一种体外扩增脐血CD34+细胞的方法 |
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申请号 | CN201610023769.4 | 申请日 | 2016-01-14 | 公开(公告)号 | CN105543172A | 公开(公告)日 | 2016-05-04 |
申请人 | 卢连伟; | 发明人 | 卢连伟; | ||||
摘要 | 本 发明 公开了一种体外扩增脐血CD34+细胞的方法,具体包括以下步骤: 抽取 脐带血,加入肝素抗凝,以新生儿血清或成人的血清做为媒介进行预处理;与Hank's液混合,加入分离液,离心,吸取白色雾状单个核细胞;除去红细胞,用PBS清洗,计数,接种到含培养基Ⅰ的培养瓶中;使用 磁性 细胞分选仪和CD34+细胞分选 试剂 盒 分离和纯化CD34+细胞;脐血CD34+细胞重悬于培养基Ⅱ中,接种于6孔板中,培养;在培养基Ⅲ中测定CD34+扩増的细胞的造血祖细胞集落形成能 力 。本发明建立的培养体系及其培养条件对脐血CD34+细胞的扩增具有明显的支持作用,脐血细胞培养4周后,可大大扩増脐血CD34+细胞和CFC。 | ||||||
权利要求 | 1.一种体外扩增脐血CD34+细胞的方法,其特征在于,包括以下步骤: |
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说明书全文 | 一种体外扩增脐血CD34+细胞的方法技术领域背景技术[0002] 自1989年世界上首例脐血移植成功以来,人们己经对脐血移植进行了深入广泛的研究。但到目前为止,脐血移植仍存在一些尚待解决的问题,主要在于脐血造血干/祖细胞(CD34+)数量少,使其目前主要应用于儿童患者,限制了其广泛应用。因此,如何扩増脐血造造血干/祖细胞数量提高其植入率,缩短造血重建恢复时间,己经成为目前人们对脐血移植研究的主要问题。 [0003] 对脐血CD34+细胞的体外扩増,最初主要通过体外加入不同组合的细胞因子来达到扩増的目的,但体外加入的细胞因子不能长期维持细胞的培养,需要不断加以补充。之后,又建立了以骨髓基质细胞为滋养层的脐血CD34+细胞体外扩増共培养体系,模拟体内造血微环境,以长期持续地分泌细胞因子来维持脐血CD34+细胞的扩増。然而,人骨髓基质细胞来源受限且脐血CD34+细胞与成人骨髓CD34+细胞具有不同的生物学特性。 [0004] 因此,如何扩増脐血造造血干/祖细胞数量,提高其植入率,缩短造血重建恢复时间,己经成为目前人们对脐血移植研究的主要问题。 发明内容[0005] 本发明解决的技术问题是针对以上不足,提供一种体外扩增脐血CD34+细胞的方法,为脐血CD34+细胞的的扩增建立适合的培养条件,提高其植入率,缩短造血重建恢复时间。 [0006] 本发明的技术方案是,一种体外扩增脐血CD34+细胞的方法,包括以下步骤: [0007] (1)脐血的采集及预处理: [0008] 无菌条件下从正常分娩足月新生儿胎盘抽取脐带血30~50ml,加入肝素抗凝,以新生儿血清或成人的血清做为预处理的媒介,将脐带血与新生儿血清或成人的血清按照1:1.5d的比例混匀,-15℃冷藏30分钟; [0009] (2)脐血的分离: [0010] 预处理后的脐带血与Hank's液按体积比例为2:1混合,取一100ml离心管,加入Ficoll-Paque分离液15~25ml,将脐带血混合液30~50ml缓慢加于分离液上,1800r/min,离心16~20min,离心结束后,离心管中液体分层,吸取白色雾状单个核细胞层到一新100ml离心管中; [0011] (3)脐血CD34+细胞的纯化: [0012] 用红细胞裂解液(ACK Lysis Buffer)除去红细胞,再用PBS清洗单核细胞2~3次,计数,按1×107个细胞/ml的密度接种到含培养基Ⅰ的75cm2培养瓶中;使用磁性细胞分选仪和CD34+细胞分选试剂盒分离和纯化CD34+细胞; [0013] (4)脐血CD34+细胞体外扩增培养: [0014] 脐血CD34+细胞重悬于培养基Ⅱ中,按1×106/ml接种于6孔板中,每孔2.5ml,在37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养4周,每周半量换液一次; [0015] (5)测定CD34+扩増的细胞的造血祖细胞集落(CFC)形成能力: [0016] 吸取足量的培养基Ⅲ到注射器中,并分装到灭菌试管中,按1:10(v/v)的比例将细胞添加到培养基Ⅲ中,扭紧试管盖,振摇试管,以保证所有的成份充分混匀,用IMDM+2%FBS稀释至合适浓度,在6孔培养板中每孔接种2×103个细胞,37℃,5%C〇2和饱和湿度条件下培养培养2周,在倒置显微镜下直接计数,40个以上细胞为1个集落。 [0017] 进一步地,所述培养基Ⅰ是由基础培养基和添加成分组成,所述基础培养基为RPMI1640培养液,所述添加成分为:谷氨酰胺1~2.5ug/mL、β-巯基乙醇1%(v/v)、碳酸氢钠2~3.5ug/mL、胰岛素1~5ug/mL、bFGF 15~18ng/mL、维生素C 30~50ug/mL。 [0018] 进一步地,所述培养基Ⅱ配方如下:50~120ml胎牛血清、10~25ml非必需氨基酸,1ml谷氨酰胺、2~8μlβ-巯基乙醇、1.0~1.5ml胰岛素、1~4μlN-乙酰-L-半胱氨酸、3~20μg细胞因子GM-CSF(购于美国PeproTech公司)、1~5μg肥大细胞生长因子(MGF)、0.2~1.0μg粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、0.3~2.0μg白细胞介素8、重组人白介素-11。细胞因子GM-CSF、肥大细胞生长因子(MGF)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、白细胞介素8一起诱导细胞增生、延长其存活期。 [0019] 进一步地,所述培养基Ⅲ是在MethoCult培养基的基础上加入重组细胞因子,所述重组细胞因子包括:G-CSF 50ng/ml、IL-11 10ng/ml、IL-1β 10ng/ml、EPO 6U/ml。 [0020] 本发明与现有技术相比,有益效果体现为:采用发明的培养方法脐血细胞培养4周后,可大大扩増脐血CD34+细胞和CFC,脐血CD34+细胞扩増倍数在地2周可达(9.0士4.5)倍,CFC扩増在第1周时达到峰值,说明本发明建立的培养体系及其培养条件对脐血CD34+细胞的扩增具有明显的支持作用。 具体实施方式[0021] 实施例1: [0022] 一种体外扩增脐血CD34+细胞的方法,包括以下步骤: [0023] (1)脐血的采集及预处理: [0024] 无菌条件下从正常分娩足月新生儿胎盘抽取脐带血30ml,加入肝素抗凝,以新生儿血清或成人的血清做为预处理的媒介,将脐带血与新生儿血清或成人的血清按照1:1.5d的比例混匀,-15℃冷藏30分钟; [0025] (2)脐血的分离: [0026] 预处理后的脐带血与Hank's液按体积比例为2:1混合,取一100ml离心管,加入Ficoll-Paque分离液15ml,将脐带血混合液30ml缓慢加于分离液上,1800r/min,离心16min,离心结束后,离心管中液体分层,吸取白色雾状单个核细胞层到一新100ml离心管中; [0027] (3)脐血CD34+细胞的纯化: [0028] 用红细胞裂解液(ACK Lysis Buffer)除去红细胞,再用PBS清洗单核细胞2次,计数,按1×107个细胞/ml的密度接种到含培养基Ⅰ的75cm2培养瓶中;所述培养基Ⅰ是由基础培养基和添加成分组成,所述基础培养基为RPMI1640培养液,所述添加成分为:谷氨酰胺1ug/mL、β-巯基乙醇1%(v/v)、碳酸氢钠2ug/mL、胰岛素1/mL、bFGF 15ng/mL、维生素C 30ug/mL;使用磁性细胞分选仪和CD34+细胞分选试剂盒分离和纯化CD34+细胞; [0029] (4)脐血CD34+细胞体外扩增培养: [0030] 按下述配方配制培养基Ⅱ:50ml胎牛血清、10ml非必需氨基酸,1ml谷氨酰胺、2μlβ-巯基乙醇、1.0ml胰岛素、1μlN-乙酰-L-半胱氨酸、3μg细胞因子GM-CSF(购于美国PeproTech公司)、1μg肥大细胞生长因子(MGF)、0.2μg粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、0.3μg白细胞介素8、重组人白介素-11,细胞因子GM-CSF、肥大细胞生长因子(MGF)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、白细胞介素8一起诱导细胞增生、延长其存活期;脐血CD34+细胞重悬于培养基Ⅱ中,按1×106/ml接种于6孔板中,每孔2.5ml,在37℃、5% CO2饱和湿度条件下培养4周,每周半量换液一次; [0031] (5)测定CD34+扩増的细胞的造血祖细胞集落(CFC)形成能力: [0032] 吸取足量的培养基Ⅲ到注射器中,所述培养基Ⅲ是在MethoCult培养基的基础上加入重组细胞因子,所述重组细胞因子包括:G-CSF 50ng/ml、IL-11 10ng/ml、IL-1β 10ng/ml、EPO 6U/ml;然后分装到灭菌试管中,按1:10(v/v)的比例将细胞添加到培养基Ⅲ中,扭紧试管盖,振摇试管,以保证所有的成份充分混匀,用IMDM+2%FBS稀释至合适浓度,在6孔3 培养板中每孔接种2×10 个细胞,37℃,5%C〇2和饱和湿度条件下培养培养2周,在倒置显微镜下直接计数,40个以上细胞为1个集落。 [0033] 实施例2: [0034] 一种体外扩增脐血CD34+细胞的方法,包括以下步骤: [0035] (1)脐血的采集及预处理: [0036] 无菌条件下从正常分娩足月新生儿胎盘抽取脐带血40ml,加入肝素抗凝,以新生儿血清或成人的血清做为预处理的媒介,将脐带血与新生儿血清或成人的血清按照1:1.5d的比例混匀,-15℃冷藏30分钟; [0037] (2)脐血的分离: [0038] 预处理后的脐带血与Hank's液按体积比例为2:1混合,取一100ml离心管,加入Ficoll-Paque分离液20ml,将脐带血混合液40ml缓慢加于分离液上,1800r/min,离心18min,离心结束后,离心管中液体分层,吸取白色雾状单个核细胞层到一新100ml离心管中; [0039] (3)脐血CD34+细胞的纯化: [0040] 用红细胞裂解液(ACK Lysis Buffer)除去红细胞,再用PBS清洗单核细胞2次,计数,按1×107个细胞/ml的密度接种到含培养基Ⅰ的75cm2培养瓶中;所述培养基Ⅰ是由基础培养基和添加成分组成,所述基础培养基为RPMI1640培养液,所述添加成分为:谷氨酰胺1.75ug/mL、β-巯基乙醇1%(v/v)、碳酸氢钠2.75ug/mL、胰岛素3ug/mL、bFGF 16.5ng/mL、维生素C 40ug/mL;使用磁性细胞分选仪和CD34+细胞分选试剂盒分离和纯化CD34+细胞; [0041] (4)脐血CD34+细胞体外扩增培养: [0042] 按下述配方配制培养基Ⅱ:850ml胎牛血清、17.5ml非必需氨基酸,1ml谷氨酰胺、5μlβ-巯基乙醇、1.25ml胰岛素、2.5μlN-乙酰-L-半胱氨酸、11.5μg细胞因子GM-CSF(购于美国PeproTech公司)、3μg肥大细胞生长因子(MGF)、0.6μg粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、1.15μg白细胞介素8、重组人白介素-11,细胞因子GM-CSF、肥大细胞生长因子(MGF)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、白细胞介素8一起诱导细胞增生、延长其存活期;脐血CD34+细胞重悬于培养基Ⅱ中,按1×106/ml接种于6孔板中,每孔2.5ml,在37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养4周,每周半量换液一次; [0043] (5)测定CD34+扩増的细胞的造血祖细胞集落(CFC)形成能力: [0044] 吸取足量的培养基Ⅲ到注射器中,所述培养基Ⅲ是在MethoCult培养基的基础上加入重组细胞因子,所述重组细胞因子包括:G-CSF 50ng/ml、IL-11 10ng/ml、IL-1β 10ng/ml、EPO 6U/ml;然后分装到灭菌试管中,按1:10(v/v)的比例将细胞添加到培养基Ⅲ中,扭紧试管盖,振摇试管,以保证所有的成份充分混匀,用IMDM+2%FBS稀释至合适浓度,在6孔培养板中每孔接种2×103个细胞,37℃,5%C〇2和饱和湿度条件下培养培养2周,在倒置显微镜下直接计数,40个以上细胞为1个集落。 [0045] 实施例3: [0046] 一种体外扩增脐血CD34+细胞的方法,包括以下步骤: [0047] (1)脐血的采集及预处理: [0048] 无菌条件下从正常分娩足月新生儿胎盘抽取脐带血50ml,加入肝素抗凝,以新生儿血清或成人的血清做为预处理的媒介,将脐带血与新生儿血清或成人的血清按照1:1.5d的比例混匀,-15℃冷藏30分钟; [0049] (2)脐血的分离: [0050] 预处理后的脐带血与Hank's液按体积比例为2:1混合,取一100ml离心管,加入Ficoll-Paque分离液25ml,将脐带血混合液50ml缓慢加于分离液上,1800r/min,离心20min,离心结束后,离心管中液体分层,吸取白色雾状单个核细胞层到一新100ml离心管中; [0051] (3)脐血CD34+细胞的纯化: [0052] 用红细胞裂解液(ACK Lysis Buffer)除去红细胞,再用PBS清洗单核细胞3次,计数,按1×107个细胞/ml的密度接种到含培养基Ⅰ的75cm2培养瓶中;所述培养基Ⅰ是由基础培养基和添加成分组成,所述基础培养基为RPMI1640培养液,所述添加成分为:谷氨酰胺2.5ug/mL、β-巯基乙醇1%(v/v)、碳酸氢钠3.5ug/mL、胰岛素5ug/mL、bFGF 18ng/mL、维生素C 50ug/mL;使用磁性细胞分选仪和CD34+细胞分选试剂盒分离和纯化CD34+细胞; [0053] (4)脐血CD34+细胞体外扩增培养: [0054] 按下述配方配制培养基Ⅱ:120ml胎牛血清、25ml非必需氨基酸,1ml谷氨酰胺、8μlβ-巯基乙醇、1.5ml胰岛素、4μl N-乙酰-L-半胱氨酸、20μg细胞因子GM-CSF(购于美国PeproTech公司)、5μg肥大细胞生长因子(MGF)、1.0μg粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、2.0μg白细胞介素8、重组人白介素-11,细胞因子GM-CSF、肥大细胞生长因子(MGF)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、白细胞介素8一起诱导细胞增生、延长其存活期;脐血CD34+细胞重悬于培养基Ⅱ中,按1×106/ml接种于6孔板中,每孔2.5ml,在37℃、5% CO2饱和湿度条件下培养4周,每周半量换液一次; [0055] (5)测定CD34+扩増的细胞的造血祖细胞集落(CFC)形成能力: [0056] 吸取足量的培养基Ⅲ到注射器中,所述培养基Ⅲ是在MethoCult培养基的基础上加入重组细胞因子,所述重组细胞因子包括:G-CSF 50ng/ml、IL-11 10ng/ml、IL-1β 10ng/ml、EPO 6U/ml;然后分装到灭菌试管中,按1:10(v/v)的比例将细胞添加到培养基Ⅲ中,扭 |