细胞，用1 mL Laemmli样品缓冲 液（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA）裂解，且随后在90℃变性5分钟。在4-15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离全细胞裂解物，印迹至0.45 µm硝酸纤维素膜（Bio-Rad Laboratories），并用针对GILZ的初次小鼠单克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）随后为辣根过氧化物酶（HRP）缀合的抗小鼠二次抗体（Santa Cruz Biotechnology）探测。剥离膜并用β-肌动蛋白抗体（Santa Cruz Biotechnology）和HRP缀合的抗小鼠二次抗体再次探测。用增强型化学发光蛋白质印迹检测系统（GE Healthcare UK Limited Little Chalfont，Buckinghamshire，UK）执行免疫检测，且用VersaDoc成像系统（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA）显现。 [0179] 滴度测定使 用HPLC 泵 和UV检 测（Agilent Technologies，Santa Clara，CA）和 Applied Biosystems Poros A/20蛋白A柱（100×4.6 mm），通过亲和层析测定滴度。使用10级标准曲线来定量洗脱的蛋白质。 [0180] 结果地塞米松对CHO细胞生长的作用 在接种后两天将糖皮质激素地塞米松（DEX）以0.01 μM至10 μM的终浓度加入摇瓶培养物中，以评价糖皮质激素对CH细胞活力的作用和延长细胞培养期的潜力。剂量-反应研究中的活细胞密度（VCD）概况（图11A）显示，以剂量依赖性方式在DEX处理后一天出现的 6 细胞生长的抑制增加。在未经处理的对照培养物中，峰VCD达到8.5×10 细胞/ml，而在用 6 10 μM DEX处理的培养物中，峰VCD为6.5×10 细胞/mL。在第6天后细胞活力快速下降（图11B），且在第10天时的活力百分比仅为42.1％。相比之下，用0.01 μM和10 μM DEX的最终细胞活力分别为53.1％和64.0％。在经DEX处理的培养物中，在第6天时开始的活力损失以浓度依赖性方式改良，其中最大效应在10 μM（图11A和11B）。 [0181] 然后在摇瓶培养物中执行关于DEX添加的时间过程研究，其中将DEX加入至1 μM的最终DEX浓度，且在接种当天直到接种后第六天之间添加。如图11C和11D中所示，最终VCD和细胞活力在所有经DEX处理的培养物中增加，且VCD和细胞活力随着较早的DEX添加时机以时间依赖性方式改良。在第10天时，未经处理的CHO细胞培养物的活力降低至50％，而其中在第0、2、4和6天时添加DEX的培养物分别为63、68、72和74％。 [0182] DEX减少细胞比生长速率但增加细胞比生产率在经DEX处理和未经处理的细胞之间定量并比较比生长速率、标准化体积生产率和标准化细胞比生产率。比较含和不含1 μM DEX的细胞比生长速率和标准化生产率概况的数据显示于图12A和12B（n=5）中。在第2天时添加DEX，与添加DEX后一天的对照相比，导致细胞生长速率中的约30％减少。然而，这种生长抑制效应随着培养时间而降低。在培养期结束时，细胞死亡率在含有经DEX处理细胞的培养物中较慢。此外，通过DEX诱导的早期细胞生长抑制不影响体积生产率（对于所有培养物6.5）；然而，用DEX处理的培养物具有与-9 未经处理的细胞明显更高的比生产率，具有（7.0±0.6）×10 的最大比生产率。 [0183] 通过qRT-PCR和蛋白质印迹分析确认GILZ通过DEX的上调使用qRT-PCR分析GILZ，以验证通过微阵列分析获得的基因表达概况。对于一式三份经DEX处理和未经处理的培养物，将来自第5天和第8天的RNA样品应用于TaqMan® qPCR定量中。在相同板上建立平行反应，分析各样品中作为内源性对照的β-肌动蛋白。如图 13A中所示，通过对在第5天和第8天时的样品qRT-PCR获得的GILZ的标准化表达概况变化分别为7.66±1.08和10.48±2.16。 [0184] 通过蛋白质印迹分析来自含和不含1 µM DEX处理的第5天培养物的细胞裂解物，以测试GILZ在经DEX处理的培养物中是否是过表达的。还用β-肌动蛋白抗体作为对照再次探测印迹，以评价等量凝胶负荷。如图13B中所示，与未经处理的样品相比，GILZ蛋白的表达在经DEX处理的样品中显著增加。此外，由DEX引起的GILZ的倍数变化在第8天的样品中略微高于第5天的样品，这与qRT-PCR结果一致。 [0185] 比较地塞米松与其他两种糖皮质激素，氢化可的松和泼尼松龙在摇瓶中的实验然后测试DEX对CHO细胞活力的保护效应是否局限于DEX，或可以扩展至其他糖皮质激素化合物，例如氢化可的松（HYC）和泼尼松龙（PRD）。对于三种化合物中的每一种，在接种后两天以0、0.1、1和10 μM的终浓度添加DEX、HYC和PRD（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO）。培养细胞的峰VCD、最终VCD和最终活力呈现于表2中。 [0186] 表2 [0187] 类似于DEX，HYC（60.1-75.5％最终活力）和PRD（69.4-75.5％最终活力）也显示剂量依赖性细胞保护效应。与以0.1 μM和10 μM浓度分别地对于DEX 72.3％和82.3％；对于HYC 60.1％和75.5％；以及对于PRD 69.4％和77.5％的第10天活力比较，在第10天时的活力对于对照是56.6％。因此，所有三种糖皮质激素化合物改良培养物活力，其中对于所有三种糖皮质激素化合物最大效应在10 μM。 [0188] 地塞米松的死亡抑制作用牵涉GILZ和糖皮质激素受体为了测定来自DEX添加的活力改良是否经由GILZ和糖皮质激素受体（GR）介导，在DEX处理前将GR拮抗剂米非司酮（RU-486）加入细胞培养基中。对于含和不含RU-486的条件，由DEX诱导的最终细胞活力的增加百分比显示于图14A中。DEX改良细胞活力的能力在 1 µM RU-486的存在下显著减少。通过0.1 μM和1 µM DEX诱导的细胞活力的增加百分比分别从30.5％和32.6％（不含RU-486）降低到4.7％和5.7％（含1 μM RU-486）。同时，qRT-PCR分析（图14B）显示在1 µM RU-486的存在下，DEX对GILZ表达的上调效应显著减弱。通过0.1 μM和1 µM DEX诱导的倍数变化分别从9.0±1.9和11.3±3.0（不含RU-486）降低到1.8±0.9和2.3±1.0（含1 μM RU-486）。蛋白质印迹分析（图14C）进一步确认，GILZ蛋白的过表达在1 µM RU-486的存在下显著降低。这些结果指示DEX通过其增加活力的机制牵涉GILZ且是GR依赖性的，因为RU-486与DEX竞争GR的配体结合结构域。 [0189] 地塞米松在10-L分批补料式生物反应器培养中的应用执行在10-L生物反应器中的分批补料式培养，以测定在摇瓶中可见的DEX效应是否将按比例扩大至生物反应器。DEX的总体目标是对于在生物反应器的过程抑制细胞死亡，延长培养物寿命和由此促进糖蛋白生产。在这个研究中，三个生物反应器使用上述相同条件操作；其中分别在第2天或第7天时将1 µM DEX加入两个生物反应器中。与摇瓶运行不同，生物反应器运行延长至14天，培养温度在培养的指数末期过程中转变为较低温度，且使用有专利权的补料培养基代替仅补给葡萄糖和谷氨酰胺。 [0190] 与不含DEX的7.8×106细胞/mL比较，在第2天或第7天时添加DEX的生物反应6 器在第8天时达到约8.3×10 细胞/mL的最大细胞密度（图15A）。DEX添加降低生物反应器中的细胞死亡率。在第6天时对于所有条件的细胞活力是94％活力（图15B）。到第14天时，与分别在第2天或第7天时添加DEX的55％和39％比较，不含DEX的活力百分比降 6 低至29％。与不含DEX添加的2.8×10 细胞/mL比较，在第2天或第7天时含DEX添加的 6 在第14天时的最终VCD分别为4.1和3.5×10 细胞/mL。在第7天时在最大VCD前，标准化蛋白滴度是约5.5（图15C）。以后，在培养的静止期和死亡期过程中，蛋白质生产在具有DEX添加的生物反应器中较高。与不含DEX添加的10.5比较，在具有DEX的两个生物反应器中，第14天收获物的标准化滴度是12.5，增加20％。 [0191] 结论我们对培养基最佳化的努力已将我们导向出乎意料地发现：在CHO细胞的分批补料式培养中，糖皮质激素可以显著减弱细胞活力下降。在这种现象的机制研究中，经由qRT-PCR和蛋白质印迹分析鉴定抗细胞凋亡基因GILZ的上调的牵涉。通过研究DEX的类似物和拮抗剂对CHO细胞生长的作用，测定了GILZ和糖皮质激素受体在介导DEX活性中的作用。分批补料式生物反应器实验证实，这种糖皮质激素类似物是用于减弱细胞培养中的活力下降的有效、可行和成本有效率的化学制品。 [0192] 实施例4在这个研究中，在具有不同糖蛋白（CTLA4Ig）分泌的另一种CHO细胞系中研究地塞米松（DEX）对CHO细胞生长、蛋白质唾液酸化和聚集的作用。 [0193] 细胞系和培养基在这个研究中使用的CHO细胞系最初亚克隆自DG44亲代细胞，且在有专利权的化学成分确定的生长培养基中培养。 [0194] 摇瓶实验5 实验在250-mL摇瓶（VWR国际）中执行，使用100 mL的起始体积和6×10 细胞/mL的初始细胞密度。将培养物置于150 rpm的振荡器平台（VWR国际）上，且在37℃和6％CO2下维持10天。每天进行培养物取样，并根据需要使用1 M碳酸钠调整pH，且每两天补给葡萄糖和谷氨酰胺以维持其充足水平。在第2天时以0.001 -10 μM的终浓度添加糖皮质激素地塞米松（DEX）。使用Cedex自动化细胞计数器（Innovatis AG，Bielefeld，德国）脱机测量细胞密度和活力。使用Bioprofile分析仪400（Nova Biomedical公司，Waltham，MA）脱机测量培养物pH和葡萄糖和谷氨酰胺的浓度。从培养收获物中收集上清液用于分析唾液酸含量和HMW水平。 [0195] 唾液酸和HMW含量测定唾液酸和HMW含量测定如先前实施例中所述执行。 [0196] 结果地塞米松对CHO细胞生长的作用 在接种后两天将糖皮质激素地塞米松（DEX）以0.001 μＭ至10 μM的终浓度加入摇瓶培养物中，以评价DEX对CHO细胞活力的作用和延长细胞培养期的潜力。剂量-反应研究中的活细胞密度（VCD）概况（图16A）显示，在DEX处理后出现细胞生长的抑制增加，尽管浓 6 度依赖性在研究范围中并不明显。在未经处理的对照培养物中，峰VCD达到13.9×10 细胞 6 6 /mL，而在用0.001 μM至10 µM DEX处理的培养物中，峰VCD范围为10.6×10 至12.7×10细胞/mL。关于未经处理培养物的细胞活力在第6天后快速降低（图16B），且在第10天时活力百分比仅为64.5％。相比之下，具有0.001 μM和10 μM DEX的最终细胞活力分别为 75.5％和82.3％。 [0197] 地塞米松（DEX）增加糖蛋白CTLA4Ig的唾液酸化且减少其HMW水平除细胞生长外，还评价DEX对唾液酸含量和HMW水平的作用。经由与未经处理的培养物比较，由不同浓度DEX诱导的唾液酸含量的增加百分比（图17A）和HMW种类的减少百分比（图17B）显示于图17中。显而易见的是，即使在0.001 µM浓度下，DEX也能够增加糖蛋白的唾液酸化并减少HMW种类，指示改良的蛋白质品质。当DEX的浓度高于0.01 µM时，DEX对唾液酸含量和HMW种类的浓度依赖性并不明显。 [0198] 这些结果证实，DEX对细胞活力改良、糖蛋白唾液酸化改良和聚集体减少的作用并不仅限于单一细胞系或培养基配方。 [0199] 实施例5在这个研究中，在500-L和5000-L规模的生物反应器中证实在用于大规模重组糖蛋白生产的细胞培养基中采用DEX的可行性。 [0200] 细胞系和培养基在这个研究中使用的CHO细胞系亚克隆自DG44亲代细胞，且在有专利权的生长培养基中培养。 [0201] 生物反应器操作在7-L、500-L和5000-L生物反应器中执行生物反应器实验，其中起始工作体积分别约3 L、300 L和3000 L。所有生物反应器运行都始于37℃，且在细胞进入生产期时转变为较低温度，以便延长细胞培养期。将pH和溶解氧维持在7.05和50％空气饱和度下。关于 7-L、500-L和5000-L规模的搅动速率分别为180、75和60 rpm。所有生物反应器实验都是以分批补料式模式进行，其中每天补给无蛋白培养基，以便维持葡萄糖及其他营养素在一定水平。为了增加细胞活力和蛋白质唾液酸化的目的，在所有生产规模的补料培养基中都包括地塞米松。在细胞培养过程期间取样并分析细胞密度、细胞活力、底物和代谢产物。 [0202] 如先前实施例中所述执行滴度、唾液酸和HMW含量测定。 [0203] 结果图18A和18B呈现就细胞生长和活力而言的生物反应器性能。通过从7-L按比例扩大 6 到5000-L的细胞生长观察到具有在12至13×10 细胞/mL之间的类似峰活细胞密度，其中误差棒代表在每个时间点重叠的在特定规模下运行的标准差。细胞密度在5000-L规模在第7天时达到峰值，且对于7-L和500-L规模在第8天时达到峰值。在7-L、500-L和5000-L生物反应器规模下，培养物的第14天平均活力分别为88％、84％和91％。图18C和18D呈现来自7-L、500-L和5000-L生物反应器规模的生产率和唾液酸概况。在7、500和5000-L规模下，第14天的滴度（作为标准化值报告）分别为13.2、11.6和13.6。在递增规模下，峰唾液酸水平（作为标准化值报告）是16.0、18.0和19.0。对于所有规模，到运行结束时，唾液酸下降约2.6单位。 [0204] 结论总之，在补料培养基中包括地塞米松在所有规模下时都表现良好，指示采用地塞米松作为培养基添加剂用于工业规模生产的可行性。 |
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