细胞质膜包含各种脂质(例如磷脂、胆固醇、神经鞘脂以及糖脂质)，但它 们不必是均一分布的。例如，双层膜的内表面和外表面膜的脂质成分之间具有 显著差异。而且，脂质和某些膜蛋白可以形成“筏”或脂质微结构域，例如由于 具有更多高饱和脂肪酸的特定脂质的富集，其中脂质排列地比通常膜中更为紧 密。膜的脂质组成可以充分影响膜的特性。
培养基可以影响动物细胞膜的脂质组成。例如，D.Tombaccini等，“生长在 含脂质耗尽血清培养基中的Balb/c3T3、SV3T3和刀豆素A选择性回复体细胞 的脂质组成”(Lipid Composition of Balb/c3T3，SV3T3，and Conconavalin A-Selected Revertant Cells Grown in Media Containing Lipid-Depleted Serum)，J. Lipid Res.，22：590-597，1981注意到，细胞在脂质耗尽的培养基中在压力下生长 的情况下，膜脂质脂肪酸组成发生了多种改变。许多这样的改变与保持脂肪酸 缺失饮食的动物组织中所发现的改变类似。然而，还不清楚，补充正常的动物 饲料或细胞培养基是否会对正常的膜脂质组成产生显著变化。
已经对改变包膜病毒的脂质组成进行了尝试。例如，A.C.Roland等，“人 免疫缺陷病毒包膜和宿主细胞质膜的脂质组成和流动性”(Lipid Composition and Fluidity of the Human Immunodeficency Virus Envelope and Host Cell Plasma Membranes)，PNAS 90：5181-5185，1993发现，HIV包膜与宿主细胞膜之间存 在差异。Roland注意到，HIV-1与磷脂脂质体的孵育降低了包膜中的胆固醇量， 导致感染性的显著降低。
然而，对于影响宿主细胞和病毒脂质组成的更具有选择性的方法还存在需 求。对与正常感染和复制相关的具体脂质和组成型脂肪酸的鉴定可以有益于培 养和某些病毒特性的控制。通过以下论述，可以理解本发明所提供的这些和其 他特征。
发明概述
本发明涉及用于调节细胞膜和病毒包膜的脂质组成的组合物、方法和系统。 宿主细胞可以在含有补充了某些脂质以影响所述细胞膜中所提供的脂质种类 或亚类的培养基中生长。用于病毒宿主细胞生长的培养基可以影响病毒包膜中 的脂质特性、影响病毒产量并影响病毒的物理性质。
改变病毒脂质组成的方法可以包括，例如，调节用于培养适合所述病毒的 宿主细胞的培养基中的磷脂或胆固醇的水平，以及用所述病毒感染所述宿主细 胞。由此，与没有进行这些培养基脂质浓度调节的情况下在相同宿主细胞上生 长的相同(对照)病毒相比，可以为子代病毒粒提供不同的脂质组成。通过本方 法进行调节的典型病毒包括例如逆转录病毒(诸如HIV)、副粘病毒(诸如呼吸道 合胞病毒、副流感病毒、偏肺病毒)、正粘病毒(诸如感冒病毒)、乳多空病毒(如 人乳头状瘤病毒)、线状病毒、痘病毒、疱疹病毒、嗜肝DNA病毒、棒状病毒 (如狂犬病毒)、冠状病毒(如SARS)、囊膜病毒、沙粒病毒和布尼亚病毒。
培养基的调节可以包括对这里所确定的脂质的常规培养基浓度的提高或降 低。调节可以包括制备一种确定或未知脂质含量的培养基，然后通过改变所述 培养基的脂质含量(通常通过向培养基添加确定种类和/或亚类的脂质)对所述 培养基脂质进行调节。未调节的细胞可以在未调节的起始培养基上生长，而调 节的细胞可以在调节的培养基上生长。可以在调节的细胞中培养调节的病毒 粒，而未调节的病毒粒在未调节的细胞上生长。例如，培养基中的脂质水平可 以调至与起始培养基不同的水平，例如调至高于20mg/L或低于0.01mg/L。所 述方法包括对鞘磷脂、胆固醇、磷脂和糖脂质这些种类中的脂质进行调节。此 外，脂质的调节可以包括增加或减少酯化成某些脂肪酸(诸如，例如9-十八烯 酸(C18:1n9)、棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、亚麻油酸(C18:2n6)和油酸(C18:1)) 的脂质亚类。
以这种方式调节病毒脂质组成可以改变所述病毒的某些物理性质，如病毒 膜相变温度。因而可以调节病毒膜相变温度以影响病毒存储稳定性或赋予诸如 干燥温度等的所需制剂过程参数，从而例如有助于防腐剂分子穿透进入病毒。 例如，可以用特定相变温度的脂质制备调节的病毒，从而使得当其在液态防腐 制剂中保持在转换温度时，在干燥过程之前和/或过程中可以影响稳定剂的跨膜 摄取以制备干燥疫苗剂型。示例性的干燥方法可以包括冷冻干燥、冷冻泡沫干 燥、泡沫干燥、喷雾冷冻干燥、喷雾干燥、高压喷雾干燥以及超临界喷雾干燥。
对病毒包膜脂质含量的调节可以用于改变病毒的免疫原性。病毒包膜向外 递呈给宿主免疫系统，因此在免疫相互作用中起重要作用。膜脂质和蛋白质组 合物在包膜上形成的“脂质筏(lipid raft)”可以是重要的免疫原。整个蛋白抗原构 象和免疫原的递呈可以根据膜脂质组成而改变。例如，可以对用于哺乳动物但 在鸟类中生长的一种病毒疫苗进行调整(通过例如对病毒加以修饰使其具有更 典型的哺乳动物脂质含量)以引发更强的保护性反应。可选地，可以调节病毒 的脂质含量以引发更强烈和更持久的免疫反应，例如佐剂效应。
在另一方面，通过调节生长培养基中某些脂质的水平可以改变宿主细胞对 感染的许可性。例如，宿主细胞可以在添加或补充了与许可性相关的脂质的培 养基中生长。对于流感病毒和其他病毒，可以通过在富含鞘磷脂和/或胆固醇的 培养基中培养宿主细胞提高其感染性。尤其优选在培养基中包含具有C18:0、 C18:1n9和/或C18:2n6脂肪酸的脂质亚类。
在本发明的另一个方面，例如通过提供富含选择性掺入病毒包膜的脂质的 培养基，可以提高病毒的产量。例如，通过调节细胞生长培养基中鞘磷脂或胆 固醇的水平可以提高来自细胞的病毒产量。可选地，通过向培养基添加磷脂酰 丝氨酸或磷脂酰肌醇可以提高病毒产量。尤其优选在培养基中包含具有C16:0 和/或C18:2n6脂肪酸的脂质亚类。
本发明包括一种流感病毒粒的组合物，与在鸡蛋尿囊或表达低于最佳浓度 优选脂质的培养细胞系中生长的对照流感病毒粒相比，其具有提高的膜胆固醇 或鞘磷脂比例。在某些情况下，所提高的比例可以由在含20mg/L或更多鞘磷 脂或胆固醇的培养基中生长的宿主细胞上培养所述病毒粒而产生。在优选的实 施方式中，培养基中包含酯化成棕榈酸(C16:0)的鞘磷脂并且/或培养基中包含 酯化成棕榈酸(C16:0)或硬脂酸(C18:0)的胆固醇。在更优选的实施方式中，培养 基中脂肪酸鞘磷脂棕榈酸(C16:0)的摩尔百分比比常规培养基的提高了至少 10％，或胆固醇棕榈酸(C16:0)或硬脂酸(C18:0)比常规培养基(例如起始培养基) 的提高了至少10％。在更优选的实施方式中，膜中的脂肪酸鞘磷脂棕榈酸(C16:0) 的摩尔百分比比对照病毒粒的提高了至少10％，或或胆固醇棕榈酸(C16:0)或硬 脂酸(C18:0)比对照病毒粒(例如，来自在常规培养基中生长和感染的细胞)的提 高了至少10％。
用于病毒培养的系统包括，例如一种许可所述病毒的宿主细胞、适于所述 细胞生长的培养基、以及胆固醇或鞘磷脂。可以出于调节许可性、提高来自所 述细胞的病毒产量、提高所述病毒的存储稳定性或改变所述病毒的膜相变温度 的目的向培养基中添加胆固醇或鞘磷脂。在优选的实施方式中，所添加的胆固 醇或鞘磷脂包含摩尔百分比高于25％的棕榈酸(C16:0)、摩尔百分比高于20％ 的硬脂酸(C18:0)或摩尔百分比高于40％的油酸(C18:1)。在优选系统中，所述 病毒是逆转录病毒(如HIV)、副粘病毒(如呼吸道合胞病毒、副流感病毒、偏肺 病毒)、正粘病毒(如流感病毒)、乳多空病毒(如人乳头状瘤病毒)、线状病毒、 痘病毒、疱疹病毒、嗜肝DNA病毒、棒状病毒(如狂犬病毒)、冠状病毒(如 SARS)、囊膜病毒、沙粒病毒和布尼亚病毒。在优选的实施方式中，所述宿主 细胞是鸡蛋尿囊细胞或MDCK肾细胞。在实施方式中，为了例如提高病毒产 量，所述培养基还包含磷脂酰丝氨酸和/或磷脂酰肌醇。
在本发明的某些方法中，通过调节提供宿主细胞的动物的饮食调节病毒宿 主细胞的脂质含量。例如，通过用富含胆固醇或鞘磷脂(或其他所需脂质种类 和/或亚类)的饲料喂养鸡、收集所述鸡所产的一个或多个受精卵、用流感病毒 接种所述的一个或多个受精卵的尿囊、以及从所述一个或多个尿囊中收获流感 病毒，可以获得具有改良的膜脂质组成的流感病毒。在优选实施方式中，使用 所述富含脂质饲料直至尿囊液总胆固醇和/或鞘磷脂含有摩尔百分比高于25％ 的棕榈酸(C16:0)、摩尔百分比高于20％的硬脂酸(C18:0)和/或摩尔百分比高于 40％的油酸(C18:1)。在优选实施方式中，富含胆固醇或鞘磷脂的饲料包含至少 0.5克、1克、2克、5克或10克总胆固醇或总鞘磷脂/鸡/天。由此得到的病毒 可以具有所需特性，这些特性诸如例如比在未用相对富含受调节脂质的饲料喂 养的对照鸡的鸡蛋上培养的病毒具有更高的滴度，比在未用相对富含受调节脂 质的饲料喂养的对照鸡的鸡蛋上培养的病毒具有更长的保存期，比在未用相对 富含受调节脂质的饲料喂养的对照鸡的鸡蛋上培养的病毒更高的免疫原性，以 及与在未用相对富含受调节脂质的饲料喂养的对照鸡的鸡蛋上培养的病毒的 膜相比不同的膜相变。
定义
除非在本说明书中另有定义，这里所使用的所有技术和科学术语具有本发 明所属领域一般技术人员所通常理解的含义。以下定义是对本领域内术语的补 充并针对本中请且不用于任何相关或不相关的情况(例如任何通常自有专利或 申请)。
在详细描述本发明之前，应当理解本发明不限于具体装置或系统，它们当 然是可以变化的。也应当理解，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式 而不是对本发明的限制。
如本说明书和附属的权利要求书中所使用的，单数形式的“一个”、“一种” 和“这种”可选地包括复数指示物，除非内容有明确的不同指定。因而，对“一 种脂质”的指代可以包括两种或更多种脂质的组合；对“几个蛋”的指代可以包 括单个蛋等等。
虽然在本发明的实践中可以不需要过分的实验就使用许多与这里所描述的 类似的、改进的、或等价的方法和材料，这里描述了优选的材料和方法。在本 发明的描述和权利要求中，将根据以下定义使用以下术语。
根据例如哪些脂肪酸被酯化成所述脂质，膜脂质的种类包括可以作为某种 亚类存在的指定的脂质分子类型。例如，膜脂质的种类可以包括：胆固醇、鞘 磷脂、磷脂、糖脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰胆 碱、心磷脂、磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、脑苷脂、神经节苷脂等等。这些脂质 的亚类可以包括酯化成不同脂肪酸(诸如例如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油 酸、亚麻油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸以及/或其他)的种类成员。 与另一种病毒相比，如果存在于所述病毒中的一种或多种脂质种类或亚类在数 量或比例上与所述另一种病毒明显不同(例如10％的差异)，则所述病毒具有“不 同的脂质组成”。本发明提供了产生具有不同脂质组成的病毒的方法，例如从 相同的接种体出发，但在具有不同脂质成分和/或不同脂质比例的培养基上生长 的细胞上培养。
诸如C16:0、C18:1n9的脂肪酸链速记符号如本领域内通常所理解的。例如， 符号C18:1表示在碳链的一个不饱和位置上具有一个双键的一种18碳脂肪酸 链。C18:1n9表示在第9个碳原子上具有一个双键的一种18碳脂肪酸链。通常， 脂质分子中的脂肪酸被酯化成极性更高的基团以形成例如磷脂、鞘脂、糖脂或 其他。在其他情况下，脂肪酸可以酯化成相对疏水基团，如胆固醇。
如这里所使用的，关于脂质的术语“调节”是指改变脂质、脂质种类和/或脂 质亚类的数量、浓度和/或比例。在许多情况下，例如调节培养基脂质需要向一 种起始培养基添加脂质。然而，调节可以可选地包括从培养基、细胞膜或病毒 中减少或去除一种脂质。
附图说明
图1显示了细胞膜脂质的FTIR数据的图。对照鸡胚肾(CEK)细胞表明在约 7℃、32℃和54℃的相变(图1A)。使用环糊精从CEK细胞膜中去除胆固醇引 起了约45℃处熔化的脂质有序基团显著增加(1B)，这说明对流感病毒感染高 度许可的CEK细胞的质膜含有大量的胆固醇和胆固醇酯。将所述膜用神经磷 脂酶处理导致较低融化基团的明显降低和更有序的高熔点膜脂质基团的大量 增加。这一反应强烈暗示CEK细胞包含大量的鞘磷脂。总体而言，所述数据 说明，胆固醇和鞘磷脂是CEK膜的重要成分，并暗示这些脂质有助于流感病 毒感染的许可性。
图2显示了A/Sydney病毒包膜脂质的FTIR数据的图。用环糊精处理以降 低胆固醇含量、或用神经磷脂酶处理将鞘磷脂转化为神经酰胺，导致有序的高 熔点膜脂质基团的显著增加。所述数据说明，与CEK细胞相似，如A/Sydney 的流感病毒含有大量的胆固醇和鞘磷脂。
图3显示了鸡尿囊(CAS)宿主细胞膜和在源自鸡蛋尿囊的CAS细胞上生产 的流感病毒膜中某些脂质种类的比较的柱状图。与通常哺乳动物细胞的各种脂 质种类的典型分布相比，所述数据显示在流感病毒以及CEK细胞中磷脂酰丝 氨酸和鞘磷脂的富集，已知这些脂质非常有助于流感感染。
图4和5显示了CAS细胞和在CAS细胞上生长的病毒之间磷脂亚类的比 较的柱状图。
图6显示了CAS细胞和在CAS细胞上生长的病毒之间鞘磷脂亚类的比较 的柱状图。
图7显示了CAS细胞和在CAS细胞上生长的病毒之间胆固醇酯亚类的比 较的柱状图。结果显示，在许可性宿主和非许可性宿主之间存在显著的脂质组 成差异。
图8显示了病毒之间和对所述病毒具有不同许可性水平的细胞之间膜脂质 种类的差异。结果说明，在许可性宿主和非许可性宿主之间存在显著的脂质组 成差异。
图9显示了病毒和对所述病毒具有不同许可性水平的细胞之间膜胆固醇酯 亚类的差异。
图10显示了病毒和对所述病毒具有不同许可性水平的细胞之间膜鞘磷脂 亚类的差异。
发明详述
本发明涉及具有改进的脂质组成的病毒和影响病毒及其宿主细胞脂质构成 的方法。在一个方面，通过例如调节培养基组成，可以改进病毒宿主细胞的细 胞膜脂质。这样改进的宿主细胞可以以提高的许可性加以感染并提供更高的病 毒产量。与在未改进的宿主细胞上生长的相同病毒相比，在所述改进的细胞中 培养的病毒可以具有例如提供增强的稳定性、改进的免疫原性以及/或改变的膜 相变特性的改进的病毒膜脂质组成。
在所述方法的具体实施方式中，可以提供包含影响宿主细胞膜(外膜或内膜) 的脂质组成和/或脂质(例如病毒膜)组成的量的胆固醇、鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸 /肌醇和/或磷脂酰胆碱的培养基。所获得的膜组合物可以在培养、工艺参数、 稳定性和在所述培养基中生长的细胞中培养的病毒的抗原特性上提供益处。
我们已经发现，在许可性宿主和非许可性宿主之间以及病毒和其宿主细胞 之间存在显著的脂质组成差异，可以对此加以利用以提供例如具有更高效力、 更强免疫原性、更易于加工、和/或更长保存期的病毒疫苗。例如，包含更多膜 鞘磷脂(尤其是具有更高18:0(硬脂酸)脂肪酸链比例)和/或胆固醇酯(尤其是具 有18:1n9(油酸)脂肪酸链)的改进细胞对于诸如例如逆转录病毒(如HIV)、副粘 病毒(如呼吸道合胞病毒、副流感病毒、偏肺病毒)、正粘病毒(如流感病毒)、 乳多空病毒(如人乳头状瘤病毒)、线状病毒、痘病毒、疱疹病毒、嗜肝DNA 病毒、棒状病毒(如狂犬病毒)、冠状病毒(如SARS)、囊膜病毒、沙粒病毒和布 尼亚病毒等病毒具有提高的许可性。可选地，可以通过宿主细胞培养基的组成 影响病毒的脂质含量，以提供更高比例的病毒优选脂质和脂肪酸，如C16:0胆 固醇酯、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇和C16:0(棕榈酸)鞘脂和18:2n6(亚油酸) 胆固醇。
影响宿主细胞的脂质
根据这里所提供的脂质含量和某些宿主细胞特性之间的关系，并考虑到宿 主细胞的脂质组成可以受生长培养基脂质含量的影响这一事实，这里提供了改 善病毒宿主细胞特性的策略。
在一个方面，可以调节病毒宿主细胞的培养条件以增强对感染的许可性并 提高最终病毒培养产量。已经发现，感染的许可性(例如对于流感病毒宿主细 胞而言)与宿主细胞脂质膜中较高的C18:1n9胆固醇比例相关。我们也发现了在 更高许可性宿主细胞的膜脂质中C18:0鞘磷脂升高的趋势。在本发明的方法中， 病毒宿主细胞在含有C18:1n9胆固醇酯和/或C18:0鞘磷脂的培养基中生长。在 本发明的方法中，病毒宿主细胞在含有20mg/L、30mg/L、50mg/L、100mg/L、 500mg/L或更多C18:1n9胆固醇酯和/或C18:0鞘磷脂的培养基中生长。
在本发明的某些实施方式中，对病毒宿主细胞培养基中的C18:1n9胆固醇 酯和/或C18:0鞘磷脂的量加以调节。例如，可以向常规商品化培养基(或任何 其他起始培养基)添加各种量的C18:1n9胆固醇酯和/或C18:0鞘磷脂以确保这 些脂质的存在、提高这些脂质的绝对量、以及/或提高这些脂质的比例。可选地， 宿主细胞培养基配方可以包含比C18:1n9胆固醇酯更少或更低比例的诸如 C16:0和/或C18:0胆固醇酯的其他胆固醇酯。可选地，宿主细胞培养基配方可 以不含或含有比C18:0鞘磷脂更少或更低比例的诸如C16:0和/或C18:1n9的其 他鞘磷脂。例如，用于培养包膜病毒的宿主细胞可以在含有比其他单个胆固醇 酯过量的或比其他胆固醇酯的组合过量的C18:1n9胆固醇酯的培养基中生长。 可选地，用于培养包膜病毒的宿主细胞可以在含有比其他单个鞘脂过量的或比 其他鞘脂的组合过量的C18:0鞘磷脂的培养基中生长。在一种实施方式中，例 如一种用于培养包膜病毒宿主细胞的液体培养基含有至少1mg/L、5mg/L、10 mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L或更多的C18:1n9 胆固醇酯。在这一实施方式中，优选在培养基中不存在不含C18:1n9脂肪酸的 胆固醇酯、存在的每种不含C18:1n9脂肪酸的胆固醇酯的量低于C18:1n9胆固 醇酯、或者存在的不含C18:1n9脂肪酸的胆固醇酯总的组合量低于C18:1n9胆 固醇酯。在某些实施方式中，一种用于培养包膜病毒宿主细胞的液体培养基包 含至少1mg/L、5mg/L、10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、 400mg/L或更多C18:0鞘磷脂。在这些实施方式中，优选在培养基中基本不存 在不含C18:0脂肪酸的鞘磷脂、存在的每种不含C18:0脂肪酸的鞘磷脂的量低 于C18:0鞘磷脂、或者存在的不含C18:0脂肪酸的鞘磷脂总的组合量低于C18:0 鞘磷脂。在另一方面，优选存在于包膜病毒宿主细胞培养基中的C18:1n9胆固 醇酯的量为所述培养基总胆固醇组分的至少35摩尔％、至少40％、至少50％、 至少60％或更多。此外，优选存在于包膜病毒宿主细胞培养基中的C18:0鞘磷 脂的量为所述培养基鞘脂组分的至少15摩尔％、至少25％、至少50％、至少 60％或更多。
在本发明的组合物和方法的其他方面，我们已经发现，当细胞或培养基脂 质包含C18:2n6脂肪酸时，宿主细胞对包膜病毒的许可性更高。这些脂肪酸可 以是游离脂肪酸、或是在膜脂质分子中酯化的，如C18:2n6胆固醇、C18:2n6 胆固醇酯、和/或C18:2n6鞘磷脂。用于包膜病毒宿主细胞培养的优选液体培养 基包含至少0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、 200mg/L或更多C 18:2n6脂肪酸或含这些脂肪酸的脂质。在另一方面，优选存 在于包膜病毒宿主细胞培养基中的C18:2n6胆固醇酯的量为总的胆固醇酯组分 的至少5摩尔％、至少10％、至少15％、至少20％或更多。可选地，优选存在 于包膜病毒宿主细胞培养基中的C18:2n6鞘磷脂的量为所述培养基总的鞘磷脂 组分的至少5摩尔％、至少10％、至少15％、至少20％或更多。
在一种最优选的实施方式中，通过在生长培养基中补充上述脂质的组合对 用于病毒感染的宿主细胞的许可性进行调节。例如，在一优选实施方式中，用 C18:1n9胆固醇酯、C18:0鞘磷脂、C18:2n6鞘磷脂和C18:2n6胆固醇中的一种 或多种补充宿主细胞生长培养基。在一个方面，对培养基进行补充以产生至少 35％摩尔百分比胆固醇酯(C18:1n9酯)和至少15％摩尔百分比鞘脂脂肪酸 (C18:0脂肪酸)的培养基。在另一方面，对培养基进行补充以产生至少35％摩 尔百分比胆固醇酯(C18:1n9酯)、至少15％摩尔百分比鞘脂脂肪酸(C18:0脂肪 酸)和至少5％摩尔百分比鞘脂脂肪酸(C18:2n6)的培养基。
影响病毒滴度
培养物的病毒滴度可以对制备和处理病毒收获物的时间和费用产生重要影 响。本发明的方法通过提供与增强宿主细胞对病毒感染的许可性相关的脂质和 /或提供相对于宿主在病毒脂质中选择性富集的脂质，可以提高例如包膜病毒培 养物的产率。
受益于本发明所述方法的病毒通常包括包膜病毒。然而，本发明认为，非 包膜病毒宿主细胞的许可性可以受益于这里所述的培养基脂质调节。而且，我 们认为，许多具有脂质和/或脂蛋白组分的非包膜病毒可以受益于所述培养基改 进，以提供例如更稳定和/或更多产的病毒粒后代。
在本发明所述组合物、方法和系统中使用的优选病毒包括包膜病毒。具体 地说，能够从本发明培养基中生长的细胞上培养中获益的更优选的病毒是例如 杆病毒科(Baculoviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、虹彩病毒科(Iridoviridae)、 痘病毒科(Poxviridae)、囊状噬菌体科(Cystoviridae)、冠状病毒科 (Coronaviridae)、黄热病毒科(Flaviviridae)、囊膜病毒科(Togaviridae)、动脉炎 病毒(Arterivirus)、逆转录病毒科(Retroviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、 线状病毒科(Filoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、棒状病毒科 (Rhabdoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)和布尼亚病毒科(Bunyaviridae)家族 的成员。最优选的病毒包括各种流感病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、副粘病毒(如 呼吸道合胞病毒、副流感病毒、偏肺病毒)和乳多空病毒(如人乳头状瘤病毒)。
至于使用本发明的方法提高病毒滴度，这可以按照上述用于提高宿主细胞 许可性的方法得以完成。细胞对于一种病毒感染的许可性是细胞能否以及在多 大程度上可以作为促进病毒复制的宿主的一种尺度。无论出于何种理由，病毒 不能在对于所述病毒来说不许可的细胞中复制。另一方面，对于一种病毒具有 更高许可性的细胞通常会比较低许可性细胞复制更多数量的每细胞病毒粒数。 更高许可性的细胞的另一个好处是即便每细胞子代病毒粒不多，至少感染效率 可以较高。就是说，较高许可性的细胞经常可以被较高比例的接种体病毒粒感 染，例如从而使得使用低滴度或退化的接种体的感染可以更有效地繁殖。因此， 本发明的一个方面是，本发明提高宿主细胞许可性的方法可以用于提高由宿主 细胞培养物的感染获得的病毒的滴度。
在本发明的另一个方面，由宿主细胞感染所产生的病毒的质量和/或数量可 以受在病毒中相对丰富的或在病毒中比宿主细胞脂质相对富集的脂质的供应 的影响。例如，我们已经确定，与宿主细胞培养基和/或宿主细胞相比，病毒可 以具有某些脂质相对较高的脂质含量。预计在病毒中相对富集的脂质的供应会 在病毒培养中提供益处，例如提高的许可度、提高的感染性、更高的滴度和/ 或更高的产量。
我们已经发现，某些包膜病毒粒富含含C16:0脂肪酸的脂质。在一种实施 方式中，病毒培养物的产率可以通过在用于培养所述病毒的宿主细胞的培养基 中添加C16:0脂肪酸或含C16:0脂肪酸的脂质进行提高。例如，在某些实施方 式中，可以在含有至少1mg/L、5mg/L、10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、 200mg/L、400mg/L或更多C16:0脂肪酸(棕榈酸)、其盐、或含C16:0脂肪酸 的脂质(如胆固醇酯或鞘脂)的液体培养基上生长的宿主细胞上培养病毒。在这 些实施方式中，优选上述C16:0脂质存在的量高于单一种类脂质的或总脂质的 其他脂肪酸的量。在本发明的另一个方面，优选存在于包膜病毒宿主细胞培养 基中的C16:0胆固醇酯的量占总培养基胆固醇酯的至少10摩尔％、至少15％、 至少20％、至少30％、至少40％或更多。此外，优选存在于包膜病毒宿主细胞 培养基中的C16:0鞘磷脂的量占培养基鞘脂的至少10摩尔％、至少15％、至 少20％、至少30％、至少40％或更多。
我们已经发现，某些包膜病毒粒富含含C18:2n6脂肪酸的脂质。在一种实 施方式中，病毒培养物的产率可以通过在用于培养所述病毒的宿主细胞的培养 基中添加C18:2n6脂肪酸或含C18:2n6脂肪酸的脂质进行提高。例如，在某些 实施方式中，可以在含有至少1mg/L、5mg/L、10mg/L、25mg/L、50mg/L、 100mg/L、200mg/L、400mg/L或更多C18:2n6脂肪酸(亚麻油)、其盐、或含 C18:2n6脂肪酸的脂质(如胆固醇酯或鞘脂)的液体培养基上生长的宿主细胞上 培养病毒。在这些实施方式中，优选上述C18:2n6脂质存在的量高于单一种类 脂质的或总脂质的其他脂肪酸的量。在本发明的另一个方面，优选存在于包膜 病毒宿主细胞培养基中的C18:2n6胆固醇酯的量占总培养基胆固醇酯的至少 10摩尔％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％或更多。此外，优选 存在于包膜病毒宿主细胞培养基中的C18:2n6鞘磷脂的量占培养基鞘脂的至少 2摩尔％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％或更多。
在本发明的某些实施方式中，可以通过在补充了上述脂质组合的培养基上 培养病毒宿主细胞提高产率(例如感染性、复制、滴度、每宿主细胞感染单位)。 例如，在一优选实施方式中，用C16:0胆固醇酯、C16:0鞘磷脂、C18:2n6鞘 磷脂和C18:2n6胆固醇酯中的两种或多种脂质补充病毒宿主细胞生长培养基。 在一个方面，对培养基进行补充以产生至少15％摩尔百分比的含C18:2n6脂肪 酸的胆固醇酯和/或鞘脂脂肪酸。在另一方面，对培养基进行补充以产生至少 10％摩尔百分比的鞘脂脂肪酸(C16:0脂肪酸)、以及至少15％摩尔百分比的含 C16:0脂肪酸的胆固醇酯。在另一方面，对培养基进行补充以产生至少10％摩 尔百分比的胆固醇酯(C18:2n6酯)、至少10％摩尔百分比的鞘脂脂肪酸(C18:2n6) 脂肪酸、至少10％摩尔百分比的胆固醇酯(C16:0酯)和至少5％摩尔百分比的鞘 脂脂肪酸(C16:0脂肪酸)。
提高的病毒稳定性
根据本发明，对病毒脂质成分的数量和/或比例的调节可以用于提高病毒的 物理稳定性。例如，对病毒进行调节以包含更多高熔点脂质、更适于疫苗制剂 过程的脂质、或不易氧化的脂质，可以提供某些环境中更高的稳定性，例如对 于疫苗产品和/或工艺中间体的保存期稳定性。
含有更长脂肪酸链和含有饱和脂肪酸的脂质的熔点通常较高。此外，随着 胆固醇比例的提高，膜的流动性降低，因此含有较高胆固醇含量的膜更具刚性 并可以更稳定。而且，饱和脂肪酸对氧化(例如，存储中自由基介导的链反应) 的敏感性比不饱和脂肪酸低。在本发明的一个方面，通过在含富含饱和脂肪酸 和/或低胆固醇的培养基中生长的细胞上培养，可以提高病毒(尤其是包膜病毒) 的稳定性。例如，一种用于培养细胞以生产更稳定的病毒粒的培养基可以包含 补充量的含有比常规培养基更高比例饱和脂肪酸的鞘磷脂和磷脂。常规培养基 (例如商品化的培养基)可以补充例如显著高比例的例如C16:0脂肪酸、C18:0 脂肪酸和/或C20:0脂肪酸的脂质。在一优选实施方式中，病毒宿主细胞的生长 培养基含有至少1mg/L、5mg/L、10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200 mg/L、400mg/L或更多包含一种或多种诸如例如C16:0脂肪酸、C18:0脂肪酸 和/或C20:0脂肪酸的饱和脂肪酸的脂质。在这些实施方式中，优选所存在的饱 和C16-C20脂肪酸的量高于具体脂质(例如磷脂、鞘脂、糖脂等等)中的其他脂 肪酸或培养基中的总脂质。在本发明的另一个方面，优选存在于用于包膜病毒 宿主细胞的培养基中的不饱和C16-C20脂肪酸的量占单种培养基脂质类型或 总培养基脂质的至少10摩尔％、至少20％、至少30％、至少40％或更多。
我们已经注意到(参见通过引用纳入本说明书的申请号10/412,630)，通过将 膜生物材料在其相变温度附近暴露于液体防腐溶液可以提高生物材料(诸如细 菌、包膜病毒、动物细胞等等)的稳定性。在相变温度处，膜的渗透性充分提 高，从而使得防腐剂材料(诸如常规生物配方的糖和氨基酸)更易于穿透膜。本 发明的一个方面是使得细胞和/或病毒更适合制剂和保存工艺，通过调节培养基 脂质含量可以调节细胞或病毒宿主的相变温度。例如，一种膜的典型相变温度 可以是约15℃。然而，可能希望在较低的温度下或5-10℃处理病毒(例如疫苗) 以提高处理过程中的活力并且/或适应所遭遇到的作为例如喷雾干燥、冻干或冷 冻泡沫干燥过程中潜在发热结果的温度。另一方面，对于原本具有低相变温度 (例如嗜冷生命形式)的膜或在要求较高温度下膜渗透性情况下的处理(例如一 般转化过程)而言，可能希望将细胞膜的相变温度调至较高温度。
通常，通过例如1)在胆固醇缺失的培养基中培养细胞，2)在补充了鞘磷脂 的培养基中培养细胞，3)将细胞暴露于环糊精(以降低膜胆固醇)，4)将细胞暴 露于神经磷脂酶(由此将膜鞘磷脂转化为更具刚性的神经酰胺)，和/或在补充了 包含具有高比例长链和/或饱和脂肪酸的脂肪酸的脂质的培养基中培养细胞，可 以提高膜的刚性和相变温度。通常，通过例如1)在补充了胆固醇的培养基中培 养细胞，2)在鞘磷脂缺失的培养基中培养细胞，和/或在补充了包含具有高比例 短链和/或不饱和脂肪酸的脂肪酸的脂质的培养基中培养细胞，可以降低膜的相 变温度。
在降低细胞相变温度的优选实施方式中，细胞在含有诸如胆固醇和含相对 短链(C12-C16)脂肪酸、更优选不饱和脂肪酸的脂质的补充脂质的培养基中生 长。例如，细胞可以在经补充含有至少1mg/L、5mg/L、10mg/L、25mg/L、 50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L或更多胆固醇和/或含一种或多种 C12-C16不饱和脂肪酸的脂质的细胞常规培养基中生长。优选所述脂质的脂肪 酸的存在量高于其他脂肪酸(如C18-C22饱和脂肪酸)。可选地，为了提高膜相 变温度，宿主细胞可以在含有较低各种不同的脂质种类和/或亚类的培养基中生 长。为了帮助降低细胞的膜相变温度，优选存在于培养基中的不饱和C12-C16 脂肪酸的量占单一类型培养基脂质或总培养基脂质的至少10摩尔％、至少 15％、至少20％、至少30％、至少40％或更多。可选地，为了降低膜相变温度， 细胞可以在含有较高各种不同脂质种类和/或亚类的培养基中生长。在调节病毒 膜的相变温度的一种优选实施方式中，使用如上所述处理的宿主细胞培养所述 病毒。
在提高细胞相变温度的优选实施方式中，细胞在含有诸如鞘脂和包含相对 长链(C18-C22)脂肪酸、更优选饱和脂肪酸、更优选具有限制数量的不同脂质 的其他脂质的补充脂质的培养基中生长。例如，细胞可以在经补充含有至少1 mg/L、5mg/L、10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L 或更多鞘磷脂和/或其他含一种或多种C18-C22饱和脂肪酸的脂质的常规培养 基中生长。优选所存在的所述脂质的脂肪酸的量高于其他脂肪酸(如C12-C16 不饱和脂肪酸)。为了帮助提高细胞的膜相变温度，优选存在于培养基中的 C18-C22饱和脂肪酸的量占单一培养基脂质类型或总培养基脂质的至少10摩 尔％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％或更多。在提高病毒膜相变 温度的一种优选实施方式中，使用如上所述在培养基中生长的宿主细胞培养所 述病毒。可选地，通过暴露于神经磷脂酶和/或环糊精可以提高细胞或病毒膜的 相变温度。
用于调节细胞或病毒膜脂质的系统
本发明包括用于对细胞或病毒的膜中的脂质组成进行改进的系统。所述系 统通常包括例如位于适当生长培养基中的一种或多种细胞、所述培养基具有补 充的磷脂、胆固醇和/或鞘磷脂。所述系统可以包含能感染所述细胞的病毒。
处理细胞和病毒脂质的系统和方法包括对其中确定成分缺失或不足的培养 基进行补充。补充可以可选地包括本领域内熟知的向常规培养基添加具有已知 或未公开成分的确定脂质。通过添加(或重新配方以去除)这里所述的具体脂质 进行明确的改进，本发明设计了对细胞和病毒脂质的改进。例如，可以针对确 定的脂质对某些虽然可能含有一定量的用于改进的脂质的常规培养基进行调 整以改变细胞或病毒的脂质含量。例如，对以下培养基可以进行如这里所述的 脂质调节以改进宿主细胞和/或病毒脂质组成：293细胞培养基、脂肪细胞/前 脂肪细胞培养基、羊水细胞培养基、星形细胞培养基、Eagle基础培养基、血 液和骨髓细胞培养基、CHO细胞培养基、软骨细胞培养基、Click培养基、CMRL 1066培养基、不含谷酰胺的D-MEM、D-MEM/F12培养基、含谷酰胺的D-MEM、 内皮细胞培养基、成纤维细胞培养基、基因治疗培养基、G-MEM培养基、Ham F-10培养基、Ham F-12培养基、肝细胞培养基、杂交瘤培养基、IMEM Richter 培养基、Iscove培养基、角化细胞培养基、Liebovitz L-15培养基、McCoy 5A 培养基、MCDB 131培养基、MDCK培养基、培养基199、MEM Alpha培养基、 MEM转子培养基、含谷酰胺的MEM、不含谷酰胺的MEM、NCTC-109培养 基、神经元细胞培养基、少突细胞培养基、造骨细胞培养基、RPMI 1640培养 基、平滑细胞培养基、转染细胞选择和克隆培养基、Vero细胞培养基、Williams 培养基、Murashige&Skoog基础盐溶液、Chu(N6)培养基、DKW/Juglans基础 盐混合物、McCowen Woody植物培养基、Guillard(F/2)海洋富集基础盐等等(参 见例如因维曲根公司(Invitrogen)、西格玛公司(Sigma-Aldrich)等公司的产品)。
所述细胞、培养基和病毒可以包含在一种诸如发酵罐、T型瓶、培养皿、 烧瓶、摇瓶等等的培养容器中。所述系统可以包含亚系统组件以提供稳定的孵 育温度(例如约10℃至约40℃、或约37℃)。
在所述系统的具体实施方式中，所述鞘磷脂可以包含C16:0脂肪酸、C18:0 脂肪酸、C18:2n6和/或C18:1n9脂肪酸。例如，所述培养基鞘磷脂可以含有(酯 化的)25摩尔％或更多棕榈酸(C16:0)、20摩尔％或更多硬脂酸和/或40摩尔％ 或更多油酸(C18:1n9)。
在所述方法和系统的另一个方面，用于培养病毒宿主细胞的培养基包含补 充的(与附属的或常规培养基的量相比)磷脂酰丝氨酸和/或磷脂酰肌醇。例如， 所述细胞可以在经补充含有至少1mg/L、5mg/L、10mg/L、25mg/L、50mg/L、 100mg/L、200mg/L、400mg/L或更多磷脂酰丝氨酸和/或磷脂酰肌醇的细胞常 规培养基中生长。优选这些磷脂的脂肪酸主要是C16:0、C18:0、C18:1n9和/ 或C18:2n6。最优选的磷脂补充物含一种或多种C18:2n6脂肪酸。优选存在于 培养基中的磷脂酰丝氨酸和/或磷脂酰肌醇的量占到培养基中磷脂或总脂质的 至少10摩尔％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％或更多。
在优选的实施方式中，所述细胞是动物细胞。优选地，所述细胞是鸟类或 哺乳动物细胞。更优选地，所述细胞是人细胞、猴细胞、猿细胞、鸡细胞。最 优选地，所述细胞是鸡尿囊(CAS)细胞、鸡胚肾(CEK)细胞、犬肾细胞、Vero 细胞、淋巴细胞、MDCK细胞、MA-104细胞、CHO细胞、HeLa细胞、293 细胞、NSO细胞和U937细胞。
在优选的实施方式中，所述病毒是包膜病毒，如杆病毒科(Baculoviridae)、 疱疹病毒科(Herpesviridae)、虹彩病毒科(Iridoviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、 囊状噬菌体科(Cystoviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、黄热病毒科 (Flaviviridae)、囊膜病毒科(Togaviridae)、动脉炎病毒(Arterivirus)、逆转录病毒 科(Retroviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、线状病毒科(Filoviridae)、副 粘病毒科(Paramyxoviridae)、棒状病毒科(Rhabdoviridae)、沙粒病毒科 (Arenaviridae)和布尼亚病毒科(Bunyaviridae)家族的成员。最优选的病毒包括各 种流感病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、副粘病毒(如呼吸道合胞病毒、副流感病 毒、偏肺病毒)和乳多空病毒(如人乳头状瘤病毒)。
本发明所述系统中的病毒培养可以允许对子代病毒粒的某些特性进行控 制。例如，在补充的(调节的)培养基中培养宿主细胞可以比在未补充的培养基 上生长的细胞提供更高的病毒滴度、提供更长的病毒保存期、提供更高的病毒 免疫原性、以及/或提供改进的病毒的膜Tg。
在所述系统和方法的其他方面，通过用富含这里所明确的产生好处的脂质 的饲料喂养提供宿主细胞的动物，可以影响宿主细胞(例如CAS细胞)和/或病 毒粒的脂质含量。例如，可以用富含诸如含C16:0、C18:0、C18:1n9和/或C18:2n6 的鞘磷脂、磷脂、以及/或胆固醇酯的脂质的饲料喂养动物。
实施例
提供以下实施例以举例说明而不是限制本发明。精通本领域的人员应当认 识到，可以改变各个参数而获得充分类似的结果。
流感病毒包膜的相变测量显示出相对刚性的膜结构，说明病毒包膜上具有 高浓度高熔点脂质以及大量胆固醇和鞘脂。问题在于：与其生长的宿主细胞相 比，某些脂质种类是否优选地或选择性地在病毒粒中富集？我们研究了病毒中 富集的脂质类型和亚类；具有不同许可性水平的宿主细胞的脂质组成中的差 异；以及用“优选”脂质成分补充细胞培养基的作用。
我们发现，宿主细胞之间及其与病毒粒之间脂质组成的差异与可以在改变 细胞和病毒产物的产率和效率中使用的特性相关。例如，脂质成分分析说明， 与产生它的宿主细胞相比，在病毒包膜中表现出提高的鞘磷脂和胆固醇水平。 我们注意到了病毒和细胞之间在鞘磷脂亚类和胆固醇亚类上的显著差别。在病 毒中发现了高浓度的鞘磷脂16:0，而18:0浓度在许可的细胞中较高但(也许优 选)在病毒中下降。具有18:1n9链长的胆固醇酯优选在细胞中富集，而16:0在 病毒中富集。Vero细胞(对于流感低许可性的)比对流感感染高许可性的尿囊细 胞含有更低的鞘磷脂和显著更低的18:1n9胆固醇酯含量。
实施例1膜相变的FTIR显微镜检测
如图1A至1C中所示，膜的脂质流动性受到膜的胆固醇和鞘磷脂含量的影 响。FTIR检测了约2850cm-1处对称-CH2的伸缩振动，并用以监测磷脂尾部基 团的脂肪酰基侧链的振动。用波数对温度作图以确定膜的相改变。可以检测到 流体相高脂质流动相改变为凝胶-晶体相。发现了向更高波数的转变，说明更 有序(或更刚性)的膜脂质环境。
环糊精的疏水口袋具有从膜上隔离胆固醇的能力。如图1B中所示，在通 过环糊精处理降低膜胆固醇含量的情况下，与图1A的对照相比，脂质流动性 降低并发现脂质更为有序。如图1C中所示，通过用神经磷脂酶处理膜，从而 将膜鞘磷脂转化为神经酰胺，膜的熔点和脂质顺序进一步提高。此外，这些实 验表明，对流感病毒高度许可的CEK细胞含有大量适合调节以改变膜的特性 的胆固醇和鞘磷脂。
在一个方面，我们预见了FTIR分析可以用于预测宿主细胞的许可性。例 如，某些FTIR图谱和/或对处理的反应可以与许可性相关。预期宿主细胞培养 基的调整可以对膜脂质组成和膜特性产生类似的改变。
实施例2经处理的病毒粒膜的FTIR分析
还发现病毒膜的顺序和脂质流动性受到脂质含量改变的影响。例如，如图 2中所示，病毒膜的胆固醇含量的改变(例如通过环糊精处理)可以改变流动性 和相变特性。而且，如通过FTIR所测得的，膜鞘磷脂转化为神经酰胺也可以 改变膜的特性。这些实验说明，与许可性宿主细胞一致，这些病毒具有相对大 量的胆固醇和鞘磷脂。病毒膜显示出富集了胆固醇和鞘磷脂，甚至高于其许可 性最高的宿主细胞膜的含量。
在一个方面，我们预见了FTIR分析可以用于检测病毒中的变化(例如在保 存过程中)。例如，某些膜脂质成分的降解或损耗可以与FTIR图谱中的变化相 关。
从这些实验中观察到，正如波数的变化程度所说明的，流感包膜是相对刚 性的。流感病毒或许包含高浓度的胆固醇和鞘磷脂。在约15℃处可以检测到 A/Sydney病毒株巨大的相变，但对于B/Harbin病毒株相变程度较小。这样一 种相变可以在例如制剂干燥过程中(例如对于病毒疫苗而言)用于设计一种干燥 循环。与HIV类似，流感包膜源自普通宿主膜的膜脂质筏或非典型的微结构域。
实施例3包括脂质亚类的膜组成分析
使用了薄层层析(TLC)和气相色谱法对膜脂质的10个种类和40个亚类进行 鉴别。这些种类包括：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸/肌醇、鞘磷 脂、胆固醇酯、游离脂肪酸、甘油二酯、甘油三酯、心磷脂和溶血磷脂酰胆碱。 在这些种类内，根据例如哪些脂肪酸酯化成脂质结构，对所述脂质进一步加以 区分。检测极限通常为约1纳摩，并且轮次之间的检验偏差低于10％。
如图3中所示，与宿主CAS细胞膜相比，除了其他差异以外，病毒包膜富 集了鞘磷脂和糖脂(磷脂酰丝氨酸/肌醇)。
如图4和5中所示，在宿主细胞和子代病毒之间出现了脂质亚类含量的显 著差异。例如，对于磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸/肌醇这两者而言，与宿主相 比，在病毒中出现了C18:1n9脂肪酸的富集。
如图6中所示，与宿主细胞水平相比，病毒中充分富集了含C18:0脂肪酸 的鞘磷脂亚类。
如图7中所示，与子代病毒相比，许可性CAS细胞明显富集了含C18:1n9 的胆固醇酯。
实施例4许可性和非许可性细胞的膜组分分析
在对病毒感染具有不同许可程度的宿主细胞的选择上进行了一系列分析。 鉴定了具体膜脂质与病毒感染敏感性相关的趋势。
例如，对于流感病毒感染而言，Vero细胞是相对较低许可性的，MDCK细 胞许可性稍高，CAS细胞是最高许可性的。如图8中所示，在许可细胞中鞘磷 脂确实较为显著。
如图9中所示，对于胆固醇酯，在许可细胞中C18:1n9和C18:2n6脂肪酸 比较低许可性细胞中的确实更为显著。
如图10中所示，对于鞘磷脂亚类，在许可性和含C18:0的鞘磷脂丰富度之 间表现出相关性。
总而言之，对细胞和病毒膜脂质的调节使得改变宿主细胞的许可性以及病 毒培养物的产量成为可能。相变测量显示，流感病毒包膜是非常刚性的并由高 熔点脂质构成。脂质组成分析已经证实了在病毒包膜中鞘磷脂和胆固醇水平的 提高。在病毒和细胞之间观察到在鞘磷脂亚类和胆固醇亚类上的显著差异。与 更高许可性的尿囊细胞相比，Vero细胞含有较低的鞘磷脂和明显更低的18:1n9 胆固醇酯含量。
应当理解，这里所述的实施例和实施方式仅是为了举例说明的目的，精通 本领域的人员根据其进行的各种修改或改变包含在本申请的精神和范围以及 附属的权利要求书的范围以内。为了所有目的，这里所引用的所有出版物、专 利以及专利申请通过引用完整地整合在本申请中。